1 Il progetto, si è articolato in diverse attività di ricerca

Il progetto, si è articolato in diverse attività di ricerca che hanno riguardato sia lo studio e
l’applicazione di nuove tecnologie in fase di lavorazione e di conservazione del prodotto sia la
messa a punto di nuove colture microbiche autoctone e lo studio di fattori, come l’attacco
fagico, che possono comprometterne l’attività.
Attività di ricerca 1
Obiettivo
Standardizzazione della resa e riduzione delle problematiche di spurgo e perdita di consistenza
in formaggi molli, in particolare stracchino e casatella.
Attività realizzata
La ricerca si proponeva di valutare gli effetti di una nuova tecnologia di standardizzazione della
fase di coagulo basata sull’iniezione di anidride carbonica nel latte.
Secondo diversi Autori l’acidificazione del latte mediante aggiunta di CO2 gassosa se da un
lato, grazie al suo effetto batteriostatico, può consentire di prolungare la conservabilità del
latte, dall’altro può determinare un abbassamento del pH del latte, modulabile in funzione delle
necessità tecnologiche di trasformazione, determinando un sensibile aumento dell’attività del
caglio con conseguente riduzione della quantità da utilizzare in caseificazione. Ciò può
influenzare le caratteristiche del coagulo con effetti sia sulla resa di caseificazione che sulle
successive caratteristiche organolettiche del prodotto.
Lo studio fin qui condotto si è proposto di verificare l’effetto dell’aggiunta della CO2 gassosa
sull’attività di colture starter di batteri lattici comunemente impiegate nella produzione di
formaggi. Sono state testate diverse colture starter per formaggi molli costituite da ceppi
appartenenti unicamente alla specie Streptococcus thermophilus o da ceppi di S. thermophilus
associati a ceppi di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Le prove effettuate hanno indicato una diversa risposta alla CO2 delle colture esaminate; in
particolare, alcune colture non risultavano influenzate dalla presenza dell’anidride carbonica,
altre evidenziavano un rallentamento della loro velocità di acidificazione.
Da tali risultati si deduce che l’eventuale applicazione della tecnologia di addizione della CO2 in
caseificazione dovrebbe essere preceduta da una valutazione dell’attività dello starter, per
verificare eventuali effetti batteriostatici imputabili alla presenza dell’anidride carbonica.
Sono stati inoltre effettuati esami lattodinamografici in latte di Alta Qualità o in latte crudo
acidificato con CO2 gassosa e addizionato con concentrazioni diverse di caglio liquido.Tali esami
hanno evidenziato come la correzione del pH con CO2 consenta effettivamente una riduzione
della quantità di caglio utilizzata.
Nel complesso lo studio finora effettuato, che verrà completato con delle prove sperimentali di
caseificazione, suggerisce che la metodologia di standardizzazione dell’acidità del latte
destinato a caseificazione con CO2 può trovare applicazione nella tecnologia di trasformazione
del latte in formaggi a rapido consumo, dove potrebbe consentire dei vantaggi nel controllo
dello spurgo dei prodotti in fase di commercializzazione e nella riduzione di fenomeni
proteolitici della pasta generati dagli enzimi coagulanti. La metodologia potrebbe inoltre dare
ulteriori importanti vantaggi mettendo i caseifici nelle condizioni di trasformare latte con
caratteristiche tecnologiche costanti in qualsiasi periodo dell’anno. Ciò che frena la diffusione
dell’innovativa tecnologia nell’industria casearia è l’assenza di riferimenti legislativi necessari
ad una legittimazione in campo alimentare anche se in alcuni Paesi europei tale metodologia è
già in uso in produzione casearie non a denominazione di origine.
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Attività di ricerca 2
Il confezionamento in atmosfera modificata è una tecnologia di conservazione degli alimenti
che comporta la sostituzione dell’aria, normalmente presente nella confezione, con uno o più
tipi di gas, da soli o in miscela tra loro, in concentrazioni tali da tenere sotto controllo lo
sviluppo della flora microbica dell’alimento, mantenerne stabili le caratteristiche sensoriali e
prolungarne la conservabilità. La presente attività di ricerca si è posta due obiettivi; un primo
obiettivo ha riguardato la valutazione dell’impiego di due diverse miscele di gas e due diverse
tipologie di packaging nella conservazione di formaggi freschi, il secondo ha previsto lo studio
dell’effetto della conservazione in atmosfera modificata sulle caratteristiche sensoriali dei
formaggi duri.
Obiettivo 1
Conservazione formaggi freschi in atmosfera modificata
Attività realizzata
L’attività ha previsto la realizzazione, in collaborazione con un’azienda di packaging, di prove
sperimentali in cui sono state utilizzate per la conservazione di formaggi stracchino e casatella,
due tipologie di atmosfera modificata costituite da miscele di gas in diverse proporzioni
(atmosfera 30, costituita da 70% di azoto e 30 % di anidride carbonica e atmosfera 50,
costituita da 50% azoto e 50% anidride carbonica) e due diversi sistemi di packaging (tipologia
tradizionale e tipologia con film biodegradabile). I prodotti sono stati valutati per le loro
caratteristiche microbiologiche e sensoriali. Relativamente agli esiti dell’analisi microbiologica,
le ripetizioni disponibili non hanno consentito di effettuare una valutazione statistica dei
risultati e di dare un giudizio definitivo sulle tesi esaminate; tuttavia, per quanto riguarda sia i
lieviti che i coliformi si evidenzia una maggiore presenza di questi microrganismi nei campioni
in atmosfera modificata 50 rispetto ai campioni in atmosfera modificata 30. Per quanto
riguarda l’analisi sensoriale, essa è stata effettuata a ridosso della scadenza sui campioni di
stracchino con packaging tradizionale e conservati in atmosfera 30 e 50. Per l’analisi sensoriale
è stato utilizzato un test triangolare in cui a ciascun giudice, a cui era stato fornito un set
costituito da tre campioni di cui due uguali ed uno diverso, veniva chiesto di riconoscere i
campioni diversi. Sui 30 triangoli di campioni utilizzati 15 sono stati riconosciuti diversi, il che
indica che esiste una differenza significativa tra i campioni, anche se va tenuto presente che
per quanto riguarda la significatività del test è appena al di sotto del valore soglia dello 0.05%
(0.0435).
Obiettivo 2
Valutazione delle caratteristiche sensoriali di formaggi duri confezionati in atmosfera modificata
Attività realizzata
Sono state svolte una serie di indagini allo scopo di indagare sulle caratteristiche sensoriali di
formaggi duri, a differente grado di stagionatura, e sottoposti a diversi sistemi di
confezionamento in atmosfera modificata.
In particolare sono state effettuate diverse prove con l’obiettivo di:
•
valutare le modifiche organolettiche subite dal prodotto confezionato
•
valutare la comparsa di sapori anomali sul prodotto confezionato nel tempo
•
valutare eventuali differenze organolettiche tra formaggi conservati in atmosfera
modificata, trattati in superficie e formaggi non trattati.
•
stabilire una corretta shelf-life del prodotto confezionato in atmosfera modificata
E’ stato condotto un piano d’indagine che ha coinvolto la medesima tipologia di formaggio con
diversi periodi di stagionatura.
All’interno della tipologia si sono identificate due tesi, definite “trattato” e “non trattato”,
sottoposte ad analisi sensoriali e reologiche in tempi successivi al confezionamento (a 30, 60,
90, 120 e 180 giorni).
Le indagini ai tempi previsti, sono state condotte solamente dopo aver accertato la presenza di
anomalie gusto-olfattive e l’effettiva rilevazione di differenze tra le tesi; in caso contrario, si
consideravano i tempi di confezionamento successivi.
La ricerca delle eventuali differenze sensoriali è stata svolta mediante alcuni test di tipo
discriminanti-qualitativi, definiti duo-trio test: sono stati presentati ai giudici tre campioni dei
quali uno espressamente indicato di riferimento, e gli altri due codificati (uno di questi è uguale
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al riferimento), ed è stato chiesto loro quale fra i due campioni codificati risulta essere diverso
dal riferimento.
In parallelo all’analisi sensoriale sono state condotte sui prodotti prove reologiche di
compressione uniassiale per la definizione delle caratteristiche strutturali.
Risultati
In generale il confronto tra le tesi “trattato” e “non trattato” non ha evidenziato differenze
significative.
La mancanza di differenze è stata rilevata anche all’interno delle tipologie nei confronti svolti ai
diversi periodi di conservazione.
I risultati del test duo trio non hanno manifestato differenze significative tra il numero di
giudici che hanno riconosciuto il campione simile al riferimento e quelli che non l’hanno
riconosciuto, quindi anche se esiste una proporzione diversa tra le risposte, tali differenze non
sono confermate statisticamente.
Solamente in pochi casi sono state osservate differenze tra formaggi trattati e non, supportate
anche dalla conferma statistica, in relazione a caratteristiche indipendenti dal trattamento di
confezionamento subito.
I dati reologici confermano quelli sensoriali, in quanto non si osservano differenze nei
trattamenti subiti dai campioni.
Concludendo, i diversi trattamenti effettuati sul prodotto non trasferiscono differenze
sostanziali al prodotto confezionato, sia nei formaggi mediamente stagionati che in quelli con
maggior grado di maturazione; non si sono inoltre osservate modifiche nelle caratteristiche di
composizione (ad esempio in umidità) e neppure una modifica del grado di maturazione.
Inoltre i controlli intermedi al maggior periodo di confezionamento non hanno rilevato la
comparsa di difetti, dimostrando che la shelf life dei prodotti può essere considerata valida
almeno fino ai 180 giorni.
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Attività di ricerca 3
Obiettivo
Miglioramento della qualità della mozzarella: il problema fago
Attività realizzata
La presenza di difettosità nella mozzarella ed in altre tipologie di formaggi può essere correlata
a rallentamenti nei processi di acidificazione con conseguenti problematiche di tipo tecnologico
o igienico sanitario. Tali rallentamenti sono per lo più imputabili alla presenza di fagi, virus che
attaccano i ceppi di batteri lattici presenti nelle colture starter.
Nella presente attività progettuale, che ha coinvolto una delle aziende partecipanti al progetto,
si è voluto verificare l’eventuale sensibilità dei lattoinnesti naturali liofilizzati, dei lattoinnesti
naturali preparati in latte e delle colture commerciali impiegate nella produzione di mozzarella,
a fagi presenti in caseificio ed in lavorazione. Entrambe le tipologie di coltura starter (naturale
o commerciale) sono inoltre state sottoposte a tipizzazione molecolare allo scopo di verificare
la loro composizione in termini di ceppi. E’ noto infatti che colture costituite da più ceppi
microbici sono meno soggette a problematiche di rallentamento o di perdita di attività dovute
ad attacchi fagici, rispetto a colture costituite da uno o pochi ceppi.
Tipizzazione molecolare
Sono state sottoposte a tipizzazione molecolare sei diverse colture impiegate nella produzione
di mozzarella; di queste, due erano colture starter commerciali (StC e StD), quattro
rappresentavano altrettanti lattoinnesti naturali liofilizzati (lattoinnesto A e B) o preparati in
latte (LIM27/09 e LI S84).
La tipizzazione molecolare è stata effettuata utilizzando il metodo molecolare RAPD-PCR. Tale
metodologia consente di ottenere dei profili genetici specifici per ciascun ceppo in esame e
permette di ottenere sia informazioni per la identificazione di specie sia di riconoscere
eventuali ceppi diversi presenti all’interno di una data specie microbica. Dalle piastre di conta
(terreno M17 agar) di ciascun campione sono state isolate e successivamente purificate dalle
10 (per le colture commerciali) alle 20 colonie microbiche (per le colture naturali). Le colonie
sono state quindi sottoposte a due reazioni di RAPD-PCR utilizzando due diversi primer. I profili
genetici ottenuti sono stati quindi elaborati utilizzando un apposito software che consente di
ottenere una rappresentazione grafica della similarità tra ceppi (dendrogramma). A titolo di
esempio viene riportato in Figura 1 il dendrogramma derivato dall’elaborazione dei profili
RAPD-PCR relativi ai ceppi di Streptococcus thermophilus isolati dai lattoinnesti naturali
liofilizzati considerati nel presente lavoro (lattoinnesto A e B).
La tipizzazione molecolare mediante RAPD-PCR ha consentito di individuare nelle colture
esaminate 14 diversi profili genetici corrispondenti ad altrettanti ceppi di S. thermophilus;
inoltre, è stata rilevata la presenza di più profili e quindi di più ceppi microbici all’interno di
tutte le colture esaminate ad eccezione del lattoinnesto liofilizzato B nel quale è stato
individuato un unico profilo genetico (Tabella 1). Va sottolineato che alcuni dei profili/ceppi
rilevati risultano dominanti o particolarmente frequenti all’interno di una data coltura starter
per cui l’eventuale presenza di fagi attivi nei confronti di questi ceppi potrebbe compromettere
o ridurre l’attività della coltura stessa.
Figura 1 Dendrogramma derivato dalla elaborazione dei profili RAPD-PCR dei ceppi di S .
thermophilus isolati dai lattoinnesti naturali liofilizzati
4
80
90
100
B19
B20
B18
B14
B15
B17
B16
B1
B2
B3
B7
B8
B5
B6
B4
B13
B9
B10
B12
B11
A10
A19
A15
A13
A14
A16
A9
A12
A3
A4
A2
85T
A1
A5
A6
A7
A8
A11
A17
A18
A20
Tabella
1.
Composizione in
profili
Lattoinnesto LI M 27/09, Lattoinnesto S84, StC e StD e lattoinnesti liofilizzati A e B
Profili
A
B
C
D
E
F
G
H
I
L
M
N
O
P
LI
M
27/09
30%
10%
5%
25%
10%
20%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
LI S84
40%
Inf. 5%
Inf. 5%
10%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
10%?
Inf. 5%
Inf. 5%
10%
5%
20%
5%
Comm. St
C
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
20%
10%
70%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Comm.
St D
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
20%
Inf 10%
40%
Inf 10%
Inf 10%
40%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
Inf 10%
LI
liofilizzato A
40%
Inf. 5%
Inf. 5%
45%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
10%
5%
Inf. 5%
Inf. 5%
LI
liofilizzato B
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
Inf. 5%
100%
Inf. 5%
Inf. 5%
Sensibilità/resistenza ai fagi
I ceppi diversi (profili da A a P) isolati dai lattoinnesti naturali liofilizzati (A e B), dai lattoinnesti
preparati in caseificio (LI M27/09 e S84) e dalle colture commerciali (StC e StD) sono stati
valutati per la loro sensibilità/resistenza ai fagi. La prova è stata effettuata in latte mettendo a
contatto i singoli ceppi con aliquote di siero di fine lavorazione proveniente da diverse
produzioni di mozzarella in cui erano stati rilevati dei rallentamenti di acidificazione.
Alcuni dei ceppi esaminati evidenziavano un significativo rallentamento o blocco della loro
attività acidificante, il che suggeriva una possibile inibizione da parte di fagi. Successivi test di
laboratorio (lisi della coltura in terreno liquido, test delle placche di lisi) hanno effettivamente
confermato la presenza di virus. I fagi individuati sono stati successivamente sottoposti a
purificazione e conservati in una collezione di fagi (fagoteca), che potrà risultare utile per la
definizione di un protocollo di rotazione fagica. La rotazione fagica rappresenta tuttora uno dei
più efficaci metodi per la prevenzione e il controllo del problema fago in caseificio. Per stabilire
un adeguato protocollo di rotazione fagica, è necessario disporre di una collezione di fagi da
utilizzare per studiare la sensibilità/resistenza fagica dei ceppi presenti nelle colture naturali e
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selezionate impiegate in caseificio. I fagi isolati nel corso di questo progetto potranno essere in
futuro utilizzati per studiare lo spettro di sensibilità fagica dei ceppi di S. thermophilus presenti
nelle diverse colture adottate dal caseificio e consentire quindi la definizione di una corretta
strategia di rotazione delle colture starter impiegate in lavorazione.
Attività di ricerca 4
Obiettivo
Messa a punto di strategie alternative all’impiego di additivi chimici ad attività antimicrobica
Attività realizzata
Considerata la crescente richiesta commerciale di alimenti privi o a basso contenuto di
additivi chimici è stata introdotta una attività progettuale, il cui obiettivo è stato quello di
individuare dei metodi, di tipo tecnologico, alternativi rispetto all’impiego di additivi chimici ad
attività antimicrobica, in particolare alternativi al lisozima utilizzato nei formaggi per prevenire
il problema del gonfiore tardivo dovuto allo sviluppo di microrganismi gasogeni (clostridi
butirrici).
La sperimentazione ha riguardato il formaggio Grana, ma approcci tecnologici simili potrebbero
essere utilizzati anche in altre tipologie di formaggio, a più breve stagionatura.
Relativamente alla possibile riduzione od eliminazione dell’antimicrobico lisozima utilizzato per
prevenire lo sviluppo dei clostridi butirrici, precedenti studi condotti da Veneto Agricoltura –
Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari hanno accertato l'influenza che la
temperatura di stagionatura e le modalità di salatura del formaggio esercitano sullo sviluppo
delle spore di clostridi nel formaggio ipotizzando sperimentalmente quali potessero essere i
modi e i tempi per effettuare la salatura al fine di contrastare le fermentazioni anomale nei
formaggi studiati, senza alterare in alcun modo le caratteristiche di tipicità dei formaggi
oggetto della sperimentazione.
Viste le caratteristiche dei microrganismi responsabili delle fermentazioni anomale e la loro
sensibilità al sale, appare chiaro che per garantire il mantenimento di una buona qualità del
prodotto, si deve agire oltre che sulla selezione della materia prima e sull’affioramento del
latte, anche sulla distribuzione rapida e uniforme del cloruro di sodio nella pasta. A questo
scopo una delle tesi sperimentali testate nella presente attività progettuale ha previsto
l’effettuazione di lavorazioni a formaggio Grana in cui il cloruro di sodio è stato aggiunto
direttamente in caldaia.
Nel corso della sperimentazione i formaggi a 48 ore sono stati sottoposti a valutazione
analitica allo scopo di determinare l’umidità, il pH, la concentrazione di cloruro di sodio sul tal
quale, la sua distribuzione nella forma e l’eventuale presenza di difetti visivi. A 15 mesi è stata
svolta una seconda indagine sui parametri sopra citati, aggiungendo inoltre l’analisi degli acidi
grassi volatili con l’obiettivo di individuare eventuali fermentazioni anomale.
L’aggiunta di sale direttamente in caldaia
fermentazioni anomale, come evidenziato
stagionato che risulta significativamente
prodotto senza lisozima e paragonabile a
con lisozima.
è risultata agire favorevolmente nel controllo delle
dal contenuto di acidi grassi volatili nel formaggio
inferiore a quello rilevato nel formaggio controllo
quello riscontrato nel formaggio controllo prodotto
L’aggiunta iniziale di sale in caldaia non comporta inoltre differenze significative nel contenuto
in sale rispetto ai campioni controllo in cui la salatura è avvenuta esclusivamente attraverso il
passaggio in salamoia.
Tra le tesi controllo con e senza lisozima e la tesi sperimentale con aggiunta di sale in caldaia
si rileva invece una sensibile differenza nell’indice di maturazione indicante un ritardo nella
maturazione del formaggio sperimentale, ritardo che però non viene percepito all’analisi
sensoriale a cui sono stati sottoposti i campioni.
La tesi sperimentale con aggiunta di sale in caldaia ha consentito di ottenere interessanti
risultati come evidenziato anche dall’esame radiografico delle forme. Le forme classificate
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come “scelto sperlato” (caratteristiche strutturali eccellenti, assenza di qualsiasi difetto) sono
state il 100% per la tesi sperimentale superando il Controllo con lisozima classificato come
“scelto commerciale” (leggerissimi difetti di struttura interna, crosta, sapore e odore adeguati).
L’unico punto di difetto riscontrato nella tesi sperimentale è la colorazione molto più intensa
nella parte centrale della forma, difetto presente già nei primi giorni di produzione e che
persiste durante il processo di maturazione.
Per scoprire la causa e prevenire il difetto rilevato, è stata allestita un’ulteriore tesi
sperimentale nella quale oltre che aggiungere sale in caldaia sono state modificate le
temperature di cottura della cagliata allo scopo di favorire l’attività fermentativa dei batteri
lattici presenti e l’utilizzo del galattosio. Dati di letteratura indicano infatti che il galattosio non
fermentato dai batteri lattici e rilasciato nella pasta del formaggio, può in presenza di alte
temperature determinare la comparsa di macchie di colore rosso-bruno. Un’ulteriore variazione
introdotta nella nuova tesi sperimentale ha riguardato il tipo di caglio utilizzato; per favorire la
proteolisi durante la maturazione ed aumentare così l’indice di maturazione del formaggio è
stato infatti utilizzato un caglio arricchito in pepsina.
Allo scopo di individuare eventuali differenze nelle popolazioni di batteri lattici presenti nei
campioni con o senza difetto di colorazione, i campioni di formaggio sono stati inoltre
sottoposti ad analisi microbiologica e le colonie microbiche ad identificazione e
caratterizzazione molecolare. I risultati ottenuti hanno evidenziato che il campione che
presenta il difetto di colorazione differisce significativamente dai campioni senza difetto in
quanto ha una conta di Lb. fermentum significativamente inferiore. Lb. fermentum metabolizza
il galattosio e si può supporre che la combinazione NaCl-temperatura ne riduca drasticamente
la crescita. Nel campione con difetto è invece presente Lb. delbrueckii lactis (non metabolizza
galattosio) e Lb. helveticus che metabolizza il galattosio, ma probabilmente con velocità
diversa rispetto a Lb. fermentum causando la conseguente permanenza di galattosio non
utilizzato e la comparsa del difetto di colorazione.
Si può ritenere che con una adeguata selezione di ceppi di batteri lattici resistenti al NaCl e
dotati di un’intensa attività metabolica a carico del galattosio sia possibile eliminare il difetto
di colorazione dovuto dalla caramellizazione del galattosio residuo che resta per molteplici ore
a temperature superiori ai 50 °C nel centro della forma.
L’impiego quindi di una adeguato sieroinnesto e l’applicazione del protocollo sperimentale che
prevede l’aggiunta di sale in caldaia ed una riduzione della temperatura di cottura della
cagliata potrebbe rappresentare un innovativo approccio tecnologico per prevenire lo sviluppo
di fermentazioni anomale senza che sia necessario aggiungere lisozima. Il successo di tale
tecnica in un formaggio a grande pezzatura e a lunga stagionatura come il Grana, può
diventare stimolo per una applicazione della medesima tecnologia anche in altre tipologie di
formaggi, a più breve stagionatura e di pezzatura più piccola.
Attività di ricerca 5
Obiettivo
Messa a punto di colture autoctone starter per la produzione di Casatella Trevigiana mediante
lattoinnesti naturali liofilizzati
Attività realizzata
La tipicità dei formaggi DOP e tradizionali è influenzata oltre che dalle caratteristiche del latte e
dalla tecnologia di produzione, anche dalle colture microbiche naturali (lattoinnesti o
sieroinnesti) tradizionalmente utilizzati nella produzione di questi formaggi. Diversi lavori
scientifici relativi agli aspetti microbiologici e biotecnologici delle produzioni casearie
tradizionali e DOP, suggeriscono infatti che le caratteristiche dei prodotti ottenuti e l’originale
qualità che diventa anche tipicità e pregio commerciale, possano essere influenzate dalle
peculiari attività biochimico-enzimatiche dei microrganismi che partecipano alla trasformazione
del latte in formaggio e alle successive fasi di maturazione. L’attività realizzata in questo
progetto ha previsto lo studio delle flore microbiche presenti nei lattoinnesti naturali utilizzati
nella produzione di Casatella Trevigiana DOP e ha valutato la possibilità di riprodurre queste
colture in forma liofilizzata. La possibilità per i caseifici di disporre di colture naturali in forma
liofilizzata prontamente utilizzabii in lavorazione, anziché ricorrere giornalmente alla loro
produzione in latte o siero, rappresenta un’importante innovazione tecnologica. La procedura di
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preparazione giornaliera delle colture naturali risulta infatti laboriosa e soprattutto non
garantisce costanza di caratteristiche di composizione e di attività.
I lattoinnesti liofilizzati sono stati preparati utilizzando lattoinnesti naturali sviluppati presso il
caseificio di Soligo e selezionati in base alla loro capacità acidificante in latte e alla loro
qualità microbiologica.
L’analisi microbiologica ha previsto la verifica del loro eventuale grado di contaminazione con
microrganismi indesiderati come coliformi, stafilococchi coagulasi positivi, enterococchi, lieviti e
muffe.
Il processo di liofilizzazione ha riguardato solo i lattoinnesti caratterizzati da una buona qualità
microbiologica ed una elevata attitudine all’acidificazione.
I lattoinnesti liofilizzati sono stati impiegati in produzioni sperimentali di Casatella Trevigiana
effettuate presso la Latteria di Soligo.
Contemporaneamente, sono stati isolati e studiati batteri lattici presenti nei lattoinnesti e nella
Casatella Trevigiana con lo scopo di:
1. caratterizzare le popolazioni microbiche tipiche di questo formaggio;
2. individuare ceppi da utilizzare eventualmente come colture di integrazione al lattoinnesto.
Dai lattoinnesti naturali e da campioni di formaggio Casatella Trevigiana preparato con
lattoinnesto naturale sono state isolate e successivamente purificate colonie di presunti
Streptococcus thermophilus e di lattobacilli.
Gli isolati sono stati sottoposti ad analisi molecolare allo scopo di individuare le specie e i ceppi
presenti ed ottenere una “fotografia” della biodiversità microbica che caratterizza i lattoinnesti
naturali tradizionalmente utilizzati nella produzione di Casatella Trevigiana. I ceppi identificati
come S. thermophilus o come lattobacilli termofili sono stati infine valutati per alcune
caratteristiche di interesse tecnologico importanti per una loro successiva eventuale
applicazione nella produzione di Casatella Trevigiana.
Risultati
a) valutazione microbiologica lattoinnesti e formaggi. Studio delle caratteristiche di
acidificazione dei lattoinnesti
Tutti i lattoinnesti, prelevati in diversi momenti stagionali (ottobre, novembre, aprile e luglio),
evidenziano buona attitudine all’acidificazione sia in termini di velocità di acidificazione che di
pH raggiunto dopo 16 ore di incubazione anche se va segnalata una minore velocità di
acidificazione in alcuni campioni.
Tutti i campioni presentano numeri elevati di streptococchi termofili, mentre in un unico
lattoinnesto è stata rilevata la presenza di presunti lattobacilli termofili (100 ufc/ml).
b) Studio della biodiversità microbica: caratterizzazione molecolare dei
microrganismi isolati dai lattoinnesti e dai formaggi
Dai campioni esaminati sono state isolate 147 colonie di presunti streptococchi termofili e 40
colonie di presunti lattobacilli termofili. I ceppi sono stati sottoposti a caratterizzazione
molecolare utilizzando la metodologia molecolare RAPD-PCR che permette di ottenere profili
genetici (paragonabili a dei codici a barre) caratteristici per ciascun microrganismo.
E’ stato così possibile identificare i microrganismi in esame ed evidenziare la biodiversità
genetica presente all’interno delle popolazioni microbiche che caratterizzano questo formaggio
DOP. Ad eccezione di alcuni ceppi classificati nell’ambito della specie Streptococcus
macedonicus, la maggior parte dei ceppi isolati dai lattoinnesti naturali è risultata ascrivibile
alla specie S. thermophilus. Nell’ambito di questa specie la RAPD-PCR ha individuato la
presenza di diversi profili genetici corrispondenti ad altrettanti ceppi diversi. E’ inoltre
interessante sottolineare la presenza di alcuni profili e quindi di alcuni ceppi ricorrenti, presenti
in campioni di lattoinnesto o formaggio prelevati in diversi momenti stagionali.
c) Valutazione dell’attività acidificante dei ceppi isolati
Lo studio dell’attività acidificante, effettuato in latte di alta qualità, ha consentito di individuare
ceppi con diversa attività sia in termini di velocità di acidificazione (Vm) che di pH finale.
Nell’ambito della specie S. thermophilus si individuano infatti sia ceppi ad elevata attività
acidificante, sia ceppi scarsamente acidificanti o con caratteristiche intermedie.
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d) Preparazione di lattoinnesti liofilizzati
Nel corso del progetto sono stati sottoposti a liofilizzazione i lattoinnesti che avevano
evidenziato buona attitudine all’acidificazione e buona qualità microbiologica.
Per verificare la composizione dei lattoinnesti liofilizzati e verificare l’effetto del processo di
liofilizzazione sulla loro composizione, sono state prelevate 20 colonie da ognuno dei
lattoinnesti liofilizzati. Dopo purificazione le colonie sono state sottoposte a RAPD-PCR. I profili
ottenuti sono stati confrontati con i profili RAPD-PCR corrispondenti ai ceppi rilevati nei
lattoinnesti naturali da cui erano derivati i suddetti lattoinnesti liofilizzati.
e) Produzioni sperimentali di Casatella Trevigiana
Due lattoinnesti liofilizzati derivati dai lattoinnesti naturali studiati nel corso del progetto
(lattoinnesto naturale del 17-10-06 e lattoinnesto naturale del 18-07-07) sono stati utilizzati in
alcune produzioni di Casatella Trevigiana presso la Latteria di Soligo. Non sono stati
evidenziati problemi nel corso del processo di caseificazione, così come non sono stati
identificati difetti nei prodotti ottenuti. Di seguito vengono riassunti i risultati della valutazione
sensoriale effettuata presso il Laboratorio di Analisi Sensoriale di Veneto Agricoltura,
valutazione sensoriale che ha riguardato prodotti ottenuti con i lattoinnesti liofilizzati e prodotti
“controllo” preparati con un fermento selezionato o con un lattoinnesto naturale prodotto in
caseificio.
La seguente tabella riassume gli ordinamenti di preferenza di 28 giudici per i 4 campioni di
casatella oggetto di analisi:
Rank
1
2
3
4
Totale
Lotto 1321 (
Lotto 1421
Lotto 1521
Controllo con
(Controllo con LI
(prova con LI
fermento
naturale
liofilizzato del
commerciale)
“selvaggio”)
17-10-06)
7
0
12
8
6
7
8
9
4
5
13
5
28
28
28
Tabella 2: Riepilogo dei risultati
Lotto 1621
(prova con LI
liofilizzato del
18-07-07
9
7
7
5
28
Il rank 1 indica quante volte ciascun campione è stato posizionato al primo posto; il rank 2
indica invece quante volte ciascun campione ha occupato la seconda posizione, il rank 3 il
numero di volte che ciascun campione è stato collocato terzo fra i quattro, così la quarta
posizione occupata da ciascun campione è indicata nel rank 4 .
I risultati sono stati elaborati applicando il Test di Friedman, dal momento che l’ordine di
preferenza dei campioni non poteva essere conosciuto a priori.
Il Test di Friedman consente di dimostrare l'esistenza o meno di differenze tra i campioni.
Friedman test
Somma dei Ranks
F
corrected F
Significance (F)
Significance (corrected F)
20230,0
13,5000
13,5000
0,0037**
0,0037**
Tabella 3: Risultati del Friedman Test
In questo caso, come indicano i valori di significatività riportati nella tabella 3, risulta esserci
una differenza significativa tra gli ordinamenti dei prodotti valutati, ad un livello di probabilità
del 95%; questo significa che i 4 campioni sono stati diversamente graditi dai giudici.
9
Per stabilire la misura delle differenze esistenti tra i campioni, è stato applicato il test LSD
(Least Significant Different), avendo scelto un rischio α dello 0.05%, dove α è la probabilità di
concludere che esiste una differenza quando in realtà non esiste.
Somma dei
Gruppi
Ranks
1421
91
A
1321
67
AB
1621
64
B
1521
58
B
Tabella 4: Risultati del Test LSD
Campioni
Le lettere stanno ad indicare diversi livelli di preferenza; in particolare il prodotto 1421
differisce, in relazione alla preferenza, dai prodotti 1621 e 1521, mentre il prodotto 1321 si
colloca in una posizione intermedia rispetto agli altri campioni anche se, come sottolineano le
distanze (24 punti da 1421, 3 punti da 1621 e 9 punti da 1521), risulta trovarsi in una
condizione più simile ai campioni dei lotti 1621 e 1521.
Altra cosa da sottolineare è che le somme dei rank devono essere lette al contrario, nel senso
che più un punteggio è basso più il prodotto è stato preferito; pertanto il prodotto 1521 è
risultato essere preferito dal panel, seguito subito dopo dal prodotto 1621, quindi dalla
casatella 1321 e infine dalla casatella 1421. Va ricordato che i lotti 1521 e 1621 corrispondono
rispettivamente ai prodotti ottenuti con i lattoinnesti liofilizzati derivati dai lattoinnesti naturali
del 17-10-06 e del 18-07-07.
Nella tabella 5 sono indicate le posizioni occupate dai campioni alla fine della valutazione e le
motivazioni fornite dai giudici:
Ordine di preferenza
1° (più gradito)
Casatella lotto 1521
2°
3°
4°( meno gradito)
Casatella lotto 1621
Casatella lotto 1321
Casatella lotto 1421
Osservazioni
Cremoso, leggermente acido, buona struttura in
bocca
Cremoso, adesivo, leggermente troppo salato
Troppo salato, acido, presenza di grumi
Troppo proteolizzato, struttura non omogenea
causa presenza di grumi, eccessivamente acido,
amaro
Tabella 5: Ordine di preferenza
Considerazioni conclusive
Il lavoro effettuato ha consentito di individuare una notevole biodiversità nell’ambito delle
popolazioni di streptococchi termofili presenti nel lattoinnesto naturale per Casatella Trevigiana
prodotto presso la Latteria di Soligo. Sono stati comunque rilevati dei profili genetici e quindi
dei ceppi ricorrenti nelle diverse produzioni considerate. Dai lattoinnesti naturali sono stati
prodotti dei lattoinnesti liofilizzati, che testati in lavorazione, hanno consentito di ottenere
prodotti con caratteristiche organolettiche interessanti e sicuramente positive. L’impiego di
lattoinnesti liofilizzati, derivati dai lattoinnesti naturali tradizionali, potrebbe rappresentare una
alternativa alla preparazione del lattoinnesto naturale. Il lattoinnesto liofilizzato oltre che
essere di più pratico utilizzo, risulta sicuramente più stabile e controllato rispetto ad un
lattoinnesto naturale. Inoltre, essendo derivato dal lattoinnesto naturale, mantiene comunque
parte della biodiversità propria dei lattoinnesti naturali, garantendo quindi le caratteristiche di
complessità organolettica che caratterizzano i formaggi ottenuti con i lattoinnesti naturali
rispetto ai formaggi preparati con colture starter selezionate.
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