Artemisia arborescens - Accademia delle arti erboristiche
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Artemisia arborescens - Accademia delle arti erboristiche
La variazione della composizione degli oli essenziali e la loro attività biologica: Artemisia arborescens (dallo stadio vegetativo alla fine della fioritura). Luigi Ornanoa, Alessandro Vendittia, Mauro Balleroa, Cinzia Sannaa, Luana Quassintib, Massimo Bramuccib, Giulio Lupidib, Fabrizio Papab, Sauro Vittorib, Filippo Maggib, Armanodoriano Biancoa. a Consorzio Interuniversitario CoSMeSe, Dipartimento di Scienze Botaniche, Università di Cagliari, Dipartimento di Chimica, Università di Roma “La Sapienza”. b School of Pharmacy, University of Camerino, Camerino, Italy. Introduzione In questo lavoro ci si è proposti di effettuare l’ analisi fitochimica dell’ Artemisia arborescens, con particolare riguardo all’analisi degli oli essenziali e l’attività biologica da essi espressa. L’organismo vegetale è stato raccolto nel nord dell’isola della Sardegna, precisamente nella zona a nord-ovest dell’ isola di La Maddalena. In questo lavoro, l’organismo vegetale è stato raccolto in tre periodi differenti, al fine di poter studiare la composizione degli oli essenziali in relazione allo stato vegetato, all’inizio della fioritura e alla fine di questa. Gli oli essenziali ottenuti appartengono al chemotipo βthujone/chamazulene, in particolare con la più alta quantità di camazulene (~ 52%) rilevata fino ad ora in A. arborescens. Il ciclo fenologico è in stretta relazione con la composizione quantitativa degli oli essenziali e rappresenta il passaggio da uno stadio vegetativo alle fasi di fioritura dell’organismo vegetale oggetto di studio. L’olio essenziale è stato sottoposto a test di attività biologica come antiproliferativo, ovvero come inibitore di crescita su: cellule tumorali di glioblastoma T98G, MDA-MB adenocarcinoma mammario 435s, A375 melanoma maligno, e HCT116 colon carcinoma di linee cellulari umane, mediante saggio MTT. La più alta attività è stata osservata su A375 e HCT116 linee cellulari, con valori di IC50 di 14,28 e 14,62 mg / ml, rispettivamente. Inoltre è stata valutata l’attività di radical scavenger mediante l’inibizione contro i radicali DPPH e ABTS; dall’analisi di tali test l’olio si è rivelato un efficace antiossidante con attività paragonabile a quella del Trolox. Questi risultati supportano l'uso dell'olio nel trattamento dell’infiammazione della pelle. È stata eseguita l’analisi della frazione polare, per la prima volta in questo organismo vegetale, il componente principale isolato ed identificato è stato l’acido 5-O-caffeoil-chinico. Analisi dell’ olio essenziale L’ Artemisia arborescens è un arbusto cespuglioso, cresce in ambienti ruderali, nella parte meridionale del bacino del Mediterraneo, in terreni calcarei. È poco utilizzato nella medicina popolare , non è inclusa nella farmacopea europea. L’ Artemisia arborescens è una composita fruticosa che in Sardegna, assume una notevole importanza nella caratterizzazione del paesaggio dato che si presenta abbondantemente diffusa riuscendo a colonizzare ambienti assai diversi. La composizione degli oli essenziali è stata ottenuta dalle parti aeree dell’ A.arborescens raccolte nei tre periodi sopracitati, riportando un totale di cinquantotto componenti volatili, corrispondenti al 87.4-96.1% dell’olio ottenuto per distillazione in corrente di vapore. La frazione più abbondante è rappresentata dalla classe dei sesquitepeni (32.0-55.3%) e dei monoterpeni ossigenati (37.7-57.7%), il chamazulene (25.6-51.5%) e il β-thujone (33.8-53.20%) sono rispettivamente i maggiori componenti. Gli altri componenti, prensenti in bassa percentuale(>1%) sono stati il germacrene D (3.2-5.4%) e il (E)-caryophyllene (0.4-2.7%) fra i sesquiterpeni, e il 4-terpineolo (0.6-1.4%) fra i monoterpeni ossigenati. Nonostante l’abbondanza dell’isomero cis del thujone (forma -β), la forma trans (α-thujone) era presente in piccola percentuale (0.6-1.0%). È risultata importante nell’olio essenziale la presenza di un diterpene sconosciuto (2.7-7.7%) (MW=286), il cui spettro di frammentazione MS è attualmente oggetto di studio. L’ α- e β-thujone sono chetoni psicotropici, tipici anche di altre specie del genere Artemisia, degno di nota è l’impiego come assenzio (A. absinthium), la quale è impiegata per produrre bevande alcoliche (Leung & Foster, 1996). Il limite d’impiego è legato alla loro tossicità elevata, in Europa il livello massimo di thujone nelle bevande alcoliche ed analcoliche è fissato tra 35 e 0.5 mg/kg, ripsttivamente (Regulation EC No 1334/2008). Recentemente, molte riviste hanno riportato nuove attività farmacologiche legate a tali componenti in relazione al loro profilo lipidico (cholesterol and triglycerides) in diabetic rats (Baddar, Aburjai, Taha & Disi, 2011), in grado di inibire le metastasi delle cellule B16F-10 (Siveen & Kuttan, 2011a) ed incrementare la risposta immunitaria dei ratti. (Siveen & Kuttan, 2011b). Il chamazulene è un composto azulenico, prodotto dalla degradazione della matricina prodotta nelle foglie di camomilla (Matricaria recutita), essa è responsabile del colore blu intenso del distillato ottenuto dalle foglie. Il Chamazulene è una delle molecole più attive presenti nella camomilla. Degna di nota è l’attività antinfiammatoria in vivo per inibizione della sintesi dei leucotrieni (Safayhi, Sabieraj, Sailer & Ammon, 1994); l’inibizione della perossidazione lipidica (Rekka, Kourounakis & Kourounakis, 1996). Il chamazulene risulta essere uno dei maggiori costituenti degli oli essenziali di altre specie del genere Artemisia, a riguardo: A. absinthium, A. arborescens, A. rehan, A. santonicum, A. copa, A. feddei (Abegaz & Yohannes, 1982; Sacco, Frattini & Bicchi, 1983; Lopez Arze, Collin, Garneau, Jean & Gagnon, 2004; Kordali, Cakir, Mavi, Kilic & Yildirim, 2005; Cha, Jung, Kil & Lee, 2007). In tali oli essenziali, il chamazulene risulta essere sempre tra i maggiori costituenti, il campione da noi analizzato costituenti, (51.5%), oltre essere tra i maggiori ha presentato un valore elevato mai riportato prima. La comparazione della composizione degli oli essenziali ottenuti nei tre tempi di raccolta, Agosto, Febbraio e Giugno, ci ha permesso di rivelare significanti differenze nella composizione molecolare. Il più alto contenuto di chamazulene (51.5%) è stato ricavato in tarda estate (Agosto), mentre il β-thujone (53.2%) ha presentato il suo maggiore contributo all’inizio dell’estate (Giugno). Gli oli essenziali ottenuti ad Agosto hanno mostrato essere ricchi di sesquiterpeni (55.3%), mentre quelli ricavati in Giugno risultano ricchi di monoterpeni ossigenati. In entrambi i casi il peso di tali percentuali è discriminato dalla presenza di chamazulene e di β-thujone, in quanto essi forniscono il maggior contributo. Rispetto al campione raccolto in Febbraio, i campioni di Giugno ed Agosto mostrano il più basso contributo di sesquiterpeni ossigenati (0.4-0.5 vs 3.1%) e diterpeni (2.9-3.9 vs 8.6%). Dal punto di vista qualitativo, l’olio ottenuto a fine estate (Agosto) ha presentato un minor numero di componenti rispetto al campione ottenuto a Febbraio e a Giugno, infatti sono stati rivelati solo 23 componenti rispetto a 50 e 47 rivelati rispettivamente degli stadi di raccolta precedentemente definiti. Tali differenze possono essere spiegate tenendo conto del fatto che in tali specie Mediterranee la componente volatile risulta incrementata durante i primi mesi dell’anno fino al massimo che corrisponde al periodo di fioritura (inizio estate), superato tale periodo la pianta subisce una deidratazione con conseguente perdita della frazione volatile. Precedentemente, la componente volatile dell’ A. arborescens colta nell’isola di La Maddalena (Sardegna), è stata investigata da Biondi and coll. (2000). Sorprendentemente, la composizione dell’olio essenziale riportata si discosta molto da quella eseguita in questo lavoro. Biondi and coll. Ottennero l’olio essenziale per idrodistillazione dalle parti aeree (foglie e fiori) e hanno riportato come maggiori costituenti: canfora (45.1%), isoborneolo (14.6%), e α-thujone (17.7%). Canfora (13.0%) e β-caryophyllene (16.2%) come i maggiori costituenti, rispettivamente. Nel campione di olio essenziale da noi analizzato canfora e isoborneolo sono risultati totalmente assenti. Un altro fatto sorprendente riguarda il chamazulene, in tutti i precedenti studi non è stato rivelato mentre in questo lavoro risulta tra i maggiori costituenti. In aggiunta è stata riscontrata la presenza di una frazione diterpenica sconosciuta e che costituisce un’importante percentuale del campione analizzato. Nonostante il numero di componenti rilevati era simile, solo 16 erano in comune tra i due studi. Tra questi β-thujone è risultato il principale rappresentante nei nostri campioni, mentre α-tujone (0,6-1,0%) non ha raggiunto gli alti livelli riportati nel lavoro precedente (17,7%). Tali differenze confermano che il genere Artemisia mostra un'elevata variabilità sia a livello intraspecifico che interspecifico con chemiotipi diversi (Militello, Carrubba e Blázquez, 2012). La popolazione studiata sembra appartenere a un tipo β-thujone/chamazulene, quindi molto diverso dal tipo canfora/isoborneolo riportato in precedenza (Biondi, Valentini e Bellomaria, 2000). Quest'ultimo era di una popolazione in crescita nella stessa zona ristretta della Sardegna in cui è localizzata questa specie. Pertanto, altre indagini di diverse popolazioni sarde sono necessari per chiarire la presenza di chemiotipi diversi all'interno di questa taxon endemica localizzata. Figura 1. Chamazulene e β-thujone. Tabella 1. Composizione dell’Olio Essenziale delle parti aeree dell’ A. arborescens. N. Component 1 α-pinene a LRI lit.c Calc. LRIb Adams Nist 08 932 939 932 August 2011 %d February 2012 Tr f 2 sabinene 971 975 972 3 β-pinene 974 979 974 4 6-methyl-5-hepten-2-one 991 985 5 myrcene 991 990 991 6 α-phellandrene 1003 1002 1003 7 isobutyl 2-methylbutyrate 1004 8 α-terpinene 1017 9 iso-amyl iso-butyrate 1021 10 p-cymene 1026 1024 1026 11 β-phellandrene 1030 1029 1029 12 1,8-cineole 1033 1031 1033 13 γ-terpinene 1061 1059 1061 14 isopentyl butanoate 1065 1058 1064 15 cis-sabinene hydrate 1069 1070 1070 16 terpinolene 1087 1088 1087 17 trans-sabinene hydrate 1097 1098 18 α-thujone 1102 1102 19 2-methyl butyl-2-methyl butyrate 1107 1100 20 21 β-thujone iso-3-thujanol 1114 1136 1114 1138 22 trans-sabinol 1141 1142 23 terpinen-4-ol 1176 24 α-terpineol 25 methyl salicylate 26 myrtenol 27 (3Z)-hexenyl 2-methyl butanoate 28 thymol, methyl ether 1237 1235 1237 Tr 29 cumin aldehyde 1239 1241 1239 Tr 1235 0.1 0.1 1004 1017 1017 Tr 1021 0.1 June 2012 0.2 IDe Std 1.3 RI,MS 0.1 Std 0.1 RI,MS 0.1 Std 0.3 Std Tr RI,MS 0.2 Std 0.1 RI,MS 0.2 Std Tr RI,MS 0.1 0.2 Std 0.1 0.4 Std Tr RI,MS Tr 0.6 RI,MS Tr 0.1 Std Tr Tr 0.1 RI,MS 1102 0.6 1.0 1.3 Std 1107 0.1 0.2 0.7 RI,MS 1114 38.0 0.1 33.8 0.2 53.2 0.2 Std RI,MS Tr 0.1 Tr RI,MS 1177 1175 0.6 1.4 1.0 Std 1190 1188 1190 0.2 0.6 0.6 Std 1192 1191 1192 1194 1195 1194 1237 1232 0.1 Tr RI,MS Tr Tr Tr 30 (3Z)-hexenyl 3-methyl butanoate 1241 31 2,3-dimethoxytoluene 1245 Tr 32 carvotanacetone 1247 1247 1247 0.1 33 perilla aldehyde 1271 1271 1271 0.3 34 eugenol 1358 1359 1358 35 α-copaene 1370 1376 1370 0.1 36 β-bourbonene 1377 1388 1377 0.1 37 β-cubebene 1384 1388 1245 Std Tr RI,MS RI,MS Tr RI,MS Tr RI,MS 0.2 RI,MS RI,MS 0.2 RI,MS 0.5 0.4 RI,MS 0.3 0.1 RI,MS 1384 Tr Tr RI,MS Tr Std 38 β-elemene 1387 1390 1387 0.3 RI,MS 39 (Z)-jasmone 1397 1392 1397 Tr RI,MS 40 methyl eugenol 1409 1403 1409 0.2 0.2 0.2 RI,MS 41 (E)-caryophyllene 1409 1419 1411 0.4 2.7 1.3 Std 42 β-copaene 1421 1432 43 α-humulene 1445 1454 1444 44 selina-4(14),7(11)-diene 1469 45 46 germacrene D β-selinene 1473 1477 1485 1490 1473 1477 47 γ-himachalene 1480 1482 1480 Tr 1469 0.1 Tr RI,MS 0.2 0.1 Std 4.3 Tr RI,MS RI,MS 0.1 3.2 5.4 0.7 RI,MS 0.1 RI,MS 48 bicyclogermacrene 1487 1500 1487 Tr 0.2 0.1 RI,MS 49 δ-cadinene 1517 1523 1518 Tr 0.2 0.1 RI,MS 50 elemol 1544 1549 1544 0.4 0.3 0.4 RI,MS 51 caryophyllene oxide 1572 1583 1572 0.5 0.1 Std 52 neryl isovalerate 1585 1583 Tr 0.1 Tr RI,MS 53 geranyl 2-methyl butanoate 1603 1601 Tr 0.3 0.1 RI,MS 54 geranyl isovalerate 1610 1607 0.4 1.8 1.0 RI,MS 55 junenol 1615 1619 1613 0.4 RI,MS 56 (Z)-methyl jasmonate 1647 1649 1652 0.3 0.1 RI,MS 57 α-bisabolol 1679 1685 1680 0.1 Tr RI,MS 58 59 chamazulene unknown diterpene (MW 286)g 1718 1997 1731 1718 51.5 Tr 34.2 0.7 25.6 0.2 RI,MS MS 60 61 unknown diterpene (MW 286)g 2005 2082 3.9 7.7 0.2 2.7 MS MS 96.1 87.4 95.9 0.4 2.9 unknown diterpene (MW 300)g Total identified (%) Grouped compounds (%) Monoterpene hydrocarbons a Oxygenated monoterpenes 40.0 37.7 57.7 Sesquiterpene hydrocarbons 55.3 45.2 32.0 Oxygenated sesquiterpenes 0.4 3.1 0.5 Diterpenes 3.9 8.6 2.9 Others 0.3 1.0 2.3 Compounds are listed in order of their elution from a HP-5MS column. Linear retention index on HP-5MS column, experimentally determined using homologous series of C8-C30 alkanes. c Relative linear retention index taken from Adams (2007) and/or NIST 08 (2008) libraries. d Percentage values are means of three determinations ± standard deviation. e Identification methods: std, based on comparison with authentic compounds; MS, based on comparison with WILEY, ADAMS and NIST 08 MS database; RI, based on comparison of LRI with those reported in ADAMS and NIST 08. f Tr, % below 0.1%. g Tentative identification based on MS fragmentation pattern. b L’attività biologica degli oli essenziali dell’ A. arborescens Attività antiproliferativa L'olio essenziale di A. arborescens (campione di Febbraio) è stato sottoposto a test vitro allo scopo di valutare l'effetto potenziale inibitorio sulla crescita delle cellule tumorali su determinate linee cellulari, quali: la linea cellulare T98G glioblastoma, la linea MDA MB-435s umana adenocarcinoma mammario, linea cellulare A375 umano ,linea cellulare di melanoma maligno, linea cellulare HCT116 umano, linea cellulare di carcinoma del colon, mediante saggio MTT. I risultati mostrano che l'olio essenziale presenta un variabile effetto inibitorio sulle cellule tumorali umane esaminate. I dati mostrano che la più alta attività è stata osservata su linee cellulari A375 e HCT116, con valori di IC50 di 14,28 ± 2,53 mcg / ml e 14,62 ± 1,79 mcg / ml, rispettivamente. È stata ottenuta una bassa attività sulla T98G, con valore IC50 di 59,82 ± 1,76 mcg / ml. L'attività citotossica di olio essenziale di A. arborescens è stata attribuita a componenti specifici del petrolio. I principali composti presenti nell'olio essenziale sono thujone (33,8%), chamazulene (34,2%), e germacrene D (5,4%). Vi sono pochi dati in letteratura relativi ad attività citotossica di questi composti. E 'stato riportato che un estratto ricco di tujone di Thuja occidentalis esercita attività citotossica, antiproliferativa e apoptotica sulla linea cellulare di melanoma maligno A375 (Biswas, Mandal, Dutta, Bhattacharyya, Boujedaini e Khuda-Bukhsh, 2011). Inoltre, il thujone può inibire la metastasi polmonare di linea cellulare di melanoma topo B16F-10, attraverso l'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali, adesione, e l'invasione (Siveen & Kuttan, 2011). La presenza di thujone nell'olio essenziale può parzialmente spiegare l'attività citotossica sulla linea cellulare di melanoma umano. Attività antiproliferativa del germacrene D su linee cellulari contro la MDA-MB 231, MCF7, Hs578T, PC-3 e Hep-G2 è stata riportata da Setzer et al. (2006). In letteratura non sono disponibili dati in relazione alla citotossicità del chamazulene. Tabella 2. Test di citotossicità in vitro dell’olio essenziale delle parti aeree dell’ A. arborescens. HCT 116 Essential oil c 14.62 ± 1.79 Cell line (IC50a µg/mL ± SDb) MDA-MB 435Sd T98Ge 27.79 ± 3.17 59.82 ± 1.76 A375f 14.28 ± 2.53 Reference Cisplatin 2.29 ± 0.1 7.37 ± 0.63 2.34 ± 0.13 0.18 ± 0.02 a IC50 = The concentration of compound that affords a 50% reduction in cell growth (after 72 h of incubation). b SD = Standard deviation of four determinations. c Human colon carcinoma cell line. d Human breast adenocarcinoma cell line. e Human glioblastoma multiforme cell line. f Human malignant melanoma cell line. Attività Antiossidante L'olio essenziale di A. arborescens (campione Febbraio) ha presentato una rapida ed efficace attività di scavenger contro le ABTS radicali, tale attività è risultata paragonabile a quella del Trolox. Il valore di IC50 è stato 21,9 µ g / ml di olio essenziale rispetto al 15,1 µ g / ml del Trolox. L’attività di Scavenging è un attributo importante per le sostanze antiossidanti. ABTS, uno Scavenging Protone-radicale presenta la caratteristica assorbanza massima a 734 nm, che diminuisce con l'evacuazione dei radicali- protone (Mathew & Abraham, 2006). Il lavaggio dei ABTS + radicale da olio essenziale di A. arborescens è risultato essere molto maggiore di quella nei confronti del radicale DPPH. Fattori come stereoselettività dei radicali o la solubilità dei campioni di prova in sistemi diversi sono stati segnalati per influenzare la capacità di campioni di reagire togliere i radicali diversi (Yu, Haley, Perret, Harris, Wilson & Qian, 2002). Wang e collaboratori (Wang, Li, Rangarajan, Shao, La Voie, e Huang Ho, 1998) ha rilevato che alcuni composti che hanno attività ABTS+ scavenging non ha mostrato inibizione nei confronti del DPPH radicale. Il potenziale antiossidante dell'olio è stato stimato dalla sua capacità di ridurre TPRZ-Fe (III)-TPTZ complesso Fe (II). La riduzione ferrico / potere antiossidante (FRAP assay) è ampiamente utilizzata nella valutazione del potenziale antiossidante dei polifenoli alimentari e attività antiossidante aumenta proporzionalmente al contenuto di polifenoli. Il valore FRAP riportato per l'olio di A. arborescens è stato di 147,7 (± 2,8) TE umol / g, relativamente più elevata rispetto a quella del Trolox (399,53 mmol / g). Sulla base di questi dati si può concludere che l'olio essenziale di A. arborescens presenta elevata capacità di scavenging o come inibitore di radicali liberi così come un antiossidante primario reagisce con i radicali liberi, che possono limitare i danni dei radicali presente nel corpo umano. Tabella 3. Contenuto fenolico totale e capacità totale antiossidante dell’olio essenziale di A. arborescens. Essential oils Total Phenols mgGAE/ ml/gr DPPH TEAC µmol TE/g 93 ± 8 Control Trolox ABTS FRAP IC50 µg/ml TEAC µmol TE/g IC50 µg/ml TEAC µmol TE/g >200 2696 ±2.9 21.9 ± 0.3 147.7 ± 2.8 4.36 ±0.3 15.1 ± 0.4 TEAC=trolox equivalent (TE) antioxidant concentration Analisi della frazione polare dell’estratto idroalcolico Le parte aeree di campioni di A.arborescens , raccolti nei periodi precedentemente messi in evidenza, sono stati sottoposti ad analisi della frazione polare non volatile. Gli estratti grezzi sono stati purificati per via cromatografica (cromatografia su colonna); le frazioni raccolte sono state analizzate per via cromatografica (TLC); le frazioni riunite sono state investigate attraverso la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare al protone (1H-NMR) al carbonio-13 (13C-NMR) e mediante la spettrometria di massa (ESI-MS); tali analisi ci hanno permesso di individuare la presenza dell’acido 5-O-caffeoil chinico; mediante il confronto con un campione di riferimento è stato possibile confermare la sua identificazione. Figura 3. Acido 5-O-caffeoil-chinico (acido neoclorogenico) . Conclusioni Sulla base della nostra ricerca, l'olio essenziale di una popolazione sarda di A. arborescens appartiene al chemotipo β-thujone/chamazulene, ha prodotto un largo interesse per le applicazioni nel trattamento infiammatorio della pelle e per malattie intestinali o come potenziale agente antitumorale e antiossidante. Ulteriori sperimentazioni farmacologiche sono in ogni caso necessarie. Bibliografia: Abegaz, B., & Yohannes P. G. (1982). Constituents of the essential oil of Artemisia rehan. Phytochemistry, 21, 1791-1793. Adams, R. P. (2007). Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. Allured Publishing Co., Carol Stream, IL. Baddar, N. W. A.-H., Aburjai, T. A., Taha, M. O., & Disi, A. M. (2011). Thujone corrects cholesterol and triglyceride profiles in diabetic rat model. Natural Product Research, 25, 18801884. Biondi, E., Valentini, G., & Bellomaria, B. (2000). Essential Oil of Some Halophyle and Subhalophyle Taxa Artemisia L. from the Central European Mediterranean. Journal of Essential Oil Research, 12, 365-371. Biswas, R., Mandal, S. K., Dutta, S., Bhattacharyya, S. S., Boujedaini, N., & Khuda-Bukhsh, A. R. (2011). Thujone-Rich Fraction of Thuja occidentalis Demonstrates Major Anti-Cancer Potentials: Evidences from In Vitro Studies on A375 Cells. 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