Intervento dott.ssa N. Arrigoni

CORSO DI AGGIORNAMENTO:
“FOOD BORNE DISEASE E ARBOVIRUS DISEASE
Aspetti epidemiologici e prospettive in Sanità Pubblica Veterinaria”
Folgaria, 24 febbraio 2010
Mycobacterium avium paratuberculosis
come potenziale agente zoonosico
Norma Arrigoni
Centro Referenza Nazionale Paratubercolosi
IZSLER Sezione di Piacenza
1
Sommario
…
Map e CD (Crohn’s Disease, Malattia di Crohn)
Storia
„ Clinica
„ Ipotesi ezio-patogenetiche
„
…
…
…
Map e altre patologie (diabete mellito Tipo 1)
Possibili veicoli di Map per l’uomo
Conclusioni
IZSLER CRN Paratubercolosi
2
Malattia di Crohn (CD)
„
Crohn, 1932 : 1° descrizione come patologia distinta da TBC intestinale
„
Malattia infiammatoria di tutto l’intestino, soprattutto ileo e del colon
„
Lesioni intestinali transmurali con granulomi e aggregati linfoidi
„
Complicanze: ascessi addominali, stenosi del lume intestinale e fistole
„
Età di comparsa: gen. 15 - 25 anni, eccezionalmente > 60
„
80-90% dei casi sottoposti a trattamento chirurgico (50% ripetuto)
„
Incidenza (casi/100.000 persone): 3,1-13 (USA), 13 (UK)
„
Prevalenza nei paesi industrializzati circa 1:1000
…
…
UE: 200.000
USA: 800.000
IZSLER CRN Paratubercolosi
3
CD: situazione in Italia
Incidenza: 3-4 casi/100.000/anno
Prevalenza: 50-54 casi/100.000
4
Fattori di rischio
ƒ Familiarità
ƒ Fumo
ƒ Appendicectomia
ƒ Contraccettivi orali ??
ƒ Dieta ricca in zuccheri ??
ƒ Dieta ricca in grassi ??
ƒ Allattamento al seno (protettivo ???)
ƒ Infezioni perinatali con virus morbillo “wild-type”??
ƒ Vaccini con virus vivi attenuati del morbillo??
ƒ Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ??
(Loftus Gastroenterology 2004)
5
SIMILITUDINI ANATOMO-PATOLOGICHE
Animale
Uomo
Ispessimento della parete
Aumento volume linfonodi
Lesioni granulomatose
ed ulcerazioni
Aspetto cerebroide
6
SIMILITUDINI CLINICHE
Uomo
Animale
Diarrea
Dimagramento
Manifestazioni
extraintestinali
7
Rapporti tra CD e PTBC
„
1913: Dalziel sospetta una eziologia comune
sulla base delle caratteristiche cliniche,
anatomo-patologiche ed istologiche
„
1984: Chiodini, da due pazienti con CD, isola
Map sotto forma di CWD e riesce a riprodurre la
malattia infettando per bocca alcune capre con
gli stessi ceppi
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8
Cell Wall Deficient forms
(sferoplasti)
• Difficoltà coltivazione
• Dati immunologici contrastanti
• Colorazione Ziehl-Neelsen negativa
Foto L.Sechi, 20019
CD e PTBC: stessa eziologia?
PRO:
• Similitudini cliniche ed anatomopatologiche
• Dimostrazione Map in una significativa % di CD
• Patogenicità per i ruminanti dei ceppi Map isolati da
pazienti CD
• Patogenicità Map per i primati (McClure, 1987) morti a
seguito di una ileocolite granulomatosa molto simile alla
enterite paratubercolare
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10
CD e PTBC: stessa eziologia?
CONTRO:
•
•
•
•
•
•
Differenze cliniche e anatomopatologiche
Scarso numero di isolamenti
Dati PCR contrastanti
Dati epidemiologici non significativi
Risultati non costanti della terapia antibiotica
Miglioramento sintomatologia con immunomodulatori
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11
Ipotesi eziologiche: 3 teorie
(Chamberlin 2006)
Alterata regolazione sistema immunitario
2. Malattia da Micobatteri (Map)
3. Immunodeficienza
1.
Eziologia
multifattoriale?
IZSLER CRN Paratubercolosi
12
Teoria 1:
alterata regolazione del sistema immunitario
Iperattivazione del sistema immunitario mucosale da parte
della flora luminale ( risposta Th1 vs. batteri della flora
normalmente presente nel lume intestinale)
Predisposizione
genetica
NOD2, ATG16L1, IRGM
Alterazione
clearance
IZSLER CRN Paratubercolosi
Infezione
cronica
13
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14
FUNZIONE DI NOD2
E BARRIERA
INTESTINALE
IN PAZIENTI NORMALI
IZSLER CRN Paratubercolosi
15
IN PAZIENTI CON
MUTAZIONE DEL
GENE CARD 15
•
Alterata risposta ai
muramildipeptidi (MDP)
•
Riduzione della capacità
battericida cellulare
Micobatteri:N-glycosil-MDP
Altri batteri:N-acetyl-MDP
(Coulombe 2009)
IZSLER CRN Paratubercolosi
16
Teoria 2: Malattia da Micobatteri
Evidenze della presenza di Map
„
PCR DNA
… 92%
CD vs. 26% controlli (Bull, 2003)
… 40% CD vs.0% dai granulomi (Ryan, 2002)
„
PCR RNA
… 8/8
„
CD vs.2/4 controlli (Mishina, 1996)
Ibridazione in situ
… 83%
CD (Sechi 2001)
17
Teoria 2: malattia da Micobatteri
Evidenze della presenza di Map
Coltura:
„
Intestino 42% CD vs 9% (Bull, 2003)
„
Latte 2/2 CD vs 0/5 controlli (Naser 2000)
„
Sangue 50% CD vs 0% controlli (Naser 2004)
18
Teoria 2: Malattia da Micobatteri
Evidenze della presenza di Map
Sierologia vs. p35 e p36
77% CD
„ 8% UC
„ 0% controlli
„
(Naser, 1999)
19
Teoria 2:
Malattia da Micobatteri (Map)
Meta-analisi di 18 studi caso-controllo di pazienti CD
vs. controlli, mediante PCR nei tessuti o nel sangue
OR osservati:
OR medio:
0,04-31,5
7,01 (3,95-12,94)
Feller et Al.(2007):Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
and Crohn’s disease: a systematic review and meta-analysis.
http://infection.thelancet.com 2007, 7
IZSLER CRN Paratubercolosi
20
Teoria 3:
Immunodeficienza
Fattori genetici, ambiente, esotossine (?)
Difetto immunità innata (disfunzionalità neutrofili)
Maggiore permanenza microbica nelle cellule
Risposta compensativa Th1 verso batteri (?)
Crohn Disease
IZSLER CRN Paratubercolosi
21
Possibile ruolo di Map
“L’associazione tra MAP e CD ormai è chiara.
Rimane da chiarire qual è il ruolo di Map nel
causare la malattia dell’uomo”
Colloquium American Academy of Mycrobiology, 2008
„
„
„
„
Agente causale?
Agente scatenante in pazienti predisposti?
Commensale?
O forse:
Crohn Syndrome: 3 differenti quadri patologici con 3
diversi quadri patogenetici?
IZSLER CRN Paratubercolosi
22
Increasing incidence of Crohn’s disease
in Victorian children
Phavichitr N. et al., J.Gastroenterol. Hepatol. (2003): 18, 329-332
“..dal momento che la prevalenza di
un gene è statica, deve esserci un
fattore ambientale in aumento che
scatena la malattia clinica…”
IZSLER CRN Paratubercolosi
23
Isolamento T cells da biopsie intestinali di
pazienti CD reattive a Map (Olsen, 10 ICP)
Rilevazione risposta vs. Bacterioides, Lactobacillus,
Bifidobacterium, E.coli, MAP, MAI, M.gordonae, MTBC
Pazienti CD dimostrano una risposta vs. Map
significativamente > dei controlli (UC e non-IBD)
RUOLO SPECIFICO DI MAP?
IZSLER CRN Paratubercolosi
24
Terapia: efficacia in vitro
(Krishnan, 10 ICP)
• MACROLIDI (Azitromicina, Claritromicina) 100%
• AMIKACINA 83.3%
• CHINOLONI (Ciprofloxacin 55.5%, Levofloxacin 50%)
• RIFAMICINE (Rifampicina 44.4%, Rifabutina 38.8% )
• ETAMBUTOLO 28%
• CLOFAZIMINA 22%
• ISONIAZIDE, DAPSONE 0%
• 6-MERCAPTOPURINA: sinergia con MACROLIDI E RIFAMICINA
Terapia con almeno 2 antibiotici efficaci per 6-24 mesi:
60-80% di risposta (Sartour 2004)
IZSLER CRN Paratubercolosi
25
Terapia: nuove prospettive (Bull, 10 ICP)
Perché gli antibiotici sono inattivi su Map nel macrofago?
“Non Replicable Viable Status”
non replica
ridotta produzione di CW Ag
ridotto turnover transcrittomico
Alterazione meccanismi di difesa cellulare
antigen presentation
clearance
IZSLER CRN Paratubercolosi
26
Terapia: nuove prospettive
(Bull, 10 ICP)
RHODANINE (Thiazolidin-2,4-dione)
‰ atossica per le linee cellulari
‰ inattiva in vitro su Map
‰ attiva su Map nei macrofagi per azione indiretta
inibisce NO-derivati (anti-reattivi)
ripristino normale sorveglianza cellulare
aumento clearance Map
IZSLER CRN Paratubercolosi
27
Diabete Mellito T1:
Map è il fattore scatenante?
(Dow, 2006, Medical Hypotesis)
„
Predisposizione genetica (NRAMP, VDR)
„
Cross-reazione tra Map HSP e GAD pancreatico
„
Anticorpi specifici per Map presenti in DM-T1,
ma non in DM-T2 (Rosu 2009, PLOS One)
28
Come può avvenire la trasmissione
di Map all’uomo?
ƒ per via diretta
ƒ
Animali - Uomo
ƒ per via alimentare
ƒ
ƒ
ƒ
Latte e derivati
Acqua
Carni
IZSLER CRN Paratubercolosi
29
Quanto è probabile che Map….
„
infetti l’allevamento?
„
contamini i prodotti crudi all’origine?
„
contamini i prodotti durante la trasformazione?
„
sia presente nei prodotti pronti per il consumo?
30
A review of prevelances of
paratuberculosis in Europe
Nielsen, 2008, Prev. Vet. Med
Migliore stima prevalenza reale:
50% allevamenti
20% animali
31
Indagini di prevalenza in Italia
Area geografica
Anno
Metodo
diagnostico
% allevamenti
positivi (pa/pr)
% capi
positivi
Veneto
2000-2001
ELISA
64,9% (26,7%)
3,5%
Lazio
2005
ELISA
42%
2,4%
Lombardia
2003-2005
ELISA + CF
43,7% (19,2%)
2,6%
Emilia-Romagna
2007
ELISA latte
di massa
3,2% (10,7%)
Non det.
32
Progetto di ricerca in campo agricolo 2003-2005
Assessorato Agricoltura - Regione Lombardia
“Indagine sulla presenza di infezione da
Mycobacterium avium subs. paratuberculosis
(Map) in allevamenti di bovine da latte e
analisi del rischio sulla presenza dell’agente
infettivo nel latte crudo a livello di
produzione primaria”
33
Campioni di latte di massa contaminati in
funzione della sieroprevalenza aziendale
%
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
46,7
11,4
10,8
4,4
<5%
5-15%
>15%
Sieroprevalenza aziendale
Totale
Arrigoni 2007
34
Aziende produttrici di latte contaminato in
funzione della sieroprevalenza aziendale
%
75
80
70
60
50
40
30
20
14,3
21,2
18,5
10
0
<5%
5-15%
>15%
Totale
Sieroprevalenza aziendale
IZSLER CRN Paratubercolosi
Arrigoni 2007
35
Map nel latte
ƒ Map può contaminare il latte crudo
Giese et al., 2000
Pillai et al., 2002
Grant et al., 2002
Stabel et al., 2002
Mahler et al., 2004
O’Reilly et al., 2004
Ayele et al., 2005
ƒ Origine della contaminazione:
endogena ed esogena (fecale)
ƒ Entità media della contaminazione:
• 4-20 CFU/ml (Ayele et al, 2005)
•<100 CFU/ml (Giese et al., 2005)
IZSLER CRN Paratubercolosi
36
Contaminazione del latte crudo
Bovine con forma clinica
54% (PCR+coltura)
Giese e coll. (2000)
Bovine con forma subclinica
11.6% (coltura)
8,3% (coltura)
Sweeney e coll. (1992)
Prelievo
Streetersterile
e coll. (1995)
di emungitura
84% (PCR+coltura) Routine
Arrigoni
coll (2004)
IZSLER CRN Paratubercolosi
37
Tempo (sec) necessario per distruggere Map nel
latte in funzione della concentrazione iniziale
62 °C
65 °C
68 °C
71 °C
106
1373
287
131
70
105
1144
239
109
59
104
915
191
87
47
103
686
143
66
35
102
458
96
44
23
101
229
48
22
11
IZSLER CRN Paratubercolosi
Sung, 1998
38
Map resiste alla pastorizzazione HTST
Possibili soluzioni:
• aumentare il tempo (> 15 sec)?
• aumentare la temperatura (>72 °C)?
39
Termoresistenza di Map
In condizioni sperimentali e a
concentrazioni di 106/ml:
• non resiste a 72 °C per 25 sec
• resiste fino a 90 °C per 15 sec
Grant, 1999
40
Termoresistenza
e omogeneizzazione
In condizioni naturali resiste a 73 °C per 5’’
(Grant, 2002)
L’omogeneizzazione aumenta l’efficacia, seppur parziale,
della pastorizzazione, purchè applicata contestualmente al
trattamento termico
(Grant, 2005)
41
Omogeneizzazione
20
% of cells in size range
Brodocoltura di Map prima dell’omogeneizzazione
15
10
5
0
Clump size (micron)
Grant et al. 200542
Omogeneizzazione
20
% of cells in size range
Brodocoltura di Map dopo omogeneizzazione
15
10
5
0
Clump size (micron)
Grant et al. 200543
Omogeneizzazione
% of cells in size range
20
Brodocoltura di Map dopo 10 min
dall’ omogeneizzazione
15
10
5
0
Clump size (micron)
Grant et al. 2005
44
Termoresistenza: possibili spiegazioni
• Tendenza al clumping?
• Localizzazione intracellulare?
• Termoattivazione?
Map cresce più rapidamente se il latte è trattato
a 100°C per 10 min
(Herman L. et all. 8° ICP)
45
Centrifugazione
7000 X g per 10 sec dopo riscaldamento a 60 °C
Riduzione Media Log10 Map
Clumped:
3,05-3,56
Declumped:
3,33-3,98
Riduzione Media % Map
Clumped:
99,82-99,95
Declumped:
99,92-99,98
Grant et all, 2005 Int.J.Dai.Techn.
46
Microfiltrazione
Attraverso porosità 1,2 µm
Riduzione Media Log10 Map:
1,3-3,4
Riduzione Media % Map:
94,6-99,9
Grant et all, 2005 Int.J.Dai.Techn.
47
Trattamento alta Pressione
A Pressione di 500 Mpa per 10 min:
Riduzione Media Log10 Map:
6,52
A Pressione di 600 Mpa per 5 min + HTST:
Riesce a resistere !!
Donaghy et al., (2007): Lett. Appl.Microb. 45, 154-159
48
Trattamento con UV
Map è più R agli effetti dei raggi UV degli altri batteri
Alla dose di 1000 mJ/ml (DOSE LIMITE):
Riduzione Media Log10 Map:
0,5-1
Altic LC, et al., (2007): Appl.Env.Microb. 73, 11, 3728-3733
49
Studi di sopravvivenza su latte
pastorizzato HTST
Riduzione di 4-7 log
Il rischio è fx del livello di contaminazione iniziale
IZSLER CRN Paratubercolosi
50
Studi di sorveglianza su latte pastorizzato
e derivati in commercio
Eltholth M.M et al. (2009): J. Appl.Microb. 1061-1071
IZSLER CRN Paratubercolosi
51
Indagini sulla presenza di Map nei
derivati del latte in commercio
Formaggi
(Ikonomopoulos et al. 2005)
50% formaggio Feta (Grecia) e 12% di formaggi duri e semiduri
(Repubblica Ceca) erano positivi a IS900-PCR
3.6% del totale positivi a MAP in coltura
Latte in polvere per la prima infanzia (Hruska et al. 8ICP, 2005)
25/51 (49%) dei campioni di 10 differenti marche provenienti da 7
paesi europei sono risultati positivi a IS900-PCR
1/51 (1.9%) è risultato positivo in coltura
IZSLER CRN Paratubercolosi
52
Studi di sopravvivenza di
Map nei formaggi
D value
Formaggi freschi 59,9 giorni
Formaggi semiduri 45,5 giorni
Formaggi duri 27,8 giorni
Partendo da latte con 105 Map/ml, sono necessari 140 gg
(duri), 230 gg (semiduri), 300 gg (freschi) per ottenere
livelli di Map non rilevabili in coltura
(Sung, 2000; Spahr, 2002)
IZSLER CRN Paratubercolosi
53
Map nelle carni:
survey al macello
47 bovine di allevamenti infetti (prevalenza 3-10%)
Macellate per cause diverse
27% Paratubercolosi clinica
73% altro
Campioni da intestino
66% +
diaframma 19% +
Tutti HS, 4 con sintomi clinici, 2 subclinici
(Alonso-Hearn, 10 ICP)
IZSLER CRN Paratubercolosi
54
Map nelle acque
Resiste 55 settimane
al riparo della luce
Contamina prati e pascoli
Contamina le
acque superficiali
55
Map nelle acque
„
„
Si localizza all’interno dei biofilm (contaminazione
post-trasformazione??)
Si moltiplica e resiste fino a 4 anni all’interno di amebe
(Acanthamoeba polyphaga), ubiquitarie nelle acque
Maggiore resistenza ai trattamenti di
clorazione rispetto alle cellule libere
La clorazione, alle concentrazioni utilizzate di
routine, provoca una riduzione di 2 Log10
(Whan 2001)
IZSLER CRN Paratubercolosi
56
Caratterizzazione genetica dei ceppi
I ceppi umani e animali sono comuni
(Ghadiali 2004)
La maggior parte dei ceppi di Map
isolati dall’uomo è di tipo Bovino
(C=Cattle strain)
(Paustian et all, 2008)
Il ceppo bovino è patogeno per l’uomo (ampio spettro)?
Più elevata biocontaminazione ambientale?
57
Sicurezza alimentare e Map
„
„
„
L’allevamento bovino è la
fonte maggiore di Map
Il latte potrebbe non
essere il veicolo principale
di infezione per l’uomo
Potremmo non riuscire ad
eliminare Map una volta
che ha contaminato
alimenti e acqua
L’allevamento è il punto
critico di controllo
IZSLER CRN Paratubercolosi
58
Per ridurre il rischio
„
Certificare gli allevamenti indenni
„
Piani di controllo negli allevamenti infetti
IZSLER CRN Paratubercolosi
59
Possibile rapporto tra CD e
Paratubercolosi ?
Report CEE - Comitato Scientifico sulla
Salute e sul Benessere Animale (2000)
…“Sono necessari ulteriori studi per chiarire questo
importante quesito”…..
…”Indipendentemente dal possibile ruolo di Map nel
Morbo di Crohn, l’applicazione di ogni mezzo volto
ad eradicare la Paratubercolosi dall’allevamento
animale deve costituire una priorità”…
IZSLER CRN Paratubercolosi
60
Possibile rapporto tra CD e
Paratubercolosi ?
Report UK Food Standard Agency (2002):
…“Abbiamo un potenziale patogeno per l’uomo nei
ruminanti e in altri animali d’allevamento.
L’esposizione della popolazione umana è in
probabile aumento. In attesa di ulteriori chiarimenti
riguardo la patogenicità per l’uomo, è comunque
necessario, in via precauzionale, applicare tutte le
misure necessarie a ridurre l’esposizione
dell’uomo”…
IZSLER CRN Paratubercolosi
61
IZSLER CRN Paratubercolosi
62
prevalenza allevamenti
infetti
Situazione epidemiologica: proiezioni
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Prime
Segnalazioni
UK, NL,
DK, USA
1890 1900 1920 1940 1960 1980 2000 2020
anni
Collins M., 2001
63
Save the date!!
11 ICP:
12 ICP:
febbraio
giugno
2012 (Sidney)
2014 (Parma)
CRN Paratubercolosi
http://www.izsler.it/izs_bs/s2magazine/index1.jsp?idPagina=441
IAP (International Organisation for Paratuberculosis)
http://paratuberculosis.org
10 ICP (International Colloquium on Paratuberculosis)
http://www.cvm.umn.edu/outreach/events/icp/presentations/home.html
IZSLER CRN Paratubercolosi
64
Grazie per
l’attenzione
65