Endomicroscopia: presente e futuro

Confocal laser endomicroscopy is a
recent technique which allows immediate
microscopy during the ongoing endoscopy
(virtual histology). With this technique, an
intravital differentiation among normal,
regenerative, and neoplastic mucosal
changes is possible with high accuracy
based on validated and reproducible
morphologic criteria. Moreover,
endomicroscopy offers the potential to
image structure and function that cannot be
seen in excised tissue (i.e. vascular flow).
Furthemore, in vivo molecular imaging,
combining endomicroscopy with targeted
staining (immunoendoscopy), gives hope
for improved diagnosis and targeted
therapies in gastrointestinal disorders.
Parole chiave: endomicroscopia confocale
laser, immunoendoscopia, fluoresceina, cancro
Key words: confocal laser endomicroscopy,
immunoendoscopy, fluorescein, cancer
IF
Cristina Trovato
Cristiano Crosta
Divisione di Endoscopia
Istituto Europeo di Oncologia
di Milano
Introduzione
La costante evoluzione tecnologica dell’endoscopia ha
consentito di passare da una semplice osservazione
macroscopica delle lesioni a una più approfondita analisi
in vivo della loro struttura.
L’utilizzo di videoendoscopi elettronici ad alta risoluzione,
magnificazione d’immagine e colorazioni della superficie
mucosa ci consente già da alcuni anni di riconoscere
l’architettura ghiandolare e la vascolarizzazione della mucosa normale e patologica. Raramente queste tecniche
endoscopiche sono capaci di una diagnosi così specifica da non richiedere il campionamento bioptico, che
resta il cardine principe per la diagnosi delle patologie.
L’endomicroscopia confocale laser è una recente tecnica endoscopica che permette di ottenere delle immagini della mucosa con una magnificazione e risoluzione
di circa 1000x, tale da consentire l’identificazione delle
microstrutture cellulari e subcellulari delle aree esplorate, consentendo una diagnosi istologica in vivo (“biopsie
virtuali”) (1). Queste caratteristiche rendono la microscopia confocale endoscopica utile nella diagnosi precoce
di lesioni tumorali o displastiche, nell’ottimizzazione delle
biopsie e del trattamento endoscopico. Il recente utiliz-
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L’endomicroscopia confocale laser
è una recente tecnica endoscopica
che permette di ottenere immagini
microscopiche in tempo reale, in corso
di endoscopia (biopsie virtuali). Con
questa tecnica è possibile riconoscere
in vivo il tessuto normale, rigenerativo
e neoplastico con un’alta accuratezza
diagnostica, basandosi su criteri
morfologici validati e riproducibili.
L’endomicroscopia ha anche la
possibilità di valutare strutture e funzioni
che non possono essere studiate sul
campione bioptico (per es. il flusso
sanguigno). La combinazione dello
studio endomicroscopico con sonde
molecolari (immunoendoscopia) apre
nuovi scenari e potrebbe condurre a
una migliore identificazione delle aree
patologiche e alla valutazione della
risposta a terapie mirate.
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zo di sonde molecolari fluorescenti rende l’endomicroscopia ancora più affascinante, poiché è al momento
l’unica metodica che permette di valutare i meccanismi
fisio-patologici in vivo. L’immunoendoscopia potrebbe in
futuro consentire una migliore identificazione delle aree
patologiche e la selezione dei pazienti che potrebbero
beneficiare di terapie mirate, consentendo anche una
valutazione dell’eventuale risposta al trattamento (2).
Strumentazione
endomicroscopica
confocale laser
Al momento sono presenti sul mercato due tipi di strumentazione endomicroscopica confocale laser.
• Il primo integra la microscopia confocale
laser a uno strumento endoscopico
(gastroscopio o colonscopio) ad alta
risoluzione (Pentax, Tokyo, Giappone),
generando simultaneamente l’immagine
confocale e videoendoscopica standard.
Questa strumentazione è definita
endoscopic-based confocal laser
endomicroscopy (e-CLE).
• Il secondo sistema consta di una
minisonda confocale laser che può
essere inserita nel canale operativo di
un qualunque endoscopio tradizionale
(Cellvizio, Mauna Kea Technologies,
Parigi, Francia). Questo sistema è
definito probe-based confocal laser
endomicroscopy (p-CLE) (figura 1).
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Microscopia confocale laser
Il microscopio confocale si differenzia strutturalmente
da un tradizionale microscopio a fluorescenza per l’utilizzo di una sorgente luminosa laser e per la presenza
di un sistema ottico ed elettronico che permette di eseguire la scansione di una sezione
del campione osservato (sezione
ottica), eliminando il background causato dalla luce rifratta e non a
fuoco, con successiva ricostruzioA
ne sullo schermo di un computer
dell’immagine risultante. Questa
tecnica ha migliorato la qualità delle osservazioni della microscopia
ottica, consentendo una maggiore
risoluzione delle immagini, un migliore contrasto, rapidità d’acquisizione e possibilità di archiviazione.
Tecnica di acquisizione
delle immagini e peculiarità
dei sistemi endomicroscopici
La tecnica di acquisizione delle immagini endomicroscopiche è simile per entrambi i sistemi endomicroscopici.
L’unità confocale è collegata a una sorgente laser monocromatica blu (della lunghezza d’onda di 488-600 nm),
necessaria per eccitare un fluoroforo. La sonda confocale cattura il riflesso della luce focalizzata su piani paralleli
della mucosa mediante una lente e la ritrasmette a un
detettore d’immagine. Le immagini sono generate mediante l’uso di un agente di contrasto fluorescente. Durante l’acquisizione delle immagini endomicroscopiche il
terminale dello strumento o della sonda confocale deve
essere appoggiato delicatamente sulla mucosa da indagare e va mantenuto ben fermo per ridurre gli artefatti
legati ai movimenti. Lo studio preliminare della mucosa
con coloranti (cromoendoscopia) non determina alcuna
interferenza con l’autofluorescenza del viscere. La visualizzazione dell’architettura della mucosa avviene per piani
paralleli alla sua superficie e non per piani ortogonali come nei preparati istologici convenzionali (3).
Il sistema e-CLE acquisisce e mostra sul monitor 0.8
o 1.6 immagini endomicroscopiche per secondo, che
possono essere registrate singolarmente in un file d’immagini nel data-base dell’apparecchiatura. L’area di mucosa esplorata è di 500 per 500 µm con una risoluzione
di 0.7 µm. La scansione può essere spinta dalla superficie della mucosa sino a 250 µm in profondità, con piani
di scansione confocale dello spessore di 7 µm.
Il sistema p-CLE consta di una sonda flessibile di piccolo calibro con un piano d’immagine confocale fisso
e una risoluzione laterale di circa 1 µm. Sono presenti
sul mercato vari tipi di sonde con caratteristiche diverse per lo studio dei distretti intestinali e extraintestinali.
Il sistema p-CLE acquisisce 12 immagini/sec, generando un video della mucosa esplorata.
Entrambi i sistemi presentano vantaggi e limiti. Il sistema
fig. 1: strumentazione endomicroscopica
A) e-CLE; B) p-CLE
B
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Mezzi di contrasto
Le immagini endomicroscopiche sono generate mediante l’uso di un agente di contrasto fluorescente. I
mezzi di contrasto più comunemente usati negli studi
effettuati e già pubblicati sono la fluoresceina sodica
somministrata per via endovenosa in soluzione al 10%
e l’acriflavina in soluzione allo 0.2% applicata con catetere spray sulla mucosa da esaminare.
La fluoresceina sodica, già largamente utilizzata in oftalmologia e angiografia, è il mezzo di contrasto più
adoperato per il basso costo e l’assenza di potenzialità
mutagenica. Dopo la somministrazione endovenosa
di 5-10 mL di fluoresceina sodica al 10%, le cellule, il
sistema vascolare e il tessuto connettivo possono essere ben differenziati; mentre i nuclei cellulari non sono
chiaramente visibili. La sostanza è generalmente ben
tollerata (rare le reazioni allergiche, in genere lievi), è
eliminata completamente per via renale e condiziona
una colorazione giallastra della cute che permane per
poche ore. Un recente studio multicentrico ne ha confermato la sicurezza in corso di esame endomicroscopico. Si sono osservati solo eventi avversi lievi nell’1.4%
di 2.272 esami endomicroscopici effettuati. I sintomi
registrati sono:
• ipotensione transitoria (0.5%);
• nausea (0.4%);
• eritema nel sito d’iniezione (0.35%);
• rash (0.04%);
• lieve dolore epigastrico (0.08%) (4).
L’acriflavina idrocloride può essere applicata per via
topica per colorare il nucleo e il citoplasma cellulare.
Questa sostanza è assorbita in pochi secondi e la sua
azione è circoscritta agli strati superficiali della mucosa,
circa100 µm. Il suo uso è da limitare per una possibile
attività mutagenica. Fluoresceina e acriflavina possono
essere utilizzate contemporaneamente.
Il cresil violetto (1-2,5%) può essere applicato per via
topica, evidenzia bene il citoplasma, i nuclei appaiono
neri per contrasto.
Recentemente, per il crescente interesse verso l’imaging
molecolare, sono stati sviluppati nuovi agenti di contrasto biomarker specifici (detti anche sonde molecolari). In
genere si tratta di peptidi a basso peso molecolare, con
affinità variabile per specifiche strutture, coniugati con la
fluoresceina (per es. anticorpi fluorescenti contro il recettore per il fattore di crescita epidermico - EGFR). Sono
comunque necessari studi di farmacocinetica e sicurezza per definire le applicazioni cliniche di queste sonde
molecolari nell’uomo.
Pattern endomicroscopici
e attuali applicazioni
Studi clinici hanno definito pattern endomicroscopici di
normalità, aspetto rigenerativo e neoplastico dei diversi
distretti della mucosa gastrointestinale esplorabile. Le immagini confocali acquisite in vivo si differenziano da quelle della tradizionale istologia perché il piano di sezione è
trasversale. L’osservazione microendoscopica richiede
un’approfondita conoscenza dell’architettura cellulare e
vascolare della mucosa dell’apparato gastroenterico nei
suoi aspetti normali e patologici e presuppone una curva
di apprendimento che può essere facilitata dal lavoro a
stretto contatto con un anatomopatologo (5).
Le principali indicazioni allo studio endomicroscopico
sono tutte quelle condizioni in cui è possibile riconoscere
un’alterazione della morfologia cellulare o vascolare degli strati superficiali della mucosa, in particolare le lesioni
displastiche dei vari distretti gastroenterici, compreso il
dotto biliare. L’endomicroscopia permette l’esplorazione
di una superficie più vasta rispetto all’esecuzione delle
biopsie random standard con la possibilità di ottenere
anche delle informazioni non visibili sul campione bioptico. In particolare, essa consente uno studio dinamico
delle strutture della mucosa e della rete vascolare permettendo, quindi, la valutazione di alcuni meccanismi
fisiopatologici in tempo reale.
Esofago
L’esame endomicroscopico dell’esofago mostra la presenza di cellule poligonali di uguale dimensione e anse
capillari intrapapillari regolari dirette verso la superficie
endoluminale. Nei pazienti con malattia da reflusso ga-
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e-CLE ha una maggiore risoluzione, esplora un’area di
mucosa più ampia e permette la scansione della mucosa dalla superficie sino a 250 µm di profondità. L’integrazione del microscopio confocale al videoendoscopio limita le dimensioni del canale operativo (2.8 mm)
e condiziona una maggiore lunghezza del terminale
rigido dell’endoscopio (48 mm), rendendo lo strumento
meno flessibile di uno standard. L’utilizzo del sistema
p-CLE è più versatile, poiché può essere inserito nel
canale accessorio di qualunque tipo di endoscopio.
Per eseguire il campionamento mirato è necessario
estrarre la minisonda confocale dal canale operativo
dell'endoscopio. Il campo microscopico esplorabile in
vivo è inferiore al sistema e-CLE, è possibile comunque
eseguire una ricostruzione della superficie esplorata nel
post processing. Nonostante la differenza assoluta di
risoluzione tra i due sistemi (0.3 µm) possa sembrare
piuttosto piccola, questa costituisce il 43% di riduzione
nella soluzione.
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stroesofageo si osservano un maggior spazio intercel- per entrambe le valutazioni (rispettivamente 46% / 28%
[in cieco] e il 18% / 12% [in vivo]). Pertanto gli autori
lulare e la presenza di capillari lievemente dilatati (5).
L’Esofago di Barrett è una delle patologie più studiate hanno correttamente concluso che al momento l’encon entrambi i sistemi endomicroscopici. Attualmen- domicroscopia confocale p-CLE non può sostituire il
te la sorveglianza dell’Esofago di Barrett prevede 4 campionamento bioptico tradizionale per la diagnosi
biopsie random sui quattro quadranti ogni 1-2 cm di di esofago di Barrett e neoplasie associate (8).
mucosa di aspetto metaplastico. Tale procedura però
Sono necessari ancora dei miglioramenti
presenta diversi limiti: in particolare ha un basso podella tecnologia e altri studi multicentrici
prima di un’applicazione routinaria della
tere diagnostico, è costosa, time-consuming e non è
metodica. Sono in fase di sviluppo peptidi
scevra da errori di campionamento. La possibilità di rie anticorpi specifici per il riconoscimento
conoscere o di escludere con certezza la presenza di
precoce e mirato delle aree neoplastiche.
aree neoplastiche consentirebbe di ridurre il numero
di biopsie, quindi di ridurre i costi. La prima classificazione confocale dell’esofago di Barrett è stata de- Stomaco
scritta da Kiesslich et al nel 2006. L’esofago di Barrett Diversi studi clinici basati sul confronto con l’esame
è caratterizzato dalla presenza di un pattern ghian- istologico tradizionale hanno stabilito i criteri diagnostici
dolare di tipo villiforme con occasionali goblet cell e confocali per la diagnosi di mucosa gastrica normale, di
un pattern vascolare con capillari a struttura regola- gastrite cronica con metaplasia intestinale e di neoplasia
re, visibili nelle scansioni superficiali subito al di sotto (9-10) (figura 2) Con questi criteri l’endomicroscopia può
dell’epitelio. La neoplasia si distingue per la presenza predire la presenza del cancro gastrico con un’elevata
di capillari irregolari con spandimento di fluoresceina accuratezza. La maggior parte di questi studi basa la
e di ghiandole irregolari con componente cellulare classificazione confocale sull’aspetto cellulare e la prescura. L’applicazione di questa classificazione ha per- senza dei diversi tipi di pit-pattern. Liu et al descrivono
messo di predire la diagnosi di esofago di Barrett e di maggiormente gli aspetti endomicroscopici dell’architetneoplasia associata con una sensibilità rispettivamente del 98.1%
fig. 2: antro gastrico. A) aspetto endomicroscopico di normalità;
e 92.9%, specificità del 94.1% e
B) metaplasia gastrica; C) displasia di basso grado;
98.4% e accuratezza diagnostica
D) displasia di alto grado/carcinoma differenziato
del 96.8% e del 97.3%. (6) Uno studio successivo e indipendente
A
B
ha dimostrato un incremento della
resa diagnostica delle biopsie mirate con il sistema endomicroscopico
e-CLE (dal 17.2% al 33.7%) e una
riduzione del numero di biopsie necessarie per la diagnosi di neoplasia associata. (7) La prevalenza di
neoplasia nei due studi menzionati
varia dal 24% al 41%. Il primo lavoro effettuato su una popolazione
con un basso rischio di neoplasia
(8.3% delle biopsie, 16% dei pazienti) e in un contesto multicentriC
D
co utilizzando p-CLE ha mostrato
una specificità e un valore predittivo negativo per la diagnosi di neoplasia di 0.97 (90% CI 0.95-0.98) e
0.93 (0.91-0.95) per la rivalutazione delle immagini in cieco, e 0.95
(0.90-0.98) e 0.92 (0.90-0.94) per
la valutazione in corso di esame. Il
valore predittivo positivo e la sensibilità sono stati però piuttosto scarsi
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tura vascolare. La somministrazione di fluoresceina
permette di identificare nel corpo gastrico una rete di
capillari sottoepiteliali a nido d’ape che circonda le foveole gastriche, mentre nell’antro assumono un aspetto
a spirale. Le lesioni neoplastiche precoci ben differenziate
appaiono in genere ipervascolarizzate, con vasi tortuosi
e dilatati, di forma e dimensioni irregolari. Al contrario, il
tumore indifferenziato appare ipovascolarizzato con vasi
dai rami corti e privi di connessione (11).
È possibile riconoscere la presenza dell’Helicobacter pylori mediante l’uso di acriflavina. Quando presenti, i batteri
appaiono come singoli puntini luminosi colorati dal mezzo
di contrasto, che permette anche il riconoscimento di tutte le loro caratteristiche, compresi corpo e flagelli (5).
Piccolo intestino
L’endomicroscopia consente la visualizzazione dei villi
intestinali, il riconoscimento della presenza di atrofia e
flogosi. Pertanto può essere di ausilio nella diagnosi di
celiachia e nel follow-up dei pazienti con malattia infiammatoria cronica intestinale e Poliposi Adenomatosa
Familiare. In questo particolare gruppo di pazienti, le
immagini confocali ottenute hanno permesso di diagnosticare la presenza di alterazioni morfologiche della
mucosa ileale dopo proctocolectomia e confeziona-
mento di pouch ileale con una sensibilità del 94.1%,
una specificità del 100% e un’accuratezza del 94.4%
quando confrontate con l’istologia (12). Studi recenti
hanno permesso il riconoscimento di batteri e di gap
della barriera intestinale in modelli animali e in pazienti con malattia infiammatoria cronica intestinale, il cui
significato clinico deve essere ancora compreso (13).
Colon
L’endomicroscopia può essere utilizzata per lo screening
del cancro colorettale e la sorveglianza dei pazienti affetti da malattia infiammatoria cronica intestinale (figura
3). La somministrazione endovenosa di fluoresceina nel
colon normale permette la visualizzazione della rete di
capillari (visualizzata come una struttura luminosa bianca) che circonda a nido d’ape le ghiandole circolari delle
cripte. All’interno dei capillari è possibile riconoscere
anche lo spostamento di ombre scure nel lume che
rappresentano i globuli rossi circolanti. In presenza di
neoplasia i vasi sono dilatati, distorti, con poco o nessun orientamento verso i tessuti adiacenti. L’aumentata
permeabilità vascolare che la caratterizza è dimostrata
dal passaggio di fluoresceina dal lume vascolare nell’in-
A
B
C
D
E
F
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fig. 3: Colon. A-B) colite ulcerosa inattiva, quadro endomicroscopico di normalità; C) pattern di tipo rigenerativo;
D) quadro di colite ulcerosa con atrofia e flogosi moderata; E) quadro di colite ulcerosa con severa
infiammazione e distruzione delle cripte; F) displasia di alto grado
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terstizio, che appare intensamente luminoso (5).
L’endomicroscopia è di ausilio nella distinzione tra polipi
iperplastici e adenomatosi. I polipi adenomatosi, infatti,
possono essere diagnosticati con elevata accuratezza,
sulla base dell’alterato pattern vascolare e della perdita
di maturazione delle strutture epiteliali di superficie (14).
Nei pazienti con rettocolite ulcerosa di lunga data la
sorveglianza endoscopica con cromoendoscopia associata a endomicroscopia si è dimostrata più efficace
dell’endoscopia standard nella diagnosi di lesioni neoplastiche, aumentando il loro riconoscimento di quasi 5
volte e riducendo il numero di biopsie eseguite (e quindi i costi), con una sensibilità, specificità e accuratezza
diagnostica superiore al 95% (15). Nei pazienti affetti da
malattia infiammatoria cronica intestinale l’endomicroscopia permette anche la valutazione delle alterazioni
della mucosa legate all’infiammazione, il riconoscimento
di batteri e di gap della mucosa (13,16). Questa tecnica
potrebbe avere anche un ruolo nella valutazione dei pazienti che necessitano una modulazione del trattamento e nella valutazione della guarigione mucosa.
Dotti biliopancreatici
La minisonda confocale, per le sue dimensioni, consente l’esplorazione dei dotti biliopancreatici. L’esame
citologico e bioptico tradizionale hanno un basso potere
diagnostico per la diagnosi di neoplasia. In uno studio
pilota su 14 pazienti con stenosi indeterminata la sonda
p-CLE si è dimostrata più accurata dell’esame citologico
e istologico. Questo risultato va comunque confermato
su un campione di popolazione più rappresentativo (17).
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Limiti della microendoscopia
confocale
Per acquisire dimestichezza nell’uso dell’endoscopio e
della sonda confocale e per la corretta interpretazione
delle immagini acquisite è necessario eseguire un discreto numero di esami endomicroscopici (learning curve). L’osservazione endomicroscopica peraltro è timeconsuming. Movimenti viscerali peristaltici o trasmessi
(respiro, battito cardiaco) e il notevole ingrandimento
della visione possono generare artefatti. La profondità di esplorazione, limitata al massimo ai 250 micron,
non consente di valutare l’infiltrazione neoplastica della
sottomucosa. L’identificazione degli elementi strutturali
è condizionata dalla necessità di usare un mezzo di
contrasto. La fluoresceina non permette di visualizzare
i nuclei cellulari, pertanto la diagnosi di neoplasia e di
displasia si basa sull’osservazione della disorganizza-
zione dell’architettura del tessuto e della sua vascolarizzazione. Vi sono ancora limiti tecnici legati al tipo
di strumentazione confocale utilizzata (lunghezza del
segmento rigido terminale e scarso diametro del canale operativo per e-CLE, minore risoluzione e campo
di esplorazione per p-CLE).
Immunoendoscopia
e prospettive future
L’endomicroscopia confocale si presta a sfruttare i
recenti progressi nel campo dell'imaging molecolare.
Piccole molecole e nanoparticelle fluorescenti possono essere legate ad anticorpi monoclonali specifici
o a peptidi che si legano a loro volta a specifici bersagli. Queste sonde molecolari, visibili alla luce laser,
se utilizzate in corso di endomicroscopia potrebbero
consentire lo studio morfologico-funzionale del processo neoplastico e infiammatorio.
In un recente studio pilota è stato impiegato un eptapeptide fluorescente sensibile e specifico per i polipi
adenomatosi. Dopo la sua somministrazione topica,
l'esame endomicroscopico ha visualizzato un legame preferenziale del peptide ai colonociti displastici
con un'alta sensibilità e specificità (rispettivamente
81% e 82%), sebbene la sequenza del bersaglio molecolare sia ancora sconosciuta (18).
Più recentemente è stata valutata l’abilità dello studio endomicroscopico con imaging molecolare di
determinare in tempo reale l’espressione di EGFR,
target terapeutico per il cancro del colon-retto, in
un modello animale. EGFR è iperespresso in molti
tumori, gioca un ruolo centrale nella proliferazione,
angiogenesi, invasione e metastasi. In questo studio
è stato possibile visualizzare e differenziare i pattern
di espressione di EGFR in topi con xenotrapianto di
tumore colorettale umano con una sonda CLE palmare dopo iniezione di anticorpi fluorescenti. L'applicazione topica di anticorpo fluorescente ha fornito
un adeguato contrasto, permettendo di distinguere il
tessuto neoplastico da quello non neoplastico in base all’espressione di EGFR (19). Gli stessi ricercatori
hanno studiato successivamente anche l’espressione di VEGF, target terapeutico del cancro colorettale
metastatico (20).
Questi primi studi dimostrano che l’immunoendoscopia è fattibile e in futuro potrebbe permettere
l’applicazione dei risultati della ricerca di base alla
pratica clinica. L’immunoendoscopia potrebbe aiutarci a identificare sottogruppi di pazienti in grado di
beneficiare di terapie mirate e valutare precocemente
l’eventuale risposta al trattamento.
IF
Conclusioni
La microendoscopia confocale ci consente
di identificare in tempo reale l’architettura microscopica della mucosa (cripte ghiandolari,
villi, vascolarizzazione) e di studiare in vivo
i meccanismi fisiopatologici e le alterazioni
della struttura determinate da agenti patogeni, farmaci e chemioterapici.
Anche se siamo ancora ai primi passi in questo genere di tecnologia, si presume che in un futuro prossimo
potrà essere applicata nella pratica clinica. L’endomicroscopia confocale permette di esplorare una superficie
mucosa più vasta rispetto alle biopsie random, con una
potenzialità diagnostica più elevata. Tutto ciò consente
di ottimizzare e mirare il campionamento bioptico, risparmiando tempo e numero di prelievi. Il riconoscimento in
tempo reale delle caratteristiche neoplastiche di una lesione potrebbe migliorare il percorso terapeutico, aiutando l’endoscopista nella scelta della tecnica di rimozione
più idonea. L’applicazione dell’immunoendoscopia potrebbe ampliare le conoscenze dei meccanismi angiogenetici tumorali, identificare precocemente le lesioni e
valutare in vivo i meccanismi di risposta al trattamento
chemioterapico.
Corrispondenza
Cristina Trovato
Divisione di Endoscopia
Istituto Europeo di Oncologia
Via Ripamonti, 435 - 20141 Milano
Tel. + 39 02 57489066
Fax + 39 02 94379220
e-mail: [email protected]
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Iniziative Formative
> Tecniche endoscopiche
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