LightCycler® SeptiFast mecA Test MG

LightCycler® SeptiFast mecA Test MG
Da utilizzarsi con lo strumento LightCycler® 2.0
(nr. di serie 1415001 e successivi)
Per uso diagnostico in vitro.
DA UTILIZZARSI CON:
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
2 x 15 Tests
LightCycler® SeptiFast Kit MG
54 Tests
SeptiFast Lys Kit MG
100 Tests
SeptiFast Prep Kit MG
10 Tests
SeptiFast Software Set
REF : 04 488 814 001
REF : 04 469 046 001
REF : 04 404 432 001
REF : 04 404 459 001
REF : 04 705 220 001
USO PREVISTO
Il test per l’amplificazione in vitro degli acidi nucleici LightCycler® SeptiFast mecA Test MG è destinato alla rivelazione e all’identificazione del DNA
del gene mecA in sangue umano con K-EDTA sullo strumento LightCycler® 2.0. Il test consente di determinare la presenza di ceppi di Staphylococcus
aureus resistenti alla meticillina e viene utilizzato contestualmente alla presentazione clinica, a saggi microbiologici consolidati e/o ad altri marcatori di
laboratorio a sostegno della gestione di pazienti con sospetta infezione da MRSA nel flusso sanguigno.
Il test viene eseguito su pazienti che sono risultati positivi allo Staphylococcus aureus con il LightCycler® SeptiFast Test MG.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Lo Staphylococcus aureus è uno degli agenti patogeni che vengono isolati con maggiore frequenza in presenza di infezioni nel flusso sanguigno (1).
L’incidenza dei ceppi ospedalieri resistenti alla meticillina è in costante crescita in molte zone (2), mentre i nuovi ceppi acquisiti in comunità (3)
costituiscono una minaccia emergente. La resistenza alla meticillina è associata ad un tasso di mortalità sensibilmente più alto rispetto alla media per
batteriemia da stafilococco sensibile alla meticillina (Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus, in sigla MSSA) (4,5). È stato osservato che lo
stafilococco resistente alla meticillina (Methicillin resistant Staphylococcus aureus, in sigla MRSA) è corresponsabile di trattamenti empirici insufficienti,
ad esempio nei reparti di rianimazione (6,7), e causa di costi aggiuntivi (8).
La tempestività nella scelta dell’antibiotico è cruciale (9) e il LightCycler® SeptiFast mecA Test MG aiuta a prendere una decisione in questo senso.
Il LightCycler® SeptiFast mecA Test MG può infatti agevolare la diagnosi precoce e la scelta di un terapia antibiotica adeguata.
Questo test, che si basa sull’isolamento degli acidi nucleici, identifica il gene mecA, un mediatore della resistenza alla meticillina di alto livello.
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il test consente di identificare il DNA del gene mecA nei pazienti che sono risultati positivi allo Staphylococcus aureus con il LightCycler® SeptiFast
Test MG. La preparazione dei campioni è descritta nel foglietto illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG. Per eseguire il LightCycler®
SeptiFast mecA Test MG occorre un’aliquota dell’eluato del LightCycler® SeptiFast Test MG.
Il flusso di lavoro del LightCycler® SeptiFast Test MG prevede la preparazione dei campioni tramite lisi meccanica e la purificazione del DNA.
Successivamente il DNA bersaglio viene amplificato mediante PCR in tempo reale in 3 reazioni parallele (batteri Gram positivi, batteri Gram negativi
e funghi) e viene rivelato mediante sonde H specifiche. L’identificazione delle specie e dei controlli viene eseguita automaticamente dal
software.
Per maggiori dettagli fare riferimento al foglietto illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG (P/N: 04 469 046 001).
Selezione del bersaglio
Come area bersaglio di amplificazione, rivelazione e identificazione viene selezionata una sequenza di 314 bp nel gene mecA (10). Il prodotto del gene
mecA è la proteina PBP2a (o PBP2’), che è un’ulteriore proteina legante la penicillina (Penicillin Binding Protein, in sigla PBP) presente nei ceppi umani
e non umani di Staphylococcus resistenti alla meticillina, ovvero lo S. aureus, lo S. epidermidis, lo S. haemolyticus, lo S. cohnii e lo S. sciuri. Il gene mecA
è un mediatore della resistenza alla meticillina di alto livello nei ceppi che esprimono il gene mecA.
I geni mecA di varie specie di Staphylococcus si conservano in modo eccellente, perciò è impossibile distinguere i geni mecA di specie diverse in base
alla sequenza.
Amplificazione e rivelazione mediante PCR in tempo reale
Amplificazione
Prima dell’amplificazione PCR, il rischio di contaminazione dell’amplicon viene ridotto utilizzando l’enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi), che
riconosce e catalizza la reazione di distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina, ma non del DNA contenente deossitimidina. I campioni
trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione contenente polimerasi Taq di tipo “hot-start” nei capillari LightCycler® (100 µl) MG in cui ha
luogo l’amplificazione PCR. Il bersaglio e il reagente di controllo (RC) vengono amplificati con primer specifici.
1
Rilevazione in tempo reale dei prodotti della PCR mediante sonde H
L’amplicon viene identificato mediante fluorescenza, per mezzo di una coppia specifica di sonde H . Durante la fase di “annealing”
(appaiamento, riassociazione) del ciclo di amplificazione, le sonde H marcate con la fluorescenza ibridizzano su una sequenza interna del
frammento amplificato. La fluorescenza emessa viene misurata dallo strumento LightCycler® 2.0 in uno dei quattro distinti canali di rivelazione.
Al termine dell’amplificazione viene eseguita un’analisi della curva di melting. La temperatura di melting TM dipende dalla lunghezza, dalla sequenza e
dal grado di omologia tra la sonda e il DNA bersaglio.
Identificazione automatica del gene mecA e dei controlli
Le temperature di melting (TM) dei campioni e dei controlli vengono analizzate da un software di identificazione dedicato (SeptiFast Identification
Software) e al termine viene generato un report.
REAGENTI
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
[1a] RM 1a (miscela di reazione 1a)
5,5 U/µl polimerasi Taq FastStart
[1b] RM 1b (miscela di reazione 1b)
Tampone Tris-HCl
< 1% Brij
< 0,1% soluzione di magnesio
< 0,001% dNTP
[2] DM (miscela di rivelazione)
< 0,001% primer, sonde
Tampone Tris-HCl
< 1% Brij
[3] RC (reagente di controllo)
<0,001% DNA templato di controllo
Tampone Tris-HCl
< 0,001% RNA vettore
[4] IC (controllo interno)
< 0,001% DNA controllo interno
< 0,001% RNA vettore
Tampone Tris-HCl
[5] DE (enzima di decontaminazione)
< 0,1% enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi)
Tampone Tris-HCl
[6] BU (tampone)
< 0,5% soluzione di magnesio
[7] DI (diluente)
Acqua, grado PCR
P/N: 04 488 814 001
2 x 15 test
2 x 58 µl
2 x 164 µl
2 x 193 µl
2 x 275 µl
2 x 39 µl
2 x 20 µl
2 x 1000 µl
2 x 1000 µl
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Avvertenze e precauzioni generali
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•
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Per Uso Diagnostico in vitro.
Questo test è idoneo esclusivamente all’uso con sangue umano raccolto con K-EDTA.
Non pipettare con la bocca.
Non mangiare, bere né fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Per manipolare i campioni e i reagenti del kit indossare guanti antistatici, camici
da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo aver manipolato i campioni e i reagenti del test, lavarsi accuratamente le mani.
Non raggruppare reagenti di lotti diversi.
Non mescolare reagenti provenienti da kit diversi.
Smaltire i reagenti inutilizzati, i rifiuti e i campioni clinici in conformità alle normative vigenti in materia.
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.
Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso il rappresentante Roche locale.
Manipolare i campioni come se fossero infettivi, adottando tutte le procedure per la sicurezza in laboratorio delineate nelle linee guida
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (11) e nel documento CLSI M29-A (12). Pulire e disinfettare accuratamente tutte le
superfici di lavoro e i guanti con un reagente di decontaminazione del DNA specifico (ad esempio, LTK-008™). Controllare che i guanti siano
resistenti al reagente di decontaminazione del DNA.
Per manipolare i reagenti indossare camici da laboratorio, guanti monouso e una protezione adeguata per gli occhi. Evitare che i reagenti
entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua onde evitare
possibili ustioni. In caso di fuoriuscita accidentale dei reagenti, diluire con acqua prima di asciugare.
Il flusso di lavoro del laboratorio deve procedere in modo unidirezionale, a partire dall’area di preamplificazione per poi passare all’area di
postamplificazione (amplificazione/rivelazione). Le attività di preamplificazione prevedono la preparazione dei reagenti e la preparazione dei
campioni. Le forniture e le attrezzature devono essere dedicate a ciascuna attività di preamplificazione e non devono essere utilizzate per
altre attività, né spostate da un’area all’altra. I guanti devono essere indossati in tutte le aree e devono essere sostituiti con guanti nuovi
prima di lasciare un’area. Le forniture e le attrezzature utilizzate per la preparazione dei reagenti non devono essere impiegate per le attività
di manipolazione di campioni e controlli, né per il pipettamento o il trattamento del DNA amplificato o di altre fonti di DNA bersaglio.
Le forniture e le attrezzature utilizzate per la postamplificazione devono restare sempre nell’area di pertinenza.
La presenza dell’enzima AmpErase nel Master Mix riduce il rischio di contaminazione dell’amplicon. Ciononostante è possibile evitare la
contaminazione per opera di controlli e campioni positivi soltanto attenendosi alla buona prassi di laboratorio e alle procedure descritte in
questo foglietto illustrativo.
2
Avvertenze e precauzioni specifiche per l’uso del LightCycler® SeptiFast mecA Test MG
Nell’ambiente è presente DNA batterico. Per prevenire la produzione di risultati falsi positivi dovuti alla rivelazione di DNA ambientale (contaminazione del
DNA), è necessario garantire l’assenza di DNA contaminante nel flusso di lavoro. In particolare, l’operatore stesso può costituire fonte di contaminazione
del DNA, in quanto la pelle umana e le vie respiratorie superiori sono popolate da microorganismi che possono contenere il gene bersaglio del
LightCycler® SeptiFast mecA Test MG (ovvero lo Staphylococcus aureus resistente alla meticillina o gli Staphilococci negativi alla coagulasi e resistenti
alla meticillina). Di seguito vengono forniti consigli su come evitare la contaminazione del DNA.
Reagenti e materiali di consumo del LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
• I reagenti e i materiali di consumo del LightCycler® SeptiFast mecA Test Kit MG sono di qualità MG.
• I prodotti MG sono appositamente progettati per la rivelazione ad alta sensibilità degli acidi nucleici di batteri e funghi.
Sono stati sviluppati processi di produzione proprietari per evitare la contaminazione del DNA, che potrebbe interferire con i saggi.
• Evitare di aprire e chiudere le fiale dei reagenti se non quando strettamente necessario.
Indumenti e guanti
• Indossare guanti antistatici durante l’intero flusso di lavoro.
• Evitare l’esposizione della pelle. Indossare i guanti sopra le maniche del camice da laboratorio.
• In caso di contaminazione, sostituire immediatamente i guanti o trattarli con un reagente di decontaminazione del DNA
(ad esempio LTK-008™; i guanti devono essere resistenti al reagente).
• Evitare di toccare il palmo e le dita dei guanti indossandoli.
Cura della workstation PCR
• Pulire le superfici della workstation PCR con un reagente di decontaminazione del DNA dopo ogni configurazione della PCR.
• NOTA: assicurarsi che l’attrezzatura sia resistente al reagente di decontaminazione del DNA.
• Pulire tutte le superfici all’interno della workstation PCR a intervalli regolari (pareti, spazi sotto la piastra inferiore, base).
• Se la workstation PCR è utilizzata da più utenti, assicurarsi che non siano presenti tracce di DNA.
• Accendere la lampada UV almeno 30 minuti prima di iniziare a lavorare.
• Spegnere la lampada UV durante l’uso dello strumento.
• NOTA: sostituire la lampada UV della workstation PCR attenendosi alle istruzioni del produttore.
Trattamento di dispositivi e materiali di consumo
• Se possibile, lasciare nella workstation PCR i materiali di consumo e i dispositivi specifici che vengono utilizzati per il LightCycler® SeptiFast
mecA Test MG.
• Prima dell’uso, irradiare tutti gli oggetti con la lampada UV per almeno 30 minuti.
• Utilizzare solo materiali di consumo privi di DNA (ad esempio materiali di qualità MG; fare riferimento al foglietto illustrativo del
LightCycler® SeptiFast Test MG). Utilizzare i materiali una sola volta.
• Utilizzare l’apposito arnese per la chiusura dei capillari (per le istruzioni d’uso, fare riferimento a Manuale Operativo dello strumento
LightCycler® 2.0).
• In caso di rottura dei capillari, fare riferimento al Manuale Operativo dello strumento LightCycler® 2.0 (capitolo “Manutenzione”).
Precauzioni durante il pipettamento
• Aprire le fiale dei reagenti, le confezioni dei puntali delle pipette e le confezioni dei capillari solo sotto il flusso laminare.
• Non utilizzare gli stessi puntali delle pipette e gli stessi capillari all’esterno del flusso laminare.
• Non toccare il bordo o la filettatura delle fiale aperte. Durante il pipettamento, toccare la fiala sotto il bordo.
• Non toccare il bordo dei capillari aperti.
• Durante le procedure, disporre tutti gli elementi sotto il flusso laminare in un ordine logico.
• Se si verifica una fuoriuscita, concludere il passaggio in corso e immediatamente dopo pulire l’area di lavoro con un reagente di
decontaminazione del DNA (ad esempio, LTK-008™).
REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE
• Conservare tra -15 e -25°C.
• Conservare al buio.
• Conservare la soluzione Master Mix (per la preparazione della soluzione Master Mix, vedere la sezione Preparazione dei reagenti) a una
temperatura compresa tra 2–8°C per un massimo di 72 ore.
• Conservare le fiale aperte al massimo per 6 mesi dopo la prima apertura. Non utilizzare dopo la data di scadenza.
• Congelare e scongelare le fiale aperte al massimo per 4 volte dopo la prima apertura.
• Non utilizzare dopo la data di scadenza.
MATERIALI FORNITI
SeptiFast Lys Kit MG
P/N: 04 404 432 001
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001
10 test
LightCycler® SeptiFast Kit MG
P/N: 04 469 046 001
54 test
SeptiFast Software Set v1.1
(fornito una volta)
P/N: 04 705 220 001
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
P/N: 04 488 814 001
100 test
2 x 15 test
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
Fare riferimento al foglio illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG.
PRELIEVO, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
NOTA: maneggiare tutti i campioni come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi.
Prelievo dei campioni
Il prelievo dei campioni è descritto nel foglio illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG.
3
Trasporto e conservazione dei campioni
Il trasporto e la conservazione dei campioni sono descritti nel foglio illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG.
Conservazione dell’eluato
È possibile conservare l'eluato per un massimo di 4 ore a una temperatura compresa tra 15° e 25ºC, per 8 giorni a una temperatura compresa tra
2° e 8ºC oppure per 30 giorni a una temperatura compresa tra -15° e -25ºC.
ISTRUZIONI PER L’USO
Prima di iniziare la preparazione dei reagenti
Compensazione del colore
L’uso del LightCycler® Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001) è un prerequisito. Per i dettagli, fare riferimento al foglio illustrativo del
LightCycler® Multicolor Compensation Set.
Installazione del programma SeptiFast Identification Software (SIS) e della macro SeptiFast mecA
Prima di eseguire il test è necessario installare il programma SeptiFast Identification Software (SIS) e la macro SeptiFast mecA (nome file: SeptiFast
mecA_1.0_04488814001 o versioni successive). Per i dettagli, fare riferimento al foglio illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG.
Preparazione dei controlli
• È possibile acquistare il materiale di controllo positivo da altre società.
• Come materiale di controllo positivo per il LightCycler® SeptiFast mecA Test MG e per il LightCycler® SeptiFast Test MG, è possibile
utilizzare il materiale ATCC 33592, uno S. aureus resistente alla meticillina. La preparazione è descritta nel foglietto illustrativo del
LightCycler® SeptiFast Test MG.
• Il controllo positivo deve essere utilizzato durante tutto il flusso di lavoro, come qualunque altro campione.
Preparazione dei reagenti con il LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
1.
2.
3.
4.
Pulire e decontaminare accuratamente la cappa a flusso laminare e la workstation PCR (ad esempio, con LTK-008™).
Accendere per almeno 30 minuti la lampada UV e il flusso d’aria della cappa a flusso laminare e la lampada UV della workstation PCR.
Spegnere la lampada UV durante l’uso dello strumento.
Scongelare i componenti del LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG a temperatura ambiente per circa 20 minuti, al riparo dalla luce diretta.
Miscelare brevemente in vortex e centrifugare brevemente a impulsi.
5. A seconda del numero totale di campioni da analizzare (più le due reazioni aggiuntive per il controllo negativo e il reagente di controllo),
inserire i capillari LightCycler® negli adattatori per centrifuga preraffreddati.
6. Preparare il Master Mix moltiplicando la cifra riportata nella colonna “Volume” per il numero di reazioni da eseguire (eluati dei campioni, eluato
del controllo negativo ed eluato del reagente di controllo), più una reazione aggiuntiva per garantire un volume di pipettamento sufficiente. Per
una reazione standard da 100 µl, procedere nel modo descritto di seguito.
Passaggio
Operazione
1
Preparazione del Master Mix
In una provetta da reazione da 1,5 ml a 2-8°C, aggiungere i seguenti componenti nell’ordine indicato:
Componente
Volume (µl)
DI
13,5
BU
12
DM
10
IC
2
RM 1b
8,5
DE
1
RM 1a
3
Volume totale
50
2
3
4
5
6
• Miscelare con delicatezza mediante pipettamento. Non utilizzare il vortex.
• Pipettare 50 µl di Master Mix in ciascun capillare LightCycler® preraffreddato.
• Aggiungere 50 µl di ciascun eluato del campione in un capillare separato, quindi chiudere il capillare utilizzando
l’apposito arnese.
• Aggiungere 50 µl di eluato di controllo negativo (NC) in un capillare. Il controllo negativo (NC) non fa parte del
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG e viene preparato sottoponendo a trattamento il controllo negativo (NC) del
LightCycler® SeptiFast Test MG. I campioni ottenuti dalla preparazione di ciascun campione e dal batch PCR
devono essere analizzati insieme al controllo negativo (NC) preparato nello stesso batch. Non combinare in una
stessa seduta campioni preparati in batch diversi. Chiudere il capillare utilizzando l’apposito arnese.
• Aggiungere 50 µl di reagente di controllo (RC) in un capillare. Chiudere il capillare utilizzando l’apposito arnese.
Trasferire tutti i capillari sul rotore porta campioni LightCycler®, in base all’elenco di caricamento dei campioni
impostato nella macro SeptiFast mecA (RC, NC, campione 1, campione 2 ...).
Centrifugare il rotore porta campioni LightCycler® utilizzando la centrifuga per rotore porta campioni LC 2.0
(controllare il livello del liquido nei capillari).
Introdurre il rotore porta campioni LightCycler® nello strumento LightCycler® 2.0.
Caricamento e funzionamento dello strumento LightCycler® 2.0
NOTA: si consiglia di utilizzare lo strumento LightCycler® 2.0 in un locale diverso da quello in cui hanno luogo la purificazione del DNA e
la preparazione delle soluzioni di lavoro.
1. Avviare la macro SeptiFast mecA (nome file: SeptiFast mecA_1.0_04488814001 o versioni successive). Fare riferimento all’argomento “Esecuzione
di una macro Roche” nel Manuale Operativo dello strumento LightCycler® 2.0.
NOTA: non utilizzare il campo <assay lot number>. Se si desidera aggiungere il numero di lotto alla seduta, immettere questa
informazione nel campo corrispondente del Sample Editor.
NOTA: se l’utente non è connesso, non procedere con la seduta. Avviare una nuova seduta con un nome diverso.
4
2. Salvare la seduta con un nome univoco che ne consenta l’identificazione certa (ad esempio, nome utente e data).
3. Ridurre i campioni nell’elenco di caricamento predefinito se sono richiesti meno di 5 campioni. Se involontariamente si cancellano troppi
capillari, non aggiungerli ma riavviare la procedura dall’inizio.
4. Immettere i dati specifici del paziente tra <parentesi angolari> (ad esempio, mecA <Nome-01>).
5. Dopo avere aggiunto tutte le informazioni specifiche sui campioni, proseguire con la procedura guidata relativa al kit e avviare la seduta
dello strumento LightCycler® 2.0.
6. Al termine della seduta, controllare il livello del liquido nei capillari (i risultati per un capillare non sono validi se il volume nel capillare è variabile).
NOTA: non modificare i prefissi dei nomi dei campioni. Non cancellare le parentesi angolari. Ogni campione deve necessariamente
contenere il prefisso specifico del saggio (mecA) per consentire l’identificazione da parte del sistema SIS. Non modificare il nome del
reagente di controllo e del controllo negativo.
Rilevamento del picco e identificazione automatica del picco
Spiegazione generale dei moduli di analisi
• Il modulo TM Calling manuale prevede l’intervento manuale in due moduli TM Calling applicati automaticamente. Il modulo Absolute
Quantification, anch’esso applicato automaticamente, non richiede interventi manuali.
• La barra TM di ogni modalità di analisi è predefinita nella macro SeptiFast mecA.
• Nella finestra del picco di melting sono visualizzate tutte le curve dei diagrammi selezionati.
• È possibile selezionare o deselezionare le barre TM.
• La linea di base di ogni modalità di analisi è predefinita nella macro SeptiFast mecA.
• Non modificare o deselezionare le linee di base. In caso di modifiche accidentali, immettere i valori corretti facendo riferimento alla tabella 2,
contenente i valori della linea di base.
• Se è attivato più di un capillare, nella casella di controllo sono visualizzate le impostazioni del primo capillare.
• Lo spostamento delle barre ha effetto su tutti i capillari attivati.
NOTA: non modificare le impostazioni <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> e
<Peak Width>.
• La definizione di “picco” è: il valore massimo al di sopra della linea di base. Gli “shoulder” non sono picchi.
• I cursori devono essere selezionati negli intervalli TM validi (vedere la Tabella 1).
Tabella 1. Intervalli TM per i picchi validi
CH 640
mecA
•
CH 705
TM bassa (°C)
TM alta (°C)
TM bassa (°C)
TM alta (°C)
62,00
69,00
51,50
58,50
I valori delle linee di base sono predefiniti secondo la seguente tabella e non devono essere modificati (in caso di modifiche accidentali,
immettere nuovamente i valori in base all’elenco, onde evitare che la seduta sia contrassegnata da flag).
Tabella 2. Valori delle linee di base
mecA
CH 640
CH 705
0,021
0,022
Regolazione delle barre TM
1. Al termine della seduta, la procedura guidata dell’esperimento visualizza la finestra <Analyses have been created>.
2. Spostare la finestra in basso (senza premere il tasto <Finish>).
3. Verificare che i valori TM e Baseline siano visibili.
4. Fare clic sul modulo di analisi (ad esempio, TM Calling mecA 640).
5. Attivare tutte le posizioni del saggio per visualizzare un riepilogo.
6. Fare clic solo sulla posizione mecA #RC#.
7. Regolare la barra TM in modo da visualizzare il picco massimo sopra la linea di base. Concentrare l’attenzione solo sull’intervallo TM valido.
Se non c’è un picco al di sopra della linea di base, la barra TM deve essere cancellata (deselezionare la casella di controllo corrispondente).
Al termine dell’uso del modulo TM Calling per un capillare specifico, deve essere presente un solo picco massimo dotato di barre TM.
8. Attivare la posizione successiva (ad esempio, mecA #NC#) insieme a mecA #RC# per visualizzare un riepilogo (verrà eseguito un
ridimensionamento automatico in base al picco più alto).
9. Attivare solo la posizione selezionata (ad esempio, mecA #NC#) (verrà eseguito un ridimensionamento automatico in base ai picchi del fondo
del controllo negativo (NC); è possibile che la linea di base non sia più visibile).
10. Procedere con il rilevamento del picco dei campioni, come descritto nei passaggi 5-7.
11. Al termine dell’analisi del primo canale di rivelazione (TM Calling mecA 640), passare a TM Calling mecA 705, come descritto nei passaggi 4-10.
Conclusione del modulo TM Calling
1. Spostare la procedura guidata dell’esperimento al centro del monitor e premere il tasto <Finish>.
2. Viene automaticamente generato il Report LightCycler®, che dovrà essere stampato.
3. La seduta viene salvata automaticamente.
4. Esportare il file *.ixo nel percorso <C:\Export to SIS>.
5. Verificare l’eventuale presenza di flag nel report e controllare se è visualizzato il messaggio <run state: complete>.
6. Se sono presenti flag o altri messaggi relativi allo stato della seduta, la seduta non è considerata valida e tutti i campioni dovranno essere
analizzati nuovamente.
Identificazione automatica dei picchi con il programma SeptiFast Identification Software (SIS)
1. Fare doppio clic sull’icona SIS sul desktop e premere <Start>.
2. Selezionare la seduta nella cartella <C:\Export to SIS> e caricare il file *.ixo.
3. Scegliere “Yes” oppure “No” per specificare se il report LightCycler® contiene o meno il flag <User Developed or Modified Test Method>.
4. Il file *.ixo verrà analizzato automaticamente e i dati verranno visualizzati in un report.
5. Stampare il report SIS.
5
RISULTATI
Interpretazione dei risultati
Il programma SeptiFast Identification Software (SIS) può generare FLAG e COMMENTI , denominati RUN FLAGS, ASSAY FLAGS e FLAGS e visualizzati nella
casella SPECIMEN (vedere sotto). L’operatore è tenuto a controllare le stampe delle sedute per verificare la presenza di eventuali FLAG o COMMENTI nella
casella SPECIMEN.
Figura 1. Casella Specimen
Specimen
Assay
Data
Result
SeptiFast mecA
sample 1
mecA
<CH ..., TM ..., PH ..., CP...>
<mecA>
SeptiFast mecA
sample 2
mecA
Flags
Comment
\
Nei campi COMMENT dei RUN FLAGS e degli ASSAY FLAGS sono disponibili ulteriori informazioni. La Tabella 3 contiene un elenco completo dei flag.
Risultati dei campioni
Il termine <mecA> nel campo RESULT indica che il campione è risultato positivo al gene mecA.
Nota: controllare il campo dei commenti del LightCycler® SeptiFast Test MG se viene visualizzato il flag <for mecA resistance testing:
Peak for CoNS from SML detected>1. Per ulteriori informazioni fare riferimento al paragrafo Limiti della procedura.
I dati grezzi dei picchi pertinenti sono visualizzati nel campo DATA e includono il canale (CH), il punto di melting (TM), l’altezza del picco (PH) e il punto
di incrocio (CP 2).
Il simbolo \ nel campo RESULT indica che non è stato rilevato alcun analita rispondente ai criteri definiti per mecA.
1
2
La sigla SML sta per SeptiFast Master List. Per i dettagli, fare riferimento al foglietto illustrativo del LightCycler® SeptiFast Test MG
Viene indicato il punto di incrocio (CP) per il canale 640
Validazione della seduta
La validazione della seduta viene eseguita dal programma SeptiFast Identification Software. I risultati non validi vengono visualizzati automaticamente
e contrassegnati con .
Di seguito sono riportati i commenti dei flag e il loro significato.
Tabella 3. Flag relativi alla validazione della seduta
Commenti3
Significato
ASSAY FLAG
NC: IC not detected
ASSAY FLAG
NC: < CH …, TM …, PH …, CP …>,< mecA > Nel controllo negativo (NC) è stato rilevato il gene mecA.
ASSAY FLAG
RC: No amplicon: <mecA>
SPECIMEN FLAG IC not detected
3
Nel controllo negativo (NC) non è stato rilevato nessun gene mecA e nessun
controllo interno (IC).
Errore del reagente di controllo (RC).
Nel campione non è stato rilevato nessun gene mecA e nessun controllo interno (IC).
Gli errori di sistema sono descritti nella sezione Risoluzione dei problemi
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
In ogni seduta di analisi è necessario includere un controllo negativo (NC) e un reagente di controllo (RC). I controlli NC e RC devono essere collocati
esattamente nelle posizioni descritte nella sezione Preparazione dei reagenti.
Come Controllo Positivo, si raccomanda di utilizzare un materiale positivo disponibile presso Roche durante l’intero flusso di lavoro, come descritto
nella sezione Preparazione dei controlli.
Il software SIS determina il risultato dei controlli IC, NC e RC. Se i controlli non rispondono ai criteri definiti, tutti i risultati dei campioni saranno
accompagnati da un flag. Controllare la casella SPECIMEN nella stampa dei risultati per verificare l’eventuale presenza di flag e commenti e confermare
la validità della seduta.
Controllo negativo (NC)
Il controllo negativo (NC) deve dare un risultato negativo, mentre il controllo interno (IC) deve dare un risultato positivo. Se il controllo negativo (NC)
non risponde a questi criteri, tutti i risultati dei campioni vengono contrassegnati con un flag e l’intera seduta deve essere ripetuta.
Reagente di controllo (RC)
Il reagente di controllo (RC) deve essere positivo all’amplicon del gene mecA. Se il reagente di controllo (RC) non risponde a questo criterio, tutti i
risultati dei campioni vengono contrassegnati con un flag e l’intera seduta deve essere ripetuta.
Controllo positivo (PC)
Il controllo positivo (PC) deve dare un risultato positivo. Se il controllo positivo (PC) non risponde a questo criterio, la seduta non è valida. Il software
SIS non visualizza nessun flag e l’intera seduta deve essere ripetuta.
Controllo interno (IC)
Il controllo interno (IC) deve dare un risultato positivo in tutti i campioni negativi, oltre che nel controllo negativo (NC). Se il controllo interno (IC) non
risponde a questo criterio, il risultato del campione viene contrassegnato con un flag.
In presenza di controlli non validi, ripetere l’intera procedura (preparazione di campioni e controlli, amplificazione e rivelazione di tutti e 3 i saggi con il
LightCycler® SeptiFast Test MG e successivo test di resistenza con il LightCycler® SeptiFast mecA Test MG). Se i controlli producono risultati
costantemente non validi, richiedere assistenza tecnica all’ufficio Roche locale.
6
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
Tabella 4. Errori di sistema visualizzati come COMMENTS di RUN FLAGS e nelle stampe del software SIS
Messaggio di sistema
Possibile causa
(visualizzato sotto le voci Flag
delle stampe SIS)
Azione correttiva
User Developed or Modified
Test Method
La seduta non è valida. Le possibili cause sono
descritte nel Manuale Operativo dello strumento
LightCycler® 2.0. È possibile che siano state
apportate modifiche alle impostazioni predefinite
della macro (ad es. linea di base, protocollo della
seduta ecc.).
Aprire il file *.ixo originale nel software LightCycler® e
controllare i valori della linea di base facendo riferimento
alla Tabella 2. Salvare ed esportare di nuovo.
CCC File Name:
Multiple CCC used!
Sono stati attivati due o più file per la compensazi- Selezionare la corretta compensazione del colore e
one del colore in uno o più moduli di analisi.
ricalcolare.
Color Compensation has
expired on DD-Month-YY
L’oggetto compensazione del colore risale a più di Creare un nuovo oggetto compensazione del colore.
sei mesi prima.
Invalid Macro
È stata applicata una macro errata.
Cercare la macro corretta nel software LightCycler® e/o
SeptiFast Software Set.
Invalid Baseline
I valori della linea di base potrebbero essere stati
modificati accidentalmente.
Aprire il file *.ixo originale nel software LightCycler® e
controllare i valori della linea di base facendo riferimento
alla Tabella 2. Salvare ed esportare di nuovo.
Invalid Control Tube
Sono stati assegnati nomi errati ad uno o più
controlli.
Aprire il file *.ixo originale nel software LightCycler® e
controllare l’ortografia dei nomi dei controlli nel Sample
Editor. Ripristinare i nomi predefiniti, salvare ed esportare
di nuovo.
Missing Sample Tube
Sono stati assegnati nomi errati ad uno o più
capillari dei campioni. Oppure mancano i capillari
dei campioni.
Aprire il file *.ixo originale nel software LightCycler® e
controllare l’ortografia dei nomi dei campioni nel Sample
Editor. Ripristinare i nomi predefiniti, salvare ed esportare
di nuovo.
Invalid LightCycler® SW
Version
Alla procedura è stata applicata una versione
errata del software LightCycler®.
Aprire il software LightCycler® e controllare che il numero
della versione sia corretto.
No Manual TM Calling
Non è stata eseguita nessuna procedura manuale Aprire il software LightCycler® ed eseguire una procedura
TM Calling (né nei campioni, né nei moduli di
manuale TM Calling. Salvare ed esportare di nuovo.
analisi). La macro è terminata senza analisi.
+ additional run flags
Sono stati individuati più di 5 flag per la seduta.
Invalid CCC File Name
Sono stati attivati due o più file per la compensazi- Selezionare il file corretto per la compensazione del colore
one del colore in uno o più moduli di analisi.
e ricalcolare.
Cercare di risolvere i flag con descrizione specifica,
rieseguire la seduta con SIS.
Se sono assenti uno o più campioni dal report SIS, verificare se i nomi assegnati ai capillari dei campioni sono corretti o controllare se vi sono capillari
mancanti. Per correggere l’errore, aprire il file *.ixo originale nel software LightCycler® e controllare l’ortografia dei nomi dei campioni nel Sample Editor.
Ripristinare i nomi predefiniti, salvare ed esportare di nuovo.
LIMITI DELLA PROCEDURA
• Se lo S. aureus è stato identificato con il LightCycler® SeptiFast Test MG e nel campo dei commenti nella casella Specimen è riportato il
messaggio <for mecA resistance testing: Peak for CoNS from SML detected>, significa che è stata identificata una miscela di S. aureus e
CoNS. L’identificazione del gene mecA potrebbe essere dovuta ad un gene mecA portatore del ceppo degli stafilococchi coagulasi-negativi
(in sigla CoNS) e non alla presenza di stafilococchi resistenti alla meticillina (in sigla MRSA).
• Sebbene i geni mecA portatori di CoNS non siano rilevati dal LightCycler® SeptiFast Test MG, l’identificazione del gene mecA potrebbe
essere dovuta alla presenza di CoNS sotto al limite di sensibilità e non alla presenza di MRSA.
• Al di sotto del limite di sensibilità specificato (fare riferimento alla sezione Sensibilità analitica), possono verificarsi dei falsi negativi in quanto
la rivelazione del DNA dello S. aureus con il LightCycler® SeptiFast Test MG potrebbe essere più sensibile rispetto alla rivelazione del DNA
del gene mecA con il LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG.
• Il LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG identifica il gene mecA ma non consente di identificare inequivocabilmente il fenotipo.
• Il test è stato validato per l’uso soltanto con sangue umano raccolto in anticoagulante K-EDTA. L’impiego del test con altri tipi di campioni
potrebbe produrre risultati errati, falsi negativi o falsi positivi.
• L’uso di questo prodotto dovrebbe essere consentito esclusivamente a personale con un’adeguata conoscenza del flusso di lavoro del
LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG.
• Il rendimento del LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG è stato definito sulla base di sangue contenente tra 1.000 - 30.000 WBC/µl.
7
VALUTAZIONE DEL RENDIMENTO NON CLINICO
Sensibilità analitica
La sensibilità minima è di 30 CFU/ml di sangue con K-EDTA. Dallo studio descritto di seguito risulta che il limite di sensibilità per l’MRSA è stato
determinato con il LightCycler® SeptiFast Test MG per lo S. aureus e con il LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG per il mecA. Sono state utilizzate
diluizioni in serie di una concentrazione nota di MRSA (ATCC 33592) per arricchire sangue intero proveniente da donatori sani. Quindi i campioni
arricchiti sono stati trattati secondo le modalità descritte nei foglietti illustrativi dei test corrispondenti. Ogni livello è stato analizzato in otto replicati
utilizzando due lotti. Nella Tabella 5 sono riportati i dati combinati di entrambi i lotti. Il limite di sensibilità corrisponde a 7,7 CFU/ml (95%) CI=[4,9 - 19,0]
per lo S. aureus e a 24,2 CFU/ml (95%) CI=[15,9 - 48,9] per il mecA.
Tabella 5. Limite di sensibilità
Concentrazione di MRSA [CFU/ml]
Nr. di positivi al mecA
Nr. di positivi allo S. aureus
100
16/16
16/16
50
16/16
16/16
25
14/16
16/16
12,5
14/16
16/16
6,25
10/16
14/16
3,13
5/16
13/16
1,56
1/16
7/16
0,78
0/16
4/16
0
0/16
0/16
Specificità analitica
Inclusività
L’inclusività è stata analizzata con il DNA genomico di 167 ceppi di MRSA. I ceppi analizzati comprendevano un ceppo di riferimento (ATCC 33592) e
166 isolati clinici provenienti da Europa e USA. Gli isolati contenevano SCCmec tipi I-V, così come caratterizzati mediante elettroforesi a campi pulsati
(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). SCCmec è l’abbreviazione di Staphylococcal Chromosomal Cassette, un elemento genetico mobile che
contiene il gene mecA. Sono stati analizzati inoltre 588 isolati clinici di MRSA senza ulteriore caratterizzazione molecolare. In 580 isolati è stato
identificato il gene mecA, mentre i restanti 8 isolati sono risultati vicini alla soglia della resistenza alla oxacillina (Borderline Oxacillin Resistant
S. aureus, in sigla BORSA) oppure S. aureus modificati (Modified S. aureus, in sigla MODSA)4, con un MIC inferiore a 8 µg di oxacillina per ml.
Esclusività
Sono stati analizzati campioni di DNA da un pannello di agenti patogeni (13) notoriamente causa di infezioni nel flusso sanguigno, da ceppi
strettamente correlati a questi patogeni e da ceppi che da un punto di vista filogenetico sono strettamente correlati allo S. aureus. Tutte le specie
analizzate sono risultate negative al mecA.
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Cryptococcus neoformans
Pantoea agglomerans
Acinetobacter baumannii
Enterobacter aerogenes
Peptostreptococcus magnus
Aeromonas hydrophila
Enterobacter cloacae
Porphyromonas gingivalis
Aspergillus fumigatus
Enterobacter taylore
Prevotella denticola
Bacillus cereus
Enterococcus faecalis
Propionibacterium acnes
Bacteroides fragilis
Enterococcus faecium
Proteus mirabilis
Bartonella henselae
Escherichia coli
Proteus vulgaris
Bordetella pertussis
Gemella haemolysans
Pseudomonas aeruginosa
Borrelia burgdorferi
Histoplasma capsulatum
Salmonella enterica
Burkholderia cepacia
Klebsiella oxytoca
Serratia marcescens
Campylobacter jejuni
Klebsiella pneumoniae
Shigella sonnei
Candida albicans
Legionella pneumophila
Staphylococcus aureus
Candida glabrata
Listeria monocytogenes
Staphylococcus epidermidis
Candida krusei
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Staphylococcus haemolyticus
Candida parapsilosis
Morganella morganii
Stenotrophomonas maltophilia
Candida tropicalis
Mycobacterium fortuitum
Streptococcus agalactiae
Cardiobacterium hominis
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus mitis
Citrobacter freundii
Mycobacterium xenopi
Streptococcus pneumoniae
Clostridium perfringens
Mycoplasma pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Corynebacterium jeikeium
Neisseria meningitidis
Yersinia enterocolitica
Lo streptococco BORSA ha una resistenza di basso livello, in base all'aumento della produzione di β-lattamasi; lo streptococco MODSA ha
proteine leganti la penicillina con strutture alterate, con una minore affinità di legame o iperproduzione di PBP (rara). Nessuno dei due gruppi è
portatore del gene mecA.
4
8
Sostanze interferenti
Le seguenti sostanze non interferiscono con il test ai fini dell’identificazione del DNA del gene mecA.
Tabella 6. Sostanze interferenti
Nr.
Nome commerciale
Principio attivo
Produttore
1x Cmax
3x Cmax
Unità
1
Piperacillin®
Piperacillina
Hexal
4,0
12,0
mg/ml
2
Fortum®
Ceftazidima
GlaxoSmithKline
0,50
1,5
mg/ml
3
Zienam®
Imipenem/Cilastatina
MSD Sharp & Dohme
0,27
0,67
mg/ml
4
Tazobac®
Piperacillina/Tazobactam
Wyeth Pharma
0,75
2,3
mg/ml
5
Ciprobay®
Ciprofloxacina
Bayer
33,3
100,0
µg/ml
6
Vancomycin®
Vancomicina
Lilly
83,0
250,0
µg/ml
7
Refobacin®
Gentamicina
Merck
80
240
µg/ml
8
Zyvoxid®
Linezolide
Pfizer
0,10
0,30
mg/ml
9
Sobelin®
Clindamicina
Pfizer
0,30
0,90
mg/ml
10
InfectoClont®
Metronidazolo
Infectopharm
83,3
250,0
µg/ml
11
Diflucan®
Fluconazolo
Pfizer
0,13
0,39
mg/ml
µg/ml
12
Cancidas®
Caspofungina
MSD Sharp & Dohme
8,3
25,0
13
Amphotericin B®
Anfotericina B
Bristol-Myers Squibb
20
60
µg/ml
14
Novalgin®
Metamizolo
Aventis Pharma
0,83
2,5
mg/ml
15
Dexahexal®
Dexametasone
Hexal
1,3
4,0
µg/ml
16
ARA-cell®
Citarabina
cell pharm
63,3
190,0
µg/ml
17
Arterenol®
Norepinefrina (Noradrenalina)
Aventis Pharma
4,8
14,4
µg/ml
18
Aquo-Trinitrosan®
Glicerolo nitrato
Merck
1,3
4,0
µg/ml
19
Heparin-Natrium-5000ratiopharm®
Eparina
ratiopharm
0,83
2,5
U.I./ml
AVVISO PER L’ACQUIRENTE
Acquistando il presente prodotto si acquisisce il diritto all’uso dello stesso per le finalità di amplificazione e rivelazione delle sequenze di acidi nucleici
a scopo diagnostico in vitro su campioni di origine umana. Non si acquisisce tuttavia nessun’altra licenza di nessun tipo, ad eccezione del suddetto
diritto specifico all’uso, derivante dall’acquisto.
9
BIBLIOGRAFIA
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susceptibility of isolates collected in 1997 in the United States, Canada, and Latin America from the SENTRY Antimicrobial Surveillance
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Program, 1997-1999, Clin Infect Dis 32 (2001) (suppl 2), S114-S132.
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175(5):264-7.
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Severe Sepsis, Am J Med. (2003); 115: 529-35.
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9. Paterson, D.L., et al. Empirical antibiotic choice for the seriously ill patient: are minimization of selection of resistant organisms and
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11. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
12. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and
Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.
13. Cockerill FR 3rd, et al, Analysis of 281,797 consecutive blood cultures performed over an eight-year period: trends in microorganisms isolated
and the value of anaerobic culture of blood, Clin Infect Dis. 1997; 24 (3): 403-18.
10
11
Prodotto in Germania per conto di:
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
"Ú
Distributed by
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
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CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
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Piazza Durante 11
I-20131 Milano
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P-2700 Amadora
C
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Aquo-Trinitrosan® è un marchio registrato di proprietà della Merck & Co., Inc.
ARA-cell® è un marchio registrato di proprietà della cell pharma GmbH.
Arterenol® è un marchio registrato di proprietà della Aventis Pharma Ltd.
Cancidas® è un marchio registrato di proprietà della MSD Sharp & Dohme GmbH.
Ciprobay® è un marchio registrato di proprietà della Bayer AG.
Dexahexal® è un marchio registrato di proprietà della Hexal AG.
Diflucan® è un marchio registrato di proprietà della Pfizer Inc.
Fortum® è un marchio registrato di proprietà della GlaxoSmithKline.
Heparin-Natrium-5000-ratiopharm® è un marchio registrato di proprietà della ratiopharm International.
InfectoClont® è un marchio registrato di proprietà della Infectopharm GmbH.
LTK-008™ è un marchio registrato di proprietà della biodelta, ZTB GmbH.
Novalgin® è un marchio registrato di proprietà della Aventis Pharma Ltd.
Piperacillin® è un marchio registrato di proprietà della Hexal AG.
Refobacin® è un marchio registrato di proprietà della Merck & Co., Inc.
Sobelin® è un marchio registrato di proprietà della Pfizer Inc.
Tazobac® è un marchio registrato di proprietà della Wyeth Pharmaceuticals AG.
Vancomycin® è un marchio registrato di proprietà della Lilly Pharma Holding GmbH.
Zienam® è un marchio registrato di proprietà della MSD Sharp & Dohme GmbH.
Zyvoxid® è un marchio registrato di proprietà della Pfizer Inc.
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2/2007
04623932001-02
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