Esperimenti di irraggiamento: curve di crescita

Esperimenti di irraggiamento: curve di crescita
Gastone CASTELLANI1 , Daniel REMONDINI1 ,
Lorenzo DARPE3, Paolo MONDARDINI2
1
Physics Dept. Bologna University, Viale B. Pichat 6/2, 40127 Bologna IT
[email protected]
2
Medicine Faculty, Bologna University, Via Massarenti 9, 40127 Bologna IT
3
Department of Veterinary Clinical Sciences, Padova University Agripolis-viale dell'Università 16
35020 Legnaro (Padova) IT
In questo report riassumiamo i risultati dei 4 esperimenti svolti su cellule T98G (linea cellulare
glioblastoma di tipo fibroblastoide) in un confronto tra trattato (irraggiato) e controllo (non irraggiato
ma mantenuto nelle stesse condizioni dell'irraggiato).
I vari esperimenti hanno avuto lo scopo di valutare diversi dosaggi del laser (con quasi un fattore 20 tra
la dose minima e la massima testate), osservando la proliferazione in coltura delle cellule in multiwell
per 4 giorni consecutivi (mantenendo le multiwell in incubatore a temperatura e umidità ottimali) e
registrando il numero di cellule a vari istanti di tempo mediante fotografie eseguite con microscopio
ottico in nostra dotazione.
Gli esperimenti hanno mostrato una differenza nella proliferazione per il regime di dose maggiore
(140W per 120s, un irraggiamento al giorno per la durata dell'esperimento, con l'apparato LaseriX
personalizzato per questi esperimenti settato a 30 Khz, modulation 100%) mostrando un aumento della
proliferazione (misurato da un maggiore numero di cellule conteggiate) nel gruppo di cellule irraggiate
rispetto ai controlli non irraggiati. L'esperimento a dose maggiore è stato svolto due volte, per
verificare i risultati ottenuti tenendo conto della variabilità biologica dei campioni e delle condizioni
iniziali (es. semina cellule, pipettaggio, mezzo di cultura ecc.) ottenendo una conferma dell'aumento
della proliferazione per i campioni irraggiati.
In tutti gli esperimenti, le cellule trattate e di controllo sono contenute in due pozzetti multiwell per
ciascun gruppo, e in ogni pozzetto sono stati fotografati 6 differenti campi, per un totale di 12
osservazioni per ogni gruppo ad ogni istante di tempo.
I dati mostrati nelle figure sono normalizzati rispetto al valore al tempo zero (immediatamente
successivo al primo irraggiamento) per tenere conto di eventuali disomogeneità nella densità iniziale di
cellule seminate in ogni pozzetto: questo espediente permette di confrontare le osservazioni nei trattati
e nei controlli in termini di avanzamento relativo della crescita cellulare.
I conteggi sono stati svolti inizialmente a mano, e successivamente mediante un algoritmo di conteggio
automatico messo a punto dal nostro gruppo appositamente per questo set di esperimenti, che è stato
validato sui risultati del conteggio manuale.
NOTA: in tutti gli esperimenti il laser è stato settato a 30 Khz, modulation 100%.
Esperimento 1:
In questo esperimento è stato utilizzato Laserix con potenza di picco pari a 80W e un tempo di
irraggiamento di 12 secondi; l'irraggiamento è stato svolto una volta al giorno per 3 giorni.
La dose totale per unità di superficie è stata pari a circa 3 J/cm2. Questo valore è stato scelto in accordo
con recenti lavori in letteratura relativi ad irraggiamenti in vitro con laser in continuo di potenza
inferiore (attorno ai 40 mW, quindi più di 1000 volte inferiori in potenza).
Come si può notare, non sembrano esserci differenze nei livelli di proliferazione tra controllo e trattato.
Nota: nella fase finale le cellule hanno raggiunto la confluenza, occupando completamente lo spazio a
loro disposizione, quindi è naturale che i valori finali siano uguali per i due gruppi, anche negli
esperimenti mostrati successivamente.
Esperimento 2
In questo esperimento è stato utilizzato Laserix con potenza di picco pari a 80W e un tempo di
irraggiamento di 120 secondi (10 volte superiore al precedente); l'irraggiamento è stato svolto solo il
primo giorno.
La dose totale per unità di superficie è stata pari a circa 10 J/cm2. Questa dose è stata scelta in base ad
una stima della dose somministrata per applicazioni cliniche/ambulatoriali, riscalata tenendo conto
dell'assorbimento e attenuazione del segnale da parte del tessuto epidermico e muscolare, come
mostrato nel nostro precedente lavoro “A study of dosimetry for Near-InfraRed radiation” presentato
all'interno del Congresso “Sysbiohealth 2011”, Bologna.
Anche in questo caso non si evidenziano variazioni significative tra i due gruppi.
Esperimento 3
In questo esperimento è stato utilizzato Laserix con potenza di picco pari a 140W (superiore alla
precedente) e un tempo di irraggiamento di 120 secondi; l'irraggiamento è stato svolto una volta al
giorno per tre giorni.
La dose totale per unità di superficie è stata pari a circa 50 J/cm2, la massima utilizzata per questo
gruppo di esperimenti.
Come si può vedere, prima che le cellule raggiungano la confluenza nelle fasi finali dell'esperimento
(raggiungendo quindi la stessa densità) si osservano valori più alti nel campione irraggiato (punti
evidenziati nel box verde). L'irraggiamento sembra quindi aumentare la capacità di proliferazione nelle
cellule studiate.
Esperimento 4
Anche in questo esperimento è stato utilizzato Laserix con potenza di picco pari a 140W e un tempo di
irraggiamento di 120 secondi; l'irraggiamento è stato svolto una volta al giorno per tre giorni.
La dose totale per unità di superficie è stata pari a circa 50 J/cm2, la massima utilizzata per questo
gruppo di esperimenti.
Rispetto all'esperimento precedente con la stessa dose e lo stesso protocollo, le cellule sono risultate
seminate con una maggiore densità (che nel grafico non si vede essendo il valore a t=0 normalizzato a
1) per cui hanno raggiunto la confluenza verso la metà del terzo giorno invece che dopo 4 giorni.
Per questo motivo nell'ultimo punto del grafico i due valori sono praticamente identici.
Anche in questa ripetizione dell'esperimento a dosi massime si osservano valori più alti nel campione
irraggiato (punti evidenziati nel box verde) che quindi conferma i risultati precedentemente ottenuti.
Misure di termometria
In relazione agli irraggiamenti effettuati, abbiamo eseguito esperimenti di termometria/calorimetria per
stimare la possibile variazione di temperatura nei campioni in funzione della potenza di irraggiamento e
del tempo di esposizione.
Sono stati testati 3 regimi di potenza: 80W, 140W, 400W. I primi due sono stati utilizzati negli
esperimenti svolti finora, mentre l'ultimo corrisponde al valore massimo di potenza ottenibile con
l'apparecchio a nostra disposizione.
Le misure di temperature sono state effettuate mediante termocoppia (sensibilità circa 0.4 °C) in
triplicato per ogni punto osservato. Abbiamo considerato pozzetti multiwell contenenti una quantità di
acqua in analogia con i campioni utilizzati negli esperimenti.
Gli irraggiamenti sono stati eseguiti per vari intervalli di tempo: 30s, 60s, 120s, 300s 600s, in modo da
poter ricostruire curve affidabili per l'aumento della temperatura.
Come si può vedere dalla figura, l'andamento della temperatura in funzione del tempo di irraggiamento
è approssimativamente lineare come prevedibile teoricamente per un sistema isolato.
Anche per le potenze utilizzate nei nostri esperimenti (80W e 140W) un irraggiamento di 120 secondi
comporta una variazione della temperatura del campione variabile da 0.7 a 1.1 gradi rispettivamente
(con un errore di circa 0.4°). Solo nel caso di dose minima da noi utilizzato (80W per 12s) si può
ritenere trascurabile la variazione di temperature del campione.