Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero caseari

12° Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario
Determinazione dei batteri lattici nei prodotti
lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche
Angiolella Lombardi
Veneto Agricoltura
Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari
MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012
Il ruolo positivo dei batteri lattici
nella produzione di latti fermentati
Acidificazione (fermentazione lattica)
Produzione di acetaldeide
Produzione di polisaccaridi
- Batteri lattici con caratteristiche probiotiche
A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
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Il ruolo positivo dei batteri lattici
nella produzione di formaggi
• Acidificazione (fermentazione lattica)
• Produzione di enzimi che agiscono su:
Proteine-peptidi-aminoacidi
(lipidi)
Altre componenti
(es. citrato)
Batteri lattici
starter
Maturazione prodotto,
caratteristiche
organolettiche nutrizionali
Batteri lattici
non starter
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Aspetti negativi legati allo sviluppo di batteri lattici
nei formaggi
Produzione di gas (batteri lattici eterofermentanti,
occhiatura eccessiva, gonfiori)
Produzione di amine biogene (tiramina, istamina)
Produzione di sapori anomali (peptidi amari)
Acidificazione
eccessiva-gessatura
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BATTERI LATTICI
Caratteristiche generali
Batteri Gram positivi
Ubiquitari
Morfologia differente: bacilli/cocchi
Non sporigeni
Acido tolleranti e talvolta acidofili
Temperatura ottimale di crescita: ampio range (termofili/ mesofili)
Catalasi negativi (eccetto alcune specie genere Pediococcus )
Molto esigenti nutrizionalmente
Non patogeni (gruppo 1, tranne L. rhamnosus ed enterococchi che
rientrano in gruppo 2)
Anaerobi (aerotolleranti)
Metabolismo fermentativo (omofermentanti, eterofermentanti)
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Principali generi/specie di batteri lattici settore lattiero-caseario
Microrganismo
Morfologia
Fermentazione
Temperatura
Applicazioni
Streptococcus
thermophilus
Cocchi
Omolattica
Termofili
Formaggi, latti
fermentati
Lactococcus
lactis
Cocchi
Omolattica
Mesofili
Formaggi, burro
Enterococchi
Cocchi
Omolattica
Mesofili,
termodurici
Formaggi* (no QPS)
Pediococchi
Cocchi a
tetradi
Omolattica
Termofili
Leuconostoc
Cocchi
Eterolattica
Mesofili
Burro, vegetali
fermentati, paste
acide
Lactobacilli
Bastoncini
Omolattica
Eterolattica
Mesofili.
termofili
Formaggi, latti
ferm., insaccati,
paste acide, vegetali
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Vegetali fermentati,
insaccati,
maturazione
formaggi
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Perchè cercare i batteri lattici nei prodotti lattiero
caseari?
Requisiti di prodotto (es S. thermophilus,
L. delbrueckii subsp. bulgaricus yogurt)
Requisiti certificazioni ( es. Mozzarella
STG)
Controllo qualità colture starter (inclusi
sieroinnesti/lattoinnesti)
Monitoraggio probiotici (L. acidophilus, L.
rhamnosus, L casei/paracasei,
Bifidobacterium*)
Conteggio LAB responsabili difetti (es
eterofermentanti obbligati, enterococchi)
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Conteggio batteri lattici – Metodi normati
Microrganismo
Metodo
Campo
applicazione
S. thermophilus
ISO 7889-IDF117:
2003
Yogurt
Lactobacillus
delbrueckii subsp.
bulgaricus
ISO 7889-IDF117:
2003
Yogurt
Lactobacillus
acidophilus
ISO 20128-IDF292:
2006
Latti fermentati e non
fermentati, latte in
polvere
Batteri lattici mesofili ISO 27205-IDF149:
e termofili (diverse
2010
specie e generi)
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Colture starter per
prodotti fermentati a
base di latte (no
probiotici)
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Conteggio batteri lattici – Metodi normati
Microrganismo
Metodo
Campo
applicazione
Enterococchi
CCFRA Met.
2.2.1:2007
Alimenti , inclusi prodotti
lattiero caseari , mangimi
Bifidobatteri (NB non
LAB)
ISO 29981IDF220: 2010
Latti fermentati e non
fermentati, latte in
polvere, formulazioni per
l’infanzia,colture starter
Leuconostoc
(FIL149A:1997)
Colture starter
Batteri lattici citrato
fermentanti
(Leuconostoc, Lc.lactis
cit+)
ISO17792-IDF
180 : 2006
Colture starter e
prodotti lattiero caseari
in cui sono presenti
lattici citrato ferm.
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Streptococcus thermophilus
Norma cod.
ISO 7889 - IDF 117:2003
Norma titolo
Yogurt - Enumeration of characteristic
microorganisms – Colony count technique at 37°C
Conteggio di
Streptococcus thermophilus
Mezzo di coltura
M 17, pH 6.8 dopo sterilizzazione (consigliabile
aggiungere il lattosio dopo sterilizzazione)
Inoculo
inclusione
Atmosfera
incubazione
aerobiosi
Incubazione
37+/-1°C x 48 h
Lettura colonie
colonie lenticolari del diametro di 1-2 mm.
Conferma
colorazione gram (+, forma coccica del diametro
di 0.7-0.9 micron in coppia o a catena) e catalasi
(neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)
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Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Norma cod.
ISO 7889 - IDF 117:2003
Norma titolo
Yogurt- Enumeration of characteristic
microorganisms – Colony count technique at 37°C
Conteggio di
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Mezzo di coltura
MRS acid. pH 5.4 con acido acetico
Inoculo
inclusione
Atmosfera
incubazione
anaerobiosi
Incubazione
37+/-1°C x 72 h
Lettura colonie
colonie lenticolari, spesso a forma laminare del
diametro di 1-3 mm
Conferma
colorazione gram (+, bastoncini, generalmente
corti) e catalasi (neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)
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ISO 20128-IDF192:2006
Milk Products – Enumeration of presumptive Lactobacillus
acidophilus on a selective medium-Colony count technique at 37°C
Conteggio di
Lactobacillus acidophilus
Mezzo di coltura
MRS + Clindamycin + Ciprofloxacin
Inoculo
spatolamento
Atmosfera incubazione anaerobiosi
Incubazione
37°C x 72 +/-3 h
Lettura colonie
colonie piatte opache
grigio biancastre
bordi irregolari
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ISO 27205-IDF149:2010-Fermented milk Products – Bacterial
starter cultures – standard of identity
Specifica caratteristiche delle colture starter del settore lattiero
caseario (batteri lattici, ma anche bifidobatteri e propionibatteri)
Microrganismo
L.delbrueckii subsp.
bulgaricus
Metodo
MRS acidificato come ISO 7889-IDF117:2003
L. acidophilus
MRS+ Cli e Cipro come ISO 20128-IDF 292:
2006
S. thermophilus
M17 pH6,8 come ISO 7889-IDF117: 2003
Lattococchi
M17pH7,2, come da ISO 7889 incubato in
aerobiosi a 30 °C per 72 ore
Colture miste S.
thermophilus lattococchi
S.thermophilus : M17pH6,8 45 °C aerobiosi 48 h
Lattococchi M17pH7,2 20 °C aerobiosi 5 g
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CCFRA Method 2.7.1:2007
Enumeration of presumptive Enterococcus
species:colony count technique
Il metodo propone diversi mezzi per il conteggio degli enterococchi
negli alimenti e nei mangimi: KF streptococcus agar, Kanamicina,esculina-azide agar (KAA), Slanetz e Bartley agar (SB)
KAA inoculo per spreading,
37 °C per 24 h ± 4 h
Necessaria conferma
Sodio azide
agenti selettivi
e
kanamicina
Esculina agente differenziale
Colonie bianche o grigie circondate
da un alone nero da confermare
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ISO 29981-IDF220:2010 Milk Products-Enumeration of
presumptive bifidobacteria-Colony count technique at 37 °C
TOS-MUP propionato agar + agenti selettivi (litio-mupirocina) e
galatto-oligosaccaridi (TOS)
Inoculo per inclusione, incubazione 37 ° C per 72 h in anerobiosi
Litio e mupirocina inibiscono
crescita S. thermophilus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus, L.
L.
casei,
L.
acidophilus,
rhamnosus, Lactococcus lactis,
Galatto-oligosaccaridi
(TOS)
favoriscono
sviluppo
dei
bifidobatteri
Colonie bianche piccole da
confermare
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FIL-IDF 149A. 1997. Levains lactiques de cultures
de bactéries lactiques. Norme de composition
Leuconostoc
MSE Agar (Mayeux, Sandine, Elliker),
Inoculo per spreading, incubazione a 22 °C per 4-5 g in aerobiosi
.
Sodio azide del terreno
inibisce batteri Gram - e
lattococchi
Saccarosio
favorisce
formazione destrani.
L. mesenteroides dextranicum forma
colonie mucose, gelatinose, altri
Leuconostoc formano colonie piccole
incolori
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ISO17792-IDF180:2006
Milk, milk products and mesophilic starter cultures –
Enumeration of citrate fermenting bacteria.Colony
count technique at 25 °C
Microrganismi interessati:
Lactococcus lactis subsp. lactis cit +
Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides, cremoris,
dextranicum
Leuconostoc lactis
Citrato fermentanti presentano
alone attorno alla colonia
Terreno
di
Nickels
e
Leesment, contenente citrato
e calcio lattato, incubato a 25
°C in aerobiosi per 72 h. Dopo
incubazione viene aggiunto Xgal, ulteriore incubazione per
24 ore
Lactococcus colonie bianche
Leuconostoc colonie blu
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Altri batteri lattici
L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.plantarum
NSLAB formaggi
Latti fermentati, probiotici
MRS agar + vancomicina ( 10 µg/ml)
Incubazione 30 °C , anaerobiosi, 72 h.
In questo terreno possono sviluppare
anche pediococchi e Leuconostoc
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Batteri lattici eterofermentanti
Terreno HHD consente differenziare batteri lattici omo ed
eterofermentanti in base alla differente acidificazione del
fruttosio presente in bassa concentrazione in questo mezzo.
Dopo incubazione 30 °C per 72 h i batteri omofermentanti
crescono con colonie blu-verdi, mentre quelli eterofermentanti con
colonie incolori (non acidificano e quindi non determinano il viraggio
del verde bromocresolo)
In alternativa per il conteggio degli eterofermentanti:
MRS; verifica produzione gas in un numero rappresentativo di
colonie
Leuconostoc: MSE 22°C per 4-5 g
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Metodi di controllo sieroinnesti-Criticità
-2-8 x 108 ufc/ml
-dominanza L. helveticus (80-85%), presenza di diversi
biotipi
-L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis
-L. fermentum (eterofermentante)
-Talora presenza di S. thermophilus
Caratteristiche
sieroinnesti
MRS acidificato?
MRS + casaminoacids?
Agar siero?
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Metodi controllo lattoinnesti naturali-criticità
Microrganismo
Metodo
Campo
applicazione
Terreno
S. thermophilus
ISO 7889IDF 117:
2003
Yogurt
M17 agar, aerobiosi a 37
°C per 48 ore
Colture miste S.
thermophilus lattococchi
ISO 27205
- IDF
149:2003
Colture
starter
termofile
S.thermophilus : M17
pH6,8 45
°C aerobiosi 48 h
Risultati molto variabili in funzione di:
Brand commerciale terreno
Modalità di aggiunta del lattosio
Temperatura di incubazione
Aggiunta di ulteriori “ingredienti” (latte peptonizzato)
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E i probiotici?
Es latte fermentato contenente S. thermophilus, L.bulgaricus, L.
acidophilus, Bifidobacterium lactis
S. thermophilus
ISO 7889-IDF 117: 2003
B. lactis
ISO 29981- IDF 220: 2010
L. acidophilus
ISO 20128-IDF 292: 2006
L. delbrueckii subsp. bulgaricus ?
ISO 7889-IDF 117: 2003 non consente conta differenziale
L. bulgaricus-L. acidophilus
Semina per spreading e differenziazione morfologia colonie?
Conferma colonie mediante ISO 9232: 2003-IDF 146?
Conferma mediante PCR?
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Conclusioni
Sono disponibili diversi metodi per il conteggio di
batteri lattici.
Tuttavia, data la complessità di questo gruppo
microbico e la presenza in uno stesso alimento di più
generi/specie permangono delle criticità
Adattamento del metodo in funzione del prodotto
Necessità di confronti interlaboratori su matrici reali
Sviluppo di metodi che consentano di individuare
gruppi di batteri lattici con attività potenzialmente
negative
(es.
proteolitici,,
eterofermentanti
obbligati)?
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