Presentazione di PowerPoint - Dipartimento di Scienze e

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Modulo di
GENETICA APPLICATA
Esame integrato di
METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE
CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE
Docente: FLAVIA CERRATO
a. a. 2008-2009
PROGRAMMA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Tecniche di base. Taglio e saldatura di molecole di DNA
Vettori di clonaggio
Strategie di clonaggio - Genoteche
Sequenziamento e mutagenesi in vitro
Trasferimento genico in cellule animali – Animali transgenici
Trasferimento genico nelle piante – Piante transgeniche
Applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante
Testi consigliati:
• Sandy Primrose, Richard Twyman and Bob Old. INGEGNERIA GENETICA
principi e tecniche. Zanichelli
• Richard J. Reece. Analisi dei geni e genomi. Edises
• Edoardo Boncinelli, Antonio Simeone. Ingegneria Genetica. Idelson-Gnocchi
BIOTECNOLOGIA
1917 Karl Ereky conia la parola biotecnologia
“Tutte le linee operative che rendono prodotti a partire dalle
materie prime con l’ausilio di organismi viventi”
1961 Carl Goran Heden cambia il titolo di un giornale scientifico
da “Journal of Microbiological and Biochemical
Engineering and Technology” in “Biotechnology and
Bioengineering”
“Studio della produzione industriale di merci e di servizi
mediante processi che utilizzano organismi, sistemi e
procedimenti biologici”
METODOLOGIE
BIOTECNOLOGICHE
¾ Metodologie microbiologiche
¾ Metodologie biochimiche
¾ INGEGNERIA GENETICA
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
GENETICA APPLICATA
La TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
nasce nel 1973 quando Herb Boyer e Stanley
Cohen clonano la prima molecola di DNA
Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW, Helling RB
PNAS, 70, 3240-3244 (1973).
A COSA SERVE L’INGEGNERIA GENETICA?
DNA al microscopio elettronico
ELETTROFORESI DEGLI
ACIDI NUCLEICI
Elettroforesi degli acidi nucleici
L’elettroforesi è una tecnica biochimica che permette di
separare le molecole dotate di carica in base al loro diverso
peso molecolare. Le separazioni elettroforetiche vengono fatte
in gel.
La matrice del gel può essere costituita da
• agarosio (range di separazione: 0.5-20 kb)
• poliacrilammide (range di separazione 10-500 bp)
I gel di poliacrilamide si formano per la
copolimerizzazione di acrilamide e di un agente
che forma legami trasversali (generalmente
N,N’-metilene bisacrilamide) a formare un
reticolo tridimensionale.
Elettroforesi orizzontale
Elettroforesi verticale
L’elettroforesi è utilizzata sia a scopo analitico
che preparativo
9 Rivelazione degli acidi nucleici
9 Separazione di frammenti di dimensioni diverse
coloranti degli acidi nucleici:
etidio bromuro
sybr green
In un gel sottoposto ad elettroforesi la mobilità di un frammento di
DNA è inversamente proporzionale al logaritmo del peso molecolare
Unknown
DNA
Pulsed Field Gel Electrophoresis
Elettroforesi in campo pulsato
Permette di separare frammenti di DNA molto lunghi (centinaia di kb)
Elettroforesi di molecole di RNA
La velocità di migrazione delle molecole nell’elettroforesi
non dipende solo dalla dimensione della molecola ma
anche dalla loro forma e struttura secondaria.
Molecole di DNA lineari a doppia elica hanno una struttura
secondaria uniforme e la loro velocità di migrazione in
elettroforesi è proporzionale al peso molecolare.
Le molecole di RNA sono a singola elica e pertanto
possiedono una grande quantità di strutture secondarie che
ne influenzano la migrazione. Per ovviare a questo
problema si utilizzano gel denaturanti, aggiungendo
formaldeide al gel di agarosio e formammide all’RNA, prima
del caricamento.
TRASFERIMENTO DEGLI
ACIDI NUCLEICI SU MEMBRANA:
BLOTTING
Il Southern blotting
Con il termine blotting si intede il trasferimento
e l’immobilizzazione di acidi nucleici da un gel
o una soluzione acquosa a un supporto solido,
generalmente una membrana di nitrocellulosa
o nylon. Gli acidi nucleici così trasferiti sono
poi usati come bersaglio in esperimenti di
ibridazione.
Procedure di trasferimento e ibridazione degli acidi nucleici
Trasferimento di acidi nucleici da gel: Southern e Northern blot
Trasferimento di acidi nucleici da soluzione acquosa: Slot e Dot blot
Trasferimento di colonie (di batteri o lieviti) o placche di lisi
Ibridare vuol dire immergere la
membrana a cui è fissato il DNA in
una soluzione contenente una
sonda,
sonda ossia una segmento di DNA
o RNA (opportunamente marcato) la
cui sequenza sia complementare
alla sequenza dei frammenti che si
vogliono identificare.
Preparazione di sonde
Marcatura degli acidi nucleici
¾ Traccianti radioattivi
¾ Traccianti non radioattivi
¾ Marcatura terminale
¾ Marcatura interna
¾ Sonde a DNA
¾ Sonde a RNA
Nucleotidi marcati con radioisotopi
¾ Traccianti radioattivi
Vantaggi:
molto sensibili
Svantaggi: pericolosi poiché mutageni
vita breve
¾ Traccianti non radioattivi
Vantaggi: non pericolosi
lunga durata del segnale
Svantaggi: meno sensibili dei traccianti radioattivi
Nucleotidi marcati con sostanze non
radioattive
¾ Fluorocromi (marcatura diretta)
¾ Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con
fluorocromi o enzimi)
¾ Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)
A. Ibridazione della sonda marcata
con biotina al DNA bersaglio
B.
Si
aggiunge
avidina
(o
streptavidina) che va a legarsi alla
biotina
C. Si aggiunge un enzima marcato
con biotina come la fosfatasi alcalina
o la perossidasi
D.
Si
aggiunge
un
substrato
cromogeno o chemioluminescente
dell’enzima. Si rileva il cambiamento di
colore o l’emissione di luce per effetto
della trasformazione del substrato in
prodotto
Marcatura interna
Random priming (innesco casuale)
Il frammento di Klenow è la DNA polimerasi di E.coli, privata
della sua attività esonucleotidica 5’→3’
Marcatura terminale
Marcatura al 5’
La polinucleotide chinasi catalizza il trasferimento di un
gruppo fosfato (in posizione γ) dall’ATP ad un terminale
5’OH di un segmento di DNA o RNA. Se il segmento ha un
terminale 5’P allora bisogna prima rimuovere il gruppo
fosfato utilizzando la fosfatasi alcalina.
alcalina
Marcatura al 3’
La terminal trasferasi catalizza l’aggiunta di nucleotidi
all’estremità 3’ –OH di una molecola di DNA.
Sonde a RNA
Controllo della stringenza
La specificità con cui una sonda si lega alla sua sequenza
bersaglio è influenzata dalla temperatura e dalla salinità
(forza ionica) del tampone di ibridazione
Calcolo della temperatura di melting (Tm): temperatura alla
quale sonda e DNA bersaglio sono dissociate al 50%
Sonde > 100 nucleotidi:
M: forza ionica del tampone espressa in moli /litro
Temperatura di ibridazione: Tm – 25°C
Oligonucleotidi:
Temperatura di ibridazione: Tm –5°C
PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION.
LE ESTENSIONI
Polimerase Chain
Reaction
Elementi necessari per la PCR
• DNA contenente il segmento da amplificare
• Coppia di inneschi (o primers) :
• TAQ DNA POLIMERASI
• dNTP
• Mg2+
• Termociclatore
PCR
Le estensioni della PCR
Nested PCR
Reverse transcriptase PCR
Real time PCR
Nested PCR
Vantaggio: aumenta la specificita’ e la sensibilita’ dell’ amplificazione. Infatti eventuali
prodotti secondari della prima reazione non vengono amplificati nella seconda.
Sintesi di cDNA
ReverseTranscriptase-PCR
DNA polimerasi RNA-dipendenti più utilizzate nei laboratori:
AMV: Virus della Mieloblastosi Aviaria
MuLV: Virus della Leucemia Murina di Moloney
Real Time PCR
o
PCR Quantitativa
Proporzione
diretta
tra
segnale luminoso liberato e
DNA bersaglio amplificato
Le applicazioni della PCR
Nella ricerca:
• clonare, sequenziare e modificare i geni o in generale segmenti di DNA
• studi evoluzionistici
In medicina:
• diagnosi pre e post-natale di malattie genetiche (es. Anemia falciforme)
• diagnosi di tumori (es. linfomi)
• diagnosi di malattie infettive
In medicina legale:
• attribuzione di paternità
• Identificazione di individui sospetti
Nell’industria:
• identificazione degli Organismi Geneticamente Modificati (OGM)
Clonare (dal greco, klon:
klon ramoscello) significa produrre
copie identiche di una molecola o di una cellula o di un
intero organismo
Il clonaggio del DNA consiste nella separazione di uno
specifico gene o segmento di DNA dal suo cromosoma,
nell’unirlo a una piccola molecola di DNA che serve da
trasportatore, e che permette la replicazione di questo
DNA modificato migliaia o addirittura milioni di volte
Il risultato è un’amplificazione selettiva
particolare gene o segmento di DNA.
di
quel
Il clonaggio di un segmento di DNA, sia procariotico che
eucariotico, utilizza 6 metodologie generali:
1. Isolamento del DNA da un organismo
2. Taglio del DNA in frammenti
3. Legame dei frammenti di DNA
con un vettore di clonaggio
opportunamente scelto
4. Trasferimento del vettore
ricombinante nell’organismo ospite
5. Selezione del clone
contenente il gene di interesse
6. Recupero del vettore ricombinante e
del frammento di DNA di interesse
TAGLIO DEL DNA:
I SISTEMI DI RESTRIZIONE E
MODIFICAZIONE DEI BATTERI
Sistema di restrizione e modificazione
Gli enzimi di restrizione di tipo II tagliano il DNA in
corrispondenza di specifiche sequenze
Nomenclatura delle endonucleasi di restrizione di tipo II
-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 3500 enzimi da procarioti
-Riconoscono più di 200 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze
palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi).
EcoRI
E
co
R
I
=
=
=
=
genere Escherichia
specie coli
G/AATTC
ceppo RY13
CTTAA/G
prima endonucleasi isolata
BamHI
B
am
H
I
= genere Bacillus
= specie amyloliquefaciens G/GATCC
= ceppo H
CCTAG/G
= prima endonucleasi isolata
Siti di riconoscimento, taglio e
modificazione di vari enzimi di restrizione
Le estremità generate dal taglio degi enzimi di
restrizione
• Estremità piatte o blunt ends
• Estremità coesive o sticky ends:
5’ sporgenti o 5’ protruding
3’ sporgenti o 3’ protruding
Isoschizomeri e neoschizomeri
Sebbene gli enzimi di restrizione isolati siano oltre 3500, le sequenze
bersaglio che possono essere tagliate sono molte di meno (appena
più di 200). E’ evidente che molti enzimi isolati da batteri diversi
hanno la stessa specificità di sequenza, ossia riconoscono la stessa
sequenza.
sequenza
Gli isoschizomeri sono enzimi di restrizione di diversa origine che
però riconoscono la stessa sequenza e generano lo stesso taglio.
Esempio:
HpaII: C/CGG (Haemophilus parainfluenzae)
MspI: C/CGG (Moraxella species)
I neoschizomeri sono enzimi di restrizione che riconoscono la stessa
sequenza ma generano tagli diversi. Esempio:
SmaI: CCC/GGG (genera estremità piatte) (Serratia marcescens)
XmaI: C/CCGG (genera estremità 5’ sporgenti) (Xantomonas
malvacearum)
Numero e dimensione dei frammenti di restrizione
La maggior parte degli enzimi di restrizione riconosce palindromi di 4 o 6
nucleotidi. Se assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle
molecole di DNA:
-per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA un taglio
ogni 256 nucleotidi (44 =4x4x4x4)
-per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN MEDIA un
taglio ogni 4.096 nucleotidi (46)
SALDATURA DEL DNA.
GLI ENZIMI CHE UNISCONO
COVALENTEMENTE DUE MOLECOLE DI
DNA
Gli enzimi utilizzati per saldare le molecole di DNA

DNA ligasi
T4 DNA ligasi
Terminal deossinucleotidil-Trasferasi (TdT)
DNA topoisomerasi I
La biochimica della DNA ligasi di E. coli e della DNA
ligasi del fago T4
cofattore della T4 DNA ligasi: ATP
cofattore della DNA ligasi: NAD+
La DNA ligasi unisce due molecole di DNA con
estremità sporgenti compatibili
La T4 DNA ligasi unisce due molecole di DNA
con estremità sporgenti compatibili o con
estremità piatte
Utilizzo delle DNA ligasi nel clonaggio
Unione di due molecole di DNA con estremità
sporgenti compatibili
La temperatura ideale per una
reazione di ligasi è di circa 15°C
Svantaggio: il plasmide può richiudersi senza incorporare l’inserto
Soluzioni al problema:
1. utilizzare un eccesso di molecole di inserto rispetto alle molecole di plasmide
2. trattare il plasmide con fosfatasi alcalina per rimuovere il gruppo P all’estremità 5’
Utilizzo della fosfatasi alcalina per prevenire la chiusura
del plasmide senza l’incorporazione dell’inserto
Unione di due molecole di DNA con estremità piatte.
Le varie strategie
I linkers (T4 DNA ligasi)
Gli adattatori (T4 DNA ligasi)
Le code omopolimeriche (TdT)
Utilizzo dei linkers e della T4 DNA ligasi per il clonaggio
di molecole di DNA con estremità piatte
Utilizzo degli adattatori e della T4 DNA ligasi per il
clonaggio di molecole di DNA con estremità piatte
Utilizzo di code omopolimeriche sintetizzate dalla TdT per
il clonaggio di molecole di DNA con estremità piatte
La TdT catalizza l’aggiunta di
nucleotidi alle estremità 3’
sporgenti di una molecola di DNA
Le estremità 3’ sporgenti possono
essere generate da alcuni enzimi di
restrizione o dalla esonucleasi del fago λ
Clonaggio dei prodotti di PCR
Inserimento di siti di restrizione alle estremità 5’ dei
primer per PCR
Utilizzo dei vettori T/A cloning per il clonaggio dei
prodotti di PCR
Le DNA polimerasi termostabili comunemente utilizzate per la PCR
possiedono anche un’attività di terminal transferasi, pertanto
aggiungono un singolo dATP alle estremità 3’ dei DNA amplificati.
E’ possibile clonare gli amplificati utilizzando due diverse strategie:
1. Si creano estremità piatte con il frammento di klenow o con
polimerasi termostabili con attività esonucleasica 3’-5’;
2. Si utilizzano vettori di clonaggio che espongono un singolo dTTP
sporgente alle estremità 3’
La DNA topoisomerasi I del virus Vaccinia
taglia e salda molecole di DNA
La topoisomerasi I del virus Vaccinia è in
grado sia di tagliare che di saldare molecole
di DNA. La sequenza del sito di taglio della
topoisomerasi I è: CCCTT
1. l’enzima riconosce il sito e taglia il
plasmide generando estremità 3’ coesive di
timina, alle quali è attaccato.
2. In seguito all’aggiunta di un inserto con
estremità 3’ coesive di adenina, l’enzima
catalizza la saldatura delle due estremità.
Vantaggi:
1. la reazione avviene in 5’ contro le 12-16 ore di una reazione di ligasi
2. la percentuale di molecole di plasmide che ricircolarizzano è quasi zero