Atti del “Workshop” - CRA-PAV

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Petria 18 (2), 141-419 (2008) - 4° Incontro nazionale sulle malattie da fitoplasmi
Panoramica sulle principali acquisizioni su
fitoplasmi e fitoplasmosi scaturite dal I
convegno IPWG
A. Bertaccini
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), Patologia Vegetale,
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna
Viale Fanin 42, I-40127 (BO)
E- mail: [email protected]
Nel novembre 2007 si è tenuto a Bologna il primo convegno dell’International
Phytoplasmologist Working Group” che ha visto la partecipazione di oltre 200
ricercatori provenienti da 40 nazioni. Nel corso del convegno sono stati dibattuti
numerosi argomenti relativi alla fitoplasmologia e sono stati presentati risultati nuovi
e stimolanti la ricerca in questa branca nascente della patologia vegetale (http://www.
bulletinofinsectology.org/).
L’introduzione ha visto la panoramica sulle interazioni fitoplasma - pianta
- insetto che grazie alla disponibilità della sequenza completa del genoma di due
fitoplasmi OY-M e AY-WB, entrambi appartenenti al gruppo dell’“aster yellows”
(giallume dell’astro), si stanno finalmente cominciando a delineare. Si è avuta l’ulteriore
conferma sperimentale delle teorie avanzate già anni fa che i fitoplasmi sono parassiti
il cui genoma deriva da importanti fenomeni di evoluzione riduttiva. I geni individuati
finora suggeriscono che i fitoplasmi codifichino poche funzioni metaboliche e quindi
che il loro effetto patogeno sulla pianta sia in gran parte dovuto all’utilizzo da parte
del patogeno dei metaboliti prodotti dall’ospite. E’ stata individuata una regione di
circa 30 kb codificanti geni per il metabolismo glicolitico che risulta duplicata in
ceppi virulenti di fitoplasmi: questo ritrovamento può indicare che l’elevato consumo
di zuccheri interferisce con la capacità di sviluppo del fitoplasma e potrebbe quindi
influire, direttamente o indirettamente, sull’espressione sintomatologica. E’ stata
inoltre verificata la presenza di una pressione selettiva positiva su Amp, una proteina
della superficie della membrana fitoplasmatica dei fitoplasmi; questo fenomeno può
indicare la presenza di una interazione importante dal punto di vista evolutivo fra il
fitoplasma e il citoplasma del suo ospite. E’ stato inoltre dimostrato che nel caso di
alcuni isolati giapponesi di giallume dell’astro questa proteina forma un complesso
con le proteine filamentose (actina e miosina) degli insetti che può essere messo in
relazione con la loro capacità di trasmettere il patogeno.
Genomica ed interazione ospiti-fitoplasma
Al convegno sono state presentate le sequenze complete di due fitoplasmi
141
‘Candidatus Phytoplasma australiense’ - ceppo australiano e ‘Ca. P. mali’ che si
vanno ad aggiungere alle due già pubblicate. Mentre il primo fitoplasma possiede un
genoma più grande rispetto a quelli già pubblicati, ‘Ca. P. mali’ è risultato avere il più
piccolo genoma finora sequenziato (600 kb), è risultato inoltre essere uno dei pochi
Mollicutes con un genoma lineare e non circolare come quello degli altri fitoplasmi.
Esso presenta inoltre riduzioni delle vie metaboliche più accentuate ed ha una modalità
di duplicazione cromosomica diversa. Questo fitoplasma, come i due ceppi di giallume
dell’astro sequenziati, presenta un numero abbastanza elevato di sequenze ripetute,
ma sembra che a livello di patrimonio enzimatico sia differenziabile dagli altri due
patogeni, specialmente per quanto si riferisce al metabolismo dei carboidrati.
Anche nei fitoplasmi, come recentemente descritto in altri procarioti, sono
state individuate sequenze denominate SVM (sequenze a mosaico variabile) o
PMU (probabili unità mobili), a seconda dei ricercatori che le hanno descritte. Si
tratta di caratteristiche sequenze del genoma in cui sono presenti tratti ripetuti e/o
palindromici a localizzazione definita. L’individuazione di queste sequenze viene
associata alla capacità dei fitoplasmi di parassitizzare organismi appartenenti a regni
diversi (piante e insetti). Infatti mentre da una parte l’evoluzione degenerativa li ha
resi sempre più ospite-dipendenti, dall’altra il loro genoma è divenuto estremamente
flessibile per rispondere in maniera rapida ai segnali di difesa degli ospiti e superare
quindi la capacità di resistenza di questi ultimi e per adattarsi quindi ad ambienti
diversi, rappresentati rispettivamente da insetti e piante. Le sequenze geniche ripetute,
sovente palindromiche (trasposasi e relitti di geni correlati a proteine di fagi) possono
rappresentare siti di acquisizione di nuove sequenze geniche e siti per l’attacco di
elementi genetici mobili presenti nel cromosoma dei fitoplasmi come in quello di tutti
gli organismi viventi. Sono infatti stati individuati ‘cluster’ di geni distribuiti non a
caso nel genoma che potrebbero funzionare come ‘punti caldi’ per la ricombinazione
genica facilitando la plasticità del genoma e quindi l’evoluzione di ceppi che porta
all’adattamento a nuove nicchie ecologiche.
Dal sequenziamento del ceppo AY-WB sono state inoltre identificate 56
proteine potenzialmente coinvolte nella modulazione della risposta alla infezione in
pianta e insetto. Una di esse, denominata SAP, si accumula nel nucleo della cellula
della pianta ospite e ne modifica il profilo di trascrizione; la medesima proteina è
stata localizzata anche nel vettore di questo fitoplasma, Macrosteles quadrilineatus
ed appare essere particolarmente abbondante in alcune cellule delle ghiandole salivari
dove, però non è localizzata nel nucleo.
L’interazione fra fitoplasmi e ospiti è stata descritta in alcuni sistemi importanti
dal punto di vista patologico in alcune aree del mondo; in melo affetto da ‘Ca. P
mali’ è stato evidenziato come ceppi diversi del fitoplasma hanno capacità e velocità
di colonizzazione della pianta diversificate. In vinca i fitoplasmi CY (giallume della
margherita) e FD (flavescenza dorata) hanno dinamiche di sviluppo diverse e vengono
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trasmessi con diversa efficienza dal vettore Euscelidius variegatus. Esiste invece
competizione nel nanismo del mais descritto in Brasile fra la infezione da fitoplasmi
e quella da spiroplasmi entrambi trasmessi da Dalbulus maydis: il fitoplasma viene
rallentato nel suo sviluppo dalla presenza dello spiroplasma e dalle basse temperature.
Interessante è stata la dimostrazione sperimentale che Cacopsylla picta, vettore di
‘Ca. P. mali’ viene attratta in maniera preferenziale da effluvi emessi dalle piante di
melo infette da scopazzo rispetto a quelli emessi dalle piante sane.
Numerosi studi hanno riguardato la diversa espressione genica fra piante
infette, sane o con diverso livello di suscettibilità alla presenza di fitoplasmi. I geni
espressi differenzialmente e studiati in melo infetto da ceppi diversi di scopazzi, vinca
infetta da moria del pero, poinsettia e Cocos nucifera infetti dai fitoplasmi specifici
sono in generale quelli che presiedono alla risposta delle piante agli stress, al trasporto
elettronico, alla modificazione-degradazione di proteine ed al metabolismo ormonale
come quello della sintesi di citochinine. Osservazioni effettuate sulle alterazioni del
metabolismo glucidico di stolbur in pomodoro comparato a quello di Spiroplasma
citri e stolbur in vinca mostrano che l’attività della invertasi non è in accordo con i
dati di espressione genica: a livello genico infatti non sono state osservate alterazioni
importanti della espressione di queste proteine nei diversi patosistemi, mentre si è
osservato incremento dell’attività di invertasi vacuolare in pomodoro infetto da
stolbur, di quella di parete in pomodoro infetto da stolbur e in vinca infetta da S.
citri, e di quella neutra per tutti i patosistemi studiati; questi risultati giustificano
l’accumulo di zuccheri che si verifica nelle diverse infezioni. L’utilizzo di due ceppi
di stolbur a diversa patogenicità (che inducono o meno sintomatologie fiorali) ha
permesso di ipotizzare una inibizione della demetilazione di SIDEF (ipermetilazione)
gene importante nella corretta morfogenesi fiorale che è risultato iporegolato nel
caso di infezione con alterazioni della morfologia fiorale, risultato confermato
anche dalla iperattività della DNA metiltransferasi II che codificano una specifica
cromometiltrasnferasi. A completamento delle informazioni sulle interazioni fra
fitoplasmi e piante ospiti sono stati presentati alcuni dati sperimentali che descrivono
il fenomeno del ‘recovery’ in vite in diversi ecosistemi.
Classificazione e diagnosi
E’ stata presentata una particolareggiata illustrazione del sistema di
identificazione e classificazione dei fitoplasmi basato sul gene ribosomico 16S e su
altri geni importanti per la distinzione di ceppi ed isolati quali i geni tuf, rpS3, SecY ed
altri. Fino ad oggi sono stati identificati nel mondo oltre 800 ceppi di fitoplasmi associati
ad alcune centinaia di malattie ed a numerosi insetti vettori. Con l’introduzione della
categoria tassonomica provvisoria del ‘Candidatus’ avvenuta ufficialmente quattro
anni fa, è ora più semplice identificare i diversi patogeni associati alle varie sindromi.
Ad oggi sono stati pubblicati 25 ‘Candidatus’ genere e specie che però non descrivono
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tutti i fitoplasmi importanti dal punto di vista fitopatologico. Occorre quindi mantenere
ancora in parallelo la precedente suddivisione in gruppi e sottogruppi ribosomici che
ad oggi vede 19 gruppi descritti in maniera classica (pubblicati in riviste) e 10 gruppi
ottenuti mediante analisi RFLP virtuale delle sequenze più attendibili depositate in
tutto il mondo nella Genbank. La descrizione di questi ultimi gruppi ha avuto lo scopo
di facilitare l’identificazione di nuovi fitoplasmi con il sistema RFLP sul gene 16S. Si
rende comunque necessario l’uso di più geni per l’identificazione dei fitoplasmi per
evidenziare la presenza di ceppi a diversa capacità patogenetica. I geni fino ad ora
usati a questo scopo dovranno pertanto essere sottoposti ed approvati dalla comunità
scientifica competente (comitato internazionale di tassonomia batterica).
Oltre all’analisi RFLP ed al sequenziamento sono stati presentati metodi
diagnostici alternativi o complementari per la diagnostica quali le tecniche SSCP,
real-time PCR, RT-PCR e sono state descritte metodologie specifiche di estrazione
e/o amplificazione per alcune specie vegetali volte ad ovviare o ridurre i problemi
diagnostici legati al campionamento, alle condizioni fisiopatologiche delle piante
da saggiare oltre che alle condizioni ambientali. Utilizzando principalmente la
classificazione basata sul gene 16S sono stati descritti fitoplasmi che infettano piante
appartenenti a specie diverse in vari stati del mondo quali Repubblica Ceca, Turchia,
Lituania, Brasile, Messico, Oman, Finlandia, Isreale, India, Mauritius, Bulgaria, FYR
Macedonia, Grecia, Jamaica, Nuova Zelanda oltre naturalmente in Italia.
Nuove malattie e caratterizzazione molecolare
E’ stata individuata in Oman una malattia in Cassia italica associata a fitoplasmi
appartenenti ad un nuovo taxon descritto come ‘Ca. P. omanense’ che presenta
differenze anche a livello della proteina ribosomica dai fitoplasmi finora descritti.
Sono state associate alla presenza di fitoplasmi un nanismo con proliferazione di
Gypsohila e ad un nanismo di Mirabilis jalapa in Israele entrambi dovuti a fitoplasmi
del gruppo ribosomico 16SrII, gruppo che è stato anche individuato in campioni
di violacciocca virescente in Sicilia. Una malattia denominata “frog skin disease”
della cassava (Manihot esculenta) che colpisce le radici di questa pianta rendendole
inutilizzabili per gli scopi alimentari presente in Colombia è stata associata a fitoplasmi
del gruppo 16SrIII, fitoplasmi dello stesso gruppo ribosomico sono stati individuati
in luffa e Sicana odorifera in Brasile. ‘Ca. P. asteris’ è stato identificato in Digitalis
lanata con virescenza e nanismo in Italia, in Lilium con nervature a zig zag, nanismo
e malformazioni in Messico ed in palma da datteri con “Al-Wijam”, una malattia che
porta alla morte le palme, in Arabia Saudita. In Echinops con scopazzi in Oman è stato
descritto un fitoplasma correlato a ‘Ca. P. phoenicium’.
Numerosi sono stati poi gli studi presentati sulla variabilità genetica dei
fitoplasmi infettanti diverse specie vegetali: fitoplasmi del gruppo del giallume del
frassino (‘Ca. P. faxini’) sono stati individuati in Cile in vite con sintomi di giallume
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insieme ad alcuni dei fitoplasmi descritti in vite nelle altre zone viticole del mondo.
Impiegando marcatori genetici addizionali al gene 16S già in uso o sviluppati ex novo
sono stati differenziati fitoplasmi del gruppo 16SrX provenienti da varie parti del
mondo, fitoplasmi presenti in carote e broccoli in Serbia, in susino, melo, olmo ed
albicocco in Italia, ceppi di legno nero in Italia, Francia e Libano, fitoplasmi della
canna da zucchero in vari stati dell’Oriente e ceppi di ‘Ca. P. pyri’ in Libano.
Queste ricerche hanno fornito una panoramica abbastanza vasta di quanto ancora
ci sia da conoscere a livello di biodiversità e di capacità di esprimere sintomatologie
non ancora descritte o individuate in questi patogeni.
Vettori ed epidemiologia
L’impiego di metodiche molecolari ha incrementato anche la possibilità di
identificazione degli insetti vettori delle principali malattie da fitoplasmi, nonostante
il settore sia ancora in fase di sviluppo infatti si è riusciti ad esempio, ad identificare
il vettore del giallume letale della palma in America centrale, ma non in Africa.
Importanti conoscenze sui diversi fitoplasmi trasmessi a patata dal vettore Circulifer
tenellus hanno permesso di affrontare e cominciare a risolvere i problemi epidemici
legati alle gravi fitoplasmosi che colpiscono la patata negli stati nord Occidentali degli
USA, problemi che invece sono gravi ma solo allo stato conoscitivo sulla medesima
coltura in Pakistan.
Importanti informazioni epidemiologiche sul vettore di ‘Ca. P. prunorum’ C.
pruni portano ad ipotizzare la presenza di almeno due popolazioni diverse nel sud
della Francia a localizzazione geografica distinta e non in grado di incrociarsi fra
di loro; C. pruni è inoltre stato individuato per la prima volta anche in Spagna ed
in repubblica Ceca ove è stata descritta anche la presenza di C. pyri vettore della
moria del pero. Il principale vettore di ‘Ca. P. mali’ in Germania appare essere C.
picta mentre è stata verificata e monitorata rispettivamente in Ungheria ed in Serbia la
presenza e la diffusione del vettore della flavescenza dorata Scaphoideus titanus la cui
popolazione in Francia appare molto omogenea probabilmente in relazione alla sua
diffusione a media e lunga distanza con il materiale di propagazione infetto.
Piante di Clematis vitalba ed Alnus glutinosa infette da fitoplasmi simili a
livello di alcuni geni ai fitoplasmi associati a flavescenza dorata sono state individuate
in Italia e nei Balcani ed in alcune regioni della Francia rispettivamente, ed è stato
ipotizzato un loro ruolo nella epidemiologia della malattia. Poca importanza pare avere,
invece, come serbatoio di flavescenza dorata, anche se in grado di ospitare S. titanus
infetti, la vite americana spontanea in alcune aree italiane. Accanto al monitoraggio
della diffusione di legno nero e/o del suo vettore Hyalesthes obsoletus in Spagna,
Bosnia-Erzegovina, e Serbia, è stata anche descritta la presenza di flavescenza dorata
in Svizzera. Nuovo vettore di stolbur a mais con sintomi di arrossamento in Serbia
pare essere Reptalus panzeri. Informazioni sulla epidemiologia di legno nero veicolato
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da H. obsoletus inducono a ritenere che vi sia relazione fra le situazioni epidemiche di
questo fitoplasma che si vanno individuando via via in alcune aree viticole europee e
la comparsa e/o espansione di un nuovo ceppo di stolbur.
In Italia è stato possibile evidenziare la presenza di fitoplasmi diversi in piantine
di patate da seme asintomatiche ed in coltivazioni di mirto sarde con gravi sintomi
di scopazzi; fitoplasmi del gruppo della malattia X del pesco (16SrIII-A) sono stati
identificati in ciliegi deperienti. Fitoplasmi del gruppo 16SrII sono presenti a Cuba
in piante di papaia deperienti ma anche in piante asintomatiche ed in numerose altre
specie spontanee oltre che nell’insetto Empoasca papayae. Patogeni diversi (stolbur
più un batterio ad habitat floematico) veicolati da vettori diversi, rispettivamente
H. obsoletus il primo e Pentastiridius leporinus e Cixius wagneri il secondo, sono
associati in barbabietola da zucchero alla sindrome “basses richesses” in Francia.
Il ritrovamento di fitoplasmi del gruppo 16SrVI in Vaccinium sp., del gruppo del
giallume dell’astro in Rubus fruticosus e stolbur in Rubus idaeus e Fagus sp. in una
località forestale austriaca evidenzia il potenziale ruolo della vegetazione spontanea
come di serbatoio per malattie non ancora presenti in alcuni territori.
Sono state descritte metodologie di trasmissione dei fitoplasmi che non
prevedono la presenza di insetti vettori per lo scopazzo del melo in melo e cioè
trasmissione attraverso ponti radicali e mediante tecniche di innesto e microinnesto
diverse. Prove volte ad evidenziare la trasmissibilità del giallume letale della palma
in Gana attraverso il seme hanno individuato invece solo una maggiore vitalità del
seme proveniente da piante infette ma la mancata presenza del patogeno nelle plantule
sviluppate.
Prospettive di controllo delle malattie da fitoplasmi
Questo settore è ancora in fase estremamente iniziale e le sperimentazioni non
hanno ancora dato risultati che si possano applicare su vasta scala e/o a tutte le specie
colpite da fitoplasmosi. Tuttavia, considerando che l’uso di antibiotici non è ammesso
in agricoltura in molte parti del mondo e che comunque non viene solitamente applicato
a causa degli alti costi di applicazione in rapporto ai relativamente ridotti vantaggi che
si possono ottenere, le metodiche di controllo presentate sono state principalmente
mirate alla prevenzione.
Tecniche colturali, impiego di endofiti fungini, metodi di selezione tramite
miglioramento genetico o ricerca di resistenze in germoplasma in collezione sono stati
descritti per fitoplasmosi della vite, del melo e del sesamo. L’impiego sperimentale
di molecole di sintesi come fosetyl A e chitosano nonchè di composti presenti in
natura come cercosporina, cladosporolo, spirolaxina, pulegone, carvone nonché di
alcuni funghi ad attività micorrizica hanno dimostrato in qualche caso la capacità di
ridurre la presenza dei patogeni, ma non sono risultati mai completamente efficaci
nella eradicazione dei fitoplasmi. Trattamenti in pieno campo per ridurre l’incidenza
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di ‘Ca. P. prunorum’ in albicocco con vari principi attivi di uso commerciale in Italia
non hanno fornito risultati apprezzabili mentre applicazioni ripetute di Vertimec in
Ungheria su peri affetti da moria ed infestati da C. pyri ha permesso di controllare la
diffusione del vettore e di conseguenza della malattia. Sono invece strati presentati
risultati preliminari circa l’uso della termoterapia e della coltura di meristemi applicati
essenzialmente alle fitoplasmosi della vite.
Parole chiave: Fitoplasmi, Fitoplasmosi, Interazione ospite-patogeno, Insetti vettori,
Epidemiologia, Diagnosi.
Progress in phytoplasma and phytoplasma diseases research presented
at the I IPWG meeting
In November 2007 was held in Bologna and the first ”International Phytoplasmologist
Working Group” meeting attended by more than 200 scientists form 40 Countries.
During the meeting several issues related to phytoplasmology were discussed and about
130 abstracts were presented. Results were in most cases new and stimulating research
in this new plant pathology field and extended abstracts of all presentation are free
available at the web page of Bulletin of Insectology: http://www.bulletinofinsectology.
org/. After a main lecture about aspects of molecular interaction among phytoplasmas,
plant host and insect vectors the main topics were: genomic and host-phytoplasma
interaction, classification and detection, new diseases and phytoplasma molecular
characterization, insect vectors, transmission, epidemiology, and finally perspectives
towards control of phytoplasma diseases.
Key words: Phytoplasmas, Phytoplasma diseases, Plant pathogen interactions, Insect
vectors, Epidemiology, Detection.
147
Fitoplasmosi delle pomacee
Coordinatore: Ruggero Osler
G. Stoppa, A. Salvatori
I principali sintomi di Apple Proliferation in Trentino
R. Tedeschi, L. Bertignono, A. Alma
Cacopsylla spp. e gruppo 16SrX (Apple Proliferation): un binomio ancora da
scoprire
A. Bertaccini, F.R. De Salvador, S. Tartarini, G. Firrao, S. Paltrinieri, M. Fontanari Controllo delle infezioni da fitoplasmi nel melo e ricerca di fonti di tolleranza e/o resistenza
Sintesi poster: Nazia Loi
G. Comerlati, F. Dal Molin, N. Mori, S. Paltrinieri, A. Bertaccini
Indagini sulla presenza di scopazzi del melo in Veneto.
C. Bisognin, P. Bianchedi, A. M. Ciccotti, M. Deromedi, I. Battocletti e M. S. Grando
Risposta di genotipi suscettibili e resistenti ad infezione da ‘Ca. P. mali’.
Confronto di due tecniche di quantificazione su radici.
P. Casati, P. Spadone, M. Calvi, P. Culatti, M. Salvetti, P. A. Bianco
Risultati dell’attività svolta nell’ambito del primo anno del progetto
“Ricerche sugli Scopazzi del melo in Lombardia”.
G. Rossi, C. Beni, S. Socciarelli, S. Marconi, M. del Vaglio, F. Gervasi e M. Pastore
Studio sullo stato nutrizionale di peri infetti dal fitoplasma del sottogruppo
16SrX-C.
I PRINCIPALI SINTOMI DI APPLE PROLIFERATION IN
TRENTINO
G. Stoppa1, A. Salvadori2
Dipartimento di Informatica e Studi Aziendali -Università di Trento Via Inama 4, I-38100 (TR)
2
Fondazione E. Mach - Via E. Mach,
I-138010 - S. Michele all’Adige - (TR)
1
E-mail: [email protected]
La presente comunicazione si propone di far conoscere le evidenze empiriche
sui principali sintomi di scopazzi del melo o Apple Proliferation (AP) [arrossamento
autunnale (AR), clorosi (CL), fiori estivi (FI), mele piccole (MP), stipole (ST) e scopette
(SC); i primi quattro sono sintomi a specifici], riscontrati negli anni 2005-2007 su 37
giovani impianti commerciali di melo del trentino ed inoltre cerca di rispondere alla
seguente questione: può un sintomo essere obbligatorio rispetto ad una data malattia,
nel senso di essere probabilisticamente necessario per il suo successivo manifestarsi?
Per una panoramica del problema si può far riferimento a Stoppa e Salvadori (2008).
I principali risultati riguardano innanzitutto: il numero di impianti colpiti, i livelli
massimi di attenzione (AR, FI, ARFI e ARCL) e i livelli massimi di gravità riscontrati.
Si possono fare le seguenti valutazioni principali: 1) A valle sono stati osservati
quattro livelli di attenzione e nove tipologie di danno: differenti dai quattro livelli di
attenzione e dalle sette tipologie di danno in montagna. 2) La clorosi è un sintomo
che non si presenta mai da solo, tende ad accompagnarsi all’arrossamento. 3) Sia a
valle che in montagna risultano interessate tutte le varietà anche se la golden, a valle
presenta solo livelli di attenzione. 4) Infine i sintomi a specifici dell’arrossamento
autunnale e dei fiori estivi sono, nei giovani impianti di melo del trentino, un sintomo
probabilisticamente necessario (p<0,01 al test di Poisson) ai fini della malattia degli
scopazzi. Non male come performance, specialmente per un sintomo così poco
considerato come l’arrossamento autunnale.
Parole chiave: Infezione AP.
151
The main symptoms of apple proliferation in Trentino
The intention of the report is to raise awareness of empirical evidence on the
main symptoms of Apple Proliferation (AP) [reddening (AR), chloroses (CL), late
flowering (FI), small fruits (MP), stipules (ST) and witches’ broom (SC); the first four
are unspecific symptoms], encountered on 37 young commercial apple plants (since
2000) in Trentino during 2005-2007; moreover to answers the following question:
can a symptom be compulsory with respect to one given disease, in the sense of
being probabilistic necessary for its successive occurrence? Problem overview was
described by Stoppa and Salvadori (2008). The main findings concern: the number
of affected orchards, the maximum levels of attention (AR FI ARFI and ARCL) and
maximum levels of gravity. You can make the following principal assessments: 1) In
valley there were observed four levels of attention and nine types of damage, different
from four levels of attention and from seven types of damage in the mountains. 2)
The chloroses is a symptom that does not occur itself, it tends to go with reddening.
3) Both downstream and in the mountains all varieties are interested, even though
the golden, downstream, have only levels of attention. 4) Finally, the reddening
unspecific symptoms and late flowering will be in young apple plants of Trentino,
a symptom probabilistic necessary (p<0,01 to test Poisson) for the disease of apple
proliferation. Not a bad performance, especially for a so little considered symptom as
the reddening.
Key word: Apple Proliferation.
Lavori citati/References/References
Stoppa G., A. Salvadori, 2008. Scopazzi del Melo - Apple Proliferation – SMAP II –
rapporto annuale 2007, Fondazione E.Mach - S.Michele all’Adige, pp. 12-22.
152
CACOPSYLLA SPP. E GRUPPO 16SRX (APPLE
PROLIFERATION): UN BINOMIO ANCORA DA SCOPRIRE
R. Tedeschi1, L. Bertignono2, A. Alma1
Di.Va.P.R.A. Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di Torino,
Via L. da Vinci 44, I-10095 Grugliasco (TO)
2
Institut Agricole Régional, Loc. La Rochère, 1/A, I -11100 (AO)
1
Le psille del genere Cacopsylla sono considerate i principali insetti vettori
dei fitoplasmi dei fruttiferi appartenenti al gruppo tassonomico 16SrX (Apple
Proliferation). E’ ormai risaputo che “Candidatus Phytoplasma mali” viene
efficacemente trasmesso a piante sane di melo dalle specie C. melanoneura (Förster)
e C. picta (Förster) (Frisinghelli et al., 2000; Jarausch et al., 2003; Tedeschi e Alma,
2004), mentre “Ca. Phytoplasma prunorum” viene veicolato da C. pruni (Scopoli)
(Carraro et al., 1998a; 2001). Analogamente “Ca. Phytoplasma pyri” viene trasmesso
da C. pyri (L.) e C. pyricola (Förster) (Carraro et al., 1998b; Davies et al., 1992).
Gli insetti vettori e i rapporti tra le diverse specie e le loro piante ospiti possono
variare in relazione agli agroecosistemi frutticoli e nel loro insieme condizionare
l’epidemiologia delle malattie trasmesse. Indagini approfondite e pluriennali atte a
valutare il ruolo di piante spontanee, nello specifico di Crataegus monogyna Jacquin,
sull’epidemiologia della malattia degli scopazzi del melo, hanno permesso di
evidenziare interessanti interazioni tra i fitoplasmi del gruppo dell’Apple Proliferation
e le psille del genere Cacopsylla. Campionamenti mediante trappole cromotattiche
gialle e scuotimento meccanico dei rami, durante l’intero periodo dell’anno, hanno
consentito di evidenziare la presenza di 7 specie del genere Cacopsylla: C. melanoneura,
C. affinis (Löw), C. peregrina (Förster), C. crataegi (Schrank), C. pulchella (Löw), C.
pruni e C. pyrisuga (Förster). Il DNA delle specie più abbondanti è stato sottoposto
a PCR diretta e nested con i primer generici e specifici per i fitoplasmi del gruppo
16SrX, P1/P7 e fO1/rO1 rispettivamente (Lorenz et al., 1995; Schneider et al., 1995).
Gli ampliconi ottenuti sono stati sottoposti a RFLP con gli enzimi di restrizione SspI
e RsaI per evidenziare la presenza di “Ca. Phytoplasma mali” e “Ca. Phytoplasma
prunorum” .
“Ca. Phytoplasma mali” è stato reperito nelle specie C. melanoneura e C.
peregrina, mentre “Ca. Phytoplasma prunorum” è stato rilevato in C. peregrina e C.
affinis. Per esclusione, l’analisi RFLP ha permesso di evidenziare la presenza di “Ca.
Phytoplasma pyri” in C. melanoneura, C. peregrina e C. crataegi. “Ca. Phytoplasma
mali” e “Ca. Phytoplasma pyri” sono stati rilevati anche nella pianta ospite Cr.
monogyna.
153
Tali risultati hanno permesso di evidenziare nuove e interessanti interazioni
tra i fitoplasmi del gruppo 16SrX e le psille del genere Cacopsylla. Prove preliminari
di trasmissione sono in corso per meglio comprendere tali interazioni e le possibili
implicazioni nell’epidemiologia delle fitoplasmosi dei fruttiferi.
Parole chiave: Cacopsylla spp. , “Ca. Phytoplasma mali”, “Ca. Phytoplasma pyri”,
“Ca. Phytoplasma prunorum”.
Cacopsylla spp. and the 16SrX group
a couple yet to be discovered
The psyllids of the genus Cacopsylla are considered as the principal insect
vectors of fruit tree phytoplasmas belonging to the 16SrX taxonomic group (Apple
Proliferation). It is now well-known that “Candidatus Phytoplasma mali” is efficiently
transmitted to healthy apple plants by C. melanoneura (Förster) and C. picta (Förster)
(Frisinghelli et al., 2000; Jarausch et al., 2003; Tedeschi and Alma, 2004), while
“Ca. Phytoplasma prunorum” is carried by C. pruni (Scopoli) (Carraro et al., 1998a;
2001). Likewise “Ca. Phytoplasma pyri” is transmitted by C. pyri (L.) and C. pyricola
(Förster) (Carraro et al., 1998b; Davies et al., 1992).
The insect vectors and the relationships between the different species and
their host plants can vary depending on the orchard agroecosystems and they, all
together, can influence the epidemiology of the transmitted diseases. In-depth and
long-term studies carried out to assess the role of wild plants, in particular Crataegus
monogyna Jacquin, in the epidemiology of the Apple Proliferation disease, allowed us
to highlight interesting relationships among phytoplasmas of the Apple Proliferation
group and psyllids of the genus Cacopsylla. Field samplings by means of yellow
sticky traps and the beat tray method during all the year round allowed us to record
the presence of 7 species of the genus Cacopsylla: C. melanoneura, C. affinis (Löw),
C. peregrina (Förster), C. crataegi (Schrank), C. pulchella (Löw), C. pruni and C.
pyrisuga (Förster). The DNA of the most abundant species was subjected to direct and
nested PCR with the generic and 16SrX group specific primers, P1/P7 and fO1/rO1
respectively (Lorenz et al., 1995; Schneider et al., 1995). The amplicons were further
analysed by RFLP with the endonucleases SspI e RsaI to reveal the presence of “Ca.
Phytoplasma mali” and “Ca. Phytoplasma prunorum” .
“Ca. Phytoplasma mali” was found in the species C. melanoneura and C.
peregrina, while “Ca. Phytoplasma prunorum” was detected in C. peregrina and
C. affinis. By elimination, the RFLP analyses allowed us to reveal the presence of
154
“Ca. Phytoplasma pyri” in C. melanoneura, C. peregrina and C. crataegi. “Ca.
Phytoplasma mali” and “Ca. Phytoplasma pyri” were detected also in the host plant
Cr. monogyna.
These results showed new and interesting relationships between phytoplasmas
of the 16SrX group and psyllids of the genus Cacopsylla. Preliminary transmission
trials to better understand those interactions and the possible implications in the
epidemiology of fruit tree phytoplasmoses are ongoing.
Key words: Cacopsylla spp. , “Ca. Phytoplasma mali”, “Ca. Phytoplasma pyri”, “Ca.
Phytoplasma prunorum”.
Lavori citati/References
Carraro L., N. Loi, P. Ermacora, 2001. Transmission characteristic of the European
stone fruit yellows phytoplasma and its vector Cacopsylla pruni. European
Journal of Plant Pathology, 107, 695-700.
Carraro L., R. Osler, N. Loi, P. Ermacora, E. Refatti, 1998a. Transmission of
European Stone Fruit Yellows phytoplasmas by Cacopsylla pruni. Journal
of Plant Pathology, 80, 233-239.
Carraro, L., N. Loi, P. Ermacora, A. Gregoris, R. Osler, 1998b. Transmission of
pear decline by using naturally infected Cacopsylla pyri. Acta Horticulture,
472, 665-668.
Davies, DL., CM. Guise , MF. Clark, AN. Adams, 1992. Parry’s disease of pears is
similar to pear decline and is associated with micoplasma-like organisms
transmitted by Cacopsylla pyricola. Plant Pathology, 41, 195-203.
Frisinghelli, C., L. Delaiti, MS. Grando, D. Forti, ME. Vindimian, 2000. Cacopsylla
costalis (Flor, 1861), as a Vector of Apple Proliferation in Trentino. Journal
of Phytopathology, 148, 425-431.
Jarausch, B., N. Schwind, W. Jarausch, G. Krczal, E. Dickler, E. Seemüller, 2003.
First report of Cacopsylla picta as a vector of apple proliferation phytoplasma
in Germany. Plant Disease, 87, 101.
Lorenz, KH., B.Schneider, U. Ahrens, E. Seemüller, 1995. Detection of the Apple
Proliferation and Pear Decline Phytoplasmas by PCR amplification of
ribosomal and non ribosomal DNA. Phytopathology, 85, 771-776.
Tedeschi, R., A. Alma, 2004. Transmission of apple proliferation phytoplasma by
Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae). Journal of Economic
Entomology, 97, 8-13.
155
Schneider, E., E. Seemüller, CD. Smart, BC. Kirkpatrick, 1995. Phylogenetic
classification of plant pathogenic mycoplasma-like organisms or
phytoplasmas. In Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology,
Vol I, pp. 369-380. Eds. Razin S., J.G. Tully. Academic Press, San Diego.
Lavoro svolto con il contributo della Regione Valle d’Aosta
156
Controllo delle infezioni da fitoplasmi nel
melo e ricerca di fonti di tolleranza e/o
resistenza
A. Bertaccini1, F. R. De Salvador2, S. Tartarini3, G. Firrao4, S. Paltrinieri1,
M. Fontanari2.
2
C.R.A.- Centro di ricerca per la frutticoltura,
Via Fioranello,52, I-00134 (RM)
3
DCA, University of Bologna,
4
DiPi, University of Udine, Via delle Scienze 208, I-33100 (UD)
1
Apple proliferation è una fitoplasmosi descritta per la prima volta in Italia negli
anni 50 (Rui, 1950), ma che ha mostrato una virulenza epidemica soprattutto negli
ultimi 15 anni. Le cultivar interessate alla patologia sono pressoché tutte quelle presenti nelle principali aree di coltivazione del melo: Golden Delicious, Red Delicious,
Gala, Fusji, Jonagold, Florina innestate su diversi portinnesti. Il fitoplasma associato
a questa patologia appartiene ad AP gruppo ribosomiale X sottogruppo A, è trasmesso
da differenti specie di psille, ed è stato recentemente classificato come“Candidatus
Phytoplasma mali” (Seemüller and Shneider, 2004).
Per fronteggiare questo problema fitosanitario il Ministero dell’Agricoltura
delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali ha finanziato il progetto nazionale
“ Controllo delle infezioni da fitoplasmi nel melo e ricerca di fonti di tolleranza e/o
resistenza alla ticchiolatura mediante tecniche di biologia molecolare” ai fini di trovare metodi di controllo di AP e studiare possibili fonti di resistenza o tolleranza al
fitoplasma.
Il germoplasma di melo utilizzato nelle ricerche è stato reperito in frutteti del
Trentino e nelle collezioni del CRA- ex Istituto sperimentale per la frutticoltura di
Pergine Valsugana (TN), in un area in cui AP è endemico da più di 10 anni.
Piante asintomatiche delle seguenti cultivar o selezioni sono state esaminate per
verificare la presenza di “Ca. P. mali”: Brina’, CLR13T45, CO-OP3, CO-OP5 (‘Sir
Prize’), CO-OP6, CO-OP7, CO-OP8, CO-OP9, CO-OP10, CO-OP11, CO-OP12, COOP13 (‘Red Free’), CO-OP15, CO-OP16, CO-OP17, CO-OP23 (‘William’s Pride’),
CO-OP24, CO-OP25 (‘Scarlett O’Hara’), CO-OP26, CO-OP28, CO-OP29 (SundanceTM), CO-OP43 (‘Juliet’), ‘Enova’, ‘Golden Lasa’, ‘Geneva Early’, HCR26T132,
157
‘Jerseymac’, ‘Lederer’, ‘Melba’, ‘NewJersey109’, ‘NewJersey56’, ‘NewJersey88’,
‘Raritan’, ‘Red Chief’, ‘Red Gala’, ‘Starking Delicious’, Tesaurus, TN00-027-025,
TN00-027-079, ‘Vistabella’, ‘Wealty Red’.
L’analisi del gene ribosomiale 16S ha permesso di rilevare la presenza del fitoplasma in un numero considerevole di piante asintomatiche appartenenti a diversi genotipi (De Salvador et al., 2007). Successive caratterizzazioni molecolari delle razze
di AP su rp geni hanno messo in evidenza la presenza prevalente del tipo rpX-A/AT-2.
I dati delle analisi indicano chiaramente che le piante asintomatiche possono essere
comunque infette nel caso di “Brina”e “Tesaurus”.
L’analisi PCR effettuata su campioni prelevati in diverse parti della chioma
non ha messo in evidenza una correlazione tra concentrazione del fitoplasma e sintomi
visibili. Il periodo della stagione vegetativa è la fonte maggiore di variazione della
quantità di fitoplasma nella parte aerea della pianta, con livelli elevati anche se variabili in giugno, bassi in luglio/agosto, elevati e più stabili in ottobre (Firrao 2006).
Nell’ambito delle cultivar appartenenti al gruppo CO-OP, quasi tutte non risultano infette da AP. Interessante ai fini della presente ricerca è che questo gruppo mostra una origine genetica complessa che comprende alcune selezioni della New Jersey
Agricultural Experiment Station (USA), a loro volta negative per la presenza di AP.
Nell’ambito del gruppo CO-OP, la selezione CO-OP 12 sembra essere quella
più promettente in quanto su 34 piante analizzate solo una è risultata positiva ad AP.
Al momento, non essendo disponibili accessioni di melo resistenti è considerando l’urgente necessità di trovare sul breve-medio periodo, mezzi di contrasto al fitoplasma sono state poste in valutazione diverse sostanze naturali e di sintesi utilizzate
su materiale infetto di melo in vitro e su piante in campo.
Le prove fatte con diverse formulazioni di terpeni aggiunte ai substrati di coltura su piantine micropropagate ed iniettate nel tronco di alberi infetti non hanno
evidenziato risultati significativi.
E’ in corso comunque la verifica di altre sostanze secondo le metodiche già
citate.
Parole chiave: Fitoplasmi del melo, Suscettibilità di germoplasma melo, Sostanze
anti-sma.
Control of apple proliferation disease and research
of resistence/tollence fonts
Apple proliferation (AP) is a phytoplasma associated disease firstly described
in Italy in the fifties (Rui,1950) but showing increasing epidemic activity in the last 15
years. Apple cultivars interested are almost all those present in the main apple grow-
158
ing areas: Golden Delicious, Red Delicious, Gala, Fuji, Jonagold Florina ) grafted on
different rootstocks. The phytoplasma associated with this disease belong to the AP
16S ribosomal group X subgroup –A, it is transmitted by different species of psyllas, and was recently classified as “Candidatus Phytoplasma mali” (Seemüller and
Shneider, 2004).
To face up this phytosanitary problem the Italian Ministery of Agriculture and
Forestry funded the national project “Controllo delle infezioni da fitoplasmi nel melo
e ricerca di fonti di tolleranza e/o resistenza alla ticchiolatura mediante tecniche di
biologia molecolare”, in order to find AP control methods, and to study apple genetic
background possibly linked to AP phytoplasma susceptibility.
The apple germoplasm employed for the research was collected in Trentino
(north Italy) in orchards where AP epidemic was reported from more than 10 years
and in collections of germoplasm maintained by C.R.A Fruit Trees Research Institute
in Pergine Valsugana (TN) and in near apple growing areas. Asymptomatic trees of
the following cultivars or selections were tested to verify presence of ‘Ca. P. mali’:
‘Brina’, CLR13T45, CO-OP3, CO-OP5 (‘Sir Prize’), CO-OP6, CO-OP7, CO-OP8,
CO-OP9, CO-OP10, CO-OP11, CO-OP12, CO-OP13 (‘Red Free’), CO-OP15, COOP16, CO-OP17, CO-OP23 (‘William’s Pride’), CO-OP24, CO-OP25 (‘Scarlett
O’Hara’), CO-OP26, CO-OP28, CO-OP29 (SundanceTM), CO-OP43 (‘Juliet’), ‘Enova’, ‘Golden Lasa’, ‘Geneva Early’, HCR26T132, ‘Jerseymac’, ‘Lederer’, ‘Melba’,
‘NewJersey109’, ‘NewJersey56’, ‘NewJersey88’, ‘Raritan’, ‘Red Chief’, ‘Red Gala’,
‘Starking Delicious’, Tesaurus, TN00-027-025, TN00-027-079, ‘Vistabella’, ‘Wealty
Red’. The analyses on 16S ribosomal gene allow to detect the presence of apple proliferation phytoplasmas in a number of asymptomatic plants belonging to diverse genotypes (De Salvador et al., 2007). Further molecular characterization of AP strains on
rp genes detected mainly rpX-A/AT-2 type phytoplasmas.
Data analysis clearly indicate that asymptomatic trees can be infected as well.
Five out of eight ‘Brina’ trees and four out of seven ‘Tesaurus’ trees resulted infected
by ‘Ca. P. mali’.
Quantitative PCR performed by subdividing each apple plant into zones revealed no correlation between phytoplasma titre and symptom display. Season was a
major source of variation; quantitative values of phytoplasma were high in June, very
low in July/August and then turned high in October (Firrao, 2006)
For the CO-OP apple group most of tested cultivars or selections proved to be
not infected by AP.
Interestingly, all negative genotypes in this group show a fairly complex
pedigree including selections from the New Jersey Agricultural Experiment Station
(USA). To this regard, it is remarkable that all the three tested New Jersey selections
resulted negative to AP. Inside the CO-OP group apple selections, CO-OP12 appears
to be the most promising since, out of 34 plants tested, only one resulted positive to
159
AP only in one out of the three tests performed during the growing season.
At the present, in absence of resistant apple accessions and considering the
necessity to find in short time methods to contain Apple Proliferation disease the activity of natural and synthetic compound towards phytoplasma was evaluated in vitro
and in field (Bertaccini et al., 2007).
Therpens in different formulations were added in the vitro colture medium of
apple plants and injected also into the trunk of infected tree in the field. Quantitative
analysis of phytoplasma in order to estimate the pathogen titre in vitro material and
on orchard’s leafs doesn’t shows any significant differences.
The evaluation of other potential substances are in progress.
Key words: Apple proliferation, Apple germoplasm susceptibility, Antiphytoplasmal
substances.
160
INDAGINI SULLA PRESENZA DI SCOPAZZI DEL MELO
IN VENETO
G. Comerlati1, F. Dal Molin1, N. Mori2, S. Paltrinieri3, A. Bertaccini3
Servizio Fitosanitario Regione Veneto
Viale dell’Agricoltura, 1a - Buttapietra I-37060 (VR)
2
Agrea Centro Studi Via Garibaldi, 5,
S. Giovanni L. I-37057 (VR)
3
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale Fanin 42,
I-40127 (BO)
1
Al fine di contrastare la diffusione del fitoplasma agente degli scopazzi del
melo (“apple proliferation”, AP) in Veneto, in ottemperanza al Decreto di lotta
obbligatoria (DM del 23 febbraio 2006 – G.U. n. 61 del 14 marzo 2006), durante
la stagione vegetativa 2007 sono state eseguite indagini per verificare la presenza
dei sintomi tipici della fitoplasmosi, la loro associazione con lo specifico fitoplasma
e con i relativi insetti vettori Cacopsylla picta (Förster) (Frisinghelli et al., 2000),
Cacopsylla melanoneura (Förster) (Tedeschi et al., 2002) e Fieberiella florii (Stål)
(Tedeschi e Alma, 2006) in alcuni areali di coltivazione del melo del Veneto.
Sono state osservate piante con sintomi ascrivibili ad AP (foglie con stipole
ingrossate, germogli scopazzati, frutti piccoli con picciolo lungo) in 7 dei 14 frutteti
indagati, con una incidenza variabile dallo 0,3 al 6,2%, la presenza del fitoplasma in
questi 7 frutteti è stata confermata dalle analisi molecolari sul gene ribosomico 16S
(Bertaccini et al., 2008).
Con l’impiego di trappole cromotropiche e di strumenti di cattura diretti, C.
melanoneura è stata trovata durante i mesi di marzo, aprile e maggio in 8 dei 14
frutteti monitorati, mentre C. picta è stata rilevata solo in una azienda in provincia di
Verona alla fine di marzo. Adulti di F. florii sono stati catturati durante i mesi estivi
in 4 aziende.
La presenza di piante sintomatiche e di insetti vettori è risultata più elevata
nelle zone pedecollinari delle province di Verona e Vicenza. Nella pianura veronese,
invece, sono state rilevate solo poche piante infette e pochi esemplari di psilla. Si
sono inoltre osservate due differenti situazioni epidemiologiche: in un appezzamento
localizzato a Brentino Belluno (VR), al confine con la provincia di Trento, sono
state catturate decine di psille e le piante sintomatiche, comparse dal 2002, sono
rapidamente aumentate (attualmente interessano il 3,0%); in due appezzamenti siti a
161
Sona e Zevio (VR), invece, la malattia, pur essendo presente da molti anni, non si è
diffusa e la presenza di insetti vettori è molto scarsa.
Ponendo in relazione questi dati con il numero di trattamenti insetticidi
effettuati sulle colture durante il periodo di volo delle psille non si osservano relazioni
dirette tra l’entità della malattia e le diverse strategie di difesa impiegate, facendo
ipotizzare che il diverso andamento epidemico possa essere associato alla presenza di
differenti ceppi del fitoplasma.
Parole chiave: Apple proliferation phytoplasma, Cacopsylla picta, Cacopsylla
melanoneura, Fieberiella florii.
Survey to verify apple proliferation phytoplasma presence in Vento region
To reduce spreading of apple proliferation phytoplasma disease (AP) in the
Veneto region (Northern Italy) following the DM February 23, 2006 – G.U. n. 61
March 14, 2006, during 2007 vegetative season several field inspections were carried
out. Presence of typical symptomatology, of specific phytoplasmas and of known
insect vectors such as Cacopsylla picta (Förster) (Frisinghelli et al., 2000), Cacopsylla
melanoneura (Förster) (Tedeschi et al., 2002) and Fieberiella florii (Stål) (Tedeschi e
Alma, 2006) was monitored in some apple growing areas.
Apple plants showing typical AP-related symptoms (leaf with enlarged stipules,
witches broom, small fruits with elongated petiols) were observed in 7 out of the
14 monitored orchards; disease incidence ranged from 0.3 to 6.2% and phytoplasma
presence and identity was confirmed by molecular analyses on 16Sr DNA gene
(Bertaccini et al., 2008).
By the use of chromotropic trapping and direct capturing C. melanoneura was
collected in March, April and May in 8 out of the 14 monitored orchards, while C.
picta was only detected at the end on March in one farm located in Verona province.
F. florii adults were captured in 4 farms during the summer months.
The presence of symptomatic plants and insect vectors was more numerous
at the hill bases in Verona and Vicenza provinces. In the Verona flat areas only a
few symptomatic plants and a low number of psyllas were detected. However two
different epidemiological situations were observed: in orchards located in Brentino
Belluno (VR), near to the border to Trento province, dozens of psyllas were captured
and symptomatic plants first observed in 2002, increased rapidly, reaching now the
3.0%; while in two orchards located in Sona and Zevio (VR), the disease, in spite its
presence form several years is not spreading and insect vector presence is very low.
162
Verifying these data with number of insecticides treatments applied to the orchards
during psyllas flights no direct relationship between the disease impact and the
treatment applied was observed. It is possible that the different epidemic situations
can be related to the presence of different AP-phytoplasmas pathotypes.
Key words: Apple proliferation phytoplasma, Cacopsylla picta, Cacopsylla
melanoneura, Fieberiella florii.
Bertaccini A., S. Paltrinieri, M. Martini, M. Fisichella, P. Ermacora, M. Fontanari,
R. De Salvador. 2008. Comparison of different detection systems for apple
proliferation phytoplasmas in Trentino (North Italy). Acta Horticulturae, 781,
453-458.
Frisinghelli C., L. Delatti, MS. Grando, D. Forti, E. Vindimian. 2000. Cacopsylla
costalis (Flor 1861), as a vector of apple proliferation in Trentino. Journal of
Phytopathology, 148, 425-431.
Tedeschi R., A. Alma, 2006. Fieberiella florii (Homoptera: Auchenorrhyncha) as a
vector of “Candidatus Phytoplasma mali”. Plant disease, 90, 284-290
Tedeschi R., D. Bosco, A. Alma, 2002. Population dynamics of Cacopsylla
melanoneura (Homoptera: Psyllidae), a vector of apple proliferation
phytoplasma in Northwestern Italy. Journal of Economic Entomology, 95,
544-551.
163
RISPOSTA DI GENOTIPI SUSCETTIBILI E RESISTENTI AD
INFEZIONE DA Ca. P. mali. CONFRONTO DI DUE TECNICHE
DI QUANTIFICAZIONE SU RADICI.
C. Bisognin, P. Bianchedi, A. M. Ciccotti, M. Deromedi, I. Battocletti,
M.S. Grando
Istituto Agrario San Michele all’Adige, Fondazione E. Mach Centro Sperimentale
Via Mach, 1, I-38010 San Michele all’Adige - (TN)
La fitoplasmosi conosciuta come Apple proliferation (AP) è la più importante
malattia del melo dell’Europa meridionale trasmissibile per innesto, insetti vettori e
anastomosi radicali. L’assenza di trattamenti specifici per contrastare efficacemente
questa patologia aumenta l’importanza dell’impiego di genotipi resistenti (Bisognin et
al., 2008a). Tuttavia, i meccanismi molecolari che sono alla base della resistenza sono
in gran parte sconosciuti. Questa mancanza di informazioni ha reso quindi necessario
l’avvio di un lavoro mirato a studiare la risposta della pianta all’infezione.
Per questo studio sono stati considerati diversi genotipi del genere Malus sia
resistenti che suscettibili alla malattia. Questi genotipi includono piante della specie
Malus sieboldii che porta la resistenza ad AP, piante appartenenti alla specie suscettibile
Malus domestica e piante provenienti da programmi di incrocio tra queste due specie.
Allo scopo di lavorare con materiale in condizioni controllate e omogenee, questi
genotipi sono stati micropropagati (Ciccotti et al., 2007) ed infettati con “Candidatus
Phytoplasma mali” mediante microinnesto in vitro (Bisognin et al., 2008b).
Successivamente sono stati fatti radicare e mantenuti in serra in condizioni
controllate, per alcuni anni. Mediante l’utilizzo della tecnica real time q-PCR (Baric e
Dalla Via, 2004, modificato) è stata quantificata la presenza del fitoplasma nelle radici
nei due anni successivi alla radicazione. I dati ottenuti sono stati confrontati con quelli
rilevati con analisi DAPI (Pedrazzoli et al, 2006), effettuata nello stesso periodo,
ma in modo indipendente, sugli stessi materiali. Per tutti i genotipi i risultati sono
perfettamente paragonabili con i due metodi applicati individuando i genotipi resistenti
come quelli che presentano una concentrazione di fitoplasma significativamente più
bassa di 15-20 volte e 7-13 volte rispettivamente con la tecnica qRT-PCR e con la tecnica
DAPI, rispetto ai genotipi suscettibili. Analizzando la concentrazione del fitoplasma
nell’anno successivo queste differenze tendono ulteriormente ad aumentare indicando
il sistema ex vitro come un ottimo sistema per monitorare la risposta dell’apparato
radicale di genotipi diversi di melo all’infezione da Ca P. mali. I risultati ottenuti
confermano, come già evidenziato dalle prove di campo e in vitro, la caratteristica
164
intrinseca di scarsa ospitalità del tessuto radicale dei genotipi resistenti nei confronti
del fitoplasma Ca P. mali. Questa risposta della pianta tende ad accentuarsi con il
passare degli anni provocando una riduzione del patogeno che può arrivare anche
fino alla completa eliminazione rendendo quindi possibile l’utilizzo di questi genotipi
come portinnesti resistenti ad AP.
Parole chiave: Scopazzi del melo, PCR quantitativa, DAPI, Screening di resistenza,
Microinnesto in vitro.
Response to infection with Ca. p. mali of susceptible and resistant genotypes.
Comparison of two quantitation methods in root tissues.
Apple Proliferation (AP) is the most important phytoplasma-associated disease
affecting apple in South Europe. It is transmitted by grafting, insects vectors and root
bridges. The failure in controlling this disease by standard means strongly increased
the importance of resistant genotypes (Bisognin et al., 2008a), although little is know
about the resistance mechanisms of the plants to infection.
In this study different genotypes of genus Malus, resistant and susceptibles to
the disease, were considered. These genotypes belong to the species Malus sieboldii,
resistant to AP, to the susceptible species Malus domestica and to plants derived
from crosses between these two species. With the aim to work in standardized and
homogeneous conditions, these genotypes were micropropagated (Ciccotti et al.,
2007) and infected with “Candidatus Phytoplasma mali” by micrografting in vitro
(Bisognin et al., 2008b). Subsequently they were rooted, acclimatized ex vitro and
maintained for some years. Phytoplasma concentration in roots was measured by
quantitative real-time PCR (Baric and Dalla Via, 2004, modified) in the two years after
acclimatization. Quantitative PCR results were compared with those obtained with
DAPI method (Pedrazzoli et al., 2006), performed independently in the same periods
and on the same materials. For all genotypes data are completely comparable with both
techniques showing phytoplasma concentration of resistant genotypes significantly
lower in respect to susceptible ones. In resistant genotypes AP concentration was found
15-20 times and 7-13 times lower than in susceptible plants applying qPCR or DAPI
techniques respectively. In the following years these differences increased suggesting
the ex vitro system as a nice model to monitor and study the response of the root tissues
to infection. These findings are consistent with previous observations in the field and
in the in vitro system and show the poor host suitability of roots of M. sieboldii and
M. sieboldii derived genotypes. The decrease of the pathogen concentration in the
root system should continue till a complete elimination allowing the use of resistant
genotypes as rootstocks to prevent the disease or reduce its impact.
165
Key words: Whitches’-brooms, Quantitative PCR, DAPI, Resistance screening,
Icrografting in vitro.
Baric S., J. Dalla Via , 2004. A new approach to apple proliferation detection: a
highly sensitive real-time PCR assay. Journal of Microbiological Methods 57
(suppl. 1), 135-145.
Bisognin C., B. Schneider, H. Salm, MS. Grando, W. Jarausch, E. Moll, E.
Seemüller, 2008a. Apple Proliferation resistance in apomictic rootstocks
and its relationship to phytoplasma concentration and simple sequence repeat
genotypes. Phytopathology, 98, 2, 153-158.
Bisognin C., A. Ciccotti, A. Salvadori, M. Moser, MS Grando, W. Jarausch, 2008b.
In vitro screening for resistance to apple proliferation in Malus ssp. Plant
Pathology, in press.
Ciccotti AM., C Bisognin, I. Battocletti, A. Salvadori, M. Herdemertens, W.
Jarausch, 2007. Micropropagation of apple proliferation-resistant apomictic
Malus genotypes. Agronomy Research, submitted.
Pedrazzoli F., AM. Ciccotti, P. Bianchedi, A. Salvatori, R. Zorer, 2006. Seasonal
colonisation behaviour of “Candidatus phytoplasma mali” in apple trees in
Trentino. XXth International symposium on virus and virus-like diseases of
temperate fruit crops and XIth International symposium on small fruit virus
diseases: Antalya, Turkey, May 22-26, 2006 : 130.
Lavoro svolto nell’ambito del progetto SMAP finanziato dal Fondo Unico per i Progetti di ricerca della
Provincia Autonoma di Trento.
166
Risultati dell’attività svolta nell’ambito
del primo anno del progetto “Ricerche sugli
Scopazzi del melo in Lombardia”
P. Casati1, P. Spadone1, M. Calvi2, P. Culatti3, M. Salvetti4, P. A. Bianco1*
Istituto di Patologia Vegetale, Università di Milano, Via Celoria 2, I-20133 (MI)
Laboratorio Fitopatologico Regione Lombardia Servizio Fitosanitario/Fondazione
Minoprio, V.le Raimondi 54, I-22070 Vertemate con Minoprio (CO)
3
ERSAF Lombardia - Servizio Fitosanitario Regionale, sede di Sondrio,
Via Copernico 38, I-20125 (MI)
4
Fondazione Fojanini di Studi Superiori, Via Valeriana 32, I-23100 (SO)
1
2
La malattia nota come “scopazzi del melo”, descritta per la prima volta da Rui
nel 1950, è in espansione in molte aree melicole dell’Europa. Anche in Lombardia,
dove da anni il Servizio Fitosanitario Regionale, in collaborazione con l’Università
degli Studi di Milano, svolge attività di monitoraggio, la malattia è presente in molte
aziende e l’agente eziologico ,“Ca. Phytoplasma mali” (Seemüller e Schneider, 2004),
è stato rilevato nei campioni provenienti da tali aree (Casati et al, 2007).
Le attività di ricerca, svolte all’interno del progetto “Ricerche sugli Scopazzi del
melo in Lombardia”, avevano lo scopo di individuare l’epoca più adatta per il prelievo
dei campioni, il metodo di estrazione degli acidi nucleici più idoneo e l’individuazione
di test analitici più sensibili. Inoltre sono stati identificati e caratterizzati gli isolati di
Ca. Phytoplasma mali associati alla malattia nelle aree a vocazione melicola della
Lombardia. Sono stati effettuati, in collaborazione con la Fondazione Fojanini di Studi
Superiori di Sondrio ed il Servizio Fitosanitario della Regione, diversi sopralluoghi in
Valtellina e in alcuni meleti delle province di Brescia e Mantova. Alcuni appezzamenti
sono stati visitati in diverse epoche, nei mesi di maggio, agosto, settembre, novembre e
gennaio per osservare il decorso della malattia e prelevare campioni vegetali di diversa
matrice (foglie o legno). Le analisi, finalizzate all’identificazione e caratterizzazione
molecolare dei fitoplasmi, hanno riguardato l’ amplificazione di differenti frammenti
genici del cromosoma di “Ca.Phytoplasma mali” e le successive analisi RFLP.
I risultati ottenuti possono essere così riassunti:
• tutti i fitoplasmi individuati nei campioni di melo provenienti da tre differenti
province lombarde appartengono al genere “Ca. Phytoplasma mali” come emerge
dall’analisi RFLP condotta sul gene 16SrDNA
• la caratterizzazione sulla base di un frammento genico non ribosomico indica che i
fitoplasmi individuati appartengono al sotto-tipo AT-1, isolato diffuso nei paesi del
nord Europa
167
• le analisi condotte sulle proteine ribosomiche, mediante PCR ed RFLP, hanno
individuato 5 diversi isolati: rpX-A, rpX-B, rpX-C, rpX-D, rpX-E, come riportato
da Martini e colleghi (2008) a riguardo della malattia in Friuli Venezia Giulia
• 51 dei 53 campioni raccolti nei mesi autunnali (foglie) e nei mesi invernali (legno),
sono risultati infetti mentre i campioni fogliari raccolti nei periodi primaverile ed
estivo, pur mostrando sintomi della malattia sono risultati infetti in 32 casi su 41
campioni prelevati da circa 15 piante asintomatiche sono risultati infetti dopo analisi
PCR
Parole chiave: Scopazzi del melo, “Ca. Phytoplasma mali”, PCR, RFLP.
First year project results of “Research on Apple proliferation
in Lombardia region”
The disease known as “Apple proliferation” (AP), reported for the first time
by Rui in 1950, occurs in many European apple growing areas. In Lombardia region,
since several years the Plant Protection Service in cooperation with Università degli
Studi di Milano has been involved in the survey. Preliminary results indicated a clear
spread of AP and “Ca. Phytoplasma mali” (Seemüller and Schneider, 2004), the agest
of the disease, has been frequently detected and idendified in the samples collected in
these areas (Casati et al, 2007).
The research, developed in the frame of the project “Research on Apple
proliferation in Lombardia region”, aims to identify the suitable period for sample
collection, the useful extraction method and to identify the most sensible PCR test.
During the first year work, several isolates of Ca. Phytoplasma mali associated with
the disease, coming from the apple areas of Lombardia have been identified and
characterized.
In collaboration with Fondazione Fojanini and Plant Protection Service, several
orchards have been observed in Valtellina and in Brescia and Mantova provinces.
Some of them have been visited in different times, during the months of May, August,
September, November and January, to monitoring the disease’s symptoms and to
collect samples of different matrix (leaves and woods). The analysis consist on PCR
and RFLP assays of different genomic fragment of “Candidatus Phytoplasma mali”
chromosome.
The obtained results are summarized:
• All the phytopasmas identified in the samples collected in three different provinces
belonged to “Candidatus Phytoplasma mali” genus, in according to RFLP analysis
on 16SrDNA gene
168
• The caracterization based on a non-ribosomic fragment showed that the identified
phytoplasmas belonging to subtype AT-1, isolate spread in nord Europe
• The PCR/RFLP analysis on ribosomal protein, was able to identify 5 different
isolates: rpX-A, rpX-B, rpX-C, rpX-D, rpX-E, to confirm the report by Martini and
colleagues (2008), regarding the presence of the disease in Friuli Venezia Giulia
• 51 out of 53 apple samples collected in fall (leaves) and winter (wood) seasons
were found to be infected while samples collected in spring and summer time,
showing symptoms of the disease, were positives only in 32 cases out of 41
• 15 apple collected samples from asymptomatic plants were found positive to PCR/
RFLP analysis.
Key words: Apple proliferation, “Candidatus Phytoplasma mali”, PCR, RFLP.
Casati P., A. Stern, P. Spadone, M. Calvi, D. Bulgari, PA. Bianco, 2007. Molecular
diversity in “Candidatus Phytoplasma mali” in Lombardia.. Bulletin of
insectology, 60, 359-360.
Martini M., P. Ermacora, L. Falginella, N. Loi, L. Carraio, 2008. Molecular
differentiation of “Candidatus Phytoplasma mali” and its spreading in Friuli
Venezia Giulia Region (North-East Italy). Acta Horiculturae, 781, 395-399.
Rui D., 1950. Una malattia inedita: la virosi del melo. Humus, 6, 7-10.
Seemüller E., B. Schneider, 2004. “Candidatus Phytoplasma mali”, “Candidatus
Phytoplasma pyri”, “Candidatus Phytoplasma prunorum” the casual agents of
apple proliferation, pear decline and European stone fruit yellows, respectively.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 4, 12171226.
Lavoro svolto nell’ambito del progetto, finanziato dalla Regione Lombardia, “Ricerche sugli scopazzi del
melo in Lombardia” (APROLOMB)
169
Studio sullo stato nutrizionale di peri infetti
dal fitoplasma del sottogruppo 16SrX-C
G. Rossi1, C. Beni2, S. Socciarelli 2, S. Marconi2, M. del Vaglio3, F. Gervasi3
M. Pastore3
Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura (C.R.A.) –
Via Nazionale, 84, I-00184 (RM)
1
E-mail - [email protected]
CRA-Centro di Ricerca per lo Studio delle Relazioni Suolo PiantaVia della Navicella, 4, I-00184 (RM)
2
E-mail - [email protected]
CRA - Unità di Ricerca per la Frutticoltura di Caserta
Via Torrino, 3, I-81100 (CE)
3
Dall’evidenza riscontrata di una remissione dei sintomi nelle piante infette da
fitoplasmi che, sono state coltivate, in terra o in vaso, con terreno raccolto dall’azienda
di Caserta è nata l’esigenza di investigare sulle eventuali relazioni esistenti tra lo stato
nutrizionale delle piante ospiti e la loro suscettibilità al patogeno.
L’indagine si è svolta in una serra di tessuto antiafide, con doppia porta
di sicurezza a Caserta, ove numerose piante di pero, coltivate su due suoli, uno
proveniente dall’azienda sperimentale di Pignataro Maggiore (CE) e l’altro proveniente
dall’azienda di Caserta, sono state inoculate con tasselli raccolti da un pero infetto da
fitoplasma, ad esclusione delle piante di controllo.
Nella stagione vegetativa 2007, sono risultate infette due piante allevate nei
vasi contenenti la terra proveniente da Pignataro Maggiore, innestate entrambe nel
luglio del 2007, e precisamente una pianta di Conference su Pyrus betulaefolia,
positiva ai test molecolari nell’ottobre dello stesso anno, ed una pianta di William su
Pyrus betulaefolia, positiva nel settembre dello stesso anno.
Pertanto, nell’ottobre 2007 si è proceduto al campionamento delle foglie
dalle due suddette piante e dalle seguenti altre piante, per ognuna delle due suddette
combinazioni cv su portainnesto: una pianta, coltivata su terreno di Pignataro, inoculata
e risultata negativa ai test, una pianta coltivata su terreno di Caserta, inoculata e
risultata negativa ai test, una pianta di controllo su terreno di Caserta e una pianta di
controllo su terreno di Pignataro.
Sulle foglie sono state determinate le concentrazioni di macro-, meso- e microelementi (Kalra Yash P., 1998) calcolati i seguenti rapporti tra elementi nutritivi: Fe/
Mn, P/Zn, K/Mg, N/K (Panero, 1990).
Le analisi hanno rilevato che nelle foglie delle piante allevate sul suolo di
170
Pignataro Maggiore le concentrazioni sia di boro, che di calcio, di rame, di potassio,
di magnesio e di fosforo sono nella norma, mentre lo zinco ed il sodio sono presenti in
concentrazioni al di sotto della sufficienza ma le quantità di ferro sono elevate in tutti
i campioni mentre il manganese è presente in concentrazioni non sufficienti.
Nelle foglie delle piante allevate sul suolo di Caserta è stata evidenziata una
lieve insufficienza di calcio, concentrazioni di ferro nella media, valori di manganese
sono al di sotto dell’intervallo di sufficienza.
L’elaborazione dei rapporti nutrizionali nelle foglie ha evidenziato, in
particolare, uno squilibrio nel rapporto Fe/Mn, con manganese carenza, solo negli
alberi di pero positivi al fitoplasma. In tutte le piante risultate sane, compresi i controlli,
il rapporto Fe/Mn è equilibrato.
Ulteriori studi sono in corso per convalidare la relazione tra i valori del rapporto
ferro/manganese nelle foglie e la presenza di fitoplasma nel pero ospite.
Parole chiave: Fitoplasma del sottogruppo16SrX-C, Moria del pero, Stato nutrizionale,
Rapporto Fe/Mn.
Study on nutritional status of pear-trees infected by 16SrX-C phytoplasma
From the evidence of a remission of symptoms, associated to phytoplasmosis,
when the damaged plants were transplanted from an experimental station to an another,
we decided to investigate if there was a relationship between nutritional status of
the host plants and the susceptibility to the 16Sr X-C phytoplasma. The trial was
carried out in the green-house of Caserta, where pear trees, cultivated in pots, with
two different soils, one collected from station of Pignataro Maggiore and the other one
from station of Caserta, were patch-grafted with infected pear tissue, control plants
excluded.
In 2007, two plants, of two different cultivar/rootstock combinations, precisely
Conference on Pyrus betulaefolia and William on Pyrus betulaefolia, both trained
on the Pignataro Maggiore soil and patch-grafted in July 2007, resulted positive
to molecular test for detection of phytoplasma in the October and in September,
rispectively, of the same year.
So, in the October of the same year, leaf samples were collected not only
from the two infected plants but also from the following plants, for each of the two
cv/rootstock combination: one plant, cultivated on the Pignataro Maggiore soil,
inoculated, and resulted negative to test, one plant, cultivated on the Caserta soil,
inoculated, and resulted negative to test, one plant not inoculated, cultivated on the
Pignataro Maggiore soil, one plant not inoculated, cultivated on the Caserta soil. The
171
presence of macro-, meso- and micro-nutrients was evaluated and the ratios between
some elements (Fe/Mn, P/Zn, K/Mg, N/K) were calculated (Kalra Yash P., 1998;
Panero, 1990 )..
The results showed that the pear leaves collected on Pignataro M. soil have a
normal concentration in B, Ca, Cu, K, Mg, and P while they presented a not sufficient
quantity of Zn and Na. The level of Fe was high in all samples, while that of Mn was
very low..
In the pear leaves collected from plants cultivated in Caserta soil, a slight
deficiency of Ca, a low quantity of Mn right levels of Fe and of the other analysed
elements were found.
The data showed a lack of balance in the Fe/Mn ratio, for deficiency of Mn,
only in the pear trees positives to tests for detection of 16 Sr X-C phytoplasma.
In all healthy plants, inoculated or not, cultivated in pots with the two different
soils, the Fe/Mn ratio was equilibrated.
Studies are in progress to validate the relationship between Fe/Mn ratio and
phytoplasma presence in host pear plants.
Key words: 16SrX-C phytoplasma, Pear decline, Nutritional condition, Fe/Mn ratio.
Kalra Yash P., 1998. Handbook of Reference Methods for Plant Analysis, CRC
Press, USA pp. 300.
Panero M., 1990. Analisi degli organi vegetali, metodologia diagnostica e
interpretazione dei risultati, Reda edizioni per l’agricoltura, Roma.
Lavoro svolto nell’ambito del progetto finalizzato Mi.P.A.F. “Fru.Med.” Sottoprogetto “D.A.F.M.E.”
Pubblicazione n° 41.
172
Fitoplasmosi delle drupacee
Coordinatore: Carlo Poggi Pollini
C. Poggi Pollini, A.R. Babini, L. Bianchi, D. Dradi, C. Lanzoni, P. Pirazzini
Prime valutazioni sulla diffusione del giallume europeo delle drupacee in
albicoccheti dell’Emilia-Romagna
L. Ferretti, A. Gentili, C. Poggi Pollini, P. Ermacora, G. Pasquini
Caratterizzazione molecolare di isolati di ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
identificati in pesco, susino e albicocco
C. Marcone, B. Schneider, G. L. Rana, E. Seemüller
Confronto mediante lo studio di vari geni, di ceppi del fitoplasma del giallume
europeo delle drupacee a diversa virulenza
Sintesi Poster: Carlo Poggi Pollini
C. Poggi Pollini, L. Bortolotti, D. Bellina, M. Agosti, L. Bianchi, C. Lanzoni, A.
Pinotti
Fenologia di Cacopsylla pruni (Scopoli) e diffusione del giallume europeo
delle drupacee in Lombardia.
S. Murolo, G. Romanazzi
Caratterizzazione molecolare di fitoplasmi delle drupacee nelle Marche.
PRIME VALUTAZIONI SULLA DIFFUSIONE DEL
GIALLUME EUROPEO DELLE DRUPACEE IN
ALBICOCCHETI DELL’EMILIA-ROMAGNA
C. Poggi Pollini1, A.R. Babini2, L. Bianchi1, D. Dradi3, C. Lanzoni1, P. Pirazzini4
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DISTA), Università di
Bologna, Viale Fanin 44, I-40127 (BO)
2
Servizio Fitosanitario della Regione Emilia-Romagna,
Via di Corticella 133, I-40129 (BO)
3
CSSAA, Az. Sp.le Martorano 5, I-47023 Cesena (FC)
4
Astra Innovazione e Sviluppo, Sop “Mario Neri”, Via Emilia, I-40026 Imola,
(BO)
1
L’evoluzione della sindrome è in corso di valutazione in Emilia-Romagna,
mediante rilievi periodici negli albicoccheti e saggi molecolari con la tecnica della
Real Time PCR (Pignatta et al., 2008), su un numero molto elevato di piante (1630)
in 27 aziende. La scelta, effettuata in collaborazione con 4 associazioni di produttori
coinvolte nel progetto (Apoconerpo Intesa, Apofruit, Orogelfresco e Terremerse), è
stata orientata preferibilmente su piante giovani (non oltre 5-6 anni di età) innestate
per lo più su mirabolano, in maniera tale da rappresentare nella maniera più omogenea
possibile la realtà dell’albicocco in ambito regionale (aree di pianura e di collina) ed in
particolare le varietà più interessanti per lo sviluppo futuro della frutticoltura locale.
Al fine di confermare la presenza di Cacopsylla pruni (Scopoli), vettore di
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, agente della malattia, e di studiarne il ciclo
biologico sono stati individuati 8 siti per il campionamento primaverile-estivo
(siepi di Prunus cerasifera e P. spinosa) con trappole cromotropiche adesive gialle
e mediante “frappage”. E’ stato inoltre effettuato un campionamento nel periodo
autunno-invernale su conifere (soprattutto Picea abies) in 2 aziende nella provincia di
Forlì-Cesena e 2 località nella pineta di Ravenna.
Dopo un anno di indagini la malattia è stata riscontrata in bassa percentuale,
inferiore all’1% nella maggior parte delle aziende monitorate; percentuali maggiori
sono presenti solo in aziende con piante di età superiore ai 10 anni, di varietà
particolarmente suscettibili (Alba, ad esempio); non sono state trovate piante infette
negli impianti costituiti nel 2006.
Nel 2007 sono stati catturati individui di C. pruni in 6 aziende, con una
percentuale di insetti infetti superiore al 10%; le popolazioni catturate sono risultate
di bassa entità. Nessun insetto è stato catturato su conifere nel periodo invernale.
175
Il controllo del materiale vivaistico ed un accurato monitoraggio degli impianti
sono ritenuti molto importanti in presenza di una malattia, endemica sul territorio,
dove è molto difficile individuare fonti di resistenza genetica ed il controllo affidato
alla lotta contro i vettori si è finora mostrato di difficile attuazione (Poggi Pollini et al,
2007); sono inoltre in corso prove di valutazione di varietà e portinnesti che possano
associare elevati parametri qualitativi e una scarsa sensibilità alla malattia.
Parole chiave: Giallume europeo delle drupacee, Cacopsylla pruni, Studi
epidemiologici, Emilia-Romagna.
Preliminary surveys on European Stone Fruit Yellows diffusion in apricot
orchards in the Emilia-Romagna region
An epidemiological study aimed to assess the presence of European Stone
Fruit Yellows (ESFY), caused by ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, in apricot
orchards in Emilia-Romagna is being carried out with field observations and molecular
analysis using Real Time PCR (Pignatta et al, 2008). ESFY is being investigated
on 1630 apricot trees, located in 27 orchards. This is being done on young plants
(5-6 years old), grafted mainly on myrabolan, of the most economically important
varieties for local growers in the most intensive growing areas, chosen in collaboration
with 4 professional associations (Apoconerpo Intesa, Apofruit, Orogelfresco and
Terremerse).
To obtain more information about the life cycle of the Ca. Phytoplasma
prunorum vector, the psyllid Cacopsylla pruni (Scopoli), insects were captured in
spring 2007, using the “frappage” method or chromotropic sticky traps placed on
wild stone fruit bushes (mainly blackthorn (Prunus spinosa) and P. cerasifera) in and
around the cultivated areas in 8 localities. Other insects were captured during autumnwinter on conifers (mainly Picea abies) in 2 apricot orchards and in 2 locations in the
Ravenna pine wood.
The preliminary results showed that ESFY is present in apricot orchards in
Emilia-Romagna, however the majority of orchards inspected showed a very low
incidence of the disease (less than 1%). It is worth noting that the most serious
damage was only found in orchards where there were older plants (more than 10 years
old) of some cv. such as “Alba”, suspected to be highly susceptible to ESFY. On the
contrary ESFY-infected plants were never observed in any of the younger orchards,
setup in 2006.
Individuals of C. pruni were captured in 6 out of 8 locations inspected during
spring 2007. The populations had a low density, however a relatively high number
176
of insects (more than 10%) resulted infected with Ca. Phytoplasma prunorum. As
regards the insect collection during autumn-winter, so far C. pruni have not been
found overwintering on conifers in this area.
In conclusion the control of source material and accurate field inspections should
be considered the most effective ways of preventing the spreading of a dangerous
disease, endemic in our region on wild and cultivated stone fruits. Preliminary results
showed that most of the insecticides used against C. pruni have little or no efficacy in
controlling the disease (Poggi Pollini et al, 2007). For this reason evaluation studies
to assess possible ESFY tolerance of some cultivar/rootstock combinations are also
being carried out in this area.
Key words: European stone fruit yellows, Cacopsylla pruni, Epidemiological studies,
Emilia-Romagna.
Pignatta D., F. Forno, L. Giunchedi, M. Gobber, L. Mattedi, P. Miorelli, C. Poggi
Pollini, C. Ratti, N. Reggiani, E. Ropelato, 2008. A real time PCR assay for
the detection of European Stone Fruit Yellow Phytoplasma (ESFYP) in plant
propagation material. Acta Horticulturae, 781, 499-504.
Poggi Pollini C., L. Bianchi, F. Forno, S. Franchini, L. Giunchedi, M. Gobber, L.
Mattedi, P. Miorelli, D. Pignatta, D. Profaizer, C. Ratti, N. Reggiani, 2007.
Investigation on European stone fruit yellows in experimental apricot orchards
in the province of Trento (Italy). Bulletin of Insectology, 60, 323-324.
Attività svolta nell’ambito del progetto triennale coordinato dal CRPV “Fitoplasmi albicocco” e finanziato
dalla regione Emilia-Romagna (L.R. 28/98). Si ringraziano i tecnici delle associazioni di produttori citate
per il loro indispensabile supporto nella scelta e nei sopralluoghi nelle aziende.
177
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI ISOLATI DI
‘CANDIDATUS PHYTOPLASMA PRUNORUM’ IDENTIFICATI
IN PESCO, SUSINO E ALBICOCCO
L. Ferretti1*, A. Gentili1, C. Poggi Pollini2, P. Ermacora3, G. Pasquini1
CRA – Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale,
Via C. G. Bertero, 22 I-00156 (RM)
2
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DISTA), Università di
Bologna, Viale Fanin 44, I-40127 (BO)
3
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante, Università di Udine,
Via delle Scienze 208 I-33100 (UD)
1
La sindrome del giallume europeo delle drupacee (ESFY – European Stone Fruit
Yellows), causata dal fitoplasma ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ (sottogruppo
16SrX-B), rappresenta ancora oggi la principale malattia di origine fitoplasmale delle
drupacee, diffusa in Italia in tutti gli areali di coltivazione (Del Serrone et al., 1998;
Pilotti et al., 1995; Carraro et al., 2002; Marcone et al., 2002).
Recenti studi sulla caratterizzazione molecolare del fitoplasma agente causale
di ESFY, effettuata sul gene non-ribosomico tuf, hanno evidenziato la presenza di un
polimorfismo genetico all’interno del sottogruppo 16SrX-B con la definizione di due
gruppi di isolati riferiti come ‘tipo a’ e ‘tipo b’. Tale variabilità è stata evidenziata
mediante doppia amplificazione genica con le coppie di oligonucleotidi tuf1f/tuf1r e
tuf2f/tuf2r e successiva analisi RFLP dei prodotti di amplificazione della nested - PCR
con l’enzima NlaIII (Ferretti et al., 2007).
Allo scopo di definire la distribuzione geografica dei due isolati e stabilire
delle possibili correlazioni con l’espressione sintomatologica e l’incidenza della
malattia nei diversi ambienti di coltivazione delle drupacee, è stata effettuata
un’indagine molecolare su 136 campioni di susino, pesco e albicocco provenienti da
frutteti commerciali localizzati in diversi areali geografici (Trentino, Friuli–Venezia
Giulia, Lombardia, Emilia-Romagna, Lazio e Molise) e da due campi collezione di
germoplasma localizzati in Calabria ed in Turchia.
Le analisi molecolari hanno evidenziato la presenza dei due tipi di isolati nei
campioni analizzati, confermando che la variabilità genetica individuata è diffusa nei
diversi areali di coltivazione delle drupacee.
Entrambi gli isolati sono stati identificati su tutte le specie prese in esame e
anche sulla stessa varietà, lasciando escludere una possibile correlazione fra tipo di
isolato e pianta ospite. Sostanziali differenze sono emerse, invece, sulla diffusione e
178
distribuzione geografica dei due isolati. Il ‘tipo a’, non distinguibile dall’isolato di
riferimento di ‘Ca. P. prunorum’ (ESFY CRA-PAV, albicocco Lazio), è risultato di
gran lunga il più diffuso essendo stato identificato nel 78% dei campioni analizzati
(82/105). Tale isolato, inoltre, ha mostrato una più ampia distribuzione geografica,
risultando presente in tutte le regioni prese in esame e l’unico identificato in Lazio,
Molise ed Emilia-Romagna. Il ‘tipo b’ ha mostrato, invece, un’areale di distribuzione
più circoscritto, essendo stato identificato solo in Trentino, Friuli-Venezia Giulia
e Lombardia. Tuttavia, mentre in Friuli-Venezia Giulia e Lombardia la presenza
dell’isolato ‘b’ è risultata molto sporadica, in Trentino la sua presenza è stata rilevata
in tutte le principali zone di coltivazione dell’albicocco della provincia di Trento, con
un’incidenza media del 22,7%. In tutti i casi il tipo ‘b’ è sempre stato individuato
all’interno di frutteti in cui era contemporaneamente presente anche l’isolato ‘a’ e solo
nei campi collezione localizzati in Calabria ed in Turchia è stata riscontrata una netta
predominanza in percentuale del ‘tipo b’.
Ulteriori approfondimenti sono necessari per correlare l’espressione
sintomatologica con la differenziazione nei due tipi di isolati, pur se alcune
preliminari osservazioni portano a ritenere il ‘tipo a’ più frequentemente associato a
piante manifestanti sintomi blandi o limitati ai soli frutti e il ‘tipo b’ spesso presente
in frutteti contigui a zone con abbondante vegetazione spontanea comprendente anche
drupacee selvatiche.
Parole chiave: ESFY, Gene tuf, Variabilità, Tipo a, Tipo b.
Molecolar characterization of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ isolates
identfied in peach, plum and apricot fruit trees.
European Stone Fruit Yellows (ESFY), caused by ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ (16SrX-B subgroup), is the main stone fruits phytoplasma disease,
widespread in all the Italian growing areas of this crops (Del Serrone et al., 1998;
Pilotti et al., 1995; Carraro et al., 2002; Marcone et al., 2002).
Recent studies on the molecular characterization of the ESFY agent
phytoplasma, performed on the non–ribosomal tuf gene, showed the presence of
genetic polymorphism within the 16SrXB subgroup allowing to distinguish two group
of isolates reported as ‘type a’ and ‘type b’. Molecular variability was pointed out by
double gene amplification with the primer pairs tuf1f/tuf1r e tuf2f/tuf2r followed by
RFLP analysis of the nested–PCR amplicons with the NlaIII enzyme (Ferretti et al.,
2007).
179
In order to define the geographical distribution of the two types of isolates
and to establish possible correlations with the symptoms and incidence of the disease
in different stone fruit growing areas, a molecular investigation was performed on
136 plum, peach and apricot samples collected from commercial orchards located
in different geographic areas (Trentino, Friuli–Venezia Giulia, Lombardy, EmiliaRomagna, Latium and Molise) and from two germplasm collection fields located in
Calabria and Turkey.
Molecular analysis showed the presence of the two types of isolates in the
analyzed samples confirming the presence of the genetic variability, previously
identified, in different stone fruit growing areas.
Both isolates were detected in all the considered plant species and also in the
same varieties excluding a possible correlation between isolate type and host plant.
On the contrary, clear differences were observed on the spreading and geographical
distribution of the two types of isolates. ‘Type a’, not distinguishable from the ‘Ca.
Phytoplasma prunorum’ reference strain (ESFY CRA-PAV, apricot Latium), resulted
the most spread isolate, being identified in the 78% of the analyzed samples (82/105).
Moreover, this isolate showed a wide geographical distribution since it resulted
present in all the investigated regions and the only one retrieved in Latium, Molise and
Emilia–Romagna. On the contrary, ‘type b’ showed a more restricted distribution area
being identified only in Trentino, Friuli-Venezia Giulia and Lombardy. Nevertheless,
while in Friuli-Venezia Giulia and Lombardy the presence of ‘type b’ resulted very
sporadic, in Trentino region its presence was retrieved in all the main apricot growing
areas of the Trento province, with a percentage of 22.7. However, ‘type b’ isolate
has always been detected in orchards where the ‘type a’ was contemporaneously
present and only in the germplasm collection fields located in Calabria and Turkey its
spreading resulted prevalent.
More investigations are needed to establish a possible correlation between
symptom expressions and the two different isolate types, even if preliminary
observations suggest that the ‘type a’ is more frequently associated with trees showing
mild symptoms or symptoms restricted only on fruits and the ‘type b’ is often spread
in orchards close to areas with abundant presence of spontaneous plants including
wild Prunus species.
Key words: ESFY, tuf gene, Variability, Type a, Type b.
180
Carraro L., F. Ferrini, P. Ermacora, N. Loi, 2002. Role of wild prunus species in
the epidemiology of European Stone Fruit Yellows. Plant Pathology, 51, 513517.
Del Serrone P., E. Bianchi, A. Liberatore, 1998. Outbreak of apricot chlorotic leaf
roll in apricot orchard of Latium, Italy. Phytopathologia mediterranea, 37,
133-139.
Ferretti L., G. Pasquini, G. Albanese, M. Barba, 2007. Molecular investigation on
the genetic polymorphism of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ detected in
plum and apricot fruit trees. Bulletin of Insectology, 60, 337-338.
Marcone C., I. Camele, A. Lanzieri, GL. Rana GL., 2002. Individuazione dei
fitoplasmi del giallume europeo delle drupacee e della moria del pero in specie
arboree da frutto in Calabria e Basilicata. Petria, 12, 423-425.
Pilotti M., F. Faggioli, F. Lauretti, M. Barba, 1995. Severe die-back of plum in
Central Italy is associated with MLOs and virus infections. Acta Horticolturae
386, 126-131.
181
Confronto mediante lo studio di vari geni, di
ceppi del fitoplasma del giallume europeo delle
drupacee a diversa virulenza
C. Marcone1*, B. Schneider2, G. L. Rana3, E. Seemüller2
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Salerno,
Via Ponte Don Melillo, I-84084 Fisciano (SA)
2
Julius Kuehn Institute (JKI), Federal Research Centre for Cultivated Plants, Institute
for Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture, D-69221 Dossenheim
3
Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università degli
Studi della Basilicata, Viale dell’ Ateneo Lucano, 10, I-85100 (PZ)
1
Venti ceppi del fitoplasma del giallume europeo delle drupacee (ESFY)
i quali, sulla base di esperimenti di inoculazione mediante innesto, differiscono
considerevolmente nella loro aggressività, oscillando dalla completa (o quasi completa)
avirulenza ad una elevata virulenza (Kison e Seemüller, 2001), sono stati esaminati
mediante l’ analisi di sequenze nucleotidiche di vari geni non ribosomiali, amplificate
mediante PCR, al fine d’ individuare eventuali marcatori molecolari connessi alla loro
virulenza e/o avirulenza. I suddetti ceppi, i quali sono mantenuti in pieno campo,
in piante di drupacee diverse, presso l’ Istituto di Dossenheim, Germania, sono
indistinguibili con le tecniche rutinarie di differenziazione e caratterizzazione dei
fitoplasmi e cioè le analisi di sequenze nucleotidiche ed RFLP del DNA ribosomiale
(rDNA). Come riferimento, sono stati usati i ceppi virulenti GSFY1, GSFY2 e
ESFY1 del fitoplasma ESFY, tutti disponibili in vinca, nonché un ceppo avirulento
o debolmente virulente, dello stesso fitoplasma, mantenuto in albicocco, individuato
in Francia in piante di albicocco risanatesi spontaneamente ed impiegato nello stesso
Paese come agente proteggente per il controllo dell’ accartocciamento clorotico
fogliare dell’ albicocco mediante la tecnica di protezione incrociata (Morvan et al.,
1986; Castelain et al., 1997). Quest’ultimo ceppo è indistinguibile da quelli severi di
ESFY mediante l’analisi RFLP dell’ rDNA. Per la PCR sono state impiegate coppie
di primer selezionate dalle sequenze di vari geni del ceppo AT del fitoplasma della
proliferazione del melo del quale oramai è disponibile la sequenza dell’intero genoma
(Kube et al., 2007). Visibili prodotti di amplificazione sono stati ottenuti soltanto con
le coppie di primer amplificanti sequenze dei geni tuf che codifica il cofattore Tu
(EF-Tu), che a sua volta, regola il trasporto dell’ aminoacil-tRNA al sito specifico
di riconoscimento sui ribosomi, durante la biosintesi delle proteine, rpsC (rps3) il
182
quale codifica la proteina ribosomiale S3, tlyC che codifica emolisine, cioè proteine
secrete da molti batteri ed usate dagli stessi per la lisi delle membrane della cellula
ospite e pertanto ritenute importanti fattori di virulenza, imp e fol i quali codificano,
rispettivamente, proteine di membrana, comunemente denominate proteine
immunodominanti, ed un enzima necessario per la biosintesi del folato. Il confronto
delle sequenze nucleotidiche ottenute ha evidenziato che la massima variabilità genetica
si ha a livello del gene imp con valori di dissimilarità oscillanti da 0.2 a 4.6%. Per i
rimanenti geni, i ceppi esaminati sono risultati identici o quasi. Nell’ambito del gene
tuf, la presenza di un sito addizionale di restrizione per l’enzima TaqI, già riportata per
il ceppo GSFY1 (Marcone et al., 2002), non è stata evidenziata per tutti gli altri ceppi.
Le differenze genetiche riscontrate tra i ceppi esaminati non sono marcatori idonei di
differenziazione, né sono correlabili con i caratteri di patogenicità.
Parole chiave: Giallume europeo delle drupacee, Drupacee, Virulenza del ceppo,
PCR, Gene imp.
Comparison of European stone fruit yellows phytoplasma strains differing in
virulence by multi-gene sequence analyses
Twenty strains of the European stone fruit yellows (ESFY) phytoplasma
which on the basis of graft-inoculation experiments greatly differ in aggressiveness,
ranging from avirulent (or nearly avirulent) to highly virulent (Kison and Seemüller,
2001), were examined by sequence analyses of several PCR-amplified non-ribosomal
genes in order to identify molecular markers linked to virulence. These strains which
are maintained in various stone fruit genotypes in the field at Dossenheim Institute,
are indistinguishable with techniques for routine phytoplasma differentiation and
characterization such as sequence and RFLP analyses of PCR-amplified ribosomal
DNA (rDNA). Also, the virulent ESFY strains maintained in periwinkle, namely
GSFY1, GSFY2 and ESFY1 as well as an avirulent or low-virulent strain of the same
phytoplasma, maintained in apricot, which was identified in recovered apricot trees, in
France, and used in the same country as a cross protecting agent to control the apricot
chlorotic leaf roll disease (Morvan et al., 1986; Castelain et al., 1997), were included
in the work for comparison. The mentioned avirulent strain is indistinguishable from
severe strains of ESFY phytoplasma on the basis of RFLP analysis of rDNA. For
PCR amplification, primers were designed from a number of genes distributed over
the chromosome of strain AT of the apple proliferation phytoplasma for which the
complete sequence is now available (Kube et al., 2007). Visible PCR products were only
obtained with primer pairs directed to genes tuf which encodes the elongation factor
183
Tu (EF-Tu) that mediates the transport of aminoacyl-tRNA to the codon recognition
site of ribosomes, rpsC (rps3) encoding the ribosomal protein S3, tlyC which encodes
hemolysins, i.e., membrane-damaging agents that serve as important virulence factors
for many bacteria, imp and fol encoding an immunodominant membrane protein and
an enzyme involved in the folate biosynthesis, respectively. Nucleotide sequence
comparisons revealed that the highest genomic variability occurred at imp gene
sequence level with dissimilarity values ranging from 0.2 to 4.6%. For the remaining
genes, the strains examined proved to be identical o nearly identical. Within tuf gene,
the presence of an additional TaqI restriction site which had already known to occur
in the strain GSFY1 (Marcone et al., 2002), was not identified for the other strains.
Genetic difference observed among the strains examined are neither suitable markers
for strain differentiation, nor linked to pathological traits.
Key words: European stone fruit yellows, Stone fruits, Strain virulence, PCR, Imp gene.
Castelain C., MG. Chastellière, JP Jullian, G. Morvan, JM. Lemaire, 1997. La
prémunition contre l’enroulement chlorotique de l’abricotier. Bilan de dix
annés d’observations sur huit vergers. Phytoma, 493, 39-44.
Kison H., E. Seemüller, 2001. Differences in strain virulence of the European stone
fruit yellows phytoplasma and susceptibility of stone fruit trees on various
rootstocks to this pathogen. Journal of Phytopathology, 149, 533-541.
Kube M., B. Schneider, R. Reinhardt, E. Seemüller, 2007. First look into the genome
sequence of ‘Candidatus Phytoplasma mali’ in comparison to ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ strains OY-M and AY-WB. Bulletin of Insectology, 60,
113-114.
Marcone C., I. Camele, A. Lanzieri, GL. Rana, 2002. Individuazione dei fitoplasmi
del giallume europeo delle drupacee e della moria del pero in specie arboree da
frutto in Calabria e Basilicata. Petria, 12, 423-425.
Morvan G., M. Arnoux, C. Castelain, 1986. Prospective for the control of apricot
chlorotic leaf roll a mycoplasma disease, by cross protection. Acta Horticulturae,
193, 359-366.
184
FENOLOGIA DI Cacopsylla pruni (Scopoli) E
DIFFUSIONE DEL GIALLUME EUROPEO
DELLE DRUPACEE IN LOMBARDIA
C.Poggi Pollini1, L.Bortolotti2, D.Bellina2, M.Agosti2, L.Bianchi1,
C. Lanzoni1, A.Pinotti 3
2
Consorzio di Difesa Colture Intensive di Brescia, Via Malta 12, I-25124 (BS)
3
Servizio Fitosanitario Regione Lombardia, Via Pola 12/14, I-20124 (MI)
1
La presenza e la fenologia di Cacopsylla pruni (Scopoli), vettore di ‘Candidatus
Phytoplasma prunorum’, agente del Giallume Europeo delle Drupacee (ESFY), è
stata indagata per la prima volta in Lombardia negli anni 2006/2007 in 7 aziende in
provincia di Brescia e Mantova.
Gli adulti sono stati catturati con “frappage” settimanali su piante spontanee di
prugnolo (P. spinosa) ai margini dei frutteti e pesco (P. persica), la coltura più diffusa
nella zona, contati e separati per sesso.
La presenza di uova e stadi preimmaginali è stata valutata con osservazione
diretta e conta sui rametti di prugnolo.
Una parte dei campioni (riuniti in gruppi di 2 individui) è stata analizzata con la
tecnica Real Time PCR (Pignatta et al, 2008) per verificare la presenza del fitoplasma
negli insetti; nel 2007 sono stati analizzati anche campioni di uova. Dati significativi
sono stati ottenuti solo nelle aziende bresciane, mentre in provincia di Mantova, dove
il prugnolo è praticamente assente, solo pochi esemplari di forme preimmaginali sono
stati ritrovati su pesco.
La comparsa dei primi adulti reimmigranti è stata osservata il 20 febbraio nel
2007, mentre nel 2006 tale data non è stata individuata con precisione. A causa del
diverso andamento climatico delle due stagioni, la fenologia è stata un po’ diversa:
scomparsa dei reimmigranti il 26 aprile 2007, rispetto al 3 maggio nel 2006, comparsa
degli adulti di nuova generazione il 17 maggio 2007 (31 maggio nel 2006), scomparsa
delle forme giovanili il 7 giugno 2007 (5 luglio nel 2006).
La sex ratio degli adulti è risultata nettamente a favore delle femmine nei
reimmigranti, mentre è risultata prossima ad 1:1 nella nuova generazione.
Il 96% degli adulti di C. pruni è stato catturato su prugnolo, confermando la
185
predilezione della psilla per questa specie rispetto al pesco, dove la presenza è stata
solo sporadica (4%). Il fitoplasma è risultato presente in una percentuale simile di
insetti nelle analisi dei 2 anni, con una media del 45% per i reimmigranti e del 24,2%
per le forme giovanili.
Dati più discordanti, a causa del ridotto numero di campioni analizzati nel
2007, sono invece stati osservati per gli adulti della nuova generazione (0% di infetti
nel 2007 e 42,3% nel 2006); il fitoplasma non è mai stato riscontrato nelle uova.
Nonostante la presenza di C. pruni si sia dimostrata strettamente correlata
alla presenza di P. spinosa, la presenza di piante con sintomi riferibili ad ESFY nei
frutteti indagati non appare invece legata all’abbondanza del vettore e del suo ospite
spontaneo. L’incidenza della malattia risulta infatti molto variabile in tutte le aziende
indagate, comprese quelle del mantovano dove la presenza di prugnolo è praticamente
assente e le catture di C. pruni sono risultate molto scarse..
Parole chiave: Fenologia, Cacopsylla pruni (Scopoli), Diffusione del giallume
europeo delle drupacee in Lombardia.
Phenology of Cacopsylla pruni (Scopoli) and spreading of the European Stone
Fruit Yellows Phytoplasma in Lombardy
The presence and phenology of Cacopsylla pruni (Scopoli), vector of
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the agent of European Stone Fruit Yellows
(ESFY), were investigated for the first time in Lombardy in 2006 and 2007. Presence
of the insect was investigated weekly, in 7 orchards in the Brescia and Mantova
provinces, on wild P. spinosa (blackthorn) surrounding cultivated areas, and on P.
persica, the most common stone fruit species in this area.
Adults were collected by plant beating (“frappage”) and then counted and sexed.
The presence of eggs and preimmaginal stages was investigated by the observation
of portions of blackthorn twigs. Parts of the adults and preimmaginals collected were
grouped in pairs and processed with Real Time PCR (Pignatta et al, 2008) to verify
the presence of Ca. Phytoplasma prunorum in the insects. In 2007, egg samples were
also analysed.
Useful data were only obtained from the orchards in the Brescia province.
Blackthorn was not found close to the orchards of the Mantova province, and only
few preimmaginal stages were found on peach trees. The first overwintering adults
(reimmigrants) were found on February 20th, in 2007. In 2006 it was not possible to
fix this time exactly. Due to the different climatic conditions in these two years, the
phenology of C. pruni was quite different. The last overwintering adults were found
on April 26th, in 2007, and on May 3rd, in 2006. The first adults of the new generation
186
were collected on May 17th, in 2007, and on May 31st, in 2006. The last preimmaginal
stages and adults were found on June 7th, in 2007 and on July 5th, in 2006.
The sex ratio of the adults shifted towards female predominance in overwintering
adults, while, it was close to 1:1 for the adults of the new generation. Most of the C.
pruni adults were collected on blackthorn (96%), confirming the preference of the
psyllids for this plant, as compared to peach trees where presence was very low (4%).
The percentage of PCR positive samples was similar in the two years with an average
of 45% for the overwintering adults and 24.2% for the preimmaginal stages.
Different data were observed for the adults of the new generation. Due to the
few samples analyzed in 2007, the percentage of positives was 0% in 2007 and 42.3%
in 2006. None of the egg samples was positive to the PCR analysis.
Although the presence of C. pruni was strictly correlated to the presence of
blackthorn, the number of cultivated plants with ESFY symptoms did not appear to be
related to the amount of the vectors or blackthorn bushes. There was quite difference
in disease incidence in various the orchards studied, even in the Mantova province,
where blackthorn is almost absent and C. pruni was captured only sporadically.
Key words: Phenology, Cacopsylla pruni, European Stone Fruit Yellows.
Pignatta D., F. Forno, L. Giunchedi, M. Gobber, L. Mattedi, P. Miorelli, C. Poggi
Pollini, C. Ratti, N. Reggiani, E. Ropelato, 2008. A real time PCR assay for
the detection of European Stone Fruit Yellow Phytoplasma (ESFYP) in plant
propagation material. Acta Horticulturae, 781, 499-504.
Attività svolta con il contributo della Regione Lombardia, D.G. Agricoltura, Piano per la ricerca 2006.
187
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI FITOPLASMI
DELLE DRUPACEE NELLE MARCHE
S. Murolo, G. Romanazzi
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali,
Università Politecnica delle Marche, Via Brecce Bianche, I-60131 (AN)
La frutticoltura nella regione Marche assume una importanza rilevante in
alcune aree, quali la Val d’Aso, dove è concentrata la coltivazione delle drupacee
(prevalentemente susino e pesco). Negli ultimi anni tali colture hanno risentito in
maniera rilevante di problematiche fitosanitarie di non facile gestione. Fra queste, la
più diffusa è il giallume europeo delle drupacee, causato da ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ (Seemüller e Schneider, 2004), rinvenuto frequentemente in impianti
frutticoli dell’Italia settentrionale (Poggi Pollini et al., 2001; Carraro et al., 2002; Loi
et al., 2007) e sporadicamente nell’Italia centro-meridionale (Marcone et al., 2002;
Pastore et al., 2008). Inoltre, piante di pesco con sintomi di giallumi e arrossamenti
delle foglie sono state trovate infette da fitoplasmi del gruppo dello stolbur (16SrXIIA) in Italia settentrionale (Paltrinieri et al., 2006).
Scopo del lavoro è stato quindi l’identificazione, mediante tecniche di
analisi molecolare, dei fitoplasmi associati a piante di susino e pesco con sintomi di
giallume.
A partire dall’estate 2003, sono state individuate piante di susino cinogiapponese in agro di Montefiore (AP) e di pesco in agro di Petritoli (AP) che
presentavano sintomi di giallume. Venti campioni fogliari sono stati raccolti da piante
di susino (11) e pesco (9) con sintomi di giallume e sottoposti all’estrazione del DNA
totale mediante il kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania).
Il DNA è stato amplificato con la coppia di primer universali P1/P7 ed in nested-PCR
con le coppie di primer gruppo specifiche R16(I)F1/R1, R16(V)F1/R1, R16(III)F2/R1
e fO1/rO1, quindi i prodotti di reazione sono stati sottoposti a restrizione enzimatica.
Sette dei campioni di pesco sono risultati infetti da fitoplasmi del gruppo dello
stolbur, mentre 4 campioni di susino (cv October Sun) erano affetti da ‘Ca. Phytoplasma
prunorum’. Non sono state riscontrate infezioni di fitoplasmi appartenenti ai gruppi
16SrI, 16SrIII e 16SrV. Alcuni dei prodotti PCR ottenuti con i primer fO1/rO1 e
R16(I)F1/R1 sono stati purificati, sequenziati e dall’analisi Blastn è stato possibile
verificare una elevata omologia di sequenza con ‘Ca. Phytoplasma prunorum’
AM933142 (99,6%) e stolbur AM933139 (99,0%), rispettivamente, disponibili nella
banca dati Genbank.
188
Mentre la presenza di giallume europeo delle drupacee è comune nelle aree
frutticole, il rinvenimento di fitoplasmi dello stolbur in piante di pesco può attribuirsi
alla vicinanza di vigneti inerbiti con alta incidenza di Legno nero, dai quali tali agenti
possono provenire, come già rilevato nello stesso ambiente ma in direzione opposta
per fitoplasmi appartenenti al gruppo 16SrIII, sporadicamente rinvenuti su vite
(Romanazzi et al., 2004).
Parole chiave: Pesco, susino, ‘Ca. Phytoplasma solani’, ‘Ca. Phytoplasma prunorum’,
Stolbur, Sequenziamento.
Molecular characterization of stone fruit phytoplasma in the Marche region
In the Marche region, stone fruit cultivation (mainly plum and peach) is
particularly important in some areas, such as Val d’Aso. Over the last few years,
these crops have been affected by phytosanitary problems that are not easy to solve.
Among these, the most widespread is caused by European stone fruit yellows, induced
by “Candidatus Phytoplasma prunorum” (Seemüller and Schneider, 2004). This has
frequently been detected in northern Italy (Poggi Pollini et al., 2001; Carraro et al.,
2002; Loi et al., 2007) and sporadically in central and southern Italy (Marcone et al.,
2002; Pastore et al., 2008). Moreover, peach yellow symptoms associated with stolbur
infections (group 16SrXII-A) have been reported in northern Italy (Paltrinieri et al.,
2006).
The aim of this study was the identification of phytoplasma associated with
plum and peach with yellows symptoms, using molecular tools.
Since the summer 2003, Japanese plum located at Montefiore (AP) and peach
in Petritoli (AP) have shown yellows symptoms. Twenty symptomatic leaf samples
were collected from these plum (11) and peach (9) plants and their total DNA was
extracted using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The DNA was
amplified using the P1/P7 universal primers, followed by nested-PCR using groupspecific primers: R16(I)F1/R1, R16(V)F1/R1, R16(III)F2/R1 and fO1/rO1. Some
fO1/rO1 and R16(I)F1/R1 PCR products were purified and sequenced.
Seven peach samples were infected by stolbur phytoplasma, and four plum
(cv October Sun) samples were positive for ‘Ca. Phytoplasma prunorum’. The
samples were not infected by phytoplasma belonging to 16SrI, 16SrIII and 16SrV.
The BLASTn analysis carried out on sequenced peach and plum samples identified
a high sequence homology with stolbur AM933139 (99.0%) and ‘Ca. Phytoplasma
prunorum’ AM933142 (99.6%), respectively, as available in the Genbank database.
While the infection of plum with European stone fruit yellows is common in
all areas where the crop is grown, the presence of stolbur in peaches appears to be
189
due to neighbouring vineyards with weeds and with high incidence of Bois noir, from
where these agents may come. This has already been seen in the opposite direction,
for phytoplasma belonging to 16SrIII group, sporadically detected on grapevine
(Romanazzi et al., 2004).
Key words: Peach, plum, ‘Ca. Phytoplasma solani’, ‘Ca. Phytoplasma prunorum’,
Stolbur, Sequencing
Carraro L., F. Ferrini, P. Ermacora, N. Loi, 2002. Role of wild Prunus species in the
epidemiology of European stone fruit yellows. Plant Pathology, 51, 513-517.
Loi N., F. Ferrini, A. Loschi, 2007. Recovery e giallume europeo delle drupacee: un
caso studio. Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro le
fitoplasmosi della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte e
antagonisti – Ancona, 17-18 settembre, 15-16.
Marcone C., A. Camele, A. Lanzieri, GL. Rana, 2002. Individuazione dei fitoplasmi
del giallume europeo delle drupacee e della moria del pero in specie arboree da
frutto in Calabria e Basilicata. Petria, 12, 423-425.
Paltrinieri S., S. Botti, A. Bertaccini, N. Mori, F. Dal Montin, N. Fiore, 2006. Are
phytoplasmas involved in a severe peach decline? Acta Horticulturae, 713,
421-427.
Pastore M., F. Gervasi, M. Del Vaglio, M. Petriccione, A. Bertaccini, 2008. Differenti
reazioni indotte in susino cino-giapponese (Prunus salicina) da infezioni
ottenute mediante innesti di materiale infetto da ‘Candidatus phytoplasma
prunorum’. Atti Giornate fitopatologiche, vol. 2, 585-588.
Poggi Pollini C., R. Bissani, L. Giunchedi, 2001. Occurrence of European Stone
Fruit Yellows Phytoplasma (ESFYP) infection in peach orchards in NorthernCentral Italy. Journal of Phytopathology, 149, 725-730.
Seemüller E., B. Schneider, 2004. ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus
Phytoplasma pyri’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the causal agents of
apple proliferation, pear decline and European stone fruit yellows, respectively.
Romanazzi G., S. Murolo, L. Landi, MB. Branzanti, O. Silvestroni, V. Savino, 2004.
Giallumi della vite nelle Marche. Atti Giornate Fitopatologiche (2), 353-358.
190
Fitoplasmosi della vite
Coordinatori: Maurizio Conti e Michele Borgo
M. Barba
Progetto Gia.Vi: “I giallumi della vite: un fattore limitante le produzion
vitivinicole”.
E. Angelini, L. Filippin, D. Bellotto, L. Stringher, M. Borgo
Giallumi della vite in provincia di Treviso: caratterizzazione dei fitoplasmi
associati
D. D’Ascenzo, S. Murolo, R. Di Giovanni, G.Romanazzi
Caratterizzazione molecolare di isolati di legno nero in Abruzzo e indagini sul
recovery in viti infette.
G. Pasquini, L. Ferretti, B. Bagnoli, A. Gentili, G. Albanese, C. Rapisarda, V. Cavalieri,
M. Barba
Il legno nero della vite nel centro-sud Italia
L. Filippin, M. Borgo, G. Lucchetta, C. Michielini, E. Angelini
Caratterizzazione di fitoplasmi identificati in piante spontanee raccolte in aree
vitate
B. Bagnoli, F. Pinzauti, V. Trivellone
Reptalus quinquecostatus (Dufour): dati bio-etologici e rapporti con il
fitoplasma dello Stolbur in aree viticole toscane
N. Mori, F. Pavan, M. Bacchiavini, N. Reggiani, F. Bonomi, A. Bertaccini
Fenologia di Hyalesthes obsoletus Signoret su convolvolo e ortica
F. Lessio, P. Chiusano, A. Alma
Rilascio e cattura di Scaphoideus titanus Ball per lo studio della dispersione
M. Jermini, M. Gusberti, L. Schaub, Ch. Linder, S. Schärer, P. Kehrli, L. Colombi, S.
Bellion, S. Emery
Flavesceza dorata e Scaphoideus titanus: distribuzione e strategie di lotta PI e
biologica in Svizzera
P. Saracco, D. Pacifico, C. Marzachì, I. Gribaudo, A. Alma, D. Bosco
Attività di fenitrothion e thiamethoxam nella prevenzione della trasmissione di
flavescenza dorata
F. Mannini, I. Gribaudo
Interventi per la prevenzione e l’eliminazione dei fitoplasmi dal materiale di
propagazione viticolo
E. Crotti, E. Gonella, M. Pajoro, C. Damiani, I. Negri, A. Rizzi, N. Raddadi, M.
Marzorati, I. Ricci, G. Favia, A. Alma, D. Daffonchio
Asaia, batterio acetico associato a Scaphoideus titanus Ball: potenzialità per il
biocontrollo
E. Gonella, I. Negri, M. Marzorati, M. Mandrioli, L. Sacchi, D. Daffonchio, A. Alma
Comunità microbica associata a Hyalesthes obsoletus Signoret, vettore del
legno nero della vite
Sintesi Poster: Giuliana Albanese e Alberto Alma
G. Pasquini, G. Albanese, E. Angelini , A. Bertaccini, PA. Bianco, M. Borgo, L.
Carraro, P. Casati, G. Durante, L. Ferretti, A. Gentili, C. Marzachì, R. La
Rosa, D. Pacifico, S. Paltrinieri, A. Zorloni
Caratterizzazione molecolare del fitoplasma agente di legno nero.
F. Pavan, C. Bellomo, M. Borgo, V. Forte
Strategie di controllo della flavescenza dorata della vite.
A. Alma, F. Lessio, L. Picciau, F. Tota, V. Forte, M. Borgo, B. Bagnoli, F. Pinzauti, V.
Trivellone, C. Rapisarda, V. Cavalieri, V. D’Urso
Rapporti tra cicaline, fitoplasmi e piante ospiti nell’agroecosistema vigneto.
M. Borgo, G. Albanese, F. Quaglino, P. Casati, P. Ermacora, L. Ferretti, F. Ferrini, L.
Filippin, G. Pasquini, E. Angelini
Ruolo di altre piante nell’epidemiologia dei fitoplasmi agenti di flavescenza
dorata e legno nero.
E. Angelini, G. L. Bianchi, P. A. Bianco, M. Borgo, P. Casati, G. Durante, L. Filippin,
L. Galetto, C. Morassutti, S. Prati, F. Quaglino, A. Zorloni, C. Marzachì
Nuove acquisizioni nella diagnosi di FD e LN.
A. Bertaccini, E. Angelini, PA. Bianco, S. Botti, P. Casati, G. Durante, L. Filippin, C.
Marzachì, D. Pacifico, S. Paltrinieri, F. Quaglino
Caratterizzazione dei ceppi di flavescenza dorata individuati nel territorio
italiano nel periodo 2004-2008.
S. Carnevale, S. Paltrinieri, P. Braccini, D. Rizzo, S. Nhadi, N. Contaldo, A.
Bertaccini
Diffusione di ceppi di legno nero in vigneti toscani.
L. Ferretti, G. Pasquini, V. Cavalieri, C. Rapisarda, V. D’Urso, M. Barba, G.
Albanese
Epidemiologia e identificazione dei fitoplasmi dei giallumi della vite in
Calabria.
R. Bonfanti, F. Guglielmo, F. Prosperi, E. Junod , S. Dallou e R. Grivon
Prime segnalazioni di flavescenza dorata in Valle d’Aosta e indagini sulla sua
diffusione.
R. La Rosa, C. Rapisarda, V. Cavalieri, D. Pacifico, M. Tessitori
Monitoraggio ed epidemiologia dei giallumi della vite in Sicilia.
G. Romanazzi, S. Murolo
Caratterizzazione molecolare di isolati di legno nero della vite nelle Marche.
M.R. Silletti, S. Murolo, G. Romanazzi, V. Savino
Caratterizzazione molecolare di isolati pugliesi di legno nero della vite.
P. Margaria, M. Turina e S. Palmano
Diagnosi da succo grezzo di diversi agenti patogeni della vite in Taqman®
Real-Time RT-PCR.
G. Pasquini, L. Ferretti, A. Gentili, M. Barba
La diagnosi del legno nero nelle diverse fasi vegetative delle piante.
C. Scopel e R. Causin
Uso dell’SSCP per lo studio della variabilità molecolare di isolati di legno nero
raccolti in Veneto.
G. Durante, P. Casati, F. Quaglino, I.-M. Lee, PA. Bianco
Legno nero in Lombardia: individuazione di marcatori molecolari per la
diagnosi e la caratterizzazione dei fitoplasmi appartenenti al gruppo tassonomico
16SrXII-A.
B. Bagnoli, L. Ferretti, V. Trivellone, L. Nuccitelli, G. Pasquini
Accertamento della presenza di Scaphoideus titanus nel Lazio.
V. Forte, E. Angelini, E. Patriarca, G. Perini, M. Borgo
Monitoraggio di Auchenorrinchi potenziali vettori di fitoplasmi in vigneti del
nord-est Italia.
L. Landi, P. Riolo, S. Nardi, N. Isidoro
Infezione naturale da fitoplasmi in Hyalesthes obsoletus, Euscelis lineolatus,
Neoaliturus fenestratus e Psammotettix spp. in agroecosistemi vigneto della
regione Marche.
F. Pavan, S. Bressan, P. Mutton
Valutazione della convenienza economica a sostituire le viti con sintomi di
giallumi.
A. Zorloni, P. Casati, G. Durante, PA. Bianco, G. Belli
Prove di risanamento, tramite termoterapia, di talee di viti affette da giallumi:
risultati preliminari.
“I Giallumi della vite: un fattore limitante
le produzioni viticole”: quattro anni di
attività
M. Barba
CRA-PAV Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Via C.G. Bertero, 22
I-00156 Roma
Il Progetto Gia.Vi. “I giallumi della vite: un fattore limitante le produzioni
vitivinicole”, finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole, Alimentari e Forestali
con D.M. 652/7303/03 del 19/12/03, ha consentito una intensa e sinergica attività
di ricerca da parte di 13 gruppi scientifici italiani e stranieri che, nei quattro anni
di durata del progetto, hanno apportato ulteriori acquisizioni ed aggiornamenti alle
conoscenze dei fitoplasmi e dei vettori responsabili della malattia del legno nero (LN)
e della flavescenza dorata (FD) della vite.
Nelle fasi iniziali del Progetto sono stati definiti ed uniformati i protocolli
tecnici che le varie UU.OO., coinvolte in specifiche linee di ricerca, hanno affrontato.
Grazie a questo lavoro iniziale di armonizzazione è stato possibile ottenere, alla
conclusione dei lavori, dati uniformi e confrontabili fra di loro.
Le principali informazioni e innovazioni raggiunte dal progetto possono essere
così riassunte:
1. Diffusione e caratterizzazione dei fitoplasmi associati ai giallumi della vite.
Oltre 250 vigneti, localizzati nella maggior parte delle aree viticole italiane,
sono stati monitorati e oltre 2000 campioni sono stati analizzati molecolarmente
utilizzando i protocolli armonizzati. Questa attività ha consentito di accertare
sperimentalmente la presenza in tutte le Regioni italiane di fitoplasmi associati
ai giallumi della vite e di confermare l’assenza di FD nell’Italia meridionale e
nella maggior parte delle aree viticole dell’Italia centrale. Le numerose indagini
condotte hanno evidenziato l’espansione e recrudescenza del LN e consentito
di accertare la presenza della malattia anche in alcune zone viticole meridionali
(Calabria) non ancora indagate.
Nell’ambito dell’attività di monitoraggio è stata effettuata anche la caratterizzazione
molecolare dei fitoplasmi coinvolti per definirne la variabilità molecolare e la
distribuzione geografica degli isolati sul territorio.
Circa 800 campioni raccolti da viti infette da LN e 250 provenienti da piante
affette da FD, rappresentativi di tutte le regioni indagate, sono stati analizzati
molecolarmente.
195
La caratterizzazione molecolare degli isolati di LN, effettuata mediante
amplificazione del gene non ribosomico tuf, che codifica il fattore di allungamento
Tu (EF-Tu), ha indicato che l’isolato tuf tipo II è quello geograficamente più
diffuso, essendo presente in tutti gli areali monitorati ad eccezione del Lazio,
mentre il tuf tipo I sembra confinato alle regioni settentrionali e centrali (Pasquini
et al., 2008).
Il ceppo virulento FD-D risulta maggiormente diffuso rispetto al ceppo FD-C, la
cui presenza appare in espansione, in considerazione del suo rinvenimento anche
su campioni di vite sintomatiche raccolti in alcune province dell’Umbria e della
Toscana. Analizzando i geni Sec Y e rpS3 sono stati differenziati tipi diversi di
FD-C, indicando una elevata plasticità del genoma di questo fitoplasma in grado
di modificarsi nel giro di pochi anni (Bertaccini et al.,2008).
Interessanti, infine, anche i ritrovamenti sporadici di fitoplasmi appartenenti
a gruppi diversi, quali il giallume dell’astro (16SrI-B) e il giallume dell’olmo
(16SrV-A), rispettivamente in Calabria e Sardegna ed in Emilia-Romagna.
2. Studio dei cicli epidemiologici.
Al momento gli unici vettori accertati per la trasmissione dei fitoplasmi agenti
dei giallumi della vite rimangono Scaphoideus titanus Ball per FD e Hyalesthes
obsoletus Signoret per LN.
Infeudate alle piante spontanee dimoranti nell’agroecosistema vigneto, sono state
ritrovate numerose specie di auchenorrinchi, alcune delle quali già note come
vettori di fitoplasmi. Fitoplasmi del gruppo 16Sr-V sono stati identificati, oltre
che in S. titanus, in Anoplotettix fuscovenosus (Ferrari) e Dyctyophara europaea
(L). Numerose specie sono risultate positive al fitoplasma Stolbur, tra queste
particolare interesse suscitano alcuni cixiidi quali Reptalus quinquecostatus
(Dufour), R. cuspidatus (Fieber), R. panzeri (Löw) e Anoplotettix putoni Ribaut
(Alma et al., 2008).
Particolarmente indagato, inoltre, è stato il ruolo delle erbe infestanti che
potrebbero assumere una importanza strategica nel ciclo epidemiologico dei
fitoplasmi. L’analisi di piante spontanee, appartenenti ad oltre 60 specie per un
totale di quasi 1.000 campioni, ha indicato la presenza del fitoplasma Stolbur
in numerose specie perenni ed annuali e la presenza del fitoplasma FD in molti
campioni di Clematis vitalba e Alnus glutinosa (Borgo et al., 2008).
3. Diagnosi.
Sono stati sperimentati e verificati nuovi metodi diagnostici quali la real-time
PCR (rt-PCR) e la ligase detection reaction (LH-PCR). E’ stata confermata la
sensibilità, efficacia e relativa facilità di applicazione di entrambe le tecniche sia
per la diagnosi universale che gruppo-specifica di FD e LN. I risultati ottenuti
196
contribuiranno a sviluppare strategie di difesa basate sull’utilizzo di affidabili
procedure diagnostiche e consentiranno, inoltre, lo studio quantitativo del patogeno
nelle interazioni fitoplasma-vettore-pianta ospite (Angelini et al., 2008).
4. Controllo e prevenzione.
E’ stata confermata la necessità di una lotta chimica al vettore nella attuazione
di strategie di controllo di FD. In vigneti regolarmente trattati da anni contro
S. titanus è sufficiente un solo intervento insetticida all’anno, utilizzando un
fosforganico in coincidenza con il trattamento contro la seconda generazione
delle tignole della vite.
E’ risultato, inoltre, strategicamente importante ridurre le sorgenti di S. titanus
attraverso la eliminazione di residui di viti americane inselvatichite all’interno
di siepi e boschetti, la estirpazione di vigneti abbandonati e l’esecuzione
contemporanea ed uniforme dei trattamenti in ogni appezzamento vitato presente
in un determinato comprensorio viticolo (Pavan et al., 2008).
5. Studio del recovery.
Sono stati studiati alcuni aspetti legati al fenomeno della remissione dei sintomi
(recovery) in piante precedentemente infette e sintomatiche. Grazie a specifiche
prove sperimentali eseguite nel corso del Progetto è possibile affermare che: i)
piante in fase di recovery da due o più anni sono esenti da fitoplasmi (sia FD che
LN); ii) il fenomeno del recovery è stabile nel tempo; iii) il fenomeno è legato ad
alcuni fattori genetici intrinseci della varietà (le cvv Prosecco, Merlot, Barbera,
Bonarda piemontese, Cortese e Dolcetto sono soggette in altissima percentuale
alla regressione totale dei sintomi e mantengono un buono standard produttivo);
iv) materiale di propagazione proveniente da viti ‘recovered’ non dà origine a
piante infette; v) in viti con remissione di sintomi è stato riscontrato un accumulo
di H2O2 che potrebbe agire come segnale per l’induzione di processi di difesa nella
pianta. L’uso della tecnologia dei microarray ha, inoltre, consentito di evidenziare
una differente espressione genica in piante infette, sane e recovered, evidenziando
il possibile ruolo di geni legati a processi di difesa nel complesso meccanismo del
‘recovery’ (Carraro et al., 2008).
Il Progetto Gia.Vi., infine, non ha trascurato la divulgazione di alcuni risultati
intermedi raggiunti, organizzando riunioni ad hoc con i servizi fitosanitari regionali e
specifiche giornate di studio, nel corso delle quali sono state presentate le principali
acquisizioni raggiunte nel settore della caratterizzazione e distribuzione geografica dei
giallumi (Roma, 19 e 20 luglio 2006) e del ruolo epidemiologico dei vettori (Firenze,
9 novembre 2006).
197
A Roma, inoltre, presso il CRA-PAV, (9-13 ottobre 2006), è stato organizzato il
corso teorico-pratico “La diagnosi molecolare dei giallumi della vite: stato dell’arte”
al quale hanno partecipato 20 tecnici dei Servizi Fitosanitari Regionali e dei
Laboratori accreditati, e durante il quale sono state illustrate ed eseguite in laboratorio
le procedure di diagnosi necessarie ad identificare, differenziare e caratterizzare i
fitoplasmi associati a viti infette.
I ricercatori impegnati nel Progetto Gia.Vi. hanno partecipato in maniera
compatta a diversi incontri nazionali e internazionali, presentando poster e relazioni
orali inerenti all’attività scientifica svolta dalle singole unità o nel corso di azioni
congiunte.
L’impegno scientifico manifestato da tutte le UU.OO. nel corso delle attività del
Progetto Gia.Vi. è testimoniato dalle oltre 100 pubblicazioni elencate in appendice.
Parole chiave: Fitoplasmi, Vite, Progetto ricerca.
Grapevine yellows: a limiting factor of grapevine production (Gia.Vi. Project):
four year of activity.
The research Project named Gia.Vi. “Grapevine yellows: a limiting factor
for grapevine production”, financed by the Italian Ministry of Agriculture in 2004,
has permitted a strong and synergic collaboration among thirteen Italian and foreign
research groups which, in four years of activity, have improved knowledge on
phytoplasmas and vectors associated to Flavescence dorèe (FD) and Bois noir (BN)
grapevine diseases.
Technical protocols, specific for diagnosis, molecular characterization
of isolates and monitoring of vectors, have been discussed and harmonized at the
beginning of the project allowing, later on, the comparison of results obtained by
different research groups involved in the activity.
Here are listed the main findings reached in four years of activity.
1. Diffusion and characterization of phytoplasmas associated to grapevine yellows
More than 250 vineyards were monitored in most of the Italian areas where
grape is cultivated. About 2.000 samples were molecularly analyzed, following
harmonized protocols. FD and BN were identified by direct PCR with universal
primers P1/P7, followed by nested PCR with primers specific for ribosomal groups
16SrV and 16SrI/XII, and RFLP analyses with BfaI and MseI respectively. About
80% of the vineyards inspected from the different teams participating into the
Project resulted positive for the presence of yellows symptomatology, showing
a recrudescence of BN disease and its presence also in viticultural areas where it
198
has never been identified.
The molecular characterization of Stolbur phytoplasma, performed on the tuf
gene, indicated that the two Stolbur isolates tuf type I and tuf type II are present
in Italy even if with a different geographical distribution (Pasquini et al., 2008).
FD-C and FD-D are present in northern Italian regions and in some vineyards
of central Italy. FD-D seems to be more spread than FD-C, even if FD-C was
identified also in some areas of Umbria and Tuscany (Bertaccini et al., 2008).
Occasionally phytoplasmas belonging to 16SrI-B and 16SrV-A subgroups were
isolated from symptomatic grapevines.
2. Epidemiological cycle.
Insect samplings were conducted in many vineyards using yellow sticky traps,
D-vac and sweep net on the grapevine canopy and on the spontaneous vegetation
nearby, from June until October.
The role of Scaphoideus titanus Ball and Hyalesthes obsoletus Signoret in the
transmission of FD and BN respectively was confirmed, but also other species
were captured and resulted positive for the presence of phytoplasmas.
Phytoplasmas belonging to 16Sr-V group were identified in Anoplotettix
fuscovenosus (Ferrari) and Dyctyophara eursopaea (L).
Many other species of Auchenorrhynca were also found positive to Stolbur.
Among them, high infection rates were recorded for Reptalus quinquecostatus,
R. cuspidatus (Fieber), R. panzeri (Löw) e Anoplotettix putoni Ribaut (Alma et
al., 2008).
More than 1,000 plants belonging to 60 different species were collected and
molecularly analyzed for the presence of FD and BN phytoplasmas. Stolbur
was detected in many annual and polyannual plants, suggesting a direct role in
the epidemiology of BN. FD phytoplasma was identified in many samples of
Clematis vitalba and Alnus glutinosa (Borgo et al., 2008)
3. Diagnosis.
Two real-time PCR (rt-PCR) protocols and an alternative one based on ligase
detection reaction (LH-PCR) have been developed for the detection of grapevine
phytoplasmas. The methods resulted rapid, specific and reproducible and all
of them will contribute to the development of control strategies and to better
understand the relationship phytoplasma-plant-vector (Angelini et al., 2008).
4. Control strategies
The control of the vector is the main strategy to prevent the spreading of FD from
infected areas to healthy vineyards.
199
In vineyards regularly sprayed against S. titanus only one insecticide treatment
per year, using organophosphates in coincidence with the treatment against the
second generation of the grape berry moth, can be sufficient to maintain under
control the vector population.
Specific studies suggest that the elimination of abandoned vineyards and the
eradication of grapevines grown wild in hedgerows or woodland can reduce the
source of S. titanus adults for the adjoining treated vineyards against the vector
(Pavan et al., 2008).
5. The recovery phenomenon
Some aspects of remission of symptoms (recovery) in grapevines previously
symptomatically infected have been studied. The main findings reached during
the project indicate that: i) grapevines recovered at least from two years are
phytoplasma free (both FD and BN); ii) the recovered plants maintain their healthy
status for several years; iii) the recovery is related to some genetic factors specific
of the variety (cvv Prosecco, Merlot, Barbera, Bonarda piemontese, Cortese
and Dolcetto recovered in a high percentage maintaining a good productive and
qualitative standard); iv) propagative material derived from recovered plants do
not transmit by grafting phytoplasmas; v) in the leaf tissue of recovered plants
there is an accumulation of H2O2.
Microarray technology has allowed to evaluate the different gene expression in
infected, healthy and ‘recovered’ plants, suggesting the role of some genes in the
complex ‘recovery’ mechanism (Carraro et al., 2008).
In the frame of the Project many Meetings have been organized in order to
transfer the acquired results in diagnosis and characterization (Rome, July 19-20,
2006) and in the epidemiological role of the vectors (Florence, November 9, 2006).
A practical and teorical course was organized (Rome, October 9-13, 2006)
with the objective to teach the diagnostic protocols for the identification of grapevine
phytoplasmas.
The results obtained in the frame of the Project allowed to produce more than
100 scientific papers and numerous contributions in International and National
Meetings.
Key words: Phytoplasmas, Grapevine, Research project.
200
Lavori pubblicati nell’ambito del Progetto:
Albanese G. , G. Pasquini, R. Sciarroni, L. Ferretti, R. La Rosa, 2005. Individuazione
e caratterizzazione di fitoplasmi della vite in Calabria. Petria, 15, 109 -111.
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fitoplasmi in Calabria. Atti Convegno “Prospettive di innovazione per il
potenziamento del comparto viti-vinicolo calabrese”, Lamezia Terme, 13
dicembre 2007 (in stampa).
Albanese G., G. Pasquini, L. Ferretti, R. Sciarroni, R. La Rosa, M. Barba, 2006.
Identificazione molecolare di fitoplasmi in viti affette da giallumi in Calabria.
Informatore fitopatolotgico, 4, 39 - 43.
Alma A., F. Lessio, L. Picciau, F. Tota, V. Forte, M. Borgo, B. Bagnoli, F. Pinzauti,
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cicaline, fitoplasmi e piante ospiti nell’agroecosistema vigneto. Atti IV Incontro
Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi, Roma 28-30 maggio 2008.
Alma A., F. Lessio, L. Bertignono, F. Pavan, V. Forte, E. Angelini, M. Borgo, B.
Bagnoli, F. Pinzauti, V. Trivellone, V. D’Urso, A. Alicata, C. Rapisarda,
2005. Rilevamento di Auchenorrinchi vettori accertati e potenziali di fitoplasmi.
Petria, 15, 151-153.
Alma A., F. Lessio, F. Pavan, V. Forte, E. Angelini, M. Borgo, B. Bagnoli, F. Pinzauti,
V. Trivellone, 2005. I giallumi della vite: un fattore limitante le produzioni
vitivinicole. Rilevamento di auchenorrinchi vettori accertati e potenziali di
fitoplasmi. Petria,, 15, 151-153.
Angelini E., 2006. Nuove tecniche per la diagnosi dei fitoplasmi della vite. Atti
“Forum Scientifico Internazionale sui fitoplasmi della Vite”. Alessandria, 1516 Novembre 2006, (in stampa).
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la prevenzione ed il controllo dei giallumi della vite”. Susegana (Italy), 23
febbraio 2007. Invited speaker.
Angelini E., D. Bellotto, L. Filippin, C. Michielini, L. Leandrin, M. Borgo, 2006.
Andamenti epidemici dei giallumi della vite nel corso della stagione. Atti
Giornate fitopatologiche, vol. 2, 489-494.
Angelini E., G. Bianchi, C. Morassutti, L. Filippin, M. Borgo, 2005. Development
of new Real Time PCR methods for the identification of Flavescence dorèe
disease associated with grapevine yellows. Petria, 15, 97-98.
Angelini E., M. Borgo, 2005. Détection d’un phytoplasme associé à la Flavescence
dorée de la vigne dans clématite (Clematis vitalba L.). Revue des Oenologues,
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fitosanitario di rilevanza nazionale. Informatore fitopatolotgico, 4, 4-8.
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202
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2004-2008. Atti IV Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi, Roma
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.Atti IV Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi, Roma 28-30 maggio
2008.
210
GIALLUMI DELLA VITE IN PROVINCIA DI TREVISO:
CARATTERIZZAZIONE DEI FITOPLASMI ASSOCIATI
E. Angelini, L. Filippin, D. Bellotto, L. Stringher, M. Borgo
CRA-VIT Centro di Ricerca per la Viticoltura,
Viale XXVIII aprile 26, I-31015 Conegliano (TV)
I giallumi della vite, nella forma di flavescenza dorata (FD) e di Legno nero
(LN), hanno causato gravissimi danni alla viticoltura della provincia di Treviso a partire
dagli anni ‘80. Fin dai primi anni ’90 è stato seguito dettagliatamente l’andamento
delle epidemie in tutta la provincia tramite rilievi visivi di campo e saggi molecolari
di laboratorio. In questo lavoro vengono sintetizzati i risultati ottenuti in oltre 10 anni
di monitoraggio del territorio trevigiano, con lo scopo di verificare l’andamento di FD
e di BN e di caratterizzare i ceppi di fitoplasmi coinvolti.
I rilievi visivi sono stati condotti in vigneti dei comuni della provincia di
Treviso, da maggio a novembre. Sono stati monitorati vigneti di tutte le età, sia al
primo o secondo anno di impianto sia quelli già in produzione. Per ogni vigneto ove
erano presenti viti con sintomi ascrivibili a giallumi sono stati raccolti campioni di
foglie sintomatiche per l’analisi molecolare. Il DNA è poi stato estratto ed amplificato
in PCR con primer universali e specifici per i fitoplasmi e successivamente i frammenti
amplificati sono stati sottoposti a saggi RFLP, per la precisa caratterizzazione del
ceppo di fitoplasma (Angelini et al., 2001; Langer e Maixner, 2004).
I risultati mostrano la presenza di FD in quasi tutte le aree viticole della
provincia, tranne nell’estrema punta orientale. Mentre nel decennio 1990-2000 era
prevalente il ceppo FD-C, negli ultimi anni il ceppo FD-D ha conquistato quasi tutte
le zone in origine colpite da FD-C. Per quanto riguarda LN, si può notare come la
sua presenza sia diffusa in tutto il territorio, anche se non è mai stato identificato sui
campioni sintomatici provenienti dai vigneti dei comuni più occidentali, a confine con
la provincia di Vicenza. La distribuzione di LN ci mostra che ogni ceppo di fitoplasma
è legato ad un territorio diverso: c’è infatti una forte presenza del ceppo VK-I nella
maggior parte dei comuni della provincia, tranne nella zona del Livenza, dove è
stato identificato solo il ceppo VK-II, che però sembra essere più aggressivo. È da
sottolineare che quest’ultima è l’unica area del trevigiano dove le epidemie di FD non
sono ancora giunte.
La percentuale relativa di campioni infetti da FD o LN varia nel corso degli
anni. In particolare, c’è stata una maggiore incidenza di FD nel 1995-96 ed una
incidenza più elevata di LN nel 1998-99. Dal 2000 in poi la situazione appare più
211
stabile, anche se il numero di viti con FD raccolte dai vigneti in indagine è sempre
leggermente maggiore di quelle con LN.
Parole chiave: Epidemie, Flavescenza dorata, Legno nero, Vigneto.
Grapevine yellows in Treviso district: characterization of phytoplasmas
Grapevine yellows, i.e. Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) have been
caused very serious damages to the viticulture in the district of Treviso since ‘80
years. Since 1990 the trend of the epidemics has been minutely monitored in the whole
district, by means of field visual observations and laboratory molecular analyses. The
results obtained in more than 10 years of surveying are synthesized in this work, in
order to verify the trends of FD and BN infections in the area and to characterize the
phytoplasma isolates involved in the epidemics.
Visual observations have been carried out in vineyards of the Treviso district
from May to November. Vineyards of all ages were surveyed, spanning from new
plantations to those in production. Samples of symptomatic leaves for the molecular
analyses were collected from all vineyards where grapevines with yellows symptoms
occurred. Total DNA was extracted and amplified in PCR using phytoplasma universal
and specific primer pairs. Amplicons were subsequently digested using RFLP in order
to characterize the phytoplasma isolate (Angelini et al., 2001; Langer e Maixner,
2004)..
Results showed the presence of FD in almost the viticultural areas of the
district, saved the extreme Eastern part. FD-C has been the prevalent isolate in the
period 1990-2000, while in the last year FD-D isolate has gained almost all the areas
originally infected with FD-C. As far as BN is concerning, it occurs in all the territory,
though it has never been identified in the symptomatic samples coming from the far
Western counties, near Vicenza district. BN distribution evidenced that each isolate
is typical of a different area: indeed VK-I is spread in almost all the district, saved
the Livenza area, where however solely VK-II was identified, which seems more
aggressive. It is worth to note that this last area is the only one in the district where FD
epidemic has never been identified until now.
The percentage occurrence of samples infected by FD or BN phytoplasmas
varies during the course of the years. In particular, a higher incidence of FD was
registered in 1995-96 and a higher incidence of BN was recorded in 1998-99. Since
2000, the situation appears more stable, though the number of samples infected by FD
is always slightly higher than those infected by BN.
Key words: Bois noir, Epidemic, Flavescence dorée, Vineyard.
212
Angelini E., D. Clair, M. Borgo, A. Bertaccini, E. Boudon-Padieu, 2001. Flavescence
dorée in France and Italy - Occurrence of closely related phytoplasma isolates
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213
LEGNO NERO IN ABRUZZO E INDAGINI SUL RECOVERY
IN VITI INFETTE
D. D’Ascenzo1, S. Murolo2, R. Di Giovanni1, G. Romanazzi2
ARSSA Servizio Fitosanitario Regionale, Regione Abruzzo, Via Nazionale 38,
I- 61100 Villanova (PE)
2
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali, Università
Politecnica delle Marche, Via Brecce Bianche, I-60131 (AN)
1
Il territorio della regione Abruzzo, particolarmente vocato alla coltivazione
della vite, è anche sede di numerosi campi di piante madri per la produzione di materiale
di propagazione certificato. A tutela dell’intero comparto, il Servizio Fitosanitario ha
intensificato il monitoraggio per la ricerca e l’identificazione dei principali giallumi
della vite, soprattutto a seguito del recente rinvenimento e la rilevata diffusione di
Scaphoideus titanus Ball in diverse aree del territorio regionale (Romanazzi et al.,
2007; Mori et al., 2008), pur in assenza dell’agente di Flavescenza dorata (FD) del
quale è vettore. Il Legno nero (LN), invece, è risultato ampiamente presente nei
vigneti della Regione, come evidenziato in indagini pluriennali (D’Ascenzo et al.,
2003, 2005). Per meglio comprendere l’epidemiologia di questa malattia e mettere in
atto pratiche che potrebbero portare alla limitazione delle infezioni è utile identificare
i ceppi di LN coinvolti (Langer e Maixner, 2004).
Nel corso 2006 e 2007 i tecnici del Servizio Fitosanitario della Regione
Abruzzo hanno effettuato diversi sopralluoghi in aziende viticole, raccogliendo
campioni da viti con ingiallimenti o arrossamenti ascrivibili a fitoplasmi. Da ciascuno
degli 80 campioni è stata effettuata l’estrazione del DNA utilizzando il DNeasy
Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). La diagnosi molecolare ha previsto una
prima amplificazione con i primer universali P1/P7 (Schneider et al., 1995), ed una
seconda con le coppie di primer gruppo specifiche R16(I)F1/R1, R16(III)F2/R1 e
R16(V)F1/R1 (Lee et al., 1994). I campioni risultati positivi all’amplificazione con
la coppia di primer R16(I)F1/R1, sono stati ulteriormente caratterizzati amplificando
un frammento del gene tuf successivamente digerito con l’enzima HpaII (Langer e
Maixner, 2004) a 37°C per 4 h.
Dalle analisi di laboratorio svolte sulle 80 viti con sintomi di giallumi è emersa
la presenza di fitoplasmi del gruppo dello stolbur, agenti del LN della vite, in 47
campioni. L’amplificazione condotta sul gene tuf e la successiva digestione enzimatica
con l’enzima HpaII hanno permesso di verificare infezioni di ceppi VK-I in 27
214
campioni, la maggior parte dei quali provenienti dalla provincia di L’Aquila, mentre
20 campioni sono risultati infetti dal sottogruppo VK-II, provenienti prevalentemente
dalla provincia di Teramo. Il LN è risultato presente ed ampiamente diffuso in tutte le
aree viticole della regione Abruzzo, sia su varietà a bacca bianca sia su quelle a bacca
rossa. In nessuno dei campioni analizzati è stata ottenuta amplificazione con i primer
R16(V)F1/R1, specifici per il gruppo ribosomale 16SrV, al quale appartiene la FD.
Il fenomeno della remissione dei sintomi, o recovery (Osler et al., 1993; www.
phytoplasmarecovery.net) ha interessato circa il 10% delle piante sintomatiche di
Montepulciano in due vigneti ubicati nei comuni di Prezza (AQ) e Introdacqua (AQ),
mentre è risultato trascurabile in un impianto di Chardonnay presente nel comune di
Atri (TE). Ulteriori indagini si rendono necessarie per tentare di limitare il numero
di piante che annualmente si infettano e per promuovere la remissione dei sintomi
nelle piante infette, mentre appare fondamentale un attento monitoraggio volto
all’individuazione di possibili nuovi focolai di FD, considerando la ormai rilevante
diffusione del vettore nella Regione.
Parole chiave: Vitis vinifera, Gene tuf, PCR-RFLP, VK-I, VK-II.
Molecular characterization of Bois noir isolates in the Abruzzi region, centraleastern Italy, and investigations on recovery in the infected vines
Abruzzi is a region particularly vocated to grapevine cultivation, and it has a
number of mother stock plant fields for the growing of virus-free propagative material.
To protect these fields, the Phytosanitary Service of Abruzzi region has intensified
its surveys to search and identify the main grapevine yellows. Also, Scaphoideus
titanus Ball was recently found and has spread through different areas of the region
(Romanazzi et al., 2007; Mori et al., 2008), although the Flavescence dorée (FD)
agent he transmits has not been not found. Bois noir (BN) is widespread in vineyards
of Abruzzi, as shown in pluriannual investigations (D’Ascenzo et al., 2003, 2005). To
better understand the epidemiology of the disease in this region and to try to apply
agronomical practices that could reduce the incidence of infected plants, it is important
to identify the BN strains involved (Langer and Maixner, 2004).
In 2006 and 2007, surveys were carried out in several vineyards in Abruzzi, and
samples were harvested from plants showing leaf reddening or yellowing that can be
ascribed to phytoplasma. For each of 80 samples, total DNA was extracted using the
DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Molecular analyses were carried
out with a first round of amplification with the P1/P7 universal primers (Schneider et
al., 1995), followed by a second round with group-specific primer pairs R16(I)F1/R1,
R16(III)F2/R1 and R16(V)F1/R1 (Lee et al., 1994). The samples that provided an
215
amplicon with R16(I)F1/R1 were used for a further characterization: amplification of
the tuf gene, and digestion it with HpaII at 37°C for 4 h (Langer and Maixner, 2004).
These molecular analyses showed infection of stolbur (16SrXII-A subgroup),
BN agent, in 47 out of 80 samples. The molecular characterization of these isolates
with analysis of the tuf gene allowed the detection of VK-I infections in 27 samples,
most of which were from the L’Aquila Province; 20 samples were infected by VK-II,
which came mainly from Teramo Province. BN was present in both white berry and
on red berry cultivars. None of the samples were amplified with the R16(V)F1/R1
primer pair, specific for 16SrV group, to which FD belongs.
The remission of disease symptoms, which is better known as recovery
(Osler et al., 1993; www.phytoplasmarecovery.net), was recorded in about 10%
of symptomatic plants of cv Montepulciano grown in two vineyards located in the
municipalities of Prezza (AQ) and Introdacqua (AQ); recovery was negligible in a
vineyard of cv Chardonnnay located in Atri (TE). Further investigations are necessary
to try to reduce the number of newly infected plants and to promote symptom remission
in infected plants, while a further accurate survey to find eventual new FD locations is
needed, also considering the spread of S. titanus in the region.
Key words: Vitis vinifera, Tuf gene, PCR-RFLP, VK-I, VK-II.
D’Ascenzo D., S. Botti, S. Paltrinieri, R. Di Giovanni, D. Di Silvestro, A. Bertaccini,
2003. Identification of phytoplasmas associated with grapevine yellows in
Abruzzo Region (Italy).- Exended abstracts 14th Meeting of the international
Council for the Study of Virus and Virus –like Diseases of the Grapevine
(ICVG). Locorotondo (BA), 89-90.
D’Ascenzo D., S. Murolo, R. Di Giovanni, MB. Branzanti, G. Romanazzi, 2005.
Monitoraggio dei fitoplasmi della vite in Abruzzo. Petria, 15, 173-175.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of Grapevine yellows
Lee I.M., DE. Gundersen, R.W. Hammond, RE. Davis, 1994. Use of mycoplasmalike
organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for nested-PCR
assays to detect mixed-MLO infections in a single host plant. Phytopathology,
84, 559-566.
Mori N., D. D’Ascenzo, R. Di Giovanni, A. Di Cioccio, D. Di Loreto, 2008.
Pluriennale indagine sui vettori dei giallumi della vite in Abruzzo. Atti Giornate
fitopatologiche, vol. 2, 589-592.
216
Osler R., L. Carraro, N. Loi, E. Refatti, 1993. Symptom expression and disease
occurrence of a yellows disease of grapevine in Northeastern Italy. Plant
Disease, 77, 496-498.
Romanazzi G., S. Murolo, D. D’Ascenzo, R. Di Giovanni, 2007. Nuove acquisizioni
sulla diffusione dei giallumi della vite in Abruzzo. Italus Hortus, 14, 253256.
Schneider B., E. Seemüller, CD. Smart, BC Kirkpatrick, 1995. Phylogenetic
classification of plant pathogenic mycoplasmalike organisms or phytoplasmas.
In: S. Razin, J.G Tully eds., Molecular and diagnostic procedures in
mycoplasmology, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1, 369-380.
Siti internet consultati
www.phytoplasmarecovery.net
Lavoro svolto nell’ambito dei Progetti “Lotta alla Flavescenza dorata della Vite” promosso dalla Regione
Abruzzo e del PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da Legno nero e ricerca di mezzi
innovativi per incrementare il fenomeno”.
217
IL LEGNO NERO DELLA VITE NEL CENTRO-SUD ITALIA
G. Pasquini1, L. Ferretti1, B. Bagnoli2, A. Gentili1, G. Albanese3, C. Rapisarda4, V.
Cavalieri4, M. Barba 1
CRA-PAV Centro di ricerca per la Patologia Vegetale,
Via C.G. Bertero, 22, I-00156 (RM)
2
CRA-ABP Centro di ricerca per l’Agrobiologia e la Pedologia,
Via Lanciola, 12/a, I-50125 (FI)
3
Dipartimento di Gestione dei Sistemi Agrari e Forestali,
Università degli Studi Mediterranea,
Piazza San Francesco da Sales, 4, I-89061 (RC)
4
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie,
Università degli Studi di Catania,
Via S. Sofia, 100, I-95123 (CT)
1
Il legno nero (LN), fra i giallumi della vite, è la fitoplasmosi oggi sicuramente
più diffusa in Italia essendo stata riscontrata pressoché su tutto il territorio nazionale.
Il fitoplasma associato alla malattia appartiene al sottogruppo ribosomico 16SrXIIA (Stolbur). Per ampliare le conoscenze sulla diffusione e l’incidenza del LN in
areali centro-meridionali non sufficientemente indagati, a partire dal 2004 sono stati
effettuati periodici monitoraggi di campo nei principali comprensori viticoli delle
regioni Lazio, Toscana, Molise, Campania e Calabria.
LN è stato rilevato in tutte le aree monitorate, ma a differenti livelli di gravità
e frequenza. Toscana e Lazio sono apparse le regioni più interessate dalla presenza
della fitoplasmosi che, in alcune zone e soprattutto in impianti costituiti da vitigni
internazionali o autoctoni, dimostratisi particolarmente sensibili all’infezione, ha
causato perdite di notevole rilevanza economica. In Molise, Campania e Calabria la
malattia, pur presente in tutti i comprensori indagati, ha mostrato per il momento, a
livello di singolo vigneto, una frequenza percentuale relativamente bassa.
Per tutti i vigneti con piante sintomatiche, campionati nelle diverse aree prese
in esame, si è proceduto all’identificazione degli isolati di Stolbur denominati tuf tipo
I e tuf tipo II, tramite caratterizzazione molecolare sul gene tuf (Langer e Maixner,
2004). L’identificazione degli isolati è stata effettuata sia per valutare la loro diffusione
che per contribuire a definire i cicli epidemiologici della malattia nelle zone indagate.
I risultati delle analisi hanno evidenziato una relazione fra tipo di isolato e relativa
distribuzione geografica. Il tuf tipo II è stato riscontrato in tutte le regioni monitorate
ad eccezione del Lazio, dove invece è sempre stata accertata la sola presenza del
218
tuf tipo I (Pasquini et al., 2007a). Quest’ultimo, non essendo mai stato rinvenuto
né in Campania né in Calabria, sembrerebbe ‘geograficamente confinato’ all’Italia
centro-settentrionale (Pasquini et al., 2007b). Diversa è tuttavia la situazione presente
nei campi di collezione di germoplasma viticolo, dove sono sempre stati rinvenuti
entrambi gli isolati, indipendentemente dalla localizzazione geografica degli impianti
(Pasquini et al., 2006).
Per disporre di ulteriori elementi conoscitivi utili alla definizione del ciclo
epidemiologico della malattia nelle regioni monitorate, le indagini hanno riguardato
anche l’auchenorrincofauna e la flora spontanea presente nei vigneti. Le analisi
molecolari condotte su esemplari di cicaline e campioni di piante spontanee raccolti
nei vigneti presi in esame hanno avvalorato l’ipotesi, ormai largamente condivisa,
che varie specie di auchenorrinchi, oltre al vettore accertato Hyalesthes obsoletus
Signoret, e varie specie di piante spontanee possano essere coinvolte nella trasmissione
e diffusione della malattia. Tra gli insetti risultati positivi alla presenza di Stolbur, le
specie per le quali è stata riscontrata una precisa corrispondenza con l’isolato rinvenuto
su viti sintomatiche dello stesso vigneto sono: Reptalus quinquecostatus (Dufour) in
Toscana (Trivellone et al., 2007); R. panzeri (Low) in Calabria; Hyalesthes luteipes
Fieber, Thamnotettix zelleri (Kirschbaum) e Anoplotettix putoni Ribaut nel Lazio
(Pasquini et al. 2007b), dove gli adulti di quest’ultima specie hanno mostrato notevole
ampelofilia. Fra le piante spontanee in grado di rappresentare serbatoi di Stolbur, oltre
a Urtica dioica L. e Convolvulus arvensis L., noti ospiti rispettivamente del tuf tipo I
e tipo II (Maixner, 2006), potrebbero rientrare anche: Cirsium arvense (L.) Scopoli,
risultato nelle regioni meridionali frequentemente infetto dall’isolato tuf tipo II, ed
alcune specie annuali, quali Amaranthus spp. e Solanum nigrum L. (Pasquini et al.,
2007b). Nel Lazio, in particolare, la positività di queste piante annuali all’isolato tuf
tipo I costituisce un dato di notevole interesse dal momento che l’ortica spesso è del
tutto assente nei vigneti.
Parole chiave: Stolbur, Tuf tipo I, Tuf tipo II, Epidemiologia.
Bois noir disease in central and southern Italy
Bois noir (BN) is one of the main yellows grapevine syndrome. It is wide
spread in all Italian grapevine growing areas and it is induced by Stolbur phytoplasma,
belonging to 16SrXII-A subgroup. To verify the distribution of the disease in areas
in which modest knowledge was available, field surveys were performed in Tuscany,
Latium, Campania, Molise and Calabria Italian regions. BN was retrieved in all
monitored areas with different intensity and economic incidence. Tuscany and Latium
resulted the most damaged regions, as in some viticultural areas the disease is severely
219
spread with high percentage of infection and crop losses, especially in vineyards of
international or local varieties very sensitive to phytoplasmas. In Molise, Campania
and Calabria BN resulted less severe, with a low percentage of infected plants inside
the single vineyard, nevertheless the disease was retrieved in all monitored area.
In all investigated areas the molecular characterization of Stolbur phytoplasma
identified in positive samples was performed on the tuf gene to reveal the distribution
of the two Stolbur isolates tuf type I and tuf type II (Langer and Maixner, 2004). The
two isolates showed a different geographical distribution: tuf type II resulted spread
in all investigated areas, except Latium region, in which only tuf type I was always
identified (Pasquini et al., 2007a). Tuf type I appeared confined in the northern and
central Italian regions, as it was never identified in Campania and Calabria (Pasquini
et al., 2007b). Monitored germplasm collection fields resulted always infected by
both Stolbur types, independently by their geographical localization (Pasquini et al.,
2006).
In order to improve the knowledge on the epidemiological cycle of the
disease, the characterization of Stolbur isolates was performed also in planthoppers
and weeds collected in the monitored vineyards. Several insects and weeds resulted
infected by the same Stolbur type identified in symptomatic grapevines sampled
from the same field, suggesting a role of these species in the disease epidemiology.
Reptalus quinquecostatus (Dufour) in Tuscany (Trivellone et al., 2007), R. panzeri
(Low) in Calabria, Hyalesthes luteipes Fieber, Thamnotettix zelleri (Kirschbaum)
and Anoplotettix putoni Ribaut in Latium (Pasquini et al. 2007b) could be possible
Stolbur vectors together with Hyalesthes obsoletus Signoret. Urtica dioica L. and
Convolvulus arvensis L. are certainly involved in Stolbur cycle (Maixner, 2006), but
also Cirsium arvense L. Scopoli in southern regions and some annual species as
Solanum nigrum L. and Amaranthus spp. could be involved as source of inoculum,
especially in Latium region where nettle is very rare in the vineyard agro-ecosystem.
Key words: Stolbur, Tuf type I, Tuf type II, Epidemiology.
220
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterization of Grapevine yellows
associated phytoplasmas of the stolbur group based on RFLP-analysis of nonribosomal DNA. Vitis, 43, 191-200.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows - Current developments and unsolved questions.
In: Proceedings of the 15th Meeting of the International Council for the Study
of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICGV). Stellenbosch, South
Africa, 3-7 April 2006, 86-93.
Geographical distribution of stolbur isolates in vineyards of Central and
Southern Italy. In: Proceedings of the 15th Meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICGV).
Stellenbosch, South Africa, 3-7 April 2006, 103-104.
Pasquini G., L. Ferretti, M. Barba, 2007a. Diffusione del Legno nero della vite
nel Lazio e caratterizzazione molecolare dell’agente eziologico. Informatore
Fitopatologico, 57 (4), 42-47.
Pasquini G., L. Ferretti, A. Gentili, B. Bagnoli, V. Cavalieri, M. Barba, 2007b.
Molecular chracterization of stolbur isolates collected in grapevines, weeds
and insects in central and southern Italy. Bulletin of Insectology, 60, 355-356.
(Auchenorryncha Cixiidae) as a possible vector of stobur-phytoplasma in a
Lavoro svolto nell’ambito del P.F. Gia.Vi. “I giallumi della vite: un fattore limitante le produzioni
vitivinicole” finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali.
221
CARATTERIZZAZIONE DI FITOPLASMI IDENTIFICATI IN
PIANTE SPONTANEE RACCOLTE IN AREE VITATE
L. Filippin, M. Borgo, G. Lucchetta, C. Michielini, E. Angelini.
CRA-VIT Centro di Ricerca per la Viticoltura
Nel corso di monitoraggi condotti dal 2005 al 2007 nelle zone viticole
dell’Italia Settentrionale e Centrale, sono stati raccolti campioni di piante spontanee o
coltivate, erbacee ed arboree, presenti nelle vicinanze dei vigneti, al fine di verificare
se fossero infette da fitoplasmi. L’attenzione è stata rivolta soprattutto a quelle specie
che presentavano anomalie vegetative con sintomi di giallumi, rossori, scopazzi o
crescita stentata.
Sono stati raccolti circa 350 campioni, classificati in 40 specie. Il DNA totale è
stato estratto ed amplificato con primer specifici per i fitoplasmi. Per la caratterizzazione
degli isolati presenti sono stati utilizzati saggi di RFLP e sequenziamento nucleotidico
su frammenti ribosomici e non ribosomici (Angelini et al., 2001; Langer e Maixner,
2004).
In 14 della 40 specie raccolte sono stati rinvenuti fitoplasmi appartenenti a
diversi gruppi filogenetici. In alcuni casi si tratta di conferme di malattie già riportate
in letteratura, come infezioni di Candidatus Phytoplasma mali su Malus domestica e
la presenza di isolati appartenenti al sottogruppo 16SrV-E su Rubus sp.. Campioni di
Calystegia sepium, Convolvulus arvensis, Parietaria officinalis, Sambucus nigra ed
Urtica dioica sono risultati infetti dal fitoplasma dello stolbur (16SrXII-A), classificati
come appartenenti ai ceppi VK-I e VK-II; fra queste specie, S. nigra e P. officinalis
non erano mai stati segnalati prima come infetti da fitoplasmosi. Isolati del gruppo
16SrIX sono stati identificati in Lactuca serriola, Taraxacum officinale ed in un’altra
specie di composite. Ca. P. fragrariae, fitoplasma finora ritrovato solo in Lituania su
fragola ed in Gran Bretagna su piante ornamentali di Cordyline sp., è stato individuato
su campioni di Cornus sanguinea e Sambucus nigra. Campioni di Ailanthus altissima,
Alnus glutinosa e Clematis vitalba sono risultati infetti da fitoplasmi associati alla
Flavescenza dorata della vite (FD), sottogruppo 16SrV-C; se, da un lato, è noto che la
presenza di fitoplasmi FD sensu stricto e/o isolati correlati sia frequente su C. vitalba
ed A. glutinosa, dall’altro il ritrovamento di fitoplasmi FD su A. altissima, specie non
autoctona ed invasiva, è una novità assoluta.
Parole chiave: Fitoplasmi, Piante spontanee, Vigneto.
222
Characterization of phytoplasmas in spontaneous plants in vineyard
Samples of herbaceous and woody plants, spontaneous or cultivated, present
nearby vineyards, were collected during a survey conducted in 2005-2007 in
viticultural areas of Northern and Central Italy, in order to verify if they were infected
with phytoplasmas. Special care was taken of plants displaying yellowing, reddening,
witches broom and anomalous appearance.
Approximately 350 samples, belonging to 40 species, were collected. Total
DNA was extracted and amplified using universal and specific primer pairs for
phytoplasmas. RFLP and nucleotide sequencing were carried out on ribosomal and
non-ribosomal DNA fragments (Angelini et al., 2001; Langer e Maixner, 2004).
Phytoplasmas belonging to different phylogenetic groups were detected in 14
out of 40 collected species. Sometimes our results confirmed previous findings, some
others our finding was a new report. Candidatus Phytoplasma mali was identify in
Malus domestica; phytoplasmas belonging to the 16SrV-E subgroup were found in
Rubus sp.. Samples of Calystegia sepium, Convolvulus arvensis, Parietaria officinalis,
Sambucus nigra and Urtica dioica were infected with stolbur phytoplasmas (16SrXIIA), types VK-I and VK-II. Among the last species, S. nigra and P. officinalis were
never previously found to host phytoplasmas. Phytoplasma belonging to 16SrIX
group were detected in Lactuca serriola, Taraxacum officinale and in another
species of Compositae. Ca. P. fragrariae, isolated previously from strawberry plants
in Lithuania and from cordyline in the UK, was found in Cornus sanguinea and S.
nigra. Samples from Ailanthus altissima, Alnus glutinosa and Clematis vitalba were
infected with phytoplasmas associated with grapevine Flavescence dorée (FD),
belonging to subgroup 16SrV-C. It was already reported that FD sensu stricto and
FD-type phytoplasmas often occur in C. vitalba and A. glutinosa. However, this is the
first identification of a FD phytoplasma in A. altissima, alien and invasive species in
Europe.
Key words: Phytoplasmas, Spontaneous plant, Vineyard.
223
Angelini E., D. Clair, M. Borgo, A. Bertaccini, E. Boudon-Padieu, 2001. Flavescence
dorée in France and Italy–Occurrence of closely related phytoplasma isolates
and their near relationships to Palatinate grapevine yellows and an alder
phytoplasma. Vitis, 40, 79-86.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterization of grapevine yellows
224
REPTALUS QUINQUECOSTATUS (DUFOUR): DATI
BIO-ETOLOGICI E RAPPORTI CON IL FITOPLASMA
DELLO STOLBUR IN AREE VITICOLE TOSCANE
B. Bagnoli, F. Pinzauti, V. Trivellone
Via Lanciola, 12/A, I-50125 (FI)
Nel triennio 2005-2007, nell’ottica di caratterizzare l’auchenorrincofauna
dell’agro-ecosistema vigneto in Toscana e approfondire le conoscenze sui vettori di
fitoplasmi agenti di giallumi su vite, sono state condotte indagini in un centinaio di
aziende vitivinicole, distribuite in oltre 20 comuni afferenti in prevalenza alle province
di Firenze e Siena. I rilievi, nella maggior parte dei casi, sono stati effettuati da luglio
a settembre utilizzando principalmente trappole cromotattiche gialle.
In un vigneto della Fattoria Colle Verde (Matraia, Lucca) affetto da giallumi,
dell’estensione di circa 6.000 m2 e costituito da 14 filari di “Syrah” e 9 di “Sangiovese”,
i campionamenti sono stati invece condotti da maggio a ottobre e, mediante l’impiego
di trappole cromotattiche e l’uso del retino entomologico, hanno riguardato con
periodicità quindicinale tre ‘habitat’: vite, olmo e vegetazione erbacea dell’interfila e
di bordo. Per questo vigneto, la mappatura e l’analisi molecolare delle viti sintomatiche
svolte nel 2005 e nel 2006 hanno permesso di appurare, fra le fitoplasmosi, unicamente
la presenza di legno nero (LN, gruppo Stolbur, sottogruppo ribosomico 16SrXII-A)
rappresentato da entrambi gli isolati tuf tipo I e tuf tipo II (Langer e Maixner, 2004).
Nel complesso, fatta esclusione dei cicadellidi tiflocibini, sono state intercettate
19 specie di Fulgoromorpha e 56 di Cicadomorpha. Fra queste, a parte Scaphoideus
titanus Ball (Cicadellidae) e Hyalesthes obsoletus Signoret (Cixiidae), particolare
interesse ha suscitato il cixiide Reptalus quinquecostatus (Dufour). In effetti, nel
biennio 2005-2006, per esemplari campionati a Colle Verde in tutti e tre gli ‘habitat’
considerati, la specie ha fatto registrare un tasso di infezione al fitoplasma dello
Stolbur (rappresentato più frequentemente dall’isolato tuf tipo I ma anche dal tipo II)
dell’ordine del 50% (Trivellone et al., 2005 e 2007).
La specie è risultata piuttosto diffusa nei vigneti toscani, dove da adulto è stata
rinvenuta dalla terza decade di giugno alla prima di agosto con densità di popolazione
variabile negli anni e in funzione della composizione floristica dell’agro-ecosistema.
Non di rado è risultato il cixiide catturato in misura più abbondante. Ciò si è verificato
costantemente nel triennio di indagini svolte a di Colle Verde dove l’adulto della
specie, oltre a presentare una buona mobilità fra gli ‘habitat’, ha manifestato tendenze
225
ampelofile e dimostrato la capacità di nutrirsi su nervature fogliari e tralci non
lignificati della vite.
Nel 2006, prove condotte in laboratorio utilizzando il metodo della membrana
artificiale (Tanne et al., 2001), su adulti prelevati in campo e posti singolarmente in
provette adattate a camere di allevamento con mezzo di nutrizione artificiale, hanno
permesso di accertare che maschi e femmine di R. quinquecostatus, naturalmente
infetti da Stolbur, sono in grado di inoculare il fitoplasma nel mezzo artificiale con
un’efficienza che nel nostro caso, a fronte di una sopravvivenza di solito inferiore alle
24 ore, è stata del 40% (Pinzauti et al., 2008).
Una serie di caratteristiche bio-ecologiche rilevate negli adulti di R.
quinquecostatus e in particolare: la mobilità nell’agro-ecosistema, l’attività trofica
a carico di tralci erbacei e nervature fogliari di vite, l’elevato tasso di infezione da
16SrXII-A, nonché la provata abilità a inoculare il fitoplasma in un mezzo nutritivo
artificiale, permettono di avvalorare l’ipotesi che questo cixiide, dimostratosi specie
competente a trasmettere il fitoplasma dello Stolbur, possa svolgere un ruolo di vettore
nella diffusione del LN della vite. Prove di trasmissione su vite sono in corso per la
verifica di tale ipotesi.
Parole chiave: Vite, Giallumi, Legno nero, Cixiidae, Vettori.
Reptalus quinquecostatus (Dufour): bio-ethological observations and its
relationship with Stolbur phytoplasma in vineyards of Tuscany
In the years 2005-2007 studies were carried out in many Tuscan wine-growing
estates, mainly of Florence and Siena provinces, in order to define the planthoppers
and leafhoppers associated to the vineyard agro-ecosystem and to increase knowledge
on the grapevine phytoplasma vectors. Auchenorrhyncha samplings were mostly
conducted with yellow sticky traps from July to September.
At ‘Colle Verde’ farm (Matraia, Lucca), in a “Sangiovese” and “Sirah” vineyard
of about 0.6 hectares affected by yellows, the faunistic observations were made every
fifteen days, from May to October, using chromotropic traps and sweep net on three
different ‘habitats’: grapevine, elm, border and interrow weeds. The mapping and
molecular analysis of the symptomatic plants of this vineyard ascertained only the
presence of bois noir (BN, group Stolbur, ribosomal subgroup 16SrXII-A), represented
by the isolates tuf type I and tuf type II (Langer and Maixner, 2004).
All together, aside from Cicadellidae Tyflocibinae, 19 species of Fulgoromorpha
and 56 of Cicadomorpha were sampled. Among these, besides Scaphoideus
titanus Ball (Cicadellidae) and Hyalesthes obsoletus Signoret (Cixiidae), Reptalus
quinquecostatus (Dufour) (Cixiidae) assumed a considerable interest. In fact, R.
226
quinquecostatus adults, collected in 2005-2006 from the three ‘habitats’ considered
in ‘Colle Verde’ farm, showed an infection rate by Stolbur phytoplasma (represented
mainly by the isolate tuf type I but also by tuf type II) of about 50% (Trivellone et al.,
2005 and 2007).
R. quinquecostatus resulted rather widespread in Tuscan vineyards where its
adult population, usually detected from the third decade of June to the first of August,
appeared of different consistence in the years and in relation to the agro-ecosystem
vegetation. At ‘ColleVerde’ and in many other vineyards, R. quinquecostatus was
the more abundant cixiid. Adults showed a fairly good mobility among the different
‘habitats’ and a clear tendency to visit the vine. On this plant they were seen to insert
their stylets into the leaf midribs and green shoots.
In 2006, laboratory tests were carried out using a membrane feeding method
(Tanne et al., 2001) on wild adults placed individually in microcentrifuge tubes
adapted as insect chambers with a compartment for sucking. The trials demonstrated
that males and females of R. quinquecostatus, naturally infected by Stolbur, are able to
inoculate the phytoplasma in the artificial medium with an efficiency of 40% despite
the brief survival (less than 24 hours in most cases) (Pinzauti et al., 2008).
Some bio-ecological factors related to adults (mobility in the agro-ecosystem,
capability to feed on leaf midribs and green shoots, high infection rate by Stolbur
phytoplasma, ability to inoculate this phytoplasma to artificial feeding medium) allow
to define R. quinquecostatus a competent species to transmit the Stolbur phytoplasma
and strengthen the hypothesis that the cixiid is a vector of BN phytoplasma to
grapevine. Transmission tests on vine to verify this hypothesis are in progress.
Key words: Grapevine yellows, Bois noir, Cixiidae, Vectors.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of grapevine yellows
Pinzauti F., V. Trivellone, B. Bagnoli, 2008. Ability of Reptalus quinquecostatus
(Hemiptera: Cixiidae) to inoculate Stolbur phytoplasma to artificial feeding
medium. Annals of Applied Biology (in press).
Tanne E., E. Boudon-Padieu, D. Clair, M. Davidovich, S. Melamed, M. Klein, 2001.
Detection of phytoplasma by polymerase chain reaction of insect feeding
medium and its use in determining vectoring ability. Phytopathology, 91, 741746.
227
(Cixiidae): potenziale vettore di stolbur in un ambiente viticolo toscano. In:
Atti XXI Congresso Nazionale Italiano di Entomologia. Campobasso, 11-16
giugno 2007, 174.
228
FENOLOGIA DI HYALESTHES OBSOLETUS SIGNORET
SU CONVOLVOLO ED ORTICA
N. Mori1, F. Pavan2, M. Bacchiavini3, N. Reggiani4, F. Bonomi5, A. Bertaccini5
1
Agrea Centro Studi, Via Garibaldi, 5, I-37057 S. Giovanni L (VR)
Via delle Scienze 208, I-33100 (UD)
3
Consorzio Fitosanitario Provinciale di Reggio Emilia,
Via Gualerzi, 32 I-42100 (RE)
4
Consorzio Fitosanitario Provincia di Modena, Via Andreoli 13.
I-41100 (MO)
5
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale Fanin 42,
I-40127 (BO)
2
Il legno nero (LN) è un giallume associato al fitoplasma 16SrXII-A trasmesso
a vite da Hyalesthes obsoletus Signoret (Homoptera, Cixiidae) usando come sorgente
di inoculo Convolvulus arvensis L. (Maixner, 1994; Sforza et al., 1998) e Urtica
dioica L. (Alma et al., 2002; Bressan et al. 2007). In Germania all’interno del gruppo
ribosomico 16SrXII-A (stolbur) sono stati distinti 3 ceppi sulla base delle sequenze
del gene Tuf (Langer e Maixner 2004). Il tipo tuf I risulta associato ad ortica, mentre
quello tuf II a convolvolo (Langer and Maixner, 2004; Pasquini et al., 2007; Riolo
et al., 2007; Mori et al., 2008). In accordo con questi dati H. obsoletus catturato
su convolvolo è risultato infetto dal tipo tuf II, mentre il tipo tuf I è stato ritrovato
prevalentemente in individui raccolti su ortica (Maixner, 2007; Riolo et al., 2007).
Al fine di approfondire le conoscenze sui rapporti fra il vettore e queste due
piante ospiti, nel 2007 le popolazioni degli adulti di H. obsoletus sono state monitorate
in 18 vigneti affetti da LN, siti nelle province di Modena e di Reggio Emilia, zone di
coltivazione dei Lambruschi emiliani, e sono state condotte prove di sopravvivenza
degli adulti in condizioni di semicampo. Gli individui raccolti su ortica e convolvolo
sono stati analizzati mediante saggi di nested PCR/RFLP per individuare il tipo tuf
presente.
In analogia con quanto osservato in Germania (Maixner, 2007), la fenologia
degli adulti di H. obsoletus è risultata più precoce su convolvolo (da fine maggio a
metà luglio) che su ortica (da metà giugno a inizio agosto). L’entità delle catture è
risultata circa 10 volte più elevata su ortica che su convolvolo. In ambiente confinato
gli adulti raccolti su convolvolo hanno mostrato una minore sopravvivenza su ortica
e viceversa. Gli adulti infetti raccolti su ortica sono risultati per circa due terzi infetti
229
dal tipo tuf I, mentre quelli provenienti da convolvolo sono risultati tutti positivi al
tipo tuf II.
La diversa fenologia degli adulti di H. obsoletus su ortica e convolvolo, la
migliore sopravvivenza degli stessi sulla pianta ospite sulla quale si sono sviluppate
le forme giovanili e la diversa associazione con i due ceppi di LN suggeriscono che la
specie H. obsoletus presenta popolazioni che si sono fortemente differenziate sia dal
punto di vista biologico che epidemiologico in rapporto alle due piante ospiti.
Parole chiave: Stolbur, Hyalesthes obsoletus, Urtica dioica, Convolvulus arvensis.
Hyalesthes obsoletus Signoret phenology in bindweed and nettle
‘Bois noir’ (BN) is a grapevine yellows disease associated with 16SrXII-A
(stolbur) phytoplasmas transmitted to grapevine by Hyalesthes obsoletus Signoret
(Homoptera, Cixiidae) from bindweed (Convolvulus arvensis L.) (Maixner, 1994;
Sforza et al., 1998) and nettle (Urtica dioica L.) (Alma et al., 2002; Bressan et al.,
2007). Stolbur phytoplasmas are distinguishable in different strains using the tuf
gene sequence; tuf type I is associated with nettle, while tuf type II is associated with
bindweed (Langer and Maixner, 2004; Pasquini et al., 2007; Riolo et al., 2007; Mori et
al., 2008). In agreement with these data H. obsoletus captured on C. arvensis resulted
infected by tuf type II, while tuf type I was mainly identified in insects collected on
nettle (Maixner, 2007; Riolo et al., 2007).
To verify the relationship between the vector and its two host plants, during 2007
the adult populations of H. obsoletus were monitored in 18 BN-infected vineyards,
located in the Lambrusco grape-growing areas (north Italy), and adult surviving trials
under semi-field conditions were also carried out. The specimens collected on nettle
and bindweed were tested by nested PCR/RFLP analyses to identify the tuf type.
The phenology of H. obsoletus adults was earlier on bindweed (from late May
to mid July) than on nettle (from mid June to early August), in according with the data
observed in Germany (Maixner, 2007). In general population density on nettle was 10
times higher on nettle than on bindweed.
By forced feeding on nettle and bindweed of the two H. obsoletus adult
populations, it was clear that the cixiid survives well only on the same plant species on
which it was captured. Molecular tests showed that LN infected H. obsoletus captured
on nettle were positive for the 67% to tuf type I, while those captured on bindweed
only contained tuf type II.
The different phenology of H. obsoletus on nettle and bindweed, the better
survival of adults on the same plant species where the nymphs were developed and the
230
different association with the two stolbur phytoplasma types suggest that H. obsoletus
has populations that differ in biological and epidemiological aspects in relation with
the two plants host species.
Key words: Stolbur, Hyalesthes obsoletus, Urtica dioica, Convolvulus arvensis.
Alma A., G. Soldi,, R.Tedeschi, C. Marzachì, 2002. Ruolo di Hyalesthes obsoletus
Signoret (Homoptera, Cixiidae) nella trasmissione del Legno nero della vite in
Italia. Petria, 12, 411-412.
Bressan A., R. Turata, S. Spiazzi, E. Boudon-Padieu, V. Girolami, 2007. Vector
activity of Hyalesthes obsoletus living on nettle and transmitting a stolbur
phytoplasma to grapevines: a case study. Annals of Applied Biology, 150, 331339.
Langer M., M. Maixner, 2004 Molecular characterisation of grapevine yellows
associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP-analysis of non
ribosomal DNA. Vitis, 43, 191-199.
Maixner M., 1994. Transmission of German grapevine yellows (Vergilbungskrankheit)
by the planthopper Hyalesthes obsoletus (Auchenorrhyncha: Cixiidae). Vitis,
33, 103-104.
Maixner M., 2007. Biology of Hyalesthes obsoletus and approaches to control this
soilborne vector of Bois noire disease. IOBC/WPRS Bulletin, 30 (7), 3-9.
Mori N., F. Pavan, R. Bondavalli, N. Reggiani, S. Paltrinieri, A. Bertaccini, 2008.
Factors affecting the spread of “Bois noir” disease in north Italy vineyards.
Vitis, 47, 65-72.
Molecular characterization of stolbur isolates collected in grapevines, weeds
Riolo P., L. Landi, S. Nardi, N. Isidoro, 2007. Relationship among Hyalesthes
obsoletus, its herbaceous host plants and “bois noir” phytoplasma strains in
vineyard ecosystem in the Marche region (central-eastern Italy). Bulletin of
Insectology, 60, 353-354.
Sforza R., D. Clair, X. Daire, J. Larrue, E. Boudon-Padieu, 1998. The role of
Hyalesthes obsoletus (Hemiptera: Cixiidae) in the occurrence of bois noir of
grapevines in France. Journal of. Phytopathology, 146, 549-556.
231
Rilascio e cattura di Scaphoideus titanus Ball
per lo studio della dispersione
F. Lessio, P. Chiusano, A. Alma
Università degli Studi di Torino, Via L. da Vinci 44, I-10095 Grugliasco (TO)
L’attività di volo degli insetti vettori è un fattore essenziale nella diffusione
delle malattie causate da fitoplasmi (Weintraub e Beanland, 2006). In Italia, una delle
specie più preoccupanti è Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae), vettore
del fitoplasma (gruppo EY, 16Sr-V, sottogruppi C e D) agente della Flavescenza dorata
della vite. Un interessante metodo di studio della capacità di dispersione degli insetti è
rappresentato dal rilascio di soggetti marcati con differenti tecniche e loro successiva
cattura a diverse distanze dal punto di rilascio (Hagler e Jackson, 2001).
La capacità di dispersione di S. titanus è stata studiata nel 2005-2006 in un
vigneto sperimentale della Facoltà di Agraria, a Grugliasco (TO), costituito da 18 filari
di vitigni diversi, prevalentemente allevati a spalliera (Guyot). Gli adulti impiegati
sono stati ottenuti da allevamenti, condotti in laboratorio, di uova presenti nei tralci di
potatura raccolti in vigneti ad elevata densità di popolazione di S. titanus. Lavorando
sotto cappa aspirante, gli adulti (sfarfallati da 48-72 ore) sono stati posti in provette
(8×60mm) assieme a pochi mm3 di polvere fluorescente arancione DayGlo®; quindi
la provetta è stata agitata dolcemente finché tutti gli adulti risultavano colorati. Nel
vigneto sono state preventivamente posizionate 160 trappole adesive gialle (0,65
trappole/m2) e sono stati rilasciati 1230 adulti suddivisi in 11 lanci (850 nel 2005 e 380
nel 2006). Il rilascio è sempre avvenuto al centro del vigneto. Le trappole sono state
sostituite ogni 15 giorni. Gli adulti catturati sono stati esaminati con un visore a raggi
UV per rilevare la polvere fluorescente. La frequenza cumulata osservata delle catture
a diversa distanza dal punto di rilascio è stata confrontata con due modelli teorici di
dispersione passiva in funzione della direzione e velocità del vento. L’adattabilità dei
modelli è stata calcolata con il test di Kolmogorov-Smirnov.
Complessivamente, sono stati catturati 101 adulti su 1230 marcati e rilasciati
(8,5%); tale percentuale è superiore a quella ottenuta in un esperimento analogo
effettuato su Macrosteles quadrilineatus Forbes, che peraltro è una specie polivoltina
più facile da allevare e quindi da rilasciare in gran quantità (Zhou et al., 2003). La
maggior parte degli adulti di S. titanus è stata catturata a pochi metri dal punto di
rilascio. La distribuzione osservata parallela al vento è risultata significativamente
diversa da quella attesa secondo la distribuzione di Gumbel, indicando una probabile
232
dispersione attiva e non mediata dal vento, sia nel 2005 (Gmax=0,71; P<0,05), sia nel
2006 (Gmax=0,79; P<0,05). Anche la dispersione perpendicolare alla direzione del
vento non si è adattata al modello teorico della distribuzione normale, né nel 2005
(Gmax=0,63; P<0,05), né nel 2006 (Gmax=2,24; P<0,05). Tali risultati preliminari
suggeriscono che S. titanus è una specie relativamente poco propensa alla dispersione
a lungo raggio, in accordo con quanto evidenziato in prove precedenti (Lessio e Alma
2004a, b) e che la sua attività di volo non sembra essere influenzata dal vento.
Parole chiave: Cicalina, Vettore, Attività di volo, Polveri fluorescenti.
Mark-release-recapture of Scaphoideus titanus Ball
for the study of dispersal
The flight activity of insect vectors is an important factor affecting the spread
of the diseases caused by phytoplasmas (Weintraub and Beanland, 2006). In Italy, one
of the most threatening species Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae),
vector of the phytoplasma (group EY, 16Sr-V, subgroups C and D) agent of the
grapevine Flavescence dorée. An interesting study method of insect dispersal
capabilities consists in the mark-release-recapture technique (Hagler and Jackson,
2001).
The dispersal capability of S. titanus was studied during 2005-2006 in an
experimental vineyard of the Faculty of Agriculture, in Grugliasco (TO). The vineyard
was made of 18 rows of different vine varieties, mainly pruned with a Guyot method.
The adults used were obtained from the laboratory rearing of eggs laid in pruned canes
collected in vineyards with a high population density of di S. titanus. Under a drawing
hood, adults (emerged 48-72 hrs before) were placed into test tubes (8×60mm) with
few mm3 of orange fluorescent dust DayGlo®; then, the tube was gently shoken until
all leafhoppers were coloured. 160 yellow sticky trap were placed in the vineyard
(0.65 trap per square metre), and 1230 adults were released, at 11 different times (850
in 2005 and 380 in 2006). The release was always made in the centre of the vineyard.
Traps were changed every 15 days. Captured adults were observed with an UV
transilluminator to check the presence of fluorescent dust. The cumulated frequency
of captured adults at different distances from the release point was matched with
two theoretical passive dispersal models depending on the wind speed and direction.
Model adaptability was calculated with a Kolmogorov-Smirnov test.
On the whole, 101 out of 1230 marked adults were recaptured (8.5%); this
rate is higher than that obtained in a similar experiment made with Macrosteles
233
quadrilineatus Forbes, which is also a multivoltine species, easier to rear, and more
suitable to be released in high numbers (Zhou et al., 2003). Many more adults of
S. titanus were recaptured a few metre far from the release point. The observed
distribution parallel to the wind direction was significantly different from that expected
from the Gumbel distribution, that indiates an active and not wind-borne dispersal,
both in 2005 (Gmax=0.71; P<0.05), and in 2006 (Gmax=0.79; P<0.05). The dispersal
perpendicular to wind direction did not match the normal distribution neither in 2005
(Gmax=0.63; P<0.05), nor in 2006 (Gmax=2.24; P<0.05). These preliminary results
suggest that S. titanus is not so likely a long-range disperse, as theorized in previous
experiments (Lessio e Alma 2004a, b), and that its flight activity does not seem to be
influenced by the wind.
Key words: Leafhopper, Vector, Flight activity, Fluorescent dust.
Hagler, JR., CG. Jackson, 2001. Methods for marking insects: Current techniques
and future prospects. Annual Review of Entomology, 46, 511-543.
Lessio, F., A. Alma, 2004a. Dispersal patterns and chromatic response of Scaphoideus
titanus Ball (Homoptera Cicadellidae), vector of the phytoplasma agent of
grapevine flavescence doree. Agricultural and Forest Entomology, 6, 121127.
Lessio, F., A. Alma, 2004b. Seasonal and daily movement of Scaphoideus titanus Ball
(Homoptera : Cicadellidae). Environmental Entomology, 33, 1689-1694.
Weintraub, PG., L. Beanland, 2006. Insect vectors of phytoplasmas. Annual Review
of Entomology, 51, 91-111.
Zhou, LY., CW. Hoy, SA. Miller, LR. Nault, 2003. Marking methods and field
experiments to estimate aster leafhopper (Macrosteles quadrilineatus) dispersal
rates. Environmental Entomology, 32, 1177-1186.
Ricerca finanziata da “Regione Piemonte, Assessorato Servizi di Sviluppo Agricolo
234
Flavescenza dorata e Scaphoideus titanus:
distribuzione e strategie di
lotta in Produzione integrata (PI)
e biologica in Svizzera
M. Jermini1, M. Gusberti1, L. Schaub2, Ch. Linder2, S. Schärer2, P. Kehrli2,
L. Colombi3, S. Bellion4, S. Emery5
Stazione de ricerca Agroscope Changins-Wädenswil ACW,
Centro di Cadenazzo, CH-6594 Contone, Svizzera
2
Station de recherche Agroscope Changins-Wädenswil ACW, CP 1012,
CH-1260 Nyon 1, Suisse
3
Servizio fitosanitario cantonale, Viale Fransscini 17,
CH-6501 Bellinzona, Svizzera
4
Syngenta, Suisse
5
Service de l’agriculture, Office d’agro-écologie, CP437,
CH-1951 Châteauneuf, Suisse
1
La flavescenza dorata è il più importante giallume della vite diffuso in Europa
dal Portogallo alla Serbia. Il suo più importante vettore è la cicalina Scaphoideus
titanus, la quale fu osservata per la prima volta in Ticino nel 1967 (cantone svizzero
a sud delle Alpi).
Successive campagne di monitoraggio evidenziarono la sua continua diffusione
nei vigneti ticinesi dovuta anche ad attività umane.
Al nord delle Alpi, S. titanus fu osservato per la prima volta nel 1996 in un’area
attorno a Ginevra. La sua attuale distribuzione è limitata a due distinte e separate
regioni viticole lungo il lago Lemano, ciò che lascia presagire una sua diffusione
tramite attività umane.
La flavescenza dorata fu osservata per la prima volta nel 2004 in tre località
del sud del Ticino. Nel 2005, viti colpite furono scoperte in tre comuni circostanti
e in una zona viticola distante più di 30 km dai vigneti infetti. Nel 2006, dei nuovi
focolai di flavescenza dorata furono scoperti in una terza zona viticola distante 20 km
dai focolai del 2005. Chardonnay è il principale vitigno colpito seguito da Pinot nero,
Merlot, Cabernet sauvignon, Gamaret, Garanoir, Gewürztraminer e Seibel, Isabella e
Marechal Foch e Cabernet Jura.
In Svizzera, la presenza della flavescenza dorata si limita attualmente al solo
Ticino.
Per la lotta contro S. titanus abbiamo sviluppato dal 1991 una strategia a basso/
limitato impatto ecologico in accordo con le direttive PI svizzere. Questa strategia di
235
lotta fu lanciata nel 2005 dopo la scoperta dei primi focolai di flavescenza dorata e si
basa su:
1. Una prima applicazione di buprofezina (alla concentrazione dello 0.075%) al
massimo delle apparizioni delle forme giovanili del primo stadio di sviluppo
(L1) che corrisponde all’apparizione delle prime ninfe del terzo stadio larvale (L3).
2. Una seconda applicazione di buprofezina 15 giorni dopo.
3. Un’eventuale terza applicazione di chlorpyriphos-ethyl o chlorpyriphos-methyl
è prevista contro le ninfe del quarto stadio larvale (L4) o adulti solo dopo una
valutazione dell’efficacia dei primi due interventi.
Dopo tre anni di lotta obbligatoria, le campagne di monitoraggio confermano
l’efficacia della strategia proposta, per la quale la data della prima applicazione riveste
un ruolo fondamentale.
La lotta obbligatoria contro S. titanus pone importanti problemi nei vigneti a
conduzione biologica. Prove di pieno campo, condotte durante il periodo 2006-2007,
hanno mostrato che Parexan N (piretrina + olio di sesamo) è il solo prodotto biologico
ad avere un’efficacia superiore al 90% contro le forme immature di S. titanus, mentre
non si è osservato nessun effetto verso gli adulti. L’applicazione ripetuta di Parexan
N si è avverata tossica per i tiflodromi della specie Amblyseius andersoni. Malgrado
questa tossicità, una strategia d’applicazione basata su tre applicazioni di Parexan
N a un intervallo di dieci gironi dall’apparizione dei primi individui del terzo stadio
larvale costituisce la sola alternativa efficace nei vigneti a conduzione biologica.
Parole chiave: Scaphoideus titanus, Flavescenza dorata, Piretro, Buprofezina,
Tiflodromi, Lotta obbligatoria.
Flavescence dorée and Scaphoideus titanus: distribution and control strategy in
Integrated Production (IP) and organic vineyards in Switzerland
Flavescence dorée is the most important grapevine yellow disease in Europe
and afflicts vineyards from Portugal to Serbia. It’s most important vector is the
leafhopper Scaphoideus titanus, which was first observed in the Ticino, a Swiss region
south of the Alps, in 1967. Subsequent monitoring programs revealed that the vector
has been continuously spreading. Today it is present in all wine-growing areas of
Ticino. North of the Alps, S. titanus has been observed for the first time in 1996 in the
area around Geneva. Currently, its distribution is restricted to two separate regions
along the Lake of Geneva. This scattered distribution pattern North of the Alps may
suggest human-induced dispersal.
Flavescence dorée itself has been observed for the first time in 2004. Infestations
have been recorded at three locations of southern Ticino. In 2005, the disease has
236
also been discovered in three surrounding municipalities as well as in a previously
uninfested wine-growing area more than 30 km away. In 2006 flavescence dorée has
been discovered in a third wine-growing area 20 km away. The main variety infected
is Chardonnay followed by Pinot noir and Merlot. Also concerned are Cabernet
sauvignon, Gamaret, Garanoir, Gewürztraminer and the hybrid grapevines as Seibel,
Isabella, Marechal Foch and Cabernet Jura. At present, flavescence dorée is restricted
to the Ticino.
For the control or S. titanus, we are developing since 1991 a control scheme
with a minimal ecological impact, which is in accordance with Swiss IP guidelines.
The developed control strategy has been launched in 2005 after the discovery of the
first flavescence dorée infection. The control strategy comprises:
1. A first buprofezin application (0.075 % concentration) at the peak of the first
larval stadium (L1), corresponding to the first appearance of nymphs of the third
larval stadium (L3).
2. A second buprofezin application 15 days later.
3. A potential third insecticide treatment of chlorpyriphos-ethyl or chlorpyriphosmethyl against the nymphs of the fourth larval stadium (L4) or against the adults
after the evalutation of the efficacy othe two buprofezin aplications.
After three years of mandatory insecticide control the monitoring programmes
confirmed the efficacy of the strategy proposed. Most important is the date of the
first application, because buprofezin is an insect growth regulator, which inhibits the
synthesis of chitin
The organic vineyards will not escape flavescence dorée. In our field studies
conducted between 2006 and 2007 had shown that Parexan N (pyrethrin + sesame oil)
was the only organic product with an efficacy higher than 90% against the immature
stages of S. titanus. However, the product had no effect on adult leafhoppers. Repeated
applications of Parexan N proved to be toxic against the predatory mite species
Amblyseius andersoni. Despite this toxicity, the only efficient and recommended
control strategy in organic vineyards is the application of Parexan N. It should be
applied three times at an interval of ten days after the first appearance of individuals
of the 3rd nymphal stage.
Key words: Scaphoideus titanus, Flavescence dorée, Pyrethrin , Buprofezin, Predatory
mite, Mandatory control.
237
Attività di fenitrothion e thiamethoxam nella
prevenzione della trasmissione di
Flavescenza Dorata
P. Saracco1, D. Pacifico2, C. Marzachì2, I. Gribaudo2, A. Alma1, D. Bosco1*
Di.Va.P.R.A., Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di Torino, Via L. da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
2
Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Strada delle Cacce, 73, I-10135 (TO)
1
La Flavescenza dorata (FD) della vite è una fitoplasmosi a diffusione epidemica
assai rapida. Il controllo di FD si basa sull’integrazione di diverse tecniche, quali
l’uso di materiale propagativo sano, l’eliminazione di piante infette in campo e la
lotta all’insetto vettore, il cicadellide Scaphoideus titanus Ball. Tra le metodologie
di lotta al vettore il trattamento insetticida, con molecole di sintesi o di derivazione
naturale, è l’unica tecnica di importanza pratica finora utilizzata. Trattamenti
insetticidi in vigneto contro S. titanus sono obbligatori per legge negli areali dove
sia il fitoplasma sia il vettore sono presenti. Le cicaline sono suscettibili a molti
principi attivi (p.a.) insetticidi, ma l’attività di questi ultimi può essere insoddisfacente
perché la trasmissione del fitoplasma può avvenire con tempi di nutrizione brevi e
gli insetticidi possono non agire con sufficiente rapidità. Per le fitoplasmosi gli studi
svolti sull’attività degli insetticidi evidenziano soltanto l’effetto di mortalità sul
vettore; solo recentemente è stata valutata l’attività di protezione dalla trasmissione
di organofosforati e neonicotinoidi per un ceppo di aster yellows (Saracco et al.,
2008). Lo scopo del presente lavoro è l’analisi dell’attività di un organofosforato,
fenitrothion, e di un neonicotinoide, thiamethoxam, sulla trasmissione di FD a vite
in condizioni sperimentali controllate. I due insetticidi sono registrati per l’uso in
vigneto contro S. titanus.
Neanidi della cicalina sono state ottenute da tralci di vite con uova in serra,
mantenute su viti sane e poi trasferite, allo stadio di IV-V età, su fave infette con
FD per un periodo di acquisizione di una settimana. Dopo un periodo di latenza di
un mese le cicaline erano trasferite, in gruppi di 3, su viti test micropropagate (cv
Barbera) sottoposte a trattamento fogliare con fenitrothion, thiamethoxam (alle dosi
consigliate) o acqua come controllo. Le inoculazioni con cicaline infettive erano
condotte 1, 4, 7, 10 e 15 giorni dopo il trattamento, al fine di verificare la persistenza di
attività. Dopo l’inoculazione le piante sono state conservate in screen-house protette
da rete escludi-insetti per due anni successivi a quelli dell’inoculazione e sottoposte a
diagnosi per il rilevamento di FD mediante RT-PCR (Margaria et al., 2007). Gli insetti
238
recuperati dopo l’inoculazione a vite sono stati sottoposti ad estrazione del DNA totale
e a PCR per stimare la percentuale di S. titanus che aveva acquisito FD.
I risultati hanno mostrato che, complessivamente, 5 viti su 75 trattate con
fenitrothion e 2 su 80 trattate con thiamethoxam sono risultate infette. Circa un terzo
delle viti di controllo trattate con acqua sono state infettate. Più della metà delle cicaline
impiegate nella sperimentazione e saggiate in PCR erano positive a FD. Entrambi i
p.a. hanno significativamente ridotto la trasmissione di FD, anche se non hanno fornito
una protezione totale. Thiamethoxam in particolare ha fornito il miglior livello di
protezione. In condizioni di campo, la riduzione della trasmissione può essere anche
più marcata perché gli insetti che si nutrono su viti non trattate possono spostarsi e
infettare più piante. Nelle nostre condizioni sperimentali le cicaline, incluse quelle
isolate su piante non trattate, hanno avuto accesso ad una sola vite. In conclusione i
risultati indicano che p.a. differenti possono essere efficaci nella lotta a S. titanus e
nella prevenzione della trasmissione di FD, a condizione che dosi, modi e tempi di
applicazione siano corretti. In condizioni di forte pressione di infezione l’insetticida
sistemico thiamethoxam è probabilmente da preferire.
Activity of Fenitrothion and Thiamethoxam in
preventing transmission of Flavescence dorèe
Flavescence dorée (FD) is a phytoplasma-associated disease of grapevine with
a fast epidemic spread. The control of FD relies on different techniques, use of healthy
propagation material, removal of infected plants and control of the vector insect, the
leafhopper Scaphoideus titanus Ball. Among the different vector control strategies,
insecticide application, with synthetic or natural compounds, is the only applied
technique. Insecticide treatments against the vector are compulsory in those areas
where both FD and its vector are present. Leafhoppers are susceptible to many active
ingredients (a.i.), but the activity of insecticides can be unsatisfactory when insecticides
are not fast enough to kill the insects before they transmit. For phytoplasma diseases,
the studies on the activity of insecticides provide data on vector mortality but not on
protection of plants from infection. Only recently, the activity of some insecticides in
the prevention of transmission of an aster yellows strain has been evaluated (Saracco
et al., 2008). The aim of this work was to study the activity of an organophosphate,
fenitrothion, and of a neonicotinoid, thiamethoxam, in preventing transmission of FD
to grape under controlled experimental conditions. Both insecticides are registered for
use in vineyard against S. titanus.
Leafhopper nymphs were obtained from grape branches with eggs inside a
greenhouse, maintained on healthy grapes and transferred, as IV-V instars, on FD-
239
infected broadbean for an acquisition period of one week. After a latency of one
month, leafhoppers were caged, in groups of three, on micro-propagated grapevines
(cv Barbera). Test vines were foliar treated either with fenitrothion, thiamethoxam (at
the suggested dosages) or water as a control. Inoculations with infectious leafhoppers
were carried out at 1, 4, 7, 10 and 15 days after treatment. After the inoculation,
test plants were stored in a screen-house protected by insect-proof net for two years
and analised by RT-PCR (Margaria et al., 2007) for the detection of FD. After the
inoculation, surviving insects were collected, total DNA was extracted and FD-specific
detection was carried out by PCR in order to estimate the proportion of leafhoppers
that acquired FD.
Results showed that 5 grapes out of 75 treated with fenitrothion and 2 out of 80
treated with thiamethoxam were FD-infected, while one third of control vines (watertreated) were infected. More than half of the leafhoppers used in the experiments
were FD-positive. Both a.i. significantly reduced FD transmission, even though
total protection was not achieved. Thiamethoxam provided the best protection level.
In conclusion our results indicate that different a.i. can be effective in controlling
S. titanus and preventing FD spread, provided that they are correctly used. Under
conditions of heavy infection pressure, the systemic insecticide thiamethoxam should
probably be preferred.
Margaria P., C. Rosa, C. Marzachì, M. Turina, S. Palmano, 2007. Detection of
Flavescence dorée phytoplasma in grapevine by reverse-transcription-PCR.
Plant Disease, 91, 1496-1501.
Saracco P., C. Marzachì, D. Bosco, 2008. Activity of some insecticides in preventing
transmission of chrysanthemum yellows phytoplasma (‘Candidatus
Phytoplasma asteris’) by the leafhopper Macrosteles quadripunctulatus
Kirschbaum. Crop Protection, 27(1), 130-136.
240
Interventi per la prevenzione e l’eliminazione
dei fitoplasmi dal materiale di propagazione
viticolo
F. Mannini, I. Gribaudo
Istituto Virologia Vegetale – CNR, Unità di Grugliasco
La propagazione di materiale infetto può contribuire ad aggravare la diffusione
di due gravi fitoplasmosi della vite, la flavescenza dorata (FD) e il Legno nero (BN),
poiché a causa del periodo di latenza della malattia non sempre i tradizionali interventi
di prevenzione messi in atto nei vigneti di piante madri risultano sufficienti. Si è
quindi valutata l’efficacia di alcune tecniche innovative volte a prevenire o curare
l’infezione.
Copertura con rete a prova di insetto dei vigneti di piante madri di materiale di
moltiplicazione.
Questo accorgimento è particolarmente raccomandabile per vigneti di piante
madri atti a produrre i materiali ‘di base’, primo anello della filiera produttiva vivaistica.
Una esperienza in tal senso, la prima a livello nazionale, è in atto da qualche anno con
successo presso il Nucleo di premoltiplicazione del Piemonte, dove le viti madri per
‘base’ sono allevate isolate da possibili vettori grazie alla copertura con rete antiinsetto durante il periodo vegetativo e alla pacciamatura del sottofilare.
Termoterapia in acqua del materiale di moltiplicazione
L’attività sperimentale condotta in Piemonte dal 2004 ad oggi utilizzando
un’attrezzatura innovativa per il bagno termoterapico, appositamente progettata
e costruita, ha fugato il timore che il trattamento possa penalizzare la vitalità del
materiale. Il bagno a 50 °C x 45’ applicato a marze e talee di portinnesto è risultato
sostanzialmente innocuo nei confronti della ripresa vegetativa degli innesti-talea posti
in vivaio e della conseguente resa in barbatelle al momento dell’estirpo. Una soglia di
danno può evidenziarsi utilizzando il trattamento a 52 °C×45’.
La termoterapia in acqua è stata applicata nel 2007 anche ad alcune migliaia di
barbatelle innestate provenienti da un barbatellaio in cui era stata rilevata la presenza
di FD e BN l’estate precedente. Dopo il trattamento le piantine sono state rimesse
in vivaio, con una protezione insetticida atta ad evitare reinfezioni da vettori. I
risultati hanno indicano che la malattia può manifestarsi anche a due anni di distanza
dall’innesto e che il trattamento ha sortito un benefico effetto terapeutico (0,09 % di
241
piante infette nella tesi 50 °C × 45’ e 0 % nella tesi 52 °C × 45’ rispetto all’1% del
testimone non trattato).
Tecniche di coltura in vitro
Ai fini dell’eradicazione dei fitoplasmi da piante infette, si è studiata la coltura
in vitro a partire da viti colpite da giallumi. Nelle prove qui riportate nessuna vite,
ottenuta per micropropagazione a partire da piante madri coltivate in pieno campo
affette da FD, è risultata successivamente infetta, mentre circa la metà delle linee da
piante madri affette da LN dopo alcuni mesi risultavano positive ai saggi. Inoltre,
poiché in letteratura è stata segnalata l’efficacia delle tetracicline contro i fitoplasmi, si
sono effettuate esperienze preliminari per definire la concentrazione di ossitetraciclina
tollerabile da viti coltivate in vitro.
Key words: Vite, Fitoplasmi, Termoterapia, Propagazione, Micropropagazione.
Strategies to prevent or to eliminate phytoplasmas from grapevine
propagation material
Propagation of infected material may contribute to the diffusion of Flavescence
doreé (FD) and Bois noir (BN), two serious grapevine diseases, for the traditional
means of prevention applied to mother vine blocks may result insufficient due to
disease latency. This study was focused on some new strategies to fight phytoplasmas
at nursery level.
Field coverage of mother plant vineyards with insect-proof nets.
The technique is particularly recommended in mother vine blocks for the
production of ‘basic’ propagation material. The technique was successfully experienced
by the Pre-multiplication Centre of Piedmont and Liguria, where mother vine blocks
are safely grown isolated from vectors thanks to net coverage and soil mulching of
vine rows.
Hot water treatment of propagation material.
Experimental activity carried out in Piedmont during 2004-07, using a newly
designed equipment, showed that the 50 °C × 45’ treatment applied to scions and
cuttings before grafting has no dangerous effect on the vitality of propagation material
as previously feared. Some reduction on nursery take, however, may occur treating at
52 °C x 45’.
Hot water treatment was also applied in 2007 to few thousands grafted vines,
of which several showed the diseases (FD and/or BN) the year before in the nursery.
After the hot bath the grafted vines were replanted in the nursery protected by an
insecticide spray program suitable to prevent re-infection from vectors. The results
showed that the symptoms may come out two years after grafting and that the hot
242
water treatment was effective in reducing the infection: 0% infected plants for 52 °C
x 45’, 0,06% for 50 °C x 45’ and 1% for the untreated control.
In vitro techniques
The potentiality of in vitro cultures for eradication of phytoplasmas was
also assessed. Individual lines were obtained by micropropagation of axillary buds
collected from phytoplasma-affected mother plants growing in the field. The FD was
not detected in micropropagated lines while the BN was still detected in nearly half the
lines tested. Additional strategies for phytoplasma elimination are anyway advisable.
Therefore preliminary assays were performed to assess the sensitivity of grapevine
explants to oxytetracycline in the culture media.
Key words: Grape, Phytoplasmas, Hot water Treatment, Propagation micropropagation.
243
Asaia, batterio acetico associato a Scaphoideus
titanus Ball: Potenzialità per il biocontrollo
E. Crotti1, E. Gonella2, M. Pajoro2, C. Damiani3, I. Negri2, A. Rizzi1,
N. Raddadi1, M. Marzorati1, I. Ricci3, G. Favia3, A. Alma2, D. Daffonchio1
DISTAM, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 2, I-20133 (MI)
3
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica, Università degli Studi di
Camerino, Via Gentile da Varano 3, I-62032 Camerino, (MC)
1
2
E-mail: [email protected],
I microrganismi giocano un ruolo fondamentale nel ciclo biologico degli
artropodi, cosicché recentemente un notevole interesse è stato indirizzato verso
l’utilizzo di simbionti come agenti di biocontrollo per quelle malattie veicolate da
insetti. Caratteristica fondamentale perché si possa sviluppare tale strategia è la
caratterizzazione del microbiota associato all’insetto.
Attraverso metodi indipendenti dalla coltivazione è stata indagata la comunità
microbica di Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae), vettore della
Flavescenza dorata. Grazie all’elettroforesi su gel in gradiente denaturante è stato
identificato il batterio acetico Asaia all’interno della comunità batterica dell’insetto
(Marzorati et al., 2006). Tale microrganismo veniva anche isolato nel 2006 da tessuti
di vite in Australia (Bae et al., 2006). Altri insetti nei quali Asaia è stata individuata
recentemente sono le zanzare appartenenti al genere Anopheles. Recentemente, Favia
e coautori (2007) hanno dimostrato la sua stabile associazione e la dominanza in larve
e adulti di Anopheles stephensi Liston, principale vettore della malaria in Asia.
Per capire la natura dell’associazione esistente tra il microrganismo in questione
e la cicalina S. titanus, sono state quindi condotte diverse analisi, come la valutazione
dell’abbondanza e della localizzazione del simbionte all’interno dell’ospite. Attraverso
real-time PCR, impiegando primer specifici per Asaia, è stato stimato che il numero
di copie del gene 16S rRNA di Asaia rappresenta il 4,9% rispetto al numero di copie
del gene 16S rRNA dei batteri totali. Con un valore medio del numero di copie di
rRNA 16S pari a 9,25 × 107 ± 2,12 × 107 ed assumendo una media di quattro copie
del gene per ogni cellula batterica (http://rrndb.cme.msu.edu/, Klappenbach et al.,
2001), più di 2 × 107 batteri sono tipicamente associati con la cicalina S. titanus.
Mediante ibridazione in situ, con sonde specifiche per Asaia, tale microrganismo è
stato identificato all’interno dei fasci spermatici, dei testicoli e dei tubuli malpighiani
tra i brocosomi. Inoltre un isolato di Asaia, precedentemente ottenuto da A. stephensi
244
e marcato con green fluorescent protein (Gfp), chiamato Asaia SF2.1(Gfp), è stato
impiegato per esperimenti di colonizzazione del corpo dell’insetto. Attraverso
microscopia a scansione confocale laser si è osservata l’abilità del microrganismo di
colonizzare efficientemente le ghiandole salivari, l’intestino e gli organi riproduttori
maschili e femminili di S. titanus.
I dati confermano che Asaia rappresenta una porzione significativa, prevalente
e dominante della microflora dell’insetto, suggerendone il potenziale uso come
agente di biocontrollo della Flavescenza dorata, anche in considerazione della facile
manipolabilità genetica.
Parole chiave: Flavescenza dorata, Vettore, Asaia, Controllo simbiotico.
Asaia, acetic acid bacteria associated to Scaphoideus titanus Ball:
potentiality for the biocontrol
Microorganisms are crucial for the insect biological cycle so that recently a
great interest has been focused on the use of symbiont microorganisms as biocontrol
agents against those diseases that are transmitted by arthropod vectors. An essential
requirement to apply such a strategy is the characterization of the microbiota associated
with the insect.
The microbiota of Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae), the
vector of Flavescence dorée, has been investigated through cultivation-independent
techniques (Marzorati et al., 2006). By denaturing gradient gel electrophoresis the
acetic acid bacterium Asaia has been identified within the bacterial community of the
insect. Moreover Asaia has been recently isolated from grapevine plants in Australia
(Bae et al. 2006). Other insects in which Asaia has been found are mosquitoes belonging
to the genus Anopheles. Recently, Favia and co-workers (2007) demonstrated that
Asaia was stably associated with larvae and adults of Anopheles stephensi Liston, the
main Asian malaria mosquito vector.
In order to understand the nature of the association between Asaia and the
leafhopper S. titanus, different approaches have been used for evaluating Asaia
abundance and localization within the host. By real-time PCR using Asaia specific
primers, it has been found that Asaia 16S rRNA gene represent the 4.9% of the total
bacterial 16S rRNA gene copies within the leafhopper. With an average copy value of
9.25 × 107 ± 2.12 × 107 and assuming an average of four rRNA repeats per bacterial
cell (http://rrndb.cme.msu.edu/, Klappenbach et al., 2001), an average of over 2 × 107
bacteria are typically associated with S. titanus leafhopper. The localization of Asaia
has been established by in situ-hybridization with specific probes for Asaia that has
245
been detected within the spermatic bundles, the testicles and the malpighian tubules
between the brochosomes. Moreover by using an Asaia strain previously isolated
from A. stephensi and labelled with a green fluorescent protein (Gfp), the colonization
pattern of this bacterium in the leafhopper body has been investigated by confocal
laser scanning microscopy. The Gfp-tagged bacterium was able to efficiently colonize
salivary glands, guts, and female and male reproductive organs of S. titanus.
The data and the easy genetic manipulation of Asaia confirm that it is a
significant and dominant part within the insect microbiota and an optimal candidate
for Flavescence dorée biocontrol approaches.
Key words: Flavescence dorée, Vector, Asaia, Symbiotic control.
Lavori citati/References:
Bae S., GH. Fleet, GM. Heard , 2006. Lactic acid bacteria associated with wine
grapes from several Australian vineyards. Journal of Applied Microbiology,
100, 712-727.
Favia G., I. Ricci, C. Damiani, N. Raddadi, E. Crotti, M. Marzorati, A. Rizzi, R.
Urso, L. Brusetti, S. Borin, D. Mora, P. Scuppa, L. Pasqualini, E. Clementi,
M. Genchi, S. Corona, I. Negri, G. Grandi, A. Alma, L. Kramer, F. Esposito,
C. Bandi, L. Sacchi, D. Daffonchio, 2007. Bacteria of the genus Asaia stably
associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 104, 9047-9051.
Klappenbach JA., PR. Saxman, JR. Cole, TM. Schmidt, 2001. rrnDB: the ribosomal
RNA operon copy number database. Nucleic Acids Research, 29, 181-184.
A. Balloi, R. Tedeschi, E. Clementi, S. Corona, F. Quaglino, PA. Bianco,
T. Bennati, C. Bandi, D. Daffonchio, 2006. A novel Bacteroidetes symbiont
is localized in Scaphoideus titanus, the insect vector of Flavescence Dorée in
Vitis vinifera. Applied and environmental microbiology, 72, 1467-1475.
246
Comunità microbica associata a Hyalesthes
obsoletus Signoret, vettore del Legno nero
della vite
E. Gonella1, I. Negri1, M. Marzorati2, M. Mandrioli3, L. Sacchi4,
D. Daffonchio2, A. Alma1
2
DISTAM, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 2, I-20133 (MI)
3
DBA, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia,
Via Campi, 213/D I-41100 (MO)
4
DBA, Università degli Studi di Pavia, Piazza Botta 9, I-27100 (PV)
1
Nell’ambito della lotta alle malattie trasmesse da artropodi, il controllo
simbiotico assume rilievo crescente. Questa tecnica si avvale dell’impiego di
microrganismi simbionti del vettore per contrastare la trasmissione del patogeno
attraverso l’espressione di fattori antagonisti (Beard et al., 1998, Rio et al., 2004).
Applicato con successo in campo medico, questo modello è stato proposto nell’ambito
della lotta alla malattia di Pierce della vite e al suo agente eziologico, il batterio
xilematico Xylella fastidiosa, trasmesso dalla cicalina Homalodisca vitripennis
Germar, attraverso paratransgenesi per bloccare la trasmissione del patogeno da parte
dell’insetto vettore (Bextine et al., 2004).
Al fine di individuare microrganismi utilizzabili come agenti di controllo
simbiotico, la comunità microbica associata a Hyalesthes obsoletus Signoret
(Hemiptera: Cixiidae), vettore del fitoplasma agente del Legno Nero (LN) della
vite (Stolbur 16Sr-XII, sottogruppo A), è stata caratterizzata con analisi molecolari
indipendenti dalla coltivazione. La diversità batterica è stata studiata mediante Length
Heterogeneity-PCR (LH-PCR) e Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
del gene codificante per l’rRNA 16S batterico amplificato dal DNA totale estratto
da insetti prelevati in aree viticole piemontesi colpite dal LN. Le analisi hanno
evidenziato la presenza, accanto al fitoplasma, di una comunità microbica complessa,
composta da diverse specie batteriche. Tra i batteri prevalenti nella popolazione di
insetti saggiata sono stati osservati, attraverso sequenziamento dei frammenti di
DNA separati mediante DGGE, i generi dei manipolatori riproduttivi già descritti
in numerose specie di artropodi, Wolbachia (alfa-Proteobacteria) e Cardinium
(Bacteroidetes). Quest’ultimo è stato recentemente associato anche a Scaphoideus
titanus Ball, vettore della Flavescenza dorata della vite (Marzorati et al. 2006). Il
batterio con la più alta prevalenza in H. obsoletus presentava il 92% d’identità di
247
sequenza con il Bacteroidetes ‘Candidatus Sulcia muelleri’, simbionte di molte
cicaline. La distribuzione di tali microrganismi nei distretti corporei dell’insetto è
stata esaminata tramite ibridazione in situ fluorescente effettuata con sonde specifiche,
e mediante microscopia elettronica a trasmissione. Questi microrganismi erano
localizzati in diversi organi e tessuti dell’ospite. La presenza nelle cellule uovo
indicava la trasmissione verticale alla progenie di tali batteri e non ha permesso di
escludere un possibile ruolo nella manipolazione del comportamento riproduttivo
dell’insetto. Queste osservazioni rappresentano la base per un’approfondita analisi
delle funzioni e delle interazioni di questi organismi, con potenziali implicazioni per
il biocontrollo della fitoplasmosi.
Parole chiave: Legno nero, Vettore, Microflora, Controllo simbiotico.
Microbial community associated to the Bois Noir vector Hyalesthes
obsoletus Signoret
Among the control strategies of arthropod-borne diseases, symbiotic control
is assuming increasing relevance. This technique employs microbial symbionts of
the vector for pathogen transmission restraint, through the expression of antagonistic
factors (Beard et al., 1998, Rio et al., 2004). This model, successfully applied in
medical field, was proposed for the control of Pierce’s disease of grapevine against
its etiological agent, the xylematic bacterium Xylella fastidiosa, transmitted by the
sharpshooter Homalodisca vitripennis Germar, with promising control perspectives
through a paratransgenic approach that impair the pathogen transmission by the insect
vector (Bextine et al., 2004).
In order to detect bacteria useful as potential symbiotic control agents, the
microbial community associated to Hyalesthes obsoletus Signoret (Hemiptera:
Cixiidae), the vector of the phytoplasma agent of Bois Noir (BN) of grapevine (Stolbur
16Sr-XII, subgroup A), was studied through a cultivation-independent molecular
characterization. A screening of bacterial diversity was performed by mean of Length
Heterogeneity-PCR (LH-PCR) and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
and sequencing of bacterial 16S rRNA gene amplified from the total DNA extracted
from whole insect samples collected in wine-growing areas of Piedmont region affected
by BN. These analyses showed the occurrence, beside the phytoplasma, of a complex
bacterial community. Among the prevalent bacteria, reproductive manipulators of the
genera Wolbachia (alpha-Proteobacteria) and Cardinium (Bacteroidetes), the latter
recently associated to Scaphoideus titanus Ball, vector of the Flavescence dorée
248
phytoplasma (Marzorati et al., 2006), were found. However the most prevalent
bacterium had a 92% of sequence identity with ‘Candidatus Sulcia muelleri’, a
Bacteroidetes symbiont of many leafhoppers. The distribution of these bacteria in
the organs of the insect host was examined through fluorescence in situ hybridization
with specific probes, and through transmission electron microscopy. A localization of
these organisms in several organs and tissues of the host was observed, particularly
in key districts such as eggs, indicating the occurrence of a vertical transmission to
the progeny. Such an observation does not allow excluding possible roles in sexual
manipulation of the host. These results provide a baseline for the investigation of
function of and interaction between these microorganisms, with potential implications
for phytoplasma control.
Key words: Bois noir, Vector, Symbiotic control, Microbiota.
Beard CB., RV. Durvasula, F. Frank, FF. Richards, 1998. Bacterial symbiosis in
arthropods and the control of disease transmission. Emerging Infectious
Diseases, 4, 581–591.
Bextine B., C. Lauzon, S. Potter, D. Lampe, T.A. Miller, 2004. Delivery of a
genetically marked Alcaligenes sp. to the glassy-winged sharpshooter for use
in a paratransgenic control strategy. Current Microbiology, 48, 327–331.
A. Balloi, R. Tedeschi, E. Clementi, S. Corona, F. Quaglino, PA. Bianco,
T. Bennati, C. Bandi, D. Daffonchio, 2006. A novel Bacteroidetes symbiont
is localized in Scaphoideus titanus, the insect vector of Flavescence Dorée in
Vitis vinifera. Applied and environmental microbiology, 72, 1467-1475.
Rio RVM., Y. Hu, S. Aksoy, 2004. Strategies of the home-team: symbioses exploited
for vector-borne disease control. Trends in Microbiology, 12, 325-336.
249
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DEL FITOPLASMA
AGENTE DI ‘LEGNO NERO’
G. Pasquini1, G. Albanese2, E. Angelini3, A. Bertaccini4, P.A. Bianco5,
M. Borgo3, L. Carraro6, P. Casati5, G. Durante5, L. Ferretti1, A. Gentili1,
C. Marzachì7, R. La Rosa8, D. Pacifico7, S. Paltrinieri4, A. Zorloni5
CRA-PAV Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale,
2
Dipartimento di Gestione dei Sistemi Agrari e Forestali (GESAF), Università
Mediterranea di Reggio Calabria, Loc. Feo di Vito, I-89060 (RC)
3
CRA-VIT Centro di Ricerca per la Viticoltura, Viale XXVIII aprile 26,
I-31015 Conegliano (TV)
4
D Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), Patologia Vegetale,
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale Fanin 42, I-40127 (BO)
5
6
Via Scienze 208, I-33100 (UD)
7
Istituto di Virologia vegetale, CNR, Strada delle Cacce, 73, I-10125 (TO)
8
DISTEF - Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie, Facoltà Agraria,
Università degli Studi di Catania, Via S. Sofia 100, I-95123 (CT)
1
Nell’ambito del Progetto finalizzato Gia.Vi: “I giallumi della vite: un fattore
limitante le produzion vitivinicole”, finanziato dal Ministero per le Politiche Agricole,
Alimentari e Forestali, è stata effettuata la caratterizzazione molecolare degli isolati di
legno nero (LN) rinvenuti nei diversi areali geografici italiani monitorati.
La caratterizzazione molecolare è stata effettuata mediante amplificazione del
gene non ribosomico tuf, che codifica il fattore di allungamento ribosomico Tu (EFTu), armonizzando i protocolli utilizzati da tutte le UU.OO. che hanno collaborato a
questa attività di ricerca. Gli isolati di stolbur di riferimento, denominati tuf tipo I e
tuf tipo II, sono quelli identificati mediante l’analisi dei profili di restrizione ottenuti
dopo digestione degli amplificati con l’enzima HpaII (Langer e Maixner, 2004).
L’uniformità dei protocolli molecolari utilizzati ha consentito di confrontare i risultati
ottenuti e di costruire, al termine del progetto, una mappa di distribuzione geografica
ben definita.
Sono stati caratterizzati in totale 780 campioni di vite infetti da LN,
rappresentativi di quasi tutte le regioni italiane.
In tutte le regioni settentrionali è stata individuata la presenza di entrambi gli
isolati, con una prevalenza della diffusione del tuf tipo I in Valle d’Aosta (91%),
250
Lombardia (63.3%), Veneto (78%), Trentino Alto Adige (83, 3%) ed Emilia-Romagna
(81,8%); mentre una diffusione praticamente equivalente dei due isolati è stata
rinvenuta in Piemonte e Friuli- Venezia Giulia (Bertaccini et al., 2006; Pacifico et al.,
2005; Quaglino et al., 2006).
Le regioni dell’Italia centrale hanno invece evidenziato situazioni diversificate
(Bertaccini et al., 2006; Carnevale et al., 2008; Pacifico et al., 2005; Pasquini et al.,
2007). La Toscana, le Marche e l’Umbria sono interessate dalla presenza di entrambi
gli isolati con una predominanza del tuf tipo II. Solo il Molise presenta una diffusione
equivalente dei due ceppi.
Una situazione particolare è stata evidenziata nel Lazio, dove il 100% degli
impianti commerciali è interessata dalla sola presenza del tuf tipo I.
Nell’Italia meridionale il solo isolato tuf tipo II è stato rinvenuto negli areali
viticoli di Campania, Calabria e Sicilia (Ferretti et al., 2008; Pacifico et al., 2005;
Pasquini et al., 2006).
I campi di collezione di germoplasma viticolo, localizzati su tutto il territorio
nazionale, hanno evidenziato nella maggior parte dei casi la presenza contemporanea
di entrambi gli isolati, indipendentemente dalla loro localizzazione geografica.
Complessivamente il tuf tipo II è l’isolato geograficamente più diffuso, essendo
presente in tutti gli areali monitorati, ad eccezione del Lazio; mentre il tipo I sembra
essere confinato alle regioni settentrionali e centrali. Non è ancora possibile stabilire
una correlazione tra questa distribuzione geografica e l’evoluzione spazio-temporale
della malattia. Il tuf tipo I sembra essere maggiormente diffuso in quei comprensori
viticoli in cui il legno nero è in fase di espansione ed è presente in elevate percentuali
di infezione all’interno degli impianti; mentre il tuf tipo II sembra essere correlato a
situazioni non epidemiche, in quanto è l’unico isolato al momento presente in Italia
meridionale, dove LN, pur essendo stato rinvenuto in tutti gli areali monitorati, è
presente in percentuali di infezione non elevate. Ulteriori approfondimenti sono,
comunque, necessari per valutare le implicazioni biologiche ed epidemiologiche dei
due isolati nell’evoluzione della malattia.
Parole chiave: Stolbur, Vite, Tuf tipo I, Tuf tipo II, Distribuzione.
Molecular characterization of stolbur isolates in Italian grapevine areas
In the frame of the Italian Finalized Project ‘Grapevine yellows’, financed by
the Ministry of Agriculture, the molecular characterization of ‘bois noir’ (BN) isolates
collected from several Italian grapevine areas has been performed.
The isolates differentiation has been obtained by the amplification of the tuf
gene, that encodes for Tu ribosomal elongation factor, on the basis of the molecular
251
protocol described by Langer and Maixner (2004), that individuates two different
restriction profiles when amplicons are digested with HpaII enzyme. The two isolates,
named tuf type I and tuf type II, has been used as reference controls. The harmonization
of the protocol among all the scientific Institutions involved in this topic allowed
to obtain comparable results and to design a map of distribution of stolbur isolates
in vineyards in Italy. In total 780 samples have been processed, representative of
approximately all Italian regions.
In all northern Italian regions both tuf types were identified, with a predominance
of tuf type I in Valle d’Aosta (91%), Lombardia (63.3%), Veneto (78%), Trentino Alto
Adige (83,3) and Emilia-Romagna (81,8%); whereas an homogeneous distribution
of both isolates has been observed in Piedmont and Friuli (Bertaccini et al., 2006;
Pacifico et al., 2005; Quaglino et al., 2006).
In central Italy the distribution of the two isolates resulted differentiated
(Bertaccini et al., 2006; Carnevale, 2008; Pacifico et al., 2005; Pasquini et al., 2007):
Tuscany, Marche and Umbria are interested by the presence of both tuf types, with a
predominance of tuf type II. Only Molise region shows an equivalent distribution of
both types.
In Latium only tuf type I has been identified in all monitored areas. In southern
Italy tuf type II is the only isolate detected in Campania, Calabria and Sicily (Ferretti
et al. 2008; Pacifico et al., 2005; Pasquini et al., 2006).
The analyzed germplasm collection fields, localized throughout the entire
country, have shown the presence of both isolates, independently by their geographical
localization.
Generally, the tuf type II resulted the most frequent, being spread in all
monitored areas, except Latium region; whereas tuf type I seems to be confined only
to northern and central Italian regions.
It is difficult to associate the geographical distribution of BN isolates with their
biological characteristics: tuf type I seems to be prevalent in those areas in which
BN presence is in an increasing phase, while tuf type II is, at the moment, the only
isolate spread in southern Italy, where BN is mainly in an endemic phase with low
percentages of infected plants inside the fields.
An improvement of knowledge on biological and epidemiological significance
of BN types is need to understand the disease evolution in the diverse environmental
situations.
Key words: Stolbur, Grapevine, Tuf type I, Tuf type II, Distribution.
252
E. Torres, M. Conti, 2006. Diversity of 16SrXII phytoplasmas detected in
grapevine growing areas worldwide - 15th Meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICGV),
Stellenbosch, South Africa, 3-7 April 2006, 88-89.
Carnevale S., S. Paltrinieri, P. Braccini, D. Rizzo, N. Contaldo , A. Bertaccini, 2008.
Diffusione di ceppi di Legno nero in vigneti toscani. IV Incontro Nazionale
Ferretti L., G. Pasquini, V. Cavalieri, C. Rapisarda, V. D’Urso, M. Barba, G.
Albanese, 2008. Epidemiologia e identificazione dei fitoplasmi dei Giallumi
della vite in Calabria. IV Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi,
associated phytoplasmas of the stolbur group based on RFLP-analysis of nonribosomal DNA - Vitis, 43, 191-200.
Pacifico D., A. Alma, M. Tessitori, C. Marzachì , 2005. Caratterizzazione di fitoplasmi associati al Legno nero (LN) della vite in Liguria, Piemonte, Sardegna,
Sicilia e Valle d’Aosta. Petria, 15, 113-115.
Geographical distribution of stolbur isolates in vineyards of Central and
Southern Italy. 15th Meeting of the International Council for the Study of Virus
3-7 April 2006, 103-104.
Molecular chracterization of stolbur isolates collected in grapevines, weeds
Quaglino F., P. Casati, A. Zorloni, G. Duranre, PA. Bianco, 2006. Molecular
characterization of phytoplasmas associated with grapevine yellows in
northern Italy. 15th Meeting of the International Council for the Study of Virus
3-7 April 2006, 90-92.
253
STRATEGIE DI CONTROLLO DELLA
FLAVESCENZA DORATA DELLA VITE
F. Pavan1, C. Bellomo1, M. Borgo2, V. Forte2
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante, Università di Udine, Via delle
Scienze 208, I-33100 (UD)
2
CRA-VIT Centro di Ricerca per la Viticoltura, Viale XXVIII Aprile 26,
I-31015 Conegliano (TV)
1
La flavescenza dorata della vite (FD) è una malattia causata da un fitoplasma
che in natura è trasmesso da vite a vite dalla cicalina Scaphoideus titanus Ball. Nei
vigneti coltivati le strategie di controllo di FD si basano sulla lotta contro il vettore e
sull’estirpo delle viti sintomatiche.
I trattamenti insetticidi effettuati nei vigneti sono il principale mezzo per il
controllo del vettore. Essi sono sicuramente efficaci nel contenimento della malattia,
ma è importante stabilire quanti interventi insetticidi è conveniente effettuare
(Girolami et al., 2002; Pavan et al., 2005b). Nell’ambito del progetto Gia.Vi. è emerso
che, nei vigneti regolarmente trattati contro il vettore da lungo tempo, è conveniente
effettuare un solo intervento insetticida all’anno e che l’utilizzo di un fosforganico, in
coincidenza con il trattamento contro la seconda generazione delle tignole della vite,
è preferibile a quello di indoxacarb o flufenoxuron.
La sostituzione delle viti sintomatiche è conveniente se le viti sono destinate a
morire in elevata percentuale, ma non quando la cultivar mostra di possedere un’alta
probabilità di risanamento (Pavan et al., 2008).
I monitoraggi condotti nell’ambito del progetto Gia.Vi. hanno evidenziato che i
vigneti coltivati ma non trattati contro il vettore, così come quelli abbandonati, possono
essere sorgente di S. titanus per i vicini vigneti trattati (Pavan et al., in corso di stesura).
È quindi emersa l’importanza di trattare contro il vettore tutti i vigneti coltivati e di
estirpare quelli abbandonati. Anche viti americane inselvatichite all’interno di siepi o
boschetti possono presentare elevate densità di S. titanus (Pavan et al., 2005a; Lessio
et al., 2007). Benché una migrazione del vettore dalle viti inselvatichite verso i vicini
vigneti trattati non sia sempre chiaramente emersa, sarebbe buona pratica togliere le
viti spontanee, senza comunque eliminare le siepi e i boschetti in quanto il vettore è
monofago su vite.
Parole chiave: Vite, Flavescenza dorata, Scaphoideus titanus, Lotta insetticida, Sostituzione viti sintomatiche, Vigneti abbandonati, Viti inselvatichite.
254
Control strategy of flavescence dorée
Flavescence dorée (FD) is a disease caused by a phytoplasma transmitted from
grapevine to grapevine by the leafhopper Scaphoideus titanus Ball. Control strategies
of FD in the cultivated vineyards base on vector control and removal of symptomatic
grapevines.
The insecticide treatments are the most important means to vector control. The
efficacy of the chemical control to reduce the disease is known, but the advantage to
apply more than one insecticide treatment a year must be established (Girolami et
al., 2002; Pavan et al., 2005b). During the Gia.Vi. project it was ascertained that it is
profitable to apply only one insecticide treatment a year. In this case it is advisable to
use organophosphates, in coincidence with the treatment against the second generation
of the grape berry moths, rather than indoxacarb o flufenoxuron.
The replacement of the symptomatic grapevines is to encourage if they are
destined to die, whereas the maintenance of the plants is profitable if the symptomatic
grapevines mostly recover (Pavan et al., 2008).
The vineyards cultivated but untreated with insecticides against the vector,
so as the abandoned ones, can be a source of S. titanus adults for the adjoining
vineyards treated against the vector (Pavan et al., unpublished data). Therefore, all
the vineyards must be treated with insecticides and the abandoned ones eradicated.
Also the grapevines grown wild in hedgerows or woodland can support high densities
of S. titanus (Pavan et al., 2005a; Lessio et al., 2007). Even if a migration of the vector
from wild to cultivated grapevines did not appear always evident, the removal of these
grapevines is a recommendable practice, however protecting hedgerows or woodland
because the vector is monophagous on grapevine.
Key words: Grapevines, Flavescence dorée, Scaphoideus titanus, Chemical control,
Replacement of symptomatic grapevines, Abandoned vineyards, Grapevines grown wild.
255
Girolami V., N. Mori, E. Borella, C. Capuzzo, C. Scopel, G. Posenato, 2002. Lotta
integrata al vettore della flavescenza dorata. L’Informatore Agrario, 58 (24):
10-11.
Lessio F., R. Tedeschi, A. Alma, 2007. Presence of Scaphoideus titanus in American
grapevine in woodlands, and infection with “flavescence dorée” phytoplasmas.
Pavan F., C. Bellomo, F. Vidoni, G. Bigot, M. Ostan, W. Boccalon, S. Bressan,
P. Mutton, C. Frausin, AC. De Biasio, G. Governatori, D. Mucignat, C.
Farfugia, D. Giorgiutti, F. Gon, S. Zanutta, M. Malison, I. Battiston, M.
Masotti, G. Stasi, G. Stefanelli, A. Villani, L. Vinzi, 2005a. Efficacia della
lotta insetticida contro Scaphoideus titanus Ball in Friuli Venezia Giulia.
Supplemento Notiziario ERSA (2004), 17 (5-6), 11-21.
Pavan F., P. Mutton, S. Bressan, 2008. Valutazione della convenienza economica
a sostituire le viti con sintomi di giallumi. In: IV Incontro Nazionale sulle
Malattie da Fitoplasmi, Roma, 28-30 maggio 2008.
Pavan F., G. Stefanelli, A. Villani, N. Mori, G. Posenato, A. Bressan, V. Girolami,
2005b. Controllo di FD attraverso la lotta contro il vettore Scaphoideus titanus
Ball. In: A. Bertaccini e P. Braccini (eds), Flavescenza dorata e altri giallumi
della vite in Toscana e in Italia. Quaderno ARSIA, 3/2005, 91-116.
256
Rapporti Tra cicaline, fitoplasmi e piante ospiti
nell’agroecosistema vigneto
A. Alma1, F. Lessio1, L. Picciau1, F. Tota1, V. Forte2, M. Borgo2, B. Bagnoli3,
F. Pinzauti3, V. Trivellone3, C. Rapisarda4, V. Cavalieri4, V. D’Urso5
1
Università degli Studi di Torino,
2
CRA-VIT Centro di ricerca per la Viticoltura, Viale XXVIII Aprile 26,
Conegliano I-31015 (TV)
3
Via Lanciola, 12/a, I-50125 (FI)
4
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie,
Via Santa Sofia 100, I-95123 (CT)
5
Dipartimento di Biologia Animale “Marcello La Greca”,
Via Androne 81, I-95124 (CT)
Vengono riferiti i risultati di un quadriennio di indagini (2004-2007), condotte
in Valle d’Aosta, Piemonte, Veneto, Toscana, Lazio, Calabria e Sicilia nell’ambito del
progetto “Gia.Vi.”, sulla presenza di auchenorrinchi (Hemiptera: Auchenorrhyncha)
noti e potenziali vettori di fitoplasmi agenti di Flavescenza dorata (FD) (EY, gruppo
16Sr-V, sottogruppi C e D) e Legno nero (LN) (Stolbur, gruppo 16Sr-XII, sottogruppo
A) nell’agroecosistema vigneto. I campionamenti sono stati effettuati con trappole
cromotattiche gialle, aspiratore pneumatico e retino entomologico, sia su vite che
su piante spontanee, da giugno a ottobre. Il rilevamento dei fitoplasmi negli insetti
catturati è stato effettuato con tecniche di biologia molecolare (PCR e RFLP).
Fitoplasmi del gruppo16Sr-V sono stati identificati in Scaphoideus titanus
Ball, Anoplotettix fuscovenosus (Ferrari) (Cicadellidae) e Dictyophara europaea
(L.) (Dictyopharidae). Le seguenti specie sono invece risultate positive a fitoplasmi
del gruppo Stolbur: Hyalesthes obsoletus Signoret, H. scotti Ferrari, H. luteipes
Fieber, Reptalus cuspidatus (Fieber), R. quinquecostatus (Dufour), R. panzeri (Löw)
(Cixiidae), Toya propinqua (Fieber) (Delphacidae), Cicadella viridis (L.), Exitianus
capicola (Stål), Thamnotettix zelleri (Kirschbaum), Anoplotettix putoni Ribaut,
A. fuscovenosus (Cicadellidae) e D. europaea (Dictyopharidae). La maggior parte
degli esemplari delle diverse specie è stata catturata su piante spontanee, sia erbacee
che legnose; solo S. titanus e, in certi casi, R. quinquecostatus e Anoplotettix spp.
257
sono stati riscontrati abbondanti su vite. Elevate percentuali di positività sono state
osservate in R. quinquecostatus (48%), H. obsoletus (36%) e R. cuspidatus (27%),
confermando per i cixiidi un’associazione piuttosto frequente con i fitoplasmi dello
Stolbur (Cimerman et al., 2006).
Al momento, gli unici vettori accertati per la trasmissione di fitoplasmi alla
vite risultano S. titanus per FD e H. obsoletus per LN (Weintraub e Beanland, 2006).
Nell’ambito delle nostre indagini S. titanus non è mai stato catturato né in Calabria
né in Sicilia mentre H. obsoletus è apparso assente solo in Sicilia; nelle altre regioni,
i due vettori sono stati reperiti con densità di popolazione variabili anche in rapporto
alla metodologia di campionamento adottata e, relativamente a H. obsoletus, alla
flora spontanea presente nell’agroecosistema. Per quanto riguarda le altre specie, per
alcune delle quali sono note le principali piante ospiti, il grado di ampelofilia degli
adulti nonché la frequenza di positività ai fitoplasmi agenti di FD e LN (Alma, 1995;
Palermo et al., 2004; Bagnoli et al., 2005; Trivellone et al., 2005; Cavalieri et al.,
2007; Filippin et al., 2007; Lessio e Alma, 2008; Picciau et al., 2008), l’associazione
con detti fitoplasmi rimane per il momento solo una condizione necessaria ma non
sufficiente per dimostrarne il ruolo di vettore.
Parole chiave: Vite, Vettori, Giallumi, Diagnosi molecolare.
Relationships between Auchenorrhyncha, phytoplasmas
and host plants in the vineyard agroecosystem
A four year study (2004-2007), conducted in Aosta Valley, Piedmont, Venetia,
Tuscany, Latium, Calabria and Sicily within the “Gia.Vi.” project, on the presence of
Auchenorrhyncha known as suspected vectors of phytoplasmas that cause Flavescence
dorée (FD) (EY, group 16Sr-V, subgroups C and D) and Bois noir (LN) (Stolbur, group
16Sr-XII, subgroup A) in the vineyard agroecosystem is reported. Field samplings were
conducted with yellow sticky traps, D-Vac and sweep net, on the grapevine canopy
and on the spontaneous vegetation nearby, from June until October. The identification
of phytoplasmas in captured insects was made with molecular techniques (PCR and
RLFP).
Phytoplasmas belonging to the 16Sr-V group were identified in Scaphoideus
titanus Ball, Anoplotettix fuscovenosus (Ferrari) (Cicadellidae), and Dictyophara
europaea (L.) (Dictyopharidae). The following species were instead found positive to
Stolbur: Hyalesthes obsoletus Signoret, H. scotti Ferrari, H. luteipes Fieber, Reptalus
cuspidatus (Fieber), R. quinquecostatus (Dufour), R. panzeri (Löw) (Cixiidae), Toya
propinqua (Fieber) (Delphacidae), Cicadella viridis (L.), Exitianus capicola (Stål),
Thamnotettix zelleri (Kirschbaum), Anoplotettix putoni Ribaut, A. fuscovenosus
258
(Cicadellidae) and D. europaea (Dictyopharidae). The majority of the specimens
belonging to the different species was collected on spontaneous vegetation, both
weeds and bushes; only S. titanus and, in some cases, R. quinquecostatus and
Anoplotettix spp. were abundant on grapevine. High infection rates were recorded
for R. quinquecostatus (48%), H. obsoletus (36%) and R. cuspidatus (27%): these
data confirm the strong link between the family Cixiidae and Stolbur phytoplasmas
(Cimerman et al., 2006).
To date, the only known vectors are S. titanus for FD and H. obsoletus for
LN (Weintraub and Beanland, 2006): during this study, the former was found in all
considered regions except Calabria and Sicily, whereas the latter was absent only
in Sicily; in the other regions, the two vectors were found with different population
densities, also depending on the sampling method and, regarding H. obsoletus, on
the spontaneous vegetation in the agroecosystem. As for the other species, for many
of which the main host plants, the frequency of adults visiting the grapevine canopy,
and the positivity to the phytoplasmas agent of FD and LN are known (Alma, 1995;
Palermo et al., 2004; Bagnoli et al., 2005; Filippin et al., 2005; Cavalieri et al., 2007;
Trivellone et al., 2007; Lessio e Alma, 2008; Picciau et al., 2008), the link with these
phytoplasmas is a necessary but not sufficient condition to demonstrate their vector role.
Key words: Grapevine, Vectors, Yellows, Molecolar diagnosis.
Alma A., 1995. Ricerche bio-etologiche su Anoplotettix fuscovenosus (Ferrari) (Cicadellidae Deltocephalinae). Bollettino di Zoologia Agraria e Bachicoltura,
27, 45-52.
Bagnoli B., F. Pinzauti, V. Trivellone, 2005. Indagine preliminare sugli auchenorrinchi potenziali vettori di Stolbur in un’area viticola del Lazio. Petria, 15, 55-58.
Cavalieri V., V. D’Urso, L. Ferretti, 2007. Individuazione di fitoplasmi in auchenorrinchi (Insecta, Rhynchota) di aree vitivinicole calabresi e siciliane mediante
indagini molecolari. In: Atti del XXI Congresso Nazionale Italiano di Entomologia. Campobasso, Italy, 11-16 giugno, 2007, 183.
Cimerman A., G. Arnaud, X. Foissac, 2006. Stolbur phytoplasma genome survey
achieved using a suppression subtractive hybridization approach with high
specificity. Applied and Environmental Microbiology, 72, 3274-3283.
Filippin L., J. Jovi, V. Forte, T. Crvkovi, I. Toševski, M. Borgo, E. Angelini, 2007.
Occurrence and diversity of phytoplasmas detected in clematis and their relationships with grapevine “flavescence dorée” phytoplasmas. Bulletin of Insectology, 60, 327-328.
259
Lessio F., A. Alma, 2008. Host plants and seasonal presence of Dictyophara europaea
in the vineyard agro-ecosystem. 4th European Hemiptera Congress, Ivrea (TO),
Italy, 10-14 settembre, 2007. Bulletin of Insectology (in press).
Palermo S., M. Elekes, S. Botti, I. Ember, A. Alma, A. Orosz, A. Bertaccini, M.
Kölber, 2004. Presence of Stolbur phytoplasma in Cixiidae in Hungarian
vineyards. Vitis, 43, 201-203.
Picciau L., F. Lessio, A. Alma, 2008. Preliminary data on the Cixiid fauna of the
vineyard agro-ecosystem in Piedmont (north-western Italy). 4th European
Hemiptera Congress, Ivrea (TO), Italy, 10-14 settembre, 2007. Bulletin of
Insectology (in press).
Weintraub PG., L. Beanland, 2006. Insect vectors of phytoplasmas. Annual Review
of Entomology, 51, 91-111.
260
RUOLO DI ALTRE PIANTE NELL’EPIDEMIOLOGIA DEI
FITOPLASMI AGENTI DI FLAVESCENZA DORATA E
LEGNO NERO
M. Borgo1, G. Albanese2, F. Quaglino3, P. Casati3, P. Ermacora4, L. Ferretti5,
F. Ferrini4, L. Filippin1, G. Pasquini5, E. Angelini1
2
Dip. di Agrochimica e Agrobiologia, Univ. Mediterranea di Reggio Calabria
P.za S. Francesco di Sales 4, I-89061 Gallina (RC)
3
Ist. di Patologia Vegetale, Univ. di Milano
Via Celoria 2, I-20133 (MI)
4
Dip. di Biologia e Protezione delle Piante, Univ. di Udine
5
CRA-PAV Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale
Via Bertero 22, I-00156 (RM)
1
Piante spontanee ed infestanti, presenti in vigneto, nonché alcune colture
orticole, possono essere ospiti di fitoplasmi associati ai giallumi della vite. Dal 2005
al 2007, nell’ambito del progetto Gia.Vi. “I giallumi della vite: un fattore limitante le
produzioni vitivinicole”, finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari
e Forestali, è stato condotto uno studio congiunto tra cinque Unità Operative afferenti
al progetto, volto a ricercare la presenza di fitoplasmi agenti di Flavescenza dorata
(FD) e di Legno nero (LN) nelle specie vegetali particolarmente abbondanti in vigneto
o nelle vicinanze. Sono state raccolte sia specie già note per essere ospiti di fitoplasmi
associati ai giallumi della vite, sia specie mai prima riportate come ospiti di fitoplasmi
di FD e LN.
Sono state indagate alcune zone viticole di Veneto, Friuli Venezia Giulia,
Lombardia, Toscana, Lazio e Calabria. Osservazioni e campionamenti sporadici sono
stati eseguiti anche in Piemonte, Liguria, Trentino, Emilia Romagna ed Umbria. Sono
state raccolte piante appartenenti a 60 specie diverse, per un totale di quasi 1000
campioni. Ogni campione è stato sottoposto a PCR, per diagnosticare la presenza
di fitoplasmi. I campioni risultati positivi sono stati successivamente analizzati con
RFLP, al fine di caratterizzare il tipo di fitoplasma presente.
La presenza del fitoplasma stolbur, associato a LN su vite, è stata abbondantemente riscontrata nelle specie Amaranthus retroflexus, Apium graveolens, Calystegia
sepium, Cirsium arvense, Convolvulus arvensis, Lycopersicon aesculentum, Urtica
dioica. Lo stesso fitoplasma è stato ritrovato sporadicamente anche su Chenopodium
261
album, Clematis vitalba, Daucus carota, Lactuca sp., Mercurialis annua, Parietaria
officinalis, Petroselinum sativum, Pulicaria sp., Sambucus nigra, Solanum nigrum. In
diverse aree è stata osservata una stretta correlazione fra l’incidenza della malattia in
vite e nelle altre specie, suggerendo un ruolo diretto delle piante “reservoir” nell’epidemiologia del LN della vite.
Il fitoplasma associato a FD su vite è stato identificato in molti campioni di
Clematis vitalba ed Alnus glutinosa. È stato ritrovato sporadicamente anche su piante
di Ailanthus altissima. In questo caso non c’è una chiara relazione fra infezione in
vigneto e presenza nelle piante spontanee, per cui non sembra probabile un ruolo
fondamentale di queste ultime nell’epidemie di FD su vite. Essendo FD una malattia
epidemica e di quarantena, la presenza del fitoplasma in piante ospiti non va comunque
sottovalutata, in quanto un passaggio sporadico a vite può essere deleterio per il
vigneto, qualora il vettore Scaphoideus titanus sia presente.
Parole chiave: Flavescenza dorata, Stolbur, Piante spontanee, Vite.
Role of other plants in the epidemiology of phytoplasmas associated to
Flavescence dorée and Bois noir
Spontaneous and invasive plants, present in vineyard, together with horticultural
species, are can host phytoplasmas associated with grapevine yellows. In the frame
of the Gia.Vi. project, financed by the Italian Ministry of Agriculture for 2005-2007,
five groups carried out a joint research aimed to study the occurrence of phytoplasmas
associated with Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) diseases of grapevine
in plant species present in vineyard or at the border. Species already know to host
grapevine yellows phytoplasmas and species never reported previously to host FD
and BN phytoplasmas were collected.
Viticultural areas in Venetia, Friuli Venetia Giulia, Lombardy, Tuscany,
Latium and Calabria regions were inspected. Sporadic observations and sampling
were carried out also in Piedmont, Liguria, Trentino, Emilia Romagna and Umbria.
More than 1000 plants, belonging to 60 different species, were collected. PCR tests
were carried out in each sample, in order to detect phytoplasmas. Samples that gave a
positive signal were subsequently subjected to RFLP, in order to characterize the type
of phytoplasma.
Stolbur phytoplasma, associated with BN in grapevine, was found in many
samples of the following species: Amaranthus retroflexus, Apium graveolens,
Calystegia sepium, Cirsium arvense, Convolvulus arvensis, Lycopersicon aesculentum,
Urtica dioica. The same phytoplasma was sporadically identified also in samples
from Chenopodium album, Clematis vitalba, Daucus carota, Lactuca sp., Mercurialis
262
annua, Parietaria officinalis, Petroselinum sativum, Pulicaria sp., Sambucus nigra,
Solanum nigrum. In several areas a strict correlation between the incidence of stolbur
phytopalsma on grapevine and in the other plant species was noticed. This fact suggests
a direct role of the other host plant species in the epidemiology of BN in grapevine.
FD phytoplasma was identified in many samples of Clematis vitalba and Alnus
glutinosa. It was sporadically found also on plants of Ailanthus altissima. In this
case, a relationship between the occurrence of FD phytoplasma in grapevine and in
the other plant species was not observed. Therefore, an important role of these plant
species in the epidemiology of FD in grapevine does not seem probable. However,
given to the fact that FD is an epidemic and quarantine disease, the occurrence of
FD phytoplasma in other host plants is not to be undervalued. Indeed the occasional
transmission of the phytoplasma to grapevine can be detrimental for the vineyard if
the vector Scaphoideus titanus is present.
Key words: Flavescence dorée, Stolbur, Spontaneous plant species, Grapevine.
263
.Nuove acquisizioni
nella diagnosi di FD e LN
E. Angelini1 , G. L. Bianchi2, P. A. Bianco3, M. Borgo1, P. Casati3, G. Durante3,
L. Filippin2, L. Galetto4, C. Morassutti2, S. Prati3, F. Quaglino3, A. Zorloni3,
C. Marzachì4*
1
CRA - Centro per la Ricerca in Viticoltura, I-31015 Conegliano (TV)
2
ERSA Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale,
I-33050 Pozzuolo del Friuli (UD)
3
Istituto di Patologia Vegetale, Università degli Studi di Milano
4
Istituto di Virologia Vegetale, CNR, (TO)
La real-time PCR (rtPCR) è stata recentemente introdotta nella diagnosi di
patogeni vegetali e protocolli per l’identificazione gruppo-specifica di fitoplasmi
diversi in ospiti erbacei (Marzachi e Bosco, 2005; Wei et al., 2004) ed arborei (Baric et
al., 2006; Jarausch et al., 2004), nonchè per l’amplificazione universale di fitoplasmi
(Christensen et al., 2004; (Galetto et al., 2005) sono ormai disponibili. Il Progetto Gia.
Vi. ha contribuito allo sviluppo di due protocolli che ne prevedono l’utilizzo per la
diagnosi specifica delle fitoplasmosi della vite ed uno per la diagnosi universale dei
fitoplasmi. Sono stati sviluppati tre sistemi per il rilevamento di Flavescenza dorata
(FD), Legno nero (LN) e giallume dell’astro (AY), basati su primers specifici disegnati
sul gene 16SrRNA del fitoplasma e sull’utilizzo di sonde TaqMan (Angelini et al.,
2007). Un ulteriore saggio è stato anche sviluppato sul gene codificante la chaperonin
21 plastidiale della vite, per ottenere un controllo della qualità del DNA estratto dai
campioni di vite. Il secondo approccio ha previsto l’utilizzo di primers specifici per
il rilevamento di FD e LN basati sul gene 16SrRNA di FD e su un locus genico non
caratterizzato di Stolbur (Marzachì et al., 2000), e l’utilizzo di primers universali,
basati sul gene 16SrRNA per la diagnosi generica di fitoplasmi in ospiti diversi. Il
rilevamento degli ampliconi specifici per FD e LN è avvenuto mediante l’utilizzo
del colorante SYBR Green, mentre una sonda di tipo TaqMan è stata utilizzata per il
rilevamento degli ampliconi fitoplasma-specifici (Galetto et al., 2005). L’efficienza
dei diversi protocolli è stata confrontata con quella dei protocolli convenzionali basati
sulla PCR nested. La diagnosi di FD, LN ad AY nei campioni infetti è stata rapida,
specifica e riproducibile e la sensibilità di ciascun protocollo è risultata equivalente
a quella del corrispondente saggio convenzionale. La rtPCR può essere dunque
utilizzata con successo e convenienza per la diagnosi universale e gruppo-specifica di
fitoplasmi, anche in piante arboree provenienti dal campo con un netto miglioramento
dei protocolli analitici.
Il Progetto Gia.Vi. ha anche ottimizzato un protocollo di diagnosi delle
264
fitoplasmosi della vite basato sul sistema ligase detection reaction. Questa tecnica
utilizza il rilevamento di un amplicone di PCR mediante il legame enzimatico
tra un oligonucleotide universale per fitoplasmi ed un oligonucleotide specifico
marcato con un colorante fluorescente. L’oligonucleotide universale, a sua volta,
si attaccherà, mediante un’estensione (zipcode) di sequenza complementare, ad un
oligo stabilmente fissato su un base di vetro. Il rilevamento avviene per emissione
di fluorescenza, quando l’oligonucleotide marcato abbia riconosciuto l’amplicone
della PCR. La tecnica sviluppata ha dimostrato un’ottima specificità diagnostica ed
anche una discreta sensibilità ed è risultata particolarmente interessante perché rende
possibile la diagnosi di diversi fitoplasmi presenti nello stesso campione a partire da
un’unica reazione di PCR.
I tre metodi diagnostici descritti non influiscono sulle successive procedure di
caratterizzazione degli isolati identificati. I risultati ottenuti saranno molto utili per lo
sviluppo di strategie di difesa, potranno servire per identificare affidabili procedure
diagnostiche nei programmi di certificazione e controllo e per lo studio quantitativo
delle interazioni tra fitoplasma-pianta ed insetto vettore.
Parole chiave: Real time PCR, Giallumi della vite, Ligase detection reaction.
Advances in the diagnosis of grapevine yellows
Real-time PCR (rtPCR) has been introduced recently for the diagnosis
of plant pathogens and protocols for the group-specific identification of different
phytoplasmas in herbaceous (Marzachi and Bosco, 2005; Wei et al., 2004) as well
as in woody hosts (Baric et al., 2006; Jarausch et al., 2004) and for the universal
detection of phytoplasmas (Christensen et al., 2004; Galetto et al., 2005) have been
developed. Gia.Vi. Project has improved the diagnosis of grapevine yellows by
means of rtPCR. Two protocols have been developed for the diagnosis of grapevine
phytoplasmas and one for the universal detection of phytoplasmas based on rtPCR.
In a first approach three systems have been developed for the specific detection of
Flavescence doree (FD), Bois noir (BN) and “Candidatus Phytoplasma asteris” (AY)
based on specific primers designed on the phytoplasma 16S rDNA gene and TaqMan
probes (Angelini et al., 2007). Another assay has also been developed on the plastidial
chaperonin 21 gene of grapevine, to check the quality of each DNA extract. A second
protocol has been developed to specifically detect FD and BN in several hosts using
primers designed on the FD 16S rDNA gene and on a Stolbur-specific uncharacterized
locus (Marzachì et al., 2000); a protocol for the universal diagnosis of phytoplsmas
have also been proposed. In this case, SYBR Green has been used for the detection
of FD- and BN-specific amplicons, while a TaqMan probe has been developed for
265
the universal diagnosis of phytoplasmas (Galetto et al., 2005). The efficiency of the
protocols has been compared to the efficiency of conventional diagnostic protocols
based on nested PCR assays. Diagnosis of FD, BN and AY in the infected samples
was rapid, specific and reproducible and each protocol was as sensitive as the
corresponding conventional diagnostic assay. Our results have shown that rtPCR is
faster than conventional nested assays and few contaminations among samples occurs
when diagnosis is based on rtPCR. The technique can be used with success for the
universal detection of phytoplasmas as well as for their group-specific identification,
even in field-collected woody hosts, and therefore it represents an advance of the
diagnostic protocols for these diseases.
Gia.Vi. Project has also provided an alternative protocol for the detection of
grapevine phytoplasmas based on the ligase detection reaction. A PCR amplicon is
detected through an enzymatic ligation of a universal phytoplasma oligonucleotide
and a specific one labelled with a fluorescent dye. The universal phytoplasma oligo
has an extension (zipcode) that specifically binds to a complementary sequence
linked to a glass slide. Detection of the specific amplicons occurs when the cyaninlabelled specific oligo recognizes its complementary sequence in the diagnostic PCR
amplicon. The technique was very specific and sensitive and especially interesting
because several phytoplasmas present in the same sample may be detected with a
unique PCR reaction.
The three detection methods have no effect on the protocols for further
characterization of the detected phytoplasma isolates. The results will be extremely
useful in the development of defence strategies, may be used as effective tools in
the detection procedure of certification programs and will also be available for
quantitative approaches in the study of the relationships among phytoplasma-plant
and insect vector.
Key words: Real time PCR, Grapevine yellows, Ligase detection reaction.
Angelini E., GL. Bianchi, L. Filippin, C. Morassutti. M. Borgo, 2007. A new TaqMan
method for the identification of phytoplasmas associated with grapevine
yellows by real-time PCR assay. Journal of Microbiological Methods, 68,
613-622.
Baric S., C. Kerschbamer, J. Dalla Via, 2006. TaqMan real-time PCR versus four
conventional PCR assays for detection of apple proliferation phytoplasma.
Plant Molecular Biology Reporter, 24, 169-184.
266
Christensen NM., M. Nicolaisen, M. Hansen, A. Schulz, 2004. Distribution of phytoplasmas in infected plants as revealed by real-time PCR and bioimaging.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 17, 1175-1184.
Galetto L., D. Bosco, C. Marzachi, 2005. Universal and group-specific real-time
PCR diagnosis of flavescence doree (16Sr-V), bois noir (16Sr-XII) and apple proliferation (16Sr-X) phytoplasmas from field-collected plant hosts and
insect vectors. Annals of Applied Biology, 147, 191-201.
Jarausch W., T. Peccerella, N. Schwind, B. Jarausch, G. Krczal, 2004. Establishment of a quantitative real-time PCR assay for the quantification of apple proliferation phytoplasmas in plants and insects. Acta Horticulturae, 657, 415–420.
Marzachi C., D. Bosco, 2005. Relative quantification of chrysanthemum yellows
(16Sr I) phytoplasma in its plant and insect host using real-time polymerase
chain reaction. Molecular Biotechnology, 30, 117-127.
Marzachì, C., F. Veratti, M. D’Aquilio, A. Vischi, M. Conti, G. Boccardo, 2000.
Molecular hybridization and PCR amplification of non-ribosomal DNA to detect and differentiate stolbur phytoplasma isolates from Italy. Journal of Plant
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Wei W., S. Kakizawa, S. Suzuki, HY. Jung, H. Nishigawa, S. Miyata, K. Oshima, M.
Ugaki, T. Hibi, S. Namba, 2004. In planta dynamic analysis of onion yellows
phytoplasma using localized inoculation by insect transmission. Phytopathology, 94, 244-250.
267
CARATTERIZZAZIONE DEI CEPPI DI FLAVESCENZA
DORATA INDIVIDUATI NEL TERRITORIO ITALIANO NEL
PERIODO 2004-2008
A. Bertaccini1, E. Angelini2, P.A. Bianco3, S. Botti1, P. Casati3, G. Durante3,
L. Filippin2, C. Marzachì4, D. Pacifico4, S. Paltrinieri1, F. Quaglino3
DiSTA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum – Università di Bologna,
Viale G. Fanin, 42, I-40127 (BO)
2
C.R.A. - Centro di ricerca per la viticoltura, Viale XXVIII Aprile, 26
I-31015 Conegliano - (TV)
3
Istituto di Patologia vegetale, Università di Milano, Via Celoria 2, I-20100 (MI)
4
Istituto di Virologia vegetale, CNR, Strada delle Cacce, 73, I-10125 (TO)
1
Nell’ambito del progetto di ricerca Gia.Vi. è stata effettuata la caratterizzazione
molecolare dei ceppi di flavescenza dorata (FD) individuati nelle regioni italiane in cui
l’epidemia era già presente all’inizio della ricerca, nonché in quelle in cui la malattia è
stata individuata durante la ricerca stessa. E’ stata effettuata l’analisi del polimorfismo
della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) su amplificati del gene ribosomico
16S mediante l’enzima di restrizione TaqI per la differenziazione dei ceppi di FD-D
da quelli FD-C (Martini et al., 1999) e dei geni SecY e rpS3 con enzimi di restrizione
diversi a seconda dell’amplificato (Martini et al., 2002; Botti e Bertaccini, 2007).
Sono stati caratterizzati ceppi di FD provenienti da Piemonte, Liguria, Valle d’Aosta,
Lombardia, Emilia-Romagna, Veneto, Trentino, Friuli, Toscana e Umbria.
Sono stati analizzati circa 250 campioni infetti da FD discriminando FD-C da
FD-D: la distribuzione geografica dei due ceppi ha confermato la presenza del ceppo
FD-D, virulento ed associato alle epidemie descritte per la prima volta in Veneto a
metà degli anni novanta, in alcune province del Piemonte, del Friuli, della Lombardia,
dell’Emilia e recentemente della Romagna (provincia di Ravenna) oltre che del
Veneto. Un campione è stato individuato anche in Valle d’Aosta.
Per quanto si riferisce a FD-C occorre distinguere il tipo Treviso dal tipo
Piemonte/Lombardia che sono differenziabili solo a livello di geni SecY e rpS3. La
situazione in questo caso vede la presenza di focolai epidemici per FD-C Piemonte/
Lombardia oltre che in queste regioni, anche nella parte nord-orientale della Toscana
dove il ceppo è in fase di espansione verso sud ed è stato rilevato in casi sporadici
anche in provincia di Siena. Il ceppo FD-C Treviso è risultato ancora presente con
una certa consistenza nella regione Veneto ed in particolare nella provincia di Treviso,
anche se si sono avuti sporadici casi in provincia di Venezia. Questo ceppo è risultato
presente in maniera consistente anche se non in forma epidemica in Romagna
268
(province di Ravenna e Forlì) e sporadicamente in Toscana. Interessante è evidenziare
che questo tipo di FD-C fuori dal Veneto è stato individuato principalmente in vitigni
di Sangiovese.
Si è riscontrata inoltre la presenza di ceppi FD-C differenziabili da questi due
in alcune aree viticole del Veneto, della provincia di Piacenza (Botti e Bertaccini,
2004) ed in Franciacorta. Presenza di ceppi di FD-C molto variabili nei geni SecY e
rpS3 si è riscontrata anche nella Toscana nord orientale in piante sporadiche (Botti e
Bertaccini, 2006). In provincia di Novara e Asti si sono inoltre individuati ceppi di
FD-C con profili secY e rpS3 molto simili a quelli del ceppo di riferimento FD70 che
pare non più presente nelle coltivazioni francesi (Martini et al., 2002).
I risultati di questa indagine poliennale confermano che il patogeno responsabile
della flavescenza dorata ha un genoma in grado di modificarsi nel giro di pochi anni
portando alla comparsa di ceppi con capacità infettiva diversificata che possono
essere evidenziati con i marcatori molecolari impiegati: è quindi possibile distinguere
le piante infette da ceppi epidemici della malattia da quelle in cui sono presenti ceppi
con ridotte potenzialità di diffusione epidemica. Risulta molto importante effettuare
il monitoraggio verificando il tipo di ceppo di FD per ridurre, ove possibile, i
trattamenti a Scaphoideus titanus Ball del quale è stata finora accertata la capacità di
trasmettere FD-D e FD-C Treviso (Mori et al., 2002); d’altronde quest’ultimo ceppo
è l’unico finora identificato in una specie diversa dalla vite ((Angelini et al., 2004).
Questo ritrovamento indica la capacità di FD-C Treviso di colonizzare nuove nicchie
ecologiche che si associa alla ipotesi già avanzata che fitoplasmi dello stesso gruppo
ribosomico possano passare a vite da altre specie (Angelini et al., 2001) rendendo la
problematica relativa a FD più complessa da affrontare.
Parole chiave: Flavescenza dorata, Ceppi, Epidemiologia, Diagnosi.
Molecular characterization of “Flavescence dorée” strains detected in Italy
from 2004 to 2008
During the research project Gia.Vi. the molecular characterization of
‘flavescence dorée’ (FD) strains was carried out in the Italian regions where the
epidemic was reported as well as in the regions in which the phytoplasma was
detected during this research. Restriction fragment length polymorphism analyses
(RFLP) on 16S ribosomal gene carried out by TaqI restriction enzyme to differentiate
FD-D from FD-C strains (Martini et al., 1999), and on SecY and rpS3 genes with
diverse restriction enzymes according to the amplicons (Martini et al., 2002; Botti e
Bertaccini, 2007) were performed. FD strains from Piemonte, Liguria, Valle d’Aosta,
Lombardia, Emilia-Romagna, Veneto, Trentino, Friuli, Toscana and Umbria were
characterized.
269
Discrimination between FD-D and FD-C strains was carried out on about 250
grapevine samples: geographical distribution of the two strains confirmed that FDD, the most virulent strain, first described associated with the epidemic outbreaks in
Veneto region in the middle of the ‘90thies, was present in some Piemonte provinces,
in Friuli, in Lombardia, in Emilia and more recently in Romagna (Ravenna province),
besides in Veneto regions. In one case it was also found in Valle d’Aosta.
Regarding FD-C two types were described: Treviso and Piemonte/Lombardia
types distinguished only on SecY and rpS3 genes. Epidemic foci of FD-C Piemonte/
Lombardia type were detected in these regions besides in the north-western part of
Tuscany where this phytoplasma is moving toward south and it was sporadically
detected also in Siena province. FD-C Treviso type was still detected in Veneto
region, mainly in Treviso province, even if scattered plants were also found in Venezia
province. This FD-C type was also detected in a consistent number of samples even
if not in epidemic phase in Romagna (Ravenna and Forlì provinces) as well as in
Toscana. It is interesting to underline that this FD-C type outside of Veneto region was
mainly detected in Sangiovese grapevines.
The scattered presence of FD-C types that could be differentiated from the
two above described was detected in Veneto, in Piacenza province (Botti e Bertaccini,
2004) as well as in Franciacorta. FD-C types quite variable on SecY and rpS3 genes
were also found in north-western Toscana in scattered plants (Botti and Bertaccini,
2006). In Novara and Asti provinces FD-C showing secY and rpS3 RFLP profiles
similar to those of reference strain FD70 not anymore present in French vineyards
(Martini et al., 2002) were also detected.
Results of this survey carried out for several years allow confirming that FD
phytoplasmas are able to change some genomic features in a few years producing
strains with different pathogenic ability. Using the molecular markers described
above it is however possible distinguish between epidemic and non epidemic strains.
It is important to carry out the FD-surveys characterizing the strains to reduce, when
possibile, pesticide use against Scaphoideus titanus Ball for which ability to transmit
FD-D and FD-C Treviso was experimentally proved (Mori et al., 2002). The latter is
the only FD type detected in a plant species different from grapevine (Angelini et al.,
2004) and this finding open the question about FD phytoplasmas ability to colonize
new environments. This finding together with the hypothesis that phytoplasmas
belonging to the same ribosomal group could infect grapevine from other plant species
(Angelini et al., 2001) is giving the perspective that FD epidemiology will become
more puzzling and difficult to manage.
Key words: ‘Flavescence dorée’, Strains, Epidemiology, Detection.
270
Angelini E., D. Clair, M. Borgo, A. Bertaccini, E. Boudon-Padieu, 2001. Flavescence dorée in France and Italy - Occurrence of closely related phytoplasma
isolates and their near relationships to Palatinate grapevine yellows and an
alder yellows phytoplasma. Vitis, 40, 79-86.
Angelini E., F. Squizzato, G. Lucchetta, M. Borgo, 2004. Detection of a phytoplasma associated with grapevine “flavescence dorée” in Clematis vitalba L..
European Journal of Plant Pathology, 110, 193-201.
Botti S., A. Bertaccini, 2004. Flavescence dorée associated phytoplasmas: identification of molecular variants and epidemiological implications. 15th Congress
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Georgia, USA, 203: 122.
Botti S., A. Bertaccini, 2006. FD-related phytoplasmas and their association with
epidemic and non epidemic situations in Tuscany (Italy). XVth ICVG, Stellenbosch, South Africa, 3-7 April, 163-164.
Botti S., A. Bertaccini, 2007. Grapevine yellows in Northen Italy: molecular identification of Flavescence Dorée phytoplasma strains and of Bois Noir phytoplasmas. Journal of applied microbiology, 103, 2325-2330.
Martini M., E. Murari, N. Mori, A. Bertaccini, 1999. Identification and epidemic
distribution of two Flavescence dorée-related phytoplasmas in Veneto (Italy).
Martini M., S. Botti, C. Marcone, C. Marzachì, P. Casati, PA. Bianco, R. Benedetti,
A. Bertaccini. 2002, Genetic variability among Flavescence dorée phytoplasmas from different origins in Italy and France. Molecular and Cellular probes,
16 (3), 197-208.
Mori N., M. Martini, A. Bressan, M. Guadagnini, V. Girolami, A. Bertaccini. 2002.
Experimental transmission by Scaphoideus titanus Ball of two molecularly
distinct Flavescence dorée type phytoplasmas. Vitis, 41, 99-102.
271
.DIFFUSIONE
DI CEPPI DI LEGNO NERO IN
VIGNETI TOSCANI
S. Carnevale1, S. Paltrinieri2, P. Braccini1, D. Rizzo1, S. Nhadi2, 3, N. Contaldo2,
A. Bertaccini2
1
ARSIA – Regione Toscana, Via Pietrapiana, 30, I-50121 (FI)
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale Fanin 42, I-40127 (BO)
3
IAM, Valenzano, I-70010 (BA)
2
Il legno nero della vite (LN) è una fitoplasmosi presente in maniera endemica
in tutte le coltivazioni viticole del mondo. Recentemente in alcune aree di coltivazione
italiane ha mostrato una incidenza epidemica che sembra possa essere correlata alla
prevalente presenza di uno dei due ceppi del fitoplasma 16SrXII-A che si possono
distinguere mediante RFLP con l’enzima HpaII su amplificati del gene tuf (Langer e
Maixner, 2004; Bertaccini et al., 2006). Considerando le implicazioni epidemiologiche
che questo fenomeno sottintende (Mori et al., 2008) risulta importante individuare
quale sia il ceppo presente nelle aree viticole in cui la LN è diffuso per poter procedere
nel modo più appropriato al contenimento della sua diffusione con una corretta
gestione del vigneto. A questo scopo si è verificata la distribuzione dei due ceppi di
legno nero (tuf tipo I e tuf tipo II) nelle zone viticole più rilevanti della Toscana in cui
non è generalmente presente epidemia da LN in quanto la sintomatologia si mantiene,
specie per la varietà Sangiovese, intorno al 5%.
Durante il monitoraggio condotto nel 2007 per evidenziare la presenza di
flavescenza dorata sono stati analizzati 509 campioni sintomatici di vite, in grande
maggioranza della varietà Sangiovese; 375 campioni sono risultati infetti da LN a
seguito delle analisi molecolari di routine effettuate mediante nested PCR sul gene
ribosomico 16S (Botti e Bertaccini, 2007). Nei campioni risultati positivi a LN si
è proceduto alla amplificazione del gene tuf mediante PCR nested (Pasquini et al.,
2007). Solo 228 (61%) campioni sono risultati nuovamente positivi e l’analisi RFLP ha
permesso di evidenziare che il 10% di questi era infetto dal tipo tuf I, il 2% presentava
infezione mista di ceppi tuf tipo I e tuf tipo II e tutti gli altri erano infetti da tuf tipo II.
Si è comunque potuta evidenziare una distribuzione differente dei due ceppi in alcuni
comuni e/o località dove il campionamento è stato più intenso in quanto la presenza
di piante sintomatiche era più elevata.
In particolare in Sangiovese si sono riscontrate due situazioni interessanti
rispettivamente nel comune di Greve in Chianti località Lamole dove su un totale di
272
116 campioni 95 sono risultati positivi a LN. Solo il 36% di questi è stato riscontrato
positivo al gene tuf e il 62% è risultato infetto dal tipo tuf I, il 26% è risultato essere tipo
tuf II ed il 12% infetto da entrambi i ceppi. Nel limitrofo comune di Gaiole in Chianti
in località Panzano sui 95 campioni analizzati 88 sono risultati positivi a LN, l’89%
è risultato analizzabile sul gene tuf presentando il 97% di tipo tuf II ed il 3% di tipo
tuf I. Le due opposte situazioni sono associate a diverse condizioni pedoclimatiche ed
epidemiologiche in quanto Lamole è una località dal clima più fresco dove l’ortica è
sovente infeudata ai vigneti (R. Mazzilli, comunicazione personale) e Panzano mostra
prevalenza di convolvolo nelle zone circostanti i vigneti come in effetti avviene
comunemente in tutto il territorio viticolo toscano oggetto di questa indagine.
Parole chiave: Legno nero, Epidemiologia, Tipo tuf, Vite, Fitoplasmi.
Distribution of ‘Bois Noir’ strains in Tuscanian vineyards
Grapevine ‘bois noir’ (BN) is a phytoplasma disease endemically spread in
all grape growing areas worldwide. Recently it has shown and epidemic incidence in
some vineyards that seems to be related with predominance of one of the two strains
of 16SrXII-A phytoplasmas distinguishable by RFLP analyses with HpaII restriction
enzyme on tuf gene amplicons (Langer and Maixner, 2004; Bertaccini et al., 2006).
Taking in to account the epidemiological aspects connected with this phenomenon
(Mori et al., 2008) it is important to verify the identity of BN strains present in the
vineyards in order to devise the best disease management tools. Toward this objective
the distribution of BN tuf type I and tuf type II was determined in the most important
wine growing areas of Tuscany where no BN epidemic is present considering that
typical symptoms, especially for Sangiovese variety, are reported in about 5% of
plants.
During the survey carried out in 2007 to detect ‘flavescence dorée’ presence
509 symptomatic samples of grapevine were collected mainly from Sangiovese
variety; 375 samples resulted BN infected after molecular routine analyses carried
out by nested PCR on 16S ribosomal gene (Botti and Bertaccini, 2007). Samples
BN-positive were amplified again on tuf gene by nested PCR (Pasquini et al., 2007).
Only 228 (61%) samples were positive and after RFLP analyses the 10% resulted to
be infected by tuf type I, 2% showed mixed tuf type I and tuf type II infection while
all the other samples were infected by tuf type II. A diverse geographical distribution
of the two strains was observed in some locality where the sampling was very strong
since the symptomatic plant numbers was relevant.
In particular in Sangiovese variety two interesting situation were observed
respectively in Greve in Chianti locality Lamole where 116 samples were tested and
273
95 were BN positive the 36% of the BN-infected were reamplified with tuf gene.
Among those the 62% was tuf type I infected, the 26% was carrying tuf type II and the
12% was infected by both strains. In the nearby area of Gaiole in Chianti in locality
Panzano among the 95 samples tested 88 were BN positive; the 89% of those was also
tuf positive showing the 97% of tuf type II and the 3% of tuf type I. The two opposite
situations are associated with diverse environmental conditions since Lamole has a
cooler climate and nettle is very often present in vineyards (R. Mazzilli, personal
communication) while Panzano vineyards show the prevalence of bindweed as it
happens very often in all the viticultural areas monitored during this research.
Key words: ‘Bois Noir’, Epidemiology, Tuf type, Grapevine, Phytoplasmas.
Botti S., A. Bertaccini, 2007. Grapevine yellows in Northern Italy: molecular identification of Flavescence Dorée phytoplasma strains and of Bois Noir phytoplasmas. Journal of applied microbiology, 103, 2325-2330.
E. Torres, M. Conti, 2006. Diversity of 16SrXII phytoplasmas detected in
grapevine growing areas worldwide. XVth ICVG, Stellenbosch, South Africa,
3-7 April, 88-89.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of grapevine yellows associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP-analysis of non
ribosomal DNA. Vitis, 43, 191-199.
Mori N., F. Pavan, R. Bondavalli, N. Reggiani, S. Paltrinieri, A. Bertaccini, 2008.
Factors affecting the spread of “Bois noir” disease in north Italy vineyards.
Vitis, 47, 65-72.
Pasquini G., L. Ferretti, A. Gentili, B. Bagnoli, V. Cavalieri, M. Barba, 2007. Molecular characterization of stolbur isolates collected in grapevines, weeds and
insects in central and southern Italy. Bulletin of Insectology, 60, 355-356.
274
EPIDEMIOLOGIA E IDENTIFICAZIONE DEI FITOPLASMI
DEI Giallumi della vite in Calabria
L. Ferretti1, 4, G. Pasquini1, V. Cavalieri2, C. Rapisarda2, V. D’Urso3,
M. Barba1, G. Albanese4,
C.R.A. – Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale
Via C.G. Bertero, 22, I-00156 (RO)
2
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie (DISTEF),
Università di Catania, Via S. Sofia, 100, I-95124 (CT)
3
Dipartimento di Biologia animale “M. La Greca”, Università di Catania, Via
Androne, 81, I-95124 (CT)
4
Dipartimento di Gestione dei Sistemi Agrari e Forestali (GESAF),
Università Mediterranea di Reggio Calabria,
Loc. Feo di Vito, I-89060 (RC)
1
Dal 2004 è stata avviata un’indagine volta ad accertare la presenza di giallumi
della vite da fitoplasmi nelle principali aree viticole calabresi. Sono state rinvenute
piante di vite, appartenenti a varietà locali o a diffusione nazionale, con sintomi
ascrivibili a queste malattie. Le analisi molecolari, effettuate sul gene ribosomico 16S,
hanno consentito di stabilire che su viti infette sono presenti fitoplasmi appartenenti
al sottogruppo 16SrXII-A (Stolbur) e, solo sporadicamente, 16SrI-B (Western aster
yellows) (Albanese et al., 2005).
Al fine di approfondire le conoscenze sulla eziologia e sull’epidemiologia della
malattia, in alcuni vigneti sono state prelevate le più comuni piante spontanee annuali
e perenni ed insetti adulti appartenenti a differenti specie di Auchenorryncha.
In questa seconda fase della ricerca la caratterizzazione molecolare dei fitoplasmi
è stata eseguita analizzando la sequenza non-ribosomica del gene tuf. L’amplificazione
genica (PCR) diretta con gli oligonucleotidi fTufAY/rTufAY e la nested-PCR,
utilizzando i primer TufAYf2/TufAYr2, seguite da RFLP con l’endonucleasi HpaII
sono state effettuate come descritto da Pasquini et al. (2007). Il profilo ottenuto con
l’analisi RFLP dopo digestione con l’enzima HpaII ha permesso di distinguere gli
isolati tuf tipo I e tuf tipo II del fitoplasma 16SrXII-A, come precedentemente descritto
da Langer e Maixner (2004).
La caratterizzazione molecolare dei fitoplasmi individuati in campioni di
vite, provenienti da vigneti commerciali, ha evidenziato la sola presenza dell’isolato
tuf tipo II. Solo all’interno di due campi collezione di germoplasma viticolo è stata
rilevata anche la presenza dell’isolato tuf tipo I.
Il monitoraggio dell’entomofauna ha evidenziato la presenza di Hyalesthes
obsoletus Signoret e altre specie di cicaline (Exitianus capicola (Stål), Toya propinqua
275
(Fieber)) sempre prevalentemente associate a vegetazione spontanea di bordo.
Individui di Reptalus panzeri (Löw) sono stati, invece, spesso raccolti negli interfilari.
Le analisi molecolari hanno evidenziato la presenza dell’isolato tuf tipo II in tutti
gli individui di H. obsoletus (5/15) e R. panzeri (6/32) risultati positivi a Stolbur, in
accordo con l’isolato riscontrato nei relativi vigneti.
I rilievi sulla flora spontanea hanno evidenziato l’esclusiva presenza di
Convolvulus arvensis L. come specie riportata in letteratura ospite dello H. obsoletus,
mentre non è stata mai rilevata la presenza di ortica (Urtica dioica L.). I risultati delle
analisi molecolari effettuate sulle piante spontanee hanno evidenziato la presenza
dell’isolato tuf tipo II, oltre che in campioni di convolvolo, anche in elevata percentuale
in piante di Cirsium arvense (L.) Scop. (30/40) e Amaranthus retroflexus L. (3/7).
Parole chiave: Legno nero, Gene tuf, Vite, Vettori, Spontanee.
Epidemiology and identification of grapevine yellows phytoplasmas in Calabria
Since 2004 an investigation on phytoplasma grapevine yellows diseases has
been carried out in the main vines areas of Calabria (Italy). Plants of different varieties
with symptoms referable to these diseases were detected and molecular analysis,
accomplished on ribosomal 16S gene, showed that on affected grepevines 16SrXII-A
(Stolbur) and, very rarely, 16SrI-B (Western aster yellows) phytoplasmas were present
(Albanese et al., 2005).
In order to get deeper insights about etiology and epidemiology of the disease,
in some vineyards the most common perennial and annual weeds and adult insects
were collected.
In this second step of research, phytoplasma molecular characterization was
performed analyzing the non-ribosomal sequence of the tuf gene. Direct PCR with
primer pair fTufAY/rTufAY and nested amplification utilizing TufAYf2/ TufAYr2
primers, followed by RFLP with HpaII endonuclease were performed as suggested by
Pasquini et al. (2007). The RFLP pattern allowed to distinguish tuf type I and tuf type
II isolates, as previously described by Langer and Maixner (2004).
The molecular characterization of phytoplasmas detected in grapevine samples
collected from commercial vineyards showed that all isolates belong to tuf type II,
whereas in two monitored germplasm collection fields both types were detected.
Hyalesthes obsoletus Signoret individuals and other planthoppers (Exitianus
capicola (Stål), Toya propinqua (Fieber)) were mainly found in the edge vegetation.
Whereas Reptalus panzeri (Löw) specimens were frequently captured in the interrows.
Molecular analysis showed the presence of tuf type II in all H. obsoletus (5/15) and R.
276
panzeri (6/32) individuals affected by 16SrXII-A phytoplasma, according to the type
identified in grapevine samples coming from the same vineyards.
Field survey on weeds showed the exclusive presence of Convolvulus arvensis
L., reported as H. obsoletus host, whereas nettle (Urtica dioica L.) was never found.
Molecular analysis revealed the presence of tuf type II isolate other that in bindweed,
also in high percentage in Cirsium arvense (L.) Scop. (30/40) and Amaranhus
retroflexus L. (3/7) samples.
Key words: Bois noir, Tuf gene, Grapevine, Vectors, Weeds.
Albanese G., G. Pasquini, L. Ferretti, R. Sciarroni, R. La Rosa, M. Barba, 2006.
Identificazione molecolare di fitoplasmi in viti affette da giallumi in Calabria.
Informatore fitopatologico, 56 (4), 39-43.
and insects in central and southern Italy. Bulletin of insectology, 60, 355-356.
277
Prime segnalazioni di flavescenza dorata in
Valle d’Aosta e indagini sulla sua diffusione
R. Bonfanti, F. Guglielmo, F. Prosperi, E. Junod,
S. Dallou e R. Grivon
Ufficio Servizi Fitosanitari Regione Autonoma Valle d’Aosta
Loc. Grande Charrière, 66, I-11020 Saint-Christophe (AO)
Nell’estate del 2006, durante il monitoraggio volto a rilevare la presenza di
flavescenza dorata (FD), è stato segnalato il primo caso di vite infetta da “Candidatus
Phytoplasma vitis” in Valle d’Aosta. La pianta malata, una barbatella impiantata nel
mese di aprile del medesimo anno, è stata rinvenuta nel comune di Arvier in un impianto
di Petit Rouge, tipico vitigno autoctono. Essa proveniva da un lotto moltiplicato nel
2004 in un vivaio situato fuori dal territorio della Valle d’Aosta e frigoconservato
per 1 anno. A seguito di questo ritrovamento, oltre all’applicazione a livello regionale
del decreto di lotta obbligatoria a FD e al suo vettore Scaphoideus titanus Ball., è
stato svolto un controllo su tutte le viti di uguale provenienza con il duplice scopo
di indagare sulle possibili cause dell’introduzione di questa fitopatia e di valutarne
precocemente la diffusione nell’areale vitivinicolo valdostano.
I monitoraggi hanno riguardato sia il campo di piante madri (sito in Valle
d’Aosta), dal quale erano state prelevate le gemme usate per la produzione del lotto di
barbatelle cui è riconducibile la pianta infetta, sia 51 impianti di vite (comprendenti
circa 25000 ceppi di Petit Rouge e 12000 ceppi di Fumin), ottenuti da lotti di barbatelle
moltiplicate nel 2004 e nel 2005 nello stesso vivaio di provenienza della pianta infetta
nonché in un secondo vivaio che ha utilizzato gemme originarie dello stesso campo
madre. Durante i controlli svolti nel 2006 e nel 2007 sono stati raccolti separatamente
campioni fogliari da tutte le viti con sintomi di giallume. La diagnosi molecolare
basata su PCR nested (Marzachì e Boarino, 2002) è stata utilizzata per individuare
la presenza di fitoplasmi all’interno di tali campioni e per distinguere “Candidatus
Phytoplasma vitis” da “Candidatus Phytoplasma solani”, agente del legno nero
(LN), malattia endemica della vite con sintomi analoghi a FD e già presente in Valle
d’Aosta.
Durante i controlli nel campo di piante madri, dove peraltro la presenza
di Scaphoideus titanus è stata bassissima nel 2006 e nulla nel 2007, sono state
rinvenute 11 viti sintomatiche, nessuna delle quali, però, infetta da FD. Nel 2006, dal
monitoraggio degli impianti di barbatelle ottenute dallo stesso vivaio di provenienza
della pianta infetta, sono stati rinvenuti 26 ceppi di Petit Rouge sintomatici, dei quali
278
12 risultavano infetti da FD. Tali ceppi, reperiti in 5 diversi comuni e provenienti
da 4 diversi lotti, sono stati immediatamente estirpati. Nel 2007, dal controllo nei
medesimi impianti, non sono più state segnalate piante infette da FD, ad eccezione di
1 ceppo di Petit Rouge, situato nel comune di Sarre. Dai controlli sui ceppi di Fumin e
su barbatelle provenienti dal secondo vivaio non è emersa alcuna pianta infetta. Dalle
analisi svolte presso l’Istituto di virologia vegetale del CNR di Torino e l’Istituto
Sperimentale per la Viticoltura di Conegliano Veneto, sono stati individuati entrambi
i sottogruppi di FD comuni nel nord Italia, 16SrV-C e 16SrV-D (Lee et al., 2000),
rispettivamente in 10 e 1 dei campioni risultati infetti.
Dai risultati ottenuti finora si può ipotizzare che l’infezione, per quanto
limitata, sia avvenuta nel vivaio di provenienza delle barbatelle infette. I controlli
svolti dagli organi competenti hanno tuttavia escluso la presenza di vettori e portainnesti infetti da FD nel vivaio in questione. L’accurato monitoraggio, combinato
all’estirpo tempestivo delle piante malate, ha permesso comunque di rallentare o,
nella migliore delle ipotesi, bloccare la diffusione della malattia.
First report of “flavescence dorée” in Aosta valley and study on its spread
In summer 2006, during the annual survey for “flavescence dorée” (FD),
grapevine infected by “Candidatus Phytoplasma vitis” was first recorded in the
country of Aosta valley. The diseased vine was a grafted “Petit Rouge”, a native
variety, planted in April 2006 in Arvier and obtained in 2004 from a nursery outside
the Aosta valley. After this finding, in addition to the application of the decree of
mandatory control against FD and its vector Scaphoideus titanus Ball., a survey on
vines with the same origin of the diseased one has been performed to understand
possible causes of FD introduction, as well as to early assess and limit its spread in
Aosta valley vineyards.
Both mother plants plot (located in Aosta valley), where propagating materials
had been taken to produce the Lot of the diseased vine, and 51 vineyards (including
about 25000 vines “Petit Rouge and 12000 “Fumin”), obtained from the Lots of
grafted vines propagated in 2004 and 2005 from the same nursery of the diseased
vine as well as from a second nursery that used the propagating materials of the same
mother plant plot, have been investigated. During 2006 and 2007 foliar samples have
been taken from vines with yellows symptoms. Molecular detection based on nested
PCR (Marzachì and Boarino, 2002) was employed for the diagnosis of “Candidatus
Phytoplasma vitis”.
Although 11 symptomatic plants have been found in mother plant plot, no
vines infected by FD have been detected. In 2006, during the survey performed on
vineyards with grafted vines taken from the same nursery of the diseased vine, 12
279
plants, within 26 symptomatic vines “Petit Rouge” analysed, resulted infected by FD.
These plants, collected in 5 different areas and belonging to 4 Lots, were immediately
extirpated. In 2007, in the same vineyards, only one plant infected by FD was detected
in Sarre. No diseased plants were found in vineyards with “Fumin” and with vines
belonging to the second nursery. From the analysis performed at the plant virology
institute of CNR of Turin and at experimental institute for vine of Conegliano Veneto,
both subgroups of FD commonly present in north Italy, 16SrV-C e 16SrV-D (Lee et
al., 2000), were detected in 10 and 1 of the infected plants, respectively.
The results obtained in this work suggest infection, even if restricted, had
occurred in the nursery of provenance of the diseased plant. Nevertheless, neither
vectors nor rootstocks infected by FD were found during inspections in this nursery.
However, this accurate survey, as well as the early eradication of diseased plants,
allowed to limit the spread of this epidemic grapevine disease.
Lee IM., DE. Gundersen, RW. Hammond, R.E. Davis, 1994. Use of mycoplasmalike organism (MLO) group specific oligonucleotide primers for nested-PCR
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Lee IM., RE. Davis, DE. Gundersen-Rindal, 2000. Phytoplasma: Phytopathogenic
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Marzachì C., A. Boarino, 2002 - Diagnosi molecolare delle malattie da fitoplasmi
della vite. Informatore Fitopatologico, 52 (10), 36-41.
280
Monitoraggio ed epidemiologia dei giallumi
della vite in Sicilia
R. La Rosa1, C. Rapisarda1, V. Cavalieri1, D. Pacifico2, M. Tessitori1
DISTEF - Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie, Facoltà Agraria,
Università degli Studi di Catania, Via S. Sofia 100, I-95123 (CT)
2
IVV, CNR Sede di Torino, Strada delle Cacce 73, I-10135 (TO)
1
In Sicilia nel triennio 2005-2007 sono state ispezionate, per il rilievo di sintomi
ascrivibili a giallumi (GY, Grape yellows) e della fauna ad Auchenorrinchi potenziali
vettori di GY, circa 20 aziende viticole localizzate nelle Province di Catania, Ragusa,
Siracusa, Caltanissetta, Palermo, Trapani e nelle quali sono coltivate diverse varietà di
vite. Nel corso delle ispezioni i giallumi sono stati osservati prevalentemente in piante
della cv. Chardonnay ma anche di Nero d’Avola, Inzolia e Cabernet Sauvignon. In
un vigneto di Chardonnay (Caltagirone), monitorato sistematicamente ogni anno, si è
notato un incremento dei sintomi pari a circa il 10%.
Le analisi molecolari dei campioni prelevati nei diversi vigneti per
l’accertamento dell’eziologia dei giallumi, effettuate mediante PCR diretta e nestedPCR (Lee et al., 1994), hanno mostrato la presenza di fitoplasmi appartenenti a legno
nero (LN) (Stolbur, gruppo16SrXII-A) in 57, su un totale di 159 analizzati, campioni
di viti sintomatiche appartenenti alle cv Chardonnay, Nero d’Avola, Inzolia, Cabernet
Sauvignon e Nerello mascalese; la cv. Chardonnay, ed in particolare in piante allocate
in vecchi vigneti, si è dimostrata quella maggiormente soggetta ad infezioni di LN. In
nessun campione analizzato in nested-PCR con gli oligonucleotidi del gruppo 16Sr-V
(FD, Flavescenza dorata), è stato individuato il fitoplasma responsabile di Flavescenza
dorata. Isolati di LN sono stati caratterizzati tramite analisi RFLP ed analisi SSCP
sulla sequenza parziale del gene tuf 5 (Schneider et al., 1997; Langer e Maixner,
2004). Tali campioni sono risultati uguali tra loro e con un profilo indistinguibile da
quello caratteristico del fitoplasma Stolbur (16SrXII-A) isolato in Serbia da peperone
(RFLP: VKII; SSCP:a). Una più approfondita caratterizzazione dei suddetti isolati,
effettuata tramite lo studio del polimorfismo del gene stol1H10 (Pacifico et al., 2006),
ha consentito di confermare l’appartenenza degli isolati siciliani al gruppo VK-II e di
differenziarli nei pattern V2, V4 e V9.
I rilievi entomologici hanno consentito di catturare 438 esemplari di
insetti afferenti a 38 specie di 4 famiglie (Cercopidae, Cicadellidae, Delphacidae,
Dictyopharidae); la maggior parte delle specie (31 su 38) appartenevano alla famiglia
Cicadellidae e, tra le specie con il più alto numero di esemplari catturati, si annoverano
281
Exitianus capicola Stål, Empoasca sp. e Zyginidia lineata (Lindberg). In Scaphoideus
titanus Ball, vettore noto di flavescenza dorata (FD) e sul DNA estratto da esemplari
rappresentativi delle specie individuate (PCR diretta e nested-PCR) (Lee et al., 1994)
hanno consentito di evidenziare la presenza di fitoplasmi identificabili, anche in questo
caso, come Stolbur (16SrXII-A).
Dai risultati ottenuti emerge come le ampelopatie associate al fitoplasma
Stolbur (16SrXII-A, tuf type-II) siano ampiamente diffuse nei vigneti siciliani affetti
da giallumi, così come molti Auchenorrinchi suoi potenziali vettori, assente è, a
tutt’oggi, il fitoplasma associato alla Flavescenza Dorata (FD, 16SrV) così come il
suo unico vettore S. titanus.
Parole chiave: LN, FD, Auchenorrinchi.
Monitoring and epidemiology of grape yellows in Sicily
During 2005-2007 about 20 grapevine vineyards of Catania, Ragusa, Siracusa,
Caltanissetta, Palermo and Trapani provinces, where different grape cv. or selections
are grown, were surveyed for grapevine yellows (GY) symptoms and Auchenorrhyncha
diffusion. GY have been observed mainly on cv. Chardonnay and also on Nero
D’Avola, Inzolia and Cabernet Sauvignon. In a Chardonnay vineyard (Caltagirone),
systematically monitored each year, a symptoms increasing of~10% has been found.
Direct PCR analyses followed by nested-PCR (Lee et al., 1994) of 57, out of a
total of 159 analyzed, DNA-samples collected from different vineyards showed LN
(Stolbur, 16Sr XII-A) presence on symptomatic Chardonnay, Nero d’Avola, Inzolia,
Cabernet Sauvignon and Nerello mascalese cv, whereas in any sample the Flavescence
dorèe (FD) phytoplasma has been detected by using in nested-PCR 16Sr-V specific
oligonucleotides; Chardonnay cv, especially grape plants grown in old vineyards,
is more LN-affected. LN isolates have been further characterized by RFLP and
SSCP analyses of a partial tuf 5 gene sequence (Schneider et al., 1997; Langer and
Maixner, 2004). These samples showed an identical HpaII profile corresponding to
that of the Stolbur isolate obtained from pepper in Serbia (RFLP: VKII; SSCP:a).
A more deep molecular characterization of the same isolates, done by the stol1H10
gene polymorphysm study (Pacifico et al., 2006), allowed to confirm that the Sicilian
Stolbur isolates belong to tuf type-II, patterns V2, V4 and V9.
Entomological surveys allowed to collect 438 samples of insects belonging
to 38 species of 4 families (Cercopidae, Cicadellidae, Delphacidae, Dictyopharidae);
many of them (31 out of 38) belong to the family Cicadellidae and, among the others,
Exitianus capicola Stål, Empoasca sp. and Zyginidia lineata (Lindberg) are recorded.
Scaphoideus titanus Ball, well-known Flavescence dorèe (FD) vector, have been never
282
detected. Molecular analyses of DNA extracted from insect samples of detected species
(PCR and nested-PCR) (Lee et al., 1994) showed phytoplasma belonging, also in this
case, to Stolbur (16SrXII-A).
Obtained results show that Stolbur-associated GY (16SrXII-A, tuf type-II),
as well as potentially-vectors Auchenorrhyncha but not H. obsoletus, are spread in
Sicilian vineyards; until now FD phytoplasma and S. titanus Ball are absent.
Key words: LN, FD, Auchenorrhyncha.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterization of grapevine yellows associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RELP-analysis of nonribosomal DNA. Vitis 43, 191-199.
Lee I. M., DE. Gundersen, RW. Hammond, RE. Davis, 1994. Use of Micoplasma like
organism (MLO) group specific oligonucleotide primers for nested-PCR assay
to detect mixed MLO infections in a single host plant. Phytopathology, 84 (6),
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Pacifico D., A. Cimerman, C. Marzachì, X. Foissac , 2006. Genetic diversity of stolbur phytoplasmas assessed by PCR-RFLP and sequencing of a non ribosomal
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Schneider B., KS. Gibb, E. Seemüller, 1997. Sequence and RFLP analysis of the
elongation factor Tu gene used in differentiation and classification of phytoplasmas. Microbiology 143, 3381-3389.
283
LEGNO NERO DELLA VITE NELLE MARCHE
G. Romanazzi, S. Murolo
La Flavescenza dorata (FD) e il Legno nero (LN) sono le fitoplasmosi della
vite in grado di determinare le maggiori perdite economiche. FD è un patogeno da
quarantena, presente in diverse regioni dell’Italia centro-settentrionale (Bianco et al.,
2002) e trova il suo limite meridionale di diffusione nelle Marche nella provincia di
Ascoli Piceno (Romanazzi et al., 2007). LN, causato da fitoplasmi appartenenti al
gruppo dello stolbur (sottogruppo 16SrXII-A) è ampiamente diffuso nelle principali
aree viticole della penisola (Bianco et al., 2002) inclusa la regione Marche (Romanazzi
et al., 2007). Recenti studi di caratterizzazione molecolare hanno permesso di
distinguere, all’interno del sottogruppo 16SrXII-A, tre isolati (VK-I, VK-II e VK-III)
sulla base dell’analisi del gene tuf (Langer e Maixner, 2004). Indagini preliminari
condotte nella regione hanno evidenziato la presenza di isolati VK-I e VK-II (Quaglino
et al., 2007). Inoltre, la presenza di tali agenti è stata riscontrata nel vettore Hyalesthes
obsoletus Signoret e altri potenziali vettori di LN (Riolo et al., 2006, 2007).
Obiettivo del lavoro è stata la caratterizzazione molecolare di fitoplasmi
associati ai giallumi della vite nelle Marche.
Le indagini hanno riguardato 51 campioni di vite provenienti da 4 siti, due
nella provincia di Ancona (Castelferretti e Osimo) e 2 in quella di Ascoli Piceno
(Petritoli e Carassai). I campioni fogliari sono stati sottoposti all’estrazione del
DNA totale mediante il Kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany), a cui è seguita l’amplificazione con i primer universali e gruppo-specifici.
La differenziazione molecolare all’interno del sottogruppo 16SrXII-A è stata effettuata
sui campioni risultati positivi al fitoplasma amplificando un frammento del gene tuf
mediante due coppie di primer (fTuf1/rTuf1 e fTufAY/rTufAY) in nested-PCR. Gli
ampliconi fTufAY/rTufAY ottenuti sono stati sottoposti ad analisi CAPs condotta
mediante l’impiego dell’enzima di restrizione HpaII (Langer e Maixner, 2004).
Le indagini biomolecolari hanno consentito di verificare la presenza di
fitoplasmi dello stolbur nel 56% dei campioni analizzati. In particolare, la maggior
parte dei campioni (26) presentava infezioni da VK-II, riscontrate anche su piante di
Convolvolus arvensis L. raccolte nei vigneti oggetto di indagine in prossimità di viti
sintomatiche. Infezioni di VK-I sono state riscontrate in una pianta di Montepulciano
284
a Castelferretti e due piante di Sangiovese a Carassai. Nella regione sono sempre
più frequenti fenomeni di diffusione del LN, in parte compensati dalla remissione
spontanea dei sintomi, i cui meccanismi d’azione, le cause predisponenti, l’incidenza
e la stabilità nel tempo sono tuttora oggetto di studio (Maixner, 2006).
Parole chiave: Vitis vinifera, Gene tuf, PCR-RFLP, VK-I, VK-II.
Molecular characterization of grapevine Bois noir isolates in the Marche region
Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) are the grapevine yellows that can
induce the most severe economic losses. FD is a quarantine disease that has spread in
several regions of central and northern Italy (Bianco et al., 2002), reaching its most
southern location in the Province of Ascoli Piceno, in the Marche region (Romanazzi
et al., 2007). BN, caused by phytoplasma that belong to the stolbur group (16SrXIIA), is widely spread in the main Italian viticultural areas (Bianco et al., 2002) and it
is the most common phytoplasma disease in the Marche region (Romanazzi et al.,
2007). Recently, three different subgroup 16SrXII-A isolates (VK-I, VK-II, and VKIII) were identified through molecular characterization of the tuf gene (Langer and
Maixner, 2004). Preliminary analyses have shown the presence in the same region of
VK-I and VK-II isolates (Quaglino et al., 2007). Moreover, these agents have been
detected in Hyalesthes obsoletus Signoret and in other potential BN vectors (Riolo et
al., 2006, 2007).
The aim of the present study is the molecular characterization of the
phytoplasma associated with grapevine yellows in Marche vineyards.
Fifty-one leaf samples from grapevines with yellows symptoms were
harvested in four locations, two in the Province of Ancona (Castelferretti and Osimo)
and two in the Province of Ascoli Piceno (Petritoli and Carassai). Total DNA was
extracted using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and amplified
with universal and group-specific primers. The amplification with nested-PCR of
the tuf gene by two primer pairs (fTuf1/rTuf1 and fTufAY/rTufAY) allowed us to
investigate the molecular diversity within the 16SrXII-A group. The fTufAY/rTufAY
amplicon was digested with the HpaII restriction enzyme by CAPs analysis (Langer
and Maixner, 2004).
The molecular assays led to the detection of stolbur phytoplasma in 56% of
the samples analyzed. In particular, most of the samples (26) were infected by VK-II,
as were Convolvulus arvensis L. plants collected close to the symptomatic vines in
the same vineyards. VK-I infections were recorded in one vine cv Montepulciano at
Castelferretti, and in two plants cv Sangiovese at Carassai. In the Marche region, BN
285
infections are becoming more and more widespread, which are partially balanced by
the recovery of symptomatic plants, whose mechanisms of action, predisposing factors,
incidence and stability over time need to be better investigate (Maixner, 2006).
Key words: Vitis vinifera, tuf gene, PCR-RFLP, VK-I, VK-II.
Bianco PA., R. Osler, M. Barba, 2002. I giallumi della vite: evoluzione delle malattie
dalla loro comparsa in Italia. Petria, 12, 399-404.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of Grapevine yellows associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP-analysis of nonribosomal DNA. Vitis, 43, 191-200.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved questions. Extended Abstracts 15th Meeting of the International Council for the
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Africa, 86-88.
Quaglino F., G. Romanazzi, A. Zorloni, P. Casati, S. Murolo, G. Durante, PA. Bianco, 2007. Molecular characterization of phytoplasmas associated to grapevine
Bois Noir. Italus Hortus, 14, 218-220.
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Romanazzi G., S. Murolo, F. Terlizzi, S. Talevi, G. Stimilli, V. Savino, 2007. Fitoplasmi associati ai giallumi della vite nelle Marche. Informatore Fitopatologico, 57 (4), 48-50.
Marche e del PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da Legno nero e ricerca di mezzi
286
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI ISOLATI
PUGLIESI DI LEGNO NERO DELLA VITE
M.R. Silletti1, S. Murolo2, G. Romanazzi2, V. Savino1,3
Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura Basile Caramia (CRSA),
Via Cisternino 281, I-70010 Locorotondo (BA)
2
3
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata
Università degli Studi di Bari, Via Amendola, 165/A, I-70126 (BA)
1
La Puglia produce circa un terzo del vino italiano. La zona viticola più
interessante è presente nelle province di Taranto, Brindisi e Lecce, dove il clima è
particolarmente favorevole. La vite è soggetta a diverse problematiche fitosanitarie,
tra le quali le malattie causate da virus e fitoplasmi hanno una notevole incidenza sia
sugli spetti quantitativi sia su quelli qualitativi della produzione (Martelli e Boudon
Padieu, 2006). In particolare, il Legno nero (LN) ampiamente diffuso in tutta la
penisola e le isole (Bianco et al., 2002) e la Flavescenza dorata (FD), organismo da
quarantena localizzato nell’Italia centro-settentrionale, con limite meridionale nelle
Marche (Bianco et al., 2002; Romanazzi et al., 2007), sono le due fitoplasmosi più
temute dai viticoltori per le perdite di produzione causate e la rapidità di diffusione.
Sempre più frequenti sono i casi di giallumi o arrossamenti dei lembi fogliari ascrivibili
a fitoplasmi, dopo il primo monitoraggio effettuato nella penisola salentina (sud-est
della Puglia) nei primi anni ‘90, quando già era possibile registrare in alcuni vigneti
delle varietà Primitivo e Negramaro incidenze di malattia intorno al 30% (Di Terlizzi
et al., 1994).
Obiettivo del lavoro è la caratterizzare molecolare di fitoplasmi associati a
campioni con sintomi di giallume provenienti da vigneti particolarmente interessati
da tali malattie.
Sono stati analizzati 52 campioni provenienti da vigneti localizzati nei comuni
di Alberobello (BA), Monopoli (BA), Cisternino (BR), Mottola (TA) e Manduria (TA).
Dai campioni sintomatici sono state prelevate le nervature fogliari, dalle quali è stato
estratto il DNA totale mediante il kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,
Hilden, Germania). Il DNA totale è stato amplificato con i primer universali P1/P7 e in
nested-PCR con le coppie di primer gruppo-specifiche R16(I)F1/R1, R16(III)F1/R1
e R16(V)F1/R1. Una ulteriore caratterizzazione molecolare all’interno dei fitoplasmi
appartenenti al gruppo ribosomale 16SrXII-A è stata effettuata amplificando il gene
tuf in nested-PCR (fTuf1/rTuf1 e fTufAY/rTufAY) e digerendo l’amplificato con
l’enzima HpaII (Langer e Maixner, 2004).
287
Le analisi molecolari hanno evidenziato infezioni di fitoplasmi nella metà
circa dei campioni analizzati. Tutti i campioni positivi sono risultati infetti dallo
stolbur. Non sono state riscontrate infezioni di fitoplasmi appartenenti ai gruppi
16SrI, 16SrIII e 16SrV. La caratterizzazione molecolare degli isolati di stolbur ha
evidenziato l’appartenenza di tutti gli isolati al VK-II. Ciò è da ascrivere alla flora
erbacea spontanea presente in Puglia, ove l’ortica è rara o assente ai bordi dei vigneti,
mentre è comune il convolvolo, prevalentemente infetto dai ceppi VK-II (Langer e
Maixner, 2004), utilizzato dal vettore Hyalesthes obsoletus Signoret come serbatoio
del fitoplasma.
Parole chiave: Vitis vinifera, Stolbur, Nested-PCR, PCR-RFLP, VK-II.
Molecular characterization of grapevine Bois noir isolates in Apulia,
south-eastern Italy
Apulia accounts for about one third of Italian wine production. The most
interesting viticultural areas include the Provinces of Taranto, Brindisi and Lecce,
where the climatic conditions are particularly propitious for grapevine cultivation.
However, grapevine is affected by several diseases, among which virus and
phytoplasma disorders can have a negative impact on the quantity and the quality of
wine production (Martelli and Boudon Padieu, 2006). In particular is Bois noir (BN)
widely spread through all regions of the Italian peninsula and in the islands (Bianco et
al., 2002) and Flavescence dorée (FD) is a quarantine organism that has been located
in central and northern Italy, with the most southern locations in Marche (Bianco et al.,
2002; Romanazzi et al., 2007). These are the two phytoplasma diseases that are most
feared by grapevine growers due to losses of production and rapidity of their spread.
The yellowing and reddening of grapevine leaves, which is typical of phytoplasma
infections, is becoming more and more frequent, as was seen in the first survey carried
out in the Salento peninsula (south-eastern Apulia) at the beginning of the 1990s,
when disease incidence reached 30% in some cvs Primitivo and Negramaro vineyards
(Di Terlizzi et al., 1994).
The objective of the current work was the molecular characterization of
phytoplasma associated with symptomatic grapevine samples collected in vineyards
that are particularly affected by the disease.
Forty-one leaf samples were analysed, coming from vineyards in Alberobello
(BA), Monopoli (BA), Cisternino (BR), Mottola (TA) and Manduria (TA). The main
veins were excised from symptomatic samples, and their total DNA was extracted
using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The samples were
then amplified with the P1/P7 universal primers and nested-PCR was carried out
288
with group-specific primers: R16(I)F1/R1, R16(III)F1/R1 and R16(V)F1/R1. Further
molecular characterization within phytoplasma belonging to 16SrXII-A was carried
out by amplifying the tuf gene in nested-PCR (fTuf1/rTuf1 and fTufAY/rTufAY)
and digesting the amplicon with the restriction enzyme HpaII (Langer and Maixner,
2004).
The molecular analyses showed phytoplasma infections in about half of the
samples analyzed. All of the positive samples were infected by stolbur. No group 16SrI,
16SrIII or 16SrV phytoplasma were detected. The molecular characterization of the
stolbur isolates revealed VK-II infections. These results can be explained according
to the spontaneous herbaceous flora composition in Apulia, where Urtica dioica is
not common in the vineyards, while Convolvulus arvensis is frequently found, and it
can be infected with VK-II (Langer and Maixner, 2004); it also serves as an inoculum
source for the vector Hyalesthes obsoletus Signoret.
Key words: Vitis vinifera, Stolbur, Nested-PCR, PCR-RFLP, VK-II.
Martelli GP., E. Boudon Padieu, 2006. Updated directory of major viruses and viruses-like diseases of grapevine. Options Méditerranéens, ser. B, 55, 279 pp.
Di Terlizzi B., MA. Castellano, A. Alma, V. Savino, 1994. Present status of grapevine yellows in Apulia. Phytopathologia Mediterranea, 33, 125-131.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of Grapevine yellows associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP-analysis of nonribosomal DNA. Vitis, 43, 191-200.
Romanazzi G., S. Murolo, F. Terlizzi S. Talevi, G. Stimilli, V. Savino, 2007. Fitoplasmi associati ai giallumi della vite nelle Marche. Informatore Fitopatologico,
57 (4), 48-50.
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da
Legno nero e ricerca di mezzi innovativi per incrementare il fenomeno”.
289
DIAGNOSI DA SUCCO GREZZO DI DIVERSI
AGENTI PATOGENI DELLA VITE IN
TAQMAN® REAL-TIME RT-PCR
P. Margaria, M. Turina, S. Palmano
Istituto di Virologia Vegetale, CNR,
Strada delle Cacce, 73, I-10135 (TO)
L’attività di ricerca ha riguardato lo sviluppo di metodiche innovative per la
diagnosi delle principali malattie della vite associate a fitoplasmi, Flavescenza dorata
(FD) e Legno nero (LN), ed ai virus floematici Grapevine Leafroll associated Virus1 e -3 e Grapevine Virus A. L’utilizzo di metodiche di diagnosi rapide ed affidabili,
abbinate ad un costante monitoraggio della malattia, sono fondamentali per limitare
la diffusione delle infezioni, ma finora sono state basate su protocolli laboriosi e poco
applicabili su larga scala. Un metodo rapido per la diagnosi di agenti virali della vite
in RT-PCR da succo grezzo è stato recentemente pubblicato (Osman and Rowhani,
2006) e successivamente adattato in RealTime RT-PCR (Osman et al., 2007; 2008).
Analogamente, un protocollo rapido per la diagnosi della Flavescenza dorata mediante
RT-PCR dell’RNA ribosomale16S a partire da succo grezzo ottenuto da spremitura di
tessuto fogliare è stato recentemente descritto (Margaria et al., 2007). Nel caso dei
fitoplasmi, la scelta dell’RNA come templato permette di avvantaggiarsi dell’elevato
numero di copie di RNA ribosomale presente in una cellula viva rispetto alle sole due
copie del gene 16SrRNA presenti nel genoma (Schneider and Seemüller, 1994) ed
inoltre fornisce un‘indicazione indiretta dell’attività metabolica delle cellule.
In questo lavoro presentiamo un adattamento del metodo di diagnosi di
Flavescenza dorata utilizzando la Taqman® RealTime RT-PCR ed estendendolo anche
alla diagnosi del Legno nero. Si ha cosi ora a disposizione un metodo per la diagnosi
di agenti patogeni della vite di diversa natura, utilizzando come templato il medesimo
succo grezzo ottenuto da un singolo evento di estrazione iniziale. Oltre 200 campioni
sintomatici sono stati saggiati nella stagione 2007, diagnosticando sia infezioni singole
da fitoplasmi o virus, sia, in alcuni casi, infezioni miste.
Parole chiave: Flavescenza dorata; Legno nero; GLRaV-1; GLRaV-3; GVA
290
Multiple detection of several grapevine pathogens by
taqman® real-time RT-PCR assays from crude-sap extracts
Grapevine is one of the most important crops worldwide. Among grapevine
pathogens, phytoplasmas associated with grapevine yellows Flavescence dorée (FD)
and Bois noir (BN), and viruses are a serious threat in Europe, causing heavy economic
losses. Constant monitoring is fundamental for limiting the spread of infections. Osman
and Rowhani (2006) described a high-throughput method to screen grape samples for
virus infection by RT-PCR of the genomic RNA directly from crude extracts, and
Osman et al. (2007, 2008) improved this system using Real Time RT-PCR. Margaria
et al. (2007) developed a rapid RT-PCR protocol for Flavescence dorée detection from
leaf-extracts based on the phytoplasma 16SrRNA. For phytoplasma detection, using
RNA as template instead of DNA can take advantage of the high ribosomal-RNA copy
number compared to the two copies of the 16SrRNA gene present in the phytoplasma
genome (Schneider and Seemüller, 1994). Moreover, RNA detection allows indirect
evaluation of metabolically active cells. We now report improvement of the method
of Margaria et al. (2007) using Taqman® Real-Time RT-PCR to detect the 16SrRNA
of FD and also BN phytoplasmas. We have now used the same crude extract of
grapevines to detect, on the same plate, FD and BN, and the viruses Grapevine
Leafroll associated Virus-1 and -3 and Grapevine Virus A, which are the major
viruses infecting grapevines in Piedmont, Italy (F. Mannini, personal communication,
2007). In 2007, over 200 samples with suspicious symptoms were collected. Single
and mixed infections of both the phytoplasmas and the viruses were found.
Keywords: Flavescence dorée; Bois noir; GLRaV-1; GLRaV-3; GVA.
Margaria P., C. Rosa, C. Marzachì, M. Turina, S. Palmano, 2007. Detection of
Flavescence dorée phytoplasma in grapevine by reverse- transcription-PCR.
Osman F., A. Rowhani, 2006. Application of a spotting sample preparation technique
for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR
(TaqMan). Journal of Virological. Methods, 133,130-136.
Osman F., C. Leutenegger, D. Golino, A. Rowhani, 2008. Comparison of low-density
arrays, RT-PCR and real-time TaqMan® RT-PCR in detection of grapevine
viruses. Journal of Virological Methods, 149, 292-299.
291
Osman F., C. Leutenegger, D. Golino, A. Rowhani, 2007. Real-time RT-PCR
(TaqMan) assays for the detection of Grapevine Leafroll associated virus 1-5
and 9. Journal of Virological. Methods, 141, 22-29.
Schneider B., E. Seemüller, 1994. Presence of two sets of ribosomal genes in
phytopathogenic mollicutes. Applied and Environmental Microbiology, 60, 34093412.
292
LA DIAGNOSI DEL LEGNO NERO NELLE DIVERSE FASI
VEGETATIVE DELLE PIANTE
G. Pasquini, L. Ferretti, A. Gentili , M. Barba
C.R.A. Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Via C. G. Bertero, 22
I-00156 (RM)
L’efficienza dei protocolli di diagnosi è un elemento fondamentale nello studio
dei vari aspetti della malattia dei giallumi della vite. Attualmente il protocollo più
utilizzato nei laboratori è quello scaturito da una prova comparativa effettuata da
diverse istituzioni scientifiche italiane per armonizzare la diagnosi della flavescenza
dorata (FD) (Pasquini et al., 2001). Al fine di testare l’efficienza di tale protocollo
anche nella diagnosi del legno nero (LN), una serie di piante di vite infette sono state
saggiate ad intervalli regolari durante la stagione vegetativa. A tale scopo un vigneto
di ‘Chardonnay’ localizzato in una località viticola del Lazio (Cori, LT) è stato scelto
come impianto ‘pilota’ e 12 piante, già risultate positive all’infezione da Stolbur, sono
state cartellinate e, ad intervalli di circa 20 giorni da maggio fino a metà novembre,
sono state saggiate molecolarmente a partire da campioni fogliari. Inoltre, campioni
di legno sono stati prelevati dalle stesse piante in febbraio per valutare la possibilità di
rilevare la presenza del fitoplasma da matrice sottocorticale anche nelle fasi di riposo
delle piante.
Dalle nervature principali delle foglie e dal sottocorticale ottenuto dal legno
invernale è stato estratto il DNA totale secondo la metodologia descritta in Barba et
al., 1998. Il pellet finale è stato risospeso in 100 µl di acqua sterile.
L’amplificazione del gene 16S è stata effettuata mediante una PCR diretta con
i primers P1/P7 (Deng & Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995) utilizzando 2µl del
DNA estratto diluito 1:10, seguita da una nested-PCR con i primers R16(I)F1/R1 (Lee
et al., 1994), effettuata utilizzando come target il prodotto amplificato della diretta,
diluito 1:40 in acqua sterile. Le condizioni di amplificazione e le miscele di reazione
utilizzate sono state quelle indicate nel protocollo pubblicato (Pasquini et al., 2001).
I primi segnali di positività in nested-PCR sono stati ottenuti in 8 piante su
12 verso la seconda metà di giugno, quando i sintomi non erano ancora comparsi
sulle piante. Intorno al 20 luglio, alla comparsa dei primi arrotolamenti fogliari verso
il basso e all’emissione di foglioline dalle gemme ascellari, la positività al saggio
molecolare è comparsa anche in 9 dei 12 campioni nella PCR diretta. Nei successivi
campionamenti, compresi tra fine luglio e metà settembre, tutte le piante sono risultate
293
positive solo in nested-PCR e nessun infetto è stato ottenuto dalla diretta con i primers
P1/P7. A partire dai primi di ottobre in poi, tutte le piante sono risultate positive in
PCR diretta.
La diversa reattività al saggio molecolare potrebbe essere correlata ad un
gradiente di concentrazione del fitoplasma nelle nervature fogliari, che sembra
raggiungere un picco in corrispondenza della comparsa dei sintomi, per poi regredire
in tarda estate ed innalzarsi di nuovo in autunno. La positività ai saggi effettuati in
inverno dal tessuto floematico sottocorticale mostra la possibilità di diagnosticare la
malattia anche durante il periodo di riposo vegetativo e che i fitoplasmi non migrano
completamente nell’apparato radicale durante l’inverno.
La diagnosi del LN mediante il protocollo attualmente utilizzato nella maggior
parte dei laboratori di diagnosi sembra essere efficiente in modo particolare solo
dalla comparsa dei sintomi in poi e con un picco di sensibilità alla fine della stagione
vegetativa. Ai fini di una diagnosi precoce, indispensabile per il controllo del materiale
di propagazione, appare necessaria la messa a punto di metodi più sensibili che siano
in grado di rilevare la presenza del fitoplasma anche quando la sintomatologia non è
ancora evidente.
Parole chiave: Stolbur, vite, Identificazione, Gene 16S.
Bois noir diagnosis in the different vegetative stages of the plants
The diagnostic efficiency is important in all steps of yellows grapevine studies.
Actually the most used diagnostic protocol in Italian laboratories is that obtained by
a ringtest performed to harmonize the diagnosis of flavescence dorée (FD) (Pasquini
et al., 2000). In order to evaluate the efficiency of this protocol also in the diagnosis
of bois noir (BN) disease, a number of BN infected grapevine plants have been
molecularly assayed during the growing phases. A ’Chardonnay’ vineyard was chosen
as model and 12 plants, previously found infected, were molecularly assayed, from
may to the end of November, using midribs leaf samples. Moreover, woody samples
were collected from the same plants in February to evaluate the possibility to reveal
the presence of the phytoplasma also during the winter.
Total DNA was extracted from phloem tissue (leaf midribs and bark) using the
methodology described in Barba et al., 1998. The final pellet was resuspended in 100
µl of sterile distilled water.
The 16S gene amplification was obtained by a direct PCR with the universal
primers P1/P7 (Deng & Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995), from 2 µl of total DNA
diluted 1:10, followed by a nested-PCR with the primers R16(I)F1/R1 (Lee et al.,
1994), performed with 1:40 diluted amplicons obtained from the direct PCR.
294
The first positive samples (8/12) were obtained in nested-PCR in the second half
of June, when symptoms were not yet visible on the plants. When the symptomatology
started to be clear 9 samples resulted positive in direct-PCR. From the end of July to
half of September the plants resulted positive only in nested-PCR, but from the first of
October until the end of November all samples resulted infected in direct-PCR.
The results obtained during the growing stage could be correlated to a different
gradient of phytoplasma concentration in leaf midribs. The phytoplasma concentration
seems increase with the symptoms appearance, then decreases at the end of the summer
and reaches a peak in autumn.
The positive results obtained in nested-PCR from all bark samples collected
in winter show that it is possible to detect the phytoplasma also during the quiescent
season and that phytoplasmas do not migrate completely in root apparatus during the
winter.
The BN diagnostic protocol seems to be particularly efficient when symptoms
become visible, but it is necessary to improve the diagnosis sensitivity to detect
the phytoplasma also during the latent period, especially for propagative materials
control.
Key words: Stolbur, Grapevine, Identification, 16S gene.
Barba M., G. Boccardo, L. Carraro, P. Del Serrone, P. Ermacora, G. Firrao, L.
Giunchedi, N. Loi, M. Malfitano, C. Marcone, C. Marzachì, R. Musetti,
R. Osler, S. Palmano, C. Poggi Pollini, A. Ragozzino, 1998. Confronto
di differenti tecniche di diagnosi applicate al rilevamento di fitoplasmi in
pomacee. Notiziario sulla protezione delle piante, 9, 263-278.
Deng S., C. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and nonculturable mollicutes. Journal Microbiological Methods, 14, 53-61
Lee IM., DE. Gundersen, RW. Hammond, R.E. Davis, 1994. Use of Micoplasma like
organism (MLO’s) group specific oligonucleotide primers for nested-PCR
assay to detect mixed MLO infections in a single host plant. Phytopatology
84, 449-566
Pasquini G., E. Angelini, R. Benedetti, A. Bertaccini, L. Bertotto, PA. Bianco,
F. Faggioli, M. Martini, C. Marzachì, M. Barba, 2001. Armonizzazione
della diagnosi della Flavescenza dorata della vite (FD): risultati di una
prova comparativa. In Atti Progetto POM A32 (vol II), Norme fitosanitarie e
commercializzazione delle produzioni vivaistiche’, Locorotondo (BA-Italy),
4-7 dicembre 2001, 921-940.
295
Schneider B., MT. Cousin, S. Klinkong, E. Seemüller, 1995. Taxonomic relatedness
and phylogenetic positions of phytoplasmas associated with disease of faba bean,
sunhemp, sesame, soybean and eggplant. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten
und Pflanzenschutz, 102, 225–232
296
USO DELL’SSCP PER LO STUDIO DELLA VARIABILITÀ
MOLECOLARE DI ISOLATI DI LEGNO NERO
RACCOLTI IN VENETO
C. Scopel, R. Causin
Università degli Studi di Padova - Dipartimento Territorio e Sistemi Agro ForestaliSez. Patologia Vegetale - AGRIPOLIS - Viale dell’Università 16
I-35020 LEGNARO (PD)
Il Legno Nero (LN) è un’importante malattia della vite, diffusa in tutte le aree
viticole del mondo con un’incidenza che recentemente è in aumento.
Finora sono state caratterizzate tre diverse varianti molecolari di LN, nella
vite, nel vettore H. obsoletus e negli ospiti erbacei, ciascuna associata specificamente
a piante spontanee dei vigneti (Langer e Maixner, 2004).
Con questo lavoro si è saggiata la variabilità molecolare negli isolati di LN
raccolti in Veneto da viti e piante spontanee durante un’indagine triennale. A tal
fine le tecniche dell’RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e del RESSCP (Restriction Enzymes-Single Strand Conformational Polymorphism) sono state
applicate a 622 campioni di LN (611 di vite e 11 piante spontanee).
Una porzione del gene Tuf è stata amplificata in PCR diretta con i primers
Tuf1f/Tuf1r, seguita da una nested con i primers TufAyf/TufAyr (Schneider et al.,
1997); gli amplificati di 940 bp stati poi sottoposti ad RFLP con l’enzima HpaII
evidenziando nei campioni di vite la presenza di solo 2 delle varianti molecolari, VK
Type I e VK- Type II, ed unicamente di VK- Type II nelle piante erbacee. I due profili
sono stati ottenuti nei campioni di tutte le aree indagate.
Un gruppo rappresentativo di 94 isolati, assieme a 1 proveniente dalla Francia
(E. Boudon-Padieu) e 3 dalla Germania (VK Type I, VK- Type II e VK- Type III; M.
Maixner), è stato sottoposto a RE-SSCP per individuare la presenza di mutazioni,
anche puntiformi.
Per ridurre gli ampliconi del gene di Tuf in frammenti di meno che 400 bp, più
adatti ad essere sottoposti ad SSCP, i prodotti di PCR sono stati digeriti con HpaII,
prima di essere sottoposti all’analisi del polimorfismo della singola elica. Di seguito
si è proceduto a sequenziare gli amplificati, allineare le sequenze ed eseguire gli studi
filogenetici con i programmi MEGA. 3.1 e TCS 1.21.
L’analisi SSCP ha prodotto 13 diversi profili elettroforetici, dimostrando come
questa tecnica sia più sensibile e in grado di evidenziare la variabilità molecolare
meglio dell’RFLP. Tutti i profili ottenuti sono stati riproducibili e costanti.
297
L’analisi filogenetica delle sequenze ha prodotto un albero nel quale il gruppo
principale è rappresentato da VK Type I, seguito in ordine di grandezza dal VK Type II e
da un piccolo gruppo di 3 ceppi tra loro identici; 3 isolati sono risultati diversi da tutti.
Questo studio preliminare conferma che l’SSCP può essere proficuamente
utilizzato per la caratterizzazione di isolati diversi (Pacifico et al., 2005; Šeruga et
al., 2007) ed ha evidenziato la presenza nelle aree viticole del Veneto di isolati di
LN diversi dai tipi di VK caratterizzati in Germania e nel resto d’Italia. Il significato
epidemiologico di queste nuove varianti molecolari di LN è al momento in corso di
studio.
Parole di chiave: Bois Noir, Polimorfismo, Gene tuf, RFLP, SSCP.
Use of SSCP to detect molecular variability in boisnoir isolates
collected in Veneto region
Bois Noir (BN) is an important worldwide grapevine disease which occurs,
often with high incidence, in all viticultural areas of Italy including those of Veneto.
Until now in the BN phytoplasma three strains, isolated in the grapevine as well
as in vector H. obsoletus and wild hosts, have been characterized; each strain showed
a specific association with different vineyard weed (Langer and Maixner, 2004).
In order to verify the presence of these three BN strains and of all other possible
genetic variability, a study in infected grapevines as well as in weeds, collected in
Veneto during a three year survey was carried out.
The genetic variability was assayed by RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) and by RE-SSCP (Restriction Enzymes-Single Strand Conformational
Polymorphism).
For the differentiation of the 622 BN isolates collected (611 from grapes and
11 from weeds) the tuf gene was amplified by direct PCR using the Tuf1f/Tuf1r primer
pair, followed by nested PCR with TufAyf/TufAyr (Schneider et al., 1997); the 940
bp PCR products were subjected to RFLP analysis with HPA II enzyme (Langer and
Maixner, 2004) and the presence of the two different BN population, reported in
literature as VK- Type I and VK- Type II, was evidenced. These two profiles were
found in all the areas surveyed.
A representative sample of 94 BN isolates, together with 1 reference strain
from France (kindly provided by E. Boudon-Padieu) and 3 reference strains from
Germany (VK- Type I, VK- Type II, VK- Type III kindly provided by M. Maixner),
was chosen to investigate by RE-SSCP the presence of potential mutations.
In order to reduce the size of the Tuf gene amplicons into small fragments of
less than 400 bp the PCR products were digested with the restriction enzyme Hpa II.
298
The digestion products obtained were processed by SSCP analysis and
subsequently sequenced, aligned and phylogenetic analysed by using MEGA v. 3.1
and TCS 1.21 program.
Compared to the RFLP analysis, the SSCP analysis showed 13 different
elettrophoretic profiles with a higher molecular variability. All the profiles were
reproducible and constant. Phylogenetic analysis of sequences produced a tree in
which the main group is represented by VK type I, followed by the VK II and a small
group of 3 isolates; 3 strains remained not grouped.
This preliminary study confirmed that SSCP can be useful for the detection
of molecular variability in Phytoplasma strains (Pacifico et al. 2005; Šeruga 2007)
and evidenced the presence in grapes and weeds growing in Veneto vineyards of
BN isolates different from the VK type already individuated in Germany and also
detected in Italy. The epidemiological role of these new molecular variant of BN is
still investigated.
Key words: Bois Noir, Polymorphism, Tuf gene, RFLP, SSCP.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of grapevine yellows associated phytoplasmas of the stobur-group based on RFLP-analysis of non ribosomal DNA. Vitis, 43, 191-199.
Schneider B., K. Gibb, E. Seemüller, 1997. Sequence and RFLP analysis of the elongation factor Tu gene used in differentiation and classification of phytoplasmas. Microbiology, 143, 3381-3389.
Pacifico D., A. Alma, M. Tessitori, R. Tedeschi, C. Marzacchì, 2005. Caratterizzazione di fitoplasmi associati al Legno Nero (LN) della vite in Liguria, Piemonte, Sardegna, Sicilia e Valle d’Aosta. Atti del 3° Incontro Nazionale sulle
malattie da fitoplasmi. Petria, 15, 113-115.
Šeruga Musi M., M. Krajai, D. Škori, 2007. Evaluation of SSCP analysis as a tool
for detection of phytoplasma molecular variability. Bulletin of Insectology, 60,
245-246.
299
Legno nero in Lombardia:
individuazione di marcatori molecolari per la
diagnosi e la caratterizzazione dei fitoplasmi
appartenenti al gruppo tassonomico 16SrXII-A
G. Durante1, P. Casati1, F. Quaglino1,2, I.M. Lee2, PA. Bianco1
Istituto di Patologia Vegetale, Università di Milano,
2
Molecular Plant Pathology Laboratory, USDA, ARS,
Beltsville, MD 20705, USA
1
La viticoltura rappresenta una delle principali attività agricole della regione
Lombardia dove rinomati vini internazionali sono prodotti nelle prestigiose aree
viticole come la Franciacorta (BS) e l’Oltrepò pavese (PV). In tali aree, Flavescenza
dorata (FD) e Legno nero (LN), due gravi fitoplasmosi appartenenti al complesso
di malattie denominate giallumi della vite [Grapevine Yellows (GY)], costituiscono
una grave minaccia alla filiera vitivinicola. FD e LN causano identici sintomi in
vite, ma sono associati a fitoplasmi geneticamente distinti. I fitoplasmi associati a
FD (sottogruppi 16SrV-C/-D) e a LN (sottogruppo 16SrXII-A) sono stati proposti
non ufficialmente in due specie separate, rispettivamente: “Ca. Phytoplasma vitis”
e “Ca. Phytoplasma solani” (IRPC Phytoplasma/Spiroplasma Working Team,
2004). Quest’ultimo risulta in forte espansione in diverse aree viticole in Italia ed in
Europa.
In questo lavoro, è stata studiata la variabilità genetica dei fitoplasmi associati
a LN, identificati in viti dell’Oltrepò pavese e della Franciacorta, attraverso l’analisi
delle sequenze dei geni rps19, rpl22 e rps3. In totale, 46 isolati appartenenti al gruppo
tassonomico 16SrXII-A (29 individuati in Franciacorta e 17 in Oltrepò pavese)
precedentemente identificati come tuf tipo-I (27 isolati) e tuf tipo-II (19 isolati),
(Quaglino et al., 2007), sono stati analizzati. Il lavoro è stato eseguito attraverso:
(I) amplificazione dei geni rps19-rpl22-rps3 in eminested PCR mediante l’uso dei
primer specifici per il sottogruppo 16SrXII-A rpStolF/rpStolR, seguiti da una secondo
ciclo di amplificazione condotto con i primer rpStolF2/rpStolR (Martini et al., 2007);
(II) analisi del polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)
condotta con gli enzimi di restrizione DraI, Tsp509I, AluI e MseI; (III) clonaggio e
sequenziamento di 6 prodotti PCR, di 1250bp ciascuno, ottenuti dall’amplificazione
condotta con i primer rpStolF2/rpStolR; (IV) ricerche svolte mediante software
“BlastN” http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST e successiva analisi filogenetica delle
sequenze nucleotidiche ottenute.
300
Sulla base del profilo di restrizione ottenuto con l’enzima MseI, gli isolati
fitoplasmatici associati a LN sono stati suddivisi in due sottogruppi rp (ribosomal
protein), qui chiamati rpXII-A (profilo di restrizione A) e rpXII-B (profilo di
restrizione B). Il sottogruppo rpXII-A includeva 44 isolati fitoplasmatici (tuf tipo-I e
tuf tipo-II), identificati sia in Franciacorta sia in Oltrepò pavese, mentre il sottogruppo
rpXII-B includeva 2 isolati (tuf tipo-I ), identificati in Franciacorta. Singolarmente,
i due genotipi rp identificati non coincidevano con i due “VK-tipi”, che erano basati
sulla sequenza del gene tuf. Le analisi condotte sulle 6 (4 tuf tipo-I e 2 tuf tipoII) sequenze geniche ottenute, indicavano che questi isolati fitoplasmatici erano
geneticamente vicini (99% d’identità) alla sequenza del fitoplasma associato alla
“Virescenza ipertrofica del pomodoro”, noto come Stolbur del pomodoro. Inoltre,
l’allineamento dei geni ribosomici, qui in studio, evidenzia un’alta diversità genica
tra gli isolati di tipo tuf tipo-I rispetto agli isolati tuf tipo-II.
Quindi, un’inattesa diversità molecolare è stata trovata nei geni ribosomici
rps19, rpl22 ed rps3 nella popolazione di fitoplasmi associati a LN nei vigneti
lombardi. La diversità genica osservata pone la questione circa le possibili relazioni
tra i marcatori molecolari identificati sulla base dei geni ribosomali e l’epidemiologia
dei fitoplasmi associati a LN.
Parole chiave: Giallumi della vite, tuf tipo-I , tuf tipo-II, Geni ribosomali.
Bois noir in Lombardy (northern Italy): Identification of molecular markers for
diagnosis and characterization of 16SrXII-A phytoplasmas.
Viticulture is one of the main agricultural activities in the Lombardy region of
Northern Italy where internationally renowned wines are produced in the prestigious
wine-growing areas as Franciacorta (Brescia province) and Oltrepò pavese (Pavia
province). In these areas, Flavescence dorèe (FD) and Bois noir (BN) diseases, two
primary components of the Grapevine Yellows (GY) disease complex, constitute a
serious threat to the wine production industry. FD and BN cause identical symptoms in
grapevine, but are associated with genetically distinct phytoplasmas. FD phytoplasmas
(subgroups 16SrV-D and 16SrV-C) and BN phytoplasma strains (subgroup 16SrXIIA) have been unofficially proposed as two separate species, “Ca. Phytoplasma vitis”
and “Ca. Phytoplasma solani”, respectively (IRPC Phytoplasma/Spiroplasma Working
Team, 2004). BN is spreading in several viticulture areas in Italy and Europa.
In this work, genetic variability of BN phytoplasma isolates identified in
Oltrepò pavese and Franciancorta grapevines was investigated through analysis of
rps19, rpl22 and rps3 gene sequences. A total of 46 BN phytoplasma strains (29 from
Franciacorta and 17 from Oltrepò pavese), previously characterized as tuf tipo-I (27
301
strains) and tuf tipo-II (19 strains) types, (Quaglino et al., 2007), were analyzed. The
study was carried out through: (I) amplification of the rps19-rpl22-rps3 genes by
semi-nested PCR using the 16SrXII-A subgroup-specific primer pair rpStolF/rpStolR
followed by a second round of amplification primed by rpStolF2/rpStolR (Martini
et al., 2007); (II) restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis with
restriction enzymes DraI, Tsp509I, AluI and MseI; (III) cloning and sequencing of 6
PCR-product, (1250bp each) from the rpStolF2/rpStolR-primed reactions; and (IV)
“BlastN” (http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/) searches and phylogenetic analyses
of the nucleotide sequences obtained.
On the basis of the RFLP patterns obtained by analysis with MseI, the
BN phytoplasma strains were divided into two rp subgroups, here called rpXII-A
(restriction profile A) and rpXII-B (restriction profile B). Subgroup rpXII-A included
44 phytoplasma strains (both type tuf tipo-I and tuf tipo-II) identified in Franciacorta
and in Oltrepò pavese, while subgroup rpXII-B contained 2 strains (type tuf tipo-I)
from Franciacorta vineyards. Interestingly, the two rp genotypes identified did not
coincide with the two VK types, which are based on tuf gene sequences. The analysis
performed on the 6 (4 tuf tipo-I and 2 tuf tipo-II) obtained sequences indicated
that these strains are most closely related (99% identity) to the tomato hypertrophic
virescence phytoplasma, known as tomato stolbur. Moreover, the ribosomal protein
gene sequence alignment revealed that the BN strains of type tuf tipo-I exhibited
greater genetic diversity than those of type tuf tipo-II.
Thus, an unexpected molecular diversity was found in the S19, L22 and S3
ribosomal protein genes among stolbur phytoplasma strain populations associated
with BN disease in Lombardy vineyards. The observed molecular genetic diversity
raises the question of possible relationships between the molecular markers identified
on phytoplasmal rp genes and BN epidemiology
Key words: Grapevine Yellows, tuf tipo-I , tuf tipo-II, Ribosomal genes.
IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team – Phytoplasma Taxonomy Group,
2004. ‘Candidatus Phytoplasma’, a taxon for the wall-less, non-helical
prokaryotes that colonize plant phloem and insects. Int J Syst Evol Microbiol,
54, 1243-1255.
Martini M., IM. Lee, KD. Bottner, Y. Zhao, S. Botti, A. Bertaccini, NA. Harrison,
L. Carraro, C. Marcone, AJ. Khan , R. Osler, 2007. Ribosomal protein gene-based
phylogeny for finer differentiation and classification of phytoplasmas. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57, 2037-2051.
302
Quaglino F., G. Romanazzi, A Zorloni, P. Casati, S. Murolo, G. Durante, PA.
Bianco, 2007. Caratterizzazione molecolare dei fitoplasmi associati al Legno
nero (LN) della vite. Italus Hortus 14, 87-90
Questo progetto è realizzato grazie ai fondi della Sovvenzione Globale INGENIO erogati dal Fondo Sociale
Europeo, dal Ministero del Lavoro e della Previdenza Sociale e dalla Regione Lombardia” e del.P.F. Gia.Vi.
“I giallumi della vite: un fattore limitante le produzioni vitivinicole” finanziato dal Ministero delle Politiche
Agricole Alimentari e Forestali.
303
ACCERTAMENTO DELLA PRESENZA
DI SCAPHOIDEUS TITANUS NEL LAZIO
B. Bagnoli1, L. Ferretti2, V. Trivellone1, L. Nuccitelli3, G. Pasquini2
1
Via Lanciola, 12/A, I-50125 (FI)
2
CRA-PAV Centro di ricerca per la Patologia Vegetale,
Via C.G. Bertero, 22, I-00156 (RM)
3
Servizio Fitosanitario della Regione Lazio,
Via R. Raimondi Garibaldi, 7, I-00145 (RM)
Dopo l’emanazione del decreto “Misure di lotta obbligatoria contro la
flavescenza dorata della vite” (D.M. n. 32442 del 31/05/2000), le nuove segnalazioni
della malattia (FD, 16SrV, sottogruppi C e D) nell’Italia centrale (Credi et al., 2002;
Bertaccini et al., 2003; Natalini et al., 2005) e del suo vettore specifico Scaphoideus
titanus Ball (Cicadellidae Deltocephalinae) in regioni del centro-sud Italia (Lucchi
et al., 2000; Viggiani, 2002 e 2004; Santinelli et al., 2003; Braccini et al., 2005)
hanno dato concretezza all’esigenza di realizzare, anche nei diversi comprensori
viticoli dell’Italia centro-meridionale, idonei programmi di monitoraggio, diagnosi e
determinazione delle fitoplasmosi e dei cicadellidi deltocefalini.
Tale attività è stata espletata, a partire dal 2004, anche nel Lazio in
collaborazione con il Servizio Fitosanitario Regionale. A tal fine, sopralluoghi periodici
e campionamenti sia di materiale vegetale che di insetti sono stati condotti da luglio
a settembre in una quindicina di aree viticole delle province di Viterbo, Roma, Latina
e Frosinone. I rilievi sulla auchenorrincofauna sono stati effettuati prevalentemente
per mezzo di trappole cromotattiche gialle, di solito distribuite in numero di tre per
vigneto campione e mantenute esposte per due-tre turni di 20 giorni ciascuno.
Le analisi molecolari condotte su campioni di viti sintomatiche ai giallumi,
prelevati nei diversi vigneti presi in esame, hanno fornito nella maggior parte dei
casi risultati positivi alla presenza di fitoplasmi, evidenziando tuttavia sempre e solo
il fitoplasma agente di legno nero (LN, Stolbur, sottogruppo 16SrXII-A) (Pasquini et
al., 2007).
Per quanto riguarda S. titanus, la specie nel Lazio è stata intercettata per la
prima volta nel 2005 attraverso un unico esemplare maschio catturato con trappola
cromotattica in un’azienda ubicata nel comune di Cori (LT). La presenza del vettore
nel territorio regionale è stata confermata negli anni successivi sia nella stessa azienda
che in altre due ubicate ad Anagni (FR) e a Olevano Romano (RM). Mentre a Cori
304
e ad Anagni sono state osservate popolazioni del cicadellide di scarsa consistenza,
in impianti di oltre 30 anni dell’azienda di Olevano Romano, costituiti da ‘Cesanese
d’Affile’ e da ‘Malvasia’, si sono riscontrate da luglio a settembre popolazioni di
S. titanus particolarmente abbondanti. In questi vigneti su entrambe le varietà non
sono stati osservati sintomi di giallumi e le analisi molecolari, condotte su campioni
prelevati in modo random, hanno portato a escludere la presenza di fitoplasmosi.
Nei vigneti delle aziende di Cori e Anagni è stato invece possibile rilevare piante
sintomatiche, risultate all’analisi molecolare affette da LN.
Gli adulti di S. titanus catturati sono stati analizzati molecolarmente mediante
estrazione del DNA totale da singoli individui secondo la procedura di Marzachì et
al. (1998), con le modifiche dettagliate in Trivellone et al. (2005). L’amplificazione
del gene 16S è stata effettuata adottando il protocollo di Pasquini et al. (2001). Tutti
gli esemplari del cicadellide analizzati sono risultati negativi alla presenza sia dei
fitoplasmi agenti di FD che di LN.
Sulla scorta di quanto emerso in Toscana (Braccini et al., 2005), Campania
(Danise et al., 2005), Basilicata (Castoro et al., 2006) e Abruzzo (Di Giovanni et
al., 2008), è verosimile che anche nel Lazio la specie abbia una diffusione assai più
ampia di quella finora evidenziata e che la sua reale distribuzione possa essere meglio
definita con l’estendersi e l’intensificarsi del monitoraggio. Le caratteristiche degli
ambienti viticoli, e in particolare l’età degli impianti interessati dalla presenza di S.
titanus a Cori e Olevano Romano, lasciano supporre che il cicadellide sia presente nel
Lazio da svariati anni. Per quanto riguarda la sua introduzione nella regione, si ritiene,
in accordo con molti altri Autori, che sia avvenuta e possa continuare a verificarsi per
cause antropiche soprattutto attraverso la commercializzazione di materiale vivaistico
di propagazione della vite infestato da uova.
La presenza del vettore di FD, pur in presunta assenza della malattia, deve
essere considerato, senza allarmismi, un importante fattore di rischio e deve condurre,
attraverso la cooperazione dei viticoltori, alla realizzazione di un capillare monitoraggio
territoriale delle fitoplasmosi e delle popolazioni di S. titanus. Quest’ultime dovranno
essere oggetto di adeguate e specifiche misure di controllo che, per rimanere aderenti
a criteri di protezione fitosanitaria integrata ed eco-compatibile, sarà necessario
differenziare opportunamente in funzione delle densità di popolazione del cicadellide
e del contesto produttivo: vivai, campi di piante madri, vigneti commerciali.
Parole chiave: Flavescenza dorata, Cicadellidae, Vettori, Italia centrale.
305
Occurrence of Scaphoideus titanus in Latium region
After the decree of the Italian Ministry of Agriculture “Measures of mandatory
control of the grapevine flavescence dorée” (D.M. n. 32442 of 31/05/2000), the
new identification of this disease (FD, 16SrV, sub-groups C e D) in central Italy
(Credi et al., 2002; Bertaccini et al., 2003; Natalini et al., 2005) and of its specific
vector Scaphoideus titanus Ball (Cicadellidae Deltocephalinae) in regions of central
and southern Italy (Lucchi et al., 2000; Viggiani 2002 and 2004; Santinelli et al.,
2003; Braccini et al., 2005) pushed to achieve, in the different vine growing areas of
these regions, suitable survey programs for the identification of phytoplasmas and
leafhoppers.
From 2004, a specific monitoring activity in collaboration with the Regional
Phytosanitary Service was carried out also in Latium region. Periodic field inspections
and samplings were performed from July to September in about 15 vine growing
areas of the provinces of Viterbo, Rome, Latina and Frosinone. Insect monitoring
was mainly conducted by yellow sticky traps, usually spread in number of three per
vineyard and exposed in two-three shifts of 20 days each.
Molecular analysis, performed on yellow symptomatic vines of the observed
vineyards, gave in a high percentage positive results to phytoplasma presence, showing
only the phytoplasma associated to bois noir (BN, Stolbur, sub-group 16SrXII-A).
S. titanus (one male) was found for the first time in 2005 in an estate of Cori
(LT). The presence of the leafhopper in this region was confirmed in subsequent
years in the same and in other two sites, Anagni (FR) and Olevano Romano (RM). At
Cori and Anagni farms, the cicadellid population density appeared very low, while at
Olevano Romano farm, in ‘Cesanese d’Affile’ and ‘Malvasia’ vineyards (over thirty
yeas old), a large number of S. titanus adults was collected in summer period. In these
vineyards, yellow symptoms were not observed and molecular analysis, performed
on random samples, gave negative results. BN presence was instead confirmed in
symptomatic vines of Cori and Anagni fields.
The captured insects were analyzed by molecular analysis, after the extraction
from each specimen of the total DNA following the protocol described by Marzachì et
al. (1998), with some modifications reported by Trivellone et al. (2005). The 16S gene
amplification was obtained following the procedure reported in Pasquini et al. (2001).
All analyzed S. titanus specimens resulted negative to FD and BN.
Survey results obtained in Tuscany (Braccini et al., 2005), Campania (Danise
et al., 2005), Basilicata (Castoro et al., 2006) and Abruzzo (Di Giovanni et al., 2008)
suggest that S. titanus has, also in Latium, a larger diffusion than that one registered
until now. Improving the monitoring will certainly allow a better definition of the
cicadellid spreading. The age of the S. titanus infested vineyards at Cori and Olevano
Romano leads to hypothesize that the leafhopper is present in Latium from several
306
years. According to many other Authors, we believe that the introduction of the
species in this region is due to anthropic factors mainly related to the vine propagation
materials infested by S. titanus eggs.
The presence in Latium of the FD vector must be considered, without any undue
alarm, an important risk factor and it must lead, through the cooperation of growers,
to the implementation of a capillary territorial monitoring. Specific and suitable
measures of integrated control of S. titanus population need to protect propagation
materials and grape productions.
Key words: Flavescence dorée, Cicadellidae, Vectors, Central Italy.
Bertaccini A., S. Botti, A. Tonola, C. Milano, P. Braccini, A. Sfalanga, 2003. Identificazione di fitoplasmi di flavescenza dorata in un vigneto della Toscana.
L’Informatore Agrario, 59 (21), 65-67.
Braccini P., A. Paoli, G. Vettori, 2005. Attività svolta e programmata di monitoraggio dei giallumi e dei loro vettori in Toscana. In: A. Bertaccini, P. Braccini (a
cura di), Flavescenza dorata e altri giallumi della vite in Toscana e in Italia.
Quaderno ARSIA, 3/2005, 39-43.
Castoro V., B. Mattatelli, V. Fornarelli, C. Marcone, A. Tranfaglia, I. Camele, R.
Spicciarelli, 2006. Scafoideo e flavescenza dorata su vite in Basilicata. L’Informatore Agrario, 62 (46), 73-75.
Credi R., F. Terlizzi, G. Stimilli, S. Nardi, R. Lagnese, 2002. Flavescenza dorata
della vite nelle Marche. L’Informatore Agrario, 58 (22), 61-63.
Danise B., R. Griffo, G. esapane, G. Scognamiglio, F. Tropiano, 2005. Presenza massiccia di scafoideo in Campania. L’Informatore Agrario, 61 (11), 73-75.
Di Giovanni R., D. D’Ascenzo, AM. Di Cioccio, D. Di Loreto, N. Mori, 2008. Attenzione
in Abruzzo ai giallumi della vite. L’Informatore Agrario, 64 (13), 55-56.
Lucchi A., F. Cosci, V. Mazzoni, L. Santini, 2000. Preoccupante diffusione di Scaphoideus titanus Ball (Homoptera Cicadellidae) in vigneti della Liguria meridionale e della Toscana litoranea. Petria, 10, 183-185.
Marzachì C., F. Veratti, D. Bosco, 1998. Direct PCR detection in phytoplasmas in
experimentally infected insects. Annals Applied Biology, 133, 45-54.
Natalini G., C. Santinelli, C. Porcacchia, 2005. Bilancio fitosanitario 2004. Umbria.
L’Informatore Agrario, 61 (15), 49.
307
Pasquini G., E. Angelini, R. Benedetti, A. Bertaccini, L. Bertotto, PA. Bianco, F.
Faggioli, M. Martini, C. Marzachì, M. Barba, 2001. Armonizzazione della
diagnosi della Flavescenza dorata della vite (FD): risultati di una prova comparativa. In: Atti Progetto POM A32 (vol II), Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche. Locorotondo (BA-Italy), 4-7 dicembre
2001, 921-940.
Pasquini G., L. Ferretti, M. Barba, 2007. Diffusione del Legno nero della vite nel
Lazio e caratterizzazione molecolare dell’agente eziologico. Informatore Fitopatologico, 57 (4), 42-47.
Santinelli C., M. Santoni, P. Braccini, S. Botti, A. Bertaccini, 2003. Trovato in
Umbria Scaphoideus titanus, vettore della flavescenza dorata. L’Informatore
Agrario, 59 (15), 81-84.
(Auchenorryncha Cixiidae) as a possible vector of stobur-phytoplasma in a
Viggiani G., 2002. Il vettore della Flavescenza dorata trovato in Basilicata. L’Informatore Agrario, 58 (36), 59.
Viggiani G., 2004. Il vettore della Flavescenza dorata anche in Campania. L’Informatore Agrario, 60 (18), 98.
308
MONITORAGGIO DI AUCHENORRINCHI POTENZIALI
VETTORI DI FITOPLASMI IN VIGNETI DEL NORD-EST
ITALIA
V. Forte, E. Angelini, E. Patriarca, G. Perini, M. Borgo
Viale XXVIII Aprile 26, I-31015 Conegliano (TV)
Le malattie da giallumi (GY) che affliggono la viticoltura europea stentano
ancora oggi a trovare una soluzione che porti a ridurre i rischi delle epidemie.
Particolarmente dannosi sono la Flavescenza dorata (FD) ed il Legno nero (LN),
causati rispettivamente da fitoplasmi del gruppo tassonomico 16SrV e 16SrXII.
La diffusione di queste malattie è strettamente legata alla presenza di due specifici
vettori, Scaphoideus titanus Ball e Hyalesthes obsoletus Signoret, che trasmettono
rispettivamente FD e LN. Altri auchenorrinchi vengono comunemente indicati come
potenziali vettori. Lo scopo del presente studio è stato di censire le cicaline all’interno
di vigneti e ai bordi di essi nell’Italia nord-orientale.
La ricerca ha avuto durata di 4 anni, dal 2004 al 2007, ed è stata effettuata
monitorando 22 vigneti colpiti da GY e 5 barbatellai. La cattura degli insetti è stata
eseguita tramite l’utilizzo del retino entomologico e di trappole cromotropiche,
installate all’interno dei filari e sulle siepi poste ai margini della zona vitata. Alcuni
degli insetti raccolti sono stati sottoposti a diagnosi biomolecolari per la ricerca di
eventuali fitoplasmi.
Sono state determinate 64 specie (eccetto quelle appartenenti alla sottofamiglia
Typhlocibinae), ascrivibili a 9 famiglie di auchenorrinchi. In totale sono state catturate
circa 10.000 cicaline; in particolare sono stati trovati 404 S. titanus e 903 H. obsoletus,
presenti in tutti i vigneti monitorati. Il confronto tra i due metodi di cattura utilizzati
mostra che il 70% degli esemplari è stato catturato con le trappole, mentre non rivela
sostanziali differenze nel numero delle specie raccolte. Per quanto riguarda la zona di
raccolta, il 28% delle specie è stato ritrovato esclusivamente all’interno dei vigneti e il
38% ai bordi di essi, mentre il restante 34% è stato catturato in entrambi gli ambienti.
All’interno degli appezzamenti di barbatellai di viti non sono mai stati catturati i due
specifici vettori, mentre ai bordi di alcuni impianti è stata rilevata la presenza di H.
obsoletus.
Sono stati sottoposti a diagnosi biomolecolare PCR/RFLP 331 campioni,
costituiti da insetti singoli o da pool di insetti della medesima specie: 11 campioni
sono risultati infetti da FD, 12 da LN e un solo esemplare presentava un fitoplasma
appartenente al gruppo 16SrI.
309
I monitoraggi effettuati nell’arco dei 4 anni hanno permesso di constatare la
presenza nell’agroecosistema vigneto di un alto numero di specie e di individui di
auchenorrinchi, più o meno legati alla vite. Inoltre il ritrovamento di alcune specie,
potenziali vettrici di fitoplasmi, induce a sviluppare in futuro ricerche sul loro ruolo
nella trasmissione delle fitoplasmosi della vite. La presenza di insetti vettori accertati
e potenziali ai margini dei barbatellai impone di mantenere alta l’attenzione su questi
ambienti-chiave per la produzione di materiale viticolo esente da malattie. Infine i
risultati delle analisi finora effettuate rilevano la presenza, oltre che dei due vettori
noti, anche di altri insetti infetti dai fitoplasmi di FD e LN, sui quali appare utile
indagare con ulteriori approfonditi studi: Dictyophara europaea (Linnaeus) e Reptalus
sp. Emeljanov.
Parole chiave: Cicaline.
Survey on Auchenorryncha potential phytoplasma vectors in
north-eastern Italy
Grapevine yellow (GY) diseases have been afflicting European viticulture
since many years. Effective strategies, able to reduce the risks of epidemics, are
still difficult to find out. Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) are the most
dangerous. They are associated with phytoplasmas belonging to 16SrV e 16SrXII
phylogenetic groups, respectively. Spreading of the two yellows is strictly related
to the presence of their respective vectors, Scaphoideus titanus Ball and Hyalesthes
obsoletus Signoret. However other Auchenorryncha are often pointed out as potential
vectors. The aim of this work was to list and check leafhoppers and planthoppers
present in the vineyard and at the border in north-eastern Italy.
The 4-year survey (2004-2007) was carried out in 22 GY-infected vineyards
and 5 nurseries. Insects were caught by sweep net and yellow sticky traps, exposed in
vineyard and the borders. Some of the collected insects were analysed with molecular
methods for the identification of phytoplasmas.
Except species belonging to subfamily Typhlocibinae, 64 species were
identified, belonging to 9 Auchenorryncha families. Approximately 10000 leafhoppers
and planthoppers were caught. In particular, 404 specimens of S. titanus and 903 H.
obsoletus, present in all the surveyed vineyards. The comparison between the two
capture techniques showed that 70% specimens were caught by traps; however the
same species were captured with both methods. Differences were noticed between
the two ecosystems, vineyard and underbrush: approximately one third (28%) of the
species was collected exclusively inside the vineyard, one third (38%) only at the
border, one third (34%) in both ecosystems. The know vectors were never captured
310
inside the nursery plantations, though at the borders of some nurseries H. obsoletus
was sporadically found.
A total of 331 individual insects or samples formed by several individuals of
the same species were analysed by PCR/RFLP assay. Eleven samples were infected
by FD phytoplasmas, 12 by BN phytoplasmas and one by phytoplasmas belonging to
the 16SrI group.
The 4-year survey showed that many Auchennorryncha species and specimens
are present in vineyard and its surrounding. The finding of several potential vectors
of phytoplasmas lead the development of future studies focused on their role on
phytoplasma transmission. Moreover, the presence of known and potential vectors
at the borders of the nurseries impels to take particular care to the plantations, which
play a fundamental role for the obtainment of disease-free grapevine material. Last
but not least, in this work insect species other than the two known vectors were found
to be infected with FD and BN: Dictyophara europaea (Linnaeus) e Reptalus sp.
Emeljanov. Further studies will be useful to clear their role, if any, in the transmission
of GY phytoplasmas to grapevine.
Key words: Leafhopper, Planthopper.
311
INFEZIONE NATURALE DA FITOPLASMI IN
HYALESTHES OBSOLETUS,
EUSCELIS LINEOLATUS, NEOALITURUS FENESTRATUS
E PSAMMOTETTIX SPP. IN AGROECOSISTEMI VIGNETO
DELLA REGIONE MARCHE
L. Landi1, P. Riolo1, S. Nardi2, N. Isidoro1
Dip. SAPROV, Università Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche I-60131 (AN)
2
Servizio Fitosanitario Regionale - ASSAM, Via Alpi 21, I-60131 (AN)
1
I giallumi della vite causati da fitoplasmi, sono in molte regioni d’Italia, un
grave problema fitosanitario. Questo complesso di malattie, in particolare Flavescenza
Dorata (FD) e Legno Nero (LN), può causare gravi danni economici alla produzione
vitivinicola. Nelle Marche fino ad oggi sono stati riscontrati due “focolai” di FD,
mentre diffusa ed in continuo incremento è la presenza di LN in vari comprensori
viticoli (Romanazzi et al., 2007). In alcuni vigneti affetti da LN, indagini precedenti,
hanno rilevato la sporadica presenza del cixiide Hyalesthes obsoletus Signoret (vettore
naturale del LN) e la contemporanea presenza, in numero elevato, di alcune specie
di Auchenorrinchi note od oggetto di indagine come vettori di fitoplasmi (Riolo et
al., 2007). L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di approfondire le conoscenze
relative all’infezione naturale da fitoplasmi in popolazioni di H. obsoletus, Euscelis
lineolatus Brullé, Neoaliturus fenestratus (Herrich-Schäffer) e Psammotettix spp.
(Homoptera, Auchenorrhyncha) presenti negli agroecosistemi vigneto della regione
Marche.
L’indagine è stata condotta nell’anno 2007, da maggio a settembre, in quattro
agroecosistemi affetti da LN, campionando con retino entomologico gli esemplari
adulti presenti sulla vegetazione erbacea del vigneto. L’infezione naturale da
fitoplasmi è stata analizzata su un totale di 642 esemplari, di cui 343 E. lineolatus,
122 H. obsoletus, 96 N. fenestratus ed 81 Psammotettix spp. (principalmente P.
alienus). Il DNA estratto da ogni singolo individuo è stato sottoposto ad indagine
PCR con i primers universali P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991) specifici per la sequenza
ribosomica 16S dei fitoplasmi. Di seguito è stata effettuata un’indagine nested PCR
gruppo specifica (Lee et al., 1993) per individuare i fitoplasmi associati allo Stolbur (LN
o sottogruppo 16SrXII-A), al Giallume dell’olmo (Elm yellows o gruppo 16SrV), al
Giallume dell’astro (Aster yellows o gruppo 16SrI), ed all’X-disease (gruppo 16SrIII).
312
L’analisi PCR-RFLP ha individuato la presenza dei fitoplasmi appartenenti
ai sottogruppi: 16SrI-B (Giallume dell’astro), 16SrI-C (Fillodia del trifoglio) e
16SrXII-A in E. lineolatus; di 16SrI-B in Psammotettix spp.; di 16SrI-B o 16SrI-C,
in relazione all’agroecosistema, in N. fenestratus. H. obsoletus è risultato positivo al
solo sottogruppo 16SrXII-A. In nessun caso sono stati trovati fitoplasmi appartenenti
ai gruppi tassonomici 16SrIII e 16SrV. La percentuale di infezione è variata, in
relazione alla località, dal 9,9% al 29,2% per E. lineolatus, dal 10,6% al 37,2% per
H. obsoletus, dal 4,8% all’11,1% per Psammotettix spp. mentre è stata del 13% per N.
fenestratus. La sporadica presenza di H. obsoletus in alcuni agroecosistemi affetti da
fitoplasmosi e la contemporanea presenza (in numero elevato) di E. lineolatus, infetto
dal fitoplasma del LN, potrebbe suggerire l’ipotesi che questa specie possa essere
coinvolta nella diffusione della malattia. Inoltre la presenza di Auchenorrinchi infetti
da fitoplasmi 16SrI-C e/o 16SrI-B mostra come questi due gruppi di procarioti siano
diffusi nell’agroecosistema vigneto. Infine, l’indagine pur evidenziando un diverso
rapporto insetto-fitoplasma, osservabile tra le specie di Auchenorinchi, mostra il ruolo
fondamentale che riveste l’agroecosistema vigneto nella diffusione delle malattie
causate da giallumi.
Parole chiave: Agroecosistema vigneto, Auchenorrinchi, Fitoplasmi, Vettori,
Infezione naturale.
Natural phytoplasma infection of Hyalesthes obsoletus, Euscelis lineolatus,
Neoaliturus fenestratus and Psammotettix spp. in vineyard ecosystems
of the Marche Region (central-eastern Italy)
Grapevine yellows associated with phytoplasmas are severe diseases that constitute
a serious phytosanitary problem in several Italian regions. In particular, Flavescence Dorée
(FD) and Bois Noir (BN) can cause severe economic damage to grapevine production.
At the moment, only two “foci” of infection of FD have been detected in the Marche
Region, while BN is being spread and is on the increase in different vine growing areas
(Romanazzi et al., 2007). Previous investigations have shown the sporadic presence of the
cixiid planthopper Hyalesthes obsoletus Signoret (BN natural vector) in some vineyards
affected by BN, with the concomitant presence of other Auchenorrhyncha species known
to be or under investigation as phytoplasma vectors (Riolo et al., 2007). Here, we report on
the natural phytoplasma infection of H. obsoletus, Euscelis lineolatus Brullé, Neoaliturus
fenestratus (Herrich-Schäffer) and Psammotettix spp. (Homoptera, Auchenorrhyncha) in
vineyard ecosystems of the Marche Region.
The study was carried out from May to September, 2007, in four vineyards
where BN was known to occur. Adults were sampled using a sweep net on the
313
herbaceous plants. A total of 642 specimens were collected and analyzed, which
included 343 E. lineolatus, 122 H. obsoletus, 96 N. fenestratus and 81 Psammotettix
spp. (mainly P. alienus). Natural phytoplasma infection was detected in individual
insects by PCR using the P1/P7 universal primers (Deng and Hiruki, 1991) specific
for the phytoplasma 16Sr ribosomal sequence. Nested PCR procedures were used
with different sets of primers (Lee et al., 1993) specific for phytoplasmas associated
with Stolbur (BN or 16SrXII-A subgroup), with Elm yellows (16SrV group), with
Aster yellows (16SrI group) and with X-disease (16SrIII group).
PCR-RFLP analysis detected the subgroups: 16SrI-B (Aster yellow), 16SrIC (Clover phyllody) and 16SrXII-A in E. lineolatus; 16SrI-B in Psammotettix spp.
and 16SrI-B or 16SrI-C, according to the vineyard ecosystem, in N. fenestratus. H.
obsoletus harboured only the 16SrXII-A subgroup. No X-disease and FD phytoplasma
were detected in any of the analyzed insect specimens. The infection level detected,
according to the vineyard ecosystems, varied in E. lineolatus from 9.9% to 29.2%, in
H. obsoletus from 10.6% to 37.2%, and in Psammotettix spp. from 4.8% to 11.1%;
N. fenestratus showed 13% infection. The sporadic presence of H. obsoletus in some
ecosystems, with the concomitant presence (in a large number) of E. lineolatus,
infected by BN phytoplasma, would suggest that this species could be involved in
the disease spreading. Moreover the presence of Auchenorrhyncha infected with
16SrI-C e/o 16SrI-B phytoplasmas shows that these two groups of prokaryotes are
widespread in the vineyard ecosystems. Finally, the investigation also highlights
different relationships between insect-phytoplasma among the Auchenorrhyncha
species, and it shows the fundamental role of the vineyard ecosystem for the diffusion
of the yellow diseases.
Key words: Vineyard ecosystems, Auchenorrhyncha, Phytoplasmas, Vectors, Natural
infection.
314
Deng S., C. Hiruki, 1991. Genetic relatedness between two non - culturable
mycoplasmlike organisms revealed by nucleic acid hybridisation and
polymerase chain reaction. Phytopathology, 81, 1475-1479.
Lee IM., DE. Gundersen , RW. Hammond , RE. Devis , 1994. Use of mycoplasmalike
organism (MLO) group specific oligonucleotide primers for nested-PCR assays to
detect mixed-MLO infections a single host plant. Phytopathology, 84, 559-566.
Riolo P., N. Isidoro, L. Nicoletti, F. Riga, R. Lagnese, S. Nardi, 2007. Cicaline
dell’agroecosistema vigneto: risultati di un quadriennio di indagini nelle
Marche. Italus Hortus, 14, 213-217.
Romanazzi G., S. Murolo, F. Terlizzi, S. Talevi, G. Stimilli, V. Savino, 2007.
Fitoplasmi associati ai giallumi della vite nelle Marche. Informatore
Fitopatologico, 57 (4), 48-50.
315
Valutazione della convenienza economica A
sostituire
le viti con sintomi di giallumi
F. Pavan1, S. Bressan2, P. Mutton2
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante, Università di Udine, Via delle
Scienze 208, I-33100 (UD)
2
Provincia di Pordenone, largo San Giorgio 12, I-33170 (PN)
1
I Giallumi della vite, flavescenza dorata (FD) e Legno nero (BN), possono
causare gravi perdite di produzione. Il decorso delle due malattie può comportare il
risanamento o la morte delle viti colpite. Per FD, in aree viticole del nord Italia, il
primo comportamento è stato osservato su Prosecco, mentre il secondo su Garganega
e Perera (Posenato et al., 1996; Pavan et al., 1997). In molti vitigni il risanamento è
prevalente, anche se una percentuale non trascurabile di viti può morire.
Di fronte ad una vite sintomatica il viticoltore può fare due scelte: sostituirla
o mantenerla (Girolami, 2000; Osler et al., 2002). La decisione dell’agricoltore deve
essere guidata da criteri economici. La sostituzione comporta sia costi diretti (estirpo
e reimpianto) sia indiretti (mancate produzioni durante la fase di allevamento). Il
mantenimento della vite infetta può comportare perdite di produzione se negli anni
successivi presenta ancora sintomi o addirittura muore. La sostituzione di una vite che
muore in anni successivi alla prima manifestazione dei sintomi rappresenta un danno
economico, in quanto il raggiungimento della piena produzione da parte del reimpianto
viene ritardato. Nel caso di FD fra i costi del mantenimento di una vite ammalata deve
anche essere considerato che essa costituisce una sorgente del fitoplasma.
La convenienza a sostituire una vite sintomatica è influenzata soprattutto dalla
sensibilità varietale (perdite di produzione e incidenza della mortalità negli anni
successivi) e dalla durata residua del vigneto. In Friuli Venezia Giulia l’evoluzione della
malattia in viti di cultivar Chardonnay e Merlot affette da BN rende economicamente
non conveniente la sostituzione delle viti infette, anche ipotizzando una durata residua
del vigneto di 20 anni.
Parole chiave: Vite, Giallumi, Perdite economiche, Risanamento, Reimpianto.
316
Evaluation of advantage to replace grapevines affected by Grape Yellows
Grape Yellows, Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN), can cause heavy
yield losses. The course of the two diseases can bring to the recovery or death of the
affected grapevines. For FD in grape-growing areas of North Italy the first course
was observed in cv Prosecco, whereas the second one in cvv Garganega and Perera
(Posenato et al., 1996; Pavan et al., 1997). In many cultivars the recovery is prevalent,
even if a significant percentage of grapevines can die.
When a farmer founds a symptomatic grapevine, he has to choose between
two alternatives: replace or maintain the plant (Girolami, 2000; Osler et al., 2002).
The farmer choice has to be guided by economic criteria. The replacement of affected
grapevines involves costs both direct (removing of affected grapevines and their
replacement with new grapevines) and indirect (missed yields in the first years of
grapevine rearing).
The maintenance of symptomatic grapevines involves yield losses, if in
the following years the grapevines continue to have symptoms or even die. The
replacement of dead grapevines in the years following to appearance of the disease
implies an economic damage because the new grapevines delay the reaching of the full
production. For FD a further economic damage has to be ascribed to the symptomatic
grapevines because they are a source of phytoplasma for healthy ones.
The advantage to replace a symptomatic grapevine was mostly influenced by
cultivar sensitivity (yield losses and mortality incidence in the following years) and
by the residual productive life of the vineyard.
In Friuli Venezia Giulia region the replacement of Chardonnay and Merlot
grapevines affected by BN was not profitable also considering a residual lasting of 20
years.
Key words: Grapevines, Grape Yellows, Yield loss, Recovery, Replanting.
317
Girolami V., 2000. Vettori e problemi aperti sui giallumi della vite. In: Petria, 10,
167-170.
Osler R., C. Zucchetto, L. Carraro, C. Frausin, N. Mori, F. Pavan, G. Vettorello,
V. Girolami, 2002. Trasmissione di flavescenza dorata e legno nero e
comportamento delle viti infette. L’Informatore Agrario, 58 (19) 61-65.
Pavan F., L. Carraro, G. Vettorello, E. Pavanetto, V. Girolami, R. Osler, 1997.
Flavescenza dorata nei vigneti delle colline trevigiane. L’Informatore Agrario,
53 (10) 73-78.
Posenato G., R. Consolaro, N. Mori, V. Girolami, 1996. La flavescenza dorata
nell’area del Soave. L’Informatore Agrario, 52 (20) 61-65.
318
PROVE DI RISANAMENTO, TRAMITE TERMOTERAPIA, DI
TALEE DI VITI AFFETTE DA GIALLUMI:
RISULTATI PRELIMINARI
A. Zorloni, P. Casati, G. Durante, PA. Bianco, G. Belli
La termoterapia in acqua è considerata un metodo efficace per l’eradicazione
di microrganismi patogeni (in particolare fitoplasmi) da materiale vegetale. Diversi
lavori sono stati svolti in anni passati al fine di verificare l’efficacia di questa tecnica
per risanare materiale viticolo infetto da fitoplasmi agenti di Flavescenza dorata (FD)
e Legno nero (LN). Risultati incoraggianti sono stati ottenuti per il risanamento da
FD (Caudwell et al., 1990; Bianco et al., 2000; Mannini e Marzachì, 2007), mentre
notevoli perplessità sono sorte in seguito alle prove eseguite nei confronti di LN
(Frausin et al., 1999; Tassart-Subirats et al., 2003).
Il seguente lavoro riporta i risultati di prove di risanamento tramite termoterapia
effettuate su materiale viticolo affetto prevalentemente da LN, appartenente alle
varietà Chardonnay e Barbera, prelevato durante l’inverno 2005-2006 in vigneti
di Franciacorta e Oltrepò pavese. Il legno raccolto è stato conservato a +4°C fino
all’esecuzione della prova, avvenuta ad aprile del 2006. I tralci, suddivisi in talee di
3-4 gemme e raccolti in fascine omogenee, sono stati sottoposti ad un pre-adattamento
in acqua a +22 °C per un’ora, quindi al trattamento vero e proprio. Sono state provate
quattro tesi di trattamento differenti per temperatura e tempo di esposizione, ovvero:
tesi A, 45 °C per 3 ore; tesi C, 50 °C per 45 minuti; tesi D, 52 °C per 45 minuti; tesi E,
52 °C per 30 minuti. Nella prova è stato inoltre inserito un testimone non trattato (tesi
NT), costituito da tralci prelevati dalle stesse viti malate, non sottoposti a trattamento
termico.
La percentuale di sopravvivenza del materiale trattato è diminuita con
l’aumentare della temperatura: 61% per il materiale trattato a 45 °C (tesi A); 46% per
il materiale trattato a 50 °C (tesi C); 31% per quello trattato a 52 °C per mezz’ora (tesi
E); 22% per quello trattato a 52 °C per 45 minuti (tesi D). In tutto sono state ottenute
275 viti, mantenute in osservazione all’interno di una screen-house: 88 sono state
ottenute da talee sottoposte alla tesi A; 67 da talee sottoposte alla tesi C; 30 alla tesi D;
41 alla tesi E; 49 da talee non trattate.
Le piante sono state sottoposte a periodici controlli basati su osservazioni
visive, al fine di accertare l’assenza di sintomi di giallume. Sulle medesime piante
sono tuttora in corso analisi di laboratorio (PCR e Real-time PCR). Le osservazioni
319
visive eseguite a ottobre 2007, hanno rilevato quanto segue: tesi A: 78 piante su 88
(pari all’89%) non presentavano sintomi di giallume; tesi C, 61 su 67 (91%); tesi D,
27 su 30 (90%); tesi E, 38 su 41 (93%). Per quanto riguarda le 49 viti non sottoposte a
trattamento termico, 27 di esse (pari al 55%) non manifestavano sintomi, e 22 (45%)
presentavano accartocciamenti della lamina fogliare, ingiallimenti (Chardonnay) ed
arrossamenti (Barbera). Esiti preliminari delle analisi di laboratorio eseguite su alcune
delle viti termotrattate, escludono la presenza di fitoplasmi appartenenti al gruppo
tassonomico 16SrXII-A.
I risultati fin qui ottenuti, inducono a ritenere che i trattamenti eseguiti a
temperature più elevate (52 e 50 °C) siano quelli più efficaci, con percentuali di
risanamento superiori al 90%, sebbene la vitalità del materiale viticolo sottoposto a
tali temperature per tempi prolungati venga in alcuni casi compromessa.
Parole chiave: Termoterapia, Giallumi della vite, PCR, Real-time PCR.
Hot water treatment on Grapevine Yellows affected plants: preliminary results
Hot water treatment (HWT) has been proposed as an efficient method to
eradicate pathogenic microrganisms from woody plant material. Some works were
conducted in order to verify HWT efficacy on phytoplasma-infected vine material.
Encouraging results were obtained for Flavescence dorèe (Caudwell et al., 1990;
Bianco et al., 2000; Mannini e Marzachì, 2007), while results for Bois noir were
uncertain (Frausin et al., 1999; Tassart-Subirats et al., 2003).
The present work reports the results of HWTs conducted on lignified canes
collected during winter 2005-2006 from mostly BN infected Chardonnay and Barbera,
in Franciacorta and Oltrepò pavese vineyards. Cuttings, maintained in refrigerated
cells (+4 °C) till April 2006, were firstly pre-treated for 1 hour in +22 °C water before
being treated. Different HWT conditions (temperatures and durations) were checked:
3 hours at +45 °C (thesis A); 45 minutes at +50 °C (thesis C); 45 minutes at +52 °C
(thesis D); 30 minutes at +52 °C (thesis E). Cuttings from the same infected vines, but
not HW treated, were included in the experiments as untreated controls (thesis NT).
Percentage of vitality of treated cuttings was higher with lower temperature
conditions: 61% for canes treated at +45 °C (thesis A); 46% for canes treated at +50
°C (thesis C); 31% for canes treated at +52 °C for 30 minutes (thesis E); 22% for
canes treated at +52 °C for 45 minutes (thesis D). Totally, 275 rooted cuttings were
obtained: 88 from thesis A; 67 from thesis C; 30 from thesis D; 41 from thesis E; 49
from not treated material.
All the plants were maintained in screen-house and periodically observed in
order to verify the absence of Grapevine Yellows (GY) symptoms. Molecular analysis
320
(PCR, Real-time PCR) on samples collected from the same plants are in progress.
Visual screening conducted in October 2007 revealed no GY symptoms on 89% of
the vines of the thesis A; 91% in the thesis C; 90% thesis D; 93% thesis E. 45% of
untreated plants showed rolling and yellowing (Chardonnay) or reddening (Barbera)
of the leaves, while 55% of them were symptomless. Molecular tests conducted up to
now on samples collected from some treated plants, exclude the presence of 16SrXIIA phytoplasmas.
Results obtained in these experiments suggest that higher temperature HWTs
(50-52°C) are the most efficient, with over 90% health plants, but severe damage can
occur to the treated material.
Key words: HWT , Grapevine Yellows, PCR, Real-time PCR.
Bianco PA., A. Fortusini, G. Scattini, P. Casati, S. Carraro, GC. Torresin, 2000.
Prove di risanamento di materiale viticolo affetto da Flavescenza dorata
mediante termoterapia. Informatore fitopatologico 50 (4), 43-49.
Caudwell A., J. Larne, C. Valat, S. Grenan, 1990. Les traitements à l’eau chaude
des bois de vigne atteints de Flavescence dorèe. Progrès Agricole et Viticole
107, 281-286.
Frausin C., A. Gregoris, F. Anaclerio, 1999. Verifica di pratica utilizzazione della
tecnica di termoterapia in acqua calda per il risanamento di talee di vite affette
da giallume (GY). Atti Convegno “Flavescenza dorata e legno nero della vite
in Friuli-Venezia Giulia”, Gorizia, 5/11/99; 85-90.
Mannini F., C. Marzachì, 2007. Termoterapia in acqua contro i fitoplasmi della vite.
L’Informatore Agrario, 63 (24) 62-65.
Tassart-Subirats V., D. Clair, S. Grenan, E. Boudon-Padieu, J. Larrue, 2003.
Hot water treatment: curing efficiency for phytoplasma infection and effect
on plant multiplication material. Extended abstracts 14th ICVG Conference,
Locorotondo (Bari), 12-17th September 2003: 69-70.
321
Altre fitoplasmosi
Coordinatore: Assunta Bertaccini
S. Murolo, L. Biagiarelli, G. Romanazzi
Caratterizzazione molecolare di ‘Candidatus Phytoplasma ulmi’ in bonsai di
olmo infetti da giallumi
R. d’Amelio, D. Bosco, G. Berta, G. d’Agostino, E. Gamalero, N. Massa,
C. Marzachì
Effetto di elicitori biotici ed abiotici di resistenza su margherite infette da
giallume del crisantemo
E. Mazzoni, A.Gentili, M. Romanini, C. Delvago, V. Testi, G. Pasquini
Studi preliminari sul ciclo epidemiologico dello Stolbur in campi di pomodoro
infetti localizzati nell’Italia settentrionale
Sintesi poster: Cristina Marzachì
A. Bertaccini, S. Paltrinieri, A. Benni, M.G. Bellardi
Una grave malattia associata alla presenza del fitoplasma del giallume dell’astro
in Grindelia robusta Nutt.
M. Martini, L. Carraro, C. Marcone, M. Maixner, D. Deli, A. Myrta
Caratterizzazione molecolare di fitoplasmi associati a giallume in convolvolo.
V. De Luca, C. Capasso, G. Catara, M. Pastore, L. Carraro, A. Capasso, V.
Carginale
Identificazione dei geni di pervinca la cui espressione risulta alterata in seguito
ad infezione con ‘Candidatus Phytoplasma pyri’.
E. Mancini, C. Marcone, V. De Feo
Indagini sul metabolismo secondario di piante di Spartium junceum affette
dalla malattia degli scopazzi della ginestra.
V. Vicchi, A. D’Anniballe, P. Fini, P. Grillini
Epidemie del fitoplasma dello Stolbur su fragola e specie orticole in EmiliaRomagna.
F. Terlizzi, A. R. Babini, D. Dradi, T. Battelli, P. Lucchi, R. Credi
Ulteriori osservazioni sulla clorosi del margine fogliare della fragola.
Caratterizzazione MOLECOLARE di ‘Candidatus
Phytoplasma ulmi’ in bonsai di olmo infetti da
giallumi
S. Murolo, L. Biagiarelli, G. Romanazzi
Ulmus L., il genere della famiglia delle Ulmaceae più diffuso in Europa,
raggruppa circa 45 specie, molte delle quali ben si adattano ad essere allevate come
bonsai. Una delle più diffuse e pericolose malattie di tali specie è rappresentata dagli
“scopazzi dell’olmo”, il cui agente eziologico è ‘Candidatus Phytoplasma ulmi’
(sottogruppo 16SrV-A) (Lee et al., 2004). Tale malattia è stata riscontrata su piante
adulte di U. parvifolia, U. pumila, U. chenmoui e U. minor in alcune regioni del
sud Italia (Marcone et al., 1997), in Emilia Romagna (Pisi et al., 1981), Toscana
(Sfalanga et al., 2002), Lombardia (Mittempergher et al., 1990; Quaglino et al.,
2005) e in Friuli Venezia Giulia, dove Macropsis mendax (Fieber) è stato riscontrato
come vettore (Carraro et al., 2004). Romanazzi e Murolo (2008) hanno recentemente
riportato infezioni di ‘Ca. Phytoplasma ulmi’ in piante di olmo giapponese (Zelkova
serrata Spach.) con sintomi di giallume, e bonsai di U. parvifolia sono stati rinvenuti
infetti dallo stesso fitoplasma nelle Marche (Murolo e Romanazzi, 2008).
Scopo del lavoro è stato quello di caratterizzare, mediante tecniche di analisi
molecolare, fitoplasmi da esemplari sintomatici di U. parvifolia, Ulmus sp. e Z.
serrata.
A partire dal giugno 2006, sono state ispezionate piante pre-bonsai e bonsai
che manifestavano sintomi ascrivibili ad infezioni da fitoplasmi: arrossamento
delle foglie, modesto sviluppo degli apici vegetativi, lenta crescita e rosettamento
dell’intera pianta. Foglie sintomatiche di olmo sono state sottoposte all’estrazione
del DNA totale mediante il kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,
Hilden, Germany). Il DNA è stato amplificato utilizzando i primer universali P1/P7
e successivamente in nested PCR le coppie di primer R16(I)F1/R1, R16(V)F1/R1
e R16(III)F1/R2, specifiche rispettivamente per i gruppi ribosomali 16SrI, 16SrV
e 16SrIII. I campioni amplificati con i primer R16(V)F1/R1 sono stati digeriti con
l’enzima di restrizione BfaI (New England BioLabs, Beverly, MA) a 37°C per tutta la
notte e in parte sequenziati.
Tutti i campioni sintomatici, risultati negativi quando amplificati con i primer
P1/P7, hanno evidenziato un amplicone di 1050 pb quando sottoposti a nested-PCR
325
con i primer R16(V)F1/R1. L’analisi PCR-RFLP utilizzando l’enzima di restrizione
BfaI ha consentito di ottenere, in tutti i campioni amplificati, un profilo elettroforetico
paragonabile a quello di fitoplasmi appartenenti al sottogruppo 16SrV-A. Confrontando
la sequenza del gene 16S rRNA, i fitoplasmi rinvenuti in piante sintomatiche di U.
parvifolia, Ulmus sp. e Z. serrata sono risultati tra loro identici e molto simili (99,4%
di omologia) alla sequenza dell’isolato EY-627 (AY197658), depositata in Genbank. I
dati riportati in questo lavoro suggeriscono l’opportunità di ampliare il monitoraggio
della malattia su olmi bonsai e verificare la presenza del fitoplasma e di eventuali
vettori in piante importate.
Parole chiave: Ulmus parvifolia, Zelkova serrata, PCR-RFLP, 16Sr DNA,
Sequenziamento.
Characterization of ‘Candidatus Phytoplasma ulmi’ in yellows infected
bonsai elm
Ulmus L. is the most prevalent genus of the Ulmaceae family in Europe, and it
contains about 45 species, most of which can be trained as perfect bonsai specimens.
One of the most widespread and serious diseases of the species is elm witches’ broom,
which is caused by ‘Candidatus Phytoplasma ulmi’ (sub-group 16SrV-A) (Lee et al.,
2004). This disease has been detected in mature U. parvifolia, U. pumila, U. chenmoui
and U. minor in southern Italy (Marcone et al., 1997) and in several other Regions
including Emilia Romagna (Pisi et al., 1981), Tuscany (Sfalanga et al., 2002),
Lombardy (Mittempergher et al., 1990; Quaglino et al., 2005), and Friuli-VeneziaGiulia, where Macropsis mendax (Fieber) was found as a vector of the disease-causing
phytoplasma (Carraro et al., 2004). Recently, Romanazzi and Murolo (2008) reported
infections of ‘Ca. Phytoplasma ulmi’ in symptomatic Japanese elm (Zelkova serrata
Spach.), as well as in U. parvifolia bonsai infected by the same phytoplasma were
found in the Marche region (Murolo and Romanazzi, 2008).
The aim of the present study was to use molecular tools to characterize the
phytoplasma infecting U. parvifolia, Ulmus sp. and Z. serrata.
From June 2006, we carried out surveys on pre-bonsai and bonsai plants that
showed symptoms associated with phytoplasma: foliar reddening on one or more
branches, attenuation of apical shoots, slow growth and stunting of the entire plant,
and witches’ broom. Leaf samples from symptomatic plants were processed, and their
total nucleic acids were extracted using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany). The DNA samples were amplified with the P1/P7 universal primer pair
and the resulting products were used as templates in nested PCR. This PCR made
use of the R16(I)F1/R1, R16(V)F1/R1, and R16(III)F1/R2 primer pairs, which can
326
amplify specific ribosomal fragments of the 16Sr groups I, V and III, respectively.
The 1,100-bp PCR products obtained with R16(V)F1/R1, were digested with the
restriction endonuclease BfaI (New England BioLabs, Beverly, MA, USA), overnight
at 37°C, and some of them were sequenced.
All of the symptomatic samples were negative with the P1/P7 universal
primer pair, but gave an amplicon of 1,050 bp when analysed by nested-PCR with the
R16(V)F1/R1 primers.
PCR-RFLP using the restriction enzyme BfaI yielded a similar pattern to
the 16SrV-A subgroup in all of the isolates analysed. The 16S rDNA sequences of
phytoplasma infecting U. parvifolia, Ulmus sp. and Z. serrata were identical and
showed high sequence homology with EY-627 (99.4%), as available in the Genbank
database (AY197658).
The data reported here highlight the need for a large-scale survey to determine
the spread of this phytoplasma in bonsai elms to reveal the presence of the phytoplasma
and eventual vectors in imported plants.
Key words: Ulmus parvifolia, Zelkova serrata, PCR-RFLP, 16Sr DNA, Sequencing.
Carraro L., F. Ferrini, P. Ermacora, N. Loi, M. Martini, R. Osler, 2004. Macropsis
mendax (Fieber) as a vector of elm yellows phytoplasma of Ulmus species.
Plant Pathology, 53, 90-95.
Lee IM., M. Martini, C. Marcone, SF. Zhu, 2004. Classification of phytoplasma strains
in the elm yellows group (16SrV) and proposal of ‘Candidatus Phytoplasma
ulmi’ for the phytoplasma associated with elm yellows. International Journal of
Systemic and Evolutionary Microbiology, 54, 337-347.
Marcone C., A. Ragozzino, E. Seemüller, 1997. Identification and characterization
of the phytoplasma associated with elm yellows in southern Italy and its
relatedness to other phytoplasmas of the elm yellows group. European Journal
Forest Pathology, 27, 45-54.
Mittempergher L., A. Fagnani, F. Ferrini, G. D’Agostino, 1990. Elm yellows a
disease to be taken into consideration when breeding elm for disease resistance.
In: Institute Agronomique et Veterinaire Hassan II (Ed.). Proceedings of the 8th
Congress of the Mediterranean Phytopathological Union, Agadir, Morocco: 433435.
327
Murolo S., G. Romanazzi, 2008. Infections of ‘Candidatus Phytoplasma ulmi’ in
Ulmus parvifolia, Ulmus sp. and Zelkova serrata trained as bonsais. Journal of
Plant Pathology, 90, 343-347.
Pisi A., F. Marani, A. Bertaccini, 1981. MLOs associated with elm witches’ broom
symptoms. Phytopathologia Mediterranea, 20, 189-191.
Quaglino F., P. Casati, T. Eccher, PA. Bianco, 2005. Variabilità genetica di fitoplasmi
appartenenti alla specie ‘Ca. Phytoplasma ulmi’ riscontrati in un olmo (Ulmus
minor) secolare. Petria, 15, 209-211.
Romanazzi G., S. Murolo, 2008. ‘Candidatus Phytoplasma ulmi’ causing yellows in
Zelkova serrata newly reported in Italy. New Disease Report 17, Plant Pathology, 57 (in stampa).
Sfalanga A., M. Martini, G. Surico, A. Bertaccini, 2002. Involvement of phytoplasmas in a decline of Ulmus chenmoui in Central Italy. Forest Pathology,
32, 265-275.
www.bspp.org.uk/ndr/july2008/2008-26.asp
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Indagini eziologiche su malattie di piante ornamentali nella
Regione”, promosso dall’Università Politecnica delle Marche. Si ringraziano il Dott. Davide Streccioni per
la collaborazione nei sopralluoghi e la Dott.ssa Silvia Zitti per l’aiuto nell’identificazione delle specie.
328
Effetto di elicitori biotici ed abiotici di
resistenza su margherite infette da
giallume del crisantemo.
R. D’Amelio1, 2, D. Bosco2, G. Berta3, G. D’Agostino1, E. Gamalero3,
N. Massa3, C. Marzachì1*
Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Strada delle Cacce, 73 I -10135 (TO)
2
Universita’ degli Studi di Torino, Di.Va.P.R.A.
Viale Pier Andrea Mattioli, 39 I-10125 (TO)
3
Università del Piemonte orientale, Dipartimento
di Scienze dell’Ambiente e della Vita,
Via Bellini, 25/G I-15100 (AL)
1
E - mail - [email protected]
I funghi vescicolo arbuscolari (AM) sono presenti naturalmente nelle
radici della maggior parte degli alberi da frutto. Essi stabiliscono un’associazione
mutualistica con la pianta che risulta in una sua migliore resistenza a stress di origine
abiotica (Leyval et al., 2002) e biotica (Berta et al., 2005). In letteratura è noto che
il fungo AM Glomus mosseae può ridurre di circa il 70 % l’infezione da Stolbur in
piante di pomodoro (Lingua et al., 2002). Anche la presenza di rizobatteri non patogeni
può indurre resistenza sistemica acquisita (ISR) nelle piante. Livelli efficienti di ISR
sono stati riportati nei confronti di numerosi e diversi patogeni, tra cui funghi, virus e
batteri (van Loon et al., 1998). Anche alcuni composti di origine naturale o sintetica,
privi di evidenti effetti deleteri diretti sul patogeno, possono indurre l’attivazione del
meccanismo di difesa della pianta nei confronti di numerosi patogeni (Ryals et al.,
1996). Tra questi, l’estere S-metilico dell’acido benzo (1,2,3) tiadiazole-7-carbotioico
(BTH) possiede una ben nota attività capace di elicitare il meccanismo di difesa della
pianta nei confronti di patogeni diversi e di ridurre l’infezione da fitoplasma in piante
di Arabidopsis thaliana inoculate con insetti vettori del fitoplasma X-disease (Bressan
and Purcell, 2005).
Abbiamo utilizzato il ritardo nello sviluppo della sindrome infettiva e nella
morte della pianta per valutare l’attività di 1) funghi micorrizici arbuscolari (Glomus
mosseae e G. intraradices), 2) rizobatteri (Pseudomonas putida S1PF1, Pseudomonas
aureofaciens 30-84 e Streptomyces sp. SB20), e 3) BTH come induttori di resistenza
contro l’infezione da “Candidatus Phytoplasma asteris” nel crisantemo (giallume del
crisantemo).
329
Trattamenti con G. mosseae e P. putida S1PF1 hanno ridotto il numero di piante
con sintomi di giallume, ed hanno esteso il tempo di sopravvivenza delle piante infette
rispetto a quelle di controllo; gli stessi trattamenti hanno anche diminuito l’eccesso di
ramificazione indotto dal fitoplasma. Nelle piante trattate con il rizobatterio P. putida
S1PF1 gravi sintomi della fitoplasmosi sono comparsi con una settimana di ritardo
rispetto ai controlli.
Sono anche stati misurati numerosi parametri morfologici e fisiologici per
confermare gli effetti degli elicitori analizzati. Piante infette trattate con G. intraradices,
avevano lo stesso peso fresco delle radici e del fusto dei controlli non infettati. Inoltre,
G. intraradices e Pseudomonas sp. S1Pf1 e 30-84 erano in grado di ridurre l’eccesso
di ramificazione associato alla fitoplasmosi.
Il trattamento con 2.4 mM BTH ha prodotto un numero inferiore di piante
sintomatiche e le piante infette mostravano un ritardo nella comparsa dei sintomi.
Due piante che erano infette a 40 giorni dopo l’inoculazione (dpi) risultavano
asintomatiche a 60 dpi e rimanevano tali fino alla fine dell’esperimento. Queste piante
risultavano effettivamente prive di fitoplasma al saggio diagnostico effettuato alla
fine dell’esperimento. Il trattamento con BTH non era apparentemente in grado di
compensare le alterazioni morfometriche associate alla fitoplasmosi.
Il titolo del fitoplasma nelle piante infette non era influenzato né dai trattamenti
abiotici né da quelli biotici. Le possibili interazioni tra gli elicitori e gli insetti vettori
delle fitoplasmosi saranno anche oggetto di ulteriori approfondimenti.
Parole chiave: Glomus mosseae, Glomus intraradices, Pseudomonas, Streptomyces, BTH.
Preliminary results on the effects of biotic and abiotic elicitors of plant
resistance on chrysanthemum yellows phytoplasma infection.
Arbuscular mycorrhizal fungi (AM) are naturally present in the roots of most
fruit trees. They establish a mutualistic association with the plant, which results in an
improved resistance to abiotic (Leyval et al., 2002) and biotic stresses (Berta et al.,
2005). It has been reported that the AM fungus Glomus mosseae may reduce Stolbur
infection of tomato plants of about 70% (Lingua et al., 2002). Also the presence
of non-pathogenic rhyzosphere bacteria may induce a systemic resistance (ISR) in
plants. Efficient ISR has been described towards several pathogens, including fungi,
viruses and bacteria (van Loon et al., 1998). Few natural or synthetic compounds, with
no obvious deleterious effect on the pathogen, may also induce the activation of the
330
plant defence machinery against several pathogens (Ryals et al., 1996). Benzo (1,2,3)
thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH) has also a well-known ability
to elicit host plant defence against different pathogens and to reduce phytoplasma
infection of Arabidopsis thaliana plants inoculated with X-disease phytoplasmainfective vectors (Bressan and Purcell, 2005).
Delay of syndrome development and of plant death has been used to evaluate the
activity of 1) the arbuscular mycorrhizal fungi Glomus mosseae and G. intraradices, 2)
the rhizobacteria Pseudomonas putida S1PF1, Pseudomonas aureofaciens 30-84 and
Streptomyces sp. SB20, and 3) benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl
ester (BTH) as inducers of resistance against chrysanthemum yellows phytoplasma
infection.
Treatments with G. mosseae and P. putida S1PF1 slightly reduced the number
of CY-infected plants, extended the life span of the affected plants, as compared to
the controls and overcame the stem branching induced by the phytoplasma. In plants
treated with the bacterial strains P. putida S1PF1 serious phytoplasma symptoms
appeared a week later than in the controls.
Several morphological and physiological parameters were measured to confirm
the effects of the elicitors on the plants. Infected plants treated with G. intraradices,
had the same fresh root and stem weight as the uninfected controls. Moreover G.
intraradices and Pseudomonas sp. S1Pf1 and 30-84 reduced the stem branching
associated with CY infection.
Treatment with 2.4 mM BTH resulted in a lower number of symptomatic plants.
Infected plants showed a delay in disease development. Two plants that were infected
at 40 days post inoculation (dpi) became symptomless at 60 dpi and remained healthy
until the end of the experiment. These plants were phytoplasma-free at the end of the
experiment. Treatment with BTH apparently did not compensate for morphological
alterations associated with CY infection.
Phytoplasma titre in infected plants was not influence by either abiotic or biotic
treatements. The possible interactions between elicitors and insect vectors will also
be investigated.
Key words: Glomus mosseae, Glomus intraradices, Pseudomonas, Streptomyces, BTH.
331
Berta G., S. Sampo, E. Gamalero, N. Massa, P. Lemanceau, 2005. Suppression of
Rhizoctonia root-rot of tomato by Glomus mossae BEG12 and Pseudomonas
fluorescens A6RI is associated with their effect on the pathogen growth and on the
root morphogenesis. European Journal of Plant Pathology, 111, 279-288.
Bressan A., AH. Purcell, 2005. Effect of benzothiadiazole on transmission of X-disease
phytoplasma by the vector Colladonus montanus to Arabidopsis thaliana, a new
experimental host plant. Plant Disease, 89, 1121-1124.
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Van Loon LC., P. Bakker, CMJ. Pieterse, 1998. Systemic resistance induced by
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332
STUDI PRELIMINARI SUL CICLO EPIDEMIOLOGICO
DELLO STOLBUR IN CAMPI DI POMODORO INFETTI
LOCALIZZATI NELL’ITALIA SETTENTRIONALE
E. Mazzoni1, A. Gentili2, M. Romanini1, C. Delvago3, V. Testi3, G. Pasquini2
Istituto di Entomologia e Patologia Vegetale Università Cattolica del Sacro Cuore
Via Emilia Parmense, 84 I-29100 (PC)
2
CRA-PAV Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale
3
Consorzio Fitosanitario Provinciale di Parma Viale Gramsci, 26/C, I-43100 (PR)
1
Il pomodoro risulta essere frequentemente infetto da una fitoplasmosi, il cui
agente eziologico appartiene al sottogruppo ribosomico 16SrXII-A (STOL). Nel
2005 la malattia è stata segnalata per la prima volta nella provincia di Parma (EmiliaRomagna), dove è presente una delle più importanti aree italiane di coltivazione del
pomodoro da industria. La presenza del fitoplasma è stata segnalata in diversi campi in
tre successive annate di coltivazione e la malattia è in forte espansione con percentuali
di piante infette fino al 20-30% e con una perdita di produzione fino al 40% (Testi et
al., 2006 e 2007). Nel 2006 il fitoplasma è stato individuato anche in alcuni areali
pomodoricoli della provincia di Piacenza.
Al fine di definire il ciclo epidemiologico della malattia per attuare tempestivi
interventi di controllo, sono state effettuate indagini in 19 campi di pomodoro
localizzati nella provincia di Parma e Piacenza. In questi campi a fine estate sono stati
raccolti campioni sintomatici di piante di pomodoro ed è stata effettuata una analisi
e raccolta di campioni delle principali piante spontanee presenti all’interno e nelle
bordure dei campi, per valutare il loro ruolo come ospiti intermedi di specie vettrici
o come sorgente di inoculo del fitoplasma. Contestualmente è stata effettuata una
analisi della entomofauna presente nei campi. Gli insetti sono stati catturati mediante
trappole cromotattiche gialle invischiate e/o con retino entomologico.
Il DNA totale è stato estratto dai campioni fogliari con il protocollo descritto
da Marzachì et al. (1998) e dai singoli insetti tramite l’uso di un kit commerciale
(SIGMA Genelute mammalian genomic DNA miniprep kit). L’amplificazione del
gene 16S è stata effettuata mediante una PCR diretta con i primers P1/P7 (Deng
& Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995), seguita da una nested-PCR con i primers
R16(I)F1/R1 (Lee et al., 1994) o con i primers universali M1(= 16k758f) (Gibb et
al., 1995)/B6(=758f/m23sr) (Padovan et al., 1995). Le condizioni di amplificazione
e le miscele di reazione utilizzate sono state quelle indicate nel protocollo pubblicato
(Pasquini et al., 2001). Il sottogruppo 16SrXII-A è stato individuato mediante l’analisi
333
dei profili di restrizione degli ampliconi ottenuti nelle nested-PCR con gli enzimi MseI
o TaqI. L’amplificazione del gene tuf per la individuazione degli isolati di Stolbur è
stata effettuata mediante una PCR diretta con i primers fTufAY/rTufAY (Schneider
et al., 1997), seguita da una nested-PCR con i primers TufAYf2/r2 (Pasquini et al.,
2007). La definizione degli isolati è stata ottenuta mediante l’analisi dei profili di
restrizione ottenuti dopo digestione degli ampliconi con l’enzima HpaII (Langer e
Maixner, 2004).
Tutti i campioni di pomodoro analizzati sono risultati appartenere all’isolato tuf
tipo II, indistinguibile dal ceppo tipo Serbian Stolbur (STOL, 16SrXII-A), utilizzato
come controllo positivo. Sei specie di piante spontanee (Aristolochia clematitis,
Convolvulus arvensis, Calystegia sepium, Plantago lanceolata, Setaria viridis e
Urtica dioica) e due specie di piante coltivate (Trifolium sp. e Medicago sativa) sono
risultate positive all’infezione di Stolbur. Il convolvolo, la callistegia, la aristolochia,
la piantaggine ed il trifoglio sono risultati infetti da tuf tipo II, mentre l’ortica e l’erba
medica dal tuf tipo I. Non è stato, invece, possibile ottenere alcuna amplificazione del
gene tuf da piante di S. viridis risultate infette.
Tra gli insetti raccolti, vari esemplari appartenenti a diverse specie sono
risultati positivi nelle PCR effettuate con primers universali (Anaceratagallia sp.,
Aphrodes sp., Dictyophara europea, Euscelidius sp., Laodelphax sp., Macrosteles
sp., Metcalfa pruinosa, Philaenus spumarius, Psammotettix sp. e Zyginidia sp.). I
fitoplasmi individuati, non ascrivibili al gruppo “Stolbur” non sono stati ulteriormente
caratterizzati.
La presenza di Stolbur è stata evidenziata in individui di Hyalesthes obsoletus,
risultati tutti infetti dall’isolato tuf tipo I e in un esemplare di D. europea, che non è
stato possibile caratterizzare.
I risultati preliminari ottenuti in una annata di prelievi non hanno, al momento,
consentito di definire il ciclo epidemiologico della malattia in pomodoro. Ulteriori
approfondimenti sono necessari per individuare, soprattutto, gli insetti coinvolti nella
trasmissione del fitoplasma.
Parole chiave: 16SrXII-A fitoplasma, Tuf tipo I, Tuf tipo II, Spontanee, Insetti.
334
Preliminary studies on epidemiological cycle of stolbur in tomato
infected fields in northern Italy
Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) is reported to be frequently infected
by “Stolbur” disease, one of the main important tomato systemic syndrome, whose
etiological agent belongs to the 16SrXII-A subgroup.
In 2005 the disease appeared in Parma’s province (Emilia Romagna region),
where there is an important Italian area of processing tomato production. The presence
of phytoplasma was reported in several tomato fields during three years of production
(2005-2007) and appears to be in expansion with a percentage of infected plants up
to 20-30% and 40% yield loss (Testi et al., 2006 and 2007). Symptomatic plants were
detected since 2006 also in the province of Piacenza.
In order to improve the knowledge of the Stolbur tomato disease and to get
information to develop a selective control of its spreading, in several tomato fields in
the provinces of Parma and Piacenza different weed and insect species were collected,
identified and molecularly characterized.
Leaf samples of different tomato varieties and of the main weeds present in the
fields have been collected in 19 fields in the provinces of Piacenza and Parma at the
end of the summer. In the same fields insect have been captured using yellow sticky
traps and/or sweeping nets, starting from May till the end of August.
Total DNA has been extracted from 1.5 g of mid-ribs of plant samples following the protocol reported by Marzachì et al., (1999) and from single insects using a
commercial kit (SIGMA Genelute mammalian genomic DNA miniprep kit). The ribosomal sequence (16S gene) has been amplified (Pasquini et al., 2001) by a direct PCR
with the universal primers P1/P7 (Schneider et al., 1995; Deng and Hiruki, 1991), followed by a nested-PCR with the group-specific primer pairs R16(I)F1/R1 (Lee et al.,
1994) or with the primers pair M1(= 16k758f) (Gibb et al., 1995)/B6(=758f/m23sr)
(Padovan et al., 1995). The subgroup has been identified by RFLP analysis with MseI
or TaqI.
To characterize Stolbur isolates a fragment of the tuf gene sequence has been
amplified using a direct PCR with the primers fTufAY/rTufAY (Schneider et al.,
1997), followed by a nested PCR with the primers TufAYf2/r2 (Pasquini et al., 2007).
The molecular characterization has been obtained by RFLP analysis on 5% polyacrilamide gel of amplicons digestion with HpaII (Langer and Maixner, 2004).
All tomato samples resulted infected by Stolbur tuf type II, not distinguishable
from the Serbian Stolbur from pepper (STOL, 16SrXII-A), used as control. Six weed
species (Aristolochia clematitis, Convolvulus arvensis, Calystegia sepium, Plantago
lanceolata, Setaria viridis and Urtica dioica) and 2 crops (Trifolium sp. and Medicago
sativa) resulted positive for the presence of Stolbur infection. The molecular characterization of positive samples with “tuf” primers was unsuccessful only with S. viridis.
335
The characterization of the tuf types showed that C. arvensis and C. sepium, as well as
birthwort, narrow leaf plantain and clover were infected only by tuf type II, whereas
U. dioica and M. sativa resulted infected by tuf type I.
Several insect samples resulted phytoplasma positive(Anaceratagallia sp.,
Aphrodes sp., Dictyophara europea, Euscelidius sp., Laodelphax sp., Macrosteles sp.,
Metcalfa pruinosa, Philaenus spumarius, Psammotettix sp. e Zyginidia sp.). As these
phytoplasma were not correlated with the “Stolbur” group, any further characterizations was not carried out. Stolbur phytoplasma was detected only in Hyalesthes obsoletus and in one specimen of D. europaea. Only a few specimens of H. obsoletus
produced a positive amplification of the tuf gene and resulted to belong to the tuf I
type.
Key words: 16SrXII-A, tuf type I, Tuf type II, Weed, Insect.
Deng S., C. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and nonculturable mollicutes. Journal Microbiological Methods, 14, 53-61.
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experimentally infected insects. Annals Applied Biology, 133, 45-54.
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commercializzazione delle produzioni vivaistiche’, Locorotondo (BA-Italy),
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336
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Schneider B., KS. Gibb, E. Seemüller, 1997. Sequence and RFLP analysis of
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Testi V., C. Delvago, C. Vitali, B. Robuschi, P. Grillini, V. Vicchi, 2006. Comparsa e
diffusione di stolbur su Tomato nel Parmense. L’Informatore Agrario 62 (43),
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Testi V., C. Delvago, C. Vitali, B. Robuschi, E. Mazzoni, M. Romanini, 2007. Stolbur
ancora in espansione su pomodoro da industria. L’Informatore Agrario 63 (10),
37-39.
337
UNA GRAVE MALATTIA ASSOCIATA ALLA PRESENZA
DEL FITOPLASMA DEL GIALLUME DELL’ASTRO IN
GRINDELIA ROBUSTA NUTT.
A. Bertaccini, S. Paltrinieri, A. Benni, M.G. Bellardi
Grindelia robusta Nutt. (Asteraceae), nota in Italia come grindelia (in
inglese “wild sunflower”: girasole selvatico) è una pianta officinale perenne, dal
portamento eretto, nativa della California, che produce ampi e solitari capolini di
colore giallo acceso. Ha proprietà balsamiche ed anticatarrali, è infatti utilizzata a
scopo terapeutico per la cura delle sindromi da raffreddamento. Nella primavera del
2007, una malattia tipicamente riferibile ad infezione da fitoplasmi è stata osservata
in un impianto allestito nel Giardino delle Erbe “Augusto Rinaldi Ceroni” di Casola
Valsenio (Ravenna; Emilia-Romagna). I primi sintomi sono stati osservati nel mese
di maggio e con sempre maggiore frequenza nei mesi successivi, soprattutto durante
la fioritura. Infatti, nella fase vegetativa, solamente pochi esemplari mostravano
ingiallimento fogliare e/o riduzione di crescita, mentre nel periodo della schiusura
dei boccioli erano ben visibili sintomi di virescenza e fillodia, associati a parziale o
completo rosettamento e malformazione dei capolini fiorali.
Campioni sintomatici ed asintomatici sono stati sottoposti alle analisi di
laboratorio per individuare ed identificare i fitoplasmi eventualmente presenti. E’
stata applicata la tecnica PCR utilizzando i primers P1/P7 seguita da ‘nested’ PCR
con i primers F1/B6 (Duduk et al., 2004). Le analisi di RFLP sono state eseguite
utilizzando gli enzimi TruI e Tsp509I per 16 ore a 65°. Ulteriori analisi di PCR sono
state effettuate impiegando i primers fTufu/rTufu (Schneider et al., 1997) e rpF1C/
rp(I)R1A (Martini et al., 2007). Sono stati usati (come controllo) isolati di fitoplasmi
appartenenti ai sottogruppi ribosomici 16SrI-B: AYW, AY2192, CCH, EAY, KAY;
16SrI-A: CHRY; 16SrI-C: GY, PPT; 16SrI-F: CVB; 16SrI-L: BGWL. Le analisi
eseguite hanno confermato la presenza nei soli campioni sintomatici di fitoplasmi
appartenenti al sottogruppo ribosomico 16SrI-B (“Aster yellows”: giallume dell’astro,
AY, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’). I fitoplasmi individuati sono fra quelli più
diffusi al mondo in piante erbacee, arbustive ed anche arboree coltivate e spontanee,
e sono responsabili di malattie anche gravi dal punto di vista economico. Per quanto
riguarda le specie officinali, circa 11 anni fa fitoplasmi del sottogruppo 16SrI-B sono
stati identificati in Digitalis lutea L. (digitale gialla) e, nel 2007, in D. lanata Ehrh.
338
(digitale lanata), entrambe coltivate nello stesso Giardino delle Erbe (Bellardi et al.,
1999; 2007). Questo della grindelia costituisce il primo caso di infezione naturale da
fitoplasmi in G. robusta. Sono state avviate analisi sull’olio essenziale ottenuto da
piante sane ed infette al fine di valutare l’eventuale influenza di AY sulla qualità e
concentrazione dei principi attivi.
Parole chiave: Grindelia, Virescenza, Fillodia, Fitoplasma del Giallume dell’Astro.
A serious disease induced by aster yellows phytoplasma on
Grindelia robusta Nutt.
Grindelia robusta Nutt. (Asteraceae), also named wild sunflower or gum plant,
is an erect perennial plant native of California with large and solitary flower-heads,
consisting of yellow and single-serried ray-flowers. This species is employed in pharmaceutical manufacture since it is known to be antitussive, expectorant, sedative, and
also specific to asthmatic breathing. During the 2007 spring, a phytoplasma-like disease was observed in a cultivation of G. robusta located at the Herb Garden “Augusto
Rinaldi Ceroni” of Casola Valsenio (Ravenna; Emilia-Romagna region, northern
Italy). After first symptoms observation in May, an increasing percentage of symptomatic plants were found in the following months, at the blooming stage. In fact, before
flowering, only few yellowing symptoms were present on the leaves; however in some
cases, the plants showed reduction of leaf size and stunting. Whereas, at blooming,
severe virescence and phyllody symptoms were observed, in combination with a partially or complete rosetting and malformation of flower disks. A study was carried out
with the aim to verify phytoplasma presence and to determine their identity. Samples
from symptomatic plants were collected and tested by direct PCR with primers P1/P7
followed by nested PCR with primers F1/B6 (Duduk et al., 2004).
RFLP analyses were performed with TruI and Tsp509I for 16 hours at 65°C.
Further PCR analyses were carried out with primers fTufu/rTufu (Schneider et al.,
1997) and rpF1C/rp(I)R1A (Martini et al., 2007). Phytoplasma stains representative
of 16SrI-B ribosomal subgroup employed as reference were: AYW, AY2192, CCH,
EAY, KAY; of 16SrI-A: CHRY; of 16SrI-C: GY, PPT; of 16SrI-F: CVB and of 16SrIL: BGWL. Both direct and nested PCR as well as RFLP analyses on 16Sr DNA gene,
confirmed that in all the symptomatic samples examined phytoplasmas identified belong to ribosomal subgroup 16SrI-B (Aster yellows, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’). These phytoplasmas are associated with a number of economically important
diseases worldwide and represent one of the most diverse and widespread phytoplasma group. As regarding herbs, about 11 years ago 16SrI-B phytoplasmas were identified in Digitalis lutea L. (yellow floxglove) and in 2007 in D. lanata Ehrh. (woolly
339
floxglove), both cultivated in the same Herb Garden (Bellardi et al., 1999; 2007). This
is the first report of a phytoplasma infection in G. robusta. Researches involving the
possibility for phytoplasmas to modify essential oil concentration and/or quality are
in progress.
Key words: Grindelia robusta Nutt., Virescence, Phyllody, Aster Yellows
Phytoplasma.
Bellardi MG., C. Rubies-Autonell, A. Bertaccini, 1999. Infezioni da virus e
fitoplasmi in piante officinali in Emilia-Romagna. III Contributo. Informatore
fitopatologico, 49 (6), 47-53.
Bellardi MG., A. Benni, S. paltrinieri, A. Bertaccini, 2007. A severe disease
induced by ‘Candidatus Phytoplasma asteris” in Digitalis lanata. Bulletin of
Duduk B., S. Botti, M. Ivanovi, B. Krsti, N. Duki, A. Bertaccini, 2004. Identification
of phytoplasmas associated with grapevine yellows in Serbia. Journal of
Phytopathology, 152, 575-579.
Gundersen DE., IM. Lee, DA Schaff, NA. Harrison, CJ. Chang, RE. Davis, DT.
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Group I (Aster Yellows and related phytoplasmas) and III (X-Disease and
related phytoplasmas). International Journal of Systematic Bacteriology, 46,
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Martini M., IM. Lee, KD. Bottner, Y. Zhao, S. Botti, A. Bertaccini, NA. Harrison,
L. Carraro, C. Marcone, J. Khan, R. Osler, 2007. Ribosomal protein genebased filogeny for finer differentiation and classification of phytoplasmas.
Schneider B., KS. Gibb, E. Seemüller, 1997. Sequence and RFLP analysis of
phytoplasmas. Microbiology, 143, 3381-3389.
340
Caratterizzazione molecolare di fitoplasmi
associati a giallume in convolvolo
M. Martini1, L. Carraro1, C. Marcone2, M. Maixner3 D. Delic4, A. Myrta4
2
3
Julius Kuehn Institute (JKI), Federal Research Centre for Cultivated Plants,
Institute for Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture,
Brüningstraße 84, D-54470 Bernkastel-Kues
4
Istituto Agronomico Mediterraneo, Via Ceglie 9, I-70010 Valenzano (BA)
1
Piante di Convolvulus arvensis L. (convolvolo) con sintomi di giallume,
nanismo e/o proliferazione sono state osservate e raccolte nella regione Campania in
Italia meridionale, nella regione Wuerttemberg in Germania e nell’area di Sarajevo in
Bosnia-Erzegovina (BiH).
Sei ceppi di fitoplasmi del giallume del convolvolo (bindweed yellows, BY)
(3 dall’Italia, 2 dalla BiH e 1 dalla Germania) sono stati esaminati con analisi RFLP
e sequenziamento dei geni rDNA, rplV e rpsC (geni rp) e tuf amplificati tramite PCR.
Il ceppo P-TV (stolbur del pomodoro) mantenuto in pervinca è stato usato come
ceppo di riferimento appartenente al gruppo dello stolbur (16SrXII-A) in tutti gli
esperimenti di PCR/RFLP. Due procedure di PCR/RFLP basate su rDNA sono state
adottate usando rispettivamente i primers universali P1/P7 e R16F2n/R16R2, a cui ha
fatto seguito l’analisi RFLP con gli enzimi AluI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaII, MboI,
TaqI, e Tru1I. Tutti gli enzimi usati nell’analisi RFLP dei prodotti P1/P7, ad eccezione
di HhaI, hanno permesso di differenziare i ceppi BY dal ceppo di riferimento di
stolbur, P-TV; mentre solo gli enzimi Tru1I, HaeIII e AluI sono risultati utili per la
differenziazione dei ceppi sulla base dei prodotti R16F2n/R16R2. L’analisi delle
sequenze del gene 16S rDNA ha rivelato che i ceppi dei fitoplasmi BY condividevano
rispettivamente una similarità di sequenza pari a 96.5% con ‘Candidatus Phytoplasma
(Ca. P.) australiense’ e ‘Ca. P. fragariae’, e una similarità di sequenza pari a 96.3% con
ceppi di fitoplasmi appartenenti al gruppo dello stolbur, indicando quindi che i ceppi
BY potrebbero rappresentare un’entità tassonomica distinta.
Per amplificare i geni rp è stata usata in PCR la coppia di primers rpF1c/rpIR1A
(Martini et al., 2007), a cui è seguita l’analisi RFLP con le endonucleasi AluI, BstUI e
Tsp509I; mentre per amplificare il gene tuf è stata fatta una PCR-diretta con i primers
341
Tuf1f/Tuf1r e una PCR-nested con TufAYf/TufAYr, seguita da analisi RFLP con gli
enzimi HpaII, Tru1I e TstI (Schneider et al., 1997). L’analisi RFLP sui geni rp e tuf ha
dimostrato che tutti i ceppi BY erano simili tra loro e chiaramente differenti dal ceppo
di riferimento P-TV (16SrXII-A). In particolare, l’analisi RFLP dei prodotti TufAYf/
TufAYr ha differenziato i tre ceppi Italiani di BY dagli altri e ha indicato che tutti i
ceppi BY non appartenevano al tipo tuf tipo-II (Langer and Maixner, 2004), tipico
dei fitoplasmi appartenenti al gruppo dello stolbur, trovati normalmente associati
con il convolvolo. La presenza di variabilità genetica tra i ceppi BY nel gene tuf, è
stata più tardi rafforzata dal sequenziamento e dall’analisi delle sequenze del gene
tuf, che rappresenta un gene meno conservato del 16S rDNA. Inoltre, l’analisi delle
sequenze dei geni rp ha confermato che i ceppi BY sono strettamente correlati ai
fitoplasmi appartenenti al gruppo dello stolbur e ad altri gruppi affini, condividendo
la più alta similarità di sequenza con ‘Ca. P. americanum’ (89%), ‘Ca. P. australiense’
(86%) e con il ceppo P-TV di stolbur (83%). Questi risultati hanno dimostrato che il
convolvolo è una pianta ospite di fitoplasmi strettamente correlati ma non identici a
quelli dello stolbur non solo in Italia come precedentemente dimostrato da Marcone
et al. (1997), ma anche in Germania e in BiH. Infine, analizzando un frammento di
DNA non-ribosomiale, il gene tuf, è stato possibile distinguere i ceppi Italiani di BY
da quelli provenienti dalla Germania e dalla BiH.
Parole chiave: PCR/RFLP, Sequenziamento, 16S rDNA, Proteine ribosomiali, Gene tuf.
Molecular characterization of phytoplasma strains associated
with bindweed yellows
Plants of Convolvulus arvensis L. (field bindweed) showing symptoms of
yellowing, stunting and/or proliferation have been observed and collected in Campania
region (South Italy), in Wuerttemberg region (Germany) and in the area of Sarajevo
(Bosnia and Herzegovina, BiH).
Six bindweed yellows (BY) phytoplasma strains (3 from Italy, 2 from BiH and
1 from Germany) were examined by RFLP and sequence analysis of PCR-amplified
rDNA, ribosomal protein (rp) and tuf genes. P-TV (stolbur of tomato) phytoplasma
strain maintained in periwinkle was used as stolbur reference strain (16SrXII-A) in all
PCR/RFLP experiments. Two PCR/RFLP procedures based on rDNA were adopted
using respectively universal primers P1/P7 and R16F2n/R16R2 followed by RFLP
analysis with AluI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaII, MboI, TaqI, and Tru1I restriction
enzymes. All enzymes, except HhaI, used in RFLP analysis of P1/P7 products were
342
able to differentiate BY phytoplasma strains from P-TV stolbur reference strain;
whereas only Tru1I, HaeIII and AluI were useful for strain differentiation based on
R16F2n/R16R2 products. Sequence analysis based on 16S rDNA gene revealed that
BY phytoplasma strains shared 96.5% and 96.3% sequence similarity respectively
with ‘Candidatus Phytoplasma (Ca. P.) australiense’ and with ‘Ca. P. fragariae’ and
stolbur phytoplasma strains, thus indicating that BY strains could represent a distinct
taxonomic entity.
To amplify rp genes (rplV and rpsC) the primer pair rpF1c/rpIR1A (Martini et
al., 2007) has been used, followed by RFLP analysis with AluI, BstUI and Tsp509I
endonucleases; whereas to amplify tuf gene a direct-PCR with Tuf1f/Tuf1r followed
by a nested-PCR with primer pair TufAYf/TufAYr have been performed, followed
by RFLP analysis with HpaII, Tru1I and TstI restriction enzymes (Schneider et al.,
1997). RFLP analysis based on rp and tuf genes demonstrated that all BY strains were
similar to each other and clearly different from P-TV stolbur phytoplasma strain. In
particular, RFLP analysis of TufAYf/TufAYr products differentiated the 3 Italian BY
strains from the others and indicated that all the BY strains did not belong to the VKType II (Langer and Maixner, 2004), typical of stolbur phytoplasma strains found
associated with bindweed. The presence of genetic variability in tuf gene among the
BY strains, was later proved by sequence analysis based on tuf gene, less conserved
than 16S rDNA. Besides, the analysis of rp gene sequences confirmed that BY
strains are closely related to stolbur and related phytoplasma groups, with the highest
sequence similarities shared with ‘Ca. P. americanum’ (89%), ‘Ca. P. australiense’
(86%) and P-TV stolbur phytoplasma strain (83%). These results demonstrated that
field bindweed is a host plant of phytoplasma strains closely related but not identical
to stolbur phytoplasma, not only in Italy as previously demonstrated by Marcone et
al. (1997), but also in Germany and in BiH. Finally, analyzing a non-ribosomal DNA
fragment, the tuf gene, it was possible to distinguish the Italian BY strains from those
collected in Germany and BiH.
Key words: PCR/RFLP, Sequencing, 16S rDNA, Ribosomal protein, Tuf gene.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterization of grapevine yellows
Marcone C., A. Ragozzino, E. Seemüller, 1997. Detection and identification of
phytoplasmas in yellows-diseased weeds in Italy. Plant Pathology, 46, 530-537.
343
Martini M., IM. Lee , KD. Bottner, Y. Zhao, S. Botti, A. Bertaccini, NA. Harrison,
L. Carraro, C. Marcone, AJ. Khan, R. Osler, 2007. Ribosomal protein genebased phylogeny for finer differentiation and classification of phytoplasmas.
Schenider B., KS. Gibb, E. Seemüller, 1997. Sequence and RFLP analysis of
phytoplasmas. Microbiology, 143, 3381-3389.
344
Identificazione dei geni di pervinca la cui
espressione risulta alterata in seguito ad
infezione con ‘Candidatus Phytoplasma pyri’
V. De Luca1, C. Capasso1, G. Catara2, M. Pastore3, L. Carraro1, A. Capasso1,
V. Carginale1
CNR Institute of Protein Biochemistry, Via P. Castellino 111, I-80100 (NA)
2
Unità di ricerca per la frutticoltura,Via Torrino 2, I-81100 (CE)
3
Dip. Biologia applicata alla Difesa delle Piante, Università di Udine,
Via delle Scienze 208, I- 33100 (UD)
1
I fitoplasmi sono procarioti pleomorfi caratterizzati da piccole dimensioni,
assenza di parete cellulare, genoma molto piccolo, con un basso contenuto in G+C,
metabolismo ridotto, con solo 1 o 2 operoni per rRNA e un basso numero di tRNA
(Lee et al., 2000; Christensen et al., 2005). I sintomi provocati dai fitoplasmi sono
numerosi e molto severi (Chang, 1998). Il fitoplasma responsabile della moria del
pero (Candidatus Phytoplasma pyri, PD) è responsabile di una grave malattia tra
le varie cultivar di Pyrus communis. Allo scopo di chiarire i meccanismi molecolari
alla base dell’interazione patogeno-pianta ospite è stato effettuato uno studio relativo
all’effetto del fitoplasma sull’espressione genica. Come organismo modello è stata
scelta la pervinca (Catharanthus roseus G. Don.). Il profilo di espressione genica di
piante di pervinca infettate con fitoplasma PD è stato determinato usando la tecnica del
Differential Display, una potente tecnica di biologia molecolare ampiamente utilizzata
per identificare rapidamente ed isolare geni differenzialmente espressi nelle varie fasi
del ciclo vitale delle piante.
La metodica del Differential Display è stata applicata su piante di pervinca
controllo e infettate con fitoplasma PD. Sono stati usati 32 primers arbitrary al
5’, ciascuno di essi in combinazione con uno dei 3 oligo(dT) ancorati al 3’, per
amplificare per PCR i cDNA ottenuti per retrotrascrizione dell’RNA totale estratto da
piante infette e non con fitoplasma PD. In totale sono stati identificati, reamplificati
clonati e sequenziati16 putativi frammenti di cDNA. Le sequenze ottenute sono state
analizzate mediante il programma di ricerca delle similarità tra sequenze Fastx3.
Esperimenti di ibridazione molecolare (Northern blot) hanno rivelato che 7 di questi
geni risultano essere regolati positivamente in seguito ad infezione con PD, mentre 3
sono regolati negativamente. I rimanenti 6 geni, invece, non mostrano cambiamenti nei
livelli di espressione; essi sono stati, quindi, considerati falsi positivi. I geni regolati
positivamente risultano essere: EDD1, mitochondrial translocase, isopropylmalate
synthase, LEA14, beta-glucosidase, una proteina con attività idrolasica, e Potyvirus
345
VPg interacting protein. WD40-like, una ZIM-protein, e Ras-related protein Rab11A
sono quelli regolati negativamente. I geni identificati sono principalmente coinvolti
nella risposta a fattori di stress, metabolismo di proteine, regolazione della trascrizione,
trasduzione del segnale, struttura della parete cellulare. Alcuni dei geni identificati
(WD-40 like, ZIM protein, Potyvirus VPg interacting protein e EDD1) sono dei fattori
di trascrizione che coordinano l’espressione genica di vie metaboliche attivate da
segnali cellulari. I risultati ottenuti suggeriscono che i sintomi causati dall’infezione
con fitoplasma derivino dall’attivazione/repressione dell’espressione di determinati
geni della cellula ospite. In che modo i fitoplasmi possano alterare l’espressione genica
non è chiaro, ma appare plausibile che più di un meccanismo possa essere coinvolto.
Identification of periwinkle genes whose expression was
altered by Pear Decline Phytoplasma
Phytoplasmas are small, pleomorphic prokaryotes characterized by small
genomes, with low G+C content, limited number of metabolic pathways, only one
or two ribosomal RNA operons, a small number of tRNA, and the absence of a cell
wall (Lee et al., 2000; Christensen et al., 2005). Plants infected by phytoplasmas
exhibit diverse and severe symptoms (Chang, 1998). Pear Decline (Candidatus
Phytoplasma pyri, PD) phytoplasma causes an important disease in Pyrus communis
fruiting cultivars. We studied the effects of PD phytoplasma on gene expression in
order to elucidate the molecular mechanisms involved in host-pathogen interactions.
The periwinkle C. roseus G. Don., was chosen as a model of host plant. Transcriptome
profiling of periwinkle plants exposed to PD infection was studied using Differential
Display, a powerful technique used to investigate genes involved in plant life cycle
(Carginale et al., 2004; Tessitori et al., 2007).
Differential Display was carried out on periwinkle plants infected or not
with PD phytoplasma. A total of thirty-two 5’-arbitrary primers were used, each of
them together with one of the three 3’-anchored oligo(dT) primers, to PCR amplify
cDNAs obtained by reverse transcription of total RNA from control and PD-infected
plants. Sixteen putative differentially expressed cDNA fragments were detected,
reamplified, cloned and sequenced. Fastx3 search utility was used to recognize
putative proteins encoded by these mRNAs. Northern blot analysis showed that 7 of
the 16 genes identified were up-regulated following PD infection while 3 genes were
down-regulated. The remaining 6 genes did not show significant changes in the level
of expression; therefore, they were considered to be false positives. The identified
proteins encoded by the up-regulated genes were: EDD1, mitochondrial translocase,
isopropylmalate synthase, LEA14, beta-glucosidase, a protein with hydrolase activity,
and Potyvirus VPg interacting protein. WD40-like, a protein containing a ZIM motif,
346
and Ras-related protein Rab11A were the proteins encoded by the down-regulated
genes. The identified genes are involved in stress response, signal transduction, protein
metabolism and transport, cell wall structure. Some of these genes (WD-40 like, ZIM
protein, Potyvirus-interacting protein, EDD1) are transcription factors that coordinate
downstream gene expression in signal transduction pathways. Our results provide
evidence suggesting that phytoplasmas cause disease symptoms by enhancing or
repressing the expression of physiologically important plant genes. The mechanisms
by which phytoplasmas can alter host gene expression remain to be investigated, but
it appears feasible that more than one mechanism is responsible for gene activation/
inhibition.
Carginale V., G. Maria, C. Capasso, E. Ionata, F. La Cara, M. Pastore, A.
Bertaccini, A. Capasso, 2004. Identification of genes expressed in response
to phytoplasma infection in leaves of Prunus armeniaca by messenger RNA
differential display. Gene 332, 29–34.
Chang CJ., 1998. Pathogenicity of aster yellows phytoplasma and Spiroplasma citri
on periwinkle. Phytopathology 88, 1347-1350.
Christensen NM., KB. Axelsen, M. Nicolaisen, A. Schulz, 2005. Phytoplasmas and
their interactions with hosts. Trends Plant Science 10, 526-535.
Lee IM., RE. Davis, DE. Gundersen-Rindal, 2000. Phytoplasma: phytopathogenic
Mollicutes. Annual Review of Microbiology 54, 221-255.
Tessitori M., G. Maria, C. Capasso, G. Catara, S. Rizza, V. De Luca, A. Catara, A.
Capasso, V. Carginale, 2007. Differential Display analysis of gene expression
in Etrog citron leaves infected by Citrus viroid III. Biochimica et Biophysica
Acta, 1769, 228-235.
Lavoro svolto nell’ambito del progetto “FRU.MED.”; sottoprogetto Subproject “DAFME”, finanziato dal
Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali. Pubblicazione n. 47
347
Indagini sul metabolismo secondario di piante di
Spartium junceum affette dalla malattia degli
scopazzi della ginestra
E. Mancini, C. Marcone, V. De Feo
Spartium junceum L. (ginestra odorosa) è un arbusto legnoso, appartenente
alla famiglia Fabaceae, componente della macchia mediterranea e particolarmente
diffuso in Italia centro-meridionale. Tale arbusto, che è di rapida crescita e di elevata
adattabilità, riveste notevole importanza ecologica poiché previene i fenomeni erosivi
dei suoli. E’ inoltre usato come ornamentale e, soprattutto in passato, come pianta da
fibra ed ha proprietà medicinali. Tuttavia, a causa del suo contenuto in alcaloidi, può
causare fenomeni di tossicità nell’uomo e negli animali (Lurz et al., 1990; Barboni
et al., 1994). In Italia meridionale, la ginestra odorosa è gravemente affetta da una
malattia letale, fitoplasmatica, denominata scopazzi della ginestra (SpaWB). I sintomi più appariscenti consistono in scopazzi, raccorciamento degli internodi, attività
vegetativa fuori stagione e moria. La malattia SpaWB è associata alla presenza di
due fitoplasmi, geneticamente differenti, i quali, pur appartenendo a gruppi filogenetici diversi, inducono gli stessi sintomi. Questi agenti sono (i) ‘Candidatus Phytoplasma spartii’, membro del gruppo della proliferazione del melo ed (ii) un fitoplasma
che appartiene al gruppo del giallume dell’olmo (Marcone et al., 1996, 2004). Molto
spesso, nella stessa pianta malata sono presenti ambedue i fitoplasmi dei quali, uno
è prevalente e, pertanto, facilmente diagnosticabile mediante la PCR diretta mentre
l’altro è presente in concentrazione molto bassa e diagnosticabile soltanto tramite la
PCR nested. A differenza del progresso conseguito nella diagnosi, differenziazione e
filogenesi dei fitoplasmi, piuttosto scarse o nulle sono le conoscenze riguardanti gli
effetti di tali procarioti sulla composizione fitochimica in metaboliti secondari delle piante affette. Si è, pertanto, ritenuto opportuno avviare una serie di studi al fine
di individuare differenze nel contenuto di metaboliti secondari in piante di ginestra
odorosa affette da SpaWB in confronto a quelle sane. Piante di ginestra odorosa con
sintomi tipici di SpaWB nonché piante apparentemente sane, campionate in Campania durante la primavera del 2007, sono state saggiate mediante PCR per verificare la
presenza di infezioni fitoplasmatiche. Sulla base della specificità dei primer impiegati
e l’ RFLP dell’ rDNA fitoplasmatico, è stato possibile individuare i suddetti fitoplasmi
soltanto in piante sintomatiche. Campioni costituiti da porzioni di fusto e rametti,
348
prelevati sia da piante malate che da piante sane, sono stati sottoposti ad una serie
di estrazioni, a temperatura ambiente, utilizzando solventi a polarità crescente quali
etere di petrolio, cloroformio e metanolo. Gli estratti metanolici ottenuti sono stati poi
separati mediante cromatografia ad esclusione molecolare ed RP-HPLC. Inoltre, gli
oli essenziali ottenuti da parti fiorali sia sane che malate, sono stati analizzati mediante
gas cromatografia e spettrometria di massa. Differenze marcate tra piante sane e malate sono state evidenziate sia nella frazione alcaloidea e sia nei costituenti volatili.
In particolare, in piante malate il contenuto di alcaloidi è risultato più elevato rispetto
alle sane. Gli studi sono tuttora in corso per l’identificazione dei singoli componenti.
L’incremento del contenuto di alcaloidi evidenziato in piante malate conferma precedenti risultati secondo i quali in S. junceum, il contenuto di dette sostanze aumenta,
come meccanismo di difesa, in risposta ad avversità biotiche (Wink and Witte, 1987;
Barboni et al., 1994).
Parole chiave: Metaboliti secondari, Alcaloidi, Scopazzi della ginestra, Infezioni
fitoplasmatiche, ‘Candidatus Phytoplasma spartii’.
Studies on secondary metabolism of Spartium junceum plants affected
by the spartium witches’-broom disease
Spartium junceum L. (Spanish broom) is a fabaceous woody shrub that is a
component of the Mediterranean maquis habitat and is particularly widespread in
central and southern Italy. This rapidly growing plant is highly adaptable to various
environmental conditions and is of considerable ecological importance due to its role
in decreasing soil erosion. The plant is also used as an ornamental and mainly in the
past, for fiber production. In addition, it has medicinal properties. However, due to
its alkaloid compounds, Spanish broom may be toxic to humans and animals (Lurz et
al., 1990; Barboni et al., 1994). In southern Italy, Spanish broom is severely affected
by a lethal phytoplasmal disease, the spartium witches’-broom (SpaWB). The most
characteristic symptoms of the disease are pronounced witches’-brooms, shortened
internodes, off-season growth and death of the plants. SpaWB is associated with two
genetically different phytoplasmas which induce the same symptoms. These agents
are (i) the ‘Candidatus Phytoplasma spartii’ which is a member of the apple proliferation phylogenetic group and (ii) a phytoplasma that belongs to the elm yellows group
(Marcone et al., 1996, 2004). Most of the diseased plants are doubly infected with the
two phytoplasmas of which, one is predominant and readily detectable by direct PCR
while the other occurs in a very low titer and could be detected only by the highly
sensitive nested PCR. In contrast to progress made in detection, differentiation and
349
phylogenetic classification of phytoplasmas, very little is known about the effects of
phytoplasmal infections on the biochemical content of affected plants. Thus, the aim
of this work was to identify changes in the secondary metabolite content of SpaWBaffected Spanish broom plants in comparison to healthy ones. Symptomatic and nonsymptomatic plants of Spanish broom, sampled in the Campania region (southern
Italy) during spring 2007, were examined for phytoplasmal infections using PCR
technology. On the basis of primer specificity and RFLP analysis of PCR-amplified
rDNA using several restriction endonucleases, the above-mentioned phytoplasmas
could be identified only in symptomatic plants. Stem and shoot samples from diseased
and healthy plants were extracted sequentially, at room temperature, using petroleum
ether, chloroform and methanol. Metanolic extracts obtained were then separated by
gel permeation chromatography and RP-HPLC analyses. Also, essential oils from
diseased and healthy flower parts were analyzed by gas chromatography and mass
spectrometry. Great differences between infected and healthy plants were identified
in both the alkaloid and volatile compounds. In particular, the alkaloid content was
higher in diseased plants than in healthy plants. Work is still in progress in order to
identify single compounds. Data obtained largely agree with previous findings which
indicate that in S. junceum plants alkaloid content increases in response to attack by
adverse biotic factors (Wink and Witte, 1987; Barboni et al., 1994).
Key words: Secondary metabolites, Alkaloids, Spartium witches’-broom,
Phytoplasmal infections, ‘Candidatus Phytoplasma spartii’.
350
Barboni L., A. Manzi, B. Bellomaria, AM. Quinto, 1994. Alkaloid content in four
Spartium junceum populations as a defensive strategy against predators.
Phytochemistry, 37, 1197-1200.
Lurz G., R. Greinwald, L. Witte, FC. Czygan, 1990. Quinolizidine alkaloids in
Spartium junceum. Planta Medica, 56, 522-525.
Marcone C., A. Ragozzino, B. Schneider, U. Lauer, CD. Smart, E. Seemüller, 1996.
Genetic characterization and classification of two phytoplasmas associated
with spartium witches’-broom disease. Plant Disease, 80, 365-371.
Marcone C., KS. Gibb, C. Streten, B. Schneider, 2004. ‘Candidatus Phytoplasma
spartii’, ‘Candidatus Phytoplasma rhamni’ and Candidatus Phytoplasma
allocasuarinae’, respectively associated with spartium witches’-broom,
buckthorn witches’-broom and allocasuarina yellows diseases. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1025-1029.
Wink M., L. Witte, 1987. Alkaloids in stem roots of Nicotiana tabacum and Spartium
junceum transformed by Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bioscience, 42,
69-72.
351
EPIDEMIE DEL FITOPLASMA DELLO STOLBUR SU
FRAGOLA E SPECIE ORTICOLE IN EMILIA-ROMAGNA
V. Vicchi, A. D’Anniballe, P. Fini, P. Grillini
Servizio Fitosanitario Regione Emilia-Romagna, Sede tecnica,
Via di Corticella 133, I-40129 (BO)
Nella regione Emilia-Romagna sono stati osservati sintomi riferibili a fitoplasmi
su fragola e su alcune specie orticole: pomodoro da mensa e da industria, sedano. Per
determinare l’eziologia dei patogeni responsabili di tali sintomi sono stati analizzati
con tecniche di biologia molecolare (PCR e nested-PCR) campioni prelevati dal 2003
al 2007. Le colture, l’anno di individuazione dei sintomi e la loro descrizione, la
localizzazione geografica e l’incidenza in campo sono di seguito riportati:
- fragola, cv. Maya (2003), cv. Clerie (2006), cv. Elsinore (2007); nanismo,
bordi fogliari clorotici, vegetazione ridotta ed arrossamento delle foglie più vecchie;
Forlì-Cesena, Ravenna e Ferrara. Impianti commerciali e campi di moltiplicazione;
incidenza media molto bassa con distribuzione casuale;
- pomodoro da mensa a tipologia “ciliegino” (2002 e 2005) di differenti varietà;
germogli apicali eretti con internodi allungati, foglie piccole, malformate e filiformi,
clorotiche e/o violacee, virescenza dei fiori con scarsa produzione di frutti malformati;
Forlì-Cesena. Azienda biologica con incidenza variabile dal 20% al 50% nel 2002;
- pomodoro da industria (2004 e 2007) di differenti varietà, provincia di Ferrara
con infezioni tra il 5% ed il 30% e pomodoro da industria di varietà Perfect Peel,
(2005 e 2006), provincia di Parma con vegetazione cespugliosa, foglie piccole con
colorazione violacea, fiori con peduncoli e sepali ingrossati; elevata incidenza;
- sedano (2005), nanismo della pianta ed evidente clorosi fogliare; percentuale
di infezione del 15%, Bologna.
Le piante sintomatiche sono state analizzate per accertare l’infezione da
fitoplasmi. L’estrazione del DNA totale è stata effettuata seguendo il protocollo
di Barba et al. (1998), con alcune modifiche, a partire da piccioli e foglie. Il DNA
ottenuto è stato poi sottoposto ad una prima amplificazione con i primers universali
P1/P7 e quindi a nested- PCR con i primers fStol/rStol, specifici per i fitoplasmi
dello stolbur (Maixner et al., 1995). Tutti i campioni sintomatici sono risultati infetti
da fitoplasmi appartenenti al gruppo dello Stolbur (16SrXII). Al fine di verificare
differenze genetiche dei fitoplasmi dello Stolbur rinvenuti sono state effettuate
successivamente analisi RFLP di sequenze del gene Tuf, utilizzando l’enzima HPA II
(Langer e Maixner, 2004) su alcuni campioni: pomodoro Parma 2005 e 2006, sedano
352
Bologna 2005, pomodoro Forlì-Cesena 2005, fragola Clerie Ferrara (2006). Tutte le
piante così analizzate hanno un profilo di restrizione riconducibile al VK- tipo II.
Da alcuni anni si assiste in Emilia-Romagna a gravi e onnipresenti epidemie
su piante di vite causate dal fitoplasma dello Stolbur che è veicolato in natura dal
cixiide Hyalesthes obsoletus Signoret; esso è in grado però di infettare molte altre
piante arboree, arbustive ed erbacee tra cui alcune specie orticole largamente coltivate
(Marzachì et al., 2000).
Il suo rinvenimento, avvenuto anche recentemente su sedano (Ferrini et
al., 2005) e fragola (Credi et al., 2005) conferma quindi la sua elevata presenza in
differenti ambienti colturali ed evidenzia la necessità di definire precise strategie di
contenimento.
Parole chiave: Fitoplasma, Fragola, Orticole, PCR, Stolbur.
Epidemics of stolbur on strawberry and horticultural crops in Emila Romagna
In the Emilia-Romagna region phytoplasma-like symptoms were observed on
strawberry and some horticultural crops: fresh tomato and processing tomato, celery.
Samples prelevated during 2003-2007 have been analyzed using molecular biology
techniques (PCR and nested-PCR) for determination of the pathogens responsible for
the symptoms.
Crops, date of detection of the symptoms and their description, geographic
localization and incidence at field sites are listed below:
- strawberry, cv. Maya (2003), cv. Clerie (2006), cv. Elsinore (2007); plant stunting,
leaf-edge chlorosis, underdeveloped vegetation and reddening of older leaves;
Forlì-Cesena, Ravenna and Ferrara; crop fields and multiplication sites; very low
average incidence with random distribution;
- different cultivars of fresh cherry tomato (2002 and 2005); upright top sprouts with
lenghtened internodes, small, deformed and wiry, chlorotic and/or purplish leaves,
flower virescence and little production of deformed fruits; Forlì-Cesena. Organic
farm where incidence ranged from 20% to 50% in 2002;
- different cultivars of tomato for processing (2004 and 2007), province of Ferrara,
with infection range from 5% to 30 %, and processing tomato cv. Perfect Peel
(2005 and 2006), province of Parma, with bush-like vegetation, small and purplish
leaves, flowers with enlarged peduncles and sepals; high incidence;
- celery (2005), plant stunting and evident chlorotic leaves; infection rate of 15%,
Bologna.
353
Symptomatic hosts were tested for phytoplasma infection. Total DNA was
extracted from leaves and petioles applying some change to the method by Barba et al.
(1998). Extracted DNA was subjected to a first amplification with universal primers
P1/P7, then to a nested- PCR with Stolbur phytoplasmas specific primers fStol/rStol
(Maixner et al., 1995). All symptomatic samples turned out to be infected by Stolburgroup phytoplasmas (16SrXII). After that, in order to verify genetic differences among
the detected Stolbur phytoplasmas, RFLP analysis of Tuf gene sequences were realized
applying HPA II enzyme (Langer and Maixner, 2004) to some samples: tomato Parma
2005 and 2006, celery Bologna 2005, tomato Forlì-Cesena 2005, strawberry Clerie
Ferrara 2006. All tested samples showed a VK-type II restriction profile.
For the last years strong epidemics on grapevines, caused by Stolbur
phytoplasma, took place everywhere in Emilia-Romagna; this phytoplasma,
transmitted by Hyalesthes obsoletus Signoret (Cixiidae), can also infect many other
hosts (trees, bushes and herbaceous plants) including some horticultural crops with
wide distribution (Marzachi et al., 2000).
Its high level of presence on different crop areas was confirmed by the recent
detection too, on celery (Ferrini et al., 2005) and strawberry (Credi et al., 2005),
stressing the need for defining precise strategies for its control in different species.
Key words: Phytoplasma, Strawberry, Horticultural crops, PCR, Stolbur.
Barba M., G. Boccardo, L. Carraro, P. Del Serrone, P. Ermacora, G. Firrao, L.
Giunchedi, N. Loi, M. Malfitano, C. Marcone, C. Marzachì, R. Musetti,
R. Osler, S. Palmano, C. Poggi Pollini, A. Ragozzino, 1998. Confronto
di differenti tecniche di diagnosi applicate al rilevamento di fitoplasmi in
pomacee. Notiziario sulla protezione delle piante, 9, 263-278.
Credi R., F. Terlizzi, AR. Babini, 2005. Associazione del fitoplasma dello Stolbur
(16SrXII-A) ad un giallume della fragola in Emilia-Romagna. Petria 15, 2325.
Ferrini F., L. Carraro, M. Babici, N. Loi, 2005. Una grave epidemia di Stolbur su
sedano in Friuli Venezia Giulia. Petria 15, 27-29.
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterisation of grapevine Yellows
associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP- analysis of non
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354
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Molecular hybridization and PCR amplification of non-ribosomal DNA to
detect and differentiate stolbur phytoplasma isolates from Italy. Journal of
Plant Pathology, 82, 201-21
355
ULTERIORI OSSERVAZIONI SULLA CLOROSI DEL
MARGINE FOGLIARE DELLA FRAGOLA
F. Terlizzi1, A. R. Babini2, D. Dradi3, T. Battelli3, P. Lucchi4, R. Credi1
DiSTA, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali,
Università di Bologna, Viale Fanin 40, I-40127 (BO)
2
Servizio Fitosanitario Regione Emilia-Romagna, Via di Saliceto 81,
I-40129 (BO)
3
C.S.S.A.A., Centrale Sperimentazioni e Servizi Agro Ambientali,
Via Calcinaro 1920, I-47020 Martorano di Cesena (FC)
4
CRPV, Centro Ricerche Produzioni Vegetali, Via Vicinale Monticino 1969,
I-47020 Diegaro di Cesena (FC)
1
In questi ultimi anni, una nuova affezione della fragola (Fragaria x ananassa
Duch.) è comparsa in Emilia-Romagna. I sintomi, rilevabili sia in impianti produttivi
che in vivaio, sono caratterizzati principalmente da accentuato nanismo delle piante,
accartocciamento, arrossamento e/o ingiallimento fogliare (Credi et al., 2006). Tale
sindrome viene assimilata alla clorosi del margine fogliare, “strawberry marginal
chlorosis”, da tempo presente in Francia (Zreik et al., 2001).
La malattia è stata individuata in diverse località e su svariate varietà. Le
ricerche di carattere eziologico hanno portato all’identificazione del fitoplasma dello
Stolbur (16SrXII-A) e di un proteobatterio-γ 3 simile a Candidatus Phlomobacter
fragariae (Terlizzi et al., 2006; Terlizzi et al., 2007). Il primo è stato ritrovato con alta
frequenza nei vivai, mentre il secondo è risultato prevalente negli impianti produttivi,
confermando pienamente i risultati di Zreik et al. (2001).
Studi epidemiologici sono stati intrapresi nel corso del 2007. Potenziali insetti
vettori (Hyalesthes obsoletus Sign., Cixius sp., Reptalus sp.) sono stati catturati in
alcuni siti ove era presente la fitopatia e, in ambiente protetto, fatti alimentare su
piante sane di fragola. Una apposita prova di campo è stata poi allestita per verificare
gli effetti indotti dal fitoplasma. In piante della cv. Onda, prescelte in vivaio come
sicuramente sintomatiche, ciò si evidenziava in maniera particolarmente evidente,
registrando una mortalità dell’86,5% dopo pochi mesi dall’impianto.
L’identificazione in vivaio delle piante sintomatiche e loro successiva
eliminazione, è al momento l’unica pratica consigliabile per evitare la diffusione di
materiali infetti.
Parole chiave: Fragola, Clorosi del margine fogliare, PCR, Stolbur, Candidatus
Phlomobacter fragariae.
356
Further investigations on strawberry marginal chlorosis
During the last years, diseased plants of strawberry (Fragaria x ananassa
Duch.) have been observed and collected from nurseries and production fields in
Emilia-Romagna region (northern Italy). Symptoms were essentially a conspicuous
plant stunting accompanied by a very poor root systems; older leaves were rolled
upward and displayed a marked premature purple discoloration; new leaves
showed size reduction, shortened petioles, chlorosis and were generally cupped
(Credi et al., 2006). This syndrome was considered similar to “strawberry marginal
chlorosis” described in France (Zreik et al., 2001). Affected plants were identified
on the most important cultivars and in various locations. Plants were collected and
assessed by PCR for possible disease-associated pathogenic agents. Molecular assays
confirmed infection of Stolbur phytoplasma (16SrXII-A) and the occurrence of a γ 3proteobacterium similar to Candidatus Phlomobacter fragariae (Terlizzi et al., 2006;
Terlizzi et al., 2007). The phytoplasma was frequently found among nursery samples,
whereas the proteobacterium was prevalent in production fields. Our findings confirm
the previous report of Zreik et al., (2001).
Epidemiological studies started up in 2007. Potential insect vectors (Hyalesthes
obsoletus Sign., Cixius sp., Reptalus sp.) were collected at sites with disease presence
and placed on healthy strawberries. A field trial was also carried out to evaluate the
effect of Stolbur. After transplanting, symptomatic plants of cv. Onda showed a quick
decline with a final death rate of 86.5%. Our observations indicate that roughing could
be a good practice in order to prevent the spread of infected materials.
Key words: Strawberry, Marginal chlorosis, PCR, Stolbur, Candidatus Phlomobacter
fragariae.
Credi R., F. Terlizzi, AR. Babini, P. Lucchi, 2006. “Clorosi del margine fogliare”:
prime indagini in Emilia-Romagna su una grave malattia infettiva della fragola.
Frutticoltura, 4, 22-26.
Terlizzi F., AR. Babini, R. Credi, 2006. First report of Stolbur phytoplasma (16SrXIIA) on strawberry in Northern Italy. Plant Disease, 90, 831.
Terlizzi F., AR. Babini, C. Lanzoni, A. Pisi, R. Credi, 2007. First report of a γ 3proteobacterium associated with diseased strawberry in Italy. Plant Disease,
91, 1688.
Zreik L., JL. Danet, X Foissac., J. Gandar, E. Verdin, JM.Bovè, M Garnier, J.G
Nourisseau. 2001. Marginal chlorosis of strawberry plants can be induced by
two different phloem-restricted bacteria: the proteobacterium “Candidatus
phlomobacter fragariae” and the Stolbur phytoplasma. Acta Horticolturae,
551, 101-105.
357
Recovery
Coordinatore: Piero Attilio Bianco
R. Osler
Progetto PRIN 2005-2008: Le fitoplasmosi della vite e dei fruttiferi: recovery
e resistenze indotte.
P. Braccini, M. Nasca
Influenza di alcuni fattori climatici sul fenomeno del recovery in piante di vite
affette dal legno nero
R. Garau, V.A., Prota, A. Sechi, G. Moro
Somminastrazioni di biostimolanti a piante affette da “legno nero”: esiti ai fini
del recovery
D. Bulgari, P. Casati, F. Quaglino, L. Brusetti, D. Daffonchio, P. A. Bianco
LH-PCR come metodo di analisi per lo studio del ruolo dei batteri endofiti nel
fenomeno del recovery in vite
G. Romanazzi, S. Murolo, L. Landi, Q. Silvestri, S. Virgili
Induzione del recovery in viti infette da legno nero mediante stress abiotici
N. Loi, F. Ferrini, A. Loschi, M. Martini, L. Carraro
Fenomeni di recovery in albicocchi infetti da European Stone Fruit Yellows
R. Musetti, F. Tubaro, R. Polizzotto, P. Ermacora, R. Osler
Il “Recovery” da Apple Proliferation in melo è associato all’aumento della
concentrazione dello ione Calcio nel floema
Sintesi poster: Luigi Carraro
L. Carraro, P. Ermacora, R. Musetti, M. Martini, F. Ferrini, N. Loi, F. Pavan, R.
Osler, M. Hren, K. Gruden, M. Borgo, D. Bellotto, PA. Bianco, P. Casati, F.
Quaglino, A. Zorloni, C. Morone, P. Gotta, V. Rossi, C. Marzachì
Il recovery in viti con giallumi.
A. Zorloni, P. Casati, F. Quaglino, D. Bulgari, PA. Bianco
Incidenza del fenomeno del “recovery” in vigneti della Lombardia.
R. Garau, V.A. Prota, A. Sechi, G. Moro
Ulteriori informazioni sulla produttività di Chardonnay e Vermentino affette
da legno nero ed in recovery.
G. Romanazzi, S. Barbone, S. Murolo, D. D’Ascenzo
Uso di induttori di resistenza per il controllo del legno nero della vite in pieno
campo: primi risultati.
M. Pastore, F. Gervasi, M. del Vaglio, A. Bertaccini
Evidenza di risanamento da fitoplasmi in chioma e radici di piante di pero e susino infettate mediante innesto.
Le resistenze indotte, gli antagonisti ed il
recovery, base di studio per un controllo
innovativo di fitoplasmosi dei fruttiferi e
della vite
R. Osler1, A. Bertaccini2, PA. Bianco3, G.L. Rana4, G. Romanazzi5
Dip. Biologia e Protezione delle Piante, Università degli Studi di Udine
Via Palladio, 8 Palazzo Florio, I-33100 (UD)
2
3
4
Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università degli
Studi della Basilicata, Viale dell’ Ateneo Lucano, 10, I-85100 (PZ)
5
1
Si riportano i risultati più interessanti acquisiti nell’ambito di un progetto
biennale PRIN concluso nel 2008 e che ha coinvolto Ricercatori di cinque Unità
operative italiane. Scopo della ricerca era quello di individuare metodi alternativi
di lotta contro le fitoplasmosi, in particolare quelli basati su resistenze indotte e sul
recovery. Si sono privilegiati allo scopo fruttiferi e vite e le relative fitoplasmosi.
Nel complesso le ricerche hanno confermato che il recovery da fitoplasmosi
può assumere interesse pratico diretto nella lotta contro AP (Apple Proliferation), PD
(Pear Decline), FD (Grape Flavescence Dorée) e BN (Grape Bois Noir). Per la vite
affetta da BN è stato accertato che la varietà Chardonnay, in differenti aree viticole
italiane, presenta un tasso di recovery basso, in confronto con altre cultivar. Anche
l’albicocco affetto da ESFY (European Stone Fruit Yellows) non manifesta in genere
livelli alti di recovery: in compenso piante ottenute da madri recovered esprimono
completa tolleranza verso il fitoplasma. Sempre in albicocco, piantine infettate con
ceppi attenuati di ESFY si comportano da tolleranti, anche in zone con epidemie
provocate da ceppi virulenti. Stress, quali lo sradicamento o lo strappo di viti infette
da GY (Giallumi della vite), accelerano e potenziano il recovery. Fra gli endofiti della
vite, due funghi (Aureobasidium pullulans e Epicoccum nigrum) ed il batterio Pantoea
agglomerans sembrano connessi con fenomeni di resistenze indotte. Si riportano
anche i primi risultati ottenuti con vari elicitori biotici ed abiotici in piante affette da
AP e PD. Si è confermato come alla base del recovery da fitoplasmosi vi é la sintesi
di perossidi.
361
Si suggeriscono vari atteggiamenti pratici nella lotta contro le fitoplasmosi:
proteggere gli endofiti (evitare la termoterapia di massa); accertare e sfruttare anche
direttamente il recovery (non sempre il roguing è giustificato); usare portinnesti che
favoriscono il recovery-resistenze indotte; in zone con epidemie in corso, il reimpianto
con materiale sano, ma senza alcuna forma di resistenza-tolleranza, è improprio.
Parole chiave: fitoplasma; recovery; SAR
Induced resistances, antagonists, and recovery as innovative methods to control
phytoplasma diseases in grape and fruit trees
The most important results achieved inside a National Project that involved
five italian Units are here reported. The main purpose of the project was to gain and
propose practical alternative methods to control phytoplasma diseases of grape and
fruit trees, including the recovery and acquired resistances.
It was confirmed that recovery can be efficient in apples infected by AP (Apple
Proliferation), pears with PD (Pear Decline), grape with FD (Grape Flavescence
Dorée) or BN (Grape Bois Noir). Recovery is in general low in Chardonnay cultivar
compared with other varieties. Also apricot do not recover in an efficient way from
ESFY (European Stone Fruit Yellows) in our conditions; interestingly apricot plants
obtained from recovered mothers behave as completely tolerant and react as resistant
to new infections of virulent strains of ESFY.
Stress caused by up-rooting grapes infected by FD or BN increases the
recovery phenomenon: the root-stocks influence the recovery, too. The presence in
plants of fungal (Aureobasidium pullulans and Epicoccum nigrum) or bacteria (Pantoea
agglomerans) endophytes seems to induce SAR (Systemic Acquired Resistances).
Also the possible importance of different factors that govern recovery-SAR
–such as chemicals and biotic elicitors are treated. It has been also confirmed that
peroxids are involved with the recovery.
Some general behaviours are suggested when considering the phytoplasma
diseases control procedures: protect the endophytes (avoid the massive thermotreatment); utilize the recovery phenomenon when it is efficient (roguing can be
suggested but not as a rigid role); select roots that favour the recovery; healthy tested
plants are improperly used in infected areas if not resistant in some ways or tolerant
to the disease agents.
Key words: phytoplasma; recovery; SAR
Ricerca finanziata dal MIUR, PRIN 2005
362
Influenza di alcuni fattori climatici sul
fenomeno del recovery in piante di vite affette
dal legno nero
P. Braccini1, M. Nasca2
2
1
ARSIA – Regione Toscana, Via Pietrapiana, 30, I-50121 (FI)
Dipartimento di Biotecnologie Agrarie, Sezione Patologia vegetale
Piazzale delle Cascine 28, I-50100 (FI)
Il recovery è una remissione spontanea dei sintomi, con diversa incidenza in
relazione agli areali di coltivazione, alle condizioni colturali e pedoclimatiche e alle
cultivar, (Romanazzi et al., 2007). Talvolta il fenomeno è temporaneo ma nel caso di
recovery “duraturo”è stato evidenziato che, almeno per la parte epigea, le viti possono
essere considerate al pari di piante sane (Carraro, e Ermacora, 2007). In questo lavoro si è voluta analizzare la relazione fra alcuni fattori climatici e
il fenomeno del recovery.
Sono stati presi in esame due vigneti della cv. Chardonnay, affetti da legno
nero, allevati a cordone speronato, monitorati a partire dal 2002 e situati in due diverse
province toscane (Pistoia e Siena). Il primo impianto si trova nel comune di Montale
(PT), impiantato nel 1993 e sono state monitorate 1195 piante. L’altro vigneto è situato
a San Gimignano (SI), l’impianto è del 1997 e sono state monitorate 790 piante. Il
monitoraggio nei due vigneti ha permesso di calcolare per ogni anno il numero di
piante sintomatiche e quelle che andavano incontro a recovery. Sono stati inoltre
raccolti ed elaborati i dati climatici di temperatura e pioggia provenienti da stazioni
meteo localizzate nelle vicinanze dei due vigneti. L’influenza dei dati climatici sulla
manifestazione della malattia è stata valutata elaborando le regressioni lineari tra
variabili indipendenti meteorologiche e variabili dipendenti espressione della malattia
come il recovery. Dove le regressioni hanno mostrato valori di R2 elevati è stata
verificata la loro significatività statistica.
L’incidenza annuale delle piante sintomatiche espressa come rapporto
percentuale sulle piante presenti, evidenzia per il vigneto di Montale la percentuale
di infezione più bassa (18,1%) nel 2003 seguita da un costante incremento fino al
2007, quando la malattia ha raggiunto un’incidenza del 71,4%. Considerando invece
il valore dell’incidenza cumulata, cioè di viti che dal 2002 hanno almeno una volta
mostrato sintomi della malattia, si raggiunge un valore di incidenza dell’82,8%.
Diversa è la situazione nel vigneto di San Gimignano con infezioni basse nel 2003
(18,4%) e 2006 (17,3%) e picchi nel 2004 (35,1%) e 2007 (30,5%) e un’incidenza
cumulata della malattia del 48,1%.
363
L’evoluzione del recovery nei due vigneti evidenzia un’alta incidenza nel 2003,
il 56,4% nel vigneto di Montale e il 63,4% nel vigneto di San Gimignano. Quest’ultimo
impianto e quello di Montale mostrano la più bassa incidenza di recovery nel 2004
(poco meno del 10%) e andamento altalenante gli anni successivi con un solo picco
nel 2006, il 42,1% a San Gimignano e il 17,9% a Montale.
I parametri climatici utilizzati riguardano per i mesi da maggio ad agosto le
temperature medie, le temperature massime e la pioggia. Per il vigneto di Montale si
sono rilevate correlazioni dirette fra recovery e temperature medie del mese di maggio
con un R2=0,962 e fra recovery e temperature medie nel periodo maggio-agosto
con un R2=0,984. Questi valori hanno un coefficiente di correlazione significativo
per P<0,05. Sempre per il vigneto di Montale si rilevano correlazioni dirette sia fra
recovery e media delle temperature massime del mese di giugno con un R2=0,957, sia
fra recovery e media delle temperature massime da maggio ad agosto con un R2=0,994.
Anche in questi casi il coefficiente di correlazione è significativo per P<0,05. Nel
vigneto di Montale si rileva una correlazione inversa fra recovery e mm di pioggia
da maggio ad agosto con un valore di R2=0,946 e una significatività statistica per
P<0,05. Il vigneto di San Gimignano ha evidenziato tale livello di significatività per
le correlazioni dirette fra recovery e temperature medie tra maggio e agosto con un
R2=0,771, e fra recovery e media delle temperature massime tra maggio e agosto
con un R2= 0,754; in questo vigneto si è anche rilevata una correlazione inversa fra
recovery e pioggia fra maggio e agosto con un R2=0,791.
Sulla scorta delle nostre esperienze pluriennali la remissione dei sintomi, o
recovery, appare strettamente collegata all’andamento di alcuni parametri climatici
(scarsa piovosità e soprattutto temperature elevate durante il periodo vegetativo della
vite) anche se non sempre sono stati ottenuti valori altamente significativi. Le alte
temperature sembrano favorire la remissione dei sintomi, come evidenziato anche
dall’andamento della malattia nell’annata, molto calda, del 2003 quando si è avuta
un alta incidenza del recovery nei due vigneti monitorati. E’ comunque opportuno
continuare in queste ricerche estendendole anche ad altri areali viticoli e coinvolgendo
anche aspetti agronomici, colturali e varietali.
Parole chiave: Rcovery, Chardonnay, Legno nero, Monitoraggio, Parametri climatici.
364
Influence of some environmental factors on the phenomenon of
recovery in Bois noir affected vines
Two Chardonnay vineyards affected by Bois noir and located in two different
Tuscan provinces (Pistoia and Siena) have been examined. Beginning in 2000-2002,
monitoring of symptomatic plants also pointing out those recovered was carried out.
Climatic data for temperature and rainfall provided by weather stations were available
for both vineyards and linear regressions were calculated between independent
meteorological variables and the number of recovered plants as a dependent variable.
Recovery and high temperatures from May to August showed statistically significant
correlations (vineyard in the district of Montale, Pistoia, mean temperatures R2=0,984,
maximum temperatures R2=0,994; vineyard in the district of San Gimignano, Siena,
mean temperatures R2=0,771, mean of maximum temperatures R2= 0,754). Instead,
an inverse correlation was shown between recovery or remission of symptoms and
mm of rainfall from May to August (Montale vineyard, R2=0,946; San Gimignano
vineyard, R2=0,791). These first results suggest that the phenomenon of recovery is
favored by high temperatures and scarce rainfall.
Parole chiave: Recovery, Chardonnay, Bois noir, Monitoring, Climatic parameters.
Carraro L., P. Ermacora, 2007. Piante in recovery e presenza di fitoplasmi. In:
Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro le fitoplasmosi
della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte e antagonisti”.
Ancona, settembre17-18, 2007, 14.
Romanazzi G., VA. Prota, P. Casati, S. Murolo, MR. Silletti, R. Di Giovanni, L.
climatiche e varietali italiane e tentativi di comprensione ed induzione del
fenomeno. In: Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro le
antagonisti”. Ancona, settembre17-18, 2007, 9-11.
365
Somministrazioni di biostimolanti a piante
affette da “Legno nero”: esiti
ai fini del recovery
R. Garau, V.A. Prota, A. Sechi, G. Moro
Dipartimento di Protezione delle piante. Università degli Studi di Sassari
Via E. de Nicola, 1 I-07100 (SS)
e-mail: [email protected]
In Sardegna, dal 2005, sono stati condotti studi, su parcelle di 658 piante di
Chardonnay (CH) e, dal 2006, su 1417 piante di Vermentino (VRM) affette da “Legno
nero”, finalizzati all’evidenza di azioni pro-recovery di un prodotto commerciale
(Kendal) contenente glutatione, oligossaccarine ed estratti vegetali somministrato per
via fogliare. Sono stati eseguiti tre trattamenti/anno (giugno-luglio), alla concentrazione
di 3,5 Kg/ha/1000 l di acqua, e distribuito a pressione normale. Sono stati considerati
i gruppi “Trattato” (T) e “Non Trattato” (NT) e nel loro ambito piante sintomatiche
(S), asintomatiche (H) ed in recovery (n°R) delle quali sono stati misurati parametri
produttivi.
I dati sono stati sottoposti all’analisi della varianza (ANOVA) ed al test di
confronto multiplo LSD per la valutazione della significatività delle differenze tra
le medie per P ≤ 0,05. I risultati relativi al NT sono riportati separatamente in questo
Convegno (Garau et al., vedi). L’elaborazione dei dati relativi alla produttività di
Chardonnay, tra le medie di S e quelle di n°R ed H comprese in T mostra, nel triennio
2005/2007, differenze altamente significative (P< 0,0001). Il confronto tra S, n°R
ed H nei gruppi di piante T ed NT esprime differenze incostanti e poco indicative.
Decrementi produttivi sono stati osservati, nel triennio, nei differenti gruppi di T e di
NT con una flessione media, in S, del 57%.
La “tendenza” al recovery non è risultata significativamente differente tra
le tesi T ed NT. Mentre il confronto numerico delle piante sintomatiche ha dato
esiti significativi solo nelle annate 2006/07, a favore di T. Relativamente a VRM il
confronto delle medie dei vari raggruppamenti (H, n°R ed S) in T non ha mostrato, per
il 2006, differenze significative, al contrario, l’anno successivo differenze altamente
significative hanno distinto le sintomatiche dagli altri gruppi. Il confronto in T ed
NT, nel 2007, ha sottolineato situazioni contradditorie. La riduzione della produzione,
tuttavia, è risultata complessivamente meno evidente nelle piante sottoposte a
trattamento rispetto alle altre. Relativamente alle due varietà, nessun elemento di
differenziazione è sortito dai confronti tra gli altri caratteri quanti-qualitativi.
In conclusione, le due classi, T e NT risultano accomunate, pur in proporzioni
annualmente differenti da una riduzione crescente della produzione dalle sane verso
366
le sintomatiche passando per le recovered. In generale l’esito delle prove, alla
pari di altre esperienze (Mazio et al. 2008) sono stati contradditori e meritevoli di
approfondimenti.
Parole chiave: Bois Noir, Recovery, Biostimolanti.
Biostimulants distribution to plants affected by ‘Bois Noir’: results regarding
recovery
Since 2005 studies have been carried out In Sardinia on stands of 658 plants
of Chardonnay (CH) and, since 2006, on 1417 plants of Vermentino (VRM) affected
by ‘Bois Noir’. These tests were aimed at highlighting the pro-recovery ability of
the commercial product Kendal containing glutathione, oligosaccharides and plant
extracts distribuited on the leaves. Three treatments were carried out per year (June/
July), at a concentration of 3.5 Kg/ha/1000 l of water, and distributed at normal
pressure. Treated (T) and Untreated (NT) plants were considered and within these
latter the productive parameters of symptomatic plants (S), asymptomatic plants (H)
and those in recovery (n°R) were measured.
The data were subjected to One-way Analysis of Variance (One-way ANOVA,
P ≤ 0.05) and to a post-hoc Fisher’s Least Significant Difference test (LSD, P ≤ 0.05)
to evaluate statistical differences between means. The detailed results related to the
NT group are reported in another paper presented in this Meeting (see Garau et al.).
Data analysis related to Chardonnay production showed highly significant differences
(P < 0.0001) for S, n°R and H plants within the treated group in the period 2005/2007.
The comparison of the same treatments within the T and NT groups showed erratic
differences. Yield decreases were observed over the three years for T and NT groups
with an average reduction of 57% for S plants.
The trend towards recovery did not prove to be significantly different between
the T and NT groups, while the numerical comparison of symptomatic plants gave
significant results only in the year 2006/07 for T plants. Regarding VRM, the
comparison of the production mean value for H, n°R and S plants within the T group
did not show significant differences for 2006. On the other hand, the following year
symptomatic plants were distinguished from the other plants by highly significant
differences. The comparison between T and NT, in 2007, highlighted contradictory
evidences. The decrease in production, however, proved to be far less evident in
treated plants compared to the others. Regarding the two varieties, no element of
differentiation emerged from comparing the other quali-quantitative parameters.
Common to both the varieties the production within T and NT groups was
healthy >recovered > symptomatic plants, although the ratios were different depending
367
on the year considered. In general, although these results were in part contradictory,
as highlighted in similar studies (Mazio et al., 2008), they are worthy of further
investigation.
Key words: Grapevine, Bois Noir, Recovery, Biostimolants.
Garau R., VA. Prota, A. Sechi, G. Moro, 2008. Ulteriori informazioni sulla produttività di Chardonnay e Vermentino affette da “Legno nero” ed in recovery.
Petria, 18, 391-393.
Mazio P., A. Montermini, P. Brignoli, 2008. Indagini preliminari degli effetti di trattamenti con Bioattivatori nei confronti delle manifestazioni sintomatologiche da
giallumi della vite. Atti Giornate fitopatologiche, vol. 2, 593-600.
Lavoro svolto nell’ambito del Prin 40%, 2005 “Le resistenze indotte, gli antagonisti ed il recovery, base
di studio per un controllo innovativo di fitoplasmosi dei fruttiferi e della vite”.
368
LH-PCR COME METODO DI ANALISI PER LO STUDIO DEL
RUOLO DEI BATTERI ENDOFITI NEL FENOMENO DEL
RECOVERY IN VITE
D. Bulgari1, P. Casati1, F. Quaglino1, L. Brusetti2, D. Daffonchio2, P. A. Bianco1
1
Istituto Patologia Vegetale, Università di Milano, Via Celoria 2, I-20133 (MI)
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM),
Università di Milano, Via Celoria 2, I-20133 (MI)
2
Il recovery è definito come la remissione spontanea dei sintomi in piante
infette da patogeno. Nell’ambito delle malattie da fitoplasmi, tale fenomeno è stato
rilevato in albicocco affetto dal giallume europeo delle drupacee, in melo affetto da
scopazzi e in vite affetta da Flavescenza dorata e da Legno nero (Osler et al., 1999,
Carraro et al., 2004). La remissione dei sintomi non è sempre associata all’assenza
del patogeno (melo e albicocco) (Carraro et al., 2004) ed è influenzata, soprattutto
nel caso della vite, da diversi fattori quali gli areali di coltivazione e le condizioni
colturali e pedoclimatiche; inoltre, le cultivar di Vitis vinifera mostrano una diversa
propensione al recovery (Romanazzi et al., 2007). Le cause alla base di tale fenomeno
non sono del tutto chiare, anche se studi biochimici e citochimici hanno evidenziato il
coinvolgimento di una sorta di Resistenza Sistemica Acquisita (SAR) (Musetti et al.,
2005; 2007). In natura, è noto che le piante sono colonizzate da microrganismi endofiti
(funghi, batteri ed attinomiceti) in grado di proteggerle dai patogeni (Lodewyckx et
al., 2002). Studi recenti hanno evidenziato differenze significative nella composizione
delle comunità fungine endofite, associate a piante di vite sane, infette da giallumi e
risanate, ipotizzando il possibile coinvolgimento di specie fungine nel fenomeno del
recovery (Musetti et al., 2007).
L’obiettivo di questo lavoro è stato valutare il ruolo dei batteri endofiti nel
fenomeno del recovery da giallumi della vite attraverso l’analisi LH-PCR (Length
Heterogeneity PCR) delle comunità microbiche associate a viti sane, infette da
giallumi e risanate. Tale analisi permette di distinguere le specie batteriche sulla base
del polimorfismo di lunghezza delle prime due regioni variabili del gene 16S rRNA
(Ritchie et al., 2000). Lo studio ha previsto, per prima cosa, la messa a punto di un
‘database LH-PCR’, descrittivo della microflora batterica presente in piante di vite sane,
da impiegare successivamente come riferimento per verificare le possibili variazioni
nella comunità endofita associata a viti malate, sane e recovered. Una regione parziale
del 16S rDNA di ogni specie batterica precedentemente identificata in vite (prevalenza
di γ-proteobatteri) (Bulgari et al., 2007) è stata amplificata con primers universali
369
per batteri ed analizzata mediante LH-PCR. Tale analisi ha permesso di associare un
picco caratteristico a ciascun batterio. Il confronto tra gli elettroferogrammi di intere
comunità microbiche (insieme di picchi) associate a vite ed i picchi specie-specifici
del ‘database LH-PCR’ ha evidenziato una differenza nella composizione batterica tra
le viti esaminate, facendo ipotizzare un possibile ruolo di alcuni batteri nel fenomeno
del recovery. Infine, in tutte le viti analizzate è stato rilevato un picco di 356 bp, non
presente nel ‘database LH-PCR’, in corso di identificazione.
Parole chiave: LH-PCR, Recovery, Giallumi della vite, Endofiti.
LH-PCR as tool for investigation of endophytic bacterial role
in the recovery phenomenon in grapevine
Recovery is defined as the spontaneous remission of symptoms in plant
infected by pathogens. In yellows diseases, this phenomenon was described in apricot
infected by European stone fruit yellows phytoplasma, in apple infected by apple
proliferation phytoplasma and in grapevine affected by Flavescence dorèe and Bois
noir (Osler et al., 1999, Carraro et al., 2004). Recovery is not always associated with
the absence of the pathogen (apple and apricot) (Carraro et al., 2004), and in the
case of grapevine it is influenced by cultivation area and location; moreover, Vitis
vinifera varieties recover with different frequency (Romanazzi et al., 2007). Recently
Musetti and colleagues demonstrated the involvement of a type of systemic acquired
resistance (SAR) (Musetti et al., 2005; 2007).
It is well known that in nature endophytic microrganisms (fungi, bacteria)
colonized plants and protect them from pathogens (Lodewyckx et al., 2002). Recent
studies have pointed out that there are significant differences the endophytic fungi
communities associated with healthy, yellows infected and recovered grapevines.
This finding lead to hypothesize a possible role of the endophytic fungi in the recovery
phenomenon (Musetti et al., 2007).
This work aims to investigate the possible role of endophytic bacteria in
the recovery from grapevine yellows. Description of the microbial communities
associated with healthy, yellows infected and recovered grapevine plants was carried
out by means of the cultivation-independent LH-PCR (Length Heterogeneity PCR)
analysis. Utilization of this molecular technique allow to distinguish bacteria strains
on the basis of 16S rDNA length polymorphisms (Ritchie et al., 2000). An ‘LH-PCR
database’ describing the bacterial community associated with healthy grapevine plants
was set up like a ‘reference database’ in order to analyze the diversity of the bacterial
microflora in healthy, yellows infected and recovered grapevine. A partial region of
the 16S rDNA of each grapevine endophytic bacteria species previously identified
370
in grapevine (prevalence of γ-proteobacteria) (Bulgari et al., 2007) was amplified
with bacterial universal primers and analyzed by LH-PCR. This analysis allowed to
associate each bacteria with a characteristic length peak. The comparison between
the single species-specific peaks of the ‘LH-PCR database’ and the complex multipeak LH-PCR electropherograms of entire bacterial microflora identified in diverse
grapevine plants highlighted differences in the bacterial community composition of
yellows infected, healthy and recovered plants. At the end, a peak of 356 bp was
detected in all the grapevine samples analyzed. Attribution of this peak to a bacterial
strain is in progress.
Key words: LH-PCR, Recovery, Grapevine yellows, Endophyte.
Bulgari D., P. Casati, F. Quaglino, G. Belli, PA. Bianco, 2007. Endophytic
bacterial community in yellows infected and recovered grapevine plants. In:
della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte ed antagonisti”.
Ancona, settembre 17-18, 2007, 20-22
Carraro L., P. Ermacora, N. Loi, R. Osler, 2004. The recovery phenomenon in apple
proliferation infected apple trees. Journal of Plant Pathology 86: 141-146
Lodewyckx C., J. Vangronsveld, F. Porteous, E. Moore, S. Taghavi, M. Mezgeay,
D. Van der Lelie, 2002. Endophytic Bacteria and Their Potential Applications.
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Musetti R., L. Sanità di Toppi, M. Martini, F. Ferrini, A. Loschi, M. A.Favali,
R.Osler, 2005. Hydrogen Localization and Antioxidant Status in the Recovery
of Apricot Plants from European Stone Fruit Yellows. European. Journal of
Plant Pathology, 112: 53-61
(Vitis vinifera, cv Prosecco) from Flavescence dorèe disease. Functional Plant
Biology, 34: 750-758
Osler R., N. Loi, L. Carraro, P. Ermacora, E. Refatti, 1999. Recovery in plants
affected by phytoplasmas. Proceedings of the 5th Congress of the European
Fundation for Plant Pathology, 589-592
371
Ritchie NJ., ME. Schutter, RP. Dick, DD. Myrold, 2000. Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Apply and Environmental Microbiology, 66(4), 1668-1675.
Romanazzi G., VA. Prota, P. Casati, S. Murolo, M.R. Silletti, R. Di Giovanni, L.
Landi, A. Zorloni, D. D’Ascenzo, S. Virgili, R. Garau, V. Savino, PA. Bianco, 2007. Incidenza del recovery in viti affette da fitoplasmi in diverse condizioni climatiche e varietali italiane e tentativi di comprensione ed iduzione del
fenomeno. In: Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro le
fitoplasmosi della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte ed
antagonisti”. Ancona, settembre 17-18, 2007, 9-11
Lavoro svolto nell’ambito del progetto PRIN dal titolo “Le resistenze indotte, gli antagonisti ed il recovery,
base di studio per un controllo innovativo di fitoplasmosi della vite e dei fruttiferi”
372
INDUZIONE DEL RECOVERY IN VITI INFETTE DA LEGNO
NERO MEDIANTE STRESS ABIOTICI
G. Romanazzi1, S. Murolo1, L. Landi1, Q. Silvestri2, S. Virgili2
2
ASSAM, Regione Marche, Via Alpi 21, I-60131 (AN)
1
Il Legno nero (LN) e la Flavescenza dorata (FD) sono i giallumi della vite in
grado di determinare le maggiori perdite di produzione e talvolta condurre a morte le
piante. FD, patogeno da quarantena, è presente spesso in maniera epidemica in diverse
regioni dell’Italia centro-settentrionale (Bianco et al., 2002; Morone et al., 2007) e
nelle Marche è stata rinvenuta in due focolai, al momento sotto controllo (Romanazzi
et al., 2007). Al contrario, il LN è la malattia da fitoplasmi più dannosa nella regione
in quanto interessa, con diversa incidenza, quasi tutti i vigneti (Romanazzi e Murolo,
2008). A tutt’oggi non sono disponibili efficaci mezzi di lotta per il controllo delle
fitoplasmosi della vite. Tuttavia, nelle piante infette è possibile la remissione spontanea
dei sintomi di malattia, fenomeno meglio noto come recovery. Stress abiotici quali
l’estirpo e l’immediato reimpianto (Osler et al., 1993) o pratiche agronomiche quali la
potatura e la capitozzatura (Borgo e Angelini, 2002; Zorloni et al., 2002) sono risultati
in grado di favorire il recovery in viti infette da fitoplasmi.
Pertanto, la ricerca ha avuto l’obiettivo di verificare l’efficacia di pratiche
agronomiche quali l’estirpo controllato e lo strattonamento nell’induzione del recovery
in viti infette da LN isolato VK-II.
Tali viti, delle varietà Chardonnay, Verdicchio e Sangiovese innestate su Kober
5BB e viti della cv Chardonnay allevata su 420A, sono state sottoposte ad estirpo
controllato nell’aprile 2006. Inoltre, piante di Primitivo e di Chardonnay innestate
rispettivamente su Kober 5BB e 420A sono state sottoposte a strattonamento nell’aprile
2007. Le prove sono state condotte in un vigneto dell’ASSAM localizzato in agro di
Petritoli (AP).
Le indagini hanno evidenziato una efficacia quasi completa dell’estirpo
controllato nell’induzione del recovery in viti di Chardonnay, Verdicchio e Sangiovese
quando innestate su Kober 5BB, mentre l’efficacia è stata parziale quando la pratica
è stata applicata a viti di Chardonnay allevate su 420A. Una efficacia parziale è stata
osservata su piante strattonate, stavolta senza differenze fra i portinnesti. Campioni
373
fogliari prelevati dalle piante recovered e sottoposti ad analisi molecolari sono risultati
liberi dal fitoplasma, come verificato anche in prove svolte in Friuli Venezia Giulia
e in Piemonte (Osler et al., 1993; Morone et al., 2007). Numerose sono le alterazioni
fisiologiche indotte nelle viti recovered, molte delle quali legate al metabolismo
dell’acqua ossigenata (Musetti et al., 2007). Le prime indagini sull’espressione genica
nelle foglie di viti recovered in seguito all’estirpo controllato hanno evidenziato il
coinvolgimento di alcuni enzimi della via biosintetica dei flavonoidi, quali PAL e
CHS, che potrebbero essere implicati nei meccanismi di resistenza/tolleranza al
patogeno.
Parole chiave: Vitis vinifera, Gene tuf, PCR in tempo reale.
Recovery induction in Bois noir infected grapevines by abiotic stresses
Bois noir (BN) and Flavescence dorée (FD) are the most important of the
grapevine yellows and they can induce severe loss of production and death of plants.
FD is a quarantine pathogen, and it is present in several areas of northern and central
Italy (Bianco et al., 2002; Morone et al., 2007); in the Marche region it has been
found in two locations, and it is currently under control (Romanazzi et al., 2007).
Conversely, BN is the most widespread grapevine phytoplasma disease in the region,
where it affects almost all vineyards (Romanazzi and Murolo, 2008). At present, there
are no known effective disease control methods to apply to grapevines infected by
these phytoplasma. However, in infected plants, it is possible to have spontaneous
symptom remission, better known as recovery. Abiotic stresses, such as uprooting
followed by immediate transplanting (Osler et al., 1993), or agronomical practices
such as pruning or pollarding, can promote this recovery (Borgo and Angelini, 2002;
Zorloni et al., 2002).
Our aim is to study the effectiveness of some agronomic practices, such as
partial uprooting and pulling, for the induction of recovery in grapevines infected
with VK-II BN.
In April 2006, grapevines of cv Chardonnay, Verdicchio and Sangiovese
grafted onto Kober 5BB rootstock, and Chardonnay grafted onto 420A rootstock
infected with BN were subjected to partial uprooting. Moreover, in April 2007 BN
infected plants cv Chardonnay grafted onto 420A rootstock and cv Primitivo grafted
onto Kober 5BB rootstock were “pulled”. These trials were carried out in an ASSAM
vineyard located in Petritoli (AP).
Almost all of plants cv Chardonnay, Verdicchio and Sangiovese grafted onto
the Kober 5BB rootstock that underwent the partial uprooting did not show disease
374
symptoms in the autumn of 2006 and 2007, while the effects of the treatment was
only partially successful when applied to cv Chardonnay grafted onto 420A rootstock.
Moreover, some of the “pulled” grapevines cv Primitivo and Chardonnay grafted onto
Kober 5BB and 420A rootstocks, respectively, did not show disease symptoms in
the following autumn, while others had only mild infections. In this last trial, it was
not possible to reveal any differences between the rootstocks. All of the recovered
plants had the leaf veins free from the phytoplasma, confirming the results of similar
investigations that have been carried out in Friuli Venezia Giulia and in Piedmont
(Osler et al., 1993; Morone et al., 2007). Several physiological changes were seen in
the recovered plants, most of which related to hydrogen peroxide metabolism (Musetti
et al., 2007). The first investigations that we carried out on gene expression in leaves
from plants recovered after partial uprooting showed the involvement of enzymes of
the flavonoid pathway, as PAL and CHS, that can be implicated in the mechanisms of
resistance or tolerance to the pathogen.
Key words: Vitis vinifera, Tuf gene, Real Time PCR.
Borgo M., E. Angelini, 2002. Diffusione della Flavescenza dorata della vite in Italia
e relazioni con vitigni, pratiche agronomiche e materiali di propagazione. Atti
Giornate fitopatologiche, vol. 1, 35-49.
Morone C., M. Boveri, S. Giosuè, P. Gotta, V. Rossi, I. Scapin, C. Marzachì, 2007.
Epidemiology of Flavescence dorée in vineyards in northwestern Italy. Phytopathology, 97, 1422-1427.
Musetti R., R. Marabottini, M. Badiani, M. Martini, L. Sanità Di Toppi, S. Borselli, M. Borgo, R. Osler, 2007. On the role of H2O2 in the recovery of grapevine
(Vitis vinifera, cv. Prosecco) from Flavescence dorée disease. Functional Plant
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occurrence of a yellows disease of grapevine in Northeastern Italy. Plant Disease, 77, 496-498.
Romanazzi G., S. Murolo, F. Terlizzi, S. Taveli, G. Stimilli, V. Savino, 2007. Fitoplasmi associati ai giallumi della vite nelle Marche. Informatore Fitopatologico, 57 (4), 48-50.
375
Romanazzi G., S. Murolo, 2008. Partial uprooting and pulling to induce recovery in
Bois noir infected grapevines. Journal of Phytopathology (in stampa).
Zorloni A., G. Scattini, PA. Bianco, G. Belli, 2002. Possibile reduction of grapevine
Flavescence dorée by a careful winter pruning. Petria, 12, 407-408.
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da
Legno nero e ricerca di mezzi innovativi per incrementare il fenomeno”.
376
FENOMENI DI RECOVERY IN ALBICOCCHI INFETTI DA
EUROPEAN STONE FRUIT YELLOWS
N. Loi, F. Ferrini, A. Loschi, M. Martini, L. Carraro
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante (DiPi),
Università di Udine, Via Scienze 208, I-33100 (UD)
Il fenomeno del recovery, noto e studiato per importanti fitoplasmosi quali
gli scopazzi del melo ed i giallumi della vite (Carraro et al., 2004; Osler et al.,
1999) è stato indagato anche nel caso dell’albicocco infetto da European stone fruit
yellows (ESFY). In un’area del Friuli Venezia Giulia caratterizzata da alta pressione
di infezione della malattia, un frutteto è stato monitorato per più anni a partire dal
suo impianto effettuato nel 1990. Sono state rilevate tre diverse tipologie di piante
infette da ESFY: molte piante con sintomi gravi, alcune piante asintomatiche e
alcune piante in recovery. Con lo scopo di isolare ceppi del patogeno differenti in
virulenza e/o attitudine al recovery, ogni gruppo di piante – infette sintomatiche,
infette asintomatiche, infette recovered - è stato propagato ed in parte sottoposto a
termoterapia; successivamente è stato impiegato per costituire frutteti sperimentali,
monitorati a partire dal 2003. In parallelo sono state condotte prove di trasmissione
per innesto in serra ed in pieno campo impiegando ceppi in cui si era supposta una
diversa virulenza e/o attitudine al recovery.
I risultati ottenuti hanno evidenziato e confermato la presenza di ceppi iper
ed ipovirulenti del patogeno. I ceppi ipovirulenti isolati erano originariamente presenti
in piante recovered; le piante infette asintomatiche hanno invece dato luogo ad una
discendenza sintomatica. Il materiale propagato ha dimostrato una diversa suscettibilità
alle infezioni naturali tramite vettore; particolarmente suscettibili sono risultate le
piante termotrattate. Risultati preliminari ottenuti da analisi condotte mediante realtime PCR (Martini et al., 2007) hanno dimostrato che nelle piante infettate con ceppi
ipovirulenti la colonizzazione del patogeno è inferiore rispetto alle piante infettate
con ceppi ipervirulenti. Il lavoro prosegue nell’intento di trovare marcatori molecolari
per differenziare i ceppi ipo ed ipervirulenti individuati e di verificare la possibilità di
“cross protection” fra essi.
Parole chiave: Albicocco, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, Recovery.
377
Recovery phenomena in apricot trees infected by
European stone fruit yellows
The recovery phenomena, already known and studied for important diseases
like apple proliferation and grapevine yellows (Carraro et al., 2004; Osler et al.,
1999), have been investigated also in the case of apricot infected by European stone
fruit yellows (ESFY). In an area of Friuli Venezia Giulia Region under high ESFY
infection pressure, an apricot orchard has been surveyed for several years starting
from the year of planting (1990). Three different groups of plants infected by ESFY
were identified: many symptomatically infected plants, some asymptomatically
infected plants and some recovered infected plants. With the aim to isolate strains of
the pathogen characterised by different virulence and/or aptitude to recovery, each
group of the considered plants was propagated. Some of the plants were also treated
with thermotherapy. They were used to constitute experimental orchards, located in
different areas and surveyed starting from 2003. At the same time, graft transmission
trials were carried out under both controlled and open field conditions using strains
with the supposed different virulence and/or aptitude to recovery.
The obtained results showed and confirmed the presence of hyper and
hypovirulent strains of the pathogen. The hypovirulent strains were originally present
in recovered infected plants; the plants propagated from asymptomatically infected
apricots showed symptoms of the disease and resulted infected by PCR analyses. In
the experimental apricot orchards, a different susceptibility of the propagated plants
to natural infections by vector was observed; in particular, the plants subjected to
thermotherapy resulted highly susceptible. Preliminary results obtained by real-time
PCR analyses (Martini et al., 2007) showed that in the plants infected by hypovirulent
strains the colonisation was lower than in the plants infected by hypervirulent
strains. The research will continue with the aim to find molecular markers useful for
the differentiation of the identified hyper and hypovirulent strains and to verify the
possibility of cross protection among them.
Key words: Apricot, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, Recovery.
378
Carraro L., P. Ermacora, N. Loi, R. Osler, 2004. The recovery phenomenon in apple
proliferation-infected apple trees. Journal of Plant Pathology, 86, 141-146.
Martini M., N. Loi, P. Ermacora, L. Carraro, M. Pastore, 2007. A real-time PCR
method for detection and quantification of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ in its natural hosts. Bulletin of Insectology, 60, 251-252.
affected by phytoplasmas. Proceedings of the V congress of the European Fundation for Plant Pathology, 589-592.
Ricerca in parte finanziata dal MIUR, PRIN 2005, progetto ‘Le resistemze indotte, gli antagonosti ed il
recovery, base di studio per un controllo innovativo di fitoplasmosi dei fruttiferi e della vite’.
379
Il “Recovery” da Apple Proliferation in melo
è associato all’ aumento della concentrazione
dello ione Calcio nel floema
R. Musetti1, F. Tubaro2, R. Polizzotto1, P. Ermacora1 R. Osler1
2
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università di Udine,
Via Cotonificio 108, I-33100 (UD)
1
Il fenomeno del “recovery” (o guarigione spontanea), in piante affette da
fitoplasmi, è caratterizzato da un accumulo di specie reattive dell’ossigeno, in
particolare H2O2, nel floema e dalla variazione dello stato ossidativo dei tessuti della
pianta (Musetti et al., 2004; 2005; 2007), che porta all’instaurarsi di una resistenza
sistemica acquisita (Systemic Acquired Resistance, SAR). La SAR è caratterizzata
non solo dall’accumulo di H2O2 in prossimità del sito di attacco del patogeno, ma
anche dalla sintesi ed accumulo di H2O2 ed acido salicilico nelle parti distanti, nelle
quali viene attivata l’espressione dei geni di resistenza. Molti lavori hanno dimostrato
che lo ione Ca2+ gioca un ruolo fondamentale sia nell’instaurarsi dello scoppio
ossidativo che nella trasduzione del segnale a lunga distanza che è alla base della
SAR (Lecourieux et al., 2006).
Numerose modificazioni ultrastrutturali a carico del floema, come l’accumulo
di callosio o l’aggregazione della proteina floematica (P-protein), sono connesse
a meccanismi di difesa contro i patogeni e sono mediate da variazioni della
concentrazione dello ione Ca2+ all’interno dei tubi cribrosi (Furch et al., 2007).
Nell’ottica di approfondire le conoscenze sulle basi fisiologiche del “recovery”sono
state effettuate analisi ultrastrutturali e biochimiche volte a verificare, in piante di
melo cv. Florina “recovered” da Apple Proliferation, la presenza di modificazioni
riconducibili ai suddetti meccanismi di resistenza. Sono stati analizzati e confrontati
tessuti fogliari di meli “recovered”, di meli sani (che mai avevano contratto la malattia)
e di meli infetti-sintomatici con lo scopo di: 1) verificare la localizzazione di Ca2+ nei
tessuti fogliari mediante la tecnica della precipitazione con pirantimoniato di potassio
e analisi al TEM; 2) quantificarne la concentrazione nel citosol mediante separazione
della frazione citosolica e analisi ICP-MS del Ca 43; 3) verificare la presenza di grandi
ammassi di callosio e di aggregazioni di P-protein nel floema, soprattutto in prossimità
delle placche cribrose.
Dalle nostre osservazioni è emerso che i precipitati di pirantimoniato, indicatori
380
della presenza di Ca2+, sono localizzati nel floema, in tutte e tre le tipologie di piante,
ma in quelle “recovered” la concentrazione di tale ione nel citosol risulta notevolmente
incrementata rispetto alle altre due tesi (circa il 120% rispetto alle sane). Questo fatto
lascerebbe presupporre un aumento, nel floema, delle attività-segnale dipendenti dalla
concentrazione di Ca2+ nel citosol, tra cui quelle legate ai processi di resistenza nella
pianta. Nel floema dei meli “recovered” sono stati anche osservati, in prossimità delle
placche cribrose, notevoli accumuli di callosio e/o aggregazioni di P-protein.
La sintesi di callosio e la aggregazione della P-protein sono fenomeni Ca2+dipendenti (Köhle et al., 1985; Knoblauch et al., 2001), regolati dall’afflusso di
questo ione all’interno del floema, e sono probabilmente tra i primi eventi chiave che
portano alla formazione di vere e proprie barriere fisiche nel floema, che ne limitano
la colonizzazione da parte del fitoplasma.
Questi risultati, assieme a quelli precedentemente riportati (Musetti et al.,
2004) rafforzano l’ipotesi che alla base del “recovery” in melo sia attiva una sorta di
SAR.
Parole chiave: Apple Proliferation, Calcio, Melo, Recovery, SAR.
Recovery from Apple Proliferation in apple trees is associated
to the increase of Ca2+ in the phloem
Recovery in phytoplasma-infected plants is characterized by the accumulation
of reactive oxygen species, particularly H2O2, in the phloem and by the changes of
oxidative status of plant tissues (Musetti et al., 2004; 2005; 2007), leading to Systemic
Acquired Resistance (SAR). SAR is characterized by accumulation of H2O2 at the
site of attack and by the subsequent production of H2O2 and salicylic acid in distant
part of the plant, where the expression of resistance genes is triggered. Many studies
demonstrated that Ca2+ plays a pivotal role in the oxidative burst and in the longdistance signaling transduction that is at the basis of SAR (Lecourieux et al., 2006).
Numerous ultrastructural modifications in the phloem, such as callose accumulation
or phloem protein (P-protein) plugging, are connected to the defense mechanisms
against pathogens and they are mediated by changes of Ca2+ concentration inside sieve
elements (Furch et al., 2007). With the aim to investigate thoroughly the physiological
bases of “recovery”, ultrastructural and biochemical analyses have been carried out
in “recovered” apple trees (cv. Florina) to evidence modifications correlated to the
above described resistance mechanisms. “Recovered”, healthy (never infected) and
symptomatic/infected leaf tissues have been analyzed in order to: 1) verify Ca2+
localization in the leaf tissues by potassium-pyroantimonate precipitation method and
381
TEM observations; 2) quantify Ca2+ in the cytosol by separation of cytosolic fraction
and Ca 43 ICP-MS analysis; 3) verify presence of callose accumulation and P-protein
plugs in the phloem, mainly in the proximity of sieve plates.
Our observations demonstrated that pyroantimonate precipitates, indicating
Ca2+ presence, are localized in the phloem in all three kinds of plants, but in the
“recovered” apples Ca2+ concentration in the cytosol is remarkably increased compared
to the healthy or infected ones. This fact could enhance the hypothesis concerning an
increase of Ca2+-dependent signaling activities, among which those connected with
resistance mechanisms. In the phloem of “recovered” apples callose accumulation and
P-protein plugs have been observed, mainly in the proximity of sieve plates. Callose
synthesis and P-protein plugging are Ca2+-dependent phenomena (Köhle et al., 1985;
Knoblauch et al., 2001), regulated by Ca2+ flux into the phloem, and they are among
the early key events carring to the formation of physical barriers that might prevent
the in planta movement of phloem-restricted microorganisms.
These data, together with the already reported results (Musetti et al.,
2004), support the hypothesis that a SAR is at the basis of recovery from Apple
Proliferation.
Key words: Apple, Apple Proliferation, Calcium, Recovery, SAR.
Furch ACU., JB. Hafke, A. Schulz, AJE. Van Bel, 2007. Ca2+-mediated remote
control of reversible sieve tube occlusion in Vicia faba. Journal of Experimental
Botany, 58, 2827-2838.
Knoblauch, M., WS. Peters, K. Ehlers, AJE Van Bel, 2001. Reversible calciumregulated stopcocks in legume sieve tubes. Plant Cell, 13, 1221-1230.
Köhle H., W. Jeblick, F. Poten, W. Blascheck, H. Kauss, 1985. Chitosan-elicited
callose synthesis in soybean cells as a Ca2+-dependent process. Plant
Physiology, 77, 544-551.
Lecourieux D, R. Ranjeva, A. Pugin, 2006. Calcium in plant defence-signalling
pathways. New Phytologist, 171, 249-269.
Musetti R., L. Sanità di Toppi, P. Ermacora, MA. Favali, 2004. Recovery in apple
trees infected with the apple proliferation phytoplasma: an ultrastructural and
biochemical study. Phytopathology, 94, 203-208.
Musetti R., L. Sanità di Toppi, M. Martini, F. Ferrini, A. Loschi, MA. Favali, R.
Osler, 2005. Hydrogen peroxide localisation and antioxidant status in the
recovery of apricot plants from European stone fruit yellows. European
Journal of Plant Pathology, 112, 53-61.
382
(Vitis vinifera cv. Prosecco) from Flavescence Dorée disease. Functional Plant
Biology, 34, 750-758.
383
IL RECOVERY IN VITI CON GIALLUMI
L. Carraro1, P. Ermacora1, R. Musetti1, M. Martini1, F. Ferrini1, N. Loi1,
F. Pavan1, R. Osler1, M. Hren2, K. Gruden2, M. Borgo3, D. Bellotto3,
P.A. Bianco4, P. Casati4, F. Quaglino4, A. Zorloni4, C. Morone5, P. Gotta5,
V. Rossi6, C. Marzachì7
Via Scienze 208 I-33100 (UD)
2
Department of Biotechnology and System Biology, NIB,
Vecna pot 111, Sl-1000 Lubiana, Slovenia
3
Centro di Ricerca per la Viticoltura, CRA-VIT,
Via XXVIII Aprile 26, I-31015 Conegliano (TV)
4
5
Regione Piemonte, Settore Fitosanitario, Via Livorno 60, I-10144 (TO)
6
Istituto di Entomologia e Patologia Vegetale, Università Cattolica S. Cuore,
Via Emilia Parmense 84, I-29100 (PC)
7
Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Strada delle Cacce 73, I-10135 (TO)
1
Il recovery, ossia la scomparsa spontanea di sintomi in piante precedentemente
infette e sintomatiche, è potenzialmente sfruttabile ai fini del contenimento delle
fitoplasmosi (Osler et al., 1999). Per tale ragione sono stati studiati alcuni aspetti
legati a tale fenomeno nel caso dei giallumi della vite. In particolare, gli obiettivi dello
studio sono stati:
1) una dimostrazione definitiva e probante del recovery;
2) la conferma del risanamento dal patogeno (oltre che dai sintomi) in viti
recovered;
3) l’accertamento della trasmissibilità o meno dell’infezione attraverso
l’innesto di gemme prelevate da viti recovered;
4) l’acquisizione di conoscenze sulle basi fisiologiche e genetiche del
recovery.
Relativamente agli obiettivi previsti nei punti 1 e 2, le analisi di laboratorio
hanno dimostrato che le piante in fase di recovery da due o più anni sono da
considerarsi esenti da fitoplasmi, sia Flavescenza dorata (FD) che Legno nero (LN).
Solo nel caso della cv Chardonnay infetta da LN, sono stati riscontrati casi di viti in
recovery da un anno in cui il fitoplasma era ancora presente mentre per viti in recovery
da almeno due anni il patogeno è sempre risultato assente. Il fenomeno del recovery
384
è stabile nel tempo, soprattutto quando l’attività dei vettori è fortemente ridotta e può
interessare altissime percentuali di viti, come nel caso delle cvv Prosecco, Merlot,
Barbera, Bonarda piemontese, Cortese e Dolcetto infette da FD. Si è inoltre dimostrato
che la prestazione produttiva delle viti in recovery si mantiene buona. Riguardo
all’obiettivo previsto al punto 3, è stata effettuata una prova sotto tunnel a tenuta di
insetti, allevando per tre anni più di 4000 viti (innesti-talea) ottenute da piante madri
infette da FD, recovered e sane. Tali piante non hanno mai dimostrato sintomi di
giallume né sono risultate infette alle analisi. Solo al primo anno di vegetazione, è
stata riscontrata una mortalità statisticamente superiore nelle piante derivate da piante
madri infette (39,7%) rispetto a quelle derivate da piante recovered (15,9%) e sane
(16,1%). Relativamente all’obiettivo previsto nel punto 4, è stato dimostrato che nei
tessuti fogliari delle viti in recovery si verifica un accumulo di H2O2; tale molecola
sembra svolgere un ruolo di segnale per l’induzione di processi di difesa nelle piante
e di molecola con attività antibiotica verso il patogeno. E’ stato rilevato anche un
possibile ruolo di Aureobasidium pullulans ed Epicoccum nigrum - già segnalati
come funghi endofiti della vite e possibili antagonisti nei confronti di diversi patogeni
– nel recovery delle viti infette da giallume. Per quanto riguarda le basi genetiche del
recovery, sono state analizzate mediante microarray viti infette, sane e recovered. E’
stata riscontrata una differente espressione genica che coinvolge geni legati a processi
di difesa e alla risposta delle piante agli stress. E’ stata analizzata mediante PCR
quantitativa l’espressione di tre geni “marker” in viti Barbera e Prosecco (infette da
FD o recovered) e Chardonnay (sane o infette da LN). I due geni sucrose synthase e
alcohol dehydrogenase sono risultati sovraregolati nelle piante infette rispetto alle
sane; il gene heat shock protein 70 è invece sovraregolato nelle piante infette rispetto
alle piante recovered. Il lavoro svolto, dai risultati più che promettenti, ha gettato le
basi per futuri approfondimenti possibili grazie al recente sequenziamento dell’intero
genoma della vite.
Parole chiave: Recovery, Flavescenza dorata, Legno nero.
The recovery phenomenon in yellows-infected grapevines
The recovery, i.e. the spontaneous remission of symptoms in plants previously
symptomatically infected, is a phenomenon potentially useful to the control of
phytoplasma diseases (Osler et al., 1999). In the case of grapevine yellows, some
aspects of the recovery have been studied. In particular, the objectives were: 1) to
demonstrate definitively the recovery; 2) to confirm the absence of the pathogen in
recovered grapevines; 3) to ascertain the transmissibility of the pathogen from recovered
grapevines using grafting; 4) to deepen the knowledge on the physiological and
385
genetic bases of the recovery. Regarding the objectives 1) and 2), the analyses carried
out showed that the grapevines recovered at least from two years were phytoplasmafree, both Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN). Some BN-infected grapevines
cv Chardonnay resulted infected only during the first year of recovery. The recovered
plants maintain their healthy status for several years, especially when the vectors
are controlled; very high percentages of grapevines, if FD-infected, can recover as
demonstrated by the cases of cvs Prosecco, Merlot, Barbera, Bonarda piemontese,
Cortese and Dolcetto. It was also demonstrated that the production of the recovered
grapevines did not decrease. Regarding the objective 3), an experiment was carried
out using more than 4000 grapevines derived by bench-grafting with FD-infected,
recovered and healthy mother-plants. The grapevines, planted under screenhouses
and observed for three years, never showed yellows symptoms nor resulted infected.
During the first year of vegetation, 39,7% (highly significant value) of the grapevines
derived from FD-infected mother-plants died while the mortality was respectively
15,9% among the plants derived from recovered grapevines, and 16,1% among the
plants derived from the healthy ones. Regarding the objective 4), it was demonstrated
that in the leaf tissues of recovered grapevines there is an accumulation of H2O2; it
seems that this molecule plays a signal role in induce defence processes in the plant and
has antibiotic activity against the pathogen. It was also demonstrated a possible role of
Aureobasidium pullulans and Epicoccum nigrum in the recovery of yellows-infected
grapevines; these endophytes are known as antagonists against several pathogens.
The genetic bases of recovery were investigated applying microarray technique on
yellows-infected, recovered and healthy grapevines. A different genetic expression
regarding genes linked with both the defence processes and the stress response
was obtained. Using quantitative PCR, the expression of three marker genes was
analysed: the sucrose synthase and alcohol dehydrogenase genes resulted upregulated
in infected plants compared with the healthy ones; the heat shock protein 70 gene
resulted upregulated in infected plants compared with the recovered ones. The present
work carried out with promising results, represents the basis for future developments
that will be possible since recently the grape genome has been completely sequenced
and annotated.
Key words: Recovery, Flavescence dorée, Bois noir.
386
affected by phytoplasmas. Proceedings of the V Congress of the European
Foundation for Plant Pathology, 589-592.
387
INCIDENZA DEL FENOMENO DEL “RECOVERY” IN
VIGNETI DELLA LOMBARDIA
A. Zorloni, P. Casati, F. Quaglino, D. Bulgari, PA. Bianco
Frequentemente, in vigneti affetti da Flavescenza dorata (FD) e Legno nero
(LN), vengono riscontrati casi di remissione spontanea di sintomi da parte di viti
malate, fenomeno indicato con il termine “Recovery”. Casi di “recovery” sono
stati riscontrati in molte aree viticole italiane, con incidenze diverse a seconda
delle condizioni colturali e delle varietà colpite. In alcuni casi l’assenza dei sintomi
è temporanea, mentre in altri il fenomeno è stabile nel tempo; l’assenza di sintomi
viene spesso accompagnata dalla scomparsa dell’agente patogeno, in questi casi è più
corretto parlare di risanamento vero e proprio della pianta (Osler et al., 2006; Bellomo
et al., 2007; Garau et al., 2007; Morone et al., 2007; Romanazzi et al., 2007).
Uno studio condotto in Oltrepò pavese e Franciacorta ha messo in evidenza
il verificarsi di questo fenomeno in viti appartenenti alle varietà Barbera e Cabernet
Sauvignon affette da FD, e in Chardonnay affetto da LN. In particolare, sono stati
esaminati due vigneti costituiti da Barbera, situati nei comuni di Borgo Priolo e Montù
Beccaria (Pavia), uno costituito da Cabernet Sauvignon, a Cigognola (Pavia) e uno
costituito da Chardonnay, a Erbusco (Brescia). In tutto sono state esaminate 466 viti
di Barbera, 320 di Cabernet Sauvignon e 228 di Chardonnay, per un totale di 1014
piante. Ogni pianta è stata sottoposta ad osservazioni visive durante il periodo estivoautunnale, dal 2000 al 2007, al fine di individuare la presenza di sintomi di giallume.
Inoltre si è provveduto a prelevare campioni fogliari da sottoporre a diagnosi mediante
PCR ed RFLP. Tali analisi hanno rilevato che le viti di Barbera e Cabernet Sauvignon
provenienti dall’Oltrepò pavese erano infette da fitoplasmi appartenenti al gruppo
tassonomico 16SrV-C/-D, mentre le viti di Chardonnay provenienti dalla Franciacorta
erano infette da fitoplasmi appartenenti al gruppo tassonomico 16SrXII-A.
Durante le osservazioni svolte dal 2000 al 2007, nel vigneto di Barbera a
Borgo Priolo, 100 piante in tutto hanno mostrato remissione spontanea di sintomi: 52
nel 2001; 18 nel 2002; 16 nel 2003; 5 nel 2004; 6 nel 2006; 3 nel 2007. Nel vigneto
di Barbera a Montù Beccaria, le piante recovered sono state in tutto 26: 10 nel 2001;
4 nel 2002; 8 nel 2003; 1 nel 2004; 1 nel 2005; 2 nel 2006. Nel vigneto di Cabernet
Sauvignon sono stati riscontrati 56 casi di recovery: 19 nel 2001; 15 nel 2002; 10 nel
2003; 3 nel 2004; 5 nel 2005; 2 nel 2006; 2 nel 2007. Nel vigneto di Chardonnay,
388
infine, dal 2005 al 2007, sono stati registrati 18 casi di viti recovered: 2 nel 2005;
7 nel 2006; 9 nel 2007. Analisi molecolari condotte su campioni fogliari prelevati
da viti recovered hanno, nella maggior parte dei casi, rilevato l’assenza dell’agente
patogeno.
L’elevata frequenza di viti recovered ha determinato una notevole diminuzione
del numero di piante malate in tutti i quattro vigneti esaminati. Nonostante la presenza
del fenomeno del “recovery” nelle aree e varietà esaminate sia risultato rilevante, le
sue cause scatenanti non sono ancora note; studi atti a chiarire quali siano i fattori
coinvolti e i meccanismi che regolano questo fenomeno sono in corso, e risultano
necessari al fine di permettere un eventuale sviluppo di metodi utilizzabili per il
controllo della malattia.
Parole chiave: Recovery, Giallumi della vite, PCR, RFLP.
Recovery incidence in Lombardia’s vineyards
Spontaneous grapevine yellows (GY) symptom’s remission (“recovery”) has
been observed in both Flavescence dorèe (FD) and bois noir (BN) affected grapevines.
Cases of recovery have been reported in many italian viticultural areas, and incidence
of this phenomenon seems to be correlated to different cultural conditions and
cultivars. Remission of symptoms in some cases occurs temporary, but it is more
often observed as definitive; lack of symptoms accompanied by lack of phytoplasma,
should be defined as a real resanation of the plant (Osler et al., 2006; Bellomo et al.,
2007; Garau et al., 2007; Morone et al., 2007; Romanazzi et al., 2007).
In the period 2000-2007, recovery phenomena have been observed in Oltrepò
pavese and Franciacorta vineyards, respectively in FD affected cv Barbera and
Cabernet Sauvignon, and in BN affected cv Chardonnay. In detail, two Barbera
vineyards were monitored in Borgo Priolo and Montù Beccaria (Pavia), one Cabernet
Sauvignon vineyard in Cigognola (Pavia) and one Chardonnay vineyard in Erbusco
(Brescia). In total, 1014 plants were observed year by year: 466 Barbera, 320 Cabernet
Sauvignon and 228 belonging to Chardonnay cultivar. GY symptom’s observations
were conducted on all vines, each year in September. At the same time, leaf samples
were collected from symptomatic plants, and analysed by PCR and RFLP tests; 16SrVC and -D phytoplasmas (FD) were detected in Barbera and Cabernet Sauvignon from
Oltrepò pavese, and 16SrXII-A (BN) in Chardonnay from Franciacorta.
Eight years’ survey, from 2000 to 2007, noticed the presence of 100 recovered
plants in the Barbera vineyard of Borgo Priolo: 52 in 2001; 18 in 2002; 16 in 2003; 5
in 2004; 6 in 2006; 3 in 2007. In the Barbera vineyard of Montù Beccaria, recovered
plants were 26: 10 in 2001; 4 in 2002; 8 in 2003; 1 in 2004; 1 in 2005; 2 in 2006. In
389
the Cabernet Sauvignon vineyard, recovered plants were 56: 19 in 2001; 15 in 2002;
10 in 2003; 3 in 2004; 5 in 2005; 2 in 2006; 2 in 2007. In the Chardonnay vineyard,
from 2005 to 2007, 18 plants recovered: 2 in 2005; 7 in 2006; 9 in 2007. The high
frequency of recovery phenomenon determined a decrease of the disease in all the
four examined vineyards. Molecular tests on samples collected from recovered plants,
resulted in most cases negative.
The incidence of recovery, in the areas and cultivars examined, was relevant,
nevertheless, the causes of this phenomenon are still unknown. Studies will be needed
to understand the mechanisms and the factors involved, in order to allow the develop
of new strategies to control the disease.
Key words: Recovery, Grapevine Yellows, PCR, RFLP.
Bellomo C., L. Carraro, P. Ermacora, F. Pavan, R. Osler, C. Frausin, G. Governatori, 2007. Recovery phenomena in grapevines affected by grapevine yellows
in Friuli Venezia Giulia. Bulletin of Insectology, 60, 235-236.
Garau R., A. Sechi, VA. Prota, G. Moro, 2007. Productive parameters in Chardonnay and Vermentino grapevines infected with “bois noir” and recovered in
Sardinia. Bulletin of Insectology, 60, 233-234.
Morone C., M. Boveri, S. Giosuè, V. Rossi, I. Scapin, C. Marzachì, 2007. Epidemiology of Flavescence dorèe in vineyards in Northwestern Italy. Phytopathology,
97, 1422-1427.
Osler R., PA. Bianco, GF. Romanazzi, 2006. Il fenomeno “recovery”: esperienze nel
Nord Est, in Lombardia e Italia Centrale. Forum Scientifico Internazionale “I
fitoplasmi della vite”, Alessandria, 15-16 novembre 2006.
Romanazzi G., VA. Prota, P. Casati, S. Murolo, M.R. Silletti, R. Di Giovanni, L.
climatiche e varietali italiane e tentativi di comprensione ed individuazione
del fenomeno. Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro le
antagonisti”, Ancona, 17-18 settembre 2007: 9-11.
390
Ulteriori informazioni sulla produttività di
Chardonnay e Vermentino affette da “Legno
nero” ed in recovery
R. Garau, V.A Prota, A Sechi, G. Moro.
Dipartimento di Protezione delle piante. Università degli Studi di Sassari
Via E. de Nicola, 1 I-07100 (SS)
Studi sono stati eseguiti, in impianti del nord Sardegna, affetti da “Legno nero”,
sulle cultivar Chardonnay (CH) e Vermentino (VRM), in parcelle rispettivamente di
310 e 1500 piante, al fine di verificare la reattività produttiva dei due vitigni alla
malattia. Annualmente rilevamenti produttivi sono stati eseguiti, alla vendemmia, dal
2004 al 2007 su CH e dal 2005 al 2007 su VRM, relativamente ad alcuni parametri
quanti-qualitativi (kg/ceppo di uva, n° di grappoli/pianta, peso medio del grappolo e
di 10 acini, grado glucometrico e, negli anni 2006/2007, pH e acidità totale). Ciò nelle
tesi “asintomatico” (H), “sintomatico” (S) ed in recovery per uno o più anni, (n°R).
Gli esiti sono stati sottoposti all’analisi statistica (ANOVA) ed al test di
confronto multiplo LSD per la valutazione della significatività delle differenze tra le
medie. Il più alto tasso d’infezione, per cv e su base sintomatica, è stato per CH il 12%
(2004) e per VRM il 5,2%. (2007). In CH la più alta incidenza di piante recovered è
stata del 72% (1R) nel 2005, mentre in VRM del 50% (1R) nel 2007. Relativamente
alla produzione, espressa come kg/ceppo o come n° di grappoli/ceppo, differenze
altamente significative sono emerse, in CH e VRM, dai vari confronti risultati sempre
favorevoli alle piante sane. I valori medi delle produzioni sono risultati decrescenti
dal sano (H) al sintomatico (S) passando attraverso le n°R; ciò per CH ma non per
VRM nel 2007. Il decremento produttivo è stato massimo (73%), per CH nel 2004,
e per VRM nel 2006. Tre anni di recovery in CH ma non in VRM hanno consentito
di riguadagnare i livelli della produttività del sano. Nessuna differenza significativa è
emersa, per le due cv, dal confronto degli altri parametri analizzati.
Gli esiti, in generale, confermano quanto segnalato da altri autori relativamente
alla ripresa produttiva delle piante recovered (Mutton et al 2001; Mazio e Nasuelli
2007), peraltro verosimilmente non univoci su base geografica e varietale.
Parole chiave: Vite, Bois Noir, Produttività, Recovery.
391
Further knowledge on the productivity of Chardonnay and Vermentino affected
by ‘Legno nero’ and in recovery
In this study we evaluated the productivity of Chardonnay (CH) and Vermentino
(VRM) cultivars affected by Legno nero disease in two stands of 310 and 1417 plants
respectively. Samples were taken once a year at harvest since 2004 and until 2007
on CH and since 2005 until 2007 on VRM. Different quali-quantative parameters
were recorded (yield kg/cultivar, number of clusters/plant, average cluster weight
and weight of ten grapes, glucometric level, and in 2006/2007, pH and total acidity).
Each parameter was recorded for asymptomatic (H), symptomatic (S) and in recovery
plants for one or more years (n°R).
The results were subjected to Analysis of Variance (One-way ANOVA, P<
0.05) and multiple comparison test following the Fisher’s Least Significant Difference
Test (LSD, P< 0.05) to evaluate significant differences between averages. The highest
infection rate, per cultivar and on a symptomatic basis, was 12% (2004) for CH and
5.2% (2007) for VRM. In CH, the highest incidence of recovered plants was 72%
(1R) in 2005, whereas in VRM was 50% (1R) in 2007. With regard to production,
expressed as kg/plant or as number of clusters/plant, highly significant differences
were highlighted: in both CH and VRM, all the comparisons were favourable to
healthy plants. The mean productive values diminished from healthy plants (H)
towards symptomatic (S) coming through the n°R plants; thus for CH but not for
VRM in 2007. The yield decrease peaked in 2004 for CH and in 2006 for VRM,
reaching 73%. After three years of recovery the productive levels of CH, but not for
VRM, were similar to those of healthy plants. No substantial differences emerged, for
both cultivars, from the comparison of the other parameters analysed.
In general, the results support the findings of other authors regarding recovered
plants (Mutton et al 2001; Mazio e Nasuelli 2007).
Parole chiave: Grapevine, Bois Noir, Productivity, Recovery.
392
Mutton P., W. Boccalon, S. Bressan, C. Coassin, M. Colautti, D. Del Cont
Bernard, A. Floreani, D. Zucchiatti, F. Pavan, D. Mucignat, C. Frausin, P.
Antoniazzi, G. Stefanelli, A. Villani, 2001. Legno nero della vite in vigneti
di Chardonnay del Friuli – Venezia Giulia. Informatore fitopatologico, 51 (1),
52-59.
Mazio P., P. Nasuelli, 2007. Le conseguenze economiche. In: I Giallumi della vite
- sintomi, epidemia e lotta, l’esperienza reggiana con atlante fotografico; a
cura di A. Montelmini, Consorzio Fitosanitario Provinciale di Reggio Emilia,
Edizioni L’informatore Agrario, 63 73-84.
Lavoro svolto nell’ambito del PRIN 40% dal titolo “Le resistenze indotte, gli antagonisti ed il recovery,
base di studio per u n controllo innovativo di fitoplasmosi dei fruttiferi e della vite”.
393
USO DI INDUTTORI DI RESISTENZA PER IL CONTROLLO
DEL LEGNO NERO DELLA VITE IN PIENO CAMPO:
PRIMI RISULTATI
G. Romanazzi1, S. Barbone2, S. Murolo1, D. D’Ascenzo2
2
ARSSA Servizio Fitosanitario Regionale, Regione Abruzzo, Via Nazionale 38,
I-61100 Villanova (PE)
1
Le fitoplasmosi rappresentano gravi malattie della vite e di altre colture, per
il controllo delle quali al momento non sono disponibili mezzi di lotta volti alla
limitazione del numero di piante infette. Tuttavia, le piante infette da fitoplasmi
possono andare incontro al fenomeno della remissione spontanea dei sintomi
di malattia, meglio noto come recovery, fenomeno già conosciuto poco dopo la
scoperta di tali malattie (Caudwell, 1961). Una via per tentare di limitare il numero
di piante infette potrebbe essere l’induzione del recovery. Tale possibilità è stata
messa in atto applicando con successo alle viti infette da giallumi stress abiotici quali
l’estirpazione e l’immediato reimpianto (Osler et al., 1993), l’estirpazione controllata
o lo strattonamento (Romanazzi e Murolo, 2008). Una possibilità innovativa per il
controllo dei giallumi della vite consiste nell’irrorazione di induttori di resistenza
sulla chioma della pianta. In Sardegna, trattamenti con un prodotto commerciale a
base di glutatione e oligosaccarine su viti infette da Legno nero (LN) hanno fornito
risultati interessanti (Garau et al., 2007), analogamente a prove svolte in Emilia
Romagna con altri bioattivatori (Mazio et al., 2008). Trattamenti con promotori delle
resistenze della pianta effettuati su Catharanthus roseus, Arabidopsis thaliana o
Chrysanthemum carinatum hanno mostrato una buona attività nella riduzione della
trasmissione di fitoplasmi (Prati et al., 2004; Bressan e Purcell, 2005; Chiesa et al.,
2007; D’Amelio et al., 2007).
Obiettivo del lavoro è stato quindi la valutazione dell’efficacia di trattamenti
con induttori di resistenza nel controllo del LN della vite.
Cinque prodotti commerciali a base di induttori di resistenza, quali chitosano,
Phosetyl-Al, miscela di glutatione e oligosaccarine (due formulati) e acibenzolarS-metile (benzothiadiazolo o BTH) sono stati irrorati sulla vegetazione di viti
della cv Chardonnay affette da LN localizzate in un vigneto in agro di Atri (TE). I
trattamenti sono stati effettuati settimanalmente dall’inizio di giugno a metà luglio
394
2007, distribuendo con una irroratrice a spalla a motore un volume equivalente
di 1000 litri/ha di ogni soluzione. Ogni trattamento è stato applicato a 35 piante e
altrettante sono state utilizzate come testimone non trattato. Tutti i trattamenti hanno
incrementato l’incidenza del recovery rispetto al testimone non trattato, mentre
non sono state riscontrate differenze significative fra i diversi prodotti applicati. La
diagnosi molecolare condotta sulle nervature fogliari prelevate dalle viti recovered
non ha evidenziato la presenza del fitoplasma. Resta tuttavia da valutare la stabilità
del recovery nel tempo.
Parole chiave: Vitis vinifera, Recovery, Resistenza indotta.
Use of resistance inducers to control grapevine Bois noir
in the vineyard: first results
Phytoplasmoses are severe diseases of grapevine and other crops, and
nowadays there are no known effective means to reduce the number of infected plants.
However, symptomatic plants infected by phytoplasma can undergo spontaneous
symptom remission, better known as recovery, a phenomenon that has been known
since soon after the discovery of these diseases (Caudwell, 1961). A strategy to
reduce the number of symptomatic plants thus lies in the induction of recovery. This
phenomenon has been successfully induced on yellows infected grapevines exposed
to abiotic stresses, such as transplantation (Osler et al., 1993), partial uprooting or
pulling (Romanazzi and Murolo, 2008). A further innovative possibility for the control
of grapevine yellows involves spraying the plant canopy with resistance inducers. In
Sardinia, treatments of Bois noir (BN) infected grapevines with a commercial product
containing glutathion and oligisaccharines has provided interesting results (Garau
et al., 2007), as have treatments with bioactivators carried out in Emilia Romagna
(Mazio et al., 2008). Treatments with resistance inducers carried out on Catharanthus
roseus, Arabidopsis thaliana and Chrysanthemum carinatum have been shown to
be effective in phytoplasma transmission prevention (Prati et al., 2004; Bressan and
Purcell, 2005; Chiesa et al., 2007; D’Amelio et al., 2007).
The aim of the present study is to evaluate the effectiveness of field treatments
with several resistance inducers in the control of grapevine BN.
Five commercial products based on resistance inducers, as chitosan, PhosetylAl, glutathion and oligisaccharines mixture (two formulations) and acibenzolarS-methyl (benzothiadiazole, BTH) were sprayed on the canopies of BN infected
grapevines cv Chardonnay located in a vineyard at Atri (TE). The treatments were
carried out weekly from the beginning of June to the middle of July 2007, with spraying
by a backwards engine sprayer with an equivalent volume of 1,000 litres/ha solution.
395
Each treatment was applied to 35 plants and the same number of plants were used as
untreated controls. All of the treatments increased the incidence of recovered plants
with respect to the controls, while these resistance inducers did not differ significantly
between each other in their effectiveness. The molecular diagnosis carried out on leaf
veins from the recovered plants failed to find the phytoplasma. However, the stability
of this recover over time needs to be assessed.
Key words: Vitis vinifera, Recovery, Induced resistance.
Bressan A., AH. Purcell, 2005. Effect of benzothiadiazole on transmission of Xdisease phytoplasma by the vector Colladonus montanus to Arabidopsis
thaliana, a new experimental host plant. Plant Disease, 89, 1121-1124.
Caudwell A., 1961. Les phénomènes de rétablissement chez la flavescence dorée de
la vigne. Annales of Epiphytes, 12, 347-354.
Chiesa S., S. Prati, G. Assante, D. Maffi, PA. Bianco, 2007. Activity of synthetic
and natural compounds for phytoplasma control. Bulletin of Insectology, 60,
313-314.
D’Amelio R., N. Massa, E. Gamalero, G. D’Agostino, S. Sampò, G. Berta, F. Faoro,
M. Iriti, D. Bosco, C. Marzachì, 2007. Preliminary results on the evaluation
of the effects of elicitors of plant resistance on chrysanthemum yellows
phytoplasma infection. Bulletin of Insectology, 60, 317-318.
Garau R., VA. Prota, A. Sechi, G. Moro, 2007. Applicazioni di biostimolanti su
Chardonnay e Vermentino affetti da “legno nero” e loro influenza sul recovery.
della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte e antagonisti”
- Ancona, 17-18 settembre, 12-13.
Mazio P., A. Montermini, P. Brignoli, 2008. Indagine preliminare degli effetti di
trattamenti con bioattivatori nei confronti delle manifestazioni sintomatologiche
da giallumi della vite. Atti Giornate Fitopatologiche, vol. 2, 593-600.
occurrence of a yellows disease of grapevine in Northeastern Italy. Plant
Disease, 77, 496-498.
396
Prati S., D. Maffi, C. Longoni, S. Chiesa, PA. Bianco, S. Quaroni, 2004. Preliminary
study on the effects of two SAR inducers and prohexadione calcium on the
development of phytoplasmas in vinca. Journal of Plant Pathology, 87, 303.
Romanazzi G., S. Murolo, 2008. Partial uprooting and pulling to induce recovery in
Bois noir infected grapevines. Journal of Phytopathology (in stampa).
www.phytoplasmarecovery.net
Abruzzo e del PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da Legno nero e ricerca di mezzi
397
EVIDENZA DI RISANAMENTO DA FITOPLASMI IN
CHIOMA E RADICI DI PIANTE DI PERO E SUSINO
INFETTATE MEDIANTE INNESTO
M. Pastore1, F. Gervasi1, M. Del Vaglio1, A. Bertaccini2
CRA - Unità di Ricerca per la Frutticoltura di Caserta
Via Torrino, 3 - I-81100 (CE)
2
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA),
Patologia Vegetale, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna,
1
Precedenti ricerche hanno evidenziato che quattro piante di susino infette da
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, perché ottenute da gemma infetta o perché
innestate con tasselli di corteccia infetta, sono risultate negative all’analisi per la
diagnosi di fitoplasmi a distanza di sette anni dall’acquisizione dell’infezione (Pastore
et al., 2008a). Avendo verificato il risanamento della parte aerea, si è proceduto alla
analisi delle radici, per controllare se anche queste fossero prive del patogeno.
Sono inoltre state analizzate anche tre piante di pero “William”/Cotogno A, due
delle quali innestate a tassello ed una ottenuta da gemma, sia i tasselli che la gemma
erano stati prelevati, nel maggio 1999, da piante infette da ‘Ca. P. pyri’, reperite in
un campo gravemente colpito da moria del pero (Pastore et al., 1998). Tali piante
risultarono positive alla presenza del patogeno nel novembre 2000. Le foglie di questi
peri sono state analizzate nuovamente nel giugno 2006 risultando negative alle analisi
molecolari.
Nel marzo 2008, tutte le suddette piante sono state tolte dai vasi e, dal taglio
di otto radici contigue per ogni pianta, sono stati prelevati campioni poi sottoposti ad
estrazione degli acidi nucleici (Bosco et al., 2002). Si è proseguito con le analisi di
PCR diretta, utilizzando la coppia di primers P1 (Deng e Hiruki, 1991) e 16S-SR (Lee
et al., 2004), e con le analisi di PCR ‘nested’, con la coppia di primers f01/r01 (Lorenz
at al., 1995). Le analisi hanno dato esito negativo per tutti i campioni prelevati.
Poiché tutte le piante sono state coltivate nell’ambiente protetto della serra, si
può supporre che tale ambiente, così come riscontrato in piante di pero e di albicocco
coltivate in campo coperte da tessuto anti-afide (Pastore et al., 2008b), abbia aiutato
la pianta a reagire alla presenza del patogeno.
Parole chiave: Susino giapponese, Pero, Risanamento, Diagnosi, radici, ‘Candidatus
Phytoplasma prunorum’, ‘Candidatus Phytoplasma pyri’.
398
Evidence of recovery from phytoplasmas in leaves and roots of pear
and japanese pum trees infected by grafting
Previous researches showed that leaves of Japanese plum trees infected from
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, respectively one by patch-grafting and three by
bud-grafting, resulted negative to the molecular analyses for phytoplasma detection
after seven years from the acquisition of the pathogen (Pastore et al., 2008a). The
root analyses were therefore preformed in order to verify if the whole plants were
recovered.
Further analyses were carried out on leaves and roots of three pear plants
“William”/Cotogno A, resulting infected in November of 2000 after patch-grafting
and bud-grafting performed in May 1999 using plant material infected by ‘Ca. P.
pyri’ and collected in a field severely affected by pear decline (Pastore et al., 1998).
Leaf samples were collected in June 2006, analyzed by molecular tools to detect the
phytoplasma, and resulted negative.
In March of 2008, samples collected pulling out all the above described plants
from their pots and prepared after cutting eight contiguous roots from each of them,
were analyzed by direct PCR with primers P1 (Deng e Hiruki, 1991) e 16S-SR (Lee et
al., 2004) followed by nested PCR with primers f01/r01 (Lorenz at al., 1995). All the
root sample tested resulted negative.
Considering that all plants grew under greenhouse conditions, we suppose that,
as observed in pear and apricot plants grown covered by anti-aphid tissue in field
(Pastore et al., 2008b), also for these plants grown in pots, the protected environment
was helpful to the plants to react to the pathogen presence.
Key words: Japanese plum, Pear, Recovery, Detection, Roots, ‘Candidatus
Phytoplasma prunorum’, ‘Candidatus Phytoplasma pyri’.
Bosco D., S. Palermo, G. Mason, R. Tedeschi, C. Marzachì, G. Boccardo, 2002.
DNA-Based methods for the detection and the identification of phytoplasmas
in insect vector extracts. Molecular Biotechnology, 22 (1), 9-18.
Deng S., C. Hiruki, 1991. Amplification of 16rSRNA genes from culturable and non
culturable Mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
Lee IM., M. Martini, C. Haren, SF. Zhu, 2004. Classification of phytoplasma strains
in the elm yellows group (16SrV) and proposal of ‘Candidatus Phytoplasma
ulmi’ for the phytoplasma associated with elm yellows. International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 337-347.
399
Lorenz KH., B. Schneider, U. Ahrens, E. Seemüller, 1995. Detection of the apple
proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of ribosomal and nonribosomal DNA. Phytopathology, 85, 771-776.
Pastore M., IM. Lee, M. Vibio, M. Santonastaso, F. La Cara, A. Bertaccini, 1998.
Susceptibility to phytoplasma(s) infection of three pear varieties grafted on
different rootstocks. Acta Horticulturae, 472, 673-680.
Pastore M., F. Gervasi, M. Del Vaglio, M. Petriccione, A. Bertaccini, 2008a.
Differenti reazioni indotte in susino cino-giapponese (Prunus salicina
LINDL) da infezioni ottenute mediante innesti di materiale infetto da
‘Candidatus phytoplasma prunorum’. Atti Giornate fitopatologiche, vol. 2,
585-588.
Pastore M., M. Petriccione, S. Paltrinieri, M. Del Vaglio, F. Gervasi, A. Bertaccini,
2008b. Research on phytoplasma persistence in pear and apricot trees under
protected enviroment. Book of Abstract First Symposium on Horticulture in
Europe Wien Austria 17th-20th February: 265-266.
Lavoro svolto nell’ambito del progetto finalizzato Mi.P.A.F. “Fru.Med.” Sottoprogetto “D.A.F.M.E.”
Pubblicazione n° 48.
Si ringrazia il collaboratore tecnico di ricerca Giovanni Scognamiglio per avere attivamente partecipato al
prelevamento dei campioni dalle piante oggetto di tale studio.
400
Conclusioni
PA. Bianco, A. Alma, M. Barba, A. Bertaccini, M. Conti, R. Osler
Prospettive future nella ricerca dei fitoplasmi
PROSPETTIVE FUTURE NELLA RICERCA DEI
FITOPLASMI
P. A. Bianco1, A. Alma2, M. Barba3, A. Bertaccini4, M. Conti5, R. Osler6
2
Università di Torino, Via L. da Vinci 44, I-10095 Grugliasco (TO)
3
CRA-PAV– Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Via C. G. Bertero, 22,
I-00156 (RM)
4
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), Patologia vegetale,
Alma Mater Studiorum Università di Bologna, Viale Fanin, 42, I-40127 (BO)
5
Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Strada delle Cacce 73, I-10135 (TO)
6
Dipartimento di Biologia Applicata alla Difesa delle Piante, Università di Udine,
1
La ricerca sui fitoplasmi in Italia è particolarmente vivace e attiva sia in campo
nazionale che internazionale. Lo sta a dimostrare, tra l’altro, l’attività convegnistica
specifica in questo ambito che, per quanto riguarda il nostro Paese, vede questo
incontro alla sua IV edizione. A livello internazionale poi, nel novembre del 2007,
si è tenuto a Bologna il primo incontro dell’IPWG (“International Phytoplasmologist
Working Group”) di cui viene data ampia sintesi in questo convegno.
Alcuni fattori propulsivi di questa attività possono essere individuati nella
pressoché costante azione di supporto da parte del MiPAAF, in particolare attraverso
progetti ad hoc. Il primo di questi è stato il Progetto sulla ‘Flavescenza dorata della
vite’, che ha permesso la nascita di un gruppo nazionale il quale, partendo da questa
malattia ha affrontato con successo anche lo studio di altre fitoplasmosi come quelle
dei fruttiferi (P.F. Biotecnologie. Area: I diagnostici. ‘Produzione di diagnostici per la
diagnosi e la caratterizzazione dei fitoplasmi dei fruttiferi’) e, successivamente, della
vite. Questi ultimi studi, grazie al progetto Gia.Vi (‘I giallumi della vite: un problema
limitante le produzioni vitivinicole’), hanno prodotto un notevole incremento delle
conoscenze sia per quanto riguarda la Flavescenza dorata che il Legno nero. Un
ulteriore progetto ministeriale (FITO.RE.MO) che si occupa di scopazzo del melo
ha analizzato il germoplasma di melo di varie provenienze e genotipi per individuare
fonti di resistenza alla malattia.
Notevoli sono stati i progressi nello studio dei patogeni agenti eziologici di
queste malattie, delle loro caratteristiche biologiche e genetiche, dei loro insetti vettori
nonché delle loro piante ospiti alternative.
Qui di seguito vengono brevemente discusse le tematiche di ricerca che
si ritengono al momento più importanti per conoscere e combattere le malattie da
fitoplasmi.
403
Resistenza genetica.
Si deve ammettere che i geni di resistenza all’infezione da fitoplasmi sono
risultati finora poco comuni nelle specie vegetali, in particolare per le colture più
importanti e che, per questo motivo, le ricerche di miglioramento genetico sono al
momento praticamente precluse. E’ pertanto di primaria importanza incrementare la
ricerca di fonti di resistenza in quanto essa potrebbe aprire la possibilità di avviare
studi di genetica volti alla creazione di ibridi e varietà resistenti. Tali studi potrebbero
essere anche orientati a ricercare eventuali casi di “non host resistance”, fenomeno di
notevole interesse già oggetto di studio per altri patogeni (es. Magnaporthe grisea,
agente del brusone del riso).
Inoltre, di particolare interesse sono gli studi che riguardano la resistenza
sistemica acquisita (SAR, “Systemic Acquired Resistance”) con particolare riferimento
al ruolo delle molecole reattive dell’ossigeno. Infatti, studi recenti hanno messo in
evidenza un ruolo importante della SAR come meccanismo coinvolto nel risanamento
spontaneo di piante infette da fitoplasmi (“recovery”).
Simbiosi ed endofitismo
Gli studi sulle comunità batteriche presenti sia negli insetti vettori che nelle
piante coltivate sembrano aprire nuove prospettive di conoscenza sui rapporti fra i
fitoplasmi e altri microorganismi (e di possibilità di lotta innovative). È il caso degli
studi relativi a Scaphoideus titanus e alla presenza di procarioti come il batterioide
‘Candidatus Cardinium hertigii’ e di altre specie, potenziali agenti di biocontrollo
di fitoplasmi. Infine, le recenti acquisizioni sui batteri acetici coltivabili del genere
Asaia in S. titanus gettano le basi per ulteriori sviluppi delle ricerche sul controllo
simbiotico.
Per quanto riguarda le piante, è nota la presenza di comunità endofite batteriche
e fungine e di altri procarioti che sono in grado di sintetizzare una vasta gamma di
sostanze biologicamente attive, molte delle quali hanno dimostrato attività antibatterica
e antifungina contro i patogeni. Ricerche più approfondite in tal senso potrebbero
essere estese dalla vite, per la quale esistono già studi avviati, ad altre specie.
Instabilità dei genomi
L’importanza degli studi di genomica applicata ai fitoplasmi è legata alla
possibilità di disporre di strumenti utili per la loro classificazione, caratterizzazione
e diagnosi, nonché alla necessità di comprendere le interazioni con la pianta ospite e
con il suo vettore. Tali studi hanno messo in evidenza l’estrema plasticità del genoma
di questi microrganismi come documentato dal recente rilevamento di sequenze
denominate PMU (“Potential Mobile Units”) o SVM (“Sequence-Variable Mosaic”)
, facendo supporre che, anche per questi procarioti, esistono probabili meccanismi di
404
ricombinazione, già descritti per altri batteri. Infatti, la caratterizzazione molecolare di
un fitoplasma mette a volte in evidenza una certa variabilità anche in geni conservati,
che raramente risulta correlata a caratteristiche fenologiche. Pertanto le ricerche
a questo proposito dovrebbero basarsi essenzialmente sulla correlazione fra le
caratteristiche genetiche e i tratti della malattia (sintomatologia, epidemiologia ecc).
Procedere in senso inverso, ovvero cercare differenze su base genetica di isolati e
poi investigare per scoprire eventuali differenze biologiche può risultare di minore
o nessun significato. A questo va aggiunta la considerazione che la popolazione
fitoplasmatica, nel tempo, va spesso incontro a selezioni che portano alla comparsa di
varianti molecolari che possono essere prive di importanza sia sotto profilo eziologico
che sotto quello epidemiologico.
Per questo i risultati di ricerche sulle relazioni patogeno-pianta-vettore, vanno
considerati con cautela quando sono basati solo su informazioni genomiche. A tale
scopo lo studio dell’espressione genica (proteomica), è essenziale non solo o non
tanto per la caratterizzazione dei fitoplasmi, ma soprattutto per la comprensione della
loro interazione con l’ospite e quindi della loro capacità epidemica.
Epidemiologia
La variabilità genetica degli insetti vettori può influenzare in modo determinante
l’epidemiologia di una malattia indotta da virus o da fitoplasmi. Nuove conoscenze
in questa materia potrebbero emergere da studi volti a comprendere l’innesco e la
successiva attenuazione di fenomeni epidemici attraverso indagini sulle interazioni
vettore/ patogeno-pianta. Tali studi potrebbero gettare nuova luce sul possibile ruolo
del vettore nella selezione di ‘varianti’ di fitoplasmi che, una volta acquisiti da una
pianta, verranno diffusi in natura a diverse specie vegetali. È ipotizzabile infatti che
la popolazione dell’agente fitopatogeno acquisito subisca fondamentali e profonde
selezioni durante gli adattamenti al biotipo del vettore ed ai suoi vari organi, nel
processo di trasmissione propagativo, e che ciò possa influire sull’evoluzione
dell’epidemiologia, incluso il ruolo della trasmissione transovarica, laddove venga
accertata.
Uno strumento utile per lo studio dell’influenza di diversi fattori (ambientali e
gestionali) sulla diffusione degli insetti vettori in un areale può essere rappresentato
dall’impiego della tecnica delle reti neurali che costituiscono un approccio moderno
di studio scientifico e forniscono ampie possibilità di applicazioni anche in campo
entomologico.
Data la perdurante impossibilità di coltivare i fitoplasmi in coltura axenica
è di notevole importanza approfondire le ricerche su metodologie e protocolli di
inoculazione da utilizzare per la soddisfazione dei postulati di Koch nonché per la
405
sperimentazione a fini terapeutici di principi attivi, di sintesi o naturali. Studi recenti
hanno messo in evidenza l’estrema difficoltà di tali ricerche che tuttavia rivestono
notevole interesse dal momento che tali sostanze potrebbero rappresentare una via di
contenimento dei fitoplasmi affidabile e innovativa.
Parole chiave: Fitoplasmi, Resistenza genetica, Instabilità genomica, Endofitismo,
Controllo simbiotico.
Perspectives on phytoplasma research
The research on phytoplasmas is particularly active in Italy, as shown by the
numerous national and international meetings which have been organized in the last few
years. In November 2007, the first conference of the International Phytoplasmologist
Working Group (IPWG) was held in Bologna, and its main conclusions are widely
summarized in this 4th national meeting of phytoplasmology.
Research focused on phytoplasmas and phytoplasma diseases is consistently
supported by the Italian Ministry for Agriculture, Food and Forest Policies (MiPAAF)
by funding specific ad hoc projects. In detail, a national team of scientists was
involved in the study of phytoplasma-induced diseases, such as Flavescence dorèe
and Bois noir of the grapevine (Grant: ‘Grapevine flavescence dorée’; ‘Grapevine
yellows: a limiting factor for grapevine production’), apple proliferation and European
stone fruit yellows (Grant: ‘Development of biotechnologies for the diagnosis and
characterization of fruit tree phytoplasmas’). Substantial progress has been obtained
in the knowledge of the etiologic agents of such diseases, of their biological and
genetic characteristics, insect vectors, and alternative host plants. Moreover, in the
ministerial project FITO.RE.MO, diverse apple tree genotypes were tested in order
to identify possible resistance sources to the apple proliferation phytoplasma. Here,
the most intriguing perspectives on phytoplasma research are briefly discussed, with
particular attention to the control strategies against the diseases.
Genetic resistance
Nowadays, the knowledge about plant genes inducing phytoplasma resistance
is very scarce, and it limits the chances to select resistant plant hybrids and varieties by
traditional and/or molecular-assisted breading. Therefore, studies on the identification
of natural plant genetic traits for phytoplasma resistance should be increased. Besides,
investigations about non-host resistance, previously reported for other pathogens (eg.
Magnaporthe grisea of rice), and spontaneous recovery from phytoplasma infection,
whose mechanism involves the reactive oxygen molecules activated in the systemic
acquired resistance (SAR) could be fruitful as well.
406
Symbiosis and endophytism
Description of bacterial communities associated with both insect vectors and
host plants seems to open new knowledge about relationships between phytoplasmas
and other microorganisms, and about development of innovative biocontrol strategies.
For example, the consistent association of prokaryotes such as the bacteroide
‘Candidatus Cardinium hertigii’ and the culturable acetic bacteria of the genus Asaia
with the leafhopper Scaphoideus titanus, specific insect vector of Flavescence dorèe
phytoplasmas) suggests the possible use of these microorganisms for the development
of symbiotic control strategy.
Moreover , it is known that bacterial and fungal endophytes associated with
plants are able to synthesize a wide range of molecules acting against a large spectrum
of plant pathogens. Characterization of grapevine-associated microflora is presently
in progress, and it could be extended to other plant species naturally infected by
phytoplasmas.
Genome instability.
Studies on phytoplasma genomics allowed to provide useful tools for (i)
molecular characterization, (ii) specific detection and classification; (iii) research on
phytoplasma-plant and phytoplasma-vector interactions. Recent findings highlighted
the extreme plasticity of the phytoplasma genome, probably caused by the presence
of small multiple-copy sequences, known as PMU (Potential Mobile Units) or SVM
(Sequence-Variable Mosaics), potentially involved in recombination events. Routine
molecular characterization is based on the analysis of highly conserved housekeeping
genes, even if it was shown that heterogeneity in these phytoplasmal sequences is
rarely related to biological properties. Here, it is necessary reinforce the idea that
molecular analyses of phytoplasmas make sense when relationships between genetic
markers and disease traits are demonstrated. First approach to a phytoplasma
disease must be always the observation of the disease in field conditions (symptoms,
alternative hosts, insect vectors), followed by ad hoc molecular analyses. Proceeding
in the opposite direction, i.e. by studying the genetic differences among phytoplasma
strains and then looking for their possible biological differences, might be not
significant. In fact phytoplasma molecular variants deriving from selection processes
inside the phytoplasma populations in specific hosts could lack epidemiological or
phytopatological importance. So, research on plant-pathogen-vector interactions must
be therefore performed not only through genomic approach, but also on the basis of
gene expression studies (proteomics).
407
Epidemiology
Genetic variability of insect vectors may significantly influence the
epidemiology of the diseases caused by viruses or phytoplasmas. Interesting studies
for the interpretation of the epidemiological patterns of phytoplasma diseases could
be carried out in order to elucidate (i) the selection of possible phytoplasma variants
within the insect vector body, and (ii) their successive transmission to plants. It is in
fact reasonable that the adaptations to the vectors and to their diverse organs might
significantly modify the phytoplasma population through outstanding biological
screening. These phenomena might actually influence the pathogen transmission and
the disease epidemiology of the disease(s) it causes; the possible selective role of the
phytoplasma insect-to-insect transovarial transmission must has to be considered.
Focusing on the insect, the technique of neural networks is a useful and
innovative tool for the analysis of the environmental and anthropological impact on
the phytoplasma insect vector spread.
Phytoplasmas are still not cultivable in axenic conditions: the development of
accurate methodologies to artificially inoculate diverse phytoplasma species to their
host plants should be helpful for two different targets: in plant hosts is necessary to
(i) fulfil the Koch’s postulates, and (ii) test the anti-phytoplasmal activity of synthetic
or natural molecules. Recent studies have already highlighted the extreme difficulty
on standardizing the experimental conditions to be adopted for evaluating the antiphytoplasmal activity of these molecules, that that might offer new, innovative
strategies to control phytoplasma diseases .
Key words: Phytoplasmas, Genetic resistance, Genome instability, Endophytism,
Symbiotic control.
408

Atti del “Workshop” - CRA-PAV

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