Rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi
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Rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi
50 anni Rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi: metodologie di laboratorio a confronto Sanja BARIC, Luis LINDNER, Josef DALLA VIA, Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg Negli ultimi anni si è assistito, nei frutteti altoatesini, ad una progressiva diffusione degli scopazzi. Poiché la fitoplasmosi non si è manifestata esclusivamente negli impianti più datati, ma ha colpito anche le piante più giovani, grande è l’incertezza che si è manifestata relativamente al materiale vivaistico. Per questo sono comprensibili le richieste di praticare test massali per la certificazione. Una tale modalità di procedere è però praticabile? G li scopazzi sono stati descritti per la prima volta nel 1950 come una virosi del melo. Oggi sappiamo che la patologia è provocata da un batterio appartenente al gruppo dei fitoplasmi. A livello internazionale diverse centinaia di patologie vengono associate a questo gruppo di batteri. Tutti gli agenti patogeni mostrano alcune caratteristiche comuni, tra le quali l’impossibilità di sopravvivere all’esterno della cellula dell’ospite e di essere coltivati su substrati artificiali. Di conseguenza la loro rilevazione strumentale può essere praticata esclusivamente all’interno del tessuto vegetale o dell’insetto vettore, il che rappresenta un grave ostacolo per lo studio delle fitoplasmosi. PRELIEVO DEI CAMPIONI Per una corretta rilevazione strumentale del patogeno agente degli scopazzi, la fase del prelievo dei campioni è di pari importanza ri128 spetto alla scelta del più adeguato metodo di test. La distribuzione del fitoplasma nel tronco e nei rami è spesso irregolare e la probabilità di reperirlo non dipende soltanto dal periodo dell’anno, ma anche dal caso. Può così accadere che in rami o foglie prelevate da una pianta infetta e sintomatica non si rilevi la presenza di fitoplasmi (nemmeno con le metodologie più sofisticate e sensibili) soltanto perché si sono scelte foglie o rami senza patogeno. Per contro, il patogeno è regolarmente presente nell’apparato radicale, dove può essere reperito durante tutto l’arco dell’anno sia su piante sintomatiche che su piante con un’infezione latente. Una “lacuna diagnostica” (= spazio temporale durante il quale l’agente non può essere diagnosticato) si presenta immediatamente dopo l’infezione e perdura fino a che il patogeno non ha colonizzato l’apparato radicale. Nonostante il prelievo di radici sia oggettivamente più impe- gnativo rispetto a quello di getti o foglie, questa strategia appare giustificata e necessaria a motivo della maggiore affidabilità degli esiti delle analisi. METODOLOGIE MICROSCOPICHE La prima scoperta dei fitoplasmi avvenne, nel 1967, da parte di un gruppo di ricerca giapponese che utilizzò il microscopio elettronico. A causa della loro somiglianza con altri batteri privi di parete cellulare, noti patogeni dell’uomo e degli animali, vennero definiti, fino al 1994, come MLO (mycoplasma-like organisms). La microscopia elettronica consentì in seguito di ottenere importanti informazioni sulla natura e sullo spettro delle piante ospiti di questi organismi. A motivo però degli elevatissimi costi delle apparecchiature necessarie e del considere- 4/2007 vole impegno lavorativo per la preparazione delle sezioni ultrasottili dei campioni, questa tecnica non è mai stata proposta per la diagnostica di routine. Negli anni ‘70 venne infine adottato il metodo DAPI, che consentì la rilevazione strumentale dei fitopla- Inoltre i diversi ceppi o le differenti specie di fitoplasmi non possono essere identificati né differenziati tra loro. Ciò risulta di fondamentale importanza quando una specie vegetale può essere infettata da diversi fitoplasmi con differente epidemiologia (come per la vite, che può essere colpita dal legno nero e dalla flavescenza dorata). Anche se il problema della specificità può essere risolto con l’immunofluorescenza, per questo metodo rimangono tutti gli altri svantaggi già descritti per il metodo DAPI. METODOLOGIE BASATE SULL’ANALISI DEL DNA Le metodologie che si fondano sull’analisi del DNA si basano sull’unicità del materiale ereditario proprio di ciascun organismo vivente. Come l’impronta digitale viene impiegata per l’identificazione di persone, è possibile sfruttare le informazioni contenute nel materiale ereditario come “impronta genetica” per l’identificazione ed il riconoscimento dei diversi organismi (anche patogeni!). In particolare, lo sviluppo della cosiddetta “reazione a catena della polimerasi” (PCR), con la quale si riproduce un determinato segmento di DNA (ed indirettamente lo si può rendere identificabile/visibile; vedi Frutta e Vite 6/2003, pag. 169), condusse, negli anni ‘90, ad un enorme passo in avanti nella ricerca relativa ai fitoplasmi. Solamente grazie all’impiego delle metodologie basate sull’utilizzo del DNA o sulla PCR divenne possibile verificare le relazioni esistenti tra determinate specie di fitoplasmi, le loro piante ospiti e gli insetti vettori, oltre che stabilire la loro molteplicità genetica ed i rapporti di parentela. A motivo della precisione e della loro elevatissima sensibilità strumentale i metodi basati sulla PCR entrarono a pieno titolo nei laboratori diagnostici. Negli ultimi anni, presso il Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg, è stato sviluppato, per la rilevazione strumentale specifica dei fitoplasmi agenti patogeni degli sco- L Ripresa vegetativa anticipata. smi con il microscopio ottico. Questo metodo si basa sulla colorazione di sezioni microscopiche di tessuto vegetale con 4,6-DiamidinoPhenylindol (abbreviato: DAPI), che si lega specificamente al DNA. In presenza di un’infezione è possibile riconoscere, alla luce di un microscopio, caratteristiche particelle fluorescenti nelle cellule cribrose. L’impiego di questa metodologia richiede però un occhio particolarmente allenato, poiché il colorante non agisce soltanto sul materiale genetico del fitoplasma, bensì anche su quello della pianta (il DNA si trova, oltre che nel nucleo, anche nei cloroplasti e nei mitocondri!), ed in tal modo è facile confondere quanto si vede. L’ausilio del microscopio permette una corretta rilevazione strumentale solo quando la densità dei patogeni è sufficientemente elevata. A causa dell’irregolare distribuzione dei fitoplasmi nei tessuti vegetali, è necessario preparare e controllare un gran numero di sezioni per campione, ottenendo così solo una ridotta portata analitica. 129 50 anni L pazzi, un nuovo procedimento che si fonda sulla real-time PCR (vedi Frutta e Vite 2/2005, pagg. 15-16). Tale metodo di analisi risulta, al confronto con quello tradizionale di PCR, il più sensibile e preciso. Sebbene i costi dei reagenti impiegati siano più elevati, essi vengono compensati dal ridotto impegno lavorativo richiesto per la conduzione dell’analisi (vedi grafico). Indipendentemente da quale metodologia PCR si decida di seguire, uno dei passi più impegnativi rimane comunque l’estrazione del DNA. Come già detto, per la rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi si utilizzano campioni prelevati dall’apparato radicale, generalmente tre per pianta, dello spessore di una matita e della lunghezza di circa 10 cm. In laboratorio si procede alla loro accurata pulizia, e alla preparazione del tessuto floematico (tubi cribrosi), al quale si limita la presenza del patogeno. Tale passo è necessario, in quanto consente di aumentare la quantità di DNA del patogeno rispetto a quello della pianta e di incrementare la probabilità d’identificazione. Tra la preparazione di un campione e quella del successivo è assolutamente necessario pulire accuratamente e sterilizzare tutta la strumentazione utilizzata per evitarne la contaminazione. Il tessuto così preparato viene poi sminuzzato con un omogenizzatore. Una serie di successive operazioni permettono l’isolamento del DNA. A causa dell’impegnativa preparazione descritta presso il laboratorio di biologia molecolare del Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg è possibile l’estrazione del DNA di 15 doppi campionamenti durante una giornata lavorativa. Tenuto conto di 200 giorni lavorativi in un anno è possibile dunque ottenere 3000 isolati di DNA - senza aver condotto alcuna analisi PCR! Appare quindi evidente che a causa dell’elevato impegno per l’estrazione nessuna metodologia basata sul DNA è adatta ad effettuare test di massa diagnostici per gli agenti degli scopazzi. 130 METODOLOGIE SIEROLOGICHE - ELISA l’estrazione del DNA real-time PCR incubazione con anticorpo 1 lavaggio analisi dei dati incubazione con anticorpo 2 lavaggio incubazione su substrato analisi dei dati Confronto tra i procedimenti, rispettivamente, della metodologia real-time PCR (a sinistra) ed ELISA (a destra) per la rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi. Per effettuare entrambe le analisi è necessario predisporre il prelievo di campioni radicali (A) e la preparazione del tessuto floematico (B). Quest’ultimo viene omogeneizzato (C) e da esso, per la real-time PCR, si isola il materiale genetico - DNA (riquadro rosso). Per il test ELISA, invece, è possibile utilizzare direttamente l’estratto vegetale, sebbene il suo impiego (riquadro giallo) richieda un maggior impegno rispetto a quanto avviene per la real-time PCR. La sensibilità strumentale del test ELISA risulta almeno 100 volte inferiore rispetto a quella della real-time PCR. Di frequente il test ELISA viene nominato in alternativa alle metodologie basate sul DNA per la rilevazione strumentale degli agenti causali degli scopazzi. Il termine ELISA deriva dall’inglese Enzyme-Linked Immunosorbent Assay e si fonda sul riconoscimento di proteine che appartengono al patogeno attraverso specifici anticorpi - analogamente a quanto avviene durante una reazione immunologica del nostro sistema di difesa. Un argomento spesso associato al test ELISA è “l’utilizzo semplice e conveniente” di questo procedimento. La sua convenienza economica può in questa occasione essere senza dubbio confermata sebbene solo in relazione ai reagenti. L’impegno lavorativo che esso richiede per la preparazione dei campioni (estrazione) è però soltanto leggermente inferiore a quello della PCR, poiché anche per il test ELISA si necessita del tessuto floematico radicale per poter avere la possibilità di individuare un’infezione latente. Rispetto al procedimento di preparazione presentato nel paragrafo precedente, per il test ELISA non viene effettuata solo l’estrazione del DNA dal tessuto vegetale sminuzzato - il rimanente procedimento rimane invariato (vedi grafico). A ciò si deve aggiungere il fatto che l’analisi vera e propria è costituita da diversi passaggi e richiede per lo meno il doppio del tempo richiesto dal procedimento a passaggio unico della real-time PCR (vedi grafico, riquadro giallo). Un ulteriore e particolarmente gravoso svantaggio per una metodologia diagnostica è rappresentato dalla ridotta sensibilità strumentale: un confronto diretto tra un metodo PCR ed un metodo ELISA per la rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi eseguito anche dai collaboratori dell’Università di Udine (Brzin et al. 2003, Journal of Plant Diseases and Protection 110, 476-483), ha mostrato una sensibilità del test ELISA di ben 100 volte inferiore. A causa di ciò, in al- 4/2007 cune piante colpite da infezione latente, la presenza dei fitoplasmi è stata disconosciuta ed è stato fornito un esito erroneamente negativo. Sulla base di queste esperienze, presso il Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg è stato osservato che, in alcuni casi, nonostante evidenti manifestazioni sintomatiche, il test ELISA non ha consentito la rilevazione del patogeno (vedi Frutta e Vite 6/2003, pagg. 172173). Per questo è opportuno dubitare, in generale, degli esiti negativi forniti dal test ELISA. Gli autori dell’articolo sopra citato propongono quindi di sottoporre ad analisi PCR (più sensibile) le piante per le quali l’esito del test ELISA risulta dubbio o negativo. Questo significherebbe un raddoppio dell’impegno lavorativo e finanziario per l’analisi nel controllo del materiale di moltiplicazione e vivaistico. Per evitare questi inutili costi sarebbe opportuno, sin dall’inizio, seguire una metodologia analitica affidabile, rappresentata attualmente dalla real-time PCR sviluppata presso il Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg. CONCLUSIONI Attualmente non disponiamo di metodologie analitiche per l’esecuzione di test di massa per la rilevazione strumentale dei patogeni agenti degli scopazzi. Tale situazione è da addebitare soprattutto all’elevato impegno lavorativo che esse richiedono per la preparazione dei campioni e ai loro gravosi costi. Oggigiorno, con una produzione annua di 6 milioni di astoni, il materiale vivaistico altoatesino può essere sottoposto ad analisi solo a campione ed in occasione di piante sospette. Con il metodo della realtime PCR, a nostra disposizione, è comunque possibile garantire lo stato di salute del materiale di premoltiplicazione, operazione che viene effettuata presso il Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg (vedi Frutta e Vite 2/2006, pagg. 41-42). Fiere AGRIALP 2007 20ª Fiera Agricola dell’Arco Alpino Bolzano, 9 – 12 novembre 2007 Nel quartiere fieristico di Bolzano fervono i preparativi per “Agrialp”, 20ª Fiera Agricola dell‘Arco Alpino. La rassegna, ampia vetrina per tutti coloro che operano nel settore dell‘agricoltura, avrà luogo dal 9 al 12 novembre 2007. Saranno in mostra prodotti e novità del settore. In Alto Adige sono presenti oltre 27.000 aziende agricole e forestali nelle quali lavorano circa 24.500 persone. La superficie agricola utile si estende su 272.456 ettari, ossia sul 37% dell‘intero territorio altoatesino. Questi dati sono eloquenti e sottolineano l‘importanza che l‘agricoltura riveste, fin dai tempi antichi, nella nostra provincia. La prima Fiera Agricola dell‘Arco Alpino si tenne a Bolzano nel 1971; il prossimo novembre gli organizzatori festeggeranno la ventesima edizione. Nel nutrito ed articolato programma di iniziative che farà da cornice anche alla 20ª Fiera Agricola del- l’Arco Alpino figura il congresso “Conto alla rovescia per Interpoma 2008”. L’evento verterà sul tema della mela e sarà organizzato in collaborazione con la casa editrice “Il Sole 24 ore – Edagricole”. Sul palco eventi di “Agrialp” l’Unione Agricol- tori e Coltivatori Diretti Sudtirolesi (Bauernbund) terrà numerose manifestazioni e tavole rotonde. “Agrialp” resterà aperta tutti i giorni dalle ore 8.30 alle 18.00. Ulteriori informazioni alla pagina www.agrialp.com