Quantitative phenotyping of bone fracture repair - ETH E

Diss. ETH No. 23623
Quantitative phenotyping of bone
fracture repair
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Michele Aquilino Leonida Casanova
MSc. Mech. Eng. ETH
born on 11.01.1986
Citizen of Ligornetto, TI, Switzerland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ralph Müller, examiner
Prof. Dr. David Little, co-examiner
Prof. Dr. Philipp Schneider, co-examiner
2016
Summary
Summary
Fracture repair is a complex process that involves the interaction of numerous
molecular factors, cell lineages and tissue types. These biological processes allow
for an impressive feat of engineering: an elastic soft callus is progressively replaced
by a rigid and mineralized callus. However, during this reparative phase, the
healing bone is exposed to the risk of refracture. Bone volume and bone quality
are the two major factors determining the strength of the callus. Although both
factors are important, often only bone volume is analysed and reported in
preclinical studies.
In recent years consolidation of the importance of bone quality led researchers
to experiment emerging techniques for the assessment of fracture repair. Tools
such as Raman spectroscopy, nanoindentation, scanning acoustic microscopy, in
vivo micro-computed tomography (micro-CT), and high-resolution (HR) micro-CT
have the potential to be adopted as new powerful instruments for these
evaluations.
The aim of this doctoral thesis was to develop or adapt methods for a
quantitative evaluation of the fracture callus. We also wanted to apply these
techniques to a preclinical study on the effect of a combined treatment with
zoledronic acid and parathyroid hormone on fracture repair to demonstrate the
relevance of a quantitative phenotyping. The thesis was divided into three main
aims: (i) Development of new methods for the quantitative phenotyping of bone
fracture repair, (ii) Investigation of changes in bone callus microstructure and local
material properties during fracture repair (iii) Investigation of interplay between
anti-catabolic and anabolic treatment during fracture repair.
In a first step, tools for the quantitative phenotyping of bone fracture repair
were developed or adapted. Moreover, sample preparation protocols allowing for
the employment of these tools were established from scratch or adapted from
information found in the literature. Techniques considered included HR micro-CT,
deconvolution microscopy (DV microscopy), Raman spectroscopy,
nanoindentation, and immunohistochemistry. To quantify callus microstructure,
HR micro-CT was adopted. We then combined existing and novel in-house
developed image processing methods for computing established predictors of the
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resistance to refracture. For the quantification of the lacuno-canalicular network in
the callus, DV microscopy and HR micro-CT were concurrently performed. For the
assessment of local material properties of the bone callus, Raman spectral
acquisitions were obtained from the healing bone. Tools for the post-processing of
these spectral acquisitions were then developed. We also investigated
microstructural properties of bone through nanoindentation, although we did not
experiment directly on the healing bone tissue. Moreover, we evaluated the
sensitivity of nanoindentation and Raman spectroscopy indirectly in two
methodological studies which led to the conception of two manuscripts.
In order to address the second aim, bone callus microstructure during fracture
repair was compared to native intact bone, focusing on the development of the
lacuno-canalicular network (LCN). This network has been found to be fundamental
for bone callus quality and the tools we developed could provide for the first time
quantitative data during fracture repair. We adopted a model of closed fracture of
the right femur in mice which was established at the Orthopedic Research &
Biotechnology Unit at The Children’s Hospital at Westmead, Australia. We divided
the mice in three groups. The first group was in an early stage of fracture repair,
where the callus is mostly cartilaginous and the LCN is starting to be formed. The
second group showed a consolidated callus which was mostly mineralized and
around its peak in total volume. The third group was in a final stage of bone
fracture repair, and the callus was remodelling towards the original bone shape. We
then investigated microarchitectural parameters and the LCN with HR micro-CT,
and DV microscopy, analysing the invariant and variant features by comparison.
Mean lacuna volume was 501 µm3 at two weeks after fracture and decreased to 366
µm3 at three weeks and to 312 µm3 at six weeks after fracture. Canalicular density
was found to be 0.08 canaliculi/µm2 at two weeks after fracture, increasing to 0.10
canaliculi/µm2 at three weeks and to 0.15 canaliculi/µm2 at six weeks. Intact bone
had a mean lacuna volume of 304 µm3, which was not significantly different from
the mean lacuna volume at six weeks after fracture; on the other hand, canalicular
density in the intact tibiae was significantly higher than each of the three groups
(0.18 canaliculi/µm2). This might reflect the fact that the bone in the callus is already
highly remodelled, but the higher bone volume of the callus compared to intact
bone allows for lower strains per bone volume; and it was already observed that
lower strains can be associated to reduced canalicular density. Moreover, we
observed a lacunar enlargement in the necrotic cortical bone in the bone callus, with
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significant larger mean lacuna volume compared to intact bone at two weeks (+20%;
p<0.05) and three weeks after fracture (+27%; p<0.001). We believe that this
mineral dissolution in the perilacunar region is happening to rapidly respond to the
calcium need induced by the repairing process.
To investigate the interplay between anti-catabolic and anabolic treatment during
fracture repair, a dual treatment of zoledronic acid and parathyroid hormone (1-34)
was implemented in a mouse model of closed tibial fracture. A considerable
amount of research has been undertaken to understand how fracture repair might
be altered by the effects of zoledronic acid (ZA). While initial union may not be
impaired, remodelling is generally delayed by BPs, whereby the reasons for this
remain unclear. Parathyroid hormone (PTH) has been shown to accelerate fracture
repair in osteoporotic patients and it is currently the only osteoporosis treatment
for which a randomized controlled trial in fracture repair has been completed. For
investigating their interplay, we assessed treated (PTH, ZA or a combination of
both) and non-treated (vehicle) mouse bone calluses using micro-CT, HR microCT, Raman spectroscopy, DV microscopy, and quantitative histomorphometry.
The mouse model adopted was the same described in the previous paragraph. We
showed that a treatment of PTH combined to ZA improved both bone mass and
microarchitecture measures. Combined treatment showed an increase of 41% in
bone volume fraction and of 91% in trabecular number compared to vehicle. At a
material level, Raman measures did not differ between groups in the callus, which
we interpret as a sign that treatments did not negatively alter bone composition. At
a lacunar level, we observed that combined treatment did not significantly alter
lacunar number density nor mean lacuna volume compared to vehicle.
In conclusion, with the tools developed on this thesis it was possible to
quantitatively assess bone callus quality parameters such as lacunar parameters,
canalicular density, and material properties. These developments have the
potential to be extensively adopted in preclinical studies investigating the effect of
new treatments on the strength of the healing bone. We are confident that a
deeper understanding of their effect will lead to a better design of subsequent
clinical studies.
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Sommario
Sommario
Il processo di frattura ossea è complesso e implica l’interazione di molti processi
molecolari, tipologie cellulari e tessuti. Questi processi biologici permettono un
incredibile sviluppo nella struttura meccanica della regione affetta: una massa
altamente elastica composta di vari tessuti (callo osseo) viene progressivamente
sostituito da una struttura rigida e mineralizzata. Durante questo processo riparativo,
il callo è soggetto al rischio di rifrattura. La volumetria ossea e la qualità ossea sono
due dei fattori determinanti della resistenza del callo alla rifrattura. Nonostante
entrambi i fattori siano importanti, spesso solo il volume osseo è analizzato e
pubblicato in studi preclinici.
Negli ultimi anni la crescente importanza data alla qualità ossea ha portato i
ricercatori a sperimentare nuove tecniche per valutare la resistenza del callo. La
spettroscopia Raman, la nanoindentazione, la microscopia a scansione acustica, la
microtomografia in vivo e la microtomografia ad alta risoluzione hanno il potenziale
per essere adottate come nuove tecniche per la valutazione del callo osseo.
Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato lo sviluppo e la validazione di metodi
per comprendere e valutare il callo osseo. Volevamo inoltre applicare queste
tecniche in uno studio preclinico sull’effetto di una terapia combinata di acido
zoledronico e ormone paratiroideo sulla riparazione della frattura ossea per
dimostrare l’importanza di uno studio svolto sugli stessi campioni integrante
differenti fattori di qualità ossea per valutare la probabilità di rifrattura. La tesi è
stata divisa in tre obiettivi principali: (i) Lo sviluppo di un nuovo metodo per la
caratterizzazione del callo osseo, (ii) Lo studio dei cambiamenti nella microstruttura
e nelle proprietà dei materiali nel callo osseo e (iii) Lo studio dell’effetto di un
trattamento combinato con medicamenti anti-catabolici e anabolici durante la
frattura ossea.
In una prima parte, strumenti per la valutazione quantitativa del callo osseo
dovevano essere sviluppati o adattati. La preparazione di protocolli per permettere
una valutazione quantitativa della struttura del callo e le sue proprietà materiali sono
state adattate da procedure trovate nella letteratura o sviluppate da zero. Le tecniche
considerate includono la spettroscopia Raman, la nanoindentazione, la
microtomografia ad alta risoluzione, la microscopia deconvoluzionale, e
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Sommario
l’immunoistochimica. Per la quantificazione della microstruttura del callo, sono state
utilizzate la microtomografia ad alta risoluzione congiunta alla microscopia
deconvoluzionale. Per la quantificazione delle proprietà locali del materiale abbiamo
utilizzato la spettroscopia Raman. Inoltre, sono stati sviluppati strumenti per
l’elaborazione delle acquisizioni spettroscopiche. Abbiamo anche studiato le
proprietà microstrutturali dell’osso tramite nanoindentazione, anche se non la
abbiamo sperimentata direttamente sul callo osseo. Abbiamo pure condotto uno
studio per valutare indirettamente la sensitività della nanoindentazione e della
spettroscopia Raman in due studi metodologici che hanno portato alla produzione
di due manoscritti.
Per compiere il secondo obiettivo, la microstruttura del callo osseo durante il
processo riparativo è stata comparata all’osso integro, focalizzandosi sullo sviluppo
della rete lacuno-canalicolare. Questa rete è stata infatti dimostrata essere
fondamentale per il buon esito della riparazione ossea e gli strumenti da noi
sviluppati permettono per la prima volta un’analisi quantitativa durante la
riparazione ossea. Abbiamo utilizzato per questi esperimenti un modello della
frattura femorale nella tibia destra del topo, il quale è stato sviluppato dall’Orthopaedic
Research & Biotechnology Unit at The Children’s Hospital at Westmead in Australia.
Abbiamo diviso I topi in tre gruppi. Il primo gruppo era in una fase iniziale di
riparatura della frattura, nella quale il callo è prevalentemente cartilagineo e la rete
lacuno-canalicolare sta iniziando a essere formata. Il secondo gruppo mostrava un
callo consolidato e prevalentemente mineralizzato. Il terzo gruppo infine era in una
fase finale della riparazione della frattura ossea, nella quale il callo è rimodellato
verso la forma precedente alla frattura. Abbiamo studiato i parametri micro
architetturali e la rete lacuno-canalicolare per mezzo delle microtomografia ad alta
risoluzione e della microscopia deconvoluzionale. Abbiamo quindi analizzato gli
elementi variabili e invariabili comparandoli tra loro. Il volume medio delle lacune
era di 501 µm3 a due settimane dopo la frattura. A tre settimane dopo la frattura il
volume medio delle lacune era di 366 µm3 e dopo tre settimane era di 312 µm3. La
densità canalicolare dopo due settimane era di 0.082 canalicoli/µm2 ed era
aumentata a 0.10 canalicoli/µm2 a tre settimane, mentre a sei settimane era di 0.151
canalicoli/µm2. L’osso intatto aveva invece un volume lacunare di 304 µm3, il quale
non era significativamente diverso dal volume lacunare a sei settimane. Al contrario,
la densità canalicolare era significativamente più alta (0.18 canalicoli/µm2). Questo
può potenzialmente mostrare che l’osso nel callo è già altamente rimodellato, ma la
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grande quantità di osso presente nel callo comparato all’osso integro permette di
una ridotta tensione per volume osseo ed è già stato osservato che una riduzione
della tensione è associata con una ridotta espressione canalicolare. Inoltre, abbiamo
osservato un ingrandimento delle lacune nell’osso corticale necrotico presente nel
callo con un aumento significativo del 20% due settimane dopo la frattura e del 34%
tre settimane dopo la frattura. Pensiamo che quest’aumento nella dimensione delle
lacune sia dovuto alla dissoluzione di minerali nella regione perilacunare e che
questo processo serva per rispondere all’immediato bisogno di calcio causato dalla
crescita del callo osseo.
Per comprendere l’interazione tra medicamenti anti-catabolici e anabolici durante
la frattura ossea, un trattamento combinato di acido zoledronico e ormone
paratiroideo (1-34) è stato utilizzato lo stesso modello di frattura ossea menzionato
prima. Una considerevole quantità di studi è stata svolta per capire come la frattura
ossea possa essere alterata dall’effetto dell’acido zoledronico. Anche se all’inizio la
riparazione della frattura ossea possa non essere impedita, la fase di rimodellamento
è generalmente rallentata dai bisfosfonati e le ragioni rimangono poco chiare.
L’ormone paratiroideo è stato mostrato capace di accelerare la riparazione della
frattura ossea in pazienti osteoporotici, ed è attualmente l’unico trattamento per il
quale uno studio clinico sulla frattura ossea è stato completato. Per studiare la loro
interazione, abbiamo studiato gruppi di topi ai quali era stata fratturata la tibia e poi
sottoposti a trattamento (ormone paratiroideo, acido zoledronico o una
combinazione di entrambi) e non trattati (veicolo). Il modello di frattura ossea
utilizzato era identico a quello mostrato nel paragrafo precedente. Abbiamo quindi
utilizzato la microtomografia ad alta risoluzione, la spettroscopia Raman, la
microscopia deconvoluzionale e l’immunoistochimica. Abbiamo in seguito mostrato
che il trattamento combinato di ormone paratiroideo con acido zoledronico ha
mostrato un miglioramento nelle misure di massa ossea e di microstruttura
comparato al trattamento salino. Il trattamento combinato ha mostrato un aumento
del 41% nella frazione ossea e del 91% nel numero di trabecole comparato al
trattamento salino. Al livello delle proprietà del materiale, nessuna differenza tra i
differenti gruppi è stata individuata. Interpretiamo il risultato come segno che I
trattamenti non hanno influenzato negativamente la composizione ossea. A livello
lacunare, abbiamo osservato che i trattamenti non hanno alterato né la densità
lacunare, né il volume lacunare.
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In conclusione, con gli strumenti sviluppati in questa tesi è stato possibile
determinare in maniera quantitativa i parametri della qualità del callo osseo e altri
importanti fattori, come i parametri lacunari, la densità canalicolare e le proprietà del
materiale. Questi sviluppi hanno il potenziale di essere estensivamente adottati in
studi preclinici sullo studio degli effetti di nuovi trattamenti sulla resistenza alla
rifrattura. Siamo fiduciosi che una più profonda comprensione sui loro effetti
porterà a una migliore pianificazione dei successivi studi clinici.
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