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Progetto
Monitoraggio dell’accumulo di composti chimici nel biota delle acque marinocostiere e di transizione della Regione Puglia.
Obiettivi del progetto
Il progetto si propone il monitoraggio della qualità delle acque marino-costiere e di transizione
della Regione Puglia mediante l’utilizzo di organismi marini filtratori. In particolare, in 42 stazioni
(Figura 1 e Tabella 1) sarà effettuata un’indagine per verificare la presenza di allevamenti e/o
banchi naturali di mitili. Per un set ridotto di stazioni (n° 12), considerate indicative per ognuno
dei siti di produzione designati dalla Regione Puglia con DGR 785/99, il prelievo e l’analisi sono
state effettuate essere effettuate nel secondo semestre del 2008.
Figura 1 - Ubicazione delle stazioni di campionamento.
Tabella 1 - Elenco stazioni di campionamento (in giallo le stazioni campionate entro il
secondo semestre 2008 ed in verde le stazioni da campionare anche nel periodo maggio-luglio
2009).
codice
Ambito geografico
cartografico
delle stazioni
delle stazioni
Coordinate
Siti di campionamento
Gauss-Boaga
x
2561205.582
y
4662918.707
2
0
15
29
53
99
a 500 m dalla riva
2531531,03
4642234,54
41 55 54
91
15
8
20
25
Foce Fiume Fortore
a 500 m dalla riva
2544389,11
4641555,12
41 55 31
84
15
17
38
48
P.ta Pietre Nere (foce Acquarotta)
a 500 m dalla riva
2548246,94
4641080,72
41 55 16
0
15
20
25
90
Foce Schiapparo
a 500 m dalla riva
2562173,28
4640361,50
41 54 50
45
15
30
30
31
MC 5A
Foce di Capoiale
a 500 m dalla riva
2575298,67
4641698,58
41 55 30
89
15
40
0
51
MC 6A
Foce di Varano
a 500 m dalla riva
2585807,15
4641698,58
41 55 27
99
15
47
36
73
MC 7A
Molino di Mare
a 500 m dalla riva
2595973,70
4643176,24
41 56 12
61
15
54
58
77
MC 11A
Mattinata
a 200 m dalla riva
2609002,83
4616432,70
41 41 40
72
16
4
10
4
MC 12A
Manfredonia
a 500 m dalla riva
2596351,11
4607980,94
41 37 11
42
15
54
58
89
MC 1TR
Tremiti
a 200 m dalla riva
MC 1A
Foce T.te Saccione
MC 2A
MC 3A
MC 4A
g°
Geografiche WGS84
Lat. N
Long. E
m' s'' dec. g° m' s'' dec.
42
7
MC 13A
Foce T.te Candelaro
a 500 m dalla riva
10
15
53
59
49
a 500 m dalla riva
4604070.539
4597717,63
5
Foce T.te Cervaro
2595017.258
2596237,78
41 35
MC 14A
41 31 38
71
15
54
49
30
MC 15A
Foce T.te Carapelle
a 500 m dalla riva
2597760,28
4594239,04
41 29 45
40
15
55
53
38
MC 16A
Saline (Foce Carmosina)
a 500 m dalla riva
2609501,75
4585399,68
41 24 54
41
16
4
15
0
MC 17A
Foce Fiume Ofanto
a 500 m dalla riva
40
16
12
17
19
Barletta Est
a 500 m dalla riva
4580056.45
4577455,03
41 21 56
MC 18A
2620772.23
2624176,34
41 20 30
50
16
14
42
8
MC 24A
Bari est (Il Trullo)
a 500 m dalla riva
50
16
56
9
69
Torre Canne
a 500 m dalla riva
4553009.398
4523884,15
41
MC 30A
2682560.252
2728485,66
40 50 22
13
17
28
21
98
MC 34A
Brindisi (Capo Bianco)
a 500 m dalla riva
2774119.41
4504226.403
40 38 59
20
18
0
19
49
6 43
MC 48A
Porto Cesareo
a 200 m dalla riva
17
53
39
79
a 500 m dalla riva
4459214.793
4463731,16
90
Torre Colimena
2766196.085
2752855,20
40 14 49
MC 49A
40 17 29
93
17
44
21
68
MC 50A
Campomarino
a 200 m dalla riva
2737771,92
4463759,39
40 17 45
46
17
33
43
53
MC 55A
Foce F. Patemisco
a 500 m dalla riva
2698173,34
4487454,17
40 31
7
16
17
6
11
36
MC 57A
Foce F. Lato
a 500 m dalla riva
30
16
59
43
49
Marina di Ginosa
a 100 m dalla riva
4484008.488
4476595,71
40 29 22
MC 58A
2689118.832
2680502,47
40 25 28
16
16
53
30
94
AT 7
Lago di Varano
Incile Foce Capoiale
2576924,46
4638990,84
41 54
2
68
15
41
10
15
AT 9
Lago di Varano
Bocca del Terzagno
2586127,43
4639520,81
41 54 17
29
15
47
49
76
AT 10
Lago di Varano
S. Nicola di Varano
2579666,84
4637081,27
41 53
0
4
15
43
8
48
AT 11
Lago di Varano
Loc. Bagno
2583216,80
4634061,28
41 51 21
14
15
45
41
34
AT 1
Laguna di Lesina
Incile C.le Acquarotta
2548718,29
4637257,93
41 53 11
99
15
20
45
70
AT 2
Laguna di Lesina
Lesina
2550039,01
4635297,88
41 52
8
26
15
21
42
65
AT 4
Laguna di Lesina
Foce Zanella
2559872,89
4636240,05
41 52 37
25
15
28
49
46
AT 5
Laguna di Lesina
Incile C.le Schiapparo
2564558,50
4638999,26
41 54
5
81
15
32
13
48
AT 14
Laghi Alimini
c/o foce Alimini Grande
2813730,73
4455927,15
40 12
8
36
18
27
3
8
AT 15
Laghi Alimini
Idrovora Alimini Piccolo
2813549,54
4453571,66
40 10 52
33
18
26
51
56
VM 60A
Parco allev. Mitili (Capoiale)
a 3000 m dalla riva
2575919,18
4643625,12
41 56 33
20
15
40
28
11
VM 61D
Impianto mollusc. (Manfredonia)
a 3500 m dalla riva
2597982,59
4601434,44
41 33 38
61
15
56
6
32
VM 69A
Mar Grande (Loc. Sabbione)
a 500 m dalla riva
2708886,58
4477674,71
40 25 41
70
17
13
35
84
VM 70A
Mar Grande (Loc. Tarantola)
a 500 m dalla riva
2710139,95
4478561,93
40 26
9
43
17
14
29
95
VM 71A
Mar Piccolo (I seno - Loc. Galeso)
a 500 m dalla riva
2710897,79
4485381,56
40 29 49
81
17
15
9
47
VM 72A
Mar Piccolo (II Seno - Loc. Cimini)
a 500 m dalla riva
2715292,10
4482898,67
40 28 25
68
17
18
13
26
VM 73A
Mar Piccolo (II Seno - Loc. Battentieri)
a 500 m dalla riva
2716040,91
4485322,44
40 29 43
59
17
18
47
73
Composizione dell’Unità Operativa
Per il CNR-IAMC: Dr. Nicola Cardellicchio, Dr.ssa Antonella Di Leo, Dr.ssa Santina
Giandomenico, Dr.ssa Lucia Spada, Sig.ra C. Annicchiarico.
Per Arpa Puglia: Dr. Massimo Blonda, Dr. Vito Perrino, Dr. Nicola Ungaro, Dott.ssa Anna
Maria Pastorelli, Sig.ra Rosanna Zingaro.
Indagini e campionamenti
I campionamenti degli organismi sono iniziati nel giugno 2008 dopo alcune indagini preliminari
rivolte ad accertare la presenza dei molluschi nelle stazioni da monitorare. L’attenzione è stata
rivolta prioritariamente alle 12 stazioni indicate in giallo nella tabella 1. Qui di seguito è riportato
l’elenco dei campionamenti effettuati.
ELENCO DEI CAMPIONI PRELEVATI ED ANALIZZATI
VM71A (Mar Piccolo, I Seno, loc. Galeso): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati
prelevati il giorno 16/06/2008 mediante il mezzo nautico “Cerruti” del CNR di Taranto presso
allevamento di molluschi.
VM72A (Mar Piccolo, II Seno, loc. Cimino): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati
prelevati il giorno 16/06/2008 mediante il mezzo nautico “Cerruti” del CNR di Taranto presso
allevamento di molluschi.
VM70A (Mar Grande, loc. Tarantola): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati
il giorno 19/06/2008 presso un impianto di molluschicoltura.
AT14 (presso foce Alimini Grande): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il
giorno 23/06/2008 presso un impianto di allevamento ittico alla foce di Alimini Grande.
AT9 (Lago Varano, bocca del Terzagno): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati
prelevati il giorno 24/06/2008 presso allevamento di molluschi.
VM60A (Parco allevamento mitili Capoiale): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati
prelevati il giorno 24/06/2008 presso l’impianto di allevamento a mare di Capoiale.
MC2A (Foce fiume Fortore): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno
01/07/2008 presso la foce del fiume.
MC17A (Foce fiume Ofanto): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno
02/07/2008 presso la foce del fiume.
MC11A (Mattinata): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno
03/07/2008 nei pressi dell’impianto di allevamento ittico (Maricoltura Mattinatese) con mezzo
nautico fornito dalla società che gestisce l’impianto.
VM61D (Impianto molluschicoltura Manfredonia): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono
stati prelevati il giorno 16/07/2008 nell’impianto di allevamento di molluschi con il mezzo nautico
di una cooperativa di miticoltori del luogo.
MC13A (Foce torrente Candelaro): non essendoci presenza di molluschi del genere Mytilus il
giorno 19/09/2008 sono stati prelevati esemplari di vongole Ruditapes philippinarum mediante
una vongolara di una cooperativa locale.
AT2 (Laguna di Lesina): non è stato possibile effettuare il prelievo di esemplari sia di molluschi
bivalvi che di pesci a seguito delle particolari condizioni ambientali della stazione constatate il
giorno 01/07/2008, grazie al mezzo nautico del CNR-ISMAR di Lesina e la collaborazione
scientifica del Dr. Breber. Il giorno 30/07/2008 sono state impiantate nella stessa laguna in località
San Clemente, n. 5 reste di mitili prelevati in un’area poco contaminata di Taranto. Un mese dopo,
al momento del prelievo, gli organismi sono stati ritrovati morti a causa delle precarie condizioni
fisico-chimiche delle acque della laguna, che ha presentato un esteso fenomeno di anossia. La
bassa salinità delle acque non consente poi la sopravvivenza dei molluschi.
ELENCO DEI CAMPIONI PRELEVATI MA NON ANCORA COMPLETAMENTE
ANALIZZATI
MC14A (Foce torrente Cervaro): non essendoci presenza di molluschi del genere Mytilus sono
stati prelevati il giorno 19/09/2008 esemplari di vongole Ruditapes philippinarum mediante
vongolara di una cooperativa di pescatori locali.
MC15A (Foce torrente Carapelle): non essendoci presenza rilevante di molluschi del genere
Mytilus sono stati prelevati il giorno 19/09/2008 esemplari di vongole Ruditapes philippinarum
mediante vongolara di una cooperativa di pescatori locali.
VM73A (Mar Piccolo, II Seno, loc. Battentieri): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati
prelevati il giorno 17/11/2008 presso un allevamento di molluschi.
VM69A (Mar Grande, loc. Sabbione): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati
il giorno 17/11/2008 mediante il mezzo nautico del CNR di Taranto “Cerruti” presso impianto
dismesso di allevamento molluschi con l’ausilio di un subacqueo.
MC55A (Foce Fiume Lato): non essendoci esemplari di molluschi nella località indicata e lungo
tutta la costa adiacente al fiume Lato, i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il
giorno 25/11/2008 presso la foce del fiume Lenne (località più a sud, con l’ausilio di un
subacqueo.
MC57A (Foce Fiume Patemisco): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il
giorno 25/11/2008 presso la foce del fiume, con l’ausilio di un subacqueo.
Preparazione del campione
Per ogni stazione di campionamento sono stati selezionati 300-350 individui di taglia più o meno
omogenea (Tabella 2). Per l’analisi dei metalli, in particolare, sono state utilizzati 150-170
individui; gli altri 150-170 individui sono stati utilizzati per l’analisi di composti organici. Per la
determinazione di biomarkers (stabilità della membrana lisosomiale) sono stati utilizzati circa 20
individui, mantenuti in vita fino all’analisi, in acqua marina areata (circa 1 individuo per litro di
acqua) alla temperatura di circa 14-16 °C. Per la rimozione della polpa intera sono stati utilizzati
un coltello di teflon per l’analisi dei metalli e un coltello di acciaio inox per l’analisi di composti
organici. Prima della rimozione della polpa, le valve degli organismi sono state ripulite da
incrostazioni, rimuovendo il materiale estraneo. Ogni esemplare è stato lavato con acqua distillata;
per i mitili è stato estratto il bisso dalle valve chiuse. La polpa è stata poi rimossa, lavata con
acqua distillata, fatta sgocciolare su un foglio di carta bibula e conservata in contenitori di vetro.
Prima dell’analisi i campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra Turrax T25 e
liofilizzati. Su una aliquota di campione è stata calcolata la perdita in acqua.
Tabella 2 – Intervallo di lunghezza delle valve dei mitili campionati Campione
Lunghezza (cm)
Mytilus galloprovincialis
MC 2A (Foce Fortore)
2.81-3.70
MC 11A (Mattinata)
4.73-5.11
MC 17A (Foce Ofanto)
3.50-4.12
AT 9 (Lago Varano)
5.75-6.53
AT 14 (Alimini Grande)
4.95-5.64
VM 60A (Capoiale)
5.83-6.67
VM 61D (Impianto mollusc. Manfredonia)
5.80-6.85
VM 70A (Mar Grande Loc. Tarantola)
5.38-6.48
VM 71A (Mar Piccolo I Seno Loc. Galeso)
4.97-6.01
VM 72A (Mar Piccolo II Seno Loc. Cimino)
4.68-5.90
Parametri analizzati e metodologie analitiche
Sui vari campioni i parametri determinati sono stati:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Metalli (Ag, Al, As, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, Va, Zn)
Pesticidi clorurati (4,4'-DDT; 2,4'-DDT; 4,4'-DDE; 2,4'-DDE; 4,4'-DDD; 2,4'-DDD; alfaHCH; beta-HCH; gamma-HCH; δ-HCH; Aldrin; Dieldrin; alfa-Endosulfan;
Esaclorobenzene; pentaclorobenzene)
Solventi clorurati (1,2,4-triclorobenzene; esaclorobutadiene)
Fenoli (pentaclorofenolo)
Pesticidi fosforati (Clorpyrifos; Clorfenvinfos)
Policlorobifenili (PCB) (Congeneri = 28, 52, 77, 81, 101, 118, 126, 128, 138, 153, 156,
169, 180)
Ftalati (Ftalato di bis (2-etilesile))
Difenileteri bromati (pantabromo difeniletere)
Alchilfenoli (4(para)nonilfenolo; para-terz-octilfenolo)
Idrocarburi policiclici aromatici (IPA) (acenaftene; acenaftilene; antracene;
benz(a)antracene;
benzo(a)pirene;
benzo(b)fluorantene;
benzo(ghi)perilene;
benzo(k)fluorantene; crisene; dibenzo(ah)antracene;fenantrene; fluorantene; fluorene;
indeno(1,2,3-cd)pirene; naftalene; pirene)
Composti organostannici (monobutilstagno; dibutilstagno; tributilstagno)
Prodotti fitosanitari (trifuralin)
Biomarkers (test sulla stabilità delle membrane lisosomiali)
Le metodologie analitiche utilizzate sono state:
1. Metalli: digestione acida con microonde (Metodo EPA 3052) e determinazione mediante
ICP-MS.
2. IPA e ftalato bis (2-etilesile): estrazione con microonde (metodo EPA 3546); purificazione
mediante allumina (metodo EPA 3610B) e gel di silice (metodo EPA 3630).
Determinazione in GC-MS-SIM (metodo EPA 8270).
3. Composti organostannici: estrazione con tropolone, derivatizzazione con reattivo di
Grignard e determinazione in GC-MS-SIM. Metodo ICRAM riportato in ”Metodologie
analitiche - Programma di monitoraggio per il controllo dell’ambiente marino-costiero.
Triennio 2001- 2003”.
4. PCB, pesticidi clorurati, fosforati e fitofarmaci: estrazione con metodo EPA 3546);
purificazione con Florisil e determinazione in GC-ECD. Metodo ICRAM riportato in
”Metodologie analitiche - Programma di monitoraggio per il controllo dell’ambiente
marino-costiero. Triennio 2001- 2003”.
5. PBDE: metodo EPA 1614
6. Solventi clorurati: metodo EPA 5030, EPA 8260
7. Pentaclorofenolo: estrazione in microonde, determinazione in HPLC con rivelatori LC-35 a
fotodiodi e fluorimetrico (metodo IRSA19A); conferma in LC-MS.
8. Alchilfenoli: Metodica dell'ISS riportata nel volume "Rischio chimico associato alla qualità
delle acque del mare Adriatico"; Rapporti ISTISAN 04/4 (parte seconda).
Risultati e discussione
I risultati ottenuti, riferiti sia al peso secco che umido dei molluschi sono riportati nelle tabelle
allegate.
1) Concentrazioni dei metalli
Le concentrazioni di metalli (Hg, Cd, Ni, V, Pb, Cr, Cu, Ag, As, Zn, Al e Fe) in peso umido e
peso secco nella polpa di Mytilus galloprovincialis e di Tapes philipinarum sono riportate nelle
Tabelle allegate. I risultati consentono di trarre alcune importanti considerazioni. La normativa
vigente (Regolamento CE 1881/2006), relativamente alla commercializzazione dei molluschi
bivalvi, impone dei limiti massimi di 0.5 mg kg-1 p.u per il mercurio, di 1.5 mg kg-1 p.u. per il
piombo e di 1.0 mg kg-1 p.u per il cadmio. I valori determinati nella presente indagine per questi
tre metalli sono al di sotto di questi limiti; modeste sono anche le concentrazioni riscontrate degli
altri metalli analizzati.
Per quanto riguarda il mercurio le concentrazioni più basse (0.01 mg Kg-1 p.u.) sono state
riscontrate nelle stazioni AT9 (Lago di Varano) e VM60A (Parco allevamento mitili Capoiale);
anche nella stazione MC13A (Foce T.te Candelaro), nella quale sono state campionate le vongole,
è stato trovato lo stesso livello di concentrazione. Nella stazione VM71A (Mar Piccolo, I Seno,
Loc. Galeso) è stata riscontrata la concentrazione più alta (0.05 mg Kg-1 p.u.).
Il livello più basso di Pb (0.02 mg Kg-1 p.u.) è stato trovato nella stazione AT9 (Lago di Varano),
quello più alto (0.33 mg Kg-1 p.u) nella stazione AT14 (Laghi Alimini).
Per il Cd la concentrazioni più bassa (0.06 mg Kg-1 p.u.) è stata trovata nella stazione VM 72A
(Mar Piccolo II Seno Loc. Cimino), quella più alta (0.35 mg Kg-1 p.u.) nella stazione AT 9 (Lago
di Varano).
Per quanto riguarda arsenico, nichel e alluminio le concentrazioni più basse sono state trovate nella
stazione AT9 (Lago di Varano) con valori di 1.66 mg Kg-1 p.u., 0.06 mg Kg-1 p.u. e 11 mg Kg-1
p.u. rispettivamente, mentre per il rame e il ferro i livelli più bassi, rispettivamente di 0.73 mg kg-1
p.u. e 16 mg Kg-1 p.u. sono stati riscontrati nella stazione VM61D (Impianto molluschicoltura
Manfredonia). Nelle stazioni AT9 (Lago di Varano), VM61D (Impianto molluschicoltura
Manfredonia) e MC13A (Foce T.te Candelaro) sono stati trovati i livelli più bassi di Cr (inferiori
al limite di rivelabilità, < 0.0002 mg Kg-1 p.u.), mentre nella stazione VM 72A (Mar Piccolo II
Seno Loc. Cimino) è stato trovato il valore più basso di zinco (14 mg Kg-1 p.u.), anche se nella
stazione MC13A (Foce T.te Candelaro), dove sono state campionate le vongole, è stato riscontrato
il valore più basso (7.7 mg Kg-1 p.u.).
Nella stazione AT14 (Alimini Grande) sono state determinate le concentrazioni più alte di As, Zn
e Cu con livelli di 5.76 mg Kg-1 p.u., 31 mg Kg-1 p.u., e 2.08 mg Kg-1 p.u. rispettivamente, mentre
nella stazione MC2A (Foce Fortore), VM60A (Capoiale) e MC 17A sono state trovate le
concentrazioni più alte di Ni (1.03 mg Kg-1 p.u.), Al (96 mg Kg-1 p.u. ) e Fe (68 mg Kg-1 p.u.)
rispettivamente. Nella stazione MC 2A (Foce Fortore) è stato trovato il valore più alto di Cr (0.29
mg Kg-1 p.u.). Il vanadio, invece, presenta livelli più o meno simili in tutte le stazioni campionate.
Qui di seguito sono riportati i grafici di distribuzione relativi ai tre metalli più tossici.
-1
mg kg (p.u.)
0.5
Cd
0.4
0.3
0.2
VM72A
VM71A
VM70A
VM61D
VM60A
AT14
AT2
AT9
MC17A
MC13A
MC11A
0
MC2A
0.1
Stazioni
Figura 2 - Distribuzione di Cd (mg Kg -1 p.u.) nei mitili prelevati nelle stazioni
di campionamento (nella stazione MC 13A sono state campionate le vongole).
0.06
Hg
-1
mg kg (p.u.)
0.05
0.04
0.03
0.02
VM72A
VM71A
VM70A
VM61D
VM60A
AT14
AT2
AT9
MC17A
MC13A
MC11A
0
MC2A
0.01
Stazioni
Figura 3 - Distribuzione di Hg (mg Kg -1 p.u.) nei mitili prelevati nelle stazioni
di campionamento (nella stazione MC 13A sono state campionate le vongole).
-1
mg kg (p.u.)
0.5
Pb
0.4
0.3
0.2
VM72A
VM71A
VM70A
VM61D
VM60A
AT14
AT2
AT9
MC17A
MC13A
MC11A
0
MC2A
0.1
Stazioni
Figura 4 - Distribuzione di Pb (mg Kg -1 p.u.) nei mitili prelevati nelle stazioni
di campionamento (nella stazione MC 13A sono state campionate le vongole)
2) Concentrazioni di composti organici Per quanto riguarda gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) i livelli sono compresi tra n.d. (non
determinabile) (st. MC13A foce Candelaro) e 51.7 µg/Kg p.u.(st. VM70A Mar Grande loc.
Tarantola). In nessuna stazione il benzo[a]pirene, indicato come marcatore della presenza di IPA
cancerogeni, ha superato la concentrazione di 10 µg/Kg p.u. che è il limite fissato per questo
composto nei molluschi bivalvi (regolamento CE N. 1881 /2006).
Per quanto concerne i pesticidi clorurati, il 4,4’ DDE ( metabolita del DDT risultato praticamente
assente in tutte le stazioni) è stato l’unico composto determinato in tutti i campioni. I livelli più
elevati sono stati riscontrati nella stazione VM72A (II seno del Mar Piccolo loc. Cimino) e nella
stazione MC17A (foce fiume Ofanto) con concentrazioni rispettivamente di 5.6 µg/Kg p.u e 4.5
µg/Kg p.u. Secondo il D.M 27/08/2004 la somma di tutti gli isomeri e metaboliti del DDT nei
prodotti della pesca e dell’acquacoltura con contenuto di grassi inferiore al 5% non deve superare
il limite di 50 µg/Kg p.u. Poiché il contenuto di grassi nei mitili oscilla intorno all’1%, le
concentrazioni, in tutte le stazioni, sono da ritenersi inferiori ai limiti previsti.
Tra i pesticidi fosforati il Clorpyrifos è stato riscontrato solo in campioni prelevati alle foci dei
fiumi Fortore (MC 2A), Candelaro (MC13A) e Ofanto (MC 17A) con concentrazioni
rispettivamente di 0.8, 3.8 e 7.4 µg/Kg p.u. Attualmente non esiste nessun riferimento legislativo
per i limiti di concentrazione. I composti organostannici (TBT, DBT e MBT) sono stati determinati in mitili in corrispondenza
della stazione VM 71A (Galeso, I seno del Mar Piccolo) con concentrazioni rispettivamente di 2.4,
3.9, e 0.9 µg Sn/Kg p.u.
Per quanto concerne i policlorobifenili (PCB), la somma dei congeneri determinati ha presentato
valori minimi di 0.4 µg/Kg p.u in corrispondenza della stazione foce Candelaro (MC 13A), mentre
i livelli più elevati sono stati determinati in corrispondenza della stazione VM 71A (Galeso –
Taranto) (70.8 µg/Kg p.u).
Stazioni
MC 2A
MC 11A
MC 13A
MC17A
AT 9
AT 2 *
AT 14
VM 60A
VM 61D
VM 70A
VM 71A
VM72A
Non-orto
(77, 81, 126, 169)
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
PCB (ng/g p.u.)
Mono-orto
(118, 156)
< 0.2
< 0.2
< 0.2
0.3
< 0.2
Non Diossina simili
(28, 52,101,138,153,180)
0.7
0.13
0.4
1.5
1.3
_
_
_
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
< 0.2
1.5
9.4
1.1
0.9
1.4
0.9
16
61.4
8.7
∗ stazione non campionata Tabella 3 – Livelli dei PCB congeneri non-orto, mono-orto e non diossina simili
Sebbene i policlorobifenili costituiscono un gruppo di 209 congeneri diversi, solo 12 di questi
presentano proprietà tossicologiche analoghe a quelle delle diossine e sono pertanto denominati
diossina-simili. Si tratta dei PCB non-orto 77, 81, 126, 169 e dei PCB mono-orto 105, 114, 118,
123, 156, 157, 167, 189. Poiché, ciascun congenere diossina-simile presenta un diverso livello di
tossicità (TEF), il rischio derivante dalla presenza di questi composti viene espresso, più
comunemente, in termini di Tossicità Equivalente (TEQ), ottenuto moltiplicando i valori di TEF
per la relativa concentrazione nella matrice di interesse. Il regolamento CE 199/2006 del 3
febbraio 2006 stabilisce che la somma di diossine, furani e PCB diossina-simili non deve essere
superiore, nel muscolo di pesce, a 8.0 pg TEQ/g p.u. (OMS-PCDD/F-PCB-TEQ). In assenza di
normative inerenti i molluschi bivalvi, nel fare riferimento a questo limite, si è potuto prendere in
considerazione solo i PCB non-orto come i congeneri 77, 81, 126, 169 e alcuni dei PCB mono-orto
previsti (e precisamente i congeneri 118 e 156) (Tabella 3). Sebbene la contaminazione in località
Galeso sia significativa, per nessuna stazione i valori di TEQ sono risultati superiori ai limiti di
legge (Tabella 4).
E’ da tenere presente, comunque, che nell’indagine condotta, il TEQ determinato è sottostimato in
quanto le diossine e i furani non sono stati determinati, mentre dei 12 congeneri diossina-simili dei
PCB indicati dal regolamento, l’analisi è stata prevista solo per i quattro non-orto e per due dei
mono-orto. Sarebbe pertanto auspicabile, prevedere in futuro, la determinazione degli altri
parametri (diossina, furani e PCB diossina-simili) al fine di avere una valutazione tossicologica più
approfondita e, soprattutto, in linea con le direttive CE. Nelle figure 5-7 sono illustrati gli
andamenti di alcuni contaminanti organici determinati nelle varie stazioni.
Stazioni
MC 2A
MC 11A
MC 13A
MC17A
AT 9
AT 2 *
PCB (pgTEQ/g p.u.)
Non-orto
Mono-orto
(77, 81, 126, 169)
(118, 156)
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.030
0.000
0.000
AT 14
VM 60A
VM 61D
VM 70A
VM 71A
VM72A
_
_
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.150
1.220
0.110
Tabella 4 – Livelli dei PCB congeneri espressi come pg TEQ/g p.u.
µg/Kg p.u.
Clorpyrifos
8
7
6
5
4
3
2
1
0
MC 2A MC 11A MC 13A MC17A
AT 9
AT 14 VM 60A VM 61D VM 70A VM 71A VM 72A STAZIONI
Figura 5 - Distribuzione del pesticida Clorpyrifos nelle stazioni campionate.
µg/Kg p.u. 4,4' DDE
6 5 4 3 2 1 0 MC 2A MC 11A MC 13A MC17A
AT 14 VM 60A VM 61D VM 70A VM 71A VM 72A AT 9
STAZIONI
Figura 6 - Distribuzione del 4,4 DDE nelle stazioni campionate
µg/Kg p.u. PCB (totali)
80
70
60
50
40
30
20
10
0 MC 2A MC 11A MC 13A MC17A
AT 9
AT 14 VM 60A VM 61D VM 70A VM 71A VM 72A STAZIONI
Figura 7 - Distribuzione dei PCB totali nelle stazioni campionate. DECRETO LEGGE N. 131 del 27 gennaio 1992
Attuazione della direttiva 79/923/CEE relativa ai requisiti di qualità delle acque destinate
alla molluschicoltura.
Norme sanitarie – molluschi – allevamenti - acquacoltura
Allegato 2
Requisiti delle acque destinate alla
molluschicoltura per la classificazione ai
sensi dell'art.2 della legge 2 maggio 1997,
N.192.
nel corpo del mollusco in mg/kg peso fresco
Hg
0.7
Pb
2.0
REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006 DELLA COMMISSIONE
del 19 dicembre 2006
che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari
Parte 3: Metalli
Pb
Hg
Cd
Prodotti alimentari
Tenori massimi
(mg/kg peso fresco)
Molluschi bivalvi
Molluschi bivalvi
Molluschi bivalvi
1.5
0.5
1.0
Parte 5: Diossine e PCB*
Tenori massimi
Prodotti alimentari
(pg TEQ/g peso fresco)
Somma di diossine
Muscolo di pesce e prodotti della
pesca e loro derivati esclusa
l'anguilla
4.0
Somma di diossine e PCB
diossina simili
Muscolo di pesce e prodotti della
pesca e loro derivati esclusa
l'anguilla
8.0
Somma di diossine
Muscolo di anguilla e derivati
4.0
Somma di diossine e PCB
diossina simili
Muscolo di anguilla e derivati
12.0
*Diossine [somma di policlorodibenzo-para-diossine (PCDD) e policlorodibenzofurani (PCDF), espressi in
equivalenti di tossicità dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) utilizzando gli OMS-TEF (fattori di
tossicità equivalente)], e somma di diossine e PCB diossina-simili [somma di PCDD, PCDF e policlorobifenili
(PCB), espressi in equivalenti di tossicità dell'OMS, utilizzando gli OMSTEF].
Parte 6: Idrocarburi policiclici aromatici
Tenori massimi
Prodotti alimentari
(µg/kg peso fresco)
Benzo(a)pirene *
Molluschi bivalvi
10.00
*Utilizzato come marcatore della presenza e degli effetti degli IPA cancerogeni.
RGOLAMENTO (CE) N. 565/2008 DELLA COMMISSIONE
del 18 giugno 2008
che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari; per quanto
riguarda la definizione del tenore massimo di diossine e PCB nel fegato di pesce.
Articolo 1: Diossine e PCB*
Prodotti alimentari
Tenori massimi
(pg TEQ/g peso fresco)
Somma di diossine
Fegato di pesce e suoi
derivati
-
Somma di diossine e PCB
diossina simili
Fegato di pesce e suoi
derivati
25.0
DECRETO MINISTERIALE del 27/08/2004
Prodotti fitosanitari: limiti massimi dei residui delle sostanze attive nei prodotti destinati
all’alimentazione
Prodotti fitosanitari, allegato 4
Gruppo
1
Prodotti della pesca e dell'acquacoltura citati nell'allegato 1 parte E
valori espressi in mg/kg peso fresco
HCH (somma
DDT (isomeri e
% di
Linadano
Aldrin e/o
Esaclorodi isomeri
metaboliti compreso il
sost.grassa
(gamma
dieldrin
benzene
diversi dal
DDD espressi come
nel prodotto
HCH)
gamma)
DDT
≤5
0.005
0.010
0.010
0.025
0.05
2
> 5-20
0.010
0.020
0.020
0.050
0.10
3
>20-40
0.020
0.040
0.080
0.100
0.15
4
>40
0.040
0.080
0.080
0.100
0.50
La presente tabella contiene solo le sostanze esaminate nella campagna di monitoraggio effettuata.
Di seguito sono riportati alcuni riferimenti bibliografici inerenti il contenuto lipidico dei molluschi
bivalvi M. galloprovincialis.
Riferimento bibliografico
% di grasso nel
Mytilus
galloprovincialis
Perugini et al., 2004
Naso et al., 2005
Bayarry et al., 2001
Stefanelli et al., 2004
Mar Adriatico
Golfo di Napoli
Mar Adriatico
Mar Adriatico
1.00 %
1.00 ± 0.23 %
1.4 %
1.16% - 0.9% - 1.51%
La quantità di grasso varia comunque a seconda delle stagioni e del periodo riproduttivo.
Bibliografia
Bayarry S, Baldassarri LT, Iacovella N, Ferrara F, di Domenico A, 2001. PCDDs, PCDFs, PCBs
and DDE in edible marine species from the Adriatic Sea.
Naso B, Perrone D, Ferrante MC, Bilancione M, Lucisano A, 2005. Persistent organic pollutants in
edible marine species from the Gulf of Naples, Southern Italy. Science of the Total Environment,
343: 83-95.
Perugini M, Cavaliere M, Giammarino A, Mazzone P, Olivieri V, Amorena M, 2004. Levels of
polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in some edible marine organisms from
the Central Adriatic Sea. Chemosphere, 57(5):391-400.
Stefanelli P, Di Muccio A, Ferrara F, Attard Barbibi D, Generali T, Pelosi P, 2004. Estimation of
intake of organochlorine pesticides and chlorobiphenils through edible fishes from the Italian
Adriatic Sea during 1997. Food Control, 15: 27-38.
Determinazione in vivo della stabilità delle membrane lisosomiali mediante test NRR per
campioni di bivalvi prelevati in ambienti acquatici pugliesi.
Premessa
Attività svolta:
1) determinazione degli indici biometrici e determinazione del sesso di campioni di bivalvi
quali mitili della specie Mytilus galloprovincialis e vongole della specie Tapes philippinarum;
2) determinazione in vivo della destabilizzazione delle membrane lisosomiali (NRRa) in
campioni di emolinfa di mitili della specie M. galloprovincialis;
3) messa a punto del protocollo sperimentale per la determinazione in vivo della
destabilizzazione delle membrane lisosomiali (NRRa) in campioni di emolinfa di vongole;
4) determinazione in vivo della destabilizzazione delle membrane lisosomiali (NRRa) in
campioni di emolinfa di vongole della specie T. philippinarum;
5) elaborazione dei dati ottenuti mediante analisi statistica.
1. Introduzione
1.a. Biomarker
Biomarker viene attualmente definito quella risposta biologica alla contaminazione chimica
ambientale che si verifica a livello sub-individuale segnalando una deviazione dallo stato normale;
tale risposta può essere misurata all’interno di un organismo o in suoi prodotti (urine, feci, capelli,
penne etc.) e non può essere rilevata nell’organismo intatto (Van Gastel e Van Brummelen, 1996).
D’altra parte, in senso lato, biomarker viene inteso come qualsiasi misurazione che rifletta il
rischio (che può essere chimico, fisico o biologico) cui un sistema biologico è sottoposto (WHO,
1993).
I biomarkers, in funzione della specificità di risposta nei confronti di agenti inquinanti, si possono
distinguere in specifici e generici (Peakall et Shugart, 1993).
9 Fanno parte dei biomarkers specifici quelle risposte molecolari e biochimiche che si
manifestano in un organismo a seguito dell’esposizione ad una specifica classe di contaminanti.
9 Si definiscono come biomarkers generici quelle risposte molecolari, cellulari e fisiologiche che
segnalano effetto e/o esposizione senza fornire indicazioni più precise sulla classe di contaminanti
responsabile della sindrome di stress. Pertanto, tale deviazione dallo stato normale può essere
attribuita ad un insieme complesso di contaminanti accumulato nei tessuti dell’organismo
sentinella. A questo secondo gruppo appartengono biomarkers come la destabilizzazione delle
membrane lisosomiali.
1.b. Destabilizzazione delle membrane lisosomiali
La stabilità della membrana lisosomiale nel mitilo risulta un indice estremamente sensibile dello
stato funzionale delle cellule dell’organismo (Moore, 1985), strettamente correlato all’insorgenza
di situazioni patologiche provocate da metalli pesanti e inquinanti organici. Tale indice, pertanto, è
in grado di segnalare l’esistenza di una generica sindrome di stress ascrivibile all’insieme dei
contaminanti chimici accumulati nei tessuti degli organismi.
2. Materiali e Metodi
2.a. Metodi: NRRa
Il metodo utilizzato per la determinazione della stabilità lisosomiale corrisponde a quello descritto
in MANUAL ON THE BIOMARKERS RECOMMENDED FOR THE MED POL
BIOMONITORING PROGRAMME messo a punto nell’ambito dell’UNEP-MAP (United Nations
Environment Programme – Mediterranean Action Plan) e raccomandato per il programma di
biomonitoraggio MED POL (UNEP, 1999). In base a tale metodica la stabilità della membrana
lisosomiale viene misurata su emociti di mitilo attraverso Neutral Red retention assay (Lowe et
al., 1992). Il Neutral Red (NR) è un colorante lipofilico e come tale attraversa facilmente le
membrane plasmatica e lisosomiale. Nei lisosomi, a causa del pH fortemente acido di questi
organuli cellulari, passa nella forma dissociata che gl’impedisce di ritornare liberamente nel
citoplasma e lo rende visibile microscopicamente.
L’efficienza con cui il NR rimane intrappolato nei lisosomi dipende dal pH dei lisosomi ossia dalla
funzionalità della pompa protonica (Segien,1983) presente sulla membrana lisosomiale che
trasporta attivamente H+ dal citoplasma nei lisosomi (Ohkuma et al., 1982). Eventuali danni alla
membrana lisosomiale e possibile inibizione della pompa protonica provocati da inquinanti
chimici possono essere indagati con il test del neutral red retention assay poiché esso risulta, in
ultima analisi, un indice per la misura del rilascio del contenuto lisosomiale nel citosol. Come
dimostrato da Lohse nel 1990 il metodo NRRa è sensibile a molte classi di contaminanti chimici
sia organici sia inorganici.
Praticamente, 40 µl di emolinfa diluita 1:1 in soluzione salina (Hepes 20mM, NaCl 436 mM,
MgSO4 53mM, KCl 10mM, CaCl2 10mM) sono stati posti su un vetrino polilisinato e lasciati
incubare in camera umida (16°C) per 30 minuti. Sulle cellule aderite al vetrino sono stati aggiunti
40μl di NR (20mg di NR in 1ml di DMSO; 5 μl di tale soluzione si diluiscono in 995 μl di
soluzione salina fisiologica) e lasciati incubare in camera umida (16°C) per 15 minuti.
Pool di almeno 10 individui sono stati selezionati per il prelievo dei campioni di emolinfa.
2.b. Analisi d’immagine
Il preparato è stato osservato al microscopio (Eclipse 600 by Nikon) con obiettivo ad
ingrandimento 20X e 40X; le letture sono state effettuate in triplo per ciascun campione per 3 ore
consecutive, ogni 15 minuti per la prima ora e successivamente ogni 30 minuti per le due ore
successive.
Mediante il sistema per analisi d’immagine Lucia Measurement (Nikon) è stato determinato il
tempo in corrispondenza del quale il 50% dei lisosomi delle cellule visibili in un determinato
campo del campione perde la colorazione caratteristica del rosso neutro.
Figura 1. Sequenza di rilascio del NR dai lisosomi al citosol durante il test del NRR tratta da Dailianis et al. (2003). La barra dimensionale
indica 21 µm in (a), 25 µm in (b–d).
In Fig. 1 (a-d) sono riportati i vari stadi che gli emociti di M. galloprovincialis attraversano
durante il test NRR. In 1a è possibile osservare come dopo 30 min d’incubazione con il Rosso
Neutro i lisosomi degli emociti ritengano tutto il colorante. In 1b è riportato il caso dei 45 min
d’incubazione dove si possono notare i primi segni d’espansione dei lisosomi. In fig. 1c
corrispondente al tempo 60 minuti d’incubazione è possibile osservare la maggiore espansione dei
lisosomi e l’iniziale rilascio del colorante all’interno del citoplasma. Quando entrambe le
alterazioni si verificano in più del 50% delle cellule il test del NRR si considera terminato. In Fig.
1d i lisosomi mostrano il totale rilascio del colorante nel citoplasma.
2.c. Analisi statistica dei dati
L’analisi statistica dei dati è stata effettuata mediante software dedicato GraphPad PRISM
versione 2.0..
3. Risultati
3.a. Indici biometrici
In Tab. 1 sono riportati gli indici biometrici medi relativi ai campioni di M. galloprovincialis.
Lunghezza, larghezza ed altezza valve sono stati determinati mediante calibro ventesimale. Il
campione con dimensioni medie maggiori è risultato proveniente da impianto d’allevamento:
VM61D (Manfredonia). D’altra parte mitili non allevati ma bensì nativi come, ad esempio, MC2A
proveniente dalla foce del Fortore hanno mostrato dimensioni nettamente inferiori.
Il differenziamento sessuale dedotto dal colore delle carni (il colore delle carni bianco latteo
definisce gli organismi di sesso maschile, rosso arancio gli organismi di sesso femminile) è stato
manifestato dai campioni con dimensioni maggiori o uguali a circa 5 cm; d’altra parte i campioni
MC17A (Ofanto) ed MC2A (Foce Fortore) con lunghezza valve compresa all’incirca tra 3.5 cm e
3.8 cm, dimensioni inferiori al minimo necessario per lo sviluppo degli organi sessuali, non hanno
manifestato alcun differenziamento sessuale degli individui. VM72A (Cimino Taranto), VM61D
(Manfredonia) ed AT14 (Alimini Grande) hanno presentato un forte sbilanciamento nella
distribuzione in sessi.
Campione
(M. galloprovincialis)
VM61D (Manfredonia)
VM60A (Capoiale)
AT9 (Varano)
VM70A (Tarantola)
VM71A (Galeso)
AT14 (Alimini Grande)
VM72A (Cimino - Taranto)
MC11A (Mattinata)
MC17A (Ofanto)
MC2A (Foce Fortore)
Lunghezza
Er. St. Larghezza
Er. St. Spessore
Er. St.
cm
cm
cm
± 0.27
± 0.10
± 0.09
6.37
3.19
2.29
± 0.15
± 0.08
± 0.04
6.06
2.81
2.04
± 0.17
± 0.07
± 0.09
6.00
2.91
2.09
± 0.08
± 0.08
± 0.08
5.78
3.03
2.19
± 0.15
± 0.08
± 0.06
5.38
2.62
1.75
± 0.19
± 0.07
± 0.08
5.19
2.96
2.01
± 0.15
± 0.08
± 0.09
5.17
2.62
1.86
± 0.12
± 0.09
± 0.05
4.93
2.72
1.71
± 0.08
± 0.04
± 0.04
3.76
2.00
1.43
± 0.08
± 0.07
± 0.05
3.48
1.74
1.54
Sesso
%M/F
20 / 80
70 / 30
60 / 30
50 / 50
40 / 40
80 / 20
90 / 10
60 / 40
NC
NC
Tabella 1: lunghezza, larghezza e spessore valve determinati mediante calibro ventesimanle su campioni di almeno 10 individui di M.
galloprovincialis . I dati sono espressi come media ± errore standard (N=10). Nell'ultima colonna è riportata la percentuale media di individui di sesso
maschile. Il sesso è stato dedotto dalla colorazione delle carni (NC = non classificato).
In Tab. 2 sono riportati gli indici biometrici medi relativi ai campioni di vongole. Il campione di
dimensioni medie maggiori (lunghezza e larghezza) è risultato MC13A (Foce Candelabro),
tuttavia MC15A ha mostrato un maggiore spessore medio.
3.b. Determinazione in vivo della stabilità delle membrane lisosomiali: N.R.R.a. (Neutral
Red Retention assay)
In Tab. 3 sono riportati i risultati ottenuti relativamente ai campioni di M. galloprovincialis. Il
tempo di ritenzione medio (determinato considerando per ciascun pool di 10 individui il NRR time
in triplo) corrisponde al NRR time della rispettiva stazione di campionamento. Le varie stazioni di
campionamento hanno mostrato tempi di ritenzione del rosso neutro significativamente diversi tra
loro con P = 0.0099. L’analisi statistica dei dati è stata effettuata mediante un test non parametrico
come il Kruscall-Wallis test avendo assunto come non gaussiana la distribuzione dei valori di
NRR time per ogni singolo campione. Si sottolinea come il tempo di ritenzione del rosso neutro
nel mitilo corrisponda alla relativa stabilità delle membrane lisosomiali e, di conseguenza,
rappresenti un indice estremamente sensibile dello stato funzionale delle cellule dell’organismo.
Campione
M. galloprovincialis
AT14 (Alimini Grande)
VM71A (Galeso)
AT9 (Varano)
VM70A (Tarantola)
MC17A (Ofanto)
VM60A (Capoiale)
VM72A (Cimino - Taranto)
VM61D (Manfredonia allevamento)
MC2A (Foce Fortore)
MC11A (Mattinata)
NRRt
min
100.00 ± 10.00
80.00 ± 10.00
80.00 ± 10.00
70.00 ± 10.00
70.00 ± 10.00
45.00 ± 8.66
45.00 ± 10.00
30.00 ± 10.00
NC
NC
Tabella 3. Tempo di ritenzione del Rosso Neutro (espresso in minuti) di
campioni di emolinfa provenienti da pool composti da almeno 10 individui.
Le prove sono state condotte in triplo e i dati sono espressi come media ± Err.
St. Le righe con i simboli NC si riferiscono a campioni fortemente parassitati.
Com’è possibile notare osservando la tabella, AT14 (Alimini Grande) è stata la stazione di
campionamento che ha mostrato il maggiore tempo medio di ritenzione del NR (100.0 ± 10.0),
corrispondente ad una elevata stabilità delle membrane lisosomiali e ad un probabile minore
impatto dello stress chimico sugli organismi viventi al suo interno. D’altra parte notevolmente
inferiore è risultato il NRR time della stazione di campionamento VM61D (Manfredonia) dove i
mitili hanno mostrato un tempo di decolorazione dei lisosomi degli emociti compreso tra 40 e 20
minuti. Occorre a tal proposito notare come, in base ai dati presenti in letteratura, tempi di
destabilizzazione della membrana lisosomiale inferiori a 60 min vengano considerati patologici
(Moore et al, 2006; Lowe et al., 2006; Regoli et al., 2004). Tuttavia, sui bassi valori di stabilità
lisosomiale della stazione di Manfredonia potrebbe aver influito il lungo periodo di tempo
intercorso tra il prelievo del campione ed il suo dosaggio (si veda Tab. 1 del capitolo Materiali e
Metodi). Tempi medi di ritenzione del NR compresi tra il valore massimo di AT14 (Alimini
Grande) ed il valore minimo di VM61D (Manfredonia), nonchè prossimi a 60 minuti, tempo
minino da ritenersi possibile indicatore di situazione non patologica, sono stati determinati
nell’emolinfa degli altri campioni. In Fig. 2(A-F) sono riportate le immagini rappresentative del
grado di decolorazione dei lisosomi degli emociti dei campioni di mitili durante il test del NRR, al
tempo d’incubazione massimo di 60 minuti. Osservando la figura è possibile notare come
l’espansione dei lisosomi aumenti passando dall’immagine 3.A. (dove, in realtà, non è visibile
alcun segno di rilascio del colorante) all’immagine 3.E. (le immagini 3.A-E. sono relative allo
stesso tempo d’incubazione ossia 60 min); allo stesso modo si può notare, oltre all’espansione dei
lisosomi, il rilascio del colorante nel citoplasma nelle immagini 3.F–H.. (tali immagini sono
relative al tempo d’incubazione 45 min per Capoiale-Cimino e al tempo d’incubazione 30 min per
Alimini).
In Tab. 4 sono riportati i risultati ottenuti relativamente ai campioni di T. philippinarum. Il tempo
di ritenzione medio (determinato considerando per ciascun pool di 10 individui il NRR time in
triplo) per ciascun pool di 10 individui corrisponde al NRR time della rispettiva stazione di
campionamento. Le stazioni MC13A (Foce Candelaro) ed MC15A (Foce Carapelle) si attestano su
valori di ritenzione del NR compresi tra 80 min e 52 minuti circa, mentre la stazione MC15A è
risultata non classificabile.
A tal proposito occorre precisare come l'emolinfa prelevata dai campioni MC2A (Foce Fortore),
MC11A (Mattinata) e MC15A (Carapelle) abbia mostrato al suo interno la presenza di un’elevata
quantità di organismi presumibilmente parassiti. Non è stato possibile effettuare il riconoscimento
degli organismi suddetti, tuttavia occorre notare come una tale condizione patologica sia
determinante per l'alterazione delle variabili fisiologiche indipendentemente da ulteriori fattori di
stress quali, ad esempio, l'esposizione a sostanze chimiche contaminanti. In Fig. 3 (A-C) sono
riportate alcune immagini rappresentative acquisite durante l'osservazione dei preparati relativi ai
campioni parassitati.
Figura 2.A.: AT14 (Alimi Grande), tempo d’incubazione 60 minuti, ingrandimento 40X.
Figura 2.B.: VM71A (Galeso), tempo d’incubazione 60 min, ingrandimento 40X.
Figura 2.C.: AT9 (Varano), tempo d’incubazione 60 min, ingrandiamneto 40X.
Figura 2.D. VM70A (Tarantola), tempo d’incubazione 60 min, ingrandimento 40X.
Figura 2.E.: MC17A (Ofanto), tempo d’incubazione 60 min, ingrandimento 40X.
Figura 2.F.: VM60A (Capoiale), tempo d’incubazione 45 min, ingrandimento 40X.
Figura 2.G.: VM72A (Cimino), tempo d’incubazione 45 min, ingrandimento 40X.
Figura 2.H.: VM61D (Manfredonia), tempo d’incubazione 30 min, ingrandimento 40X.
Figura 3.A.: MC2A (Fortore), ingrandimento 40X
Figura 3.B.: MC15A (Carapelle), ingrandimento 40X
Figura 3.C.: MC15A (Carapelle), ingrandimento 40X
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