assorbimento intestinale del grasso nel neonato pretermine
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assorbimento intestinale del grasso nel neonato pretermine
UNIVERSITÀ POLITECNICA DELLE MARCHE SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA DELLA FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA Curriculum: PATOLOGIE IMMUNOMETABOLICHE, DEGENERATIVE ED INFETTIVE IX° Ciclo ASSORBIMENTO INTESTINALE DEL GRASSO NEL NEONATO PRETERMINE mo Referente: Chiar. Dottorando: Dr.ssa Lorena Angelini Prof. P.E. Varaldo Relatore: Chiar.mo Prof. Virgilio P. Carnielli Anno Accademico 2009-2010 INDICE 1.INTRODUZIONE 1.1 lipasi 1 3 1.1.1 lipasi gastrica 3 1.1.2 lipasi pancreatica 4 1.1.3 lipasi stimolata dai Sali biliari 5 1.1.4 metabolismo degli acidi biliari 6 1.2 strategie nutrizionali per aumentare l’assorbimento del grasso nel neonato 9 pretermine 1.2.1 Trigliceridi a media catena 9 1.2.2 Olio di palma 15 1.2.3 Impatto della posizione strutturale dell’acido palmitico 18 2. OBIETTIVO DELLO STUDIO 20 3. MATERIALI E METODI 20 3.1 Soggetti in studio e reclutamento 20 3.2 Metodi analitici 24 3.2.1 Gas-cromatografia 3.3 Analisi statistica 25 27 4. RISULTATI 27 5. DISCUSSIONI E CONCLUSIONI 34 6. BIBLIOGRAFIA 37 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 1 .INTRODUZIONE L’assorbimento dei grassi alimentari è fondamentale nell’apporto energetico per la crescita questo è particolarmente vero per quanto riguarda le prime fasi di sviluppo. Nel neonato, e soprattutto nel neonato di peso estremamente basso (ELBW), una parte considerevole dell’apporto alimentare di lipidi non viene assorbita dall’intestino e viene persa con le feci [1] [2] [3] [4]. Questo malassorbimento lipidico determina una perdita energetica cospicua, in maniera particolare nel neonato ELBW, che necessita di apporti calorici elevati per mantenere un tasso di crescita il più possibile vicino a quello intrauterino; obiettivo che difficilmente viene raggiunto stanti le condizioni di malattia e di immaturità gastrointestinale che non consentono un’adeguato apporto di nutrienti nell’ELBWI. La maggior parte dei pretermine nati fra le 24 e le 29 settimane di età gestazionale infatti quando raggiunge un’età gestazionale corrispondente circa al termine della gravidanza presenta un importante ritardo di crescita [5] [6]. Tale ritardo si associa con una riduzione dello sviluppo neurointellettivo nelle successive fasi della vita [7] [8] [9] [10] [11] [12]. I grassi derivanti dalla dieta giocano un ruolo critico nella crescita e nello sviluppo del neonato e rappresentano sia un’importante risorsa energetica sia i componenti dei tessuti neuronali e retinici; questi vengono divisi in tre forme: triacilgriceroli, fosfolipidi ed esteri del colesterolo, i primi costituiscono circa il 98% di tutti i grassi della dieta nel latte umano o nella formula. La digestione e l’assorbimento dei grassi della dieta avviene in tre fasi: 1. la solubilizzazione, l’emulsificazione e l’idrolisi del grasso 2. la riesterificazione degli acidi grassi e la secrezione nei chilomicroni linfatici o il rilascio degli acidi grassi non esterificati nel sistema venoso portale ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 1 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 3. l’assorbimento degli acidi grassi non esterificati o il trigliceride del chilomicrone nei tessuti. Durante la fase digestiva vengono coinvolte le lipasi e i sali biliari necessari per l’attivazione di tali lipasi, inoltre i sali biliari rendono solubili i lipidi per permetterne l’assorbimento; le lipasi coinvolte sono la lipasi gastrica, pancreatica e la lipasi del latte umano. Nell’adulto l’assorbimento del grasso è un processo efficiente in quanto ne viene assorbito il 95%, il neonato pretermine fra le 32 e le 34 settimane gestazionali assorbe il 65-75% del totale, il neonato a termine invece assorbe 8590% del totale [13]. L’inefficienza dell’assorbimento del grasso nel neonato pretermine è legata all’immaturità fisiologica della funzione pancreatica ed epatica, ciò risulta in ridotti livelli della lipasi pancreatica e dei sali biliari. [14] [15] [16]. La qualità della composizione del grasso, come la lunghezza della catena, il grado di insaturazione degli acidi grassi del latte materno o formula modula l’efficienza dell’assorbimento del grasso. Gli acidi grassi insaturi e gli acidi grassi saturi a media catena (MCT) sono assorbiti in maniera più efficiente rispetto agli acidi grassi saturi a lunga catena (LCFA) come il C14:0, C16:0 e il C18:0 [17] [18] [19] [20]. Le caratteristiche del latte materno come la presenza della lipasi stimolata dai sali biliari [21] [22] [23] e la specifica struttura stereoisomeria dei trigliceridi permette un migliore assorbimento del grasso rispetto alla formula [19] [24] [25]. L’efficacia dell’assorbimento del grasso è legata alle modalità di conservazione del latte materno, i neonati pretermine alimentati con latte fresco assorbono 85-90% del grasso derivante dalla dieta [26]. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 2 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 1.1 LIPASI le lipasi coinvolte nella digestione del grasso posso essere divise in: lipasi gastrica, pancreatica e del latte materno. 1.1.1 lipasi gastrica la lipasi gastrica è prodotta dalle ghiandole localizzate nella mucosa gastrica, si tratta di una glicoproteina il cui peso molecolare è approssimativamente di 52 kilo Dalton (kD) ed è costituita da 379 residui di aminoacidi con un peso molecolare non glicosilato di 43.16 kD. Questo enzima è stabile ad un pH compreso tra 2.5 e 6.5 con un optimun di pH di 5.4, è resistente alla proteasi gastrica e non ha bisogno di cofattori o sali biliari per espletare la propria attività [27] [28] [29]. L’attività della lipasi negli aspirati gastrici è presente nei neonati a 25 settimane di gestazione e resta costante fino a 34 settimane per poi aumentare di circa il 40% rispetto al livello precedende e rimane allo stesso livello fino al termine di gestazione [28]. La produzione di lipasi gastrica nella fase post prandiale nei neonati pretermine è uguale a quella di adulti nutriti con dieta ad alto contenuto di lipidi (23±5 vs 23±3 UI/kg rispettivamente) ed è più alta rispetto a quella di adulti alimentati con dieta a basso contenuto lipico (5.2 ± 1.3 UI/kg) in quanto la produzione della lipasi è stimolata dal contenuto lipidico della dieta [30] [31]. Il sito selettivo dell’indrolisi è la posizione Sn-3 del trigliceride con il rilascio di acidi grassi liberi e il di gliceride Sn-1,2. Gli acidi grassi polinsaturi a media e lunga catena del latte sono localizzati principalmente a questa posizione e sono efficientemente liberati dalla lipasi gastrica [4] La natura idrofobica della lipasi gastrica permette all’enzima di penetrare nel globulo di grasso del latte e idrolizzare quindi il trigliceride, questa attività permette la ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 3 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ digestione della materia grassa del latte attraverso la lipasi pancreatica e la lipasi stimolata dai sali biliari. Studi iniziali in vitro hanno indicato che la preincubazione con la lipasi gastrica porta ad un’aumento di 20 volte l’idrolisi successiva dei trigliceridi nei globuli di grasso del latte, attraverso la lipasi pancreatica [32]. I prodotti della lipasi gastrica promuovono l’emulsificazione dei trigliceridi nello stomaco e aumentano l’affinità della lipasi pancreatica e colipasi alle goccioline di grasso che assicurano un’efficiente digestione del grasso nel duodeno [32] [33] [34] [35]. La lipasi gastrica permette l’idrolisi del 3-12% dei grassi della dieta [33]. Nei neonati questa attività è aumentata del 15-30% [36] e nei bambini pretermine la lipasi gastrica gioca un ruolo fondamentale nella digestione del grasso come indicato da una più alta escrezione del grasso nei neonati alimentati con nasodigiunale (23.0 ± 2.9%) rispetto a quelli alimentati con il sondino nasogastrico (14.9 ± 1.7%) [37]. 1.1.2 lipasi pancreatica Il succo pancreatico contiene due enzimi che sono attivi nella digestione intestinale. La colipasi pancreatica lipasi dipendente (CLD) è un polipeptide di 449 aminoacidi con un peso molecolare di 48 kD e un pH ottimale compreso fra 6.5-8.0 [38]. La CLD è inibita dai Sali biliari che si trovano nel duodeno, questa inibizione è invertita dalla colipasi pancreatica, una proteina che è secreta come una procolipasi ed è attivata dalla tripsina. La colipasi riconosce e lega una molecola di trigliceride in presenza dei Sali biliari, mentre una lipasi riconosce e lega questo complesso colipasi-TG. La CLD è molto più attiva contro il substrato emulsionato insolubile che contro quello solubile ed idrolizza i trigliceridi in posizione Sn 1 e Sn3 liberando 2-monoacilgliceroli e gli acidi grassi liberi [39]. L’attività della lipasi durante la ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 4 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ piccola età gestazionale (SGA) è più bassa di quella trovata nei bambini prematuri con appropriata età gestazionale (AGA), questo suggerisce che la lipasi pancreatica abbia potuto risentire della privazione dei nutrienti in utero [4]. Un’altra lipasi, la carbossilestere lipasi (CEL), è una glicoproteina di 100 kD e costituisce il 4% del totale delle proteine nel succo pancreatico di un’adulto, è molto più attiva contro substrati micellari solubili che contro i substrati emulsionati insolubili. Queste lipasi sono presenti a basse concentrazioni dopo la nascita e nei bambini pretermine la concentrazione è più bassa che nei neonati a termine. Durante la prima settimana di vita, l’attività della lipasi aumenta circa quattro volte nei neonati pretermine, ma un’aumento verso valori dell’adulto si verifica durante il primo anno di vita [14]. 1.1.3 Lipasi stimolata dai Sali biliari la lipasi del latte materno fu la prima ad essere descritta nel 1953 [40] e da allora la lipasi del latte umano fu rilevata e caratterizzata. La lipasi stimolata dai Sali biliari (BSSL) possiede 722 residui di aminoacidi ed ha un peso molecolare di circa 90 kD. La lipasi stimolata dai Sali biliari sembra essere un’enzima costitutivo delle ghiandole mammarie in quanto è indipendente dal volume di latte, l’attività è simile sia durante la lattazione che durante lo svezzamento [41] [42]. Le caratteristiche dell’enzima (cinetica, concentrazione enzimatica, optimum di pH, stabilità del pH, ed effetto dei Sali biliari) sono simili indipendentemente dalla durata della gravidanza o della lattazione. L’attività nel latte è costante e non cambia durante il giorno o all’interno dell’alimentazione [43]. La nutrizione materna sembra interessare questa attività, il latte di donne malnutrite ha più bassa attività enzimatica rispetto a quelle meglio nutrite [44]. La BSSL ha un massimo di attività tra un pH neutrale e alcalino di 7.3-8.6, anche se in realtà il 45____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 5 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 70% del massimo di attività si sviluppa ad un pH compreso tra 6.2-6.8, questo è il pH del piccolo intestino superiore del neonato pretermine. Questo enzima è stabile ad un pH di 3.5 per un’ora, tale proprietà lo rende adatto a sopravvivere nello stomaco con una piccola perdita di attività [41]. La BSSL è attivata dai Sali biliari primari, colato e chenodeossicolato, ad una concentrazione trovata nel duodeno dei bambini pretermine (1-2 mM) che è al di sotto della concentrazione critica micellare. Il legame tra la BSSL e i Sali biliari protegge l’enzima dall’inattivazione da parte del calore e dalla proteolisi messa in atto dalla tripsina e chemotripsina [21]. La BSSL idrolizza i trigliceridi senza specificità di posizione, i principali prodotti sono acidi grassi liberi che vengono assorbiti più rapidamente dei mono gliceridi in presenza di basse concentrazioni intraduodenali di Sali biliari come nei nati pretermine [21] [45]. Questa funzione permette alla BSSL di completare l’idrolisi del digliceride e monogliceride prodotti rispettivamente dalla lipasi pancreatica e gastrica. Un’ altro ruolo importante della BSSL è la capacità di idrolizzare gli esteri del retinolo perché l’efficiente assorbimento di questa vitamina richiede la precedente idrolisi. Degli studi in vitro hanno suggerito che la BSSL potrebbe avere un ruolo per un utilizzo più efficiente degli acidi grassi polinsaturi a lunga catena del latte umano [46]. L’attività dell’enzima è stabile durante la conservazione del latte a -20°C e tra i 1525°C per 24 ore. Mentre la pastorizzazione del latte permette l’inattivazione della BSSL che causa un ridotto assorbimento del grasso del 30% [47]. 1.1.4 Metabolismo degli acidi biliari La biosintesi degli acidi biliari inizia nel fegato a partire dal colesterolo, l’acido colico e chenodesossicolico sono i primari acidi biliari, nell’adulto il rapporto dell’acido colico sull’acido chenodesossicolico è approssimativamente 1.5:1.0. Gli acidi biliari primari sono metabolizzati, dall’azione della microflora intestinale, in ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 6 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ acido deossicolico, litocolico, e ursodeossicolico, chiamati acidi biliari secondari. Acido colico rappresenta il 40% degli acidi biliari totali, il chenodesossicheolico il 37% e l’acido desossicolico il 20%. Gli acidi biliari sono coniugati nel fegato con la glicina o la taurina prima di essere escreti nella bile, il rapporto di glicina coniugata agli acidi biliari e quello di taurina coniugata agli acidi biliari è approssimativamente 3:2 [48] [49]. Gli acidi biliari coniugati sono escreti dal fegato nella bile e vengono concentrati nella cistifellea a circa un quinto del volume originale, successivamente alla contrazione della cistifellea la bile è scaricata nel duodeno. Gli acidi biliari ad alte concentrazioni si aggregano per formare dei complessi molecolari chiamati micelle che presentano la regione idrofobica orientata all’interno e la regione idrofilica verso l’esterno. La concentrazione alla quale l’acido biliare monomerico si aggrega a formare delle micelle viene detta “ critical micellar concentration” (CMC), sotto condizioni fisiologiche di digiuno la CMC è in un range compreso tra 1-2 mM. Gli acidi biliari sono assorbiti per la maggior parte nell’ileo, negli adulti normali il 95-98% degli acidi biliari coniugati sono assorbiti attraverso un meccanismo di trasporto attivo nell’ileo in modo tale che solo il 2-5 % dei sali biliari secreti ogni giorno viene perso con le feci [13] [48] [49]. La quantità totale di sali biliari contenuti nella circolazione enteropatica viene chiamata pool di sali biliari., nell’adulto è circa 3g, e tale quantità resta costante a causa del meccanismo di feedback per cui la quantità di sali biliari persi ogni giorno è sostituta dalla sintesi epatica di nuovi sali biliari [50]. La sintesi degli acidi biliari aumenta progressivamente durante la gestazione e a 22-26 settimane gestazionali i principali acido biliari della cistifellea fetale sono la taurina coniugata all’acido biliare colico e chenodesossicolico[51]; nel feto la coniugazione della taurina è il processo principale, i coniugati della glicina sembrano essere predominanti durante l’infanzia. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 7 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ L’acido colico è predominante alla nascita, entro il primo mese di vita la sintesi dell’acido chenodesossicolico aumenta e la proporzione fra acido colico e chenodeossicolico rientra nei valori normali di 1.2:1 [52]. Il metabolismo dell’acido biliare nei bambini è caratterizzato dall’immaturità dei differenti steps. Il neonato ha un più basso pool di acido biliare rispetto all’adulto; uno studio, che ha utilizzato la tecnica della marcatura con isotopi non radioattivi, ha mostrato che la media della quantità del pool dell’acido colico nei neonati a termine era 290±36 mg/m² mentre il pool degli adulti di 605±122 mg/m². Il tasso medio della sintesi dell’acido colico nel bambino è stato trovato essere di 110±20 mg/m²/die rispetto a quello dell’adulto 194±28 mg/m²/die [13]. La quantità del pool di acido biliare del neonato prematuro era ulteriormente ridotto, approssimativamente, da un mezzo ad un terzo rispetto al neonato nato a termine [13]. Bohem e collaboratori [16] hanno trovato che la concentrazione degli acidi biliari nel succo duodenale, misurato durante i primi sessanta giorni di vita, aumentava significativamente, e di continuo fino alla fine del periodo di osservazione. Altri steps della circolazione enteropatica sono alterati, in effetti è stato notato che a digiuno, nel siero, i livelli di acido colico coniugato e acido chenodesossicolico coniugato nei primi anni di vita sono significativamente più alti rispetto a quelli dell’adulto sano e gradualmente si riducono fino a raggiungere i valori dell’adulto alla fine del primo anno [53]. Questi dati suggeriscono che la capacità di secrezione e la clearance degli acidi biliari del siero attraverso il fegato è deficitaria e quindi responsabili della colestasi fisiologica. La bassa quantità del pool di acido biliare e l’incapacità di escrezione spiega la bassa concentrazione di acido biliare intraluminale trovata nei neonati soprattutto nei pretermine mentre la concentrazione media totale di acidi biliari nei fluidi duodenali era 1.8 mM; questo è in contrasto con i livelli medi di 5.3 mM nei neonati a termine, 7.0 mM nei bambini più grandi e 8.5 mM negli adulti [54] [55]. Gli acidi biliari ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 8 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ giocano un ruolo critico nel promuovere la lipolisi attraverso l’attivazione della lipasi pancreatica e del latte materno [13] [16] [49]. L’aggregazione degli acidi biliari nelle micelle è essenziale solo per garantire un’efficiente trasporto e assorbimento dei nutrienti insolubili nell’acqua. Questo include il prodotto di lipolisi come gli acidi grassi e monogliceridi e altri lipidi come il colesterolo e le vitamine solubili A, D, E ,K. Nei neonati pretermine la bassa concentrazione degli acidi biliari intraluminali non favorisce l’aggregazione per formare le micelle, quindi la digestione dei grassi alimentari è alterata, eccetto per gli acidi grassi medi e corti che sono assorbiti in assenza dei sali biliari . 1.2 STRATEGIE NUTRIZIONALI PER AUMENTARE L’ASSORBIMENTO DEL GRASSO NEL NEONATO PRETERMINE 1.2.1 Trigliceridi a media catena I trigliceridi a media catena (MCTs) sono acidi grassi saturi con catene di lunghezza che variano da C6 a C12, sono ottenuti dall’idrolisi e frazionamento dell’olio di cocco, il preparato MCT contiene C6 dall’1 al 2%, C8 dal 65 al 75%, C10 dal 25 al 35% ed il C12 dal 1 al 2%. Il punto di ebollizione degli acidi grassi a media catena (MCFAs) è molto più basso (C8:0 a 16,7°C, il C10:0 a 31.3° C) rispetto a quello degli acidi grassi a lunga catena (LCFAs) (C16:0 ha una temperatura di ebollizione di 63.1°C), di conseguenza gli MCFAs sono liquidi a temperatura ambiente [56]. Il latte materno delle madri dei neonati a termine e dei neonati pretermine possono contenere fino al 10% di MCTs [57] mentre le formule per i neonati pretermine negli USA contengono il 50% e in Europa percentuali variabili dallo 0 al 25% del grasso come MCTs. L’aggiunta degli MCTs nella formula dei neonati pretermine è dovuta ad una migliore digestione e assorbimento rispetto agli LCTs. Gli MCTs sono ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 9 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ relativamente solubili in acqua e il loro basso peso molecolare rispetto agli LCTs facilita la digestione attraverso la lipasi e l’assorbimento intestinale perfino in presenza di bassi livelli di sali biliari e ridotti livelli di lipasi pancreatica [56]. Gli MCFAs sono principalmente trasportati nel fegato attraverso la vena porta, solo una piccola quantità di MCFAs viene trovata nei chilomicroni degli MCTs del latte umano, mentre gli LCFAs e monoacilgliceroli sono riassemblati nel triacilglicerolo nell’enterocita e secreto nella linfa come componente dei chilomicroni [58]. Studi che confrontano l’assorbimento del grasso nelle formule dei pretermine, con aggiunta di MCTs a differenti concentrazioni, hanno evidenziato quasi completo assorbimento intestinale degli MCFAs [59] [60]. Il confronto tra formule con e senza MCTs documenta un miglioramento nell’assorbimento del grasso nelle formule con MCTs [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66]. Per esempio Spencer e collaboratori hanno studiato 33 neonati pretermine, clinicamente stabili, a 4-5 settimane di età e hanno trovato un alto assorbimento di grasso dell’83.5% nel gruppo alimentato con il 30% di MCTs confrontato con il solo 71.6% nei neonati alimentati con la formula contenete 1.4% di MCTs; la loro conclusione è stata che il miglioramento è largamente dovuto al quasi completo assorbimento del C8:0 e del C10:0 i quali rappresentano una porzione elevata di grasso nella formula con MCTs [66]. Sebbene in stessi studi non è stato osservato un differente assorbimento di grasso, tra questi Hamosh e collaboratori hanno trovato lo stesso assorbimento degli acidi grassi in venti prematuri appropriati per età gestazionale ad età post natale di 3.13±0.71 settimane (4.33±0.91 settimane) alimentati con formula contenete il 50% 14% e 1,5 % di MCTs [67]. Hanno notato che sia gli MCFAs che LCFAs non saturi erano idrolizzati nello stomaco dei neonati. Tutto ciò conferma che gli MCTs sono meglio assorbiti in confronto agli acidi grassi a lunga catena (C16:0. C18:0) e l’assorbimento degli acidi grassi polinsaturi (C18:1 e C18:2n6) risulta alto [60] [66]. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 10 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ L’uso degli MCTs nelle formule pretermine riduce la formazione dei saponi insolubili di calcio e magnesio e quindi aumenta il loro assorbimento [59] [68], così l’equilibrio del bilancio dei minerali può essere migliorato con l’uso degli MCTs nelle formule. L’aumento dell’assorbimento del grasso con gli MCTs tuttavia non si associa ad una aumentata crescita nei neonati pretermine [65] [69]. Whyte e collaboratori [69] hanno notato che il 46% di MCTs nella formula non consente un vantaggio nutrizionale nella digeribilità o nella metabolizzazione di energia delle formule ne una differenza nel bilancio energetico e nell’aumento del tasso di crescita nei neonati con basso peso alla nascita alimentati con la formula. Il più basso contenuto di energia degli MCFAs rispetto agli LCFAs (34 Kj vs 39 Kj/g) può portare solo ad un piccolo vantaggio in termini di aumento di energia, al 7% di aumento nella digeribilità dei grassi, come riportato da Okamoto e collaboratori [63] ci si potrebbe aspettare un aumento del 2% dell’energia digeribile, un effetto di dubbio significato biologico. L’alto effetto termogenico degli MCTs può spiegare la mancanza di energia disponibile [70] [71]. Gli MCTs sono ossidati più rapidamente rispetto agli LCTs [72] [73] [74] [75]. Nel fegato gli MCTs attraversano la membrana mitocondriale più facilmente degli LCTs grazie all’indipendenza del sistema di trasporto della carnitina; recenti studi hanno portato alla luce che la carnitina gioca un ruolo fondamentale nel metabolismo degli MCTs della dieta nell’uomo [76] [77]. Nei mitocondri gli MCTs vengono β-ossidati, tuttavia l’alta concentrazione degli MCTs nella formula pretermine impedisce la completa ossidazione mitocondriale. Sulkers e collaboratori usando la tecnica degli isotopi stabili hanno visto che le formule contenenti il 40% di C8:0 e C10:0 non più del 47% degli MCTs era ossidato sia nei bambini a termine che in quelli pretermine [78]. L’aumento dell’acetyl CoA risulta in un aumentata ω-ossidazione degli acidi grassi. Il processo coinvolge il citocromo p-450 nel reticolo endoplasmatico e l’escrezione ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 11 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ dell’acido di carbossilico (DCA) prodotto nelle urine [79] [80]. L’escrezione del DCA rappresenta lo 0.7% degli MCTs assunti con la dieta per cui la quantità di energia persa con le urine è bassa. Attualmente non ci sono evidenze che i valori trovati nei neonati alimentati con formula contenente il 40% di grassi come MCTs siano nocivi, la concentrazione del DCA è inoltre più bassa rispetto al valore di DCA responsabile di effetti neurologici avversi [81] [82] [83]. Alte concentrazioni di 3idrossibutirrato sono state trovate nei neonati alimentati con il 50% contro il 25% di MCTs nella formula [84], il valore di chetonemia era simile a quello riportato per i neonati a termine allattati al seno [85]. I chetoni nel corpo giocano un ruolo importante nel metabolismo dei neonati soprattutto nel cervello dove il loro uso come substrati per la sintesi del colesterolo della mielina, acidi grassi [86] sono ossidati ad elevati tassi [87]. Gli acidi grassi a media catena contribuiscono poco al deposito di grasso nei tessuti, analisi gas cromatografiche degli acidi grassi del tessuto adiposo dei neonati pretermine alimentati con formula contenente il 44% e il 51 % di MCTs come grassi, ha evidenziato che il C8:0 e il C10:0 sono mal incorporati nei grassi corporei mentre l’utilizzo del C12:0 aveva indicato una stretta correlazione con l’apporto della dieta [88]. Un possibile effetto positivo dell’assunzione di MCT è legato alla rapida ossidazione di una gran quantità di MCTs assunti con la dieta che possono ridurre l’ossidazione del glucosio e di acidi grassi polinsaturi [89] [90] con la potenziale utilizzazione di questi metaboliti in altri pathway metabolici come la lipogenesi. L’assunzione degli MCTs causa una profonda modificazione nel pattern dei lipidi plasmatici e il loro effetto sul metabolismo degli acidi grassi essenziali è controverso, la capacità dei neonati pretermine nell’allungare la catena degli MCTs provenienti dalla dieta è stato messo in evidenza con gli isotopi stabili [91]. I prematuri alimentati con il 4050% di grassi sottoforma di MCTs risultano avere un significativo aumento di ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 12 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ MCFAs nel plasma maggiormente come acidi grassi liberi o incorporati nei triacilgliceroli, gli MCTs inoltre sembra che aumentino la lipogenesi degli acidi grassi saturi a lunga catena e aumenti l’ossidazione del glucosio che a sua volta può essere responsabile per l’aumento del tasso metabolico e la produzione di calore del bambino [92] [71]. Studi in neonati pretermine hanno mostrato, ad esempio, che l’acido stearico è ossidato solo al 50% nelle formule prese dai bambini e che gli acidi grassi a media catena sono utilizzati per sintetizzare gli acidi grassi polinsaturi a lunga catena [78] [91] Altri studi hanno evidenziato alti livelli di acido palmitico e stearico nei lipidi e tessuto adiposo in umani e animali alimentati con MCTs [93] [94]. Sarda e collaboratori nel 1987 [88] hanno suggerito che gli MCTs non sono solamente usati come fonte di energia ma hanno anche visto che formule contenenti circa il 30-40% di MCTs hanno provocato un’aumento di circa il 12.9% di acidi grassi a media catena che sono immagazzinati nei grassi subcutanei. È stata anche trovata una più alta concentrazione di acido palmitico nel tessuto adiposo dovuto all’aumento degli MCTs suggerendo che quest’ultimi partecipano all’allungamento e alla sintesi dell’acido palmitico, ciò è in linea con i risultati riportati da Carnielli e collaboratori nel 1994 [91]. Wall e collaboratori [95] hanno usato un porcellino come modello per suggerire che gli MCTs interferiscono con la sintesi dei PUFA a lunga catena, in questo studio è stato trovato un aumento della concentrazione dell’acido palmitico e oleico in tutte le classi lipidiche con diminuzione dell’acido arachidonico che è importante per la crescita e lo sviluppo dei bambini. Mentre l’ipotesi che un’alto contenuto di MCT possa diminuire la sintesi dei PUFA a lunga catena indebolendo il metabolismo degli acidi grassi essenziali non è riportata [90] [96] [95]. Carnielli e collaboratori [96] hanno studiato gli effetti, di un alto contenuto di MCT (HCMCT 47% 8:0 + 10:0 mol of fat blend) e basso contenuto di MCT ( LMCT 4.8% 8:0 + 10:0 mol of fat blend), nelle formule, sia sui lipidi del plasma che ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 13 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ sulla concentrazione degli acidi grassi del plasma e sul metabolismo degli acidi grassi essenziali in 20 neonati pretermine, alimentati con formula per più di 24 giorni. Nel gruppo degli HMCT sono state trovate, nel plasma, alte quantità di acidi grassi a media catena. Non c’erano differenze di acido palmitico e oleico nei due gruppi indicando che la sintesi de novo degli acidi grassi a lunga catena dagli MCTs ha generato Acetyl CoA nei neonati alimentati con formula HMCT. Inoltre il DHA dei fosfolipidi del plasma era significativamente più basso nel gruppo HMCT, gli autori suggeriscono che alti livelli di MCTs potrebbero competere con la betaossidazione perisossomiale che è coinvolta nella retroconversione dei PUFAs a lunga catena ed anche la sintesi del DHA. Gli autori concludono che l’uso degli MCTs nei pretermine aumenta la lipogenesi e interferisce con il metabolismo del DHA, sebbene altri studi suggeriscono che gli MCTs non interferiscono con il metabolismo degli acidi grassi essenziali [90]. Altri studi hanno valutato l’effetto di una formula con MCTs( 37% MCTs e 63% LCTs) contro una formula con il 100% di LCTs andando a studiare la termoregolazione e il sonno di 17 neonati pretermine [97]. Ogni bambino veniva alimentato per tre giorni consecutivi e misurato il cibo ingerito, tasso metabolico, temperatura e sonno. È stato dimostrato che il gruppo MCTs aveva un maggior aumento di energia ( 63.3 Kj/Kg/die), tasso metabolico (1.8 Ml O2 consumo/min Kg) temperatura cutanea (0.31°C) e aumentate ore di sonno (52 min) rispetto al gruppo degli LCTs. Nel gruppo degli MCTs si era anche riscontrato un aumento della massa corporea rispetto al gruppo degli LCTs (16 g/kg vs. 15 g/kg)senza raggiungere però significatività. Gli autori notano che le differenze nell’assunzione di cibo sono molto probabilmente dovute ad una minore sazietà data dagli MCTs, a causa di uno svuotamento gastrico più veloce rispetto agli LCTs. L’aumento della temperatura è forse legato all’aumento del dispendio energetico nel gruppo MCT. L’aumento delle ore di sonno nel gruppo degli MCTs era attribuito ad ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 14 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ un risveglio ritardato rispetto a quello degli LCTs. Gli autori hanno correlato questo risveglio anticipato del gruppo con gli LCTs ad una componente comportamentale dell’alimentazione ossia i bambini che vengono nutriti con gli LCTs sono meno sazi per cui si svegliano prima e più volte rispetto al gruppo degli MCTs che dorme più ore. Tutto ciò ci fa intuire che manipolando i lipidi delle formule possiamo avere delle implicazioni fisiologiche importanti. Con questo studio di breve durata è difficile valutare se l’aumento di temperatura, il dispendio di energia e l’ingestione di cibo avrà un impatto positivo o negativo per il bambino. Gli autori dichiarano che la formula con LCTs può dare giovamento per ciò che concerne la sazietà e che invece una formula con MCTs può aiutare il neonato a mantenere la temperatura corporea. Gli MCTs come maggior fonte di grasso nelle formule dei bambini può migliorare l’assorbimento del grasso e del calcio rispetto all’olio di palma. Uno studio ha comparato una formula, per neonati nati con basso peso, con il 38% di MCTs contro una formula con il 6% di MCTs ed è stato riscontrato un più alto assorbimento di grasso nel gruppo con contenuto di MCTs al 38% (88% vs79%), è stato anche visto che c’era un maggior assorbimento di calcio (73% vs 60%) e magnesio [65] [68]. Altri studi usando l’olio di cartamo e gli MCTs derivanti dall’olio di soia e di cocco (30% e 28% rispettivamente) hanno riscontrato un assorbimento di calcio del 57.4% [98], mentre uno studio usando il 60% di olio di soia e il 40% di olio di cocco hanno visto che l’assorbimento di calcio era del 48.4% [99]. 1.2.2 Olio di palma L’ olio di palma è un olio vegetale ricco di acido palmitico, l’oleina di palma è una frazione con un punto di ebollizione più basso dell’olio di palma e contiene il 40% di acido palmitico e il 43% di acido oleico. Molte formule per bambini che si trovano in ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 15 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ commercio usano oleina di palma per uguagliare l’acido palmitico ed oleico, contenuto nel latte umano. Tuttavia, l’acido palmitico nell’oleina di palma è principalmente concentrato sui siti Sn-1 Sn-3 del trigliceride a differenza dell’acido palmitico nel latte umano che è prevalentemente esterificato nella posizione Sn-2 o Beta. L’acido palmitico nelle posizioni Sn-1 e Sn-3 è assorbito meno rispetto alla posizione Sn-2 e questo avviene sia nei roditori che nei bambini [100] [101] [102] [103]. Alcuni studi hanno mostrato che quando l’oleina di palma viene usata come grasso principale, l’assorbimento dei grassi e del calcio è significativamente più basso di quando non è presente, ciò può essere spiegato dal ridotto assorbimento dell’acido palmitico e dalla formazione di saponi insolubili calcio-palmitato. In uno studio incrociato randomizzato dove 11 bambini alimentati con formula contenente l’oleina di palma (53% della miscela, 24.9% di acido palmitico) contro una formula contenete 60% di olio di soia , 40% olio di cocco (9.5 % di acido palmico) si è visto che l’assorbimento di grasso totale era il 4.6% più basso (p<0.001) per il gruppo che assumeva l’oleina di palma [99]; l’assorbimento di calcio era il 9.6% più basso (p<0.001) per il gruppo dell’oleina di palma. In un altro trial con 10 bambini, sono state usate due formule, di cui una consisteva di oleina di palma (45%) con soia, cocco e olio di cartamo e l’altra invece con olio di cartamo, cocco e soia [98]. L’escrezione fecale era di 0.44g/kg/die più alta (p<0.001) nel gruppo dell’oleina di palma, inoltre l’assorbimento del grasso era l’8.5% più basso (p<0.001) rispetto al gruppo alimentato con formula contenete solo olio di cocco, di soia e cartamo. Questa riduzione dell’assorbimento del grasso era, molto probabilmente, dovuta al ridotto assorbimento di acido palmitico e stearico. L’escrezione del calcio fecale era 16mg/kg/die (p<0.001) nel gruppo con l’oleina di palma, inoltre l’assorbimento di calcio sempre in tal gruppo era il 19.9% più bassa rispetto all’altro gruppo. Gli effetti della riduzione dell’assorbimento del calcio con ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 16 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ l’oleina di palma sono stati legati a degli effetti clinici come la ridotta mineralizzazione delle ossa. E’ stato inoltre effettuato uno studio su 128 bambini alimentati con formula contenente il 45% di oleina di palma contro una formula contenete olio di cartamo, cocco e soia per sei mesi [104].dove veniva appunto valutata a zero, tre e sei mesi il contenuto di minerali nelle ossa (BMC) e la densità di minerali nelle ossa (BMD). Il BMC e il BMD erano simili tra i due gruppi all’inizio dello studio, ma a 3 mesi, il BMC per il gruppo dell’oleina di palma era 143.8 g rispetto ai 158.2g dell’atro gruppo, questo rappresentava un miglioramento del 10% (p=0.002). A sei mesi, il BMC per il gruppo dell’oleina di palma era 207.8g contro 224.1g, anche qui un miglioramento del 7% (p=0.003). A tre mesi il BMD per il primo gruppo era 0.251g/cm² contro 0.268g/cm² per il gruppo olio di cartamo, cocco, soia rappresentando un miglioramento del 6% (p=0.001). A sei mesi il BMD era rispettivamente 0.290g/cm² contro 0.304g/cm² con un miglioramento del 4% (p=0.01). In un altro studio sono stati dimostrati effetti simili sulla riduzione di accrescimento della massa ossea per via dell’oleina di palma [105]; in questo studio sono stati studiati tre gruppi, uno che veniva allattato al seno, un gruppo riceveva oleina di palma e l’ultimo olio di palma libero per sei mesi. È stato trovato che il gruppo allattato al seno aveva più alta BMC rispetto al gruppo dell’oleina di palma passato il periodo di assunzione. A tre e sei mesi in seguito, nel momento in cui i neonati allattati al seno iniziavano ad essere nutriti con formula a base di oleina di palma l’accrescimento delle ossa in questo gruppo diminuiva; sei mesi dopo, il gruppo che originariamente era allattato al seno (che dopo questo periodo di tempo aveva consumato oleina di palma) e il gruppo dell’oleina di palma aveva l’11.5% di diminuzione del BMC rispetto al gruppo dell’olio di palma originale. Una recente ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 17 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ review ha riportato l’effetto negativo dell’oleina di palma sull’assorbimento del calcio e di grasso nelle formule [106]. In questa review sono riportati nove studi in cui sono state utilizzate formule con oleina di palma e non, in alcune è stato aggiunto il beta-palmitato come fonte di grasso. In questi studi è stato visto che l’oleina di palma era associata, con un impatto significativamente negativo (p<0.05) sul l’assorbimento del grasso, dell’acido palmitico e del calcio. L’assorbimento dell’acido palmitico e del calcio sembra essere più alto nelle formule prive di oleina di palma, mentre il contenuto di minerali nelle ossa era significativamente più basso con formule contenenti oleina di palma. Questi studi mostrano l’effetto negativo dell’oleina di palma sullo sviluppo delle ossa nel primo periodo di vita; in uno studio è stato mostrato che dopo 4 anni, in 178 bambini, l’ BMC e BMD di bambini alimentati esclusivamente con formule contenenti oleina di palma non era differente dai bambini allattati solo al seno o nutriti con formule senza oleina di palma [107]. 1.2.3 impatto della posizione strutturale dell’acido palmitico Nel latte umano l’acido palmitico è veramente abbondante e rappresenta circa il 2025% degli acidi grassi totali ed è principalmente esterificato per il 60-70% in posizione Sn-2 (β) del trigliceride (β-palmitato). Questa posizione dell’acido palmitico nel latte umano consente dei benefici nutrizionali per i bambini promuovendo l’assorbimento dei minerali, assorbimento del grasso e rende le feci meno dure [108] [103] [109] [110]. La struttura chimica degli acidi grassi saturi a lunga catena nei trigliceridi delle formule è differente dal latte umano. Nel latte materno l’acido palmitico esiste principalmente in posizione Sn-2 (β-posizione) mentre gli oli vegetali sono principalmente esterificati in posione Sn-1 e Sn-3 (α-palmitato). La lipasi pancreatica rilascia gli acidi grassi in posizione Sn-1,3 dei trigliceridi per produrre acidi grassi ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 18 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ liberi e 2-monogliridi. Quando l’acido palmitico è presente in posizione Sn-1 o Sn-3, può essere facilmente attaccato dagli enzimi per formare acidi grassi liberi i quali possono legarsi con i minerali come calcio e magnesio e formare dei saponi insolubili. Piuttosto che essere assorbiti, questi saponi insolubili di acidi grassi sono escreti nelle feci che divengono più dure con minore perdita di feci e calcio. Il 2monogliceride è meglio assorbito rispetto agli acidi grassi liberi perché forma una miscela micellare con gli acidi biliari impedendo la formazione di saponi insolubili con calcio e magnesio. Degli studi hanno dimostrato che l’assorbimento dell’acido palmitico del latte umano è più alto di quello presente nelle formule [19] [111] [112] [7] [87] [88]. In uno studio su neonati a termine è stato visto che usando una formula con grassi derivanti dal lardo (contente 85% di acido palmitico in posizione Sn-2), l’acido palmitico esterificato in posizione Sn-2 del grasso della dieta era meglio assorbito del grasso esterificato in posizione Sn1-3 [111] [102]. Tuttavia, Verkade e collaboratori [2][3] [90] [91] non ha trovato un miglioramento nell’assorbimento del grasso nel neonato pretermine alimentato con formula, contenente grasso modificato rispetto alle formule standard. Studi recenti [112] [108] [103] [109] in neonati a termine e non hanno stabilito che usando trigliceridi sintetici con struttura isomerica simile a quelli del latte umano, aumenta significativamente l’assorbimento intestinale dei maggior acidi grassi saturi (acido miristico palmitico e stearico) e nei neonati a termine anche l’assorbimento totale del grasso. Bambini alimentati con β-palmitato avevano più alti livelli di acido palmitico nei trigliceridi del plasma rispetto ai neonati alimentati con α-palmitato [113] [114]. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 19 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 2.OBIETTIVO DELLO STUDIO Questo studio è parte di uno studio multicentrico prospettico randomizzato crossover, doppio cieco, BSSL-020 supportato dalla ditta farmaceutica biovitrum, effettuato su neonati pretermine per confrontare l’assorbimento del grasso e la crescita con l’aggiunta della lipasi stimolata dai sali biliari ricombinante (rhBSSL). Abbiamo misurato la quantità totale di grasso fecale, gli acidi grassi fecali, i lipidi del plasma e la composizione degli acidi grassi dei fosfolipidi e trigliceridi in neonati pretermine alimentati sia con rhBSSL che senza. La formula è stata fornita dalla ditta Ordesa . 3.MATERILI E METODI 3.1 soggetti in studio e reclutamento In questo studio abbiamo analizzato i dati dei neonati pretermine reclutati dai tre dei cinque reparti di terapia intensiva neonatale che hanno partecipato a questo studio; i centri coinvolti sono il reparto di Neonatologia dell’ospedale “G salesi” di Ancona, la Neonatologia del policlinico gemelli di Roma e la neonatologia del Policlinico Universitario di Padova; lo studio è stato effettuato nel periodo che va da Marzo 2008 a aprile 2009. I neonati pretermine nati ad un’età gestazionale inferiore alle 32 settimane e alimentati esclusivamente con la formula sono stati arruolati dopo consenso informato di entrambi i genitori. I neonati che ricevevano un’altra formula precedentemente all’arruolamento sono stati fatti passare dalla formula che stavano prendendo a quella dello studio il giorno dell’arruolamento. I criteri di esclusione dallo studio erano: - neonati che ricevevano nutrizione parenterale ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 20 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ - neonati che ricevevano latte fortificato - neonati sotto ventilazione meccanica - neonati piccoli per l’età gestazionale - neonati che ricevevano FiO2 > 30% - neonati sotto fototerapia - neonati con emmoragie intra ventricolari di III o IV grado, meningiti o idrocefalo, leucomalacia periventricolare - dismorfismi o malattie congenite che incidevano sulla crescita e lo sviluppo - neonati con PDA ( dotto arterioso persistente) - evidenze cliniche di sepsi - documentate infezioni congenite (CMV) - presenza di enterocolite necrotizzante - emorragie polmonari - trattamento con corticosteroide, eccetto idrocortisone - arruolamento in altri studi clinici le caratteristiche cliniche sono riportate in tabella 1. Tabella 1. Caratteristiche cliniche dei 25 neonati pretermine Characteristiche M±SD Età Gestazionale (giorni) Peso nascita (g) Giorni di vita all’entrata dello studio Quantità di latte (ml•kg-1•day-1) 207±7 1225±287 23±10 164±3 I neonati erano randomizzati a ricevere formula con rhBSSL in 0.15 g/l o formula senza rhBSSL per i primi sette giorni. Dopo un periodo di wash-out di due giorni il paziente veniva fatto passare all’altro trattamento per ulteriori sette giorni. La ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 21 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ formula data nello studio era fornita dalla Ordesa, la miscela lipidica della formula lattea conteneva diversi oli vegetali (olio di palma, olio di girasole, olio di cocco, olio di soia), la composizione ed il profilo degli acidi grassi sono riportati in tabella 2 e 3. La quantità di formula che i neonati dovevano ricevere era determinata pesando i biberon o le siringhe nel caso di alimentazione con sondino naso-gastrico. Il bilancio metabolico era ottenuto con la raccolta delle feci durante gli ultimi tre giorni di ogni periodo di trattamento. L’inizio e la fine della raccolta delle feci erano identificati mediante il rosso carminio. Il rosso carminio veniva somministrato prima del pasto delle dodici il giorno quattro e sette di ogni periodo. Le feci erano raccolte includendo la prima evacuazione con il rosso carminio ed escludendo l’ultima con rosso carminio approssimativamente tre giorni dopo per ogni periodo di trattamento. Abbiamo analizzato 5-10 mg di feci raccolte gli ultimi tre giorni di ogni periodo di trattamento, e 0,2 ml di plasma anti coagulato con EDTA. La separazione del plasma era ottenuta centrifugando il sangue contenuto nella provetta con EDTA a 1200 rpm per 10 minuti Il plasma utilizzato per questa analisi era quello prelevato in eccesso rispetto alle esigenze cliniche di routine. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 22 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Tabella 2. Composizione della formula Sanor preterm (Ordesa) Nutrienti Energia (kJ) (Kcal) Proteine (g) Siero latte (g 65%) Caseina (g 35%) Carboidrati (g) Lattosio Malto destrina Grassi (g) Acido Linoleico (mg) Acido Linolenico (mg) Acido Arachidonico (mg) Acido Docosaesaenoico(mg) Taurina (mg) L-Carnitina (mg) 100 ml 339 81 2.3 1.5 0.8 8.7 6.5 2.2 4.1 689 62 20.5 14.4 5.1 2.7 Tabella 3. Profilo degli acidi grassi della formula Sanor preterm (Ordesa) Acidi grassi C 8:0 C 10:0 C 12:0 C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 trans C 18:1 cis C 18:2 C 20:0 C 18:3 20:4n-6 22:6n-3 Other 18:2/18:3 Saturated Monoinsaturi Poliinsaturaturi %totale acidi grassi 0.5 0.5 7.2 3.0 22.3 0.0 3.3 0.0 40.1 16.6 0.0 1.4 0.5 0.35 4.1 12.1 36.9 40.1 23.0 ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 23 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 3.2 metodi analitici I campioni di feci (5-10mg) stati addizionati con 100µl di standard interno C9-C17 (acido nonanoico ed eptadecanoico) direttamente metilati con HCL-MeOH (Merck Milano) e gli esteri metilici degli acidi grassi estratti con esano. Un µl della miscela è stato iniettato in gascromatografo (modello trace-GC Ultra Thermo Finnigan) con iniettore operante in modalità splitless (280°C) e gli esteri metilici sono stati quantificati con rivelatore fid (290°C) dopo separazione in colonna omegawax, 30m x 0.25mm i.d. x 0.25um f.t (Supelco, milano Italy), utilizzando elio come carrier. Il gascromatografo utilizzava il seguente programma di temperatura: T° iniziale 60°C (3min), prima rampa da 20°C/min fino 200°C (20 min), seconda rampa da 0,4°C/min fino a 205°C (10 min), terza rampa da 0,1°C/min fino a 208°C (2 min), quarta rampa 3°C/min fino a 213°C (10 min), quinta rampa 30°/min fino a 240°C (18 min). Le aree dei picchi sono state calcolate con il software Crhomcard (Thermo Finnigan). Gli acidi grassi sono stati identificati confrontando il loro tempo di ritenzione con una miscela standard (NuCheck Prep, Elysian MN). Per l’analisi delle classi lipidiche i lipidi plasmatici sono stati estratti da 200 µl di plasma secondo il metodo descritto da Folch [115]], dopo aggiunta di acidi grassi dispari come standard interni. Le varie classi lipidiche sono state isolate con la TLC, una tecnica cromatografia adatta per l’esecuzione di valutazioni qualitative. I fosfolipidi e i trigliceridi sono stati trasesterificati con HCL-MeOH (Merck Milano) e gli esteri metilici degli acidi grassi estratti con esano. Anche in tal caso la separazione e l’identificazione dei vari acidi grassi è stata effettuata con le stesse modalità descritte sopra per le feci. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 24 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 3.2.1 Gas cromatografia La gas-cromatografia è una tecnica cromatografia, impiegata a scopo analitico, che si basa sulla diversa ripartizione di diverse sostanze tra una fase stazionaria e una fase mobile, in funzione dell’affinità di ogni sostanza con la fase stazionaria. Le caratteristiche che hanno fatto della gascromatografia una tecnica di larghissimo uso possono essere così riassunte: - tempi di analisi molto ridotti - possibilità di separare, operando nelle opportune condizioni, qualsiasi miscela di sostanze - possibilità di effettuare analisi in serie, in quanto la stessa colonna può essere rigenerata di continuo dal gas di trasporto - alta sensibilità (quantità di sostanza analizzabile 1O-5 - 1O-12 g). Le analisi gas-cromatografiche sono applicabili soltanto a sostanze volatili o comunque rese tali e vengono realizzate con il gas cromatografo. In figura 1 viene riportato lo schema essenziale di un gascromatografo. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 25 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ La bombola contiene il gas che costituirà la fase mobile (carrier), questo viene purificato tramite alcune trappole prima di essere inserito in colonna. La colonna cromatografica contenente la fase stazionaria è posta all'interno di una camera opportunamente termostata allo scopo di tenere in fase gassosa i vari costituenti della miscela da separare. Tramite l'iniettore s’introduce la miscela da analizzare in colonna, questa può essere iniettata in fase gassosa, se la miscela è un gas, oppure solubilizzata in un opportuno solvente se la miscela da analizzare è liquida o solida. Alla fine della colonna viene posto un rivelatore in grado di evidenziare le varie sostanze che fuoriescono in tempi diversi emettendo un segnale con una intensità proporzionale alla loro concentrazione, il segnale viene registrato da uno strumento che darà così luogo al cromatogramma (figura 2) ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 26 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Fig. 2: schema di un cromatogramma 3.3 analisi statistica I dati sono stati espressi come medie e deviazioni standard e analizzati con il T-Test per dati appaiati, la significatività è stata considerata a 0.05. Tutte le analisi statistiche sono state fatte utilizzando il programma SPSS ( versione 15.0; SPSS Inc, Chicago, IL) e microsoft EXCEL (versione 2000; microsoft Corp, Redmond, WA) software. 4.RISULTATI Per questo studio BSSL-020 sono stati arruolati 32 pazienti dai cinque centri partecipanti allo studio. Per questo studio secondario nei tre centri principali sono stati reclutati 25 pazienti. Noi abbiamo collezionato campioni di feci e di plasma durante il periodo di trattamento. per quanto riguarda le feci abbiamo arruolato 21 pazienti, per quanto riguarda il plasma invece 18 pazienti in quanto il resto dei campioni era inadeguato allo studio. La quantità di formula espressa come ml·Kg1 ·day-1 era costante nei due periodi del trattamento per ogni neonato. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 27 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Il contenuto del grasso nelle feci (espresso come mg di grasso/g di feci) era significativamente più basso quando il bambino riceveva la formula con rhBSSL (formula B) rispetto a quando erano alimentati con formula senza rhBSSL (formula A,placebo) (331.54±83.06 mg/g vs 375.13±102.80 mg/g, p=0.045). Abbiamo analizzato la concentrazione fecale dei maggiori acidi grassi (tabella 4). La percentuale di alcuni acidi grassi saturi era significativamente aumentata nel gruppo rhBSSL rispetto al Placebo (14:0: 4.70±0.54 vs 4.43±0.48 mol%, p=0.047; 16:0: 42,06±8.15 vs 37,52±8.11 mol% , p= 0.009; 18:0: 10.88±2.52 vs 9.18±2.35 mol% , p=0.005; 20:0: 0.56±0.13 vs 0.45±0.11 mol%, p= 0.003; 22:0: 0.51±0.13 vs 0.39±0.096 mol%, p=0.002; 23:0: 0.070±0.019 vs 0.050±0.013 mol%, p=0.000; 24:0: 0.21±0.06 vs 0.17±0.04 mol%, p=0.014; 21:0: 0.016±0.005 vs 0.013±0.003 mol%, p=0.026). La concentrazione degli acidi grassi monoinsaturi non era differente tra i due gruppi solo il 16:1n-7e il 16:1n-9 erano più bassi nel gruppo rhBSSL (0,07±0.03 vs 0,09±0.02 mol%, p=0.011 e 0.021±0.009 vs 0.028±0.01 mol%, p=0.003 rispettivamente). Mentre per quanto riguarda gli acidi grassi polinsaturi l’acido linoleico, linolenico e arachidonico (ARA) erano significativamente più bassi nel gruppo rhBSSL che in quello placebo (18:2n-6: 6.05±3.28 vs 8.91±3.61, p=0.007; 18:3n3: 0.28±0.16 vs 0.45±0.23, p=0.011; ARA: 0.19±0.12 vs 0.29±0.14 mol% p=0.026), anche l’acido docosaesanoico (DHA) era più basso nel gruppo rhBSSL ma senza significatività. In tabella 5 sono stati riportati i valori assoluti degli acidi grassi, espressi come mg di acidi grassi/g di feci. Per gli acidi grassi menzionati sopra, il risultato era simile a quello trovato considerando la percentuale degli acidi grassi, abbiamo notato però che il contenuto di alcuni acidi grassi in particolare il DHA e l’acido eicosapentaenoico (EPA) era più basso quando la formula era supplementata con la rhBSSL (22:6n-3: 0,49±00,47 vs 0,83±0,67 mg/g, p=0.046; 20:5n-3: 0,36±0,17 vs 0,45±0,20 mg/g, p=0.026). ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 28 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Tabella 4. Concentratione dei principali acidi grassi fecali dei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula B (rhBSSL) 1 P2 Acidi Grassi Formula A (Placebo) Formula B ( rhBSSL) 8:0 0.28±0.087 0.32±0.098 0.094 10:0 0.5±0.50 0.5±0.10 0.967 11:0 0.002±0.0028 0.0025±0.0028 0.731 12:0 4.72±1.13 5.18±1.37 0.247 13:0 0.014±0.006 0.156±0.008 0.448 14:0 4.43±0.48 4.70±0.54 0.047 14:1n-5 0.007±0.002 0.008±0.003 0.228 15:0 0.06±0.01 0.07±0.01 0.060 16:0 37.52±8.11 42.06±8.15 0.009 16:1n-7 0.09±0.02 0.07±0.03 0.011 18:0 9.18±2.35 10.88±2.52 0.005 18:1n-9 26.91±6.30 23.59±9.21 0.118 18:1n-7 0.57±0.29 0.55±0.28 0.710 18:2n-6 8.91±3.61 6.05±3.28 0.007 18:3n-6 0.057±0.018 0.051±0.013 0.075 18:3n-3 0.45±0.23 0.28±0.16 0.011 20:0 0.45±0.11 0.56±0.13 0.003 20:1n-9 0.17±0.02 0.21±0.18 0.351 20:2n-6 0.016±0.010 0.013±0.0096 0.158 20:3n-6 0.041±0.016 0.034±0.011 0.042 20:4n-6 0.29±0.14 0.19±0.12 0.026 20:5n-3 0.10±0.028 0.09±0.032 0.074 22:0 0.39±0.096 0.51±0.13 0.002 22:1n-9 0.035±0.025 0.036±0.031 0.861 22:2n-6 0.003±0.005 0.002±0.003 0.295 22:6n-3 0.16±0.10 0.10±0.08 0.054 23:0 0.050±0.013 0.070±0.019 0.000 24:0 0.17±0.04 0.21±0.06 0.014 24:1n-9 0.031±0.021 0.029±0.011 0.691 17:1 0.022±0.008 0.021±0.011 0.604 21:0 0.013±0.003 0.016±0.005 0.026 16:1n-9 0.028±0.01 0.021±0.009 0.003 18:1n-9 OH 0.13±0.18 0.11±0.26 0.719 18:0 OH 4.00±3.83 3.26±3.87 0.554 1 2 Values are means ± SD, mol% Paired sample T-Test ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 29 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Tabella 5. valori assoluti dei principali acidi grassi dei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula B (rhBSSL) 1 Acidi grassi Formula A (Placebo) Formula B (rhBSSL) P2 8:0 0.57±0.09 0.57±0.08 0.847 10:0 1.35±1.02 1.16±0.80 0.411 11:0 0.004±0.006 0.005±0.005 0.629 12:0 13.96±5.74 13.32±4.95 0.688 13:0 0.04±0.001 0.04±0.002 0.406 14:0 14.55±4.13 13.48±3.13 0.244 14:1n-5 0.02±0.001 0.02±0.009 0.666 15:0 0.22±0.04 0.21±0.04 0.404 16:0 134.73±31.13 133±28.42 0.804 16:1n-7 0.06±0.02 0.04±0.02 0.009 18:0 35.01±9.96 37.25±8.62 0.263 18:1n-9 107.81±40.68 86.20±42.66 0.034 18:1n-7 2.16±0.7 1.85±0.71 0.134 18:2n-6 35.30±21.72 22.75±15.53 0.034 18:3n-6 0.22±0.11 0.17±0.06 0.022 18:3n-3 1.87±1.25 1.04±0.77 0.014 20:0 1.95±0.59 2.14±0.56 0.158 20:1n-9 0.74±0.28 0.86±0.85 0.509 20:2n-6 0.07±0.04 0.05±0.04 0.068 20:3n-6 0.18±0.08 0.13±0.06 0.018 20:4n-6 1.29±0.87 0.79±0.62 0.027 20:5n-3 0.45±0.20 0.36±0.17 0.026 22:0 1.86±0.59 2.13±0.69 0.074 22:1n-9 0.74±0.28 0.15±0.13 0.000 22:2n-6 0.01±0.02 0,01±0,01 0.382 22:6n-3 0.83±0.67 0.49±00.47 0.046 23:0 0.24±0.07 0.30±0.10 0.008 24:0 0.89±0.34 0.99±0.32 0.237 24:1n-9 0.15±0.10 0.13±0.05 0.335 17:1 0.08±0.04 0.07±0.04 0.347 21:0 0.05±0.01 0.06±0.02 0.171 16:19 0.09±0.04 0.07±0.03 0.000 18:19 OH 0.56±0.76 0.37±0.81 0.235 18:0 OH 15.83±16.49 11.21±14.46 0.319 1 Values are means ± SD, mg/g 2 Paired sample T-Test ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 30 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ La concentrazione dei fosfolipidi del plasma era differente tra i due gruppi (157.02±35.15 vs 155.22±29.20 mg/dl, p=0.82). Neppure la concentrazione dei trigliceridi plasmatici era significativa tra il gruppo placebo e quello rhBSSL (57.32±33.61 vs 57.65±32.94 mg/dl, p=0.95). L’aggiunta della rhBSSL alla formula lattea ha determinato cambiamenti statisticamente significativi nella concentrazione del DHA e ARA dei fosfolipidi plasmatici. Il DHA e ARA dei fosfolipidi del plasma erano significativamente più alti nel gruppo la cui formula era supplementata con la rhBSSL rispetto al gruppo con formula senza supplementazione (22:6n-3: 2.98±0.55 vs 2.72±0.45 mol% p=0.031; 20:4n6: 10.41±0.73 vs 9.92±1.14 mol% p=0.017). I dati sui fosfolipidi e trigliceridi del plasma sono riportati in tabella 6 e 7. Non sono state riscontrate differenze per quanto riguarda gli acidi grassi saturi e monoinsaturi. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 31 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Tabella 6. Concentratione dei principali fosfolipidi plasmatici nei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula B (rhBSSL) 1 Formula A Formula B (Placebo) (rhBSSL) 8:0 0.12±0.08 10:0 P2 P (wilcoxon) 0.12±0.07 0.982 0.879 0.05±0.02 0.05±0.02 0.979 0.811 12:0 0.21±0.08 0.21±0.07 0.877 0.879 14:0 0.61±0.10 0.61±0.11 0.599 0.528 14:1n-5 0.03±0.02 0.03±0.02 0.957 0.811 16:0 31.48±1.86 30.92±1.40 0.158 0.349 16:1n-7 0.88±0.56 0.79±0.65 0.490 0.122 18:0 14.01±1.05 14.37±1.05 0.373 0.500 18:1n-9 11.35±0.97 11.22±0.85 0.619 0.983 18:1n-7 1.88±0.42 1.79±0.51 0.347 0.267 18:2n-6 16.38±2.21 16.60±2.32 0.446 0.286 18:3n-6 0.18±0.06 0.17±0.06 0.277 0.215 18:3n-3 0.07±0.02 0.08±0.02 0.093 0.122 20:0 0.57±0.07 0.56±0.08 0.239 0.248 20:1n-9 0.30±0.08 0.30±0.06 0.600 0.199 20:2n-6 0.36±0.07 0.35±0.07 0.655 0.446 20:3n-9 0.65±0.50 0.53±0.46 0.198 0.102 20:3n-6 3.11±0.52 2.97±0.52 0.065 0.133 20:4n-6 9.92±1.14 10.41±0.73 0.017 0.022 20:5n-3 0.28±0.08 0.26±0.09 0.424 0.349 22:0 0.70±0.10 0.69±0.14 0.178 0.372 22:1n-9 0.07±0.01 0.07±0.02 0.940 0.879 22:2n-6 0.04±0.05 0.03±0.02 0.268 0.233 22:4n-6 0.35±0.06 0.34±0.11 0.484 0.845 22:5n-6 0.40±0.12 0.40±0.11 0.635 0.500 22:5n-3 0.20±0.05 0.20±0.07 0.896 0.679 22:6n-3 2.72±0.45 2.98±0.55 0.031 0.043 24:0 0.45±0.09 0.43±0.08 0.094 0.085 24:1n-9 2.41±0.42 2.35±0.35 0.539 0.349 Acidi grassi 1 Values are means ± SD, mol% 2 Paired sample T-Test ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 32 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ Tabella 7. Concentrazione dei principali triglicedi plasmatici dei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula B (rhBSSL) 1 Formula A Formula B (Placebo) (rhBSSL) 8:0 1.17±1.51 10:0 P2 P (wilcoxon) 0.89±0.79 0.454 0.711 0.47±0.19 0.46±0.17 0.812 0.913 12:0 7.12±2.80 6.90±2.15 0.759 0.711 14:0 3.41±0.54 3.58±0.66 0.163 0.327 14:1-n5 0.03±0.08 0.03±0.08 0.070 0.068 16:0 27.10±2.55 27.16±3.54 0.935 0.811 16:1n-7 4.39±2.71 3.67±2.49 0.336 0.085 18:0 2.91±0.86 2.99±1.07 0.679 0.983 18:1n-9 33.50±3.76 33.79±3.41 0.765 0.948 18:1n-7 2.10±0.73 1.86±0.66 0.152 0.094 18:2n-6 12.63±3.31 13.03±3.01 0.540 0.500 18:3n-6 0.32±0.07 0.31±0.09 0.510 0.372 18:3n-3 0.57±0.14 0.63±0.23 0.320 0.267 20:0 0.04±0.03 0.06±0.05 0.027 0.030 20:1n-9 0.29±0.05 0.30±0.05 0.709 0.616 20:2n-6 0.17±0.04 0.16±0.06 0.899 0.845 20:3n-9 0.32±0.11 0.29±0.14 0.490 0.528 20:3n-6 0.71±0.16 0.84±0.23 0.043 0.085 20:4n-6 1.01±0.24 1.13±0.20 0.093 0.122 20:5n-3 0.11±0.06 0.13±0.05 0.310 0.356 22:4n-6 0.13±0.07 0.14±0.06 0.856 0.918 22:5n-6 0.92±0.18 1.04±0.20 0.081 0.102 22:5n-3 0.03±0.03 0.02±0.03 0.242 0.263 22:6n-3 0.36±0.15 0.38±0.12 0.621 0.586 Acidi grassi 1 Values are means ± SD, mol% 2 Paired sample T-Test ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 33 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 5.DISCUSSIONI E CONCLUSIONI Questa tesi rientra in una serie di studi sul metabolismo lipidico del neonato che a differenza dell’adulto assorbe male il grasso della dieta (latte formulato ma anche latte materno). Questa condizione ha grosse ripercussioni nutrizionali soprattutto se il neonato è pretermine in cui bisogni nutrizionali ed energetici sono ancora più alti rispetto al neonato a termine e l’assorbimento del grasso è ancora più precario. Riportiamo in questa tesi il primo studio dove è stata usata la rhBSSL aggiunta alla formula nei neonati prematuri ed è stato messo a punto per valutare se si verifica un miglioramento dell’assorbimento intestinale del grasso con l’ipotesi che l’aumento dell’apporto energetico porti ad un miglioramento della crescita che è una delle sfide più importanti per la cura di questi neonati prematuri. In questo studio pilota abbiamo trovato un miglior assorbimento intestinale del grasso della dieta con la supplemetazione con rhBSSL. L’acido palmitico è principalmente esterificato in posizione Sn-1 e Sn-3 negli oli vegetali, le lipasi pancreatiche liberano gli acidi grassi nelle posizioni Sn-1,3 a formare acidi grassi non esterificati non assorbibili in quanto formano saponi insolubili con i cationi divalenti come calcio e magnesio. È stato notato un miglioramento nell’assorbimento soprattutto per gli acidi grassi polinsaturi a lunga catena, ARA e DHA, quando la formula era supplementata con rhBSSL. La concentrazione fecale del DHA tendeva ad essere più bassa in presenza di rhBSSL anche se non c’erano differenze significative tra i due gruppi in entrambi i periodi, molto probabilmente ciò è dovuto al numero basso di pazienti inclusi nello studio. Inoltre è stato osservato un aumento significativo della concentrazione del DHA e ARA nei fosfolipidi del plasma. Tutto ciò fa ipotizzare che l’uso della BSSL migliori l’assorbimento degli LCPUFA. Un ruolo possibile della BSSL nel favorire ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 34 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ l’aumento della digestione degli LCPUFA è stato suggerito da Hernell e collaboratori in uno studio in vitro [46]. In tal studio hanno utilizzato il triacilglicerolo del chilomicrone del ratto contenete acido arachidonico e linoleico marcati oppure acido arachidonico e eicosapentaenoico marcati come substrato per l’incubazione in vitro con lipasi pancreatica umana colipasi-dipendente purificata e BSSL. L’acido arachidonico e l’acido eicosapentaenoico erano idrolizzati molto più efficientemente ad acidi grassi liberi con la BSSL rispetto all’utilizzo della lipasi pancreatica colipasi-dipendente. La loro ipotesi è stata che la posizione del doppio legame fosse di grande importanza per l’idrolisi del legame estere da parte della lipasi pancreatica mentre la BSSL non ha preferenze nella posizione del doppio legame ed è in grado quindi di idrolizzare rapidamente gli acidi grassi rilasciando gli acidi grassi liberi come ARA ed EPA. Una simile scoperta è stata fatta anche da Chen e collaboratori, con alcuni studi in vitro hanno notato che quando la lipasi pancreatica umana carbossilestere, enzima molto simile rispetto alle sue proprietà con la BSSL del latte umano, e lipasi pancreatica colipasi-dipendente, erano combinate l’idrolisi dei chilomicroni del ratto che contengono 20:4n-6 e 20:5n3 marcati era molto più efficiente rispetto alla lipasi pancreatica colipasi-dipendente usata da sola [116]. Gli acidi grassi polinsaturi a lunga catena, soprattutto ARA e DHA sono molto presenti in alte concentrazioni nelle cellule dei neuroni del feto e la loro incorporazione aumenta nella parte finale della gestazione. Nel periodo postnatale una diminuzione della concentrazione del DHA è stata trovata, in studi autoptici , nel cervello dei bambini alimentati con la formula rispetto ai bambini che erano stati allattati al seno [117] [118]. Questi dati suggeriscono che l’assunzione del DHA dalla dieta sia importante per lo sviluppo del cervello, questo è vero specialmente per i neonati pretermine che hanno bassi depositi nel corpo di LCPUFA. La supplementazione della formula con ARA e DHA consente di avere ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 35 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ nel plasma e nei glubuli rossi elevate concentrazioni dei due acidi grassi. Uno studio ha riportato che nei neonati pretermine alimentati con formula supplementata con ARA e DHA, livelli simili di ARA e DHA nel plasma e nei globuli rossi rispetto ai neonati alimentati con latte umano [119]. Gli effetti benefici degli LCPUFA sullo sviluppo della vista sono stati ampiamente dimostrati [120] [121] [122] [123] anche se la questione sullo sviluppo mentale e psicomotorio a lungo termine è molto controversa [124] [125] [126] [127]. Riguardo al fatto che I neonati pretermine necessitino di una formula supplementata con LCPUFA è un qualcosa che è suggerito da molti anni e che oggi è entarata a far parte della pratica. Nel nostro studio l’uso di rhBSSL ha portato ad un migliore assorbimento e aumento nei fosfolipidi del plasma di ARA e DHA, questi risultati fanno supporre che la rhBSSL possa avere un ruolo fondamentale nell’assorbimento del grasso soprattutto degli LCPUFA. ____________________________________________________________________ Tesi di dottorato Pagina 36 Università Politecnica delle Marche Angelini Lorena ____________________________________________________________________ 6.BIBLIOGRAFIA 1. Signer, E., et al., Role of bile salts in fat malabsorption of premature infants. Arch Dis Child, 1974. 49(3): p. 174-80. 2. Verkade, H.J., et al., Fat absorption in neonates: comparison of long-chain- fatty-acid and triglyceride compositions of formula, feces, and blood. Am J Clin Nutr, 1991. 53(3): p. 643-51. 3. 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