Nuova metodica con tecnologia microfluidica per la valutazione

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Università degli Studi di Padova
Facoltà di Agraria
Università degli Studi di Verona
Facoltà di Economia
Università degli Studi di Udine
Facoltà di Agraria
Corso di Laurea Magistrale Interateneo in
VITICOLTURA, ENOLOGIA E MERCATI VITIVINICOLI
TESI DI LAUREA
Nuova metodica con tecnologia microfluidica
per la valutazione rapida della
stabilità proteica nei vini
Relatore:
Prof. Emilio Celotti
Dr. Roberto Larcher
Laureanda: Sabrina Dorigoni
ANNO ACCADEMICO 2010 - 2011
INT RO D UZ IO N E ......................................................................................... 4
1. 1
I c om pos t i d i n at ur a pr ot e ic a .................................................................. 4
1. 2
La t or b id i tà pr o te ic a n e i v i ni bi a nc h i ........................................................ 7
1. 3
Pr ot e in e d e l v i no - or i g in e e c ar a tt er is t ic he .............................................. 10
1. 4
F at t or i c he de ter m i na n o u n aum e nt o d el l e pr ot e in e n e l v i no ........................ 14
1. 5
Cas s e pr ot e ic a .................................................................................... 15
1. 6
T es t per i l c on tr o ll o d e l la s t a b il i tà pr o t eic a .............................................. 17
1. 6. 1
La be nt o n it e n el c on tr o ll o d e l la s t a b il i tà pr o t e ic a ................................ 18
1. 6. 2
Ut i l i z zo p r a t ic o d e l la b en t on i te ......................................................... 19
1. 7
T ec nic h e a lt er na t i v e a l la be nt o n it e p er e l im inar e l e pr o te i ne ....................... 21
1. 7. 1
Ul tr af i ltr a zi o n e t an g en zi a l e ............................................................. 21
1. 7. 2
Com pos t i f e n o lic i im m ob i l i z za t i ........................................................ 21
1. 7. 3
S is t em i as s o r b e nt i a lt er n a ti v i .......................................................... 22
1. 7. 4
P as t or i z za zi o n e F l as h .................................................................... 23
1. 7. 5
E n zim i pr ot e o l it ic i .......................................................................... 23
1. 7. 6
F at t or i p r o t et ti v i d e l l a tor b id i tà ........................................................ 24
1. 8
T es t di v al u ta zi o n e e qu a nt if ic a zi o n e ...................................................... 25
1. 8. 1
B en to t es t ..................................................................................... 25
1. 8. 2
Pr ot oC ec k .................................................................................... 27
1. 9
V al u ta zi o n e d i pr o te i n e e g l ic o pr ot e i ne .................................................... 28
1. 1 0 Me t od i p er l a q u an t if ic a zi o n e ................................................................. 29
1. 1 0. 1
Me t od i p er l a c ar a tt er i z za zi o n e d i pr ot e in e e p e pt i di ............................ 30
1. 1 0. 2
S ep ar a zi o n e c o n t ec n i c he el e ttr of or et ic he ......................................... 31
1. 1 0. 3
S ep ar a zi o n e c o n t ec n i c he c r om ato gr af ic he ........................................ 34
1. 1 1 Me t od i d i r il e v am ent o ........................................................................... 36
1. 1 1. 1
S pe ttr om etr i a d i m as s a ( M S) ........................................................... 36
2
O BI ET T IVI ................................................................................................ 37
3
S VI L UP P O DI U NA M E T O DIC A P E R L A C AR AT T ERI Z Z AZ I O N E D E LL E PRO T EI N E
DE L VI NO ....................................................................................................... 38
3. 1
Ma t er ia l i e R ea g e nt i ............................................................................. 38
3. 1. 1
Pr ot oc ol l o " A g i le nt Pr o te i n 8 0 K it G ui d e " ( c o de G 29 3 8 - 90 0 62) ............. 39
3. 1. 2
Re a ge nt i d e l k i t A g i le n t Pr ot e in 80 ................................................... 39
3. 1. 3
Pr ep ar a zi o n e d i Cam p i on i e La d der .................................................. 40
3. 1. 4
At tr e z za t ur e e m at er ia l i .................................................................. 41
3. 1. 5
Str um en t i ..................................................................................... 41
3. 1. 6
Car ic am ent o d e l c h i p ..................................................................... 44
3. 2
M E S SA A P UNT O E V ER IF IC A D E LL A PR E P AR A Z IO N E D EL L E P R O T EIN E D E L
VI NO CO N E ST R AZ IO NE M ED I ANT E PR E CI PIT AZ IO N E IN AL CO O L ..................... 46
3. 2. 1
Pr ep ar a zi o n e d el pr ec i p it at o ............................................................ 46
3. 2. 2
V al u ta zi o n e e s c el t a d e l B uf f er ot tim a le per l a .................................... 48
3. 3
M E S SA A P UNT O E V ER IF IC A D E LL A PR E P AR A Z IO N E D EL L E P R O T EIN E D E L
VI NO C O N E ST R AZ IO NE M ED I ANT E U LT R A F ILT R AZ IO NE ................................. 51
3. 4
M E S SA A P UNT O E V ER I F IC A D E LL A PR E P AR A Z I O N E D EL L E P R O T EIN E
P ER S E P AR AZ IO N E M ED I ANT E ULT R AF ILT RA Z IO N E P E R C ENT R IF UG A Z IO N E CO N
UT ILI Z Z O D I M EM B R A NE D A 3K D A ................................................................. 53
3. 4. 1
Es t r a zi o n e d e l le p r o te i ne ................................................................ 53
3. 4. 2
Pr o va di r i ut i l i z za b i li t à d e l le m em br an e ............................................. 58
1
3. 5
M E S SA A P UNT O E V ER I F IC A D E LL A PR E P AR A Z I O N E D EL L E P R O T EIN E
P ER S E P AR AZ IO N E M ED I ANT E ULT R AF ILT RA Z IO N E P E R C ENT R IF UG A Z IO N E CO N
UT ILI Z Z O D I M EM B R A NE D A 10 K D A ............................................................... 60
3. 5. 1
Es t r a zi o n e d e l le p r o te i ne ................................................................ 61
3. 5. 2
Us o d i SD S n e l la f as e pr e p ar at i v a .................................................... 62
3. 5. 3
P ur if ic a zi o ne c am pi on e .................................................................. 64
3. 5. 4
S ep ar a zi o n e d el l e pr ot e in e t ot a li e de l l e g l ic opr o te i n e ......................... 64
3. 6
V ER IF IC A D E LL A PR E S E N Z A DI P RO T E IN E IN V IN O T R A G L I 80 E 2 3 0 k Da 66
3. 6. 1
Re a ge nt i d e l k i t A g i le n t Pr ot e in 23 0 .................................................. 66
3. 6. 2
Pr ep ar a zi o n e d i Cam p i on i e La d der .................................................. 67
3. 6. 3
Car ic am ent o d e l G e l - D ye - Mix de i C am pi on i e d e l L ad d er ..................... 68
3. 6. 4
Pr ot e in e n e l v i no ........................................................................... 68
3. 7
V ER IF IC A D E LL ’ A B B A T T IM ENT O PR O T EI C O O P ER AT O D A L L A B ENT O N IT E
SU VI NI BI A NC HI ......................................................................................... 70
4
PR E V I SIO N E D EL L ’I N ST AB IL IT A’ D EI V I NI ................................................... 73
4. 2
V er if ic a de l l e c o r r e la zi on i tr a l e f r a zi o n i pr ot e ic h e t ot a li de i vi n i e i l t es t W ater s
et a l ( 1 9 9 1) ................................................................................................. 75
4. 3
V er if ic a de l l e c or r e la zi on i tr a l e f r a zi o n i pr ot e ic h e t ot a li de i vi n i e i l t es t L af f or t
( 20 0 8) 76
4. 4
V er if ic a de l l e c or r e la zi on i tr a l e f r a zi o n i pr ot e ic h e t ot a li de i vi n i e i l pr ec ip i ta t o
W ater s e t a l ( 1 99 1) ..................................................................................... ..77
4. 5
V er if ic a de l l e c or r e la zi on i tr a l e f r a zi o n i pr ot e ic h e i ns t a b il i de i vi n i e i l t es t
W ater s e t a l ( 1 99 1) ....................................................................................... 78
4. 6
V er if ic a de l l e c or r e la zi on i tr a l e f r a zi o n i pr o te ic he ins t ab i l i d e i v i ni e il t es t
Laf f or t ( 2 00 8) ............................................................................................... 79
4. 7
V er if ic a de l l e c or r e la zi on i tr a l e f r a zi o n i pr ot e ic h e i ns t a b il i de i vi n i e i l
pr ec i p it a to W ater s et a l
( 19 9 1) …… … …… … … …… … …… … …… … …… …… … …… … …… … …… ........................ 80
4. 8
V er if ic a de l l e c or r e la zi on i tr a i l r a p po r t o d el l e f r a zi o n i pr o t eic h e to t a li e s ta b i li
de i v in i e i d i ver s i t es t ………………………………………………... ………….......81
5
CO N CL U S IO NI .......................................................................................... 82
A LL EG AT O 1 .................................................................................................. 84
BI B L IO G R A F I A ................................................................................................ 91
RI NG R AZ I A ME NT I: .......................................................................................... 98
INTRODUZIONE
1
1.1
INTRODUZIONE
I composti di natura proteica
Le proteine, insieme a polisaccaridi e polif enoli , rappr esentano uno de i
principali component i macromolecolar i pr esent i nel vino
Le proteine, presenti nelle uve come elementi strutturali e f unzionali,
durante le operazioni di vinif icazione vengono trasf erite prima ai mosti e
quindi ai vini, e in q uesti ult imi possono divenire causa di f ormazione di
f enomeni di int orbidamento.
La f ormazione di
torbidità
dei
vini,
in
particolare
nei
vini
bianchi
rappresenta tutt’oggi uno dei problemi che maggiormente preoccupa gli
enologi: il consumat ore non è inf atti disposto ad accettare la torbidità
come un dif etto di tipo principalmente visivo, ma imputa al vino privo di
limpidezza caratter istiche di generale scarsa qualità, oltr eché di poca
accuratezza pr odutt iva. G li intorbidamenti legati alla precipitazione della
f razione prot eica si possono manif estare in bott iglia o durante una
conser vazione a temperature elevate, o in seguito all’arricchiment o
naturale del vino con i tannini estratti dal sughero di tappatur a.
Si tratta di macrom olecole con peso m olecolare super iore a 1000 Da,
costituite di una cat ena di amminoacidi unit i da un legame polipeptidico e
con una struttura tridimensionale che d ipende dalla sequenza degli
amminoacidi presenti all’interno della catena polipept id ica stessa. In
f unzione del pH del vino e del loro punt o isoelettrico − il pH al quale la
proteina presenta carica neutra − possono avere una carica elettrica
positiva o negativa. I vini bianchi e rosat i presentano un tenore generale
di proteine che può arrivare a qualche centinaio di mg/L, concentrazione
in grado di determ inare anche f orte instabilità e f enomeni def initi di
“casse proteica” , mentre i vini rossi, grazie alla maggiore presenza d i
tannini, hanno la nat urale capacità di f ar precipit are quasi completament e
la f razione proteica meno stabile.
INTRODUZIONE
Da oltre cinquant ’anni ( Saywell L.G., 1934; Riberau-Gayon J., 1935) la
bentonite, un m iner ale argilloso naturale prodotto dalla decom posizione
geologica di cenere vulcanica, viene impiegata con indubbio successo
tecnico per la r imozione delle pr oteine instabili dei vini bianchi , anche se
la sua azione chiar if icante, legata alla capacità di pr ecipit azione delle
sostanze
colloidali
indiscr iminatament e
disper se
a
nel
car ico
mosto
dell’intera
e
nel
f razione
vino,
avviene
prot eica,
senza
dist inguere tra pr oteine più stabili e meno stabili. È stato osser vat o ,
d’altronde, che tutti i compost i di natura proteica possono in qualche
misura inter ve nir e nei f enomeni di instabilit à proteica dei vini (RiberauGayon P. et al., 1998).
Le f razioni proteiche isolate da most o si rivelano dif f erenti a seconda
della variet à d’uva e presentano nei vini un comportamento dif f erenziato
nei r iguardi dei trattamen ti termici.
Koch e Saj ak (1959), per prim i, hanno mostrato che i peptidi proteici
isolat i dal mosto d’uva sia per pr ecipit azione con solf ato d’ammonio, sia
per riscaldament o, corrispondono alle f razioni proteiche separate per
elettrof oresi su cart a. Tali f razioni sono costituit e da am minoacidi ma
contengono anche tannini, cat ioni e zuccheri r iduttor i.
Secondo Berg H.W ., Akioshi M., (1961) non è dimostrata una correlazione
tra il tenore in pr oteine totali del m osto e il torbido formato per
riscaldamento nei test di inst abilità prot eica, indicando pertanto che non
tutte le proteine mostrano la medesima instabilità alla temperat ura. Inf atti
Bayly e Berg (1967) hanno conf ermato questa ipotesi attraverso la
purif icazione delle proteine con var ie tecniche: dalla f iltrazione su gel alla
cromatograf ia su resine a scambio cat ionico , alla dialisi. Analizzando le
diverse
f razioni
isolate
hanno
notat o
che,
sebbene
t utte
f ossero
inf luenzate dal calore, quelle comprese tra i 18000 e i 23000 Da lo
f ossero in maniera partico lare.
Da esperimenti condotti da diversi ricercatori (Hsue J. C. e Hesther bell
D.A., 1987; Paet zold M., et al.1990; W aters E.J. et al., 1991,1992) su
cult ivar
diff erenti,
sembra
emergere
che
le
prot eine
responsabili
dell’instabilit à nei vini bianchi pr oveng ono esclusivament e dall’uva e
presentano
masse
molecolari
relat ivamente
piccole ,
comprese
tra
i
INTRODUZIONE
12.000 e i 35.000 Da, e che il lor o punto isoelettrico (pi), il grado di
glicosilazione e la r elat iva t ermostabilit à var i ano appunto al variare della
cult ivar.
Il dosaggio delle proteine nel vino può essere f acilmente valutato tramite
cromatograf ia
liquida
di
esclusione
molecolare
ad
alt e
prestazioni
(Dubodieu D, et al., 1986), o come più r ecentemente illustrato da Ledoux
V.,
e
Dulau
D.
(1992),
sf ruttando
il
f ort e
potere
risolut ivo
della
elettrof oresi capillar e su mosto e vino. Da indagini ef f ettuate su diverse
cult ivar, tra cui Sauvignon, è emerso che i prof ili elettrof oretici non
var iano qualitativam ente in dipendenza delle condizioni
di zona vit icola,
di annata, di terro ir e che mosti di uno st esso vit igno contengono
indicativamente le stesse specie proteiche , pur in quantità variabile a
seconda dell’origine. Al contrar io le proteine hanno composizione anche
prof ondamente diver sa tra dif f erenti cult ivar ( Moine- Ledoux V., 1996).
La concentrazione di prot eine nei mosti è stata st imata in un range che
var ia da qualche decina a 300 mg/L.
INTRODUZIONE
1.2
La torbidità proteica nei vini bianchi
Spesso la torbidità dei vini bianchi dopo imbottigliament o è legata a
problemi di instabi lità di origine micr obiologica o chimica, quest’ult ima
spesso dovuta alla presenza di proteine termolabili. Le pr oteine in Vit is
Vinif era, def inite PR pr oteins ( Pathog enesis -Related), che prendono il
nome
di
taumat ina
e
chit inasi,
tendono
ad
aggregarsi
d urante
l’aff inamento, con f ormazione di particelle in dispersione che possono
essere “ viste” come torbidità dal consumatore che le considera un dif etto,
nonost ante non com promettano la qualit à del vino, procurando un danno
econom ico ai produt tori (Høj et al.,2000; Tattersall et al., 2001; Ferreira et
al., 2002).
Durante il processo di vinif icazione e f ermentazione la concentrazione di
proteine dim inuisce progressivamente a causa delle condizioni di stress al
quale
vengono
sot toposte .
La
f razione
proteica
re sidua
si
presenta
generalment e stabile nel breve -medio periodo; nel tempo tende però a
diventare
insolubil e
dando
luogo
alla
f ormazione
di
particelle
in
sospensione con comparsa di intorbidamenti. S i tratta in questo caso di PR
proteins, quelle maggiorment e resistent i alle operazioni di f ermentazione.
Anche se il meccanismo di f ormazione delle torbidità pare non essere del
tutto
chiarito,
responsabile
si
della
ritiene
lenta
che
il
tempo
pr ecipit azione
sia
delle
il
f attore
proteine
maggiormente
che
vengono
denatur ate (Bayly F.C. e Berg, H.W., 1967; Hsu J.C. e Heatherbell D.A.,
1987; W aters E.J., et al., 1991, 1992).
Il ruolo delle PR protein s nel m eccanismo di dif esa della bacca , in
particolare la loro azione ant if ungina, non è stato ancora completamente
spiegato. Lavor i sugli eff etti dell’attacco della Botr yt is Ciner ea (muff a
grigia) sulle uve hanno mostrato, con r isultat i ambivalent i, sia come ciò
abbia portato ad un aumento del livello f inale di torbidità dei vini (Girbau T.
et al., 2004), sia, nel lavoro c ondotto da Marchal T. (et al., 1998), come
l’inf ezione della bacca abbia portato ad un mosto con un ridotto livello di
INTRODUZIONE
proteine, suggerendo un’azione proteolitica di questo patogeno rispetto alle
proteine dell’uva.
Finora sono diciassette le classi di PR-prot eins conosciute, numerate
nell’ordine in cui sono state scoperte da PR-1 a PR- 17. Si è anche notato
che molt e delle PR- proteins corr ispondono a proteine omologhe present i
tra gli allergeni più dif f usi tra gli alimenti ( van Loon L.C. and Van Str ien
L.A., 1999; Hoff mann-Sommergruber K., 2002; Pastorello E.A. et al., 2002).
La f ase di sviluppo della pianta comporta nella bacca una f orte espressione
costitut iva di alcune PR -proteins (Derckel et al., 1996; Robinson et al.,
1997). La loro sintesi si ver if ica pr incipalmente nella buccia dell’acino : si
tratta pertanto di una espressione regolata in modo evolut ivo e che
interessa tessuti spe cif ici (Igartuburu J. M., et al., 1991; Pocock K.F., et al.,
1998; Monteiro S., et al., 2001).
In tutte le cultivar di V. V inif era indagate le proteine Taumat ina-sim ile (TL,
Thaumatin- like) e Chit inasi sono risult ate esser e la f onte principale di
proteine solubili dell’uva (Peng Z., et al., 1997; Tattersall D.B., et al.,
1997; Pocock K.F., et al., 1998, 2000). In part icolare, in determ inate
var ietà come Muscat Gordo Blan co il livello della pr oteina TL è risultato
aumentare drast icamente dopo l’inizio dell’invaiatura, proseguendo f ino
alla mat urazione. Si suppone pertant o che il f attore connesso con la
torbidità potenziale si sviluppi durante la f ase di maturazione deg li acini
( Murphey J. M. et al., 1989; Tattersall D.B., et al.,1997; Pocock et al.,
2000).
La quant ità totale di
PR- proteins r ilevabile nella bacca m atura dipende
dalla var ietà, dalla collocazione geograf ica del vigneto, dal clima e dalle
pratiche agronomiche (Ferreir a R.B. et al., 2002). Anche pr atiche com e la
raccolta meccanica sono note per condurre ad un aumento generale delle
PR-prot eins contenute nel succo d’uva ; ciò a causa dei danni f isici che le
operazioni meccaniche provoc ano alle piante ed ai grappoli (Pocock K.F. et
al.,
1998).
Grazie alla lor o stabilit à intrinseca, queste proteine possono permanere
INTRODUZIONE
f ino a f ine f ermentazione e possono causare torbidità nel vino f inito
durante la conser vazione.
Oltre alle due classi pr incipali,Taumatina e Chit inasi, nell’uva sono state
trovat e anche altre classi minor i di proteine: Lipid Transf er protein ( LTP) e
β glucanasi.
Le LPTs (Pr 14) sono proteine di piccole dimensioni, stabilizzat e da quattro
legami
disolf uro,
capaci
di
trasf erire
f osf olipidi
tra
membrane .
Il
meccanismo di dif esa antif ungino che esplicano non è ancora compreso,
anche se par e abbiano la capacità di inserirsi all’interno della membr ana
del f ungo tramite la loro cavità idrof obica f ormando un por o attraverso il
quale iniettano ioni intracellular i che portano alla morte della cellula
f ungina.
Le β-1.3-glucanasi delle piant e sono denominate PR-2 pr oteins (Ferreira
R.B., et al., 2007) e partecipano a diver si processi f isiologici e di sviluppo
della
pianta.
Inoltre
le
I
β-1,3-glucanasi
dimostrano
elevata
attività
antif ungina in vitro e in pianta, come dimostrato in piante transgenic he
dove la proteina PR- 2 era sovraesposta ( Mauch F. et al., 1988; Joshi B.N.,
et al., 1998), mentr e la classe II β-1,3- glucanasi espr ime in vetro attività
antif ungina solo se applicat a in combinazione con chitinasi o I β-1,3glucanasi (Theis and Stahl, 2004).
INTRODUZIONE
1.3
Proteine del vino - origine e caratteristiche
Risalgono agli anni ’50 gli studi iniziali sull’or igine delle proteine nel
vino1 con
risultati che sono stat i spesso contraddittor i. In un pr imo
momento si era r iten uto inf atti che le prot eine presenti nel vino f ossero un
mix di proteine dell’uva e di proteine da autolisi del lievito, ma questa
convinzione è stata smentita nel 1967 da Bayly e da Berg che hanno
dimostrato tram ite studi su un modello che la quantità di proteine
rilasciate dal lie vit o in lisi non contribuiva in maniera signif icativa alla
f ormazione di intorbidament i. Nel 1985 Lee ha osser vato che la presenza
di pr oteine present i nel vino era legata all’uva e la loro concentrazione è
inf luenzata dalla var ietà, dal grado di maturazi one e dal clima. Anche altri
autori, tramit e l’ut ilizzo di diverse tecnologie, hanno conf ermato le
medesime osser vazioni ( Hsu J.C. e Heatherbell D.A., 1987; Ruiz-Larrea
F. et al., 1998; Fer reira R.B. et al., 2000; Dambr ouck T. et al., 2003),
mentre altri, in disaccordo, hanno r iten uto che esist esse una dif f erenza
tra i prof ili pr oteici dell’uva e quelli del vino, inf luenzat i quest i ultim i dalla
presenza di proteine dovute all’attività dei lieviti (Yokotsuka K. et al.,
1991; Monteiro S. et al., 2001; Kwon Y., 2004). A suf f ragio di quest a
teoria,
W aters
E.J.
e
colleghi
(1994)
hanno
mostrato
come
due
mannoprot eine, isolate da un vino bianco e da un vino rosso f ermentat i
con ceppi di Saccharomyces cerevisiae, f ossero liberate dai lieviti sia in
f ermentazione
dur ante
la
f ase
di
molt iplicazione ,
che
durant e
l’aff inamento del vino sulle f ecce . Risultat i simili sono st ati raggiunt i
anche da Yokotsuka K. e colleghi (1997), dimostrando che alcune
glicoproteine r iscontrate nei vini rossi erano prodotte dall’att ività dei
lieviti e che comparivano sia durant e la fermentazione alcolica che quella
malolattica. Lugera C. et al. (1998) hanno osser vato tramite approccio
cromatograf ico che la f ermentazione alcolica ed i pr ocessi successivi di
stabilizzazione conducono alla dimin uzione del contenuto proteico di un
vino Chardonnay. In questo studio gli autori hanno evidenziato come le
proteine prodotte dai lievit i non f ossero presenti durante la f ermentazione
ma solo dopo 18 mesi di aff inamento sulle f ecce. I lievit i possono tuttavia
INTRODUZIONE
inf luenzare la composizione proteica del vino in due modi, o attraverso la
cessione di pr oteine nel vino durante il processo di autolisi del lievito e/o
attraverso
l'em issione
di
enzimi
proteolit ici
extracellulari
che
contribuiscono ad una maggiore idro lisi proteica (Feuillat J. et al., 1980).
Il
processo
f ermentativo
è
responsabile
della
diff erenza
tra
la
concentrazione di proteine presenti nell’uva e nel vino, inf atti molte delle
proteine contenut e nella polpa di uva bianca vengono perse durante il
processo f ermentativo ( Murphey J. M. et al., 1989). Il m inore livello di
proteine riscontrate nel vino è legato a f enomeni di pr oteolisi e di
denatur azione
delle
proteine
dell’uva
in
f ermentazione,
causato
rispett ivamente dall’attivit à prote asica e dalla varia zione di pH (Bayly
F.C. and Berg H.W ., 1967; Feuillat J., 1980; Murphey J. M. et al., 1989).
E’ stat o inoltre stim ato che f ino a metà del precipitato ‘proteico’ dell’uva,
che si f orma durante le operazioni di vinif icazione , è costituito da
polif enoli (Somers T.C. e Ziemelis G., 1973).
Grazie allo sviluppo di nuove tecniche analit iche di elettrof oresi già a
partire dagli anni ’60 sono state caratterizzate nel vino quat tro dif f erenti
bande di proteine caratterizzate da concentrazione var iabile legata alla
tipologia di vino e alla cult ivar di Vit is Vinif era ( Mor etti R.H. e Berg H.W .,
1965;). Si è cominciato inoltre ad ipot izzar e che solo alcune tipologie di
proteine
e
non
tutto
l’intero
pattern
proteico
f ossero
responsabili
dell’instabilit à nei vini bianchi .
Somers T.C. and Ziemelis G.(1973), con l’utilizzo della cromatograf ia ad
esclusione dimensionale, hanno raggiunto la separ a zione delle pr oteine
dagli altr i composti del vino stabilendo che la dimensione delle pr oteine
var iava da 10 a 50 kDa.
Nel 1987 Hsu et al., dopo rim ozione dei component i f enolici d ei vini
bianchi pr ima dell’analisi, hanno valutato che i pesi molecolar i
( MW )
f ossero compresi in un range tra 11.2 - 65 kDa. Studi successivi ( Hsu
J.C. e Heatherbell D.A., 1987) hanno condotto all’ipotesi che le proteine
con peso molecole inf eriore (20-30 kDa) f ossero quelle m aggiormente
responsabili della f ormazione di torbidità in conf ronto alle f razioni di
maggior peso. Questa ipotesi è stata più r ecentemente conf ermata da
W aters E.J., e colleghi (1991, 1992) che, descr ivendo le tre maggiori
INTRODUZIONE
f razioni proteiche del vino (rispett ivamente 24, 32 e 63 kDa, da Muscat
Gordo Blanco), hanno evidenziato come la f razione da 24 kDa produca
una torbidità super iore f ino a l 50% r ispetto alle altre due f razioni studiate.
Inoltre,
la
f razione
da
63
kDa
è
risultata
quella
maggiormente
termostabile ed ha spinto ad avviare studi di ver if ica circa un suo
possibile ruolo quale agente protettor e naturale contro i l rischio di
torbidità nel vino (W aters E.J. et al., 1993). Ulteriori studi su 5 diverse
f razioni pr oteiche (W aters E.J. , et al., 1996) hanno mostrato come esse si
dif f erenziassero per un comportamento diverso in un test a caldo ne llo
sviluppo di torbidit à . Le part icelle che si f ormavano avevano inoltre
dimensioni dif f erenti inducendo a consider are possibili int erazioni tra
proteine e composti f enolici .
L’uso della elettroforesi bidimensionale ha reso possibile evidenziare
un’alta complessità dei pr of ili proteici dell'uva altr imenti non osser vabili
con le normali tecniche (unidimensionali ) di SDS-PAG E. In particolare, è
stato
possibile
realizzare
mappe
bidimensionali
della
bacca
d'uva,
osser vando f ino a 270 spots (Sarr y J.E. et al., 2004) ed ottenendo un
risultato in qualche misura sorprendente : la maggior parte delle proteine
molto
spesso
presentava
un
basso
peso
molecolare
( Hsu
J. C.
e
Heatherbell D.A., 1987; Murphey J. M. et al., 1989a; Pueyo E. et al.
(1993).
Secondo quanto osservato da Sarr y J. E. et al. (2004) le proteine residu ali
in vino sono quelle capaci di rimanere sol ubili a pH acido e di resister e
all’azione delle prot easi endogene e dei lieviti, alla precipit azione con i
tannini e all’azione insolubilizzante dell’etanolo.
Le proteine con basso punto isoelettrico ( pi) rappresent ano la quota
maggiormente presente nei vini ( Morett i R.H. e Berg H.W ., 1965) e sono
considerat e come i principali responsabili della f ormazione di torbidità
(Bayly F. C. and Ber g H.W ., 1967). Al pH del vino le prot eine presentano
carica
elettrica
positiva,
il
che
ne
f avorisce
la
rimozione
tram it e
trattamento con bentonit e (car ica negativa). Secondo a lcuni autor i le
proteine hanno un pi compreso in genere tra 4 e 7 (Lee T.H., 1985; Hsu
J.C.e Heatherbe ll D. 1987; Paet zold M. et al., 1990).
Appare tuttavia
INTRODUZIONE
evidente come anche molt i altr i f attori co ncorrano alla complessità del
quadro dei f enomeni connessi con la f ormazione d i torbidit à.
INTRODUZIONE
1.4
Fattori che determinano un aumento delle proteine nel vino
Come sopra indicat o il tenore di prot eine riscontrabile in un mosto
dipende dalla var ietà, ma anche dal grado di maturazione e dalle
operazioni pr ef ermentative.
In particolare le operazioni di macer azione pellicolare provocano, in
conf ronto con la pressatura senza macerazione, un aumento sensibile
della f razione proteica instabile. Inoltre operazioni come i l solf itaggio del
pigiato macerato favoriscono l’estrazione della componente proteica.
Secondo Dulau L. ( 1990) la pressatura delle uve con il r aspo consente
una r iduzione della f razione proteica, indicando come i tannini del raspo
tendano a f issare le prot eine del mosto al momento della pressatura.
Nel caso di utilizzo d i bentonite come coadiuvante per il controllo della
concentrazione di proteine, le dosi utilizzate negli ultimi anni
sono
passate dai 20-40 g/hl a dosi che oggi vanno spesso anche a 80-120 g/hl.
Questo può essere inter pretato come conseguenza di mutati approcci
vitienologici:
la
f requente
raccolta
di
uve
con
maggiore
grado
di
maturazione, l’impiego del la macer azione pellicolare, l ’uso della raccolta
meccanica e della solf itazione.
INTRODUZIONE
1.5
Casse proteica
I f attori che portano alla casse proteica sono r iconducibili allo schema
classico di un colloide idrof ilo che f loccula quando viene privat o dei due
f attori di stabilità: la sua car ica e la sua idratazione.
Si evince pertanto che l’associazione proteina-tannino si comporta come
un colloide idrof obo con carica negativa che in associazione con i cat ioni
del vino precipita. Altrettant o il riscaldamento d i un vino bianco a 70 80°C., per un tempo prolungato, può pr ecipitare quasi completamente le
proteine presenti in un vino. Nel caso in cui il riscaldamento avvenga in
tempi molto rapidi la presenza del pr ecipitato sarà osservabile solo
quando il vino si sar à raff reddato.
L’ef f etto provocat o dal r iscaldamento è quello di trasf ormare le proteine
in una f orma solubile a caldo che diviene invece insolubile e precipita
durante il raf f reddamento.
Il riscaldamento porta sostanzialmente alla f ormazione di precipitato
dovuta alla disidrat azione delle proteine per eff etto del riscaldamento
medesimo. Il precipi tato che si f orma per riscaldamento è correlato con il
punto isoelettrico ( pi) ( Dawes H. et al., 1994), inf atti le proteine che
hanno un pi maggiore di 7 f ormano un precipitato compatto, mentre quelle
con un pi compreso tra 5,94 e 4.65 precipitano per f loc culazione, quelle
con un pi minore di 4.65 tendono a f ormare torbidità in sospensione .
Allo scopo di prevenire la casse proteica autor i diversi si sono espressi a
f avore dell’utilizzo di coadiuvanti di chiarif ica
o metodi dif f erenti,
giungendo all’univoca conclusione che l’ut ilizzo della bentonit e pare
essere ancora il mezzo più eff icace nel controllo della stabilit à proteica.
Laborde, secondo q uanto riportato da Riber au -Gayon (Riber au-Gayon P.
et al., 1998), aveva suggerito il riscaldamento del vino da 15 a 30 minuti
a 70-80° C, con le relat ive conseguenze sulla qualità sensor iale del vino
f inito. Questo metodo poteva tuttavia tr ovare giustif icazione nel per iodo
in cui è stato pensato, ovvero intorno al 1904!
INTRODUZIONE
È stato suggerito inoltre l’ut ilizzo di tannini, ma la dose (2g/hl) necessar ia
alla sicura stabilizzazione è troppo elevata, mentre alle dosi t ecnicament e
praticabili rende invece il vino ancora sensibile nei conf ronti della casse
proteica (Riberau-G ayon P. et al., 1998). L’ef f etto del raff reddamento
prolungato non provoca invece che la f ormazione solo par ziale di
precipit ato rendendo il trattamento poco utile dal punto di vista della cura
della casse proteica. (Riber au-Gayon P. et al., 1998). Nel 1932 RiberauGayon J. sugger ì l’utilizzo del caolino, ma anche in questo caso le dosi
richieste, 500 g/hl, rendono inut ilizzabile tale metodo a causa della
quantità di sottoprodotti da smalt ire, oltre alla signif icativa perdita di
prodotto. Inf ine, nel 193 4, Saywell suggerisce l’uso della bentonite, un
silicato di allum inio idrato composto principalmente di montmorillonite, ma
solo
nell’anno
meccanismi
di
successivo
azione
di
Riberau
G ayon
J.
comprende
questa
ar gilla,
constatando
a
che
f ondo
il
meccanismo di azione è dieci volt e più ef f icace di quello del c aolino.
i
suo
INTRODUZIONE
1.6
Test per il controllo della stabilità proteica
La determ inazione quali-quant itat iva delle pr oteine nel vino risult a di
grande interesse per ottimizzare le operazioni di cant ina e f ornire
strumenti preditt ivi che consentano all’enologo di eseguire inter vent i
mirati di protezione dall’intorbidamento.
Allo scopo di valutare il rischio di f ormazione di torbidità o di precipitat i
proteici, sono stati da tempo messi a punto diversi saggi di laboratorio
f inalizzat i
alla
det erminazione
della
dose
ott imale
di
bentonite
da
impiegare nel trattamento stabilizzante. A t ale f ine va r icordato come un
vino venga consider ato stabile dal punto di vista della stabilità proteica
quando, dopo il trattamento a caldo, l’analisi nef elometrica dia valori
inf erior i a circa 2 NT U (Dubordieu D. et al., 1988).
Il test a caldo (spesso riscaldamento a bagnomaria a 80°C per 30 minut i,
ma talora anche in stuf a a 30 -35 ° C per 10 giorni o a 90 °C per un’ora) è
considerat o
in
generale
più
attendibile
nella
valutazione
della
concentrazione delle proteine del vino r ispetto a var i altri metodi. Qualora
il vino present i instabilità pr oteica si osser ver à la f ormazione di un
precipit ato durante il raf f reddamento. Come metodo alternativo di st ima
della f razione proteica è possibile u tilizzar e anche il tannino di quercia
(soluzione 0. 5- 2 g/L). In questo caso la f ormazione di torbidità è in
genere immediatamente percepibile. Sono inoltre disponibili met odiche
ottimizzate per i laboratori di controllo quali il Bent otest (Jakob L., 1962),
dove il liquido si colora in blu e il torbido appar e istantaneam ente. Questo
test però pare tendere alla sovr astima del rischio di casse proteica. Si
sono
valutat e
anche
aggiunte
di
acido
f osf omoblidico
o
di
acido
tricloroacetico. In questo caso la misce la viene scaldata per 2 min a
bagnomaria a 100° C e il torbido viene osser vato dopo 15 minut i.
INTRODUZIONE
Boulton R. B. (et al. , 1996) hanno suggerito un’aggiunta def inita ed in
accesso di etanolo assoluto al vino. La torbidità f ormatasi in alcol viene
valutata mediant e nef elometro, anche se la torbidità osser vat a non si
rif erisce alla sola f razione proteica precipitata ma anche a polisaccar idi,
in part icolar e nelle mannoprot eine.
1.6.1
La bentonite nel controllo della stabilità proteica
L’ut ilizzo della bentonite è stat o indicat o in enologia sia sui m osti che sui
vini f initi ed in entrambe i casi, a concentrazioni dif f erenti, si sono
osser vat i risult ati apprezzabili.
La bentonite in soluzione acquosa f orma un composto di dispersione
colloidale con car ica negativa, capace di f issare le proteine che, al pH del
vino, hanno invece carica posit iva. La quantità di bentonite da utilizzar e è
legata al punto isoelettrico delle prot eine stesse.
Le bentoniti, a secondo della loro provenienza come g iaciment i, si
dist inguono principa lmente in sodiche o calciche, anche se ne esistono
altre tipologie m inori che contengono, come catione scambiabile, il
magnesio. Le bentonit i sodiche risultano essere quelle maggiormente
adatte al trattamento dei vini, presentano un buon r igonf iamento in
soluzione
acquosa
e
migliore
capacità
di
assor bimento.
Provocano
tuttavia un leggero arricchimento in sodio del vino e una trascurabile
riduzione dell’acidità totale.
Generalmente la bentonit e è inodore e insapor e, ma trattamenti con dosi
di bentonite super ior i a 80 g/hl possono avere una inf luenza negativa dal
punto di vista sensoriale sui vini, in particolare nel caso dei vini da
cult ivar aromatiche, quali ad esempio Sauvignon, dove viene eliminato
parte
del
dell’aroma
composto
di
r ibes
4 -metil- 4-mercapto-pentan-2-one,
nero
(Doubordieu
D.
et
responsabile
al.,
1993).
INTRODUZIONE
Impiegata sul mosto con trattamento in f ase di f ermentazione, inf luisce
meno
sulla
qualità
f inale
dei
vini,
con
minori
perdite
e
ridotta
manipolazione del prodotto, poiché la precipitazione de lla bentonite
avviene in concomit anza con quella dei lieviti, mentre il deposito f eccioso
aumenta solo in piccola percentuale. Una eliminazione parziale della
tirosinasi,
con
conseguente
lieve
protezione
del
m osto
verso
l’ossidazione, l’assorbimento di res idui di f ungicidi e una certa attività di
supporto r ispetto agli agenti di f ermentazione depongono a f avore di
questo tipo di ut ilizzo. Va per ò consider ato, per contro, che si impone un
travaso rapido del vino a f ine della f ermentazione alcolica, perdendo in
tal modo l’ef f etto posit ivo di permanenza del vino sul deposito di f ine
f ermentazione.
Ne consegue, come indicazione di massima, che i vini bianchi secchi
destinati alla produzione di grandi pr odotti da invecchiament o vinif icat i in
barrique, non dovr ebbero essere trattat i con bentonite a livello di mosto
ma alla f ine del loro aff inamento, evitando di essere pr ivat i anzitempo del
potere riducente dei lieviti e correndo inoltre il rischio di essere smagriti a
contatto con il legno (Riberau-Gayon P.et al., 1998).
1.6.2
Utilizzo pratico della bentonite
L’ut ilizzo della bentonite nel controllo della stabilità proteica è stat o
autorizzato
con
risoluzione
OIV
nr
11/2003,
che
viene
riportata
integralmente, tratta dal Codice Enologico Internazionale ( vedi Allegato
1). La bentonite può essere utilizzata sia su mosto che su vino, i vantaggi
e gli svantaggi legati all’uso su mosto sono stati ampiament e descr itti, in
primis la controindicazione è rif erita ai vini bianchi che prevedono un
aff inamento
“sur
lies”.
È
più
f requente
l’ut ilizzo
della
bentonite
direttament e sul vino.
Le bentonit i reperibili in commercio si possono trovare in f ormulazione
granulare
o
in
polvere.
Nel
caso
della
bent onite
gr anulare
è
INTRODUZIONE
indispensabile pr ocedere
ad
una operazione
di
idratazione
che
ne
provochi il r igonf iamento. Si procede preparando una sospensione in
acqua calda (dal 5 al 15% di acqua a t emperature comprese tra i 50 e i
60°C), per f avorir ne il r ig onf iamento, e sotto agitazione per evitar e la
f ormazione di grumi.
La bent onite in polv ere può essere utilizzat a anche direttam ente sul vino
sotto agitazione; manif esta però un tendenza alla coagulazione rendendo
meno eff icace il suo potere chiar if icante.
Riberau-Gayon P. ( et al., 1998) suggerisce l’ut ilizzo della bentonite
durante un travaso, cercando di lim itare la dissoluzione di ossigeno con i
conseguenti r ischi ossidativi. Inoltre ne suggerisce l’impiego in contenitor i
bassi e a distanza di qualche giorno da un collaggio con colla proteica
quale ad esempio la caseina che consent e la prec ipitazione delle
particelle più f ini di bentonite e consente di migliorare l’aspet to cromatico
del vino.
Indicazioni vengono f ornite anche per un trat tamento con
bentonite a distanza di qualche giorno da un collaggio con sol di silice in
concentrazioni da 30 ml/hl e gelat ina 5 g/hl che, analogamente alla
caseina, consentono la f locculazione delle particelle più f ini di bentonit e
present i nel vino. In particolare l’ut ilizzo del sol di silice viene suggerito
quale trattamento ideale nel caso di uve aromat ich e quali Sauvignon
Blanc
dove
svolge
azione
lim itante
nella
perdita
di
aromi
legata
all’impiego di dosi elevate di bentonit e. (Riberau-Gayon P. et al., 1998).
INTRODUZIONE
1.7
Tecniche alternative alla bentonite per eliminare le proteine
Nel corso degli ult imi 30 anni, sono state studiate diverse tecniche
alternative all’uso bentonite ma, per il momento, nessuno di questi è stato
adottato come met odo sostitut ivo. I n generale, questi st udi sono stat i
f ocalizzati sulle tecniche di ultraf iltrazione, impiego di enzimi proteolitici,
pastorizzazione f lash e su diversi materiali adsorbent i.
1.7.1 Ultrafiltrazione tangenziale
L’ultraf iltrazione tangenziale non può essere consider ata una soluzione
ottimale per una garanzia totale nei conf ronti degli intorbidamenti da
proteine. L’esper ie nza ha dimostrato inf atti i lim iti d i questa tecnica: la
rimozione delle prot eine è basata su un passaggio delle proteine solubili,
attraverso dei por i di membrana con un risultato stimato intorno 99% di
rimozione delle pr oteine
con MW CO di 10 kDa, tuttavia, Hsu L. C.,
Heatherbell D., aff ermano nel 1987, che si possono comunque verif icare
f enomeni di insorgenza di torbidità nel vino . Anche se la st abilità ottenuta
non è totale la tecnica della f iltrazione tangenziale consente comunque un
risparm io in bent on ite st imato intorno al 95%, a scapito però di una
diminuzione importante dei composti or ganolett ici, oltre a lla necessità di
possedere una attrezzatura altamente specializzata e d ai costi di gestione
elevati ( Miller G.C.et al., 1985; Feuillat M.et al., 1987; Voilley A. et al.,
1990).
1.7.2 Composti fenolici immobilizzati
E’ ben not a l’interazione dei tannini con le prot eine con la conseguent e
recipr oca precipitazione. Nel 1984 W eetall e colleghi suggerirono l’utilizzo
di t annini condensat i per stabilizzare le proteine del vino. Il trattamento
con proantocianidine porta ad un vino stabile. Powers J.R. , et al. (1988)
INTRODUZIONE
hanno dimostrato che immobilizzando le proantocianidine in una matr ice di
agarosio, er a possibile pr eparar e una colonna per la stabilizzazione del
vino in continuo. Tut tavia, gli studi per rigenerare la colonna della matrice
hanno mostrato una riduzione della capacità di legame pr oteico dopo pochi
cicli di r igenerazione .
1.7.3 Sistemi assorbenti alternativi
Per la loro capacità di stabilizzar e il vino bianco sono stat i speriment ati
inoltre diversi altri tipi di sostanze assorbent i alt ernat ive alla bentonite
quali altre argille, resine a scambio ionico, gel di silice, idrossiapat ite,
amberlite e allumina (Gump B. M. e Huang , C.F. 1999) ; ( Sar mento M. R. et
al., 2000).
Alcune delle resine a scambio ionico hanno mostrato comportamento
f avorevole. Inoltre, i materiali a base di ossido di metallo, in particolare
ossido di zirconio, sono stati proposti come alternative alla bentonite per
applicazioni a f lusso cont inuo. ( Pachova V. et al., 2002; Pachova V. et al.,
2004; Vincenzi S. et al., 2005) ne hanno suggerito un sistem a d’utilizzo in
f lusso cont inuo. Un altro metodo era basato sull’ut ilizzo della chitina,
substrato naturale della chitinasi, in grado di legare qu esta proteina,
considerat a tra le maggiori responsabili della f ormazione di tor bidità nei
vini (W aters E.J. et al., 1998). Ut ilizzando una colonna a chit ina, si è
ottenuta
una
buona
rimozione
delle
proteine ,
ma
non
la
completa
stabilizzazione del vino a causa della presenza di altre pr oteine termoinstabili.
E’ stato test ato inoltre l’eff etto dell’aggiunta di polisaccar idi ottenuti da
alghe (Cabello-Pasini A. et al., 2005). Si è verif icata la capacità di legame
di polisaccar idi con carica negativa quali agar, carragenine e acido
alginico, ottenendo un adsorbiment o massimo inf eriore a 50 mg/L di
proteine, anche se in taluni casi è stato rilevato un eff etto f ino a 400 mg/L.
Tuttavia il comportamento di adsorbimento ha mostrato spesso una bassa
INTRODUZIONE
selettività, r endendolo par agonabile al trattamento con bentonite.
1.7.4 Pastorizzazione Flash
Ferenczy (1966) aveva già mostrato le controindicazioni che der ivano
dall’ut ilizzo dell a pastorizzazione f lash, ma successivamente si è osser vato
che un per iodo di r iscaldamento br eve del vino a 90°C non produce ef f etti
sensor iali negativi signif icat ivi (Fr ancis I .L. et al., 1994; Pocock V. et al.,
2003). I noltre, è stato dimostrato che il riscaldamento breve permette una
riduzione della bent onite richiesta tra il 50 e il 70% . Pocock et al. ( 2003)
ha proposto di accoppiare la pastor izzazione f lash ad un trattamento
enzimatico, consent endo una ulter iore riduzione della bent onite necessar ia.
1.7.5 Enzimi proteolitici
L’impiego di enzim i proteolit ici endogeni ed esogeni
è stat o ampiamente
studiato nei most i e nei vini, in quanto sono considerati tra le miglior i
alternative alla bent onite per ridurre o eliminare le proteine instabili del
vino (Lagace L.S. e Bisson L.F., 1990; W aters E.J., et al., 1992;. Dizy M. e Bisson
L.F , 2000). Diversi autori hanno studiat o gli eff etti di aggiunta di prot easi
microbiche, come quelle da Aspergillus niger (Bakalinsky A.T. e Boulton R.,
1985), Saccharom yces cerevisiae (Feuillat M., et al., 1980; Lurton L. et al.,
1988), e Botr yt is cinerea ( Marchal R. et al., 1998 ; Girbau T. et al., 2004;
Marchal R. et al., 2006; Cilindre C. et al., 2007). In ogni studio, gli enzim i
hanno tuttavia mostr ato di non essere in grado di degradare eff icacemente
le PR-protein dell’uva, sia a causa della loro elevata resistenza alla
proteolisi, che per le condizioni sf avorevoli all’attività degli enzim i esistenti
in vinif icazione (Heatherbell D. et al., 1984;. W aters E.J., et al., 1992;
W aters E.J. , et al., 1995; Modra E.J. e W illiams P.J., 1988).
INTRODUZIONE
1.7.6 Fattori protettivi della torbidità
Negli anni novanta, è stata proposta un’alternativa tecnica al trattamento
con
bentonite
tramite l’utilizzo di pr oteine ricche di polisaccaridi che
hanno manif estato un ef f etto protettivo contro la f ormazione di tor bidit à
(W aters E.J., et al., 1993; 1994; Dupin I.V.S et al., 2000). Il composto che
ha
mostrato
maggiore
eff icacia
pr otettiva
è
r isultat o
essere
la
mannoprot eina kDa 420, della quale circa il 30% è costituit o da proteine
(W aters E.J., et al., 1994). Di altre glicoproteine è stata dim ostrata l’att ività
di
protezione
nei
conf ronti
degli
intorbidament i ,
come
ad
esempio
l’invertasi prodotta dai lievit i ( McKinnon B. M., 1996; Moine-Ledoux V. e
Dubourdieu D., 1999) e dai suoi f rammenti (Ledoux V. et al. , 1992; MoineLedoux V. e Dubour dieu D., 1999; Lomolino G. e Cur ioni A., 2007), oltre ad
una arabinogalattano-proteina da vino, e anche una ar abinogalattanoproteina
da
mela
(W aters
E.J.,et
al.,
1994).
L’esatt o
meccanismo
attraverso il quale le mannoproteine prevengano la f ormazione di torbidità
è ancora poco chiaro. E’ stato dimostrato che le mannoproteine non
aggregano tra loro e che la loro azione di interazione con le proteine del
vino porta a una r iduzione da 30 a 5 μm della dimensione delle particell e di
torbidità che si
f ormano dopo riscaldamento, rendendole praticamente
invisibili (W aters E.J. et al., 1993).
INTRODUZIONE
1.8
Test di valutazione e quantificazione
Vengono di seguito r iportat i alcuni dei test più dif f usi per la valutazione e
la quant if icazione della concentrazione pr oteica dei vini.
1.8.1 Bentotest
Il
bentotest
è
un
saggio
che
attraver so
l’impiego
di
un
reagente
denatur ante a base di acido f osf omolibdico consente di ident if icare
rapidamente la presenza di proteine nel vino . Il suo ut ilizzo è st ato
indic ato per una valutazione tecnica rapida del la quantità di bentonite
necessaria all’eliminazione delle stesse. Si ut ilizzano 10 ml di vino
(f iltrato all’occorrenza) al quale vanno aggiunti 1 ml di Bentotest. Si
procede mescolando e lasciando riposar e la solu zione per q ualche m inuto
(circa 5-7 minuti). Successivamente andranno messi a conf ronto il saggio
trattato con Bentotest rispetto al test im one non trattato: maggiore è la
concentrazione di proteine e maggiore sarà la torbidità osser vata. La
presenza
elevata
colorazione
blu,
di
f erro
rendendo
nel
così
vino
potrà
diff icoltosa
portare
la
tut tavia
ad
valutazione.
una
Q uesto
inconveniente può essere r isolto aggiungendo ai due cam pioni, test e
controllo,
una
quantità
di
perossido
di
idrogeno
che
annullerà
la
colorazione, rendendo così possibile la valutazione della tor bidità.
Per
valutar e
bassi
livelli
di
torbidità
viene
suggerito
di
illuminare
lateralmente la provetta su un f ondo scuro, osser vando i raggi luminosi
attraverso il liquido. Il test viene dichiar ato molt o sensibile, paragonabile
alla m isura con nefelometro. Per deter minare la quant ità di bentonit e
necessaria alla chiar if ica di un vino bianco o rosat o devono essere svolt i
dei saggi prelim inar i in labor atorio a dosi crescent i da 10 -20-40-60- 80
g/hl per poi determinare con Bentotest a quale concentrazione il vino si
presenta st abile, come illustrat o nel procedimento che segue:
INTRODUZIONE
INTRODUZIONE
1.8.2 ProtoCeck
ProtoCheck è un brevetto dell’Università degli Studi di Udine, (Celott i E.,
Dipartimento Scienze degli Aliment i - Università di Udine) prodotto e
distr ibuito in licenza esclusiva da EVER srl, Pramaggiore (Ve), si tratta di
un metodo innovat ivo che tiene in considerazione la disomogeneità delle
risposte f ornite dalle diverse metodiche atte a valutare la stabilit à
proteica dei vini. L’obiettivo pr ef issato da ProtoCeck è quello di essere
standardizzabile grazie al reagente anionico utilizzato, rapido poiché
f ornisce indicazioni nel tempo di 1 minuto, sf rutta l’elettropositività delle
proteine rendendolo così altamente specif ico, con bassa interf erenza
poiché i tannini, i polisaccaridi e la tor bidità non inf luiscono nella sua
valutazione, ut ilizzabile direttamente in cantina tramite l’impiego di un
semplice torbidimetr o. Inf ine non è necessar io procedere alla f iltrazione
del campione poiché la lettura è basata sul dif f erenziale di t orbidità tra “il
tal quale” e “a seguit o dell’aggiunta ”.
Conf rontato con altri tipi di indagini ProtoCeck, essendo basato sulla
elettroneutralizzazione
delle
pr oteine ,
consente
una
più
aff idabile
valutazione della potenziale instabilità proteica, non sovr astimando il
problema, of frendo inoltre la possibilit à di conf rontare i dati ottenuti in
laborator io rispetto a quelli ottenibili diret tamente in cant ina.
INTRODUZIONE
1.9
Valutazione di proteine e glicoproteine
Nell’ultim o
convegno
Enof orum
di
Ar ezzo
(maggio
2011)
è
stato
presentat o un nuovo metodo per la valutazione delle proteine nel vino,
basato
su
un
sist ema
di
precipitazione
f razionata
di
proteine
e
glicoprote ine del vino (Vincenzi S. et al., 2011). Nello studio è stato
evidenziato il r uolo delle glicoproteine nell’instabilità del vino, soprattutt o
di quelle der ivanti dal lievito, che sono ricche in mannosio, che secondo
W aters
E.J.
et
al.
(1991,
1992),
giocano
un
ruolo
decisivo
nella
prevenzione dell’aggregazione e della pr ecipitazione proteica. Si presume
pertanto che il rapporto tra proteine e glicopr oteine possa essere un
ulter iore indice di valutazione della stabilit à proteica dei vini.
Il metodo
prevede la denaturazione delle prot eine con sodio -dodecil-solf ato (SDS) e
la loro successiva precipitazione tramit e l’aggiunta di un sale (KCL). Le
glicoproteine mantenute in soluzione g razie alla por zione glicolisilata,
vengono successivamente precipitate m ediante acetone. Le due classi di
macromolecole
possono
essere
quindi
quant if icate
separatamente
mediante kit commer ciali. L’instabilità proteica è risultata essere correlata
non con il sem plice contenuto proteico t otale, ma piuttosto con il rapporto
tra le due f orme.
INTRODUZIONE
1.10 Metodi per la quantificazione
In letteratura sono indicati diversi metodi att i a quant if icare le proteine
del vino, non sempre però i risultati ottenuti con l’impiego di metodi
diversi f ornisce r isultati comparabili a causa della molteplicit à di composti
present i nel vino, quali ad esempio i polif enoli, o per via della necessit à
di procedere a concentrazione data la relat ivamente r idott a quantità di
proteine contenute nei mosti o nei vini, dando in tal modo luogo a sotto o
sovrast ima.
Alcuni metodi si basano su u n pr imo isolamento delle proteine seguito da
una
lor o
successiva
quant if icazione,
ad
esempio
calcolando
la
concentrazione di proteine come l’azot o totale della f razione esclusa
mediante cromatograf ia su Sephadex G -25 e moltiplicato per il f attore
6.25, come suggerit o da Feuillat M, et al. (1972) e da Somers T.C. e
Ziemelis G. (1973), che quantif icano invece l’ assorbiment o ottenut o a
280 nm utilizzando una separazione in esclusione con una colonna G -25
Sephadex. La crom atograf ia liquida è stata ut ilizzata anche da autori
quali T yson P.J., et al. (1981), Dubordieu D. (1986), Interesse F.S., et al.
(1987).
Il metodo proposto da Bradf ord (1976), risulta esser e tra i metodi
maggiormente dif f usi nei laborator i per l’analisi di most i e vini, viene
impiegato sia nella quantif icazione delle proteine che di altr i peptidi con
massa Mw> 3000, ma secondo quanto aff ermato da Tal M. et al. (1985) la
valutazione ottenut a sembrerebbe essere solo indicativa rispetto alla
reale concentrazione delle proteine , essendo il r isultato condizionato
dalla diversa risposta delle pr oteine al reagente e dall’assenza di una
proteina utilizzata come standard. Il metodo è basat o sulla r eazione delle
proteine e dei polipeptidi con il reatt ivo color ante Blu Coomassie G -250
con f ormazione di un composto colorat o con assorbanza a 595 nm. Per i
peptidi non ci sono dei metodi specif ici, vengono generalmente calcolati
come dif f erenza tra l’azoto totale moltiplicato per 6.25 e la somma di
amminoacidi liber i e proteine.
INTRODUZIONE
1.10.1 Metodi per la caratterizzazione di proteine e peptidi
Le proteine nel mosto e nel vino sono generalment e presenti in piccole
propor zioni
(<100
mg/L
normalmente)
ed
è
pertant o
necessario
innanzitutto concent rare il campione pr ima dell' analisi elet trof oretica o
cromatograf ica. E' inoltre necessar io eliminare i composti che possono
interf erire nell'analisi: sali, compost i f enolici, piccoli peptidi, etc.. Correa
e Polo (1991) riassumono in modo esaustivo le tecniche per l'isolamento
e l'analisi della f razione proteica di most i e nei vini.
Dei diversi metodi propost i in letterat ura per isolar e le pr oteine e per
eliminare i compost i a basso peso molecolare , la dialisi, seguita dalla
liof ilizzazione e concentrazione dei dializzat i, risulta essere uno de i
metodi più semplici per ottenere d ei buoni risultat i. ( Bayly F.C. et al., 1967) ;
(Correa I., et al., 1988); (Moreno-Arribas V., et al., 1999);
(Luguera C., et al., 1998); (Moretti R.H. e Berg H.W., 1965),; (Lamikanra O. e Inyang
I.D., 1986); (Moio L. e Addeo F., 1989); (Polo M.C, et al., 1991); (Luguera C, et al.,
1997).
Analogamente alla dialisi, anche l ’ultr af iltrazione è stata largamente
applicata all’isolamento e alla concentrazione delle proteine del vino
(Feuillat M. et al., 1972), (Somers T.C. et al., 1973), (W aters E.J. , et al.,
1992) e (Dizy M. e Bisson L.F., 1999). Una vasta gamma di membrane di
var i
materiali,
superf ici
di
f iltrazione,
e
cut-off
sono
disponibili
in
commercio, permett endo a campioni di dimensioni var iabili, da pochi
microlitr i f ino a diversi litr i, di essere frazionati in modo abbastanza
veloce. (Feuillat M. et al., 1972) – (T.C. Somers e Ziemelis G., 1973) –
(W aters E.J et al., 1992) – (Dizy M. e Bisson L.F., 1999).
Un altro metodo ut ilizzato è legato alla precipitazione della f razione
proteica e pept idica dei vini, sf ruttando la precipitazione di cristalli di sale
dovuta all’aggiunt a di sali concentrat i, ad esempio solf ato di ammonio
(Koch J. e Sajak. E, 1959) – (W aters E.J, et al., 1995) – (W aters E.J. et
al., 1996) o mediante l’aggiunta di solventi organici come etanolo e
metanolo (Poux C. and Ournac A.,1976) – (Usseglio-Tomasset L. e
Cast ino M., 1975) – (Villettaz J.C., 1988) -
(Santoro M., 1995), acetone
(Drawert F. et al., 1973) – (Drawert F. et al., 1974), o acidi come acido
INTRODUZIONE
tricloroacetico,
(Yokotsuka K,
acido
solf osalicilico
o
tungstenico/acido
f osf orico
et al., 1975) – ( Mor etti R.H e Berg H.W ., 1965) – (Bayly
F.C. e Berg H., 1967)
Sono st ate descritt e anche tecnic he c ombinate di ultraf ilt razione con
precipit azione di solf ato di ammonio (W aters E.J, et al., 1991) . Va tuttavia
sottolineato
comunque
che
la
interf erire
precipit azione
con
l’analisi
mediante
delle
tutti
proteine
questi
agenti
stesse
poiché
p uò
le
sostanze a basso peso molecolar e possono essere assorbite dalle
proteine. Pertanto, dopo la precipitazione deve seguire una f iltrazione o
centrif ugazione per separare le proteine dai peptidi solubili e/o una dialisi
per l’elim inazione dei sali.
1.10.2 Separazione con tecniche elettroforetiche
I metodi elettrof oretici corr ispondono f orse alla tecnica più datata tra
quelle utilizzat e per la caratter izzazione delle pr oteine. Tali tecniche, in
particolare la elettr of oresi capillare ( EC) sono progredite notevolmente
negli ultimi anni, avvalendosi dell’utilizzo del supporto di gel acr ilamide,
che ne ha migliorato la risoluzione.
Mediante la Nat ive- PAGE, le proteine vengono separ ate in base alla
relazione carica/massa. L’elettrof oresi Native delle proteine totali del
mosto è una tecnica semplice e, secondo diversi aut ori, vitigni diversi
hanno pr of ili elettr of oretici diversi (Bayly F.C. e Berg H.W ., 1967) (González-Lar a R. et al., 1989) e (Polo M.C, et al., 1991).
Il metodo più ampiamente utilizzato in letteratura è quello di Hillier (Hillier
R. M., 1976) con il processo di colorazione (staining) in accordo con
quanto def inito da W inter et al. (1977) e da
Pueyo et al. (1993),
mediante elettrof oresi Native, hanno ottenuto pr of ili elettroforetici simili
per most i provenient i dagli stessi vit igni, che dif f eriscono da q uelli di altre
var ietà.
Utilizzando
la
denaturazione
con
SDS-PAGE,
le
pr oteine
vengono
separate principalmente in base alla loro dimensione molecolare, il che
permette di st imarne il peso molecolare. Le condizioni per la separazione
INTRODUZIONE
elettrof oretica dipende dal range di peso molecolare delle proteine o dei
polipeptidi da analizzar e. Per le proteine > 15 kDa è possibile utilizzare il
metodo descritto da Laemli (Laemli U.K., 1970) e il metodo di colorazione
di W inter et al. (1977).
Le tecniche di isoelettrof ocalizzazione ( IEF, IsoElectricFocusing) sono
ritenute ad alta capacità di r isoluzione per proteine che diff eriscono per la
loro car ica netta. Quando una proteina si trova in una matrice con pH
var iabile, soggetta a un campo elettrico, si muove verso l' elettrodo con
carica opposta. La proteina m igra verso un punto del gradiente di pH in
cui la sua car ica net ta è par i a zer o, che è def init o punto isoelettr ico (p i).
Questo metodo elettrof oretico è stato utilizzato per l'analisi delle proteine
del mosto e del vino su gel di agarosio ( Anelli G., 1977), poliacrilamide in
tubo (Hsu J.C. e Heatherbell D. A., 1987) e ( Marshall T. e W illiams K. M.,
1987), e poliacrilam ide su lastra ( Moio L. e Addeo F., 1989) - (Polo M. C.
et al., 1991) - (Görg A, e Postel W ., 1982) - ( Murphey J. M. et al.,1989) (Correa-Gorospe. et al.,1991) e (Yokotsuka K. et al., 1991) e (Pueyo E.,
et
al.,
1993)
hanno
utilizzato
l’I EF
convenzionale
su
gel
di
poliacrilammide commerciale con un pH compreso tra 3,5 e 9, 5 per
determinare i pr of ili elettrof oretici di mosti e di vini di uve diverse.
Luguera et al. (1998) hanno caratter izzato var ie f razioni pr oteiche di un
mosto
Chardonnay
con
I EF
utilizzando
lo
strumento
automatizzato
Phast System ™ (Pharmacia- LKB).
L’IEF ha consent ito di riconoscere un numero maggiore di bande in mosto
e vino rispetto a N ative- PAGE e SDS- PAGE. Le f razioni che secondo
molti autori maggiormente contribuiscono all' instabilità del vino sono
quelle con peso molecolare compreso tr a 20 e 30 kDa e con pi super iore
al pH del vino ( Hsu J.C. e Heather bell D.A., 1987), (W aters.E.J, et al.,
1992) - (Paet zold M. et al.,1990) e (Ledoux V. et al.,1992).
Un metodo capace di f ornire una grande capacità di inf ormazioni ma
tuttavia meno ut ilizzato è l’elettrof oresi bidimensionale . Autori come Görg
A. et al. (1982), Lamikanra O. e Inyang I.D (1986), Hsu J.C. e Heather bell
D., (1987) e Marshall T. e W illiams K. M., (1987) l’hanno utilizzata in
combinazione con I EF e SDS- PAGE.
INTRODUZIONE
Proteine separ ate mediante elettrof oresi su gel possono essere trasf erite
elettrof oreticamente su una membrana di nitrocellulosa per ef f ettuare test
di
immunolocalizzazione,
quali
W estern
blotting
e
im munoblotting.
Recentemente sono stati sviluppat i anticorpi spe cif ici contro le proteine
totali o specif iche di un vino portoghese, con lo scopo di analizzare
l’origine e la somiglianza strutturale d i proteine del vino pr ovenient i da
diversi vit igni ( Mont eiro S. et al., 1999) e (Ferreira R.B. et al., 2000).
Sebbene le tecniche immunologiche non siano state ancor a dif f usamente
applicate allo studio delle proteine del vino, ci si attende che nuove
applicazioni di met odi immunologici emergeranno per la determinazione di
questi compost i, e che saranno com binat i con altre tecniche, sia di
spettroscopia che di separazione, per migliorare la velocità e la selettività
delle analisi.
L’elettrof oresi capillare ( EC) negli ult imi anni si è dimostrata tecnica
veloce e ut ile nell'analisi di biopolimer i, t uttavia, sono ancora pochissime
le applicazioni per la separazione delle proteine del vino e polipeptidi. I
capillar i di s ilice sono i più ut ilizzati, ma soff rono di un def icit importante:
l'adsorbimento delle proteine sulla par ete del capillare. Tra le varie
soluzioni proposte, Cif uentes ( Cif uentes A. e Poppe H., 2000) hanno
dimostrato che l'uso di capillar i r icopert i, unitamente all’uso di additivi
polimer ici nel buf f er di separazione conduce a separazioni veloci e
altament e r iproducibili. Ledoux V. et al. (1992) ha applicato questa
tecnica per def inir e la natura delle molecole responsabili della rottura
proteica nel vino, utilizzando un capillar e di silice f usa e un tampone 20
mM acido citr ico a pH 2,5. Più di recent e, Luguera C. et al. (1997) hanno
sviluppato un metodo EC per l'analisi delle proteine del vino tramite un
capillare di silice f usa non r ivest ito. L'uso di EC ha consentito per la
prima volta di studiare i prof ili proteici dei vini spumant i durante la loro
produzione,
im possibile
da
r ealizzare
utilizzando
altre
tecniche
di
elettrof oresi, quali l’elettrof oresi convenzionale Nat ive- PAGE.
Dizy M. e Bisson L.F. (1999), hanno anch’essi
studiato l' elettrof oresi
capillare a zone per l'analisi delle prot eine del vino e, in accordo con
Luguera et al. (1997), hanno anche convenuto su l f atto che le proteine
vino sono f acilmente separabili mediante tamponi basici.
INTRODUZIONE
1.10.3 Separazione con tecniche cromatografiche
Diversi r icercatori hanno usato la cromatograf ia liq uida (LC) nelle sue
diverse modalità, f ase inversa (RP), esclusione molecolare, aff inità e
scambio ionico, per analizzare e f razionare le proteine del succo d' uva
e/o del vino. Dubordieu D. et al. (1986) hanno impiegato una colonna ad
esclusione molecola re con acqua come solvente, per st im are il peso
molecolare delle proteine del vino, mentre Santoro M. (1995) ha separ ato
e raccolto le proteine solubili di most i e vini in reverse phase ( RP)-LC
utilizzando una colonna C18. Marchal et al. (1996) hanno isolato diverse
proteine a basso peso molecolare mediante cromat ograf ia per
aff inità
con lect ine immobilizzate ed ottene ndo così inf ormazioni sulla struttura
delle pr oteine del vino, che sono, nella loro maggioranza, glicoproteine .
Utilizzando la LC a scambio anionico, Yokotsuka K. e Singleton VL.,
(1997)
hanno
ottenuto
f razioni
proteiche
diverse
che
sono
state
successivamente caratterizzate da altr e tecniche cromatograf iche ed
elettrof oretiche.
Polo et al. (1991) utilizzando la size exclusion (SE) -LC, hanno stabilito
che la maggior parte dei picchi cromatograf ici è distribuit a in una r istretta
gamma di pesi molecolari, che vanno da 11.000 a 40.000 Da. Questa
tecnica
permette
di
ottenere
inf ormazioni
sul
peso
molecolar e
approssimat ivo delle proteine, e può essere consider ata complementar e
alla SDS- PAGE. Utilizzando l a LC ad interazione idrof obica, è stat o
possibile condurre uno studio comparativo sulle variazioni nella f razione
proteica durante la produzione di quattr o vini spumante spagnoli ottenut i
con il metodo Champenoise ( Cavas) durante la loro maturazione a
contatto con il lievito ( Moreno-Arr ibas M.V. et al., 1995). Così come
consente di separare le proteine, questa tecnica permette anche di
valutare la lor o idr ofobicità relat iva e il peso molecol are.
La Fast protein liq uid chromatography (FPLC) è stata progettata e
sviluppata specif icat amente per la separazione di biomolecole. E’ una
tecnica non- denat urante, che f acilita l'uso di colonne ad alt a risoluzione
INTRODUZIONE
con capacità sia analit ic a che semi-pr eparat iva, ottenendo risultat i in
breve tempo. La FPLC includ e lo scambio ionico, la chromat of ocusing, la
f ase inversa, la gel f iltrazione e la cromatograf ia di aff inità. Prof ili
cromatograf ici ottenuti con Fast protein -LC con scambio cationico sono
stati utilizzat i per la caratterizzazione delle proteine del vino ( Monteiro S.
et al., 1999), (Dorr estein E. et al., 1995) e (Canals J. M. et al., 1998).
Tuttavia, poiché le proteine del vino sono pr incipalment e acide (Pueyo E.
et al., 1993) - (Sant oro M., 1995) - (Gör ge A. et al., 1982) - ( Marchal R,
et al., 1996) e le diff erenze tra di lor o si basano più sul loro p i piuttosto
che sul loro peso molecolare, è probabile che la tecnica più adatta al loro
studio
sia
la
cr omatograf ia
a
scambio
anionico.
Ut ilizzando
la
cromatograf ia a scambio anionico, Lagace L.S. e Bisson LF. (1990),
hanno studiato l'att ività proteolit ica di lieviti diversi sulle prot eine del vino
bianco e W aters E.J. et al. (1995) hanno f razionato le proteine solubili
caratterizzandole con SDS-PAG E.
La
cromatograf ia
a
scambio
anionico
è
stata
anche
utilizzata
per
conf rontare i prof ili proteici di quattro vini portoghesi bianchi (Dorreste in
E. et al., 1995).
INTRODUZIONE
1.11 Metodi di rilevamento
La rilevazione di proteine con tecniche convenzionali elettrof oretiche ( ad
esempio,
Native-PAGE,
SDS-PAGE,
I EF)
viene
eff ettuata
mediante
l’utilizzo di sostanze colorant i. La color azione con blu Coomassie G -250,
secondo W inter et al. (1977), è quella utilizzata più comunemente. Per i
campioni con basse concentrazioni di pr oteine, la colorazione con nitrato
d'argento, seguendo il m etodo di Blum et al. (1987) è la più adatta, per la
sua maggiore sensibilità. Sec ondo alcuni autor i la sua sensibilità è f ino a
100 volte superiore a quella di Blue Coomassie e molto simile a lla
autoradiograf ia, una tecnica a raggi X su f ilm che permette di visualizzare
molecole
o
f rammenti
di
molecola
opportunamente
marcat i
radioattivamente. Oltre a questi metodi di colorazione gener ale possono
essere utilizzat i altr i metodi di colorazione specif ica, come ad esempio
l'acido per iodico di Schif f (PAS), che è un metodo di color azione specif ico
per le glicoproteine, (Eckhardt A.E. et al.,1976).
1.11.1 Spettrometria di massa (MS)
La spettrometria di massa ( MS) è una tecnica analit ica basata sulla
separazione d i molecole ionizzate ( ioni gassosi) in base al loro rapporto
specif ico massa/car ica. MS è stata inizialmente considerata una tecnica
off -line, ma lo sviluppo di nuove int erf accia e sist emi di ionizzazione, ha
permesso il suo accoppiament o con LC e con CE. Utilizzando nuove
tecniche di ionizzazione , come la ionizzazione elettrospr ay (ES I) e di
desorbimento/ ionizzazione
laser-assistita
( MALDI),
accoppiate
a
quadrupoli, settor e magnetico, analizzat ori di tempo di volo o MS - MS in
tandem, è possibile ottenere maggior i inf ormazioni sulla st ruttura delle
molecole, dif f icilmente ottenibili con altri metodi.
OBIETTIVI
2
OBIETTIVI
La richiest a di metodologie r obuste, rapide e tecnologicamente aff idabili per la
stima dell’instabilità proteica potenziale dei vini, in particolare bianchi e
rosati, cost ituisce ancora oggi una sf ida interessante per la chim ica analit ica
applicata all’enologia.
In questo lavoro di te si si ver if icherà l’applicabilità di una strumentazione
elettrof oretica dedicata normalmente alla caratterizzazione del DNA, RNA e
proteine in ambito biochim ico e biomedico alla def inizione dei prof ili proteici
dei vini.
In prima battuta si verif icherà qu ale sia la migliore strategia di separazione e
purif icazione delle proteine del vino in ragione della complessità della matrice,
in particolare la presenza signif icativa di tannini capaci di legare le prot eine.
Nello specif ico, si conf ronteranno gli approc ci basati sulla separazione per
precipit azione r ispetto alla ultraf iltrazione dei campioni.
Si approf ondiranno le potenzialità di indagine dei prof ili proteici dei vini
utilizzando kit analit ici studiati per il r ange 10÷80 kDa che nel r ange 10÷230
kDa. Si ver if icherà la presenza di bande proteiche singolarmente classif icabili.
Si approf ondirà la possibilità di ut ilizzo di standard interni per il miglioramento
dell’accuratezza di quantif icazione e del SDS per il m iglioramento della
risoluzione delle bande.
Si indagherà l’azione della bentonite come stabilizzante proteico sulle singole
bande proteiche.
Si ut ilizzerà la metodologia proposta su una campionatura di vini giovani non
stabilizzat i per indagare le possibili cor relazioni tra i lor o contenut i prote ici,
espressi anche come singole bande, e i r isultat i di test di valutazione
“classici” della stabilità proteica.
SVILUPPO DI UNA METODICA PER LA CARATTERIZZAZIONE DELLE PROTEINE DEL VINO
3 SVILUPPO DI UNA METODICA PER LA CARATTERIZZAZIONE
DELLE PROTEINE DEL VINO
3.1
Materiali e Reagenti
-
Agilent Prot ein 80 (code 5067 -1515 lot to MD23BP02):
-
Protein chips (25chips + electrode cleaner)
-
Agilent Prot ein 80 Reagent Part I (Dye Concentrate -Gel matrix-spin
f ilter)
-
Agilent Protein 80 Reagent Part II (Sample buf f er -Ladder)
3.1.1 Protocollo "Agilent Protein 80 Kit Guide" (code G2938-90062)
- Chip print station (recorder number 5065 -4401) + Syr inge kit
- Dit hiothreitol (DTT as reducing agent) >99.5% (code 43815 -5g, Fluka,
Milano, Italy)
-
Sodio acetato anidr o RP E- ACS >99% (code S8750 -1Kg, Sigma, Milano,
Italy)
- Soluzione a base di coadiuvant i prot eici e altro(per un contenuto totale di un
1 g/l):
-
167mg/L Pulviclar (gelatina in polver e solubile; ESSECO, Trecate,
Novar a, Italy),
-
167mg/L Goldenclar (Esseco Group , San Martino Trecate, Italy)
-
167mg/L
Oliver
Clar
Green
(Oliver
Ogar
Italia
spa,
Montebello
Vicentino, Italy)
-
167mg/L Fitopr oteine,
-
167mg/L collagene,
-
167mg/L PVPP per uso enologico.
- Anidr ase car bonica (code C3934 - 100mg Sigma, Milano Italy)
- Bovine A lbumin (BSA) >98% (code A7030 -10g Sigma, Milano, Italy)
- Sodium dodec yl sulf ate (SDS) >99% (code 436143 - 25g Sigma, Milano, Italy)
- Potassio Clorur o RPE -ACS >99.5% (code 471176 - 500g Analyticals Car lo
Erba, Rodano, Italy)
- Acqua deionizzat a
3.1.2 Reagenti del kit Agilent Protein 80
I reagenti del kit sono stati pr eparat i seguendo il pr otocollo previsto dal
produttore Agilent .
- Gel Dye Mix:
650uL di Pr otein 80 Gel - Matrix sono trasf eriti nel f iltro da centrif uga f ornit o
nel kit e centr if ugati per 15 m in a 4100 r pm, dopodiché si aggiungono 25uL di
Dye concentrat o e si omogeneizza su Vor tex per 10 -20 s.
- Destaining Solution:
650uL di Pr otein 80 Gel - Matrix sono trasf eriti nel f iltro da centr if uga del kit e
centrif ugati per 15 m in a 4100 rpm.
- Denaturing Solution:
3.5 % vol di DTT 1M (1ul) sono aggiunti al Sample Buf f er; si omogeneizza per
5s.
3.1.3 Preparazione di Campioni e Ladder
Si combinano 4uL di campione con 2uL di denaturing solut ion in una vial da
0.5 mL ed in
una vial da 0.5 mL a parte 6uL di Ladder.
Si centr if ugano le
vials per qualche secondo
in modo da garantire
il
mescolamento del campione c on la denaturin solution e riunire la f razione
liquida sul f ondo (spesso le gocce aderiscono alle paret i e tendono a non
mescolarsi). Le vial sono poi poste a 95°C per 5 min nel termoblocco e
lasciat e poi raf f reddare per qualche minuto sino a raggiungiment o della
temperatura ambient e, dopodiché si centrif ugano nuovament e per raccogliere
anche l'eventuale condensa f ormatasi sulle par eti. I campioni
ed il Ladder sono poi diluit i con 84 uL di acqua e miscelat i con Vortex.
3.1.4 Attrezzature e materiali
- Vortex I KA MS 3 Vortexer 2400 rpm (Agilent Technologies, Milano, Italy)
- Vortex Mult i Reax (Heidolph, Milano, Italy)
- Timer Roth (Agilent Technologies, Milano, Italy)
- Centrif uga Thermo Scientif ic IEC CL31 Multispeed
- Micro Centr if uga alta velocità Scilogex ref rigerata (Berlin, CT, USA)
- Termoblocco Falc (Treviglio, Bergamo, Italy)
- Bagno termostatico Jolly 1 Falc (Treviglio, Bergamo, Italy)
- Mixer rotante Torrey Pines Scientif ic (Carlsbad, CA, USA)
-
Pipette
(10uL,
20uL,
100
uL
and
1000
uL)
con
puntali
compat ibili
(Vetrotecnica, Padova, Italy)
- Centr if ugal f ilter units Am icon Ultr a 0.5mL 10 kDa (code UFC501096
Millipore, Milano, Italy)
- 0.5mL microcentr if uge tubes (Serstedt, Verona, Italy)
- 2mL microcentrif uge tubes (f ornite con i f iltri Amic on Ultra)
- Provette coniche graduate PP 17x120
15mL (code 84000 Kartel, Noviglio,
Italy)
- f iltri cellulosa 0.45um (Sartorius, Bagno a Ripoli FI, Italy)
3.1.5 Strumenti
Agilent
Bioanalyzer
2100
(Lab
Chip
Caliper)
num.
serie
(Sof tware Agilent Tec hnologies 2100 Bioanalyzer - 2100 Expert)
DE72905099
I saggi elettrof oretici f ornit i da quest o strumento si basano sui pr incipi
tradizionali dell’elettrof oresi su gel che qui sono stati trasf eriti in un f ormato
chip. L’elettrof oresi può essere ut ilizzata per l'analisi di DNA, RNA e proteine.
Il f ormato del chip, specif icamente concepito e diverso per le diverse classi di
polimer i nat urali, r iduce signif icat ivamente i tempi di separ azione e il consumo
di
campione.
In
questa
manier a
il
sist ema
f ornisce
automaticamente
inf ormazioni sulle dimensioni e sulla quantif icazione dei picchi in un f ormato
digitale. Sul chip sono ospitat i dei pozzetti per i campioni, per il gel ed uno
per lo st andard esterno (Ladder). Dei micro -canali realizzati in vet ro creano
delle ret i interconnesse tra questi pozzi .
Durante la f ase di preparazione preanalitica del chip i micro -canali vengono
riempiti, manualmente tramite una sir inga, con un polimer o caratterizzato da
una matrice ret ico lar e f iltrante (sieving polymer) e un colorante fluorescente.
Una
volta
che
i
pozzi
e
canali
sono
pieni,
il
chip
viene
posizionato
nell’analizzatore dove 16 elettrodi entrano nei pozzetti ed esso diviene un
ver o e proprio circuito elettrico integrato con
ogni elettrodo pilotato da un
generatore di alimentazione indipendente.
Durante
la
f ase
analit ica
le
biomolecole
car iche
sono
guidate
elettrof oreticamente da un gradiente di potenziale elettrico così come avviene
nell’elettrof oresi su gel in lastra. A caus a del lor o specif ico r apporto massa su
carica
e
della
presenza
del
ret icolo
polimer ico,
le
molecole
sono
progressivamente separate su base dim ensionale con i f rammenti più piccoli
che m igrano più velocemente di quelli più grandi, mentre molecole di
colorante si insinuano nelle micelle pr oteina -SDS ( o nel caso di analisi di
DNA, tra i f ilament i di DNA). Quest i com plessi colorati vengono inf ine rilevati
come f luorescenza indotta da laser.
I dati di f luor escenza misurat i possono essere visualizzati o come band e su
gel (a sinistra nella f igura sotto riportata ) o come picchi su elettrof erogrammi
(a destra).
Con l'aiuto di uno st andard esterno (Ladder), un mix di molecole di dimensioni
e concentrazioni not e, è possibile convertire i t empi di migrazione misurati in
secondi (s) in dimensione dei f rammenti espr essi come peso molecolare
(kDa).
Per il campione è quindi possibile stim are per ogni f rammento a part ire dai
tempi di migrazione misurat i la sua dimen sione. Inoltre, in ogni campione
analizzato sono aggiunti due f rammenti marcatori ( Lower e Upper Market) che
racchiudono in basso ed in alto il campo di misur a. Upper e Lower marker
sono impiegati come standar d interni, ut ilizzat i per allineare specif icame nte i
dati del campione Ladder con quelli misurat i su ogni campioni. Quest o è
necessario per com pensar e gli ef f etti di der iva che possono ver if icarsi nel
corso di una singola corsa su chip.
La quant if icazione delle proteine nel campione è f atta f acendo r if erimento alla
concentrazione nota dell’Upper Marker, standard interno di quantif icazione,
conf rontando la sua area con le ar ee dei picchi da quantif icar e. Oltre a questa
quantif icazione relat iva, una quantif icazione assol uta di specif iche proteine
può essere ef f ettuata utilizzando uno standard est erno delle stesse proteine .
3.1.6 Caricamento del chip
Si posiziona il chip sulla Chip Prim ing Station e si pipettano nel pozzetto 12uL
di Gel Dye, dopodiché si pressur izza il pozzetto con la sir inga per un minuto.
Questo
passaggio
va
ef f ettuato
con
cautela
visto
che
determina
il
posizionamento del gel all' inter no del chip. A questo punto si pipettano 12 uL
di gel dye e 12 uL di destaining solut ion negli altri 4 pozzett i contrassegnat i.
Inf ine si pipettano 6uL di campione e 6uL di Ladder nei pozzetti a loro
destinati. I l chip così preparato deve essere analizzato immediatamente .
Chip Priming Station
3.2 MESS A A PUNTO E VERIFICA DELLA PREP AR AZIO NE DELLE
PROTEINE DEL VINO CON ESTRAZIONE MEDI ANTE PRECIPITAZIONE
IN ALCOOL
3.2.1 Preparazione del precipitato
5mL di vino bianco sono aggiunt i a 25mL di alcool (96%) od in alternativa a 25
mL di alcool acidif icato HCl ( 0,16mL HCl (1:2) in 12,5mL alcool) e mes si una
notte a f reddo in f rigo (2 -4 ° C). Si centrif uga 10minuti a 4100 rpm, si elimina il
surnatant e ed il precipitato viene lavato due volte con altri 10mL di alcool ed
inf ine r ipreso con 1 mL di soluzione buf fer.
4ul della soluzione così preparata sono t rattati come da prot ocollo e vengono
poi car icat i sul chip del Kit Protein 80 secondo le modalità standard indicate
dal costruttore.
Valutazione della r ipetibilità del metodo per precipit azione in alcool 96%. In
f igura
seguente
è
riportato
il
graf ico
(ele ttrof erogramma)
relativo
alla
separazione su base tempo della f razione proteica presente in tre precipitat i
ottenuti da uno stesso vino in PBS.
Le bande pr oteiche present i tra circa 20 e 35 secondi (corr ispondent i a circa
8.4- 48.15 KDalton) presentano una accettabile r ipet ibilità conf ermando la
robustezza dell’appr occio preparativo.
Valutazione del Buffer ottimale per la dissoluzione del precipitato in alcool.
Secondo le specif iche del manuale del f ornitore del Kit Prote in 80 sono
ritenut i compat ibili le soluzioni buf f er indicate nella tabella sotto riportata:
Per le caratterist iche di sicur ezza ed economicità dei r eattivi, nonché di
rapidità del metodo in via di sviluppo, si è scelto di te stare le seguenti
soluzioni buf f er:
- 10m M EDTA
- 10 m M NaOH
- 20 m M NaAc
- PBS + urea 6M
- 10m M HCl
Procedendo alla dissoluzione del pr ecipitato si è osser vat o tuttavia che il
precipit ato disciolto con NaO H permaneva torbido, mentre quello con EDTA
non
si
scioglieva
completamente
lasciando
dei
grumi.
NaAc
e
l' HCl
scioglievano invece il precipitato in maniera veloce e complet a.
Nella
f igura
sotto
sono
r iportat i
i
graf ici
analizzando il precipitato disciolto nei var i buf f er.
della
separazione
ottenuta
Si notano sia eff etti di spostamento dei tempi che di area diversa delle bande
misurate. Le m isur e caratterizzate dalle aree maggiori (maggiore f razione
proteica disciolta o maggiore resa colorimetrica nella misura) sono state
quelle in NaAc, EDTA ed HCl (che si e' spost ato maggiormente nei tempi
rispetto agli altri, pur individuando un numero di bande magg
ior i rispetto
agli altri).
Il PBS non è stat o considerato adatto per le minori aree. NaAc è stat o
considerat o il più adatt o alla preparazione.
3.2.2 Valutazione e scelta del Buffer ottimale per la
dissoluzione del pr ecipitato in alcool acidificato
Il campione dopo pr ecipitazione in alcool acido (0, 16mL HCl ( 1:2) in 12,5mL
alcool) è stato ripr eso con i diversi buf f er.
Le aree dei
picchi (Figur a pagina seguente), pur non particolarmente
dif f erenziate f ra i var i buf f er, sono visibilmente m inori r ispetto ai relativi
precipit ati pr eparat i in alcool f acendo r it enere questa preparativa con alcool
acidif icato poco adat ta.
Applicazione del met odo con precipitazione in alcool e dissoluzione in PBS ed
analisi di un vino a vari livelli di residuo proteico
Si è pr eparat o un vino a livelli decrescenti di residuo proteico grazie al
trattamento progressivo con bentonite (10 g/hl, 50 g/hl, 100g/hl) su di un vino
tecnologicamente instabile.
Come si può notare in nella tabella sotto e relat iva f igura l’area delle bande
proteiche, consider ate tecnologicamente instabili (present i tra circa 20 e 35
secondi) e rimuovibili con l’aggiunta di un coadiuvant e specif ico, dim inuiscono
f ino quasi a sparire con le dosi maggiori di trattamento.
vino base
tatt.10gr/hl
tratt.50gr/hl
tratt.100gr/hl
Area
331,2
179,4
50,5
42,7
area totale proteine instabili
Abbattimento con bentonite
350
300
250
200
150
100
50
0
vino base
tatt.10gr/hl
tratt.50gr/hl
tratt.100gr/hl
3.3
MESSA A PUNTO E VERIFICA DELLA PREPARAZIONE DELLE PROTEINE DEL
VINO CON ESTRAZIONE MEDIANTE ULTRAFILTRAZIONE
L'ultraf iltrazione ( UF) è un processo di separ azione molt o più delicato e
“morbido” per i soluti rispetto ad un processo quale la precipit azione in
solvente. L’UF è considerata più ef f iciente perché può simultaneamente
concentrare e desalinizzar e i solut i. Non richiede inoltre un cambiamento di
f ase, che potrebbe denatur are le specie più labili, e può essere eseguita a
temperatura ambiente. L’Ultraf iltrazione è un processo di separazione di
particelle disperse estremamente piccole e di molecole d isciolte in f luidi. Alla
base della separazione vi sono le dimensioni della molecola, pur ricordando
che in tutti i pr ocessi di f iltrazione la permeabilità del mezzo f iltrante
(tipicamente
da
3
a
100
kDa)
può
essere
inf luenzata
anche
dalle
caratterist iche chimiche, molecolar i o elettrostatiche del campione.
Essa può separare
molecole che diff eriscono di almeno un ordine di
grandezza nelle dimensioni e pertant o molecole di dimensioni sim ili possono
non essere separate dall’ultraf iltrazione. Compost i con p eso molecolare ( MW )
da
1K
a
1000K
possono
essere
trattenute
da
alcune
membrane
di
ultraf iltrazione, ment re passano i sali e l’acqua. Anche i materiali colloidali e il
particolato possono esser e trattenut i. Esse possono esser e utilizzate sia per
la pur if icazione di miscele con il recupero del liquido che passa attraverso il
f iltro, sia per raccogliere il materiale solido trattenut o sul f iltro stesso. In
particolare le molecole o i particolati trattenuti dal f iltro possono essere
separat i dai contaminant i a più basso peso molecolare o concentrat i. Le
membrane di ultraf iltrazione in genere hanno due strati distinti: uno sottile
(0,1-1,5 micron) superf iciale con diam etro dei por i di 10 -400 Å e una
sottostruttura più porosa. Qualsiasi molecola in grado di passa re attraverso i
pori della pelle superf iciale può quindi liberamente passare la membrana.
http://www.millipore.com
L'aumento della temperatura di esercizio normalment e aumenta la velocità
della
UF.
Una
temperatura
più
alta
au ment a
la
diff usività
del
soluto
(tipicamente 3-3,5% per grado Celsius per le proteine ) e dim inuisce la
viscosit à della soluzione. Pratica comune è pertanto quella di operare alla
temperatura
più
alta
tollerata
dai
soluti
e
dalle
attrezzature.
3.4 MESSA A PUNTO E VERIFICA D ELLA PREPARAZIONE DE LLE
PROTEINE PER SEPARAZ IONE MEDIANTE ULTRAF ILTRAZIONE PER
CENTRIFUGAZIONE CON UTILIZZO DI MEMBRANE DA 3KDA
Si è cercato di ot tenere una adeguata estrazione e purif icazione delle
proteine, in particolare rispetto ai polif enoli del vino capaci di interagire con
esse alterando la risposta analit ica, median te l’ut ilizzo di un f iltro -membrana
con cut-of f a 3kDa.
Microcon
3K
device
centrif ugazione
( Millipore):
semplice
ed
è
un
ef f icient e
disposit ivo
per
per
concentrare
f iltrazione
e
sotto
desalinizzare
soluzioni macromolecolari d i 10-500 uL. Si può ut ilizzare qualsiasi centrif uga
che possa accettar e provette da 1,5 mL. Prestazioni ottimali si ottengono
utilizzando una cent rif uga con rotore ad angolo f isso. Il m odello YM - 3 ( yellow
top) arriva ad un cut -off nominale (Nom inal Molecul ar W eight Limit, NMW L) di
3,000 Dalton. Dopo la f ase di f iltrazione sotto centrif ugazione nel f iltro cartuccia rimane il solo deposito proteico secco che viene ricuperato per
inversione del f iltro stesso ed aggiunta di idoneo buf f er.
3.4.1
Estrazione delle proteine
La pr eparat iva per l’estrazione del mat eriale proteico avviene centrif ugando
0.5 mL di campione su apposit o supporto dotato di f iltro - membrana con
porosità da 3 kDa. La frazione proteica viene separata per trattenimento
sul filtro -membrana dopo circa 110 min di centrifugazione a 4100 rpm.
Quindi si lava la frazione solida raccolta sul fondo con 0.4mL di H2O (90
min a 4100 rpm).
Si r ecupera il deposito proteico così trattenuto, capovolgendo il f iltro e
f acendo passare in direzione opposta al campione 50uL di soluzione buf f er
AcNa 20m M. La f razione prot eica disciolta nel buff er viene così raccolta nella
vial sottostante.
La due vie di prepar ativa, per precipitazione in alcool e r ipresa in AcNa e per
ultraf iltrazione e dissoluzione in AcNa (i tracciati r osso e blu di f igura X,
rispett ivamente), mostrano una m igliore risposta Per l’altezza dei picchi nel
caso di ut ilizzo dell’ultraf iltrazione. I l tr acciato in verde evidenzia come una
secondo
lavaggio con buff er
f razione proteica,
del f iltr o -membrana non r ecuper i ulter iore
conf ermando come
tale processo sia
sostanzialmente
quantitativo.
Ricerca di un possibile standard interno per la metodica
L’individuazione di uno standard int erno da aggiunger si ai campioni in
concentrazione nota e tale da non inter f erire con il campo analit ico propr io
delle proteine inst abili del vino, potrebbe cost ituir e un utile strumento di
controllo e di correzione della metodica. L’ovalbum ina est ratta da uovo di
gallina è una glicoproteina f ormata da 38 5 amm inoacidi con quattro sit i di
glicosilazione del peso molecolare r elat ivo di 45 kDa. E’ comunemente
utilizzata come coadiuvante enologico, ma specificamente anche come
marcatore del peso molecolare per la calibrazione dei gel in elettrof oresi.
Nella procedur a proposta si aggiungevano ai 0.5 mL di vino uno standard di
ovoalbum ina sino a raggiungere i 50ug/L f inali, quindi si operava secondo lo
schema preparat ivo già indicato.
Tuttavia, mentre la r isposta in un bianco di acqua dist illata individua un pi cco
a 65 kDa (Figura sotto ), nel campione di vino si è ottenuto un picco più
piccolo e sdoppiat o a 49 kDa ( Figura precedent e, tracciato in blu). E’ possibile
che i t annini nat urali del vino interf eriscano con la proteina aggiunta e non ne
permettano un cor ret to dosaggio nel cam pione .
Per elim inare tale problema si è cercat o di rimuovere quanto più possibile i
tannini presenti nel campione ut ilizzando un’aggiunta in eccesso di collagene
(0.4 mL di soluzione 25 mg/l), una prot eina
con l’intento di determ inar e la
precipit azione del complesso tannino -pr oteina separabile per f iltrazione 0.45
um. Il collagene monomerico tipo I, una tripla elica, è f ormato da catene alf a 1
(139 kDa) ed alf a 2 (129 kDa), produce quindi bande a circa 270 (il dimer o) e
circa 400 kDa (il trimero), molto al di sopra della zona analizzata. nella f igura
seguente si può osservare come il trattamento del vino con il collagene non
altera signif icativamente la zona r elativa alle proteine instabili, ma
aumenta
invece posit ivament e la risposta del picco di sistema. Il tracciato in verde
riporta invece il prof ilo del vino trattato con collagene, f iltrato ed aggiunto di
ovoalbum ina come standard int erno. Rim angono visibili entrambi i picchi sia a
49 che a 65 kDa.
Si è voluto valutare inoltre se il m ix di standard pr oteici ( il Ledder del kit)
aggiunto in matr ice vino f osse recuper abile con l’ultraf iltrazione e rispondesse
adeguatamente. Nella immagine seguente si nota la presenza dei diversi
picchi di standard sovr apposti alle bande proteiche present i nel vino, pur con
area minore per la diluizione apportata al campione dall’aggiunta dello
standard ( in f inestra il Ledder in bianco).
Si è poi deciso di adot tare come standard interno una proteina diversa
dall’ovoalbum ina
e
iniziale
e
si
è
provato
con
l’aggiunta
di
BSA.
La
sieroalbumina bovina è una proteina est ratta dal sangue dei bovini f ormata da
585 amminoacidi del peso molecolare r elat ivo di 66.46 kDa. Ha numerose
applicazioni biochim iche ed è ut ilizzata anche come nutriente nelle culture
microbiche. Inoltre la BSA è anche comunemente usata per determ inare la
quantità di altre proteine, mettendo a conf ronto una quantit à sconosciuta di
proteine con una q uantità nota di BSA.
Aggiungendo
volum etrie
crescenti
di
BSA
al
vino
ultracentrif ugato,
per
ottenere concentrazioni f inali da 20 a 100mg/L si è costruita la cur va (Figura
sotto e pagina seguente) dove si può notare una buona linearità f ino ad
80mg/L.
y = 3,4943x - 838,28
2
R = 0,9576
Calibrazione BSA
2500
2000
area
1500
1000
500
0
0
100
200
300
400
-500
mg/L
500
600
700
800
900
3.4.2 Prova di riutilizzabilità delle membrane
Data l’alta incidenza dei costi delle m embrane in relazione alla volontà di
proporre un approccio tecnico di basso costo per la valutazione dell’instabilit à
proteica dei vini, si è voluta ver if icare la loro r ig enerabilità dopo l’impiego. In
f igura (Fig.A pag. seguente) si può osser vare il campione separato per
ultraf iltrazione e ripreso con AcNa ( in rosso) e il lavaggio del f iltro -membrana
con ulter ior i 50 ul di AcNa ( in blu). La seconda f razione appare del tutt o
assente di residui di pr oteine f acendo ritener e il processo esaustivo. Il
riutilizzo del f iltro per una successiva riestrazione del campione ( rosso, f igura
B pagina seguente) ha sostanzialmente portato ad ar ee conf rontabili con
quelle del f iltro nuovo (b lu, f igura B pagina seguente ), seppur con picchi
leggermente più allargati.
Figura A
Figura B
3.5
MESSA A PUNTO E VERIFICA DELLA PREPARAZIONE DELLE PROTEINE PER
SEPARAZIONE MEDIANTE ULTRAFILTRAZIONE PER CENTRIFUGAZIONE CON
UTILIZZO DI MEMBRANE DA 10KDA
Amicon Ultra-0.5 mL 10 K device ( Millipore): è un dispositivo per concentrar e
e desalinizzare sott o centr if ugazione soluzioni macr omolecolar i di 10 - 500 uL.
Si può utilizzar e una centrif uga (max 14000 g) che possa accettare provette
da 1,5 mL. Di norma si pongono 500uL di campione nell’inserto f iltrante, si
centrif uga (f ino a 14000 g in “concentration spin”) raccogliendo il percolato in
una
vial
(in
quest o
caso
n on
di
interesse
analit ico).
Nell’inserto -f iltro
rimangono 50 uL di liquido contenenti la f razione pr oteica concentrata.
L’inserto-f iltro
viene
quindi
trasf erito
capovolt o
su
una
seconda
vial
e
centrif ugato (max 1000 g in “reverse spin”) per la r accolta del la f razione
proteica disciolta in 50 uL. Le miglior i prestazioni preparative si ottengono
recuperando immediatamente il concentrato.
Utilizzando la tecnologia Amicon Ultra - 0.5 ed inter venendo dopo la f ase di
concentrazione è possibile procedere anche alla rimozione dei sali o di piccole
molecole organiche dal campione o ad un eventuale cambio di buf f er
ricost ituendo
il
campione
con
il
solvente
desider ato.
Tale
processo
di
"washing out" può essere ripetuto f ino a quando la concentrazione degli
inquinant i int erf erenti è stata suf f icientem ente ridotta.
3.5.1 Estrazione delle proteine
0.5 mL di campione venivano ultraf iltrati sul f iltro -membrana con cut -of f da 10
kDa centr if ugando per circa 45 min a 4100 gir i. Per r imuovere quanto più
possibile i sali si lavava il campione concentrato con due aliquote consecutive
da
0.2
mL
di
H2O
(20
min
per
ciascuna
centr if ugazione),
quindi
si
aggiungevano 0.3m L di buff er AcNa 20mM (centr if ugando per 20 min) e dopo
l’inversione
del
f iltro
si
recuperavano
i
50uL
di
soluzione
concen trata
centrif ugando per 5min.
Si sono eseguiti 2 test per def inire quale potesse essere la migliore procedur a
di lavaggio del f iltr ato sulla membrana e se il r ecupero dal f iltro f osse
completo.
In una prima esper ienza due aliquote di vino (0.5mL) sono stat e centr if ugate
per 45 minut i sul f iltro da 10kDa ed in seguito ciascuna lavata con le due
aliquote consecut ive da 0.2mL di acqua. La prima è stata recuperata a questo
punto, mentre la seconda è stata lavat a con ulter ior i 0.4 mL di AcNa e poi
recuperat a. Nella f igura sotto si osser va come la r isposta strumentale del
campione dopo il lavaggio con AcNa ( in blu) sia molto maggiore indicando una
sua
maggiore
interf erenti.
pulizia
preparativa
rispetto
a
possibili
La seconda mirata alla verif ica della esaustività del processo di rimozione del
campione dal f iltro, anche allo scopo di valutare la possibilit à di un possibile
riutilizzo analitico dei f iltri, ha mostrato come un secondo e t erzo lavaggio del
f iltro con AcNa presentino recuperi trascurabili della f razione pr oteica ( vedi
f igura sotto).
Alla
luce
delle
buone
perf ormance
preparat ive,
ma
soprattutto
delle
tempist iche signif icativamente m igliorat e nella separazione in centrif uga e
della possibilità di r accogliere in manier a automatica una volumetr ia nota di
campione prot eico concentrato (50 uL) , la membrana da 10 kDa è stata
sempre adottata nella seguente sperimentazione.
3.5.2 Uso di SDS nella fase preparativa
Il
sodio
dodici
solf ato
è
un
detergente
anionico
utilizzato
nella
deproteinizzazione. L'SDS si lega alle proteine, rompendone i legam i non covalent i (inter azioni idrof obiche e legami idrogeno) e dunque denaturandole.
La componente anionica dell' SDS lega la catena peptidica (uno ione SDS ogni
due residui am inoacidici). Questo conf erisce una carica negativa alla proteina
propor zionale alla sua massa,
signif icat ivamente maggiore della car ica
elettr ica originale. La repulsione elettr ostatica che si viene a crear e dal
legame con l’SDS causa la denaturazione della proteina, f acendo perdere la
conf ormazione nat iva ed alterando la struttura secondaria ad una struttura
f ilif orme-bastoncellare. Se cost ituit e da subunità, il legame con l’SDS porta
alla lor o dissociazione. Si eliminano in tal modo le dif f erenze di migrazione
dovute alla dif f erenza di struttura.
In
Elettrof oresi
di
proteine
in
Condizioni
Non
Denaturanti
le
pr oteine
conser vano la loro f orma normale (struttura 2°e 3°; legami disolf uro covalenti),
conser vano la loro carica n ormale e vengono separate sulla base di carica,
dimensioni e f orma.
In Elettrof oresi di pr oteine in Condizioni Denatur anti le prot eine sono trattate
con SDS pr ima dell’ elettrof oresi (esempio SDS -PAG E), le molecole di SDS si
legano alle proteine che così p erdono la loro normale f orma ed hanno t utte lo
stesso rapporto car ica/massa. Vengono separate esclusivamente sulla base
delle loro dimensioni.
Si è notato che l’aggiunta di SDS dopo la pur if icazione del vino con i
coadiuvanti permett e una risposta molt o m aggiore delle pr oteine. La BSA a
20mg/L, come si vede dall’elettrof erogramma sottostante, è praticament e non
quantif icabile in vino non aggiunto di SDS.
(vedi immagine pagina seguente)
Procedura
proposta
di
preparazione
ed
analisi
delle
proteine
totali
e
glicoproteine del vino con estrazione mediante ultraf iltrazione
In accordo con quanto proposto da Vincenzi et al. (2005) la metodica
preparat iva è stat a adattata al f ine di permettere una quantif icazione delle
proteine totali e delle glicoproteine del v ino.
3.5.3 Purificazione campione
In una pr ovetta da 15 m l si mettono 10 ml vino e si aggiunge 1 ml della
soluzione m ix di coadiuvant i (concentrazione totale 1 g/l; 167 mg/L pulviclar,
167 mg/L goldenclar, 167 mg/L oliver clar, 167 mg/L f itoproteine, 167 mg/L
collagene, 167 mg/L PVPP), quindi si lascia in agitazione per 30 min sul
Vortex e si centrif uga per 5 min a 4100 rpm. Il surnatant e si f iltra con f iltro siringa da 0.45 um.
3.5.4 Separazione delle proteine totali e delle glicoproteine
8ml del campione purif ica to sono aggiunti di 2 ml di standard interno BSA,
preparato sciogliendo 10mg di proteina in 10 ml di acet ato di sodio 20 m M e
lasciat o in agitazione per una nottesino ad ottener e una soluzione da 100
mg/L. Si aggiungono quindi 20 mg di SDS per una concentr azione dello 0. 2%
p/v. Si r iscalda il campione a 100° C per 5 min nel bagno termostatico,
dopodiché si prelevano 8ml di campione così trattato e si addizionano di 2ml
di una soluzione di KCl 2M.
Si procede quindi al f razionamento delle 2 classi di prot ein e:
-
proteine
totali:
0.5
ml
di
questa
soluzione
sono
posti
nel
f iltro
da
ultracentrif uga da 10 KDa e centrif ugate per 12 min a 14500rpm. Si lava poi
due volt e il f iltro con 0.2 m l di acqua, centrif ugando per 3 min ed inf ine con
ulter ior i 0.3ml di acetato di sodio 20 mM centrif ugando altri 5 min. Il f iltro
viene quindi girato e posto su una provetta di raccolt a e centrif ugato per 1
minuto raccogliendo i 50uL di soluzione di tampone cont enente la f razione
proteica concentrata così pr onta per l’analisi.
- f razione solubile dopo r iscaldament o (glicoproteine): 2 ml della stessa
soluzione sono post i in vial e lasciat i in agitazione a 4° C per 45 min. Si
centrif uga quindi a 4°C per 12 min a 14000g e 0.5 ml del surnatante sono
posti in f iltro da 10 KDa, centr if ugat i, lavat i e raccolti per l’analisi, come
sopra.
3.6 VERIFICA DELLA PRESE NZA DI PROTEINE IN V INO TRA GLI 80 E 230
kDa
Per tale verif ica si è utilizzato il Kit Agilent Protein 230 ( code 5067 -1517),
corredato dalle seguenti specif iche tecniche:
e composto da:
-
Protein chips (25chips + electrode cleaner)
-
Agilent Protein 230 Reagent Part I (Dye Concentrate -Gel matrix-spin
f ilter)
-
Agilent Protein 230 Reagent Part II (Sample buf f er -Ladder)
-
Chip pr int station (recorder number 5065 -4401) + Syr inge kit
-
Dithiot hreit ol ( DTT as reducing agent) >99.5% (code 43815 -5g, Fluka,
Milano, Italy)
-
Sodio acetato anidr o RPE -ACS >99% (code S8750 -1Kg, Sigma, Milano,
Italy)
-
Acqua deionizzata
Per la preparat iva ed analisi dei campioni estratti secondo lo stesso protocollo
adottato per il Kit Protein 80 si sono seguite le indicazioni previste nel
protocollo "Agilent Protein 230 Kit Guide" (code G2938 -90055).
3.6.1 Reagenti del kit Agilent Protein 230
I reagenti del kit sono stati pr eparat i seguendo il pr otocollo previsto dal
produttore Agilent
- Gel Dye Mix:
Si addizionano 25uL di Dye concentrato ai 650uL di Protein 230 Gel - Matrix e
si omogeneizza su Vortex per 10 -20s. Dopodiché si trasf erisce il tutto nel f iltro
da centr if uga f ornito nel kit e si centr i f uga per 15 min a 4100 rpm.
- Destaining Solution:
650uL di Prot ein 230 Gel- Matrix sono trasf eriti nel f iltro da centrif uga del kit e
centrif ugati per 15 m in a 4100 rpm.
- Denatur ing Solut ion:
DTT 1M è aggiunt o al 3.5 % vo l al Sample Buf f er (7uL a 200 uL); si
omogeneizza per 5s.
3.6.2 Preparazione di Campioni e Ladder
Si combinano 4uL di campione con 2uL di denaturing solut ion in una vial da
0.5 mL ed in
una vial da 0.5 mL a parte 6uL di Ladder.
Si centr if ugano le
vials per qualche secondo
in modo da garantire
il
mescolamento del campione con la denaturing solut ion (r iunir e la f razione
liquida sul f ondo, spesso le gocce aderiscono alle paret i e tendono a non
mescolarsi). Le vial sono poi poste a 95°C per 5 min nel termoblocco e
lasciat e poi raf f reddare per qualche minuto sino a raggiungimento della
temperatura ambient e, dopodiché si centrif ugano nuovament e per raccogliere
anche l' eventuale condensa f ormatasi s ulle paret i. I campioni ed il Ladder
sono poi diluiti con 84 uL di acqua ciascuno e miscelati con Vortex.
3.6.3 Caricamento del Gel -Dye-Mix dei Campioni e del Ladder
Si posiziona il chip sulla Chip Prim ing Station e si pipettano nel pozzetto 12uL
di Gel Dye, dopodiché si pressurizza il pozzetto con la sir inga per un minuto.
Questo
passaggio
va
ef f ettuato
con
cautela
visto
che
determina
il
posizionamento del gel all'interno del chip. A questo punto si elim inano dal
pozzetto i uL di Gel Dye Mix r imasti in eccesso e si pipettano altri 12 uL di gel
dye Mix nello stesso pozzetto. Si pipettano 12 uL di Gel Dye Mix di destaining
solution negli altr i 4 pozzett i contrassegnati ed inf ine si pipettano 6uL di
campione e 6uL di Ladder nei pozzett i a loro destinati. Il chip c osì prepar ato
deve essere analizzato immediatament e.
3.6.4 Proteine nel vino
L’analisi esplorat iva su vino (nella prima f igura le proteine totali di un
Traminer,
nella
seconda
la
f razione
di
glicoproteine)
non
ha
mostrato
nell’elettrof erogramma la presenza di bande signif icat ive nella zona compresa
tra gli 80 ed i 230 kDa, f acendo così r itener e ragionevole l’utilizzo del Kit
Protein80, maggiormente sensibile nella zona sicuramente interessata dalla
presenza di bande proteiche a 10÷40 kDa, come peraltro suggeri to dalle
indicazioni di letteratura.
3.7 VERIFICA DELL’ABBATT IMENTO PROTEICO OPER ATO DALLA
BENTONITE SU VINI BI ANCHI
Per stabilizzare, come detto, i vini bianchi e r osat i rispetto alla casse pr oteica
uno degli strumenti più ut ilizzat i è la bentonite, vista la sua capacità di
adsorbire e r imuovere con essa le proteine del vino.
Nello studio eff ettuato si è cercato di indagare su 2 vini bianchi (chardonnay e
pinot grigio) la modalità di rimozione esplic at a dalla bentonite in dosi f ino a
100 g/HL rispetto alle diverse bande pr oteiche presenti nel range tra 8 e 45
KDa m isurabili con il metodo proposto.
Diverse aliquote di 50 ml di vino sono state preparate con aggiunte di 10, 20,
40, 80 e 100 g/hL di bent onite utilizzando una sospensione all' 1% di bentonite
Vason (L.17508C, Verona Italy). Dopo un’or a di agit azione il campione è stato
quindi centrif ugato. Parte del surnat ant e è stata utilizzata per l' analisi delle
proteine mediante la metodica proposta (Bio analyzer), una seconda è stata
utilizzata per la misura di instabilità a caldo. Riscaldamento su bagnomaria a
70°C per 10min; r affreddament o rapido a temperatura ambiebnte e lettura con
torbidimetro Turb 550 IR (W RW ).
Il Pinot grigio è r isultato car att erizzato da un tenore iniziale circa doppio di
proteine totali rispetto allo Chardonnay. In f igura si può osser var e come
trattamenti crescenti del coadiuvante abbiano determinat o una rimozione
progressiva delle pr oteine, con raggiungimento di un ef f etto qu asi quant itat ivo
di rimozione a ca 20 e 40 g/hL, rispett ivamente.
Nella f igura seguente si possono osser var e invece gli ef f etti della bentonite
sulle dist inte bande proteiche dello Chardonnay. Inizialmente si è avuta una
maggiore incidenza di abbattimento sulle bande a 25.2 e 31. 3 kDa e su quelle
relat ivamente meno abbondant i a 12. 8, 8.6 e 23.8 kDa,
raggiungendo il
completo abbattimento tra 20 e 40 g/hL. Le bande a 35.6 e a 44.5 kDa, pur
quest’ultima meno signif icat iva, sono r isultate invece quasi inalterate sino a
dosaggi super ior i ai 40 kDa.
Nella f igura seguente si possono osser vare invece gli eff etti sul campione di
Pinot grigio, più ricco di pr oteine iniziali. Si conf erma la maggiore incidenza
iniziale sulle bande a 25.2 e 31.3 kDa, pur con una minor e pendenza della
cur va dell’abbatt imento. Un abbattiment o complet o viene raggiunto solo a ca
40 g/hL. Le altre bande hanno invece pr of ili assai sim ili a quelli vist i nel primo
vino.
Anche dag li istogrammi seguent i è possibile osser vare come in entrambi i vini
la bentonite tenda a rimuovere con maggiore eff icacia le f razioni più leggere
rispetto a quella a 36.5 kDa.
PREVISIONE DELL’INSTABILITA’ DEI VINI
4
PREVISIONE DELL’INSTAB ILITA’ DEI VINI
Su una selezione di 21 vini bianchi (4 Pinot grigio, 5 Chardonnay, 3 Traminer,
2 Sauvignon blanc, 2 Mueller Thurgau, 2 Incrocio Manzoni bianco, 1 Riesling,
1 Chardonnay base spumante e 1 Pinot nero rosè), giovani, campionat i dopo
circa 4-5 mesi dalla vinif icazione e non ancora stabilizzat i con bent onite o
tannino,
si sono analizzate le componenti proteiche totali e solubili dopo
riscaldamento (glicoproteine) utilizzando il metodo sopr a illustrato. Sugli
stessi vini si sono q uindi misur ate la tor bidità secondo il metodo pr oposto da
W aters et al. (1991), la torbidità secondo il saggio proposto da Laf f ort (Laff ort inf o, n° 59, marzo -aprile 2008) e la misura gravimetr ica del precipitato
ottenuto
applicando
il
metodo
di
W ater s
et
al.
(1991),
se parato
per
centrif ugazione.
Tipologia
Torbidità
Waters et al (1991)
(NTU)
Pinot grigio
Pinot grigio
Pinot grigio
Pinot grigio
Chardonnay
Chardonnay
Chardonnay
Chardonnay
Chardonnay
Traminer
Traminer
Traminer
Sauvignon
Sauvignon
Mueller T
Mueller T
Incrocio Manzoni bianco
Incrocio Manzoni bianco
Riesling
Base spumante
Pinot nero base spumante rosè
178
102
11,4
69,1
34,5
4,3
65,3
50,5
50,5
356
24
344
13,1
137
53,5
48,6
12,1
71,7
64,4
20,7
25,3
Peso precipitato
Waters et al
(1991)
(g/L)
0,291
0,144
0,257
0,009
0,076
0,175
0,114
0,105
0,108
0,337
0,157
0,245
0,550
0,144
0,136
0,093
0,151
0,219
0,086
0,056
0,038
Torbidità
Laffort (2008)
(NTU)
45,7
20,2
22,32
3,83
1,05
0,02
16,3
12,64
13,02
207,08
86,88
85,05
8,1
37,94
8,73
2,65
15,95
10,32
1,15
5,84
1,41
La conf rontabilità tra le tre misurazioni appare tuttavia poco stretta e
conf erma la bassa r obustezza predittiva di quest i test mediante riscaldament o
rispetto all’instabilità proteica dei vini:
350,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
precipitato Water et al (1991) (g/L)
0,600
250,0
torbidità Laffort (2008) (NTU)
250,0
torbidità Laffort (2008) (NTU)
torbidità Waters et al (1991)
(NTU)
400,0
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0
0,000
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
precipitato Water et al (1991) (g/L)
0
100
200
300
400
torbidità Waters et al (1991) (NTU)
La misura gravim etrica del precipitat o del pr imo Sauvignon appare tuttavia
poco corretta e probabilmente aff etta da errore analitico.
4.2 Verifica delle correla zioni tra le frazioni proteiche totali dei vini e il
test Waters et al (1991)
Come si può
osservar e in f igura,
non emergono
correlazioni
apprezzabili tra tor bidità ed i contenuti delle diverse bande a 10,
15, 25, 30, 32, 35 e 40 kDa, sommator ia (32+35+40 kDa) e pr oteine
totali. I m igliori risultati sono quelli relat ivi alla banda a 30kDa, pur
presente un dato aberrante relativo ai dat i del 3° Traminer. Le
proteine t otali sembrano poco indicat ive dell’inst abilità potenziale
400,0
400,0
350,0
350,0
350,0
300,0
300,0
300,0
250,0
200,0
150,0
torbidità (NTU)
400,0
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
dei vini.
250,0
200,0
150,0
150,0
100,0
100,0
50,0
50,0
50,0
0,0
0,0
100
200
300
400
500
0,0
0
50
proteine10 kDa (mg/L)
100
150
200
0
400,0
350,0
350,0
300,0
300,0
300,0
250,0
200,0
150,0
torbidità (NTU)
400,0
350,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
50,0
0,0
0,0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
proteine 32 kDa (mg/L)
350,0
300,0
300,0
300,0
torbidità (NTU)
400,0
350,0
torbidità (NTU)
400,0
350,0
150,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
50,0
0,0
0,0
100
150
200
250
300
2000
150,0
50,0
1500
200,0
100,0
50
1000
250,0
100,0
0
500
400,0
200,0
1200
0,0
0
250,0
1000
150,0
50,0
1500
800
200,0
100,0
1000
600
250,0
100,0
500
400
400,0
0
200
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
200,0
100,0
0
torbidità (NTU)
250,0
0,0
0
1000
2000
3000
4000
proteine 32+35+40 kDa (mg/L)
5000
0
2000
4000
6000
proteine totali (mg/L)
8000
4.3 Verifica delle correlazioni tra le frazioni proteiche totali dei vini e il
test Laffort (2008)
In questo caso le correlazioni tra il test a cald o ed i valor i misurat i appaiono
ancora meno apprezzabili. I risultati f orse migliori sono quelli relativi al
contenuto di proteine totali con una cr escita t endenziale delle tor bidità con il
250,0
250,0
200,0
200,0
200,0
150,0
100,0
50,0
torbidità (NTU)
250,0
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
carico complessivo di proteine.
150,0
100,0
50,0
0,0
100
200
300
400
500
0,0
0
50
100
150
200
0
250,0
200,0
200,0
200,0
150,0
100,0
torbidità (NTU)
250,0
150,0
100,0
50,0
50,0
1000
1500
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
200,0
200,0
torbidità (NTU)
200,0
torbidità (NTU)
250,0
150,0
100,0
100
150
200
250
300
1500
2000
150,0
100,0
0,0
0,0
50
1000
50,0
50,0
0
500
250,0
0,0
1200
100,0
250,0
50,0
1000
150,0
100,0
800
0,0
0
150,0
600
50,0
0,0
0,0
500
400
250,0
0
200
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
100,0
50,0
0,0
0
150,0
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
2000
4000
6000
8000
4.4 Verifica delle correlazion i tra le frazioni proteiche totali dei vini e il
precipitato Waters et al (1991)
I valor i risultano dispersi e ancora meno correlat i. Le proteine totali mostrano
0,6
0,6
0,5
0,5
0,5
0,4
0,3
0,2
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1
0,0
0,0
0
100
200
300
400
precipitato (g/L)
0,6
precipitato (g/L)
precipitato (g/L)
una certa tendenza a crescere al crescere del pr ecipitato.
500
0,2
0,0
0
50
100
150
200
0
0,6
0,5
0,5
0,4
0,3
0,2
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1
0,0
0,0
1000
precipitato (g/L)
0,6
0,5
500
1500
0,0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
0,5
precipitato (g/L)
0,5
precipitato (g/L)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,0
150
200
250
300
1500
2000
0,4
0,3
0,2
0,0
0,0
100
1000
0,1
0,1
50
500
0,6
0,1
1200
0,2
0,6
0,2
1000
0,3
0,6
0,3
800
0,4
0,4
600
0,1
0
400
0,6
0
200
precipitato (g/L)
precipitato (g/L)
0,3
0,1
precipitato (g/L)
0,4
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
2000
4000
6000
8000
4.5 Verifica delle correlazioni tr a le frazioni proteiche instabili dei vini e il
test Waters et al (1991)
400,0
400,0
350,0
350,0
350,0
300,0
300,0
300,0
250,0
200,0
150,0
torbidità (NTU)
400,0
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
Si evidenzia una cer ta correlazione con il contenuto prot eico totale.
250,0
200,0
150,0
150,0
100,0
100,0
50,0
50,0
50,0
0,0
0,0
100
200
300
400
0,0
0
50
100
150
200
0
400,0
350,0
350,0
300,0
300,0
300,0
250,0
200,0
150,0
torbidità (NTU)
400,0
350,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
50,0
0,0
0,0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
350,0
300,0
300,0
300,0
torbidità (NTU)
400,0
350,0
torbidità (NTU)
400,0
350,0
150,0
250,0
200,0
150,0
150,0
100,0
50,0
50,0
50,0
0,0
0,0
100
150
200
250
300
1500
200,0
100,0
50
1000
250,0
100,0
0
500
400,0
200,0
1200
0,0
0
250,0
1000
150,0
50,0
1500
800
200,0
100,0
1000
600
250,0
100,0
500
400
400,0
0
200
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
200,0
100,0
0
torbidità (NTU)
250,0
0,0
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
2000
4000
6000
8000
4.6 Verifica delle correlazioni tra le frazioni
il test Laffort (2008 )
proteiche instabili dei vini e
250,0
250,0
200,0
200,0
200,0
150,0
100,0
50,0
torbidità (NTU)
250,0
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
Si evidenzia una cer ta correlazione con il contenuto prot eico totale.
150,0
100,0
50,0
0,0
100
200
300
400
0,0
0
50
100
150
200
0
250,0
200,0
200,0
200,0
150,0
100,0
torbidità (NTU)
250,0
150,0
100,0
0,0
1500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
200,0
200,0
torbidità (NTU)
200,0
torbidità (NTU)
250,0
150,0
100,0
50,0
0
50
100
150
200
250
300
1000
1500
150,0
100,0
50,0
0,0
0,0
500
250,0
50,0
1200
100,0
250,0
100,0
1000
150,0
150,0
800
0,0
0,0
1000
600
50,0
50,0
50,0
500
400
250,0
0
200
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
torbidità (NTU)
100,0
50,0
0,0
0
150,0
0,0
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
2000
4000
6000
8000
4.7 Verifica delle correlazioni tra le frazioni proteiche instabili dei vini e il
precipitato Waters et al (1991)
Anche le f razioni instabili, precipitabili per r iscaldamento (ottenu te come
dif f erenza tra totali e solubili/glicopr oteine), mostrano scarsa correlazione col
0,6
0,6
0,5
0,5
0,5
0,4
0,3
0,2
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1
0,0
0,0
0
100
200
300
precipitato (g/L)
0,6
precipitato (g/L)
precipitato (g/L)
test.
400
0,2
0,0
0
50
100
150
200
0
0,6
0,5
0,5
0,3
0,2
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1
0,0
0,0
0
500
1000
precipitato (g/L)
0,6
0,5
0,4
1500
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
precipitato (g/L)
0,5
precipitato (g/L)
0,5
0,4
0,3
0,2
150
200
250
300
1500
0,4
0,3
0,2
0,0
0,0
100
1000
0,1
0,1
50
500
0,5
0
1200
0,0
0
0,6
0,0
1000
0,2
0,6
0,1
800
0,3
0,6
0,2
600
0,4
0,3
400
0,1
0,4
200
0,6
precipitato (g/L)
precipitato (g/L)
0,3
0,1
precipitato (g/L)
0,4
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
2000
4000
6000
8000
4.8 Verifica delle correlazioni tra il rapporto delle frazioni proteiche totali
e stabili dei vini e i diversi test
La trasformazione dei dati in rapporto tra c ontenuto di proteine totali e
stabili sembra migliorare le correlazioni con i diversi test. In particolare
a basse concentrazioni proteiche, la misura gravimetrica del precipitato
pare
dipendere
più
strettamente
dall’aumento
delle
proteine
totali
rispetto alla frazione solubile presente nei vini.
0,6
precipitato Waters 1991 (g/L)
250,0
350,0
torbidità Laffort (NTU)
torbidità Waters 1991 (NTU)
400,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
200,0
150,0
100,0
50,0
50,0
0,0
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
rapporto conc. proteine totali/glicoprot.
0,0
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
CONCLUSIONI
5
CONCLUSIONI
Il lavoro di tesi ha permesso la messa a punto di una procedura di isolament o
delle proteine del vino basata sull’ut ilizzo dell’ultraf iltrazione su centrif uga.
Questo ha permesso la loro separazio ne da una matrice complessa, ricca di
polif enoli e di tannini in particolare, e la lor o concentrazione. Ciò è r isultato
eff icace
e
f unzionale
ad
una
soddisf acente
applicazione
della
tecnica
elettrof oretica su supporto a microchip, come previst o dalla strum entazione
Agilent Bioanalyzer 2100.
Si sono indagate le dif f erenti potenzialità di due kit analit ici operant i nei range
10÷80
kDa
e
10÷230
kDa,
ver if icando
l’assenza
di
bande
proteiche
signif icat ive oltre gli 80 kDa. Si è pertanto ritenuta ottimale l’adozi one del kit
10÷80 kDa capace di off rire la m igliore risoluzione tra le bande proteiche di
interesse, tra i 10 ed 40 kDa.
Si è ver if icato esser e ut ile l’utilizzo di proteine quali la BSA come standard
interni
per
il
processo
di
separazione
e
pur if icazione
p reanalitica,
consentendo una maggiore accuratezza nella quant if icazione delle pr oteine.
L’impiego in f ase di preparazione del campione del SDS, m olecola capace di
denatur are le proteine f acendo per dere loro la conf ormazione nat iva e in t al
modo le dif f erenze di m igrazione,
ha prodotto una miglior e risoluzione delle
bande proteiche.
Si è osser vat o come l’impiego a dosi crescent i della bentonite sui vini
determini una rimozione selettiva e diff erenziata delle diverse bande proteiche
con
una
maggiore incidenz a
iniziale
sulle bande a
ca 25
e
32 kDa,
raggiungendo l’eliminazione totale delle proteine presenti nel range 10÷ 40
kDa, quelle sospettate in letterat ura della maggiore tendenza alla produzione
di casse, solo dopo un dosaggio relat ivamente maggiore.
L’applicazione della metodologia analitica sviluppata su una campionatura di
21 vini bianchi ancora non stabilizzati ha permesso di r intracciare scarse
correlazioni tra il contenut o di proteine totali, nonché delle singole bande
proteiche, ed i r isultati dei t est di inst abilità a caldo. Basse sono risultat e
anche le correlazioni tra i contenut i pr oteici instabili ottenuti da una procedura
CONCLUSIONI
di precipitazione selettiva e gli stessi test, mentre interessanti sono invece le
maggiori
correlazioni
tra
i
rappor ti
prote ine
totali/proteine
solubili
(glicopr oteine) capaci di conf ermare la stretta relazione tra instabilità proteica
e
sbilanciamento
t ra
contenuto
di
proteine
tot ali
e
di
glicoproteine.
ALLEGATO 1
CO D E X O ENO L O G IQ UE I NT E RN AT I O N AL
Ben t o n it e s CO E I - 1- B ENT O N : 20 0 3
N° SI N : 5 5 8
( O en o 11 /2 0 03 )
1. O B J ET , O RIG IN E E T DO M AI N E D’ AP P L I C AT IO N
Les be nt o n it es s o nt d es s i l ic a t es d' a lum i ne h ydr a tés ap p ar t e na nt au gr o u pe des
m ontm or i l lo n it es d e f o r m ule br ut e :
S i4 ( A l ( 2 - x ) Rx ) ( O 1 0, H2O ) ( C ex , n H 2O ) o u S i4 ( A l( 2 - x ) Rx ) ( H 2O ) n a vec :
- R = M g, F e , M n, Z n, Ni
- C e ( c a ti o ns éc ha n ge ab l es ) = C a , Na , M g.
E l les s on t u ti l is ées p our des op ér at i o ns d e c l ar if ic at i on ou de s tab i l is at i on
pr o t éi q u e d es m oûts et d es v ins . L es b en t on i tes f ix e nt c er t a i nes pr o t éi n es
i ns t ab l es e t p er m et te n t a ins i l eu r é l im in at i o n. Les be n to n it es s on t c a pa b l es d e
f ix er d e l a m at i èr e c o l or a n te .
2. ET IQ U ET AG E
L ’é t iq u et ag e i n d iq u er a l a n at ur e d e l a b en to n it e ( s o d i qu e n at ur e ll e ,
c a lc i q ue , c alc i q ue ac ti v é e) le n um ér o de l ot et l a d at e l im it e d ’ ut i l is at i on
op t im al e ( DL UO ) e n c e qu i c o nc er ne l es be n to n it es ac t i v é es . I l d e vr a f a ir e
ap p ar aît r e l es m ent i o ns d e r is q u e e t d e s éc ur i té r e l at i v es à l a pr és e nc e d e
s i l ic e c r is t a l li n e.
2. 1 B en t o n it es n at u re ll es:
E n f onc t io n d e l a na t u r e d u c at i o n éc h an g ea b le pr és e n t, i l ex is te à l' ét at n at ur e l
de ux t yp es de b e nt o n it es :
- l es b en t o n it e s s o d i q u e s , o ù le s o d ium es t l e c at i o n éc h a ng e ab l e m aj or it a ir e,
e ll es o nt un f or t po u v o ir d e g onf lem en t e t d' a ds or p ti o n.
- l es b en t o n it es c al c i q u e s, o ù le c a lc i um es t l e c at i o n éc h an g ea b l e m aj or it a ir e ,
e ll es
on t
un
po u v o i r
de
g onf lem en t
et
d'a ds or pt i on
p lus
f a ib l e
que
l es
be n to n it es s o d iq u es .
Ces d e ux t yp es d e b en t on i tes , é v en tu e l l e m ent ap r ès u n s éc h a ge à 80 - 9 0 ° C,
s on t s im pl em en t br o yé es a v an t l eu r c om m er c i al is at i o n.
2. 2 B en t o n it es a ct iv é es :
Af i n d' am él i or e r l es pr o pr i ét és d' a ds or p ti o n des be nt o n it es c a lc iq u es , c es
der n i èr es s o n t le p l u s s o u ve n t ac t i vé es p ar du c ar b o na te d e s od i um pu is
s éc h é es e t br o yé es ; o n o bt i en t a i ns i d es b e nt o ni t es c a lc iq u es ac ti v ées do n t l es
pr o pr i ét és s o nt é g a les o u s u pér i e ur es à c e l l es d es be n to n it es s o d i qu es .
Les pr o pr ié tés d e c e s be n to n it es a ins i a c ti v é es o u p er m uté e s s on t m oi ns
s ta b les d a ns l e tem ps ( 3 à 1 8 m o is ) et d é pe nd e nt d e l' ac ti v a t io n e t des t au x de
m agnés i um , c a lc i um e t s od i um .
Ces d if f ér e nts t yp e s d e b e nt on i tes s e pr és e nt e nt s o us f or m e d e po u dr e o u d e
gr a n u lés s p h ér iq u es o u c yl i n dr i qu es . El l es o nt d es c ou l e ur s tr ès v ar ia b l es a l l an t
du bl a nc p our les pr o d u its l es p l us p ur s a u g r is , be i g e ou v er t p o ur l es a utr es .
3. L IM IT E S ET M ET HO D E S D’ E S S AI S
3. 1 O d e u r
La be n to n it e n e d o it pas pr és e nt er d 'o d eur in d és ir a b le ( p. e. m oi s i) e t n e p as
c éd er d e g o ût a u v i n.
3. 2 M es u r e d u p H
A gi t er 5 g d e b en t on i t e a v ec 10 0 m l d 'e a u d i s ti l l ée pe n da nt 5 m in u tes .
A pr ès u ne h e ur e d e r e pos , m es ur er le p H d u l iq u i de s ur n ag e an t. L es b e nt o ni t es
c a lc i q ues n a t ur e l l es o nt u n p H v o is in de la ne utr a l it é ( e ntr e 6 ,5 et 8, 5) . L es
be n to n it es s o di q ues na t ur e l l es ou c a lc i qu es ac t i v ées o nt u n pH n et tem e nt
a lc a l i n ( e ntr e 8, 5 e t 1 0, 0) .
3. 3 P e rt e à la d es s ic c at i o n
P ar d es s ic c a ti o n d e 5 g de b e nt o ni t e à 1 05 °C p en d an t 4 h e ur es , l a pe r t e d e
po i ds d o it êtr e c om pr i s e e ntr e 5 et 1 5 p . 1 00 du po i ds i n it i a l ( l e pl us s o u v en t
v o is i n d e 1 0 p. 10 0) .
3. 4 P r ép ar at io n d e la so l u t io n p o u r e ss ai s
P es er p g d e b e nt o ni t e c o nt en a nt 1 0 g d e b en t on i te a n h yd r e .
Da ns un f lac o n d e 5 0 0 m l à l ar g e c o l, p ou v an t êtr e her m ét i qu e m ent b o uc h é ,
p lac er 1 00 m l de la s o lu t io n d' ac i de t ar tr i q ue à 5 g p ar l itr e am e né à pH 3 ( R) .
F a ir e
t om ber
en
p l u ie
la
pr is e
d' es s ai
de
b en to n it e
d a ns
la
s o l ut i on
c ons t am m ent a gi t ée ( pa r ex em p le à l 'a i d e d' un a g it a te ur m a gn é ti q ue ) en
s 'a id a nt d 'u n e nt on n o i r . U n e f o is t er m in ée c et te a d d it i on , ag i te r é ner g i qu em en t
pe n da n t 5 m i nu tes . L a is s er r e pos er 2 4 o u 4 8 h e ur es .
Déc a nt er , c en tr if u ger ou f i l tr e r s i n éc es s a ir e p our o bt en ir au m oi ns 1 00 m l d e
l iq u i de c la ir .
T o u t es le s li mit es s u iv an t e s f i x ée s p o u r la b en t o n i t e so n t r ap p o rt é es au
p o id s d e b en t o n it e s èc h e .
3. 5 T e n eu r e n mo n t m o ri ll o n i t e
T aux m in im um :
Ne do i t p as ê tr e i nf ér i eur à 8 0 % , r és u lt at d on n é p ar l e f a br ic a n t ( m étho d e d e
d if f r ac t io n a ux r a yo ns X ) .
3. 6 T e n eu r e n d if f ér e n t e s f o r me s d e si li c e li b r e
La t en e ur e n s i lic e c r i s ta l l in e ( q ua r t z N ° C A S 1 48 0 8 - 6 0- 7, c r is t ob a li t e N ° C A S
14 4 64 - 4 6- 1) d oi t ê tr e i nf ér ie ur e à 3 p . 10 0.
Le t a ux d e pa r t ic ul es i nf ér ie ur es à 1 0 m ic r o n s d o it ê tr e i nf ér ie ur à 10 %.
La t e ne ur e n s i l ic e c r i s ta l l in e r es p ir ab l e d o it ê tr e inf ér ie ur e à 0 ,3 % .
Ces n or m es do i v e nt f i gur er s ur l a f ic h e d e s éc ur i té f o ur ni e p ar l e f abr ic a nt .
3. 7 P lo m b
S ur l a s o lu t io n pr é p ar ée p our l es es s a is s e l on ( 3 .4) , f a ir e l e dos a ge à l ’a i d e d e
l a m ét ho d e d éc r i t e a u Ch a pi tr e II .
La t e ne ur e n p l om b s o l ub l e d oi t ê tr e inf ér ie u r e à 5 m g/k g.
3. 8 M e rcu r e
S ur la s o l ut i o n pr é p ar ée p o ur les es s a is ( 3. 4) dé te r m in er la t en e u r e n m er c ur e
s e lo n l a m ét h od e d éc r i te a u C ha p it r e I I.
La t e ne ur e n m er c ur e do i t êtr e i nf ér i e ur e à 1 m g/k g.
3. 9 Ar s en ic
S ur 5 m l de s o l ut i on p r ép ar é e po ur les es s a is ( 3 .4) , r ec h er c h er l 'a r s en ic par la
m étho d e d éc r it e au Ch a pi tr e I I . L a te n eur e n ar s e n ic s o l u b le do i t ê tr e
i nf ér ie ur e à 2 m g/k g.
3. 1 0 F e r
A 5 m l de s o l ut i on pr ép ar é e p o ur l es e s s a i s ( 3. 4) , aj o ut er 1 2, 5 m l d'e a u, 1 m l
d' ac i d e c h l or h ydr i q ue c onc e ntr é ( R) e t 2 m l de s o l ut i o n d e t h i oc ya n at e d e
po t as s i um à 5 p. 1 00 ( R) . L a c o l or at i on r o ug e d o it êtr e inf é r i e ur e à c e l l e q u e
l' on ob t ie n t en ut i l is a n t 2, 5 m l d' ac i de c itr i qu e à 5 p . 1 00 à pH 3 ( R ) 1 m l
d' ac i d e c hl or h yd r iq u e c onc e ntr é ( R) , 1 5 m l de s o l ut i on d' u n s e l d e f er (   
) à
0, 0 10 g d e f er p ar l it r e ( R) e t 2 m l de s o lu t i on de th i oc ya n at e d e po t as s i um à 5
p. 1 0 0 ( R) .
La t e ne ur e n f er d oi t ê tr e inf é r i e ur e à 6 00 m g/k g.
Le f e r p eu t ég a lem e nt êtr e d os é p ar s pec tr o m étr i e d ’ abs or pt i o n a t om iq ue s e lo n
l a m ét ho d e d éc r i t e a u c ha p i tr e I I.
3. 1 1 Al u min iu m
S ur
la
s o lu t io n
pr é par é e
po ur
le s
es s a is
( 3 .4 ) ,
r ec her c h e r
l' a lum i n ium
ex tr ac t i b l e s e lo n l a m é th o de d éc r i te a u C ha p i tr e I I.
La t e ne ur e n a l um in i u m ex tr ac t ib l e d oi t ê tr e i nf ér ie ur e à 2 ,5 g /k g.
3. 1 2 Ca lc iu m et ma g n és iu m
S ur la s o lu t io n pr ép ar ée p our l es es s a is ( 3. 4) , d os er l e c alc i um et l e m agn és ium
par
les
m éth o des
f i gur a nt d a ns
l e R ec ue i l d es m ét ho d es
i nt er na t io n a les
d ’a n al ys e d es v i ns e t des m oûts .
La s om m e c alc i um + m agnés i um s o lu b le d o it ê tr e inf ér i e ur e à 1 0 0 m eq p o ur 10 0
g.
3. 1 3 So d iu m
S ur l a s o l ut i on pr é p ar ée po ur les es s a is ( 3 . 4) , dos er l e s o d i um par l a m éth od e
f ig ur a n t da ns l e R ec ue i l des m ét h od es i nt er n at i on a l es d ’ a na l ys e d e s v i ns et d es
m oûts .
La t e ne ur e n s o d ium s o lu b le do i t êtr e i nf ér i eur e à 1 0 g /k g p o ur l es be n to n it es
na t ur e l l es et inf ér i e ur e o u ég a l e à 3 5 g/k g p our les be n to n it es ac ti v ées .
3. 1 4 P ré s en ce d e g r o ss e s p a rt i cu l es
P lac er 1 l d' e au d a ns un ver r e à p ie d d e 1, 5 l. Aj o ut er l en tem e nt et e n ag i t an t
s ans c es s e l e li q u id e, u ne q u an t it é de b en t on i te c or r es po n da nt à 50 g d e
be n to n it e s èc h e . A g i t er é n er gi q u em ent 2 à 3 m in ut es et l a is s er au r e p os 2 4
he ur es . Ag i ter 2 à 3 m inut es , la is s er r e p os er 2 m in u tes . Rej et er par u n s i p ho n
l es 9/ 1 0 du l iq u i de tr o ub l e q u i s ur m ont e les 10 0 m l d e l i q ui d e et le
dé p ôt es t à l a is s er a u f on d du v er r e . Aj o ut er 90 0 m l d 'e a u, a g it er 1 m inut e .
La is s er r e p os er 2 m in ut es e t r ec om m enc er a ins i j us qu 'à a vo ir f a it 5 la v a ges .
Rec u ei l l ir l e d ép ô t d ans u n e c a ps u l e. Sé c her et p es e r . L e r é s i du d o it ê tr e
i nf ér ie ur à 8 g po ur 1 0 0 g.
3. 1 5 E ss ai d e d é s ac i d if i c at io n
P es er un p o i ds p de b en t on i te c o n te n an t 0, 2 g d e b e nt on i te s èc h e.
L' in tr od u ir e d ans un f l ac o n d e 1 2 5 m l c ont en a nt 50 m l d e s o lu t i on 0, 03 3 M
d' ac i d e c i tr iq u e ( R) . A gi t er é ner g i qu em en t pe nd a nt 5 m in u tes et la is s er a u
r ep os p e nd a nt 3 0 m in ut es . F i ltr er o u c e n tr if ug er . Pr é le v er 1 0 m l d e f il tr at e t
ti tr er l' ac id i té p ar l a s o lu t io n 0, 1 M d' h yd r o x yd e d e s o d ium e n pr és e nc e d' un e
go u tt e d e s o l ut i on d e p hé n o lp ht a l é in e ( R ) . S o it n m l le vo l u m e ver s é p our
ob t en ir l e v ir a g e d e l' i nd ic at e ur :
25 0 ( 10 - n ) es t le n o m br e d e m il l ié q u i va l en ts d ’ ac id es f ix és ou n eu tr al is és par
10 0 g d e b e nt on i te .
La l im ite m ax im al e es t d e 2 ,5 e q /k g.
3. 1 6 T au x d e g o n f l em en t
In d ic e
de
go nf l em en t : tes t s p éc if i qu e néc es s a ir e
2 g d e be n to n it e es t
s au p ou dr é s u r 1 00 m l d' ea u dém i nér a l is é e et s ur 1 0 0 m l de v i n p l a c és d a ns u n e
épr o u v ett e gr a du é e. A pr ès 24 h e ur es , o n
m es ur e le v o lum e oc c up é par l a b e nt o n it e . C el u i - c i s er a ex pr im é e n m l/ g d e
pr o d u it s ec .
3. 1 7 E ss ai d ' ad so rp t i o n d e p r o t é in e s ( p o u r le s b en t o n it es
d e st in é es à la d ép ro t éin i sat io n ) :
3. 1 7. 1 - Pr é p ar at i on d e l a s o lu t io n d 'es s a i :
m éla ng er 5 g de b l a n c d' oe uf a vec u ne q u an t it é s uf f is a nt e d e s o lu t io n d' ac id e
c itr i q ue à 5 g pa r l itr e ( p H = 3) p our a vo ir 1 l itr e. F i ltr er . Dos er l 'a zo t e to t al s ur
10 0 m l d e c e tt e s o l ut i on par la m éth o de déc r it e a u C h a p itr e I I.
Ce tt e s o l ut i on c o n ti e nt e n v ir o n 9 0 m g d' a zo t e to t al s oi t 5 75 m g de pr o t éi n es
par l itr e.
3. 1 7. 2 - A 10 0 m l d e c ett e s ol u t io n ; po ur c ha q ue es s a i , a p por t er d es d os es
c r o is s a nt es de be n to n it es p r é p ar é es en s us pe ns i on à 5 % , d e m an ièr e à tr a i te r
aux d os es de 0, 1 à 0, 8 g / l. A gi t er vi g ou r eus em en t e t m ain t en i r à 1 5 - 20 °C
pe n da n t 6 h eur es . Ce n tr if ug er e t pr oc é d er a u d os ag e d e l' a zo t e
to ta l o u d es pr ot é i nes r és id u e ll es . Un e b e nt o n it e d e q ua l it é d é pr o t é i nis a nt e d o it
é lim i ner au m oi ns 5 0 % des
pr o t éi n es d e l a s o lu t io n s yn t h ét i qu e à la d os e d e 0, 4 g /l .
3. 1 8 Dét e rm in at io n d e la su rf a c e sp éc if iq u e d 'a d s o r p t io n ( o u
in d i c e d ’ ad so rp t i o n d u b l eu d e mét h yl èn e)
Mé t ho d e d éc r i t e en an nex e L a l im it e d ’ ac c e p ta t io n d o it ê tr e de 30 0 m g/1 00 g
4. CO N S ER V AT I O N
Les b e nt o n it es d oi v e nt ê tr e c ons er v é es da ns d es l i eux v en t i l és da ns d es
r éc ip i e nts é ta nc hes à l 'a br i d' él ém en ts v o l at i l s q u' e ll es p e u ve n t ads or b er .
AN N E X E D ET ERM IN AT IO N D E L A S URF AC E S P EC IF I Q U E D’ AD S O R PT IO N
DE L A B E NT O N IT E
1. G ÉN É R AL IT É S
1. 1 Bu t d e l´ e s sa i
Ce t es s a i p er m et d e m es ur er la c ap ac it é d e l a b e nt on i te à a ds or ber du b le u d e
m éth yl è n e.
Le b le u de m ét h yl è n e é ta nt a ds or b é pr éf ér e n ti e l l em ent par l e s ar g i l es , les
m atiè r es or ga n i qu es et l es h yd r ox yd es de f er , c e tt e c ap ac it é r en d c om pte
g lo b al em en t d e l´ ac t i v i té d e s ur f ac e d e c es é l ém ents .
O n a p pe l l e « v al e ur d e bl e u» d e la be nt o n it e , l a q ua nt i té ex p r im é e en gr am m es
de bl e u d e m ét h yl è n e ads or b ée p ar 1 0 0 g d e b e nt on i te .
1. 2 P r in c ip e d e l´ e ss ai
O n inj ec t e s uc c es s i v e m ent d es d os es é l ém en t air es d´ un e s o l ut i o n d e bl e u d e
m éth yl è n e d a ns
le
ba i n
aq u eux
c o nt e na nt
la
pr is e
d´ es s a i .
O n c on tr ôl e
l´ ads or pt i on du b le u a pr ès c ha q ue aj o ut , e n ef f ec tu an t u n e tac h e s ur u n p ap i er
f il tr e ( tes t d e l a tac h e, v o ir p ar ag r a p he 5 ) .
P our un s im p le c on tr ôl e de c onf o r m ité , l a q u an t it é d e b le u s p éc if i é e es t inj ec t é e
en un e s e u le f o is .
2. AP P AR E I L L AG E E T RE ACT IF
2. 1 U ne b ur et t e de c a pac i té 25 m l et d e gr a du a ti o n 1/ 1 0 m l
2. 2 P a pi er f i lt r e : q u an ti t at if et s a ns c e ndr es ( < 0 ,0 1 0) ; gr am m age :
95 g/m 2 ; ép a is s eur : 0, 2 0 m m ; v it es s e d e f i ltr at i o n 7 5 ; r ét e nt i on : 8
m ic r om ètr es .
2. 3 U ne b a gu e tt e d e v er r e : l on g ue ur 3 0 0 m m ; d iam ètr e 8 m m .
2. 4 U n ag i ta t eur m ag n ét i qu e e t b ar r e a u a im ant é.
2. 5 S o lu t i on d e b l eu d e m ét h yl è n e d e qu a l it é m édic i n a le à 10 g / l ±
0, 1 g/ l L a dur é e m ax i m ale d´ ut i l is a t io n d e l a s ol u ti o n es t d e un m ois . E l le d o it
êtr e c o ns e r vé e à l ’ a br i d e l a l um ièr e.
2. 6 E a u dém i né r a l is ée o u d is t i l l ée .
3. PR E P AR AT IO N D E L ’ EC H ANT I L L O N PO U R E S S AI
Aj o u ter 10 g de b e nt o n it e d ans 2 0 0 m l d ’ ea u d is t i l lé e , l ais s er g o n f ler p e nd a nt 2
he ur es , p u is h om og én é is er p ar a g i t a ti o n.
4. E XE CUT IO N D E L ’ E S S AI
4. 1 D éf in it i o n d u t e st à l a t a ch e
A pr ès c h a qu e a d di t io n de b l e u ( v o ir par agr a p he 5 .2) , c e tes t c o ns is te à
pr é l e v er , à l ’ a id e de l a ba g ue tt e de ver r e , un e g ou tt e de s us p en s i on q ue l ’ o n
dé p os e s u r le p a p ier f i ltr e . La t ac h e a i ns i f or m ée s e c om pos e d ’u n dé p ôt c e ntr a l
de m até r i a u, c o l or é d ’ un bl e u g én ér a lem en t s ou t en u, en to ur é d ’ un e
zo n e hum i de i nc o lor e . L a go ut t e pr é l e vé e do i t ê tr e t e l le q ue l e d iam ètr e du
dé p ôt s o i t c om pr is
en tr e 8 et 1 2 m m . Le t es t es t d it p os it if s i , d ans l a zo n e hum i de , a pp ar aî t a u to ur
du d é pô t c e ntr a l u ne aur é o le b l e u c l air per s is t a nt e. I l es t d it n ég a tif s i l ’ au r é o le
es t inc o lo r e .
4. 2 Do sa g e
A l ’ a id e d e l a b ur et t e, ve r s er 2 m l de s o lu t io n d e b l eu da ns le r éc i p ie n t
c on t en a nt l es 2 0 0 m l d e s us pe ns io n d e b e nt o n it e m ai n te n ue en a g it at i on .
A pr ès 2 m n, aj o ut er u ne d os e de 1 m l d e s o lu t io n d e b l e u, c e tt e ad d it i o n ét an t
s u i vi e du t es t d e l a t a c he s ur le pa p i er f i ltr e . O n la is s e s ’o p ér er l ’ ads or pt i o n d u
b le u, qu i n ’ es t p as i ns ta nt a né e , to ut en ef f ec tu a nt d es t es ts
de m in ut e e n m i nu te .
S i l ’a ur éo l e b le u c l a ir d is p ar aî t à l a c i n qu i è m e tac h e o n p r oc è de à de n ou v e l les
ad d it i o ns é lém en t ai r es d e b l eu d e 0 ,2 m l, p u i s d e 0 ,1 m l.
Ch a qu e a dd i t io n es t s u i vi e d e t es ts ef f ec t u é s t ouj o ur s d e m in ut e e n m in u te .
Re n ou v e le r c es op ér a ti o ns j us q u’ à c e q u e l e t es t d em eur e p os it if pe n da n t c i n q
m inut es c o ns éc u t i ves : l e dos a ge es t a l or s c ons i d ér é c om m e ter m i né .
S oi t V m l v er s és
5. E XP R E S SIO N D E S RE S UL T AT S
5. 1 V al eu r d e b le u
La va l e ur de b l e u ex p r im ée e n gr am m es de b l eu p o ur 10 0 g d e be n to n it e es t
do n né e p ar l a f or m ul e :
BIBLIOGRAFIA
-
Anelli G., (1977). Am. J. Enol. Vitic., 28, p. 200
-
Bakalinsky A.T. e Boulton R., (1985). The Study of an Immobilized Acid Protease for the
Treatment of Wine Proteins. Am. J. Enol. Vitic. 36(1)., 23-29.
-
Bayly F.C e Berg H.W., (1967). Am. J. Enol. Vitic., 18, p. 18
-
Berg H.W., Akioshi M., ( 1961). Amer. J. Enol. Vitic., 12,3 p.107
-
Blum H, Beier H e Gross H.J., (1987). Electrophoresis, 8 , p. 93
-
Boulton R.B., Singleton V.L., Bisson L., Kunee R.E.
(1996).- Principle e Practices of
Winemaking. The Chapman & Hall Enology Library, New York
-
Bradford MM., (1976). Anal. Biochem., 72, p. 248
-
Cabello-Pasini A., Victoria-Cota N., Macias-Carranza V., Herneez-Garibay E. e Muñiz-
Salazar R., (2005). Clarification of wines using polysaccharides extracted from seaweeds. Am.
J. Enol. Vitic. 56(1)., 52-59
-
Canals J.M, Arola L e Zamora F., (1998). Am. J. Enol. Vitic., 49, p. 38
-
Celotti E., (2005). Nuovo metodo per la valutazione della potenziale instabilità proteica dei
vini, Enoforum - Piacenza 21-23 marzo
-
Cifuentes A e Poppe H., (2000). Electrophoresis, 16, p. 516
-
Cilindre C., Castro A.J., Clément C., Jeeet P. e Marchal R., (2007). Influence of Botrytis
cinerea
infection
on
Champagne
wine
proteins
(characterized
by
two-dimensional
electrophoresis/immunodetection). e wine foaming properties. Food Chemistry 103(1)., 139149.
-
Correa I e Polo M.C., (1991). Rev. Agroquı́m. Tecnol. Aliment., 31, p. 319
-
Correa I, Polo M.C, Amigo L. e Ramos M., (1988). Conn. Vigne Vin, 22, p. 1
-
Correa-Gorospe I, Polo M.C. e Hernández T., (1991). Food Chem., p. 135
-
Dambrouck T., Marchal R., Marchal-Delahaut L., Parmentier M., Maujean A., e Jeeet P.,
(2003). Immunodetection of Proteins from Grapes e Yeast in a White Wine. J. Agric. Food
Chem., 51 (9)., 2727 -2732
-
Dawes H., Boyes S., Keene J., Heatherbell D., - (1994). Amer. J. Enol. Vitic., 45,3 p. 319
-
Dizy M e Bisson L.F., (1999). Am. J. Enol. Vitic., 50 , p. 120
-
Dizy M. e Bisson L.F., (2000). Proteolytic Activity of Yeast Strains During Grape Juice
Fermentation. Am. J. Enol. Vitic. 51(2)., 155-167
-
Dorrestein E, Ferreira R.B, Laureano O. e Teixeira A.R., (1995). Am. J. Enol. Vitic., 46, p.
235
-
Dorrestein E, Ferreira R.B, Laureano O. e Teixeira A.R., (1995). Am. J. Enol. Vitic., 46, p.
235
-
Doubordieu D., Darriet P., e Lavigne V., (1993). Recherche sur l’arome varietal du cepage
Sauvignon. In: Lemperle, E., (ed). Proc. 10 th Int. Oenol. Symp.(1993). Montreaux (Ch). pp.
405-416
-
Drawert F., Görg A., e Lebensm Z., (1974). Unters. Forsch., 154, p. 328
-
Drawert F., Müller W., e Lebensm Z., (1973). Unters. Forsch., 153, p. 204
-
Dubordieu D, Lauberes R.M e Ollivier C., (1986). Conn. Vigne Vin, 20, p. 119
-
Dubordieu D., Llauberes R.M et al., (1986). Vigne Vin, 20 p. 119
-
Dubordieu D., Serrano M., Vannier A.-C., Riberau-Gayon P., (1988). et al. 1988- Conn
Vigne Vin , 22,4, p 261-273
-
Dulau L. (1990). Recherches sur le proteins responsables de la casse proteique des vins
blancs secs. Tesi di Dottorato, Università Bordeaux II.
-
Dupin I.V.S., McKinnon B.M., Ryan C., Boulay M., Markides A.J., Jones G.P.,Williams P.J.
e Waters E.J., (2000). Saccharomyces cerevisiae Mannoproteins That Protect Wine from
Protein Haze: Their Release during Fermentation e Lees Contact e a Proposal for Their
Mechanism of Action. J. Agric. Food Chem. 48(8)., 3098-3105.
-
Eckhardt A.E, Hayes C.E e Goldstein I.E., (1976). Anal. Biochem., 73, p. 192
-
Bayly F.C e H.W Berg., (1967). Am. J. Enol. Vitic., 18, p. 18
-
Interesse F.S., V. Allogio, F. Lamparelli, G. D’Avella., (1987). Food Chem. 23 65.
-
Ferenczy S., (1966). Étude des protéine set des substances azotées. Bulletin del’O.I.V. 93,
1311-1336
-
Ferreira R.B, Monteiro S, Piçarra-Pereira M.A, Tanganho M.C, Loureiro V.B e Teixeira A.R.,
(2000). Am. J. Enol. Vitic., 51, p. 22
-
Ferreira R.B., Monteiro S., Freitas R., Santos C.N., Chen Z., Batista L.M., Duarte J., Borges
A. e Teixeira A.R., (2007). The role of plant defence proteins in fungal pathogenesis. Molecular
Plant Pathology 8(5)., 677-700.
-
Ferreira R.B., Monteiro S., Picüarra-Pereira M.A., Tanganho M.C., Loureiro V.B. e Teixeira
A.R., (2000). Characterisation of the proteins from grapes e wines by immunological methods.
Am. J. Enol Vitic. 51(1)., 22-28
-
Ferreira R.B., Piçarra-Pereira M.A., Monteiro S., Loureiro V.B. e Teixeira A.R., (2002). The
wine proteins. Trends Food Sci. Technol. 12, 230-239
-
Feuillat J, Bergeret e J Texter., (1972). Rev. Franc. Oenol., 48 p. 5
-
Feuillat M., Brillant G. e Rochard J., (1980). Mise en evidence d’une production de
proteases exocellulaires par les levures au cours de la fermentation alcoolique du mout de
raisin. Connaiss. Vigne Vin 14, 37-52
-
Feuillet M., Peyron D., Berger J.l., (1987). Bull OIV, 673
-
Francis I.L., Sefton M.A. e Williams P.J., (1994). The sensory effects of pre- or post-
fermentation thermal processing on Chardonnay e Semillon wines. Am.J Enol. Vitic. 45(2)., 243251
-
Girbau T., Stummer B.E., Pocock K.F., Baldock G.A., Scott E.S. e Waters E.J., (2004). The
effect of Uncinula necator (powdery mildew). e Botrytis cinerea infection of grapes on the levels
of haze-forming pathogenesis-related proteins in grape juice e wine. Austral. J. Grape Wine
Res. 10, 125-133
-
González-Lara R, I Correa, M.C Polo, P.J Martı́n-Álvarez e M Ramos., (1989). Food Chem.,
34 p. 103
-
Görg A,. Postel W, Westermeier R.,. Günther G., (1982).
Recent development food
analysis, in: Proceedings of the European Conference Food Chemistry 4 264
-
Gump B.M. e Huang C.F., (1999). Removal of unstable proteins in wine. I. Characterization
e removal by adsorbents resins. Publication 990402 California Agricultural Technology Institute,
CSU, Fresno
-
Heatherbell D., Ngaba P., Fombin J., Watson B., Garcia Z., Flores J. e Hsu J., (1984).
Recent developments in the application of the ultrafiltration e protease enzymes to grape juice e
wine processing. Proceedings of the International Symposium on Cool Climate Viticulture e
Enology, Corvallis, Oregon (Oregon State University: Corvallis, OR). pp. 418-445
-
Hillier R.M., (1976). J. Dairy Res., 43, p. 259
-
Hoffmann-Sommergruber
K., (2002). Pathogenesis-related (PR)–Proteins identified as
allergens. Biochem. Soc. Trans. 30, 930-935
-
Høj P.B., Tattersall D.B., Adams K., Pocock K.F., Hayasaka Y., van Heeswijck R. and
Waters E.J. (2000). The ‘haze proteins’ of wine – a summary of properties, factors affecting their
accumulation in grapes, and the amount of bentonite required for their removal from wine.
th
Proceedings of the ASEV 50 Anniversary Annual Meeting, Seattle, Washington, 19-23 June
2000 (American Society for Enology and Viticulture: Davis, California) pp. 149-154
-
Hsu J.C e Heatherbell D.A., (1987). Am. J. Enol. Vitic., 38, p. 6
-
Hsu J.C. e Heatherbell D.A., (1987b). Heat-unstable proteins in wine I. Characterization e
removal by bentonite fining e heat treatment. Am. J. Enol. Vitic. 38(1)., 11-15
-
Hsu J.C., e Heatherbell D., (1987). - Amer. J. Enol. Vitic., 38.1 p. 11
-
Igartuburu J.M., del Rio R.M., Montiel J.A., Peo E. e Luis F.R., (1991). Study of agricultural
by-products. Extractability e amino acid composition of grape (Vitis vinifera). skin proteins from
cv. Palomino. Journal of Science of Food e Agriculture 57(3)., 437-440
-
Jakob L., (1962). Des Weinblatt, 57 p.805
-
Joshi B.N., Sainani M.N., Bastawade K.B., Gupta V.S. e Ranjekar P.K., (1998). Cysteine
protease inhibitor from pearl millet: a new class of antifungal protein. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 246, 382-387
-
Koch J e E Sajak., (1959). Am. J. Enol. Vitic., 10, p. 114, - Waters E.J, Peng Z, Pocock
K.F e Williams P.J. -1995- Aust. J. Grape Wine Res., 1, p. 86
-
Koch J., Sayak E., (1959).– Weinberg u. Keller, 10 p. 35
-
Kwon S.W., (2004). Profiling of soluble proteins in wine by nano-highperformance liquid
chromatography/tandem mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 52(24), 7258-7263
-
Laemli U.K., (1970). Nature, 227, p. 680
-
Lagace L.S e Bisson L.F., (1990). Am. J. Enol. Vitic., 41 , p. 147
-
Lamikanra O. e Inyang I.D., (1986). Proc. Fla. State Hort. Soc., 99 , p. 148
-
Ledoux V, Dulau L e Dubordieu D., (1992). J. Int. Sci. Vigne Vin, 26, p. 239
-
Lee T.H., (1985). Protein instability: Nature, characterization e removal by bentonite. In:
Physical Stability of Wine. T. H. Lee (Ed.). pp 23-40. Austral. Soc. Vitic. Enol. Glen Osmond,
Australia
-
Lomolino G. e Curioni A., (2007). Protein Haze Formation in White Wines:22 Effect of
Saccharomyces cerevisiae Cell Wall Components Prepared with Different Procedures. J. Agric.
Food Chem. 55(21)., 8737-8744
-
Luguera C, Moreno-Arribas V, Pueyo E e Polo M.C., (1997). J. Agric. Food Chem., 45, p.
3766
-
Luguera C, Moreno-Arribas V, Pueyo E, Bartolomé B e Polo M.C., (1998). Food Chem., 63,
p. 465
-
Lurton L. e Guerreau J., (1988). Study of the proteolysis of wine yeast during storage of
wine on its lees. Rev. Fr. Oenol. 113, 35-41
-
Marchal R, Bouquelet S e Maujean A., (1996). J. Agric. Food Chem., 44, p. 1716
-
Marchal R., Berthier L., Legendre L., Marchal-Delahaut L., Jeeet P. e Maujean A., (1998).
Effects of Botrytis cinerea infection on the must protein electrophoretic characteristics. J. Agric.
Food Chem. 46(12)., 4945- 949
-
Marchal R., Warchol M., Cilindre C. e Jeeet P., (2006). Evidence for protein degradation by
Botrytis cinerea e relationship with alteration of synthetic wine foaming properties. J. Agric. Food
Chem. 54(14)., 5157-5165
-
Marshall T e K.M Williams., (1987). Electrophoresis, 8, p. 493
-
Mauch F., Mauch-Mani B. e Boller T., (1988). Antifungal hydrolases in pea tissue. II.
Inhibition of fungal growth by combinations of chitinases e beta- 1,3-glucanase. Plant Physiol.
88, 936-942
-
Miller G.C., Amon J.M., Gibson R.L. e Simpson R.F., (1985). Loss of wine aroma attribute
to protein stabilization with bentonite or ultrafiltration. Aust. Grapegrower Winemaker 256, 49-50
-
Modra E.J., Williams P.J., (1988). Are proteases active in wines e juices Aust. Grapegrower
Winemaker 292, 42-46
-
Moine-Ledoux V. e Dubourdieu D., (1999). An invertase fragment responsible for improving
the protein stability of dry white wines. J. Sci. Food Agric. 79, 537-543
-
Moine-Ledoux V., (1996). Recherces sur le role des mannoproteines de levure vis-a-vis de
la stabilisation proteique et tartarique des vins. Tesi di dottorato Università de Bordeaux II
-
Moio L e Addeo F., (1989). Vignevini, 4 p. 53
-
Monteiro S, Piçarra-Pereira M.A, Tanganho M.C, Rente J.P, Loureiro V.B, Teixeira A.R e
Ferreira R.B., (1999). J. Sci. Food Agric., 79, p. 772
-
Monteiro S, Piçarra-Pereira M.A, Tanganho M.C, Rente J.P, Loureiro V.B, Teixeira A.R e
Ferreira R.B., (1999). J. Sci. Food Agric., 79, p. 77
-
Monteiro S., Picarra-Pereira M.A., Mesquita P.R., Loureiro V.B., Teixeira A. e Ferreira R.B.,
(2001). The wide diversity of the structurally similar wine proteins. J. Agric. Food Chem. 49(8).,
3999-4010
-
Moreno-Arribas M.V, E. Pueyo, M.C. Polo., (1995). XXI Congreso Mundial de la Viña y el
Vino. 75a Asamblea Geenral de la O.I.V., Punta del Este, p. 15
-
Moreno-Arribas V, Cabello F, Polo M.C, Martı́n-Alvarez P.J e Pueyo E., (1999). J. Agric.
Food Chem., 47, p. 114
-
Moretti R.H e Berg H.W (1965). Am. J. Enol. Vitic., 16 p. 69
-
Moretti R.H e Berg H.W., (1965)., Am. J. Enol. Vitic., 16, p. 69
-
Murphey J.M, Spayd S.E e J.R Powers., (1989). Am. J. Enol. Vitic., 40 p. 199
-
Murphey J.M., Powers J.R. e Spayd S.E., (1989a). Estimation of soluble protein
concentration of white wines using Coomassie Brilliant Blue G-250. Am. J. Enol. Vitic. 40(3).,
189-193
-
Pachova V., Ferreo M., Guell C. e Lòpez F., (2002). Protein adsorption onto metal oxide
materials in white wine model system. J. Food Sci. 67, 2118- 24 2121.
-
Pachova V., Güell C e López F., (2004a). White wine continuous protein stabilization by
packed column. J. Agric. Food Chem. 52(6)., 1558-1563.
-
Pachova V., Güell C., Pueyo E., López-Barajas M., Polo M.C. e López F., (2004b). White
wine protein stabilization by a continuous process using a packed column. Am. J. Enol. Vitic.
55(2)., 195-198
-
Paetzold M., Dulau L. e Dubourdieu D., (1990). Fractionnement et caractérisation des
glycoprotéines dans les moûts de raisins blancs. J. Int. Sci. Vigne Vin 24, 13-28
-
Paetzold M., Dulau L. e. Dubordieu D., (1990). Conn. Vigne Vin, 24, p. 13
-
Pastorello E.A., Farioli L., Pravettoni V., Ortolani C., Fortunato D., Giuffrida M.G., Perono
Garoffo L., Calamari A.M, Brenna O. and Conti A. (2002). Identification of grape and wine
allergens a san endochitinase 4, a lipidtransfer protein, and a thaumatin. J. Allergy Clin.
Immunol. 111(2), 350-359.
-
Peng Z., Pocock K.F., Waters E.J., Francis I.L. e Wiliams P.J., (1997). Taste Properties of
Grape (Vitis vinifera). Pathogenesis-Related Proteins Isolated from Wine. J. Agric. Food Chem.
45(12)., 4639-4643.
-
Pocock K.F., Hayasaka Y., McCarthy M.G. e Waters E.J., (2000). Thaumatinlike proteins e
chitinases, the haze-forming proteins of wine, accumulate during ripening of grape (Vitis
vinifera). berries e drought stress does not affect the final levels per berry at maturity. J. Agric.
Food Chem. 48, 1637-1643
-
Pocock K.F., Hayasaka Y., Peng Z., Williams P.J. e Waters E.J., (1998). The effect of
mechanical harvesting e long-distance transport on the 25 concentration of haze-forming
proteins in grape juice. Aust. J. Grape Wine Res. 4, 23-29
-
Pocock K.F., Høj P.B., Adams K.S., Kwiatkowski M.J. e Waters E.J., (2003). Combined
heat e proteolytic enzyme treatment of white wines reduce haze forming protein content without
detrimental effect. Aust. J. Grape Wine Res. 9, 56-63
-
Polo M.C,. Cáceres I, Ll. Palop, M. Dizy, E. Pueyo, P.J. Martı́n-Alvarez,. (1991). Flavors e
off-flavors, in: G. Charalambous (Ed.)., Development in Food Science, Vol. 24, Elservier,
Amsterdam, p. 87
-
Poux C. e Ournac A., (1976). Ann. Technol. Agric., 19 , p. 217
-
Powers J.R., Nagel C.W. e Weller K., (1988). Protein Removal from a Wine by Immobilized
Grape Proanthocyanidins. Am. J. Enol. Vitic. 39(2)., 117-120
-
Pueyo E, Dizy M e Polo M.C., (1993). Am. J. Enol. Vitic., 44, p. 255
-
Riberau-Gaion J, Glories Y., Maujean A., Dubordieu D., (1998). pag. 123, trattato di
enologia vol.2
-
Riberau-Gayon J., (1932). Ann. Fasf. Fraudes 23, p.516
-
Riberau-Gayon J., (1935). Rev. Vitic., 82, p.367
-
Ruiz-Larrea F., Lopez R., Santamaria P., Sacristan M., Ruiz M.C., Zarazaga M., Gutierrez
A.R. e Torres C., (1998). Soluble proteins e free amino nitrogen content in must e wine of cv.
Viura in La Rioja. Vitis 3, 139-142
-
Santoro M., (1995). Am. J. Enol. Vitic., 46, p. 250
-
Sarmento M.R., Oliveira J.C., Slatner M. e Boulton R.B., (2000). Influence of 26 intrinsic
factors on conventional wine protein stability tests. Food Control 11,
-
Sarry J.E., Sommerer N., Sauvage F.X., Bergoin A., Rossignol M., Albagnac G. e Romieu
C., (2004). Grape berry biochemistry revisited upon proteomic analysis of the mesocarp.
Proteomic 4, 201-215.
-
Saywell L .G., (1934).– Ind Eng. Chem., 26, p.981
-
Somers T.C e Ziemelis G., (1973). Am. J. Enol. Vitic., 24, p. 47
-
Tal, M. et al., (1985). J. Biol. Chem., 260, p. 9976-9980
-
Tattersall D.B., Pocock K.F., Hayasaka Y., Adams K., van Heeswijck R., Waters E.J. and
Høj P.B., (2001). Pathogenesis related proteins – their accumulation in grapes during berry
growth and their involvement in white wine heat instability. Current knowledge and future
perspectives in relation to winemaking practices. In: Molecular Biology and Biotechnology of
theGrapevine. Ed. K.A. Roubelakis-Angelakis (Kluwer Academic Publishers: Dordrecht,
Netherlands), pp. 183-201.
-
Tattersall D.B., Van Heeswijck R. e Hoj P.B., (1997). Identification e characterization of a
fruit-specific, thaumatin-like protein that accumulates at very high levels in conjunction with the
onset of sugar accumulation e berry softening in grapes. Plant Physiol. 114, 759-769
-
Theis T. e Stahl U., (2004). Antifungal proteins: targets, mechanisms e prospective
applications. Cell Mol. Life Sci. 61, 437-455
-
Tyson P.J, Luis E.S., Day W.R., Walker B., Lee T.H., (1981). Am.J. Enol. Vitic. 32 p. 241.
-
Usseglio-Tomasset L e Castino M., (1975). Riv. Vitic. Enol. Conegliano, 8, p. 328.
-
van Loon LC. e van Strien LA., (1999). The families of pathogenesis-related proteins, their
activities, and comparative analysis of PR1 type proteins.Physiol. Mol. Plant Pathol. 55, 85-97.
-
Villettaz J.C., (1988). Rev. Fr. Oenol., 28, p. 23
-
Vincenzi S., Polesani M. e Curioni A., (2005). Removal of Specific Protein Components by
Chitin Enhances Protein Stability in a White Wine. Am. J. Enol. Vitic. 56(3)., 246-254
-
Vincenzi S., Zapparoli G., Zoccatelli G., Simonato B.,
(2011). Metodo rapido per la
determinazione e la quantificazione di proteine e glicoproteine nei vini bianchi – Enoforum,
Arezzo, 3-5 maggio
-
Voilley A., Lamer C., Dubois P. e Feuillat M., (1990). Influence of macromolecules e
treatments on the behaviour of aroma compounds in a model wine. J. Agric. Food Chem. 38(1).,
248-251.
-
Waters E.J, Peng Z, Pocock K.F e Williams P.J., (1995). Aust. J. Grape Wine Res., 1, p. 8
-
Waters E.J, Shirley N.J e Williams P.J., (1996). J. Agric. Food Chem., 44, p. 3
-
Waters E.J, Wallace W e Williams P.J., (1991). Am. J. Enol. Vitic., 42, p. 123
-
Waters E.J, Wallace W e Williams P.J., (1992).- J. Agric. Food Chem., 40, p. 1514
-
Waters E.J. , Wallace W., Williams P.J., (1993). J Agric. Food Chem., 41, p. 724
-
Waters E.J., Hayasaka Y., Tattersall D.B., Adams K.S. e Williams P.J., (1998). Sequence
analysis of grape (Vitis vinifera). Berry chitinases that cause haze formation in wines. J. Agric.
Food Chem. 46(12)., 4950-4957
-
Waters E.J., Pellerin P. e Brillouet J.M., (1994). A Saccharomyces mannoprotein that
protects wine from protein haze, Carbohydrate polymers 23, 185-191
-
Waters E.J., Peng Z., Pocock K.F. e Williams P.J., (1995). Proteins in white wine. II. Their
resistance to proteolysis is not due to their phenolic association or glycosilation. Aust. J. Grape
Wine Res. 1, 94-99
-
Waters E.J., Shirley N.J., Williams P.J., (1996). Nuisance proteins of wine are grape
pathogenesis-related proteins. J. Agric. Food Chem. 44(1)., 3-5.
-
Weetall H.H., Zelko J.T. e Bailey L.F., (1984). A new method for the stabilization of white
wine. Am. J. Enol. Vitic. 35(4)., 212-215
-
Winter A,. Ek K,. Eerson V.B., (1977). LKB Application Note 250
-
Yokotsuka et al., 1991; Monteiro et al., (2001). Kwon, 2004
-
Yokotsuka K e Singleton V.L., (1997). Am. J. Enol. Vitic., 48, p. 100
-
Yokotsuka K, Aihara T, Umehara Y e Kush I., (1975).- Hakko Kogaku Zasshi, 53 p. 631
-
Yokotsuka K, Ebihara T e Sato T., (1991). J. Ferment. Bioeng., 71, p. 248
Ringraziamenti:
A conclusione di questo percorso trovo doveroso ringraziare le persone che mi hanno
sostenuto, aiutato, spronato e tutti quelli che non hanno mai dubitato della mia voglia di
riuscire a conseguire questo nuovo traguardo.
Il primo grazie al dr. Roberto Larcher, responsabile presso la Fondazione E. Mach del
Laboratorio Chimico e Consulenza Enologica,
per la grande professionalità, per la
disponibilità e per la precisione necessaria a chi ha fatto della chimica una professione, oltre
al Professor Emilio Celotti per la fiducia accordatami nell’autonomia del lavoro svolto presso
la Fondazione Mach.
A Massimo Bertamini per avermi convinto e sostenuto nei giorni in cui le energie e la
volontà sembravano non bastare per arrivare in fondo, per aver compreso il mio sforzo e per
aver atteso pazientemente il mio rientro a tempo pieno.
A Tiziana Nardin, preziosissima per la sua competenza e per la sua disponibilità, per il
sorriso che non le manca mai e per avermi fatta sentire parte del gruppo in laboratorio.
A Mario Malacarne per avermi messo a disposizione la sua competenza e il laboratorio.
A Nigi, Giunto e Giac, con i quali la sfida diventa avventura da vivere insieme.
Ad Angelo che sa che quando il percorso è in salita spingo più forte sui pedali per
abbreviare la sofferenza.
E infine grazie a chi mi ha insegnato a non mollare mai.
La presente tesi è depositata presso la Facoltà di Agraria dell’Univeristà di Udine. Tutto il contenuto è sottoposto a diritti di
copyright. L’utilizzo a qualunque scopo, parziale o totale del contenuto, senza la prevista autorizzazione, sarà sanzionato a
norma di legge.

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