Campioni Respiratori

Transcript

Per uso diagnostico in vitro:
TM
MycAssay Pneumocystis
Serie Stratagene Mx3000
MycAssayTM Pneumocystis
REF 080-035
Uso previsto
MycAssay™ Pneumocystis è studiato per l'uso presso laboratori professionali qualificati per la determinazione qualitativa
del DNA genomico di Pneumocystis jirovecii estratto da campioni respiratori ottenuti dalle basse vie respiratorie (ad es.
campioni bronchiali) come ausilio alla diagnosi in pazienti adulti con presunta polmonite da P. jirovecii.
®
MycAssay™ Pneumocystis è stato convalidato per l’uso con gli strumenti della serie Stratagene Mx3000 (Mx3000P o
®
Mx3005P ) in combinazione con il software MxPro, versione 4.10.
Introduzione e spiegazione
La polmonite da Pneumocystis jirovecii (ex carinii) (PCP) è una forma comune di polmonite opportunistica in pazienti
1
immunocompromessi, soprattutto quelli con infezione HIV avanzata e AIDS . Viene di norma contratta in comunità, è
2
subacuta nella manifestazione e porta ad una progressiva insufficienza respiratoria e a morte se non curata. Di norma si
somministra a numerosi pazienti a rischio una profilassi con trimetoprim-sulfametoxazolo (Bactrim o Septrin), una pratica
che ha notevolmente ridotto l'incidenza di PCP, anche se si verifica un breakthrough e coloro che non sanno di essere
3
HIV positivi possono ammalarsi di PCP in presenza di AIDS . La PCP si manifesta anche in altri pazienti
immunocompromessi, fra cui i riceventi di trapianti di organi solidi, i soggetti con ipogammaglobulinemia e leucemia
cronica.
Attualmente la diagnosi della PCP si basa su metodi microscopici, perché non è possibile effettuare colture di P. jirovecii
nei comuni laboratori di microbiologia. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è la tecnica preferenziale per la raccolta dei
campioni. I metodi approvati per la diagnosi includono l'immunofluorescenza o fluorescenza diretta (IF) e la colorazione
4
istologica dei campioni .
TM
MycAssay Pneumocystis è un kit diagnostico molecolare per la determinazione di P. jirovecii basata sulla tecnica PCR
5
con sonde Molecular Beacons . L’intera procedura di analisi, compresa l’estrazione del DNA dal campione clinico, può
essere completata in 4 ore oppure in sole 2 ore se il DNA estratto è già disponibile. Questo dosaggio ha il vantaggio
diretto di un'aumentata efficienza di laboratorio, associata alla rapidità di analisi che consente di ottenere prevedibili
benefici clinici. La precisione diagnostica del test dipende in gran parte dalla qualità del campione.
Principi del dosaggio
TM
Dopo aver miscelato i reagenti del kit MycAssay Pneumocystis con un campione contenente la sequenza di DNA
bersaglio di Pneumocystis (una porzione della subunità maggiore dei ribosomi mitocondriali di Pneumocystis), il ciclo
termico produce l’amplificazione del DNA. Il dosaggio contiene inoltre una sequenza del Controllo di Amplificazione
Interno (IAC), un frammento di DNA non presente in Pneumocystis, altri genomi fungini, batterici o umani, per individuare
sostanze inibitorie della PCR e confermare la funzionalità dei reagenti del dosaggio.
I bersagli di DNA amplificati vengono individuati con le sonde Molecular Beacons. Si tratta di sonde di ibridazione
oligonucleotidiche a singolo filamento, che formano una struttura "stem-and-loop". Il loop (porzione ad anello) contiene
una sequenza della sonda complementare alla sequenza bersaglio, mentre lo stem (porzione a colletto) è formato da due
sequenze complementari appaiate, disposte su entrambi i lati della sequenza della sonda. Un fluorocromo, che emette
luce fluorescente se eccitato da luce a lunghezza d'onda adeguata, viene legato in modo covalente ad un'estremità,
mentre un quencher, che sopprime la fluorescenza del fluorocromo se vi si trova fisicamente vicino, viene legato in modo
covalente all’altra estremità. Le sonde Molecular Beacons non emettono luce fluorescente quando sono libere in
soluzione. Tuttavia, quando ibridano con un filamento di acido nucleico contenente una sequenza bersaglio, subiscono
una trasformazione conformazionale che consente loro di emettere luce fluorescente. La quantità di fluorescenza in un
dato ciclo, o nel ciclo successivo, dipende dalla quantità di ampliconi specifici presenti in quel momento. Il sistema RealTime PCR Stratagene monitora simultaneamente la fluorescenza emessa da ogni beacon.
1
Morris A, Lundgren JD, Masur H, Walzer PD, Hanson DL, Frederick T, Huang L, Beard CB, Kaplan JE. (2004). Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia. Emerg
Infect Dis: 10: 1713-20.
2
Miller RF, Allen E, Copas A, Singer M, Edwards SG. Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii. pneumonia is independent of highly
active antiretroviral therapy. Thorax 2006;61:716-21.
3
Kovacs JA, Gill VJ, Meshnick S, Masur H. (2001). New insights into transmission, diagnosis, and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia. JAMA: 286: 2450-60.
4
Huang L, Morris A, Limper AH, Beck JM; ATS Pneumocystis Workshop Participants. An Official ATS Workshop Summary: Recent advances and future directions in
pneumocystis pneumonia (PCP). Proc Am Thorac Soc 2006;3:655-64.
5
Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: 303-308.
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Per uso diagnostico in vitro
Precauzioni
 Il kit è previsto esclusivamente per l'uso diagnostico in vitro.
 Il kit è studiato per l'uso esclusivamente presso laboratori professionali. Sono richieste procedure particolari per la
manipolazione dei campioni in modo da prevenire la formazione di aerosol. Nella manipolazione dei campioni vanno
rispettate precauzioni standard e norme istituzionali. Myconostica Ltd. mette a disposizione su richiesta la scheda di
sicurezza del prodotto.
 Questo test è previsto esclusivamente per l’uso con la serie Stratagene Mx3000 e con il software MxPro, versione
4.10.
 Durante gli studi di convalida è stato osservato quanto segue in relazione a questo strumento:
o
Se lo strumento è appena stato utilizzato, far raffreddare la lampada per almeno 1 ora prima di preparare
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un’analisi con MycAssay
Pneumocystis, perché in caso contrario può verificarsi una perdita di
sensibilità e, di conseguenza, possono prodursi risultati falsi negativi.
o
Esiste una ridotta precisione a basse concentrazioni in corrispondenza del cut-off clinico rispetto ad altri
strumenti testati.
 Non utilizzare i reagenti o i controlli se le buste protettive sono aperte o danneggiate al relativo ricevimento.
 I reagenti e i controlli non sono intercambiabili fra i kit di diversi lotti.
 Non creare mai pool di reagenti o controlli di diverse provette, anche se appartengono allo stesso lotto.
 Non utilizzare mai i reagenti o i controlli dopo la data di scadenza.
 I reagenti e i controlli non devono essere ricongelati o riutilizzati dopo l'apertura.
 Indossare indumenti protettivi e guanti monouso per manipolare i reagenti del kit.
 Evitare la contaminazione microbica e da deossiribonucleasi (DNAsi) dei reagenti durante il prelievo di aliquote dalle
provette.
 Si raccomanda l'impiego di puntali per pipetta con filtro monouso, a bassa ritenzione, sterili, esenti da DNAsi oppure
puntali per pipetta a spostamento positivo.
 Utilizzare un nuovo puntale per ogni campione o reagente.
 Smaltire i reagenti non utilizzati e i materiali di scarto in conformità con le normative nazionali, federali, statali e locali.
 Per evitare la contaminazione da ampliconi di Pneumocystis o IAC, non aprire le provette di reazione dopo
l'amplificazione.
 Non mangiare, bere o fumare nei locali dove vengono manipolati i campioni o i reagenti del kit.
 Basse concentrazioni di DNA possono risultare instabili se non conservate correttamente. Si raccomanda di
o
conservare le estrazioni del DNA dai campioni clinici a -80 C per preservarne l’integrità. Se possibile, si raccomanda
inoltre di evitare molteplici cicli di scongelamento e ricongelamento.
 Questo kit è stato convalidato utilizzando provette per PCR da 0,2 ml in strip da 8 con cappucci collegati (Agilent
Technologies cat. # 401428 & 401425). L’impiego di altri materiali/tipi di plastica potrebbe invalidare i valori soglia e,
quindi, i dati riportati nelle istruzioni per l’uso. Qualora si utilizzino materiali alternativi, si raccomanda di eseguire una
convalida locale inserendo controlli positivi e negativi.
Contenuto del kit
Descrizione
Il kit è costituito da cinque buste di alluminio sigillate a 3 scomparti, ciascuna delle quali può essere utilizzata
separatamente. Ogni busta contiene reagenti sufficienti per 8 reazioni.
Volume
Provetta 1
(Cappuccio
arancione)
dNTP
MgCl2
Soluzione tamponata di complesso DNA-polimerasi
66 µL
Provetta 2
(Cappuccio blu)
Primer < 0,01%
Sonde Molecular Beacons < 0,01%
Controllo di Amplificazione Interno (IAC) <0,0001%
Il Controllo di Amplificazione Interno è un DNA plasmidico ricombinante
contenente una sequenza non infettiva senza legami con la sequenza
bersaglio (di Pneumocystis).
Tampone Tris-HCl
66 µL
Provetta 3
(Cappuccio
trasparente)
Controllo negativo
Acqua
25 µL
Provetta 4
(Cappuccio nero)
Controllo positivo
DNA di controllo positivo < 0,0001%
La molecola del controllo positivo è un plasmide ricombinante contenente le
sequenze bersaglio di Pneumocystis.
Tampone Tris-HCl
25 µL
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Il kit contiene inoltre:
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 CD-ROM del protocollo Myconostica MycAssay Pneumocystis
 Istruzioni per l'uso
 Certificato di analisi
Conservazione
Il kit deve essere conservato congelato (fra -15 e -25°C) fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta applicata sulla
confezione. Alla scadenza il kit deve essere smaltito in conformità con le normative locali.
Una volta aperta una busta, il relativo contenuto deve essere utilizzato immediatamente. Non ricongelare né riutilizzare.
Materiale occorrente non fornito
 Sistema Real-Time PCR per la serie Stratagene Mx3000 (incluso il manuale d'uso, il computer collegato e il Software
MxPro versione 4.10)
 Provette per PCR in strip di qualità ottica (Agilent Technologies, cat. n°: 401428)
 Cappucci per PCR in strip di qualità ottica (Agilent Technologies, cat. n°: 401425)
 Microcentrifuga con adattatore per provette per PCR da 0,2 mL.
 Agitatore tipo Vortex
 Rack di supporto per provette per PCR
 Micropipette (volumi necessari 7,5 µL - 20 µL)
 Puntali con filtro a bassa ritenzione, sterili
 Guasti monouso, non talcati
 Soluzione decontaminante proprietaria per rimuovere contaminazioni da DNA
 Pennarello indelebile
 Kit di isolamento del DNA (vedere di seguito)
Campioni
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I campioni per il dosaggio MycAssay Pneumocystis sono costituiti dal DNA totale estratto dai campioni clinici di BAL. A
tale scopo si raccomanda l’impiego del kit e dell’apparecchiatura per l’isolamento del DNA forniti da Myconostica Ltd.,
utilizzati anche per la procedura di convalida:
-
®
Kit di estrazione per DNA fungino MycXtra (Art. n°: 080-005 disponibile presso Myconostica)
Agitatore Vortex Genie 2 (Scientific Industries Inc., New York, USA)
Piastra adattatore per agitatore Vortex (Art. n°: 080-015 disponibile presso Myconostica)
Note sulla procedura
 Prima di cominciare, leggere integralmente il protocollo.
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 L’intero processo di analisi con MycAssay Pneumocystis (esclusa l'estrazione del DNA) dura all'incirca 2 ore, a
seconda del numero di campioni testati.
 La preparazione del test deve essere eseguita in una stazione di lavoro PCR o in un’area di laboratorio pre-PCR. Se
6
non è disponibile una stazione di lavoro PCR, il test deve essere preparato in un'area dedicata del laboratorio , da
pulirsi regolarmente con agenti decontaminanti contro il DNA.
 Evitare, tuttavia, di utilizzare agenti decontaminanti contro il DNA quando si prepara il dosaggio Real-Time PCR,
perché possono inibire il dosaggio.
 Utilizzare micropipette per trasferire i fluidi. Utilizzare micropipette dedicate per la preparazione di queste reazioni e
sottoporle a regolare decontaminazione.
 Si raccomanda di utilizzare puntali con filtro a bassa ritenzione per accertarsi che non vada perso DNA durante la
procedura di preparazione.
 Manipolare con cautela la Provetta 4, perchè contiene il DNA stampo e un'eventuale contaminazione potrebbe
portare a risultati di analisi falsamente positivi.
 Indossare sempre guanti protettivi.
 Tutte le provette devono essere chiuse con i rispettivi cappucci dopo l'uso e prima dello smaltimento.
 Annotare esattamente le posizioni dei campioni quando si processano numerosi campioni.
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 Far raffreddare la lampada per almeno 1 ora dopo un’analisi e prima di preparare il MycAssay Pneumocystis per
minimizzare i risultati falsi negativi. Dopo il periodo di raffreddamento la lampada necessita di 20 minuti per riscaldarsi,
come indicato al punto 1.1 seguente.
6
Vedere ad esempio Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. Dieffenbach and Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold
Spring Harbour, NY. USA.
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Procedura per l'uso
1. Preparazione del dosaggio Real-Time PCR
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.10
Per cominciare accendere il sistema Real-Time PCR per la serie Stratagene Mx3000 (strumento e computer
associato) e lanciare il software MxPro 4.10. Inserire i nomi utente e le password necessari. La lampada
necessita di 20 minuti per riscaldarsi. Non avviare l’analisi finché la lampada non è pronta.
Accertarsi che l’area di lavoro sia stata pulita con agenti decontaminanti contro il DNA e che sia perfettamente
asciutta; evitare però di utilizzare questi agenti durante la preparazione del dosaggio, perché un’eccessiva
quantità di soluzione decontaminante può inibire le reazioni PCR.
Una busta contiene rispettivamente una Provetta 1, una Provetta 2, una Provetta 3 e una Provetta 4. I reagenti di
una busta sono sufficienti per eseguire 8 reazioni. Occorre includere almeno un controllo positivo e un controllo
negativo in ogni analisi con i reagenti dello stesso lotto. Una busta consente quindi di analizzare 6 campioni. Per
analizzare più di 6 campioni è possibile utilizzare più buste, a condizione che le buste utilizzate appartengano allo
stesso lotto. Utilizzando le 5 buste di un lotto è possibile analizzare al massimo 38 campioni di pazienti.
Calcolare il numero di reazioni necessarie facendo riferimento alla seguente tabella:
Numero di buste
Numero massimo di campioni
di pazienti
1
6
2
14
3
22
4
30
5
38
Togliere dal congelatore il numero adeguato di buste. Non utilizzare le buste che non sono più sigillate. Se i
campioni dei pazienti sono stati congelati dopo l’estrazione, rimuovere anche questi dal congelatore.
Aprire il numero necessario di buste ed estrarre le provette. Se si utilizzano più buste, ma si include un solo set di
controlli positivi e negativi, è necessario estrarre la Provetta 3 e la Provetta 4 da una sola busta. Manipolare con
cautela la Provetta 4, perchè contiene il DNA di controllo positivo e un'eventuale contaminazione
potrebbe causare risultati di analisi falsamente positivi.
Far scongelare il contenuto delle provette collocandole sul banco di laboratorio per 5-10 minuti, e accertarsi che il
contenuto di ogni provetta sia completamente scongelato prima di procedere. Miscelare nell’agitatore Vortex il
contenuto delle provette e i campioni dei pazienti, quindi centrifugarli brevemente in una microcentrifuga affinché
tutto il contenuto si raccolga sul fondo delle provette prima dell'uso.
Collocare il numero necessario di provette per PCR sul rispettivo rack.
Preparare sempre prima il controllo negativo, seguito dai campioni di analisi. Il controllo positivo deve essere
preparato sempre per ultimo.
I volumi dei reagenti e del DNA sono indicati nella tabella sottostante:
Reazione
Reagente
Controllo negativo
Campione del
paziente
Controllo positivo
Provetta 1 (cappuccio arancione)
7,5 µL
7,5 µL
7,5 µL
Provetta 2 (cappuccio blu)
7,5 µL
7,5 µL
7,5 µL
Provetta 3 (cappuccio trasparente)
10 µL
-
-
Campione del paziente
-
10 µL
-
Provetta 4 (cappuccio nero)
-
-
10 µL
25 µL
25 µL
25 µL
Volume totale
1.11
Aggiungere i reagenti nell’ordine indicato in tabella: Provetta 1, quindi Provetta 2, poi il template (controllo
negativo, campione di analisi o controllo positivo). Prestare attenzione quando si prelevano le aliquote della
Provetta 1; il liquido è leggermente viscoso e può aderire al bordo interno della provetta. Se ciò accade,
centrifugare di nuovo la provetta per raccogliere il restante contenuto sul fondo prima di cercare di rimuovere le
aliquote finali.
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1.12 Utilizzare un nuovo puntale per ogni trasferimento di liquido. Dopo l’uso, chiudere ogni provetta del reagente
utilizzato e gettarla immediatamente con il contenuto eventualmente rimasto in un contenitore per rifiuti clinici
sigillabile. I reagenti non utilizzati non possono essere conservati per usi futuri.
1.13 Osservare estrema cautela durante la dispensazione della Provetta 4 (contenente il DNA di controllo positivo) per
accertarsi che non contamini altre provette di reazione. Chiudendo i cappucci delle altre provette di reazione
prima di aprire la Provetta 4 si può ridurre il rischio di contaminazione crociata.
1.14 Accertarsi che tutte le provette di reazione siano perfettamente sigillate. Annotare la posizione di ogni campione
nella strip di provette. Etichettare la prima provetta di ogni strip, se vengono utilizzate più strip di provette.
Centrifugare le provette di reazione per 10 secondi utilizzando una minicentrifuga con adattatore per provette per
PCR da 0,2 mL. Controllare visivamente che non vi siano bolle d’aria nei miscugli di reazione.
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1.15 Passare immediatamente alla sezione 2. Le reazioni di MycAssay Pneumocystis sono stabili sul banco di
laboratorio per 60 minuti.
1.16 Dopo la preparazione del dosaggio PCR accertarsi che l’area di lavoro venga accuratamente pulita utilizzando
agenti decontaminanti contro il DNA.
2.
Esecuzione dell'analisi
2.1
2.2
2.3
Aprire il software MxPro, versione 4.10.
Inserire il CD-ROM del protocollo MycAssay Pneumocystis Myconostica.
Nel menu New Options selezionare la prima opzione: Real Time: Quantitative PCR (Multiple Standards), e
cliccare su OK, come illustrato in figura:
2.4
Nel tab Plate Setup, cliccare sul pulsante Import a destra. Selezionare il CD-ROM del protocollo MycAssay
PNE Myconostica dal menu a tendina in Look-In: e poi importare il file MycAssay Pneumocystis v3_1.mxp.
Cliccare su Finish. Terminata l’operazione, il Plate Setup dovrebbe apparire come illustrato nel seguente
esempio:
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2.5
Nei pozzetti ancora vuoti si raccomanda di impostare Well Type su <blank> (dal menu a tendina Well Type) in
modo da evitare che la rifrazione della luce proveniente dalla plastica interferisca con i segnali provenienti dai
pozzetti che contengono le reazioni.
2.6
Ripetere il processo di importazione nel tab Thermal Profile Setup per importare il programma PCR per questo
dosaggio; impostare Thermal Profile Design su Custom e poi eseguire la funzione Import dallo stesso file,
come descritto al punto 2.4. Terminata l’operazione, il Thermal Plate Setup dovrebbe apparire come illustrato
nel seguente esempio:
2.7
2.9
Nel tab Plate Setup denominare i pozzetti in modo opportuno; cliccare con il pulsante destro del mouse su un
pozzetto evidenziato (o un gruppo di pozzetti se repliche) e selezionare Well Information dall’elenco delle
opzioni. Nella sezione Name: digitare il nome del campione utilizzato in quel pozzetto.
Dopo avere correttamente denominato tutti i pozzetti, salvare l’analisi attribuendole un nome del file adeguato,
che includa la data e le iniziali dell’operatore, poi avviare l’analisi selezionando il pulsante Run in alto a destra
sullo schermo nel tab Instrument, quindi cliccare sul pulsante Start nell’angolo inferiore destro.
Si rammenta di far raffreddare lo strumento per almeno 1 ora prima di ripartire dalla fase 1.1.
3.
Analisi e interpretazione dei dati
3.1
Al termine dell’analisi, è possibile visualizzare i risultati selezionando il pulsante Analysis in alto a destra sullo
schermo, poi il tab Results.
Dopo avere selezionato Amplification Plots analysis area, impostare i valori soglia di ogni canale nel modo
seguente e bloccarli cliccando sull’icona che raffigura il lucchetto;
PNE = 500
IAC = 100
Dovrebbe essere selezionato anche il pulsante Adaptive Baseline; di solito è l’impostazione di default di questo
software.
Salvare le modifiche. È possibile visualizzare separatamente ogni canale cliccando sulle caselle nella sezione
Assays Shown sullo schermo in basso a sinistra per attivarle o disattivarle.
I dati possono essere esportati in Excel per un’ulteriore manipolazione mediante File>Export Text
Report>Export Text Report to Excel. Poiché è possibile esportare soltanto i pozzetti/fluorocromi evidenziati,
accertarsi di avere selezionato tutti i pozzetti/fluorocromi rilevanti/richiesti.
Aprire il file .csv salvato con Excel o un software spreadsheet similare.
Analizzare ogni campione, partendo dai controlli, come mostra il diagramma di flusso seguente (per i dettagli
consultare anche la tabella riportata dopo il diagramma):
2.8
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
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Verificare il controllo negativo
NO
Il Ct di PNE è 39,0 o è registrato come Nessun Ct?
L’analisi è contaminata
SÌ
Verificare il controllo negativo
NO
AZIONE: ripetere l’analisi
Il valore Ct di IAC è 29,3-33,3?
Errore nell’analisi
Errore nell’analisi
SÌ
Verificare il controllo positivo
NO
Il Ct di PNE è 20,0-25,0?
SÌ
Positivo per il DNA di Pneumocystis
SÌ
Verificare il campione del paziente
Il Ct di PNE è < 39,0?
NO
Negativo per il DNA di Pneumocystis
SÌ
Verificare il campione del paziente
Il Ct di IAC è 29,3-33,3?
NO
Errore IAC
AZIONE: ripetere l’analisi del campione. In caso di
risultato identico, si ipotizza la presenza di un inibitore
nel campione
Campione
Valore Ct di PNE
MycAssay
Valore Ct di IAC
MycAssay
Interpretazione
Ulteriori azioni
Controllo negativo
39,0 o non rilevato
Entro 29,3-33,3
Controllo negativo
accettabile
I risultati del paziente
sono validi.
Controllo negativo
39,0 o non rilevato
<29,3 o >33,3
Errore nel controllo
negativo
Ripetere l’intera
analisi.
Controllo negativo
<39,0
Entro 29,3-33,3
Contaminazione
Ripetere l’intera
analisi.
Controllo positivo
Entro 20,0-25,0
N/A
Controllo positivo
accettabile
I risultati del paziente
sono validi.
Controllo positivo
<20,0 o >25,0
N/A
Errore nel controllo
positivo
Ripetere l’intera
analisi.
Paziente
39,0 o non rilevato
Entro 29,3-33,3
Negativo per il
Pneumocystis
Riportare il risultato:
Esito 1
Paziente
<39,0
N/A
Positivo per il
Pneumocystis
Riportare il risultato:
Esito 2
Paziente
39,0 o non rilevato
<29,3 o >33,3
Errore IAC nel
campione
Ripetere l’analisi del
campione: Esito 3
Consultare la sezione “Report clinico” (Esito 1, 2 o 3).
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4. Guida alla risoluzione dei problemi
4.1 Il controllo negativo ha prodotto un segnale positivo nel canale FAM:

Si è verificata una contaminazione durante la preparazione del dosaggio. I risultati dell’intera analisi non possono
essere ritenuti affidabili.
 Ripetere l’intera analisi, prestando molta attenzione alla fase di aggiunta dei template, soprattutto il controllo
positivo (Provetta 4), per essere certi di escludere una contaminazione crociata.
 Verificare che l’area di lavoro e gli strumenti vengano accuratamente decontaminati prima e dopo l’uso.

Il controllo negativo è stato collocato in modo errato nello strumento.
 Accertarsi che tutte le reazioni vengano correttamente registrate nel software e che le strip di provette vengano
collocate nello strumento nel senso corretto.

Sono state utilizzate provette o piastre non consigliate.
 I valori soglia sono validi solo se si utilizzano le provette e i cappucci per PCR in strip Agilent Technologies
(cat. # 401428 e 401425).
4.2 Il valore Ct IAC del controllo negativo è esterno al range di accettazione:

Il dosaggio PCR è stato inibito.
 Accertarsi che l’area di lavoro e gli strumenti siano perfettamente asciutti dopo averli trattati con gli agenti
decontaminanti prima di preparare il dosaggio PCR.

Le condizioni di conservazione del kit non hanno rispettato le indicazioni riportate nella sezione “Conservazione"
delle presenti istruzioni per l’uso oppure il kit è scaduto.
 Accertarsi che siano state rispettate le condizioni di conservazione corrette del kit. Verificare la data di scadenza
dei reagenti (controllando l’etichetta della confezione / della busta) e ripetere l'analisi con un kit non scaduto, se
necessario.

Il reagente della Provetta 1 o 2 non è stato aggiunto alla reazione PCR oppure è stata aggiunta una quantità
doppia della Provetta 2.
 Ripetere l’analisi prestando attenzione alla fase di preparazione. Sono presenti tali errori se in una provetta di
reazione si osserva un livello superiore o inferiore del liquido rispetto al livello nelle altre.

(cat. # 401428 e 401425).
4.3 Il controllo positivo è negativo/esterno al range:

necessario.

Si è verificato un errore durante la preparazione e il template del controllo positivo (Provetta 4) è stato collocato
nella provetta di reazione sbagliata.
 Ripetere l’analisi prestando molta attenzione alla fase di preparazione. Sono presenti tali errori se in una reazione
si osserva un livello del liquido superiore e in un’altra un livello inferiore rispetto al livello normale.

Il reagente della Provetta 1 o 2 non è stato aggiunto alla reazione.
 Ripetere l’analisi prestando attenzione alla fase di preparazione. Sono presenti tali errori se in questa reazione si
osserva un livello inferiore del liquido rispetto al livello nelle altre.

Il controllo positivo è stato collocato in modo errato nello strumento.
 Accertarsi che tutte le reazioni vengano correttamente registrate nel software e che le strip di provette vengano
collocate nello strumento nel senso corretto.

(cat. # 401428 e 401425).
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4.4 Il/I campione/i dei pazienti produce/ono l’esito “IAC failure” (errore IAC):

È probabile che il/i campione/i estratto/i contenga/ano inibitori della PCR.
 Consigliamo che il DNA venga estratto utilizzando il kit di estrazione per DNA fungino MycXtra™.
4.5 Mancano risultati per uno qualsiasi dei canali con uno qualsiasi dei campioni o dei controlli.

necessario.

L’attrezzatura utilizzata non funziona nel modo ottimale.
 Verificare che lo strumento Real-Time PCR possieda una cronologia di manutenzione aggiornata e sia stato
perfettamente tarato come descritto nella relativa Guida di Installazione e Manutenzione.

È stato utilizzato il file del protocollo errato durante la configurazione del software.
 Consultare la Sezione 2 e selezionare il file del protocollo corretto, come specificato per ogni tipo/versione di
software, dal CD-ROM del protocollo Myconostica. È possibile caricare esclusivamente il file corrispondente al
software. Ripetere l’analisi con il file del protocollo corretto.
Per qualsiasi domanda o problema non esitate a contattare l’Assistenza Tecnica ([email protected]).
Caratteristiche di performance e limiti
Dati di performance analitica della serie Mx3000
®
Il kit è stato convalidato inizialmente con il sistema Cepheid SmartCycler . Alcuni degli assunti riguardanti la performance
®
del kit sono stati riconvalidati sulla piattaforma Mx3005P utilizzando provette e cappucci per PCR di qualità ottica
(Agilent Technologies cat. # 401428 & 401425); i relativi dati sono riportati qui di seguito.
Sensibilità analitica
Utilizzando il protocollo sopra descritto e una molecola di DNA ricombinante di Pneumocystis generata da Myconostica è
stato individuato un limite di rilevamento (LoD) per il Pneumocystis corrispondente a < 50 copie. Questo valore è stato
ottenuto utilizzando un DNA plasmidico ricombinante che contiene la sequenza bersaglio. Dato che la sequenza
bersaglio di Pneumocystis è mitocondriale, esistono numerose copie per cellula, ma non si conosce esattamente quante.
Utilizzando il sistema Cepheid SmartCycler® sono stati definiti gli assunti di seguito indicati
per quanto concerne la performance.
Selettività analitica
La selettività analitica è stata testata con il DNA estratto da un’ampia gamma di specie fungine e non fungine. Le seguenti
specie non hanno prodotto un risultato positivo:
Alternaria alternata, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus, Blastomyces capitatus, Candida albicans, C.
glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus,
Fusarium solani, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospermum, S.
prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatum. Le seguenti specie batteriche non hanno prodotto un risultato
positivo: Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lactobacillus
plantarum, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius.
Il DNA genomico umano non produce un risultato positivo con questo test.
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Sostanze interferenti (controindicazioni per l'uso)
I seguenti composti sono stati testati in concentrazioni clinicamente rilevanti e hanno dimostrato di non inibire il dosaggio:
acetilcisteina, amfotericina, beclometasone dipropionato, budesonide, colistimetato sodio, fluticasone propionato,
formoterolo fumarato diidrato, ipratropio bromuro, lidocaina, mannitolo, salbutamolo solfato, salmeterolo, Septrin
(trimetoprim-sulfametoxazolo), sodio cloruro, sodio cromoglicato, terbutalina e tobramicina.
Valutazione della performance
In seguito ad analisi di un set di campioni clinici raccolti da diverse popolazioni di pazienti è stato stabilito il cut-off clinico
ad un valore Ct pari a 39,0.
I campioni clinici ottenuti mediante lavaggio broncoalveolare (BAL), che sono stati raccolti presso 2 ospedali, sottoposti
®
TM
ad estrazione con il kit MycXtra e conservati, sono stati utilizzati per valutare la performance del kit MycAssay
Pneumocystis. I risultati PCR sono stati confrontati con la microscopia a immunofluorescenza.
PCR vs. diagnosi microscopica
Microscopia positiva
Microscopia negativa
PCR positiva
45
8
0,85
PPV
PCR negativa
2
33
0,94
NPV
0,96
Sensibilità
0,80
Specificità
Tabella 1: Specificità e sensibilità diagnostica del kit MycAssay
immunofluorescenza.
TM
Pneumocystis rispetto alla microscopia a
La tabella 1 rappresenta i dati ottenuti da pazienti con diagnosi di HIV, pazienti senza infezione da HIV e pazienti con
stato HIV sconosciuto. I pazienti con polmonite da Pneumocystis presentano una carica fungina rilevabile molto variabile;
minore è il valore Ct, maggiore è la probabilità della malattia. I pazienti affetti da HIV e polmonite da Pneumocystis
tendono a presentare una maggiore carica fungina rilevabile rispetto ai pazienti senza infezione dal virus HIV, ma esiste
una considerevole sovrapposizione. Il diagramma di dispersione nella figura 1 evidenzia questa sovrapposizione. A scopo
di completezza, dato che il set di dati nella tabella 1 include pazienti il cui stato HVI è sconosciuto, il diagramma di
dispersione nella figura 1 comprende anche questo gruppo di pazienti (colonna 3):
Categoria
1 = HIV+ / microscopia+ ; 2 = HIV- / microscopia+ ;
3 = HIV sconosciuto / microscopia+ ; 4 = tutta microscopia-
Figura 1: Diagramma di dispersione dei valori Ct ottenuti da DNA estratto dai campioni respiratori di pazienti. Sono
rappresentati quattro gruppi.
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Report clinico
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Il kit MycAssay Pneumocystis è concepito come un ausilio per la diagnosi della polmonite da Pneumocystis. I risultati
devono essere considerati in relazione allo stato clinico del paziente e ai risultati di altri test diagnostici.
I report di seguito consigliati hanno carattere indicativo; ciascuno dipende dall'interpretazione dei risultati del dosaggio.
Esito n° 1
“Pneumocystis jirovecii non rilevato.”
Esito n° 2
“Pneumocystis jirovecii rilevato. Risultato positivo. Indicare il valore Ct.”
Esito n° 3
“Test non riuscito; sono presenti inibitori o altre sostanze sconosciute.”
Minore è il valore Ct, maggiore è la probabilità della malattia. Valori Ct prossimi al cut-off di 39,0 indicano con maggiore
probabilità una colonizzazione piuttosto che un’infezione, ma alcuni pazienti possono manifestare la malattia con una
carica molto bassa di P. jirovecii, il che sta a dimostrare la scarsa qualità del campione, un precedente trattamento o la
natura della carica fungina in quel dato paziente.
Limiti della procedura
 Il limite principale di questa procedura riguarda la qualità del campione primario:
- Se il campione è molto piccolo oppure non raccolto dalla zona del polmone interessata, il test è meno sensibile e
può risultare falsamente negativo.
- I campioni di BAL devono essere centrifugati prima dell'estrazione del DNA dal pellet.
- I dati hanno inoltre dimostrato che una riduzione del volume del supernatante utilizzato nel processo di estrazione,
ottenuto mediante la fase di centrifugazione, abbassa la percentuale di inibitori che entrano nel sistema.
®
 La valutazione della performance clinica non è stata confermata con lo strumento MX3005P .
 Sebbene la procedura di estrazione del DNA fungino MycXtra™ sia studiata per eliminare gli inibitori della PCR, non
sono stati presi in considerazione tutti i farmaci o tutte le popolazioni di pazienti.
 La procedura non è stata valutata completamente su espettorato, tanto meno su campioni salini indotti o su campioni
pediatrici.
 Risultati falsamente positivi possono derivare dalla contaminazione esterna del campione originale o del test. Tale
contaminazione potrebbe essere riconducibile ad aria contaminata da P. jirovecii, tecnica sperimentale di scarsa
qualità in relazione al controllo positivo oppure a materiale esterno (in particolare la pipetta) contaminato da DNA di P.
jirovecii.
 Data la possibilità di ottenere un risultato effettivamente positivo per pazienti colonizzati in modo temporaneo o
persistente da P. jirovecii, è necessaria una valutazione clinica nell'interpretazione del risultato del test.
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LICENZA
TopTaq
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®
Hot Start è fornito da QIAGEN. QIAGEN è un marchio registrato di Qiagen GmbH, Hilden, Germania.
®
SmartCycler è un marchio registrato di Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA.
Questo prodotto è venduto con licenza dell'Istituto di Ricerca per la Salute Pubblica di Newark nel New Jersey (USA) e
può essere utilizzato nel rispetto dei diritti brevettuali del PHRI esclusivamente per la diagnostica umana in vitro.
®
®
Mx3000P e Mx3005P sono marchi registrati di Stratagene. MxPro
TM
è un marchio di Stratagene.
Lab21,184 Cambridge Science Park,
Cambridge CB4 0GA , United Kingdom.
Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375
Email: [email protected]
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Campioni Respiratori

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