Draft protocol for fungal DNA extraction from sputum or BAL fluid

Transcript

Per uso diagnostico in vitro: MycXtra
®
MycXtra®
Kit di estrazione per DNA fungino
REF 080-005
Uso previsto
Il kit di estrazione per DNA fungino MycXtra® è studiato per isolare e purificare il DNA fungino presente in campioni di
liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), espettorato e altri campioni ottenuti dalle basse vie respiratorie.
Introduzione e spiegazione
Questo kit è studiato per isolare il DNA di origine fungina in campioni umani ottenuti dalle basse vie respiratorie in
pazienti con presunta infezione fungina. L'estrazione del DNA fungino è la prima fase d'importanza cruciale per l'analisi di
un campione per uno specifico DNA fungino. Data la complessa procedura di rottura delle pareti di cellule fungine, è
necessaria una combinazione di processi per ottimizzare la performance: forze meccaniche dirette nel tampone, seguite
da diverse fasi di purificazione per eliminare le sostanze inibitorie della PCR, le componenti delle pareti cellulari e della
matrice umana e, infine, l'eluizione nel tampone. La qualità del DNA purificato è idonea per l'analisi in Real-Time PCR.
Principi della procedura
Le spore e le ife fungine presenti nel campione vengono concentrate mediante centrifugazione e risospese in un piccolo
volume. Il campione viene poi aggiunto ad una provetta per l'estrazione mediante "bead beating" contenente beads,
soluzione lisante, soluzione di beads e soluzione per l'eliminazione degli inibitori. L'obiettivo di questa procedura è lisare i
microrganismi nel campione mediante una combinazione di detergente e forza meccanica contro beads specializzate. Le
componenti cellulari vengono lisate per azione meccanica su un agitatore Vortex. Dalle cellule lisate il DNA liberato si
lega ad un filtro rotativo a base di silice. Il filtro viene poi lavato, quindi il DNA recuperato in una soluzione tamponata è
disponibile per la successiva analisi della PCR.
Contenuto del kit
Sufficiente per 10 campioni di pazienti
Descrizione
10 provette con Soluzione di
Beads da 2 mL
Soluzione S1
Soluzione IRS
Soluzione S2
Soluzione S3
Soluzione S4
Soluzione S5
Volume (mL)
0,55
0,65
2,2
2,75
14,5
3,3
1,1
10 filtri rotativi in provette da 2 mL
40 provette per microcentrifuga (2 mL)
Istruzioni per l'uso
Conservazione
Il kit deve essere conservato a temperatura ambiente (15-30°C) fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta applicata
sulla confezione. Alla scadenza il kit deve essere smaltito in conformità con le normative locali.
Avvertenze e precauzioni
Il kit è studiato per l'uso esclusivamente presso laboratori professionali. Per una manipolazione dei campioni clinici che
prevenga la formazione di aerosol occorre avvalersi di procedure e pratiche, contenitori e dispositivi del livello di
biosicurezza 2. Tutte le attività che producono aerosol devono essere condotte in una cabina di sicurezza biologica di
classe II o III. Nei campioni clinici possono essere presenti microrganismi patogeni, fra cui, ma senza limitazioni, virus
dell'epatite e virus dell'immunodeficienza umana. Nella manipolazione di tutte le sostanze contaminate da sangue o altri
fluidi organici, vanno rispettate precauzioni standard e norme istituzionali. Il kit contiene piccole quantità di etanolo, sodio
dodecil solfato, guanidina idrocloruro e guanidina isotiocianato. Su richiesta, Myconostica Ltd. mette a disposizione la
scheda di sicurezza del prodotto (MSDS).
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Per uso diagnostico in vitro
®
MycXtra
Materiale occorrente

Microcentrifuga (10.000 x g)
Centrifuga multiuso
Micropipette provviste di puntali con filtro sterili (volumi necessari 40 μL–1000 μL),
Agitatore Vortex Genie 2 (di Scientific Industries, ma disponibile presso fornitori locali)
Piastra adattatore per agitatore Vortex (disponibile presso Myconostica, REF 080-015) per collegare le provette
all'agitatore.
Note sulla procedura
Il processo richiede circa 1,5 ore. Se il campione è stato ottenuto da espettorato o liquido di lavaggio broncoalveolare
(BAL), appare viscoso, quindi è necessario un ulteriore trattamento preliminare, come descritto nella sezione “Procedura
per campioni di espettorato o altri campioni respiratori viscosi”.
Prima di cominciare leggere integralmente il protocollo. Indossare sempre guanti protettivi. Tutte le provette
devono essere chiuse con i rispettivi cappucci durante le fasi di miscelazione nell'agitatore Vortex. Utilizzare
micropipette per trasferire i fluidi. Accertarsi di identificare correttamente le provette quando si analizzano più
campioni di pazienti.
Procedura per campioni di BAL trasparenti e fluidi
Nota: Se il DNA estratto deve essere utilizzato con un prodotto Myconostica MycAssayTM, si consiglia di iniziare con
≥ 2 mL di BAL.
1. Centrifugare il campione di BAL per 20 minuti a 3000 x g. Decantare il supernatante e tenerlo da parte.
2. Aggiungere 800 µL del supernatante trattenuto al pellet, risospendere e trasferire nella provetta per microcentrifuga
(in dotazione).
3. Centrifugare per 2 minuti a 10.000 x g, quindi eliminare l’eventuale supernatante. Risospendere il pellet della
soluzione rimanente nella provetta e trasferire l’intera quantità in una provetta con Soluzione di Beads da 2 mL.
4. Miscelare delicatamente nell'agitatore Vortex.
5. Controllare la Soluzione S1. Se la Soluzione S1 è precipitata, riscaldare la provetta con le mani e miscelare
nell’agitatore Vortex per sciogliere il contenuto.
6. Aggiungere 60 µL di Soluzione S1 alla provetta con Soluzione di Beads e capovolgere varie volte oppure miscelare
brevemente nell'agitatore Vortex.
7. Aggiungere 200 µL di Soluzione IRS (soluzione per l'eliminazione degli inibitori) alla provetta con Soluzione di Beads.
8. Fissare orizzontalmente la/e provetta/e con Soluzione di Beads su un'adeguata piastra adattatore per agitatore
Vortex (disponibile presso Myconostica, REF 080-015). Miscelare nell'agitatore Vortex a velocità massima per 10
minuti.
9. Centrifugare la/e provetta/e con Soluzione di Beads a 10.000 x g per 30 s. ATTENZIONE: verificare di non superare i
10.000 x g, altrimenti le provette possono rompersi. Verificare che le provette da 2 mL ruotino liberamente nella
centrifuga senza sfregare.
10. Trasferire 450 µL di supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita (in dotazione), facendo attenzione a non
disturbare le beads. Smaltire la provetta con Soluzione di Beads.
11. Aggiungere 250 µL di Soluzione S2 al supernatante e miscelare nell'agitatore Vortex per 5 s. Incubare a 4–8°C per
5 minuti.
12. Centrifugare le provette per 1 minuto a 10.000 x g.
13. Trasferire l'intero volume del supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita (in dotazione), facendo
attenzione a tralasciare il pellet.
14. Aggiungere 1,1 mL (2 x 550 µL) di Soluzione S3 al supernatante (prestando attenzione perché la provetta è quasi
piena). Miscelare capovolgendo la provetta.
15. Caricare all'incirca 650 μL su un filtro rotativo e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Gettare il liquido filtrato,
aggiungere altri 650 μL di supernatante al filtro rotativo e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Ripetere la procedura
finché tutto il supernatante non è passato attraverso il filtro rotativo. Nota: sono necessari complessivamente tre
caricamenti per ogni campione. Nella fase finale centrifugare per 1 minuto a 10.000 x g. Gettare il liquido filtrato.
16. Aggiungere 300 µL di Soluzione S4 al filtro rotativo e centrifugare per 30 s a 10.000 x g.
17. Gettare il liquido filtrato.
18. Centrifugare di nuovo per 1 minuto per eliminare le ultime tracce di Soluzione S4, poiché questa inibirebbe la
reazione PCR.
19. Posizionare con cautela il filtro rotativo su una nuova provetta per microcentrifuga pulita (in dotazione). Evitare di
trascinare la Soluzione S4 sul filtro rotativo.
20. Aggiungere 40 μL di Soluzione S5 al centro della membrana del filtro rotativo. Lasciare a temperatura ambiente per 2
minuti.
21. Centrifugare per 30 s a 10.000 x g.
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MycXtra
22. Gettare il filtro rotativo. Il DNA nella provetta è ora pronto per essere utilizzato in un'applicazione PCR. Conservare a
2–8°C al massimo per 5 giorni, altrimenti riporre il DNA in congelatore a -20°C.
23. Possono essere processati fino a 10 campioni di BAL. Se per una data analisi non vengono utilizzate tutte le
componenti, riposizionare le componenti del kit nella confezione originale. Non miscelare le componenti di diversi lotti.
24. Terminata la processazione, smaltire le componenti usate del kit in conformità con le normative locali in materia di
salute, sicurezza e ambiente.
Procedura per campioni di espettorato o altri campioni respiratori viscosi
Si consiglia di utilizzare il kit di digestione/decontaminazione per la processazione di campioni micobatterici BD BBL™
MycoPrep™ (cat. n° 240862) con il protocollo MycXtra® per la preparazione dei campioni di espettorato. La procedura di
seguito descritta è stata modificata in modo da adattarla ai requisiti di caricamento dei campioni del kit MycXtra®.
Precauzioni
Il reagente NALC-NaOH nel kit di digestione/decontaminazione per la processazione di campioni micobatterici BD BBL™
MycoPrep™ contiene forti alcali e può provocare gravi ustioni. Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati.
Occorre indossare guanti protettivi e una mascherina per gli occhi/il viso. L'NaOH è irritante per gli occhi e la pelle. In
caso di contatto con gli occhi o la pelle, sciacquare immediatamente con un prodotto di lavaggio oculare o con acqua
corrente per almeno 15 minuti e consultare un medico. In caso di ingestione, somministrare latte, albume d'uovo o grandi
quantità d'acqua e consultare un medico.
Attenzione: rompere la fiala nel centro una sola volta. Non manipolare ulteriormente la fiala, perché il flacone in plastica
potrebbe perforarsi e causare lesioni.
Istruzioni per la conservazione: al ricevimento conservare a 15–30°C. Non congelare. Aprire soltanto al momento
dell'utilizzo.
Deterioramento del prodotto: Non utilizzare i reagenti se le fiale sono danneggiate oppure se presentano segni
evidenti di deterioramento. Non utilizzare il tampone fosfato se le confezioni sono lacerate o aperte.
Procedura
1. Preparare la soluzione di tampone fosfato BBL™ MycoPrep™. Versare il contenuto di una busta di tampone fosfato
in un contenitore in vetro con tappo a vite, quindi riempire fino alla tacca di 500 mL con acqua per biologia molecolare.
Sterilizzare, con tappo allentato, in autoclave a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente e avvitare il
tappo.
2. Svitare con cautela il tappo a vite del flacone del reagente BBL™ MycoPrep™. Collocare la fiala nel flacone, far
uscire l'aria in eccesso dal flacone e avvitare il tappo. Tenendo il flacone in posizione verticale, comprimerlo fino a
rompere la fiala. Agitare delicatamente per disciogliere il NALC, evitando un'eccessiva agitazione. UNA VOLTA CHE
LA FIALA SI È ROTTA, UTILIZZARE IL REAGENTE ENTRO 24 ORE.
3. In una cabina di sicurezza biologica (almeno di classe 2) aggiungere in una provetta per centrifuga graduata da
50 mL con tappo a vite il campione e il doppio della quantità di soluzione di NALC-NaOH attivata in base al volume
dell'espettorato. Ad esempio, aggiungere 4 mL di soluzione di NALC-NaOH attivata a circa 2 mL di campione.
4. Chiudere con il tappo la provetta per centrifuga e miscelare su un agitatore Vortex finché il campione non si è sciolto.
Se il campione è particolarmente viscoso, aggiungere altra soluzione di NALC-NaOH e ripetere la miscelazione.
5. Far riposare il miscuglio a temperatura ambiente per 15 minuti agitando delicatamente di tanto in tanto.
6. Aggiungere il tampone fosfato preparato nella provetta per centrifuga fino alla tacca di 35 mL e miscelare.
Centrifugare per 20 minuti a 3000 x g.
7. Decantare con cautela tutto il supernatante liquido. Con una micropipetta rimuovere delicatamente il supernatante
rimasto che non è stato decantato.
8. Aggiungere 800 µL di tampone fosfato preparato e risospendere il sedimento. Trasferire l'intera quantità in una
provetta per microcentrifuga.
9. Seguire la procedura per il BAL a partire dalla fase 3.
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MycXtra
Caratteristiche di performance e limiti
Selettività analitica
Utilizzando un kit MycXtra® è stato estratto DNA da BAL clinico, da espettorato e da altri campioni respiratori in cui,
mediante coltura o microscopia, erano stati identificati i seguenti organismi: Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus,
Aspergillus flavus, Penicillium spp. e Pneumocystis jirovecii. Il DNA è stato rilevato utilizzando il kit Myconostica FXGTM :
RESP (Asp +) per la determinazione rapida in Real-Time PCR del DNA di Aspergillus e Pneumocystis in campioni
respiratori clinici.
Eliminazione di sostanze interferenti
I comuni farmaci utilizzati nel trattamento delle malattie respiratorie, quali tobramicina, colistina solfato, dornasi (DNAsi),
salmeterolo e altre sostanze, ad es. soluzione fisiologica normale (0,9%), eparina e acido tannico, possono inibire i
dosaggi in Real-Time PCR. Tali sostanze vengono completamente eliminate con il processo di estrazione MycXtra®.
Prove di valutazione della performance con campioni clinici hanno permesso di indicare che nei campioni respiratori
esistono alcuni inibitori della PCR di natura oscura, che non vengono eliminati durante il processo di estrazione.
Limite di rilevamento e ripetitibilità
Tutti i dati: concentrazione di spore vs valore Ct
45.00
40.00
35.00
Valore Ct
30.00
25.00
20.00
15.00
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
Numero di spore nell’estrazione
DNA estratto con il kit MycXtra®
da campioni contenenti 10
spore. Le estrazioni delle spore
di Aspergillus fumigatus in
soluzione fisiologica sono state
eseguite da 2 operatori nel
corso di 5 giorni. Il DNA è stato
rilevato con il kit Myconostica
FXGTM : RESP (Asp +), che
presenta un limite di rilevamento
di circa 1 genoma di A.
fumigatus. I risultati sono
illustrati nella Figura 1. Il
coefficiente di variazione totale
è stato calcolato intorno al 2,4%.
L’efficienza di estrazione media
si è attestata all’8%.
Figura 1. Concentrazione di spore di Aspergillus fumigatus versus il valore Ct in Real-Time PCR
Riproducibilità
Between batch extraction comparison
28.00
27.00
26.00
Ct
25.00
Batch 1
24.00
Batch 2
Batch 3
23.00
22.00
Sono state eseguite ventiquattro estrazioni
separate utilizzando ciascuno dei tre lotti dei
kit MycXtra® con una sospensione standard di
spore di Aspergillus fumigatus. Con il kit
Myconostica FXGTM : RESP (Asp +) è stata poi
eseguita la Real-Time PCR per stabilire la
variabilità interlotto e intralotto per l'estrazione
del DNA di Aspergillus fumigatus. I risultati
sono illustrati nella Figura 2.
21.00
20.00
1
2
3
4
5
6
7
8
Extractions
Figura 2. Variabilità di estrazione interlotto e intralotto
Valutazione della performance
Determinazione della specie Aspergillus
I campioni respiratori (BAL) raccolti da 2 ospedali, estratti con il kit MycXtra® e conservati, sono stati utilizzati per valutare
la performance del kit MycAssayTM Aspergillus con campioni clinici. Sono stati operati dei confronti con la diagnosi clinica.
È stato stabilito il valore cut-off di un Ct pari a 36,0 dopo aver esaminato una serie di dati di campioni raccolti da diversi
siti e diverse popolazioni di pazienti. Sono stati valutati diversi cut-off per la probabilità di differenziare lo stato patologico
dallo stato non patologico.
PCR versus diagnosi clinica
Diagnosi clinica positiva
PCR positiva
31
PCR negativa
2
0,94
Sensibilità
Diagnosi clinica negativa
1
10
0,91
Specificità
0,97
0,83
PPV
NPV
Lo 0,8% dei campioni testati conteneva inibitori della PCR, come riportato dall’IAC, in seguito ad estrazione con il kit
MycXtra®.
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MycXtra
Determinazione di Pneumocystis jirovecii
I campioni clinici ottenuti mediante lavaggio broncoalveolare (BAL), che sono stati raccolti presso 2 ospedali, sottoposti
ad estrazione con il kit MycXtra® e conservati, sono stati utilizzati per valutare la performance del kit MycAssayTM
Pneumocystis. I risultati PCR sono stati confrontati con la microscopia a immunofluorescenza.
PCR vs. diagnosi microscopica
Microscopia positiva
PCR positiva
45
PCR negativa
2
0,96
Sensibilità
Microscopia negativa
8
33
0,80
Specificità
0,85
0,94
PPV
NPV
La tabella rappresenta i dati ottenuti da pazienti con diagnosi di HIV, pazienti senza infezione da HIV e pazienti con stato
HIV sconosciuto. I pazienti con polmonite da Pneumocystis presentano una carica fungina rilevabile molto variabile;
minore è il valore Ct, maggiore è la probabilità della malattia. I pazienti affetti da HIV e polmonite da Pneumocystis
tendono a presentare una maggiore carica fungina rilevabile rispetto ai pazienti senza infezione dal virus HIV, ma esiste
una considerevole sovrapposizione. Il diagramma di dispersione nella figura 3 evidenzia questa sovrapposizione. A
scopo di completezza, dato che il set di dati nella tabella include pazienti il cui stato HVI è sconosciuto, il diagramma di
dispersione nella figura 3 (colonna 3) comprende anche questo gruppo di pazienti:
Category
1 = HIV+ / Microscopy+ ; 2 = HIV- / Microscopy+ ;
3 = HIV Unknown / Microscopy+ ; 4 = All Microscopy-
Figura 3: Diagramma di dispersione dei valori Ct ottenuti da DNA estratto da campioni respiratori di pazienti. Sono
rappresentati quattro gruppi.
Myconostica Limited, South Court, Sharston Road, Sharston, Manchester,
M22 4SN, United Kingdom.
Telefono: +44 (0) 161 998 7239 Fax: +44 (0) 161 902 2496
E-mail: [email protected]
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