4 Descriptif de I`appareil

Transcript

Multiporator®
Bedienungsanleitung
Operating Manual
Mode d'emploi
Istruzioni d'impiego
Manual de Instrucciones
eppenclorf
Bedienungsanleitung
4
Operating Manual
43
Mode d'emploi
82
:
121
160
EG-Konformitatserklarung
EC Conformity Declaration
Declaration de conformite
Dichiarazione di conformita CE
Declaracion de conformidad CEE
199
Nachdruck und Vervielfaltigung - auch auszugsweise - nur mit Genehmigung.
No part of this publication may be reproduced without the prior permission of
the copyright owner.
Toute reproduction, complete ou partielle et quel que soit le proede est
interdiete, sauf autorisation expresse de notre part.
Ristampa e riproduzione - anche di estratti - solo con autorizzazione.
Reimpresion y copia - incluso parciales - solo con autorizacion.
Copyright® 2000 by Eppendorf AG, Hamburg
B 4308 900.016-03/0800
Inhaltsverzeichnis
1
Allgemeines
5
2
Verwendungszweck
6
3
Sicherheitshinweise
7
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.7.1
4.8.5
4.8.6
4.9
Geratebeschreibung
Lieferumfang
Inbetriebnahme
Kuvetteneinschub
Tastatur
Tasten und Tastenkombinationen
Display
Elektroporation eukaryotischer Zellen und Bakterien / Hefen
Einschub (Elektroporation)
zum Anschluss von externen Elektroden (Option)
Zellfusion (Option)
Optimierung der Zellfusion (Kontrolle unter dem Mikroskop)
Reinigung der Mikro-Fusionskammer
Helix-Fusionskammer
BefCillen der Helix-Fusionskammer
und Einsetzen in den Fusionseinschub
Durchfiihren der Fusion und Entnahme der Zellsuspension.
Reinigung und Desinfektion der Helix-Fusionskammer
Druckeranschluss / Drucker (Option)
21
22
23
23
5
5.1
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
Arbeitstechniken
Modus eukaryotische Zellen
Modus Bakterien und Hefen (Option)
Modus Zellfusion (Option)
Funktion: Alignment (Zellausrichtung)
Durchfuhrung der Zellfusion
27
27
29
31
31
33
6
Fehlermeldungen
36
7
7.1
7.2
Wartung, Service und Pflege
Desinfektion
Reinigung
38
38
38
8
Technische Daten
39
9
Bestellinformationen
41
4.8
4.8.1
4.8.2
4.8.3
4.8.4
9
10
11
11
12
12
15
16
17
18
18
19
20
1 Allgemeines
Der Multiporator® ist fur die Elektroporation von eukaryotischen Zellen
ausgelegt. Als Optionen besteht die Moglichkeit, mit weiteren Modulen
die Elektroporation an Bakterien und Hefen sowie Zellfusion durchzufuhren. In dieser Anleitung wird auf alle Varianten der Bedienung des Multiporators eingegangen.
Der Multiporator® zeichnet sich dadurch aus, dass bei der Elektroporation
eukaryotischerZellen und bei derZellfusion die eingegebenen Parameter
durch interne Berechnung der Entladungskurve exakt eingehalten werden.
2 Verwendungszweck
Das Geratesicherheitsgesetz und die Industrienormen schreiben vor:
-
Gerat nur fur zelltechnologische Experimente verwenden
Das Einsatzspektrum umfasst die Elektroporation von Hefen und
Bakterien und eukaryotischen Zellen sowie die Zellfusion.
-
Nur original Eppendorf Zubehor verwenden
Es durfen nur original Zubehorteile verwendet werden. Sie sind auf
die optimale Funktion des Multiporators abgestimmt. Ausgenommen
sind nur vom Hersteller empfohlene Zusatzgerate. Anderenfalls erloschen sofort samtliche Gewahrleistungs- und Haftungsanspriiche.
3 Sicherheitshinweise
Die folgenden Bestimmungen sollten zur personlichen Sicherheit unbedingt beachtet werden!
•
Bedienungsanleitung beachten
Nur nach der Bedienungsanleitung vorgehen!
Das Gerat darf nur an Stromversorgungsnetzen mit Schutzleiter
betrieben werden.
Vor Inbetriebnahme mussen die Spannungsangaben auf dem Typenschild mit den Netzbedingungen verglichen werden!
Vor dem Offnen des Gehauses den Netzstecker ziehen!
Das Gerat darf nicht in explosionsgefahrdeten Raumen betrieben werden!
•
Es ist sicherzustellen, dass keine Flussigkeiten in das Gerat oder die
Einschube gelangen!
•
Das Gerat ist nur fur in-vitro-Anwendungen vorgesehen!
•
Gerat nur fur die beschriebene Verwendung benutzen.
Keine anderen Teile, Gerate, Werkzeuge etc. als von Eppendorf AG
beschrieben in den Kuvetteneinschub bringen!
Hochspannung!
•
Nur das aufgefuhrte Zubehor verwenden.
Anderes Zubehor nur verwenden, wenn eine Bescheinigung zur
sicherheitstechnisch unbedenklichen Verwendungsfahigkeit von der
Eppendorf AG vorliegt!
•
Elektrische Kopplungen mit Geraten, die in dieser Bedienungsanleitung nicht erwahnt sind, sind nur nach RiJcksprache und Zustimmung
des Herstellers erlaubt!
3 Sicherheitshinweise
•
Helix-Fusionskammer vorsichtig behandeln!
Bei abgelosten oder beschadigten Elektroden ist ein gesicherter Vorgang nicht mehr gewahrleistet! In diesem Fall die Helix-Fusionskammer nicht mehr verwenden!
Helix-Fusionskammer nicht wahrend der Fusion offnen, sondern das
Ende der Fusion abwarten!
•
Mikro-Fusionskammer vorsichtig behandeln!
Zellsuspension vorsichtig einfullen! Die Elektroden sollten nach Moglichkeit nicht mit der Pipettenspitze beruhrt Oder verschoben werden!
Beschadigungsgefahr!
Wahrend der Zellausrichtung/Fusion direkten Kontakt mit den Elektroden vermeiden!
•
Die Zellausrichtung/Fusion darf nur bei angeschlossener MikroFusionskammer erfolgen!
Das Kabel ist nur zum Anschluss an die Mikro-Fusionskammer
gedacht! Andere Anschliisse sind nicht zulassig! Den Stecker nicht in
Flussigkeiten halten!
•
Die Haftung fur die Funktion des Gerats geht in jedem Fall auf den
Eigentiimer oder Betreiber uber, soweit das Gerat von Personen,
die nicht dem Eppendorf-Service angehoren, gewartet oder instandgesetzt wird und wenn eine Handhabung erfolgt, die nicht der bestimmungsgemaBen Verwendung entspricht. Fur Schaden, die durch
Nichtbeachten der Hinweise eintreten, haftet die Eppendorf AG
nicht. Gewahrleistungs- und Haftungsbestimmungen derVerkaufsund Lieferbedingungen der Eppendorf AG werden durch vorstehende
Hinweise nicht erweitert.
•
Der Nachdruck der Bedienungsanleitung oderTeile daraus ist nur mit
schriftlicher Genehmigung der Eppendorf AG erlaubt!
•
Die Eppendorf AG behalt sich das Recht vor, technische Anderungen
an diesem Produkt vorzunehmen!
4 Geratebeschreibung
Das Gerat wird in vier Ausbaustufen angeboten. Als Grundgerat zur
Elektroporation von eukaryotischen Zellen, als Ausbaustufe mit der zusatzlichen Moglichkeit, Bakterien und Hefen zu elektroporieren. Als weitere Ausbaustufe steht ein integriertes Modul zurZeilfusion zurVerfugung. Diese beiden Ausbaustufen sind auch beide zusammen als vierte
Variante erhaltlich.
Der Multiporator® wird uber eine leicht verstandliche Tastatur mit Display
bedient. Neben dem Tastaturblock befindet sich der Einschub fur die Elektroporationskuvette.
fa
P
Abb. 1: Multiporator®, Vorderansicht
4.1 Lieferumfang
Grundgerat:
Multiporator® zur Elektroporation von eukaryotischen Zellen mit Netzkabel
Einschub fur Elektroporationskuvetten
Elektroporationskuvetten
(2 mm, 4 mm Elektrodenabstand)
Puffer Hypo- und Isoosmolar fur Elektroporation
Bedienungsanleitung
und Basis Applikations-Manual
Option Bakterienmodul:
Grundgerat inkl. Zubehor
mit integriertem Bakterienmodul
zusatzlich Elektroporationskuvetten
(1 mm Elektrodenabstand)
Option Zellfusionsmodul:
Grundgerat inkl. Zubehor
mit integriertem Zellfusionsmodul
Helix-Fusionskammer
(0,2 mm Elektrodenabstand))
Einschub fur Helix-Fusionskammer
Mikro-Fusionskammer (0,2 mm Elektrodenabstand)
mit speziellem Einschub
Puffer Hypo- und Isoosmolar fur Zellfusion
Option Fusions- und Bakterienmodul:
Grundgerat inkl. entsprechendem Zubehor
mit integriertem Fusions- und Bakterienmodul
10
4.2 Inbetriebnahme
Auf der Ruckseite des Multiporators befindet sich die Netzeingangsbuchse mit Sicherung und Netzschalter. Zur Inbetriebnahme das Netzkabel in die Netzeingangsbuchse stecken und anschlieRend mit dem Netz
verbinden. Das Gerat mit dem Netzschalter einschalten.
Abb. 2: Multiporator®, Ruckseite
linke Seite
Netzanschluss
rechte Seite Druckeranschluss
4.3 Kiivetteneinschub
Der Einschub fur die Elektroporationskiivetten befindet sich vorn am
Gerat neben dem Tastaturblock. Zum Entnehmen der Kuvette den Einschub herausziehen. Eine neue Kuvette wird so eingesetzt, dass die
Nase der Kuvette in den hinteren Schiitz passt. Den Kuvetteneinschub mit
der Kuvette ganz in das Gerat hineinschieben. Im Gerat befindet sich ein
Sensor, der feststellt, ob sich eine Kuvette im Kuvetteneinschub befindet.
Anmerkung: Soil das Gerat transportiert werden, sollte der Einschub mit
einer leeren Kuvette bestuckt sein oder separat transportiert werden.
Fur die Ausbaustufen Zellfusion werden andere Einschube verwendet.
11
4.4 Tastatur
Uber die Tastatur werden Parameter eingegeben und die gewunschten
Elektroporationsmodi angewahit sowie die Elektroporation gestartet. Je
nach Ausbaustufe konnen 1 bis 4 Modi angewahit werden. UberTastenkombinationen konnen weiterhin das Datum und die Uhrzeit sowie die
Lautstarke des akustischen Signales eingestellt werden.
Multiporator
eppendorf
U 500V t 220 |
n
1
UME
100%
Abb. 3: Bedienoberflache mit Tasten und Display
4.5 Tasten und Tastenkombinationen
SET
Mit der Taste SET wird der gewunschte Parameter angewahit. Dargestellt wird dieser durch einen Unterstrich im
Display. Urn einen weiteren Parameter anzuwahlen, wird
entsprechend oft die SET-Taste betatigt. Urn eine SETSequenz zu beenden, kann entweder die SET-Taste so oft
gedruckt werden bis der Unterstrich im Display nicht mehr
vorhanden ist oder durch Drucken der Taste MODE oder
START (Anmerkung: Taste MODE schaltet auf anderen
Modus, wenn vorhanden). Uber die Pfeil-auf-, Pfeil-abTasten werden die entsprechenden Parameter verandert.
Ist der niedrigste Wert erreicht, wird auf den hochsten Wert
gesprungen. Entsprechendes gilt in der anderen Richtung.
12
MODE
Mit der Taste MODE wird der gewunschte Modus
aktiviert, mit dem die Elektroporation ausgefiihrt
werden soil. Es konnen nur die Modi angewahit werden, die der Gerateausbaustufe entsprechen. Das
heiBt, dass bei der maximalen Ausbaustufe 3 Modi
und bei der Basisversion der Modus fur eukaryotische Zellen zur Verfugung stehen.
Im Display erscheint dann das entsprechende
Symbol:
0
: Modus fur eukaryotische Zellen
Ausbaustufe: Grundgerat
Verwendeter Puls: Abklingende e-Funktion
O
: Modus fur Bakterien und Hefen
Ausbaustufe: Bakterienmodul
Verwendeter Puls: Abklingende e-Funktion
(zS • Modus fur Zellfusion
Ausbaustufe: Fusionsmodul
Verwendeter Puls: Rechteckpuls
Start
START
Mit der Taste START wird die entsprechende Anwendung ausgelost.
Pfeiltasten
Mit den Pfeiltasten werden die angewahlten (unterstrichenen) Parameter aufoder absteigend verandert.
13
n
Datum einstellen
Durch gleichzeitiges Drucken derTasten SET und
MODE kann die Datums- und Uhrzeiteinstellung
aktiviert werden. Durch weiteres Drucken der SETTaste springt der Unterstrich in der Datums- und
Uhrzeitanzeige von links nach rechts. Auf diese
Weise konnen so mit den Pfeiltasten die Einstellungen verandert werden.
Um die Datumseinstellung zu beenden, kann entweder die SET-Taste so oft gedruckt werden bis der
Unterstrich im Display nicht mehrvorhanden ist oder
durch Drucken der Taste MODE oder START
(Anmerkung: Taste MODE schaltet auf anderen
Modus, wenn vorhanden).
Start
Lautstarke einstellen
Durch gleichzeitiges Drucken derTasten MODE
und START kann die Lautstarkeeinstellung fur die
akustischen Signale aktiviert werden. Dadurch
erscheint in der untersten Zeile des Displays die
Anzeige "VOLUME" mit einer Prozentzahl. Diese
Zahl gibt die Lautstarke an. Die Zahl kann uber die
Pfeiltasten verandert werden.
Um die Lautstarkeeinstellung zu beenden, konnen
alternate die SET-, MODE- oder START-Taste
gedruckt werden (Anmerkung:Taste MODE schaltet auf anderen Modus, wenn vorhanden). Die
Anzeige "VOLUME" wird ausgeblendet.
ffesef
Soil ein Versuch abgebrochen werden, ist dies nur
uber den Netzschalter moglich. Dieser dient ebenfalls als Reset-Schalter.
14
4.6 Display
Im Display werden die fur das Experiment relevanten Parameter in den
Zeilen 2 bis 4 fett und groBer dargestellt. Die Parameter und ihre Anzahl
unterscheiden sich abhangig vom gewahlten Modus. In der obersten Zeile
werden immer das Datum und die Uhrzeit dargestellt. In der untersten
Zeile wird immer rechts der angewahlte Modus durch ein Zeichen symbolisiert:
0
: Modus fur eukaryotische Zeilen
Gerateausbaustufe: Grundgerat
O
: Modus fur Bakterien und Hefen
Gerateausbaustufe: Bakterienmodul
O :
Modus fur Zellfusion
Gerateausbaustufe: Fusionsmodul
In dieser Zeile konnen gegebenenfalls auch die Anzeige "VOLUME" Oder
die verbleibende Zeit des Experimentes zusatzlich angezeigt werden.
13:37
12.AUG.00
U 500V
T
n
VOLUME 100%
220MS
1
Beispiel des Displays
zur Lautstarkeneinstellung
0
Wahrend und nach einem Experiment andert sich die Anzeige und gibt
die entsprechenden Informationen aus.
15
4.7 Elektroporation eukaryotischer Zellen und Bakterien / Hefen
Die jeweiligen Experimente werden in Einmalkiivetten durchgefiihrt. Das
biologische Material wird im Spalt zwischen den Elektroden vorgelegt. Die
auf den Kuvetten vorgeschriebene Menge ist einzuhalten. Ein Uberstand
oberhalb der Elektroden beeinflusst das Experiment nicht, aber die Effizienz des Experimentes wird herabgesetzt.
Ein mattiertes Fenster ermoglicht das Beschriften der Kuvette.
Die an der Kuvette befindliche Kunststoffnase dient zum richtigen Einsetzen in den Kuvetteneinschub. Der Deckel verschlieBt die Kuvette. Als
Schutz vor Uberdruck wird die Kuvette mit dem Deckel aber nicht hermetisch abgeschlossen. Deshalb sollte eine befullte Kuvette nur aufrecht
transportiert werden, da sonst die Gefahr besteht, dass biologische Material austritt.
Deckel
Kunststoffkuvette
Kunststoffnase
Elektroden
Spalt
Abb. 4: Schematische Darstellung der Elektroporationskuvette
Der Kuvetteneinschub wird an dem ausgebildeten Griff aus dem Multiporator® herausgezogen. Die Kuvette wird blasenfrei befullt.
Die Kuvette wird in die hintere Vertiefung des Kuvetteneinschub so eingesetzt, dass die Kuvettennase in den langen Schlitz passt und die Kuvette
auf dem Boden des Kuvetteneinschubs steht. Der Kuvetteneinschub wird
mit der eingesetzten Kuvette bis zum Anschlag in das Gerat geschoben.
Der Kuvetteneinschub kann gekiihlt aufbewahrt werden.
Fur den Transport des Gerats ist zu beachten, dass der Kuvetteneinschub
ohne Kuvette aus dem Gerat rutschen kann.
16
4.7.1 Einschub (Elektroporation)
zum Anschluss von externen Elektroden (Option)
Im nichtserienmaGigen Zubehor (siehe Bestellinformationen) gibt es
einen Einschub fur die Elektroporation (Symbol 0 , Spannungsentladung
(iber eine abklingende e-Funktion), an den externe Elektroden angeschlossen werden konnen.
Dieses sollte uber4 mm-Laborstecker mit Beruhrungsschutz erfolgen!
Dieser Einschub kann auch im Modus Zellfusion (Symbol (£3, Rechteckpuls) verwendet werden, wenn die Spannungseinstellung fur die Zellausrichtung ("alignment") auf "0" gesetzt wird.
1 Anschlussbuchse Masse (schwarz)
2 Anschlussbuchse Pluspol (rot)
Beim Anschluss externer Elektroden sind die Sicherheitsbestimmungen (Hochspannung) und die EMV-Vorschriften
des Landes maBgebend und einzuhalten (EMV: Elektromagnetische Vertraglichkeit)!
Alle angeschlossenen Geratschaften unterliegen derVerantwortung des Anwenders!
17
4.8 Zellfusion (Option)
4.8.1 Optimierung der Zellfusion (Kontrolle unter dem Mikroskop)
Urn die Parameter der Zellfusion fur die zu untersuchenden Zellen zu optimieren, konnen die Zellausrichtung und die Zellfusion mit einer speziellen
Mikro-Fusionskammer unter dem Mikroskop verfolgt werden.
Die Mikro-Fusionskammer wird uber das Kabel (ca. 1 m) mit dem Einschub verbunden.
1
2
Einschub der Mikro-Fusionskammer
1 Kontakte
2 Erdungsfedern
Mikro-Fusionskammer
1 Koaxialanschluss
Achtung: Mikro-Fusionskammer vorsichtig behandeln!
Zellsuspension vorsichtig einfullen! Die Elektroden sollten nach Moglichkeit nicht mit der Pipettenspitze beruhrt oder verschoben werden!
Beschadigungsgefahr!
Wahrend der Zellausrichtung/Fusion direkten Kontakt mit den Elektroden
vermeiden!
Die Fusion darf nur bei angeschiossener Mikro-Fusionskammer erfoigen!
18
-
Den Einschub der Mikro-Fusionskammer fest in den Multiporator®
schieben.
-
Die mit ca. 50 ul der Zellsuspension gefullte Mikro-Fusionskammer
auf das Mikroskop legen.
Hinweis: Durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension auf den
Bereich der Elektroden kann die Zahl der Zellen zwischen den Elektroden maximiert werden.
-
Zur Arretierung auf dem Mikroskoptisch konnen z. B. die Klammern
genutzt werden, die auch zur Befestigung eines Objekttragers verwendet werden.
^
Die Mikro-Fusionskammer mit dem Kabel verbinden.
Elektroden und Zellen fokussieren.
Die eingestellten Parameter iiber die Taste START unter mikroskopischer Betrachtung ablaufen lassen.
200 urn
Zellen zwischen den
Elektroden in der Zellausrichtung (alignment)
Zellen nach der Fusion und Fusionsprodukte
Das maximale Fullvolumen der Mikro-Fusionskammer betragt ca. 200 ul.
Die ermittelten und eingestellten Parameter sind direkt auf die HelixFusionskammer ubertragbar und anwendbar.
4.8.2 Reinigung der Mikro-Fusionskammer
Der Inhalt der Mikro-Fusionskammer wird mit Aqua bidest. ausgespult
(Spritzflasche), hartnackige Zellreste konnen mit einer weichen Zahnburste vorsichtig in Langsrichtung der Elektroden entfemt werden (Der
Elektrodenabstand darf nicht verandert werden!). Ein Nachspulen mit
Ethanol (70 %, unvergallt) beschleunigt den Trocknungsprozess.
19
4.8.3 Helix-Fusionskammer
Die Zellfusion einer groBeren Zahl von Zellen wird in einer Helix-Fusionskammer durchgefiihrt.
Schema der Helix-Fusionskammer
Die Helix-Fusionskammer besteht aus einem Becher und einem Kern mit
parallel gewickelten Platindrahten, den Elektroden. Sie sind als DoppelHelix urn den Kern gewickelt. Beide Teile werden miteinander verschraubt. Der Spalt zwischen Becher und Kern besitzt ein Fullvolumen
von 250 |il.
Die Helix-Fusionskammer wird uber den Koaxiaianschluss mit dem Einschub zur Zellfusion verbunden.
20
Becher
Kern
1 Gewinde
1 Elektroden
2 Koaxiaianschluss
HelixFusionskammer
1 Spalt fur Zellfusion
Fusionseinschub
1 Kontakte
2 Koaxiaianschluss
Der Abstand der gewickelten Platinelektroden betragt ca. 200 urn.
Abb. 5: Mikroskopbild der Elektroden der Helix-Fusionskammer
Achtung: Helix-Fusionskammer vorsichtig behandeln!
Bei abgelosten oder beschadigten Elektroden ist ein gesicherter Vorgang
nicht mehr gewahrleistet! In diesem Fall die Helix-Fusionskammer nicht
mehr verwenden!
4.8.4 Befallen der Helix-Fusionskammer und Einsetzen
in den Fusionseinschub
Die Helix-Fusionskammer wird mit 250 ul Zellsuspension befullt. Zu
beachten ist, dass die Flussigkeit exakt in die tiefste Stelle des Bechers
pipettiert wird. Benetzungen am Rand oder der Wandung sind zu vermeiden. Sie fuhren zu einer schlechten Befiillung der Helix-Fusionskammer.
Es bilden sich eventuell Luftblasen, die die Effektivitat des Experiments
herabsetzen.
In den stehenden Becher (im Stander) wird der Kern vorsichtig eingesetzt
und vorsichtig in den Becher geschraubt. Durch das Schrauben wird die
Zellsuspension in dem immer schmaler werdenden Spalt nach oben
gedriickt.
21
Beim Schrauben darauf achten, dass sich moglichst keine Luftblasen
ausbilden.
Bis zur DurchfiJhrung der Fusion die verschlossenen Helix-Fusionskammer uber Kopf auf dem Koaxialanschluss stehen lassen.
4.8.5 Durchfuhren der Fusion und Entnahme der Zellsuspension
- Der Fusionseinschub wird test in das Gerat geschoben.
22
-
Verschlossene Helix-Fusionskammer auf den Koaxialanschluss des
Fusionseinschubes aufstecken und durch eine viertel Drehung einrasten.
-
Die Fusion wird mit den eingestellten Parametem (siehe Kap. 5.3)
durchgefiihrt.
-
Die Helix-Fusionskammer vorsichtig durch eine viertel Drehung des
Koaxialanschlusses losen und abnehmen.
-
Zum Offnen senkrecht stellen, z. B. in den Stander.
-
Den Kern vorsichtig aus dem Becher schrauben.
-
Die am Kern befindlich Zellsuspension mit einer geringen Menge des
entsprechenden Mediums abspulen.
-
Die Zellsuspension aus dem Becher wird mit der abgespulten Zellsuspension vereinigt und entsprechend weiterbehandelt.
4 Gemtebeschreibung
4.8.6 Reinigung und Desinfektion der Helix-Fusionskammer
Becher und Kern der Helix-Fusionskammer sollten direkt nach dem Experiment gut mit destilliertem Wasser gespult werden, um ein Eintrocknen
zu verhindern.
Bei starker Verschmutzung kann die Helix-Fusionskammer kurz im Ultraschallbad (eventuell mit Reinigungszusatz, z. B. Edisonite-Super) oder
mit einersehr weichen (Zahn-)Burste gereinigt werden. Bei Reinigung mit
der Burste ist zu beachten, dass in Richtung der Wicklung gebiirstet wird.
Im anderen Fall konnen sich die Elektroden verschieben und die HelixFusionskammer unbrauchbar werden.
AnschlieBend werden die Teile mit Ethanol (70 %, unvergallt) desinfiziert.
Zum Trocknen im Stander unter sterilen Bedingungen staubfrei aufstellen.
Nach dem Trocknen kann die Helix-Fusionskammer wieder eingesetzt
werden.
4.9 Druckeranschluss / Drucker (Option)
Der Multiporator® kann zu jedem Experiment ein Druckerprotokoll liefern,
in dem die verwendeten Parameter, Datum und Uhrzeit eingetragen werden. Des weiteren konnen auf dem Druckerprotokoll weitere, das Experiment betreffende Daten wie Puffer, Konzentration, Zell-Linie etc. eingetragen werden. Auch werden im Fehlerfall die Fehlermeldungen gedruckt.
Beispielhafte Ausdrucke fur die verschiedenen Anwendungen sind im folgenden dargestellt:
18.Aug.00 16:03:04
eppendorf
Multiporator 4308
Higher Eucaryotic Cells U = 100 V,
Cuvette Gap Width
1 mm
x = 50 us,
2mm
V4.00
n= 1
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
23
18.Aug.00 16:42:47
eppendorf
Multiporator 4308
V4.00
Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, xa= 5.0 ms
Cuvette Gap Width
1 mm
2mm
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
Fusion Chamber
Strain / Cell Line A
Cell Density A
Strain / Cell Line B
Cell Density B
Buffer
Temperature
24
U'_ = 8.0 V,
U = 15 V,
U"_ = 4.0 V,
II
Cell Fusion
Multiporator 4308
n
eppendorf
II
18.Aug.00 16:17:49
20 s
100 us,
10s
V4.00
n=3
18.Aug.97 15:59:08
eppendorf
Multiporator 4308
V1.00
******** ERROR 07 ********
******** Short T *********
An die serielle Druckerschnittstelle auf der Ruckseite des Gerats konnen
serielle Drucker angeschlossen werden. Ebenso ist es moglich, die Protokolle iiber ein PC-Terminalprogramm zur Dokumentation auszulesen.
Hierfur wird ein Nullmodemkabel benotigt (9-polige Buchse / 9-polige
Buchse, Bestell-Nr. 0013 610.525).
Die Eppendorf AG bietet den folgenden Thermodrucker an. Beispielhaft
ist zusatzlich die DIP-Schalterstellung fur einen IBM-kompatiblen Drucker
beschrieben:
Bestell-Nr.
Druckertyp
Thermoprinter DPU-414
0013 608.148
Zubehor
Netzteil (230 V)
0013 608.172
Netzteil(115V)
0013 608.164
Thermopapier (10 Rollen)
6547 001.018
Anschlusskabel 9-polige Buchse / 9-poliger Stecker
Kabelfuhrung 1:1
(fur Thermoprinter DPU-414)
0013 610.517
9-polige Buchse / 25-poliger Stecker 0013 610.533
Nullmodemkabel
(IBM-kompatibel,
z. B. fur Matrixdrucker
Seikosha SP 2400 (Endlospapier)
25
DIPSW
settings
Fiir Thermoprinter DPU-414
Z. B. fur Matrixdrucker
Seikoshi1SP2400
(Endlospapier)
Dip SW-1
Dip SW-1
1 (OFF): Input = Serial
2 (ON) : Printing Speed = High
3 (ON) : Auto Loading = ON
4 (ON) :AutoLF = ON
5 (ON) : Setting Command
= Enable
6 (OFF): Printing
7 (ON) : Density
8 (ON) : = 1 0 0 %
1 (OFF) : USA
2 (OFF) : USA
3 (OFF) : USA
4 (ON) : IBM
5 (OFF) : Character Set 1
6 (ON) : 12 inches
7 (OFF) : LF only
8 (ON) : CR = CR + LF
Dip SW-2
Dip SW-2
1 (OFF): Printing Columns = 80
2 (ON) : User Font Back-up
= ON
3 (ON) : Character Select
= Normal
4 (OFF): Zero = Slash
5 (ON) : International
6 (ON) : Character
7 (ON) : Set
8 (OFF): = USA
1 (ON)
2 (ON)
3 (ON)
4 (OFF)
5 (OFF)
6 (OFF)
7 (ON)
8 (OFF)
Dip SW-3
1 (ON) : Data Length = 8 bits
2 (ON) : Parity Settings = No
3 (ON) : Parity Conditions
= Odd
4 (OFF): Busy Control
= XON/XOFF
5 (OFF): Baud
6 (ON) : Rate
7 (ON) : Select
8 (ON) : = 9600 bps
26
: 9600 Baud
: 9600 Baud
: XON/XOFF
: No Parity
: No Parity
: 8 bits
: Serial
: No single sheet
5 Arbeitstechniken
5.1 Modus eukaryotische Zellen
Dieser Modus wird im Display durch das Zeichen 0 symbolisiert.
1. Schritt - Parameter eingeben /andern
-
-
Gegebenenfalls
12.AUG.00
fiber die Taste
U 500V
MODE auf eukaryotische Zellen urnschalten.
Taste SET drucken,
um den gewunschten Parameter
anzuwahlen
(Unterstrich).
-
Mit den Pfeiltasten
die Parameter aufoder absteigend
verandern.
-
Gegebenenfalls
weitere Parameter
mit SET- und Pfeiltasten andern.
-
Eingabe beenden.
Die Parameter sind
sofort wirksam und
mussen nicht abgespeichert werden.
Beispiel des Displays
zur
Elektroporation von
220MS
eukaryotischen Zellen.
13:37
X
n
2
Die relevanten Parame-
© ter sind groB und fett
dargestellt.
U: Spannung,
Einheit V (Volt),
einstellbar im Bereich
von 20-100 V
in Einer-Schritten,
von 100-1 000 V
in Zehner-Schritten,
von 1 000-1 200 V
in EinhunderterSchritten.
v. Zeitkonstante,
Einheit us
(Mikrosekunden),
einstellbar im Bereich
von 15-500 us
in 5 |iS-Schritten.
n: Anzahl der Pulse
wahrend des
Experimentes,
einstellbar von 1-99.
Zwischen den Pulsen wird jeweils eine
Minute gewartet.
Anmerkung: Die eingesteliten Parameter werden tatsachlich angewendet, Der Verlauf des Pulses wird intern berechnet, so dass der Verlauf der
Entladungskurve (e-Funktion) entsprechend den eingegebenen Parametern eingehalten wird.
Fur die Anwendung eines Rechteckpulses kann das Fusionsmodul verwendet werden (siehe hierzu Kap. 5.4).
27
5 Arbeitstechniken
2. Schritt - Elektroporation starten
-
Mitder Taste START
die Elektroporation
auslosen.
-
Im Display erscheint in der dritten Zeile die Information "Charge",
die Ladung wird
aufgebaut.
-
12.AUG.00
U 500V
13:37
x
220|JS
Charge
0
Nach Abschluss der
Ladung kommt es
zur Entladung, dargestellt durch einen
Blitz in der dritten
Zeile.
1st mehr als ein Puls ein- 12.AUG.00
13:37
gestellt, erscheint der
U 500V X 220us
Hinweis "Wait" mit der
Wait
noch zu wartenden Zeit.
I\ 0:57
0
Nach Beendigung des
12.AUG.00
13:37
Experiments ertont ein U 500V X 220us
akustisches Doppeln
2
signal und es erscheint
wieder der Eingangsbild- READY SINCE 1:36
©
schirm mit den eingestellten und verwendeten Parametern.
Zusatzlich wird in der
untersten Zeile die Zeit
in Minuten und Sekunden seit Beendigung des
Experiments angezeigt.
Nach 99 Minuten oder
bei Betatigung einer
Taste erlischt diese
Anzeige.
23
5 Arbeitstechniken
5.2 Modus Bakterien und Hefen (Option)
Dieser Modus wird im Display durch das Zeichen O symbolisiert.
-
-
Gegebenenfalls
12.AUG.00
uber die Taste
U 2000V
MODE auf Bakterien
und Hefen umschalten.
Taste SET driicken,
um den einstellbaren Parameter
Spannung(U)
anzuwahlen
(Unterstrich).
-
Mit den Pfeiltasten
verandern.
-
Eingabe beenden.
Die Parameter sind
sofort wirksam und
X
13:42 Beispiel des Displays zur
5 ms Elektroporation von Bakterien und Hefen.
Die relevanten Para-
O meter sind groB und fett
dargestellt.
U: Spannung,
Einheit V (Volt),
einstellbarim Bereich
von 200-1 000 V
in Zehner-Schritten,
von 1 000-2 500 V
in EinhunderterSchritten.
x: Zeitkonstante,
Einheit ms
(Millisekunden),
auf 5,0 ms fest eingestellt.
29
5 Arbeitstechniken
2. Schritt - Elektroporation starten
-
Mitder Taste START
die Elektroporation
auslosen.
-
Im Display erscheint in der dritten Zeile die Information "Charge",
die Ladung wird
aufgebaut.
-
12.AUG.00
U 2000V
Charge
O
Nach Abschluss der
Ladung kommt es
zur Entladung, dargestellt durch einen
Blitz in der dritten
Zeile.
Nach Beendigung des
12.AUG.00
Experimentes ertont ein U 2000V
akustisches DoppelsiUa2003V
gnal und es erscheint
wieder der EingangsREADY SINCE
bildschirm mit den eingestellten Parametern.
In der dritten Zeile werden die tatsachlichen
Parameter L)a und t a
dargestellt.
Anzeige.
30
13:42
5 ms
x
U a : Tatsachlich verwendete, gemessene
Spannung,
.1 ms
EinheitV(Volt).
13:42
5
X
\
5
1:36
IDS
O x : Tatsachlich verwena
dete, gemessene
Zeitkonstante, Einheit ms (Millisekunden), Werte < 0,8
werden als 0,8 ms
dargestellt.
5 Arbeitstechniken
5.3 Modus Zellfusion (Option)
5.3.1 Funktion: Alignment (Zellausrichtung)
Die Funktionen fur das Alignment werden durch die Symbole U'_ (vor
dem Puls) und U"_ (nach dem Puls) in den Zeilen 2 und 4 des Displays
dargestellt.
— Gegebenenfalls
iiber die Taste
MODE auf Fusion
umschalten.
XflQfp ^ F X Hn"ir*kpn
urn die gewiinschten Parameter
anzuwahlen
(Unterstrich).
-
-
Mit den Pfei Hasten
verandern. Wird ein
Wert in den Zeilen
U'_/U"_/Ur,auf
"0" gesetzt, wird die
jeweilige Funktion
nicht ausgefiihrt.
Dadurch konnen U'_
/ U"_ einzeln oder
nacheinander ohne
Aktivierung des
Fusionspulses ausgelost werden.
Eingabe beenden,
die Parameter sind
sofort wirksam und
12.AUG.00
U'_
Un
U"
Durchfiihrung des Align5V t 60s
OV t 15s n2 ments U'_ ohne Aktivierung des Pulses Un und
OV t 30s
des
Alignments U"_.
€3
Die relevanten Parameter sind groB und fett
dargestellt.
U1 / U " :
Wechselspannung,
Einheit V (Volt),
einstellbar:
"0" und im Bereich
von 1,0-10V
in 0,1 V-Schritten.
t: Dauer des Alignments 0-95 s,
Einheit s (Sekunden)
in 5 s-Schritten.
Un: Spannung
(Rechteckpuls),
Einheit V (Volt),
einstellbar:
"0" und im Bereich
von 5-100 V
in 1 V-Schritten,
von 100-300 V
in 10 V-Schritten.
t: Pulsdauer,
Einheit us
(Mikrosekunden),
einstellbar 0-300 us
in 5 |Js-Schritten.
n: Anzahl der Pulse
0-99, einstellbar
in Einer-Schritten.
31
5 Arbeitstechniken
2. Schritt - Alignment (Zellausrichtung) starten
-
-
Mitder Taste START 12.AUG.00
13:42
das Alignment U'_
U'~ 5V t 60s
auslosen.
Un OV t 15s n2
In der vierten Zeile U"~ OV t 30s
des Displays erscheint die Information / \ A / I die Wechselspannung liegt
fur die gewahlte
Dauer an.
Nach Beendigung des
Experiments ertont ein
akustisches Doppelsignal und es erscheint
wieder der Eingangsbildschirm mit den eingestellten und verwendeten Parametern.
untersten Zeile die verstrichene Zeit in Minuten und Sekunden seit
Beendigung des Experimentes angezeigt. Nach
99 Minuten Oder bei
Betatigung einer Taste
erlischt diese Anzeige.
32
5 Arbeitstechniken
5.3.2 Durchfiihrung der Zellfusion
1. Schritt - Parameter eingeben / andern
-
Taste SET drucken, 12.AUG.00
um die gewiinschDurchfuhrung der ElekU'_ 5V t 30s
ten Parameter
Up 30V t 15ps n2 trofusion mit aktivierten
anzuwahlen
Alignments U'_ / li\.
U". 5V t 30s
(Unterstrich).
-
Mit den Pfeiltasten
Beispiel des Displays zur
die Parameter auf13:42 Durchfuhrung der Elek12.AUG.00
oder absteigend
t 30s
trofusion mit inaktivierverandern. Je nach
Up 30V t 15MS n2 tem Alignment U'_.
Wahl der Parameter
U"~ 5V t 30s
fur U'_ und U"_
Die relevanten Parakann die Fusion
meter sind groB und fett
wahlweise ohne
dargestellt.
Alignment mit nur
Un: Spannung,
einer oder mit beiEinheit V (Volt),
den Alignmenteinstellbar:
Funktionen kom"0" und im Bereich
biniert werden.
von 5-100 V
Eingabe beenden.
in 1 V-Schritten,
Die Parameter sind
von 100-300 V
sofort wirksam und
in 10V-Schritten.
mussen nicht abget: Pulsdauer,
speichert werden.
Einheit us
(Mikrosekunden),
einstellbar 0-300 us
in 5 us-Schritten.
u_ ov
-
Wechselspannung,
Einheit V (Volt),
einstellbar:
"0" und im Bereich
von 1,0-10 V
in 0,1 V-Schritten.
n: Anzahl der Pulse
0-99, einstellbar
in Einer-Schritten.
33
5 Arbeitstechniken
2. Schritt - Zellfusion starten
-
Mit der Taste START
die Zellfusion auslosen.
-
Im Display erscheint in der vierten Zeile kurz die
Information
"Charge", die Ladung wird aufgebaut.
12.AUG.00
(-3
12.AUG.00
34
13:42
U'_ 5V t 30s
Un 30V t 15us n2
Charge
13:42
-
Wan rend des LaU'_ 5V t 30s
devorgangs liegt
Un 30V t 15ps n2
schon die Wechselspannung U'_
§ 0:23
£D
fur die ausgewahlte
Dauer an. Die
Wechselspannung
wird durch ~ (Sinusschwingung) angezeigt.
-
Nach der vorgezahlten Alignmentzeit
(0-95 Sekunden)
kommt es zur Entladung, dargestellt
durch einen Blitz in
der vierten Zeile.
In Abhangigkeit von
der eingegebenen
Anzahl n erfolgt bei
n >1 jeweils nach
einer Sekunde eine
weitere Entladung.
5 Arbeitstechniken
-
Nach Abschluss der
Entladungenliegtfiir
die eingestellte
Dauer (0-99 Sekunden) die Wechselspannung U"_ an.
Die verbleibende
Gesamtzeit des
Experiments wird in
der unteren Zeile
permanent angezeigt.
Nach Beendigung des
13:42
12.AUG.00
Experimentes ertont
U'_ 5V t 30s
ein akustisches Doppel- U n 30V t 15MS n2
signal und es erscheint U"_ 5V t 30s
wieder der EingangsREADY SINCE 1:36
bildschirm mit den eingestellten und verwendeten Parametern.
Anzeige.
Hinweis: Im Fall von U'_ / U"_ = 0 kann der sonst nur bei der Fusion
zugangliche Rechteckpuls auch fur die Elektroporation verwendet werden. In diesem Fall erfolgt die Elektroporation mit dem Fusionsmodul und
mit den entsprechenden Parametern. Der Rechteckpuls kann nicht ohne
das Fusionsmodul verwendet werden.
35
6 Fehlermeldungen
Im Fehlerfall gibt der Multiporator® ein akustisches Signal sowie eine Fehlermeldung uber das Display oder uber den angeschlossenen Drucker
(Option) aus. Diese Fehlermeldungen beziehen sich auf Geratefehler
oder auf Fehler, die sich durch die Anwendung ergeben. Die Fehler 1-4
und 9 konnen bei der Verwendung des Bakterienmoduls, 1-7 bei eukaryotischen Zellen und 1-8 bei der Zellfusion auftreten.
FehlerNr.
Fehlermeldung Ursache
Behebung
01
No Display
Display wird nicht
angesteuert.
Service benachrichtigen.
02
No RTC /
NVRAM
Elektronischer Bau- Service benachrichtigen.
stein fur die interne
Uhrdefekt.
03
High Current
Die Stromstarke
wahrend der Entladung (Puls) war
zu groB.
Die Leitfahigkeit der verwendeten Ldsung herabsetzen.
Priifen, ob der richtige
Kuvettentyp eingesetzt
wurde.
04
No Cuvette
Keine Kuvette
eingesetzt.
Kuvette einsetzen,
erneut starten.
Kuvetteneinschub ganz
ins Gerat schieben.
36
05
Timeout Charge Der Kondensator
konnte nicht in der
vorgesehenen Zeit
zum Ladebeginn
aufgeladen werden.
06
Timeout Charge Bei MehrfachPulsung konnte
zwischen den einzelnen Pulsen der
Kondensator nicht
rechtzeitig aufgeladen werden.
Die Leitfahigkeit der verwendeten Losung herabsetzen.
Priifen, ob der richtige
wurde.
6 Fehlermeldungen
FehlerNr.
Fehlermeldung Ursache
Behebung
07
Short x
08
Low Resistance Zu hoher Strom in
der Kuvette. Die
Wechselspannung
kann nicht aufrecht
erhalten werden.
Die Leitfahigkeit der verwendeten Losung herabsetzen.
09
Timeout
Measuring x
Bakterienmodul
x a = 0,8 ms,
U a sehrviel
kleiner als der
eingestellte
Parameter U
Der Kondensator
Die Leitfahigkeit der verwurde restlos entwendeten Losung herableert. Es kann nicht setzen.
sichergestellt werden, dass das ein- Prufen, ob der richtige
gegebene x auch
wurde.
ausgefuhrt wurde.
Das begrenzende
Glied war nicht die
Puls-Regelung,
sondern der Kondensator.
Timeout bei der xMessung des Bakterienmoduls.
-
Funkenschlag
in der Kuvette.
-
Kuvette mit groRerem Elektrodenabstand verwenden.
-
Die Stromstarke wahrend der Entladung (Puls)
war zu hoch.
-
Die Leitfahigkeit
der verwendeten
Losung herabsetzen.
-
Technischer
Fehler.
-
37
7 Wartung, Service und Pflege
Eine regelmaBige Wartung ist nicht erforderlich.
Die Gewahrleistung und den Service ubernimmt der Lieferant.
7.1 Desinfektion
Vor der Desinfektion des Multiporators den Netzstecker ziehen.
AlleTeile des Multiporators, einschlieBlich Zubehor und der Verbindungskabel, sind einer Wischdesinfektion zu unterziehen.
Der Kuvetteneinschub kann auch einer Spruhdesinfektion unterzogen
werden.
Eine Spruhdesinfektion des Gerats ist nicht zu empfehlen, da hierbei Desinfektionsmittel in das Innere des Multiporators gelangen kann.
Die angewandte Desinfektionsmethode muss den geltenden gesetzlichen
Bestimmungen und Richtlinien zur Desinfektion entsprechen.
7.2 Reinigung
Vor der Reinigung des Multiporators den Netzstecker ziehen.
Es ist darauf zu achten, dass keine Flussigkeiten in das Innere des Multiporators gelangen. Dadurch werden Kurzschliisse in der elektrischen
Installation und Korrosion vermieden.
Lackierte Teile und Aluminiumflachen mit einem Tuch und milden Reinigungsmitteln abwischen und mit einem trockenen Tuch nachreiben.
Achtung: Keine atzenden, losenden oder schleifenden Reinigungs- Oder
Poliermittel verwenden.
38
8 Technische Daten
Spannung/Frequenz:
Sicherungen:
Leistungsaufnahme:
Uberspannungkategorie:
Schutzklasse:
Verschmutzungsgrad:
Einstellbare Spannung
(Modul fur):
Eukaryotische Zellen:
100-240 V ±10 %, 50-60 Hz
TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 Stuck)
60 W
II
I
2
20- 100 V in
1 V-Schritten
100-1 000 V in 10 V-Schritten
1 000-1 200 V in 100 V-Schritten
Pulsabstand: 1 Minute
Zellfusion:
0, 5 - 100 V in
1 V-Schritten
100- 300 V in 10 V-Schritten
Pulsabstand: 1 Sekunde
Wechselspannung: 0, 1,010 V in 0,1 V-Schritten
Bakterien:
Kondensator:
Widerstand:
200-1 000 V in 10 V-Schritten
1 000-2 500 V in 100 V-Schritten
kein Mehrfachpuls
10 uF, 2 500 V Impulsentladung
600 Q. parallel
56 Q. vorgeschaltet
<30 Sekunden
Ladedauer:
Anzahl der Pulse n:
0-99
Zeitkonstante x der Entladung:
Eukaryotische Zellen: 15-500 us in 5 us-Schritten einstellbar,
abklingende e-Funktion
Bakterien:
nominal 5 ms
mit einer Impedanz der Probe von 3,3 k£2
Messung und Anzeige von 0,8-6,0 ms
Dauer des Alignments
(Zellausrichtung):
0-95 s in 5 s-Schritten einstellbar
Dauer t des Pulses
(Zellfusion):
0-300 us in 5 us-Schritten einstellbar,
Rechteckpuls
9 600 Baud, 8 bit, keine Paritat,
RS 232-Schnittstelle:
2 Stoppbits, XON/XOFF
max. 40 °C
Umgebungstemperatur:
Umgebungsfeuchte relativ: max. 80 %
39
8 Technische Daten
Gewicht:
MaGe:
Das Gerat besitzt das
(cULE 158089).
max. 5,5 kg (je nach Ausbaustufe)
Breite:
25,2 cm
Tiefe:
34,2 cm
Hohe:
12,0 cm
- -Zeichen und die UL- und CSA-Zulassung
Technische Anderungen vorbehalten!
40
9 Bestellinformationen
Bestell-Nr.
4308 000.015
4308 000.023
4308 000.031
4308 000.040
Multiporator®
Basisversion fiir eukaryotische Zellen
100-240 V, 50-60 Hz
Multiporator®, eukaryotische Zellen und Ausbaustufe Bakerienmodul
Multiporator®, eukaryotische Zellen und Ausbaustufe Zellfusion
Multiporator®, eukaryotische Zellen und Ausbaustufe Bakerienmodul und Zellfusion
4308 070.510
4308 070.528
4308 070.536
Zubehor
Puffer
Hypoosmolarer Puffer fur Elektroporation (PH),
100 ml
Isoosmolarer Puffer fur Elektroporation (PI), 100 ml
Hypoosmolarer Puffer fur Zellfusion (FH), 100 ml
Isoosmolarer Puffer fur Zellfusion (Fl), 100 ml
4307 000.569
4307 000.593
4307 000.623
Elektropora tionskuve tten
1 mm Spaltbreite, Aluminium, steril, 50 Stuck
4308 070.501
4308 078.006
4308 070.072
4308 021.004
4308 012.005
4308 014.008
4308
4308
4308
0013
0013
0013
6547
030.003
024.003
017.007
608.148
608.172
608.164
001.018
Kuvettenstander fur 16 Elektroporationskuvetten
Einschub fur Elektroporationskuvetten
Einschub (Elektroporation/ Elektrofusion)
zum Anschluss von externen Elektroden
Einschub fur Helix-Fusionskammern
Helix-Fusionskammer
(0,2 mm Elektrodenabstand)
Mikro-Fusionskammer (0,2 mm Elektrodenabstand)
Einschub fiir Mikro-Fusionskammer
Standerfur 10 Helix-Fusionskammern
Thermodrucker DPU-414
Netzteil (230 V) fiir Thermodrucker DPU-414
Netzteil (115 V) fur Thermodrucker DPU-414
Thermopapier (10 Rollen)
41
9 Bestellinformationen
0013 610.517
0013 610.525
0013 610.533
4308 010.002
4308 011.009
42
Anschlusskabel
(9-polige Buchse / 9-poliger Stecker,
Kabelfuhrung 1:1)
Nullmodemkabel fur PC-Anschluss
(9-polige Buchse / 9-polige Buchse)
Nullmodemkabel fiir Matrixdrucker
(9-polige Buchse / 25-poliger Stecker)
Nachrustsatz Bakterien
(Einbau erfolgt durch Service)
Nachrustsatz Zellfusion
(Einbau erfolgt durch Service)
Contents
1
General information
44
2
Area of application
45
3
Safety precautions
46
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.7.1
48
49
50
50
51
51
54
55
4.8.5
4.8.6
4.9
Device description
Delivery package
Startup
Cuvette insert
Keypad
Keys and key combinations
Display
Electroporation of eukaryotic cells and bacteria / yeast . . . .
Insert (electroporation)
for connecting external electrodes (optional)
Cell fusion (optional)
Optimizing cell fusion (monitoring under a microscope) . . . .
Cleaning the micro-fusion chamber
Helix fusion chamber
Filling the helix fusion chamber
and loading into the fusion insert
Fusion and cell suspension extraction
Cleaning and disinfecting the helix fusion chamber
Printer connection / printer (optional)
60
61
62
62
5
5.1
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
Mode of operation
Mode for eukaryotic cells
Mode for bacteria and yeast (optional)
Mode for cell fusion (optional)
Function: Cell alignment
Procedure for cell fusion
66
66
68
70
70
72
6
Error messages
75
7
7.1
7.2
Maintenance and servicing
Disinfection
Cleaning
77
77
77
8
Technical data
78
9
Ordering information
80
4.8
4.8.1
4.8.2
4.8.3
4.8.4
56
57
57
58
59
43
1 General information
The Multiporator® is designed for the electroporation of eukaryotic cells.
With the aid of optional modules, it is also possible to perform
electroporation on bacteria and yeast as well as cell fusion. This manual
contains information on all possible uses of the Multiporator®.
The outstanding feature of the Multiporator® is that the parameters
entered for the electroporation of eukaryotic cells and for cell fusion are
maintained exactly by means of internal calculation of the discharge
curve.
44
2 Area of application
Device safety regulations and industrial standards stipulate the following
conditions:
-
Use the device for experiments in the field of cell technology
only
The range of application covers the electroporation of yeast and
bacteria and eukaryotic cells as well as cell fusion.
-
Please use only original accessories from Eppendorf
Original accessories only may be used. They are designed
specifically to ensure optimum functioning of the Multiporator®.
Additional devices may be used only if recommended by the
manufacturer. Eppendorf does not honor any warranty or accept
any responsibility for damage resulting from the use of incorrect
or non-recommended equipment.
45
3 Safety precautions
For reasons of personal safety, it is essential to observe the following!
46
•
Observe the instructions contained in the operating manual
It is essential to comply with the information given in the manual!
•
Only use the device with a power supply which has a grounding
contact!
•
Before starting up the Multiporator®, please ensure that the power
supply used corresponds to the voltage specifications on the
identification plate!
•
Disconnect the device from the mains supply before opening the
housing!
•
Do not operate the device in an explosive environment!
•
Do not allow any liquid to enter into the Multiporator® or the inserts!
•
The device should be used for in vitro applications onlyl
•
Use the device only for the purpose for which it is intended.
Do not place parts, devices, tools or other objects into the cuvette
insert which have not been recommended by Eppendorf AG.
High voltage!
•
Use the listed accessories only.
Other accessories may only be used if they are accompanied by a
safety certificate from Eppendorf AG confirming their suitability for
use!
•
Electrical connection to devices which are not mentioned in this
operating manual is only permitted with the prior consent of the
manufacturer!
3 Safety precautions
The helix fusion chamber must be handled with care!
Loose or damaged electrodes adversely affect operating procedures.
In such cases, the helix fusion chamber must not be used!
Do not open the helix fusion chamber until fusion has finished!
The micro-fusion chamber must be handled with care!
Take care when filling with cell suspension! Do not touch or move the
electrodes with the pipette tip! This may cause damage!
During cell alignment/fusion, avoid direct contact with the electrodes!
Cell alignment/fusion may be performed only when the micro-fusion
chamber is connected!
The cable is designed for connection to the micro-fusion chamber
only! No other connections are permitted! Do not place the plug into
liquid!
The owner or operator of the device is liable for the functioning of the
device when the device is serviced or maintained by persons who are
not members of the Eppendorf service personnel or when the device
is not operated in accordance with the given regulations and
precautions. Eppendorf AG accepts no liability for damage resulting
from such action. Warranty and liability stipulations which form part of
the terms of sale and delivery of Eppendorf AG are not affected by the
above-mentioned conditions.
This operating manual or parts of this operating manual may not be
reproduced in any form without the prior written permission of
Eppendorf AG!
Eppendorf AG reserves the right to make technical alterations to this
product!
47
4 Device description
The device has four different modification levels: the basic device is used
for the electroporation of eukaryotic cells. It can then be developed for the
electroporation of bacteria and yeast, with an additional level offering the
opportunity to perform cell fusion. These two levels can be combined to
form the fourth level.
The Multiporator® is operated using an easy-to-follow keypad with display.
The insert for the electroporation cuvette is located next to the keypad.
...
- ...,_..,_;.-- \.
\
Fig. 1: Multiporator®, front view
48
4.1 Delivery package
Basic device:
Multiporator® for the electroporation of eukaryotic
cells; with mains cable
Insert for electroporation cuvettes
Electroporation cuvettes
(gap between electrodes: 2 mm / 4 mm)
Hypo- and iso-osmolar buffers for electroporation
Operating manual and basic applications manual
"Bacteria module" optional:
Basic device incl. accessories
with integrated bacteria module
Additional electroporation cuvettes
(1-mm gap between electrodes)
"Cell fusion module" optional:
with integrated cell fusion module
(0.2-mm gap between electrodes)
Insert for helix fusion chamber
Micro-fusion chamber (0.2-mm gap between
electrodes) with special insert
Hypo- and iso-osmolar buffers for cell fusion
"Fusion- and bacteria module" optional:
with integrated fusion- and bacteria module.
49
4.2 Startup
The main power socket with fuse and main power switch is located on the
rear of the Multiporator®. To start the device, insert the power cable into
the main power socket and connect it up to the main power supply. Turn
on the device by pressing the main power switch.
I
IIIIIEII
Fig. 2: Multiporator®, rear view
Power connection (left)
Printer connection (right)
4.3 Cuvette insert
The insert for the electroporation cuvette is next to the keypad at the
front of the device. To remove the cuvette, pull out the cuvette insert.
When inserting a new cuvette, ensure that the nose of the cuvette fits into
the rear slot. Push the cuvette insert containing the cuvette into the device
up to the stop. A sensor in the device detects whether the cuvette insert
contains a cuvette.
Note: When transporting the device, please ensure that the insert
contains an empty cuvette. Alternatively, transport the cuvette insert
separately.
Different inserts are used for the modification level "cell fusion".
50
4.4 Keypad
The keypad is used to enter parameters, to select the electroporation
mode and to start electroporation. Depending on the modification level,
one to four modes can be selected. Key combinations can be used to set
the date and time as well as the volume of the acoustic signal.
Multiporator
eppencJorf
I2.OKT.97
13:37
U 500V T 220 MS
n
1
/OLUME
100%
S
Fig. 3: Control panel with keys and display
4.5 Keys and key combinations
SET
The SET key is used to select the desired parameter. This
parameter is underlined in the display. Further parameters
are selected by pressing the SET key an appropriate
number of times. A SET sequence is ended either by
pressing the SET key repeatedly until the underlining
disappears or by pressing the MODE or START key.
(Note:Tbe MODE key switches to another mode if
available.) Parameters are modified using the up/down
arrow keys. When the lowest possible value has been
reached, the display then moves to the highest value.
Similarly, when the highest value has been reached, the
display then moves to the lowest value.
51
MODE
The MODE key is used to activate the mode with
which electroporation is to be performed. It is only
possible to select modes in accordance with the
modification level of the device. This means that
three modes can be selected with the highest
modification level and the mode for eukaryotic cells
is available with the basic version.
The corresponding symbol then appears in the
display:
©
: Mode for eukaryotic cells
Modification level: Basic device
Pulse used: Decaying e-function
O
: Mode for bacteria and yeasts
Modification level: Bacteria module
Pulse used: Decaying e-function
G 3 : Mode for cell fusion
Modification level: Fusion module
Pulse used: Square-wave pulse
Start
START
The process required is started by pressing the
START key.
Arrow keys
The arrow keys are used to modify the selected
(i.e. underlined) parameters in the desired direction.
52
Setting the date
The procedure for setting the date and time can
be activated by pressing the SET and MODE keys
simultaneously. If the SET key is pressed again,
the underlining in the display for the date and time
moves from left to right. The arrow keys can thus
be used to modify the settings.
To end the process for setting the date, press the
SET key repeatedly until the underlining is no longer
visible in the display. Alternatively, the underlining
disappears from the display when the MODE or
START key is pressed. (Note:Jhe MODE key
switches to another mode if available.)
1
Start
Setting the volume of the acoustic signals
The procedure for setting the volume of the acoustic
signals can be activated by pressing the MODE
and START keys simultaneously. "VOLUME" then
appears in the bottom line of the display, together
with a figure in percent. This figure indicates the
volume and the tone type and can be modified using
the arrow keys.
To end the procedure for setting the volume of the
acoustic signals, press the SET, MODE or START
key. (Note: The MODE key switches to another
mode if available.) "VOLUME" then disappears from
the display.
Reset
An experiment can be terminated only by pressing
the main power switch. This switch also functions as
a reset switch.
53
4.6 Display
The parameters which are relevant for the experiment appear in lines
2 to 4 in larger letters and in bold print. The parameters and the number
of parameters differ according to the mode which has been selected. The
date and time are permanently visible in the top Iine.The mode which has
been selected is always represented by a symbol on the right of the
bottom line:
0
: Mode for eukaryotic cells
Modification level: Basic device
O
: Mode for bacteria and yeasts
Modification level: Bacteria model
G 3 : Mode for cell fusion
Modification level: Fusion model
"VOLUME" or the remaining time for the experiment can also appear in
the display in this line.
12.AUG.00
U 500V
13:37
X
n
VOLUME 100%
220MS
1
Example of the display for setting
the volume of the acoustic signal
0
During and after the experiment, the display changes to show the
information relevant to the stage of the experiment which has been
reached.
54
4.7 Electroporation of eukaryotic cells and bacteria /yeast
Experiments are carried out in disposable cuvettes. The biological
material is placed in the gap between the electrodes. Please use only the
quantity of substance specified on the cuvette. Although a supernatant
above the electrode does not drastically affect the experiment, it reduces
the general efficiency.
A matt window allows the cuvette to be inscribed.
The plastic nose on the cuvette ensures that the cuvette is inserted
correctly into the cuvette insert. The lid seals the cuvette. However, to
safeguard against excess pressure, the cuvette is not hermetically sealed
by the lid. A filled cuvette should therefore be transported in an upright
position only in order to ensure that biological material does not leak out.
Plastic cuvette
Plastic nose
Fig. 4: Schematic diagram of electroporation cuvette
The cuvette insert is removed from the Multiporator® using the protruding
grip. No bubbles are present when the cuvette is filled.
When the cuvette is inserted into the inner recess of the cuvette insert,
care must be taken to ensure that the cuvette nose is positioned in the
long slit and that the cuvette is in contact with the base of the cuvette
insert. The cuvette insert, complete with cuvette, is then pushed into the
device up to the stop.
The cuvette insert may be stored in a cool place.
When transporting the device, please note that the cuvette insert may slip
out of the device if no cuvette has been inserted.
55
4.7.1 Insert (electroporation)
for connecting external electrodes (optional)
The non-standard accessories (see "Ordering information") contain an
insert for electroporation ( © symbol, voltage discharge via decaying efunction). It is possible to connect external electrodes to this insert.
This should be performed using a protected 4-mm lab plug!
This insert can also be used in the cell fusion mode ((H) symbol, squarewave pulse) when the voltage setting for cell alignment is set to "0".
F
1 Connecting socket, earth (black)
2 Connecting socket, positive pole
(red)
When using external electrodes, observe the safety
precautions (high voltage) and stipulations governing EMC
(electromagnetic compatibility)!
The user is responsible for all equipment that has been
connected!
56
4.8 Cell fusion (optional)
4.8.1 Optimizing cell fusion (monitoring under a microscope)
In order to optimize the cell fusion parameters for the cells that are to be
examined, it is possible to monitor cell alignment and cell fusion under a
microscope with the aid of a special micro-fusion chamber.
The micro-fusion chamber is connected to the insert via the cable (which
is approximately 1-meter-long).
1
- \
Insert of micro-fusion chamber
1 Contacts
2 Earthing springs
Micro-fusion chamber
1 Coaxial connector
Caution: The micro-fusion chamber must be handled with care!
Take care when filling with cell suspension! Do not touch or move the
electrodes with the pipette tip! This may cause damage!
During cell alignment/fusion, avoid direct contact with the electrodes!
Cell alignment/fusion may be performed only when the micro-fusion
chamber is connected!
-
Slide the micro-fusionmicro-fusion chamber firmly into the
Multiporator®.
-
Place the micro-fusion chamber (which is filled with approx. 50 ul cell
suspension) onto the microscope.
Note: Pipetting the cell suspension carefully onto the area around the
electrodes can maximize the number of cells between the electrodes.
-
The brackets can be used
to lock into place on the
microscope table. They
can also be used to
fasten a glass slide.
57
-
Connect the micro-fusion chamber with the cable.
-
Focus the electrodes and cells.
-
Run through the parameters by pressing the START key. This can be
monitored under the microscope.
200 um
Cells between the
electrodes in cell
alignment
Cells after fusion and fusion products
The maximum filling volume of the micro-fusion chamber is approx.
200 Ml.
The parameters that have been determined and set can be transferred
directly to the helix fusion chamber and used there.
4.8.2 Cleaning the micro-fusion chamber
The content of the micro-fusion chamber is rinsed out using bi-distilled
water from a spray bottle. Cell residue that is particularly stubborn can be
removed by carefully cleaning the electrodes with a soft toothbrush using
vertical strokes. (The space between the electrodes must not be changed
during this process!) The drying process can be accelerated by rinsing the
chamber with 70 % non-denatured ethanol.
58
4.8.3 Helix fusion chamber
Cell fusion of a large number of cells is carried out in a helix fusion
chamber.
Diagram of helix fusion chamber
The helix fusion chamber consists of a cup and a core with parallel wound
platinum wires, which are the electrodes. They are wound around the core
as a double helix. Both parts are screwed together. The gap between the
cup and the core has a filling volume of 250 u.1.
The helix fusion chamber is linked to the insert for cell fusion via the
coaxial connector.
Cup
1 Thread
Core
1 Electrodes
2 Coaxial
connector
1 Gap for cell fusion
Fusion insert
1 Contacts
2 Coaxial connector
59
The gap between the wound platinum electrodes is approx. 200 urn.
Fig. 5: Microscope view of the electrodes of the helix fusion chamber
Caution: Handle the helix fusion chamber with care!
Loose or damaged electrodes adversely affect operating procedures. In
such cases, the helix fusion chamber must not be used!
4.8.4 Filling the helix fusion chamber
and loading into the fusion insert
The helix fusion chamber is filled with 250 ul cell suspension. It is
essential to ensure that the liquid is pipetted into the deepest possible
position in the cup. The edge and the walls must not be wetted as this has
an adverse effect on filling the helix fusion chamber. Air bubbles may form
which reduce the effectivity of the experiment.
A core is inserted into the upright cups in the stand and carefully screwed
into place. As a result of this screwing action, the cell suspension in the
ever-decreasing gap is forced upwards.
60
When screwing the core, make sure that no air bubbles form.
Mfl
Leave the closed helix fusion chamber upside-down on the coaxial
connector until the fusion process has been completed!
4.8.5 Fusion and cell suspension extraction
- Slide the fusion insert firmly into the device.
-
Placed the closed helix fusion chamber onto the coaxial connector
and lock it into place by rotating it a quarter-turn.
-
Fusion is performed using the parameters that have been set
(see Sec. 5.3).
-
Loosen the helix fusion chamber carefully by rotating it a quarter-turn
and then remove it.
-
To open the chamber, place it in a vertical position (e.g. in the stand).
-
Unscrew the core carefully from the beaker.
-
Using a small quantity of the appropriate medium, rinse off any cell
suspension that may be on the core.
-
The cell suspension from the beaker is mixed with the cell suspension
that has been rinsed off and is then treated further as required.
61
4.8.6 Cleaning and disinfecting the helix fusion chamber
The beaker and core of the helix fusion chamber should be rinsed with
distilled water directly after the experiment in order to prevent cell and
buffer residue from drying up.
If heavily contaminated, the helix fusion chamber should be cleaned
briefly in an ultrasonic bath (possibly with a cleaning supplement, such as
Edisonite Super) or with a very soft (tooth)brush. When cleaning is carried
out using brushes, please ensure that brushing is carried out in the same
direction as the windings, since the electrodes may otherwise move out of
their correct position and thus render the helix fusion chamber unusable.
Disinfect the parts using non-denatured 70 % ethanol.To dry the parts,
place them in the stand under sterile, dust-free conditions. After drying,
the helix fusion chamber may be re-used.
4.9 Printer connection /printer (optional)
The Multiporator® can supply a printer protocol for each experiment.
This protocol contains the parameters used as well as the date and time.
Additional data pertaining to the experiment, such as buffer, concentration
or cell line, can also be entered. In the event of an error occurring, the
error message is also printed out. Examples of printouts for different
applications are shown below:
18.Aug.00 16:03:04
eppendorf
Multiporator 4308
Higher Eucaryotic Cells U = 100V,
Cuvette Gap Width
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
62
1 mm
x = 50 us,
2mm
V4.00
n= 1
4mm
18.Aug.00 16:42:47
eppendorf
Multiporator 4308
Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V,
Cuvette Gap Width
1mm
2mm
V4.00
xa= 5.0 ms
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
18.Aug.00 16:17:49
eppendorf
Cell Fusion
U1 = 8.0 V,
U = 15 V,
U"_ = 4.0 V,
Multiporator 4308
t = 20 s
t = 1 0 0 MS,
t = 10 s
V4.00
n=3
Fusion Chamber
Cell Density A
Cell Density B
Buffer
Temperature
63
18.Aug.97 15:59:08
eppendorf
Multiporator 4308
V1.00
* ERROR 07 ********
Short x "
Serial printers can be connected to the serial printer interface at the rear
of the device. It is also possible to read protocols for documentation
purposes via a PC terminal program. This requires a zero-modem cable
(9-pin socket / 9-pin socket, order no. 0013 610.525).
The following thermal printers are available from Eppendorf AG.The DIP
switch setting for an IBM-compatible printer is also described:
Order no.
Printer type
Thermal printer DPU-414
0013 608.148
Accessories
Power unit (230 V)
0013 608.172
Power unit (115 V)
0013 608.164
Thermal paper (10 rolls)
6547 001.018
9-pin socket / 9-pin plug
cable guide 1:1
(for Thermal printer DPU-414)
0013 610.517
Connecting
cable
9-pin socket / 25-pin plug
0013 610.533
zero-modem cable
(EDP compatible
e.g. for Matrix printer
Seikosha SP 2400 (endless paper)
64
DIPSW
settings
For Thermal printer DPU-414
e.g. for Matrix printer
Seikosha SP 2400
(endless paper)
Dip SW-1
Dip SW-1
4 (ON) : Auto LF = ON
= Enable
6 (OFF) : Printing
7 (ON) : Density
8 (ON) : = 100%
1 (OFF) : USA
2 (OFF) : USA
3 (OFF) : USA
4 (ON) : IBM
6 (ON) : 12 inches
7 (OFF) : LF only
8 (ON) : CR = CR + LF
Dip SW-2
Dip SW-2
1 (OFF) : Printing Columns = 80
= ON
= Normal
4 (OFF) : Zero = Slash
6 (ON) : Character
7 (ON) : Set
8 (OFF) : = USA
1 (ON)
2 (ON)
3 (ON)
4 (OFF)
5 (OFF)
6 (OFF)
7 (ON)
8 (OFF)
: 9600 Baud
: 9600 Baud
: XON/XOFF
: No Parity
: No Parity
: 8 bits
: Serial
: No single sheet
Dip SW-3
= Odd
4 (OFF) : Busy Control
= XON/XOFF
5 (OFF): Baud
6 (ON) : Rate
7 (ON) : Select
8 (ON) : = 9600 bps
65
5 Mode of operation
5.1 Mode for eukaryotic cells
This mode is represented in the display by the symbol 0 .
Step 1 - Entering I modifying parameters
-
-
If necessary, switch 12.AUG.00
to the mode for
U 500V
eukaryotic cells by
pressing the MODE
key.
Press the SET key
to select the
parameter desired
(the parameter will
be underlined).
-
Use the arrow keys
to modify the
parameter in the
direction required.
-
If necessary, modify
other parameters
using the SET key
and the arrow keys.
-
Terminate the
entering procedure.
The parameters
are effective
immediately and
do not have to be
stored.
X
n
13:37 Example of a display for
220us the electroporation of
eukaryotic cells.
2
The relevant parameters
0 appear in the display in
larger letters and in bold
print.
U: Voltage, in V (volt).
Can be set in
increments of 1 V in
the range 20-100 V;
in increments of 10 V
in the range
100-1,000 V;
in increments of
100 V in the range
1,000-1,200 V.
x: Time, in us
(microseconds).
Can be set in
increments of 5 us in
the range 15-500 us.
n: Number of pulses
during the
experiment.
Can be set between
1 and 99. A period of
one minute elapses
between each pulse.
Note: The parameters which have been set are applicable. The course
of the curve is calculated internally, so that the course of the discharge
curve (e-function) is maintained according to the parameters which have
been entered.
The fusion module can be used for a square-wave pulse (see Sec. 5.4).
66
5 Mode of operation
Step 2 - Starting electroporation
-
Trigger the
electroporation
process by pressing
the START key.
-
"Charge" appears in 12.AUG.00
13:37
the third line of the U 500V X 220us
display. Charging
Charge
commences.
-
After the charging
procedure has
ended, discharging
occurs. This is
indicated by a flash
in the third line of
the display.
-
If more than one
12.AUQ.00
13:37
pulse has been set, U 500V T 220us
"Wait" appears in
Wait
the display,
accompanied by the
S 0:57
©
remaining waiting
time.
©
After the experiment has 12.AUG.00
13:37
ended, a double acoustic U 500V X 220us
signal is emitted and the
n
2
initial information
READY SINCE 1:36
appears
©
in the display with the
parameters which have
been set and used.
The time which has
elapsed since the end of
the experiment appears
in the bottom line in
minutes and seconds.
After 99 minutes or after
any key has been
pressed, this information
disappears from the
display.
67
5 Mode of operation
5.2 Mode for bacteria and yeast (optional)
This mode is represented in the display by the symbol O •
Step 1 - Entering / modifying parameters
-
-
68
to the mode for
U 2000V
bacteria and yeast
by pressing the
MODE key.
Press the SET key
to select the Voltage
(U) parameter (the
parameter will be
underlined).
-
Use the arrow keys
to modify the
parameter in the
direction required.
-
Terminate the
entering procedure.
The parameters
are effective
immediately and
do not have to be
stored.
Example of a display for
the
electroporation of
5 ms
bacteria and yeast.
13:42
X
O appear in the display in
print.
U: Voltage, in V (volt).
Can be set in
increments of 10 V
in the range
200-1,000 V;
in increments of
100 V in the range
1,000-2,500 V.
v. Time constant,
in ms (milliseconds).
Set to 5.0 ms.
5 Mode of operation
Step 2 - Starting electroporation
-
Trigger the
electroporation
process by pressing
the START key.
-
"Charge" appears in 12.AUG.00
13:42
the third line of the U 2000V
5 ms
display. Charging
Charge
commences.
-
After the charging
procedure has
ended, discharging
occurs. This is
in the third line of
the display,
accompanied by a
double acoustic
signal.
O
After the experiment has 12.AUQ.00
13:42 U a : Actual measured
ended, a double acoustic U 2000V t 5 ms
voltage used, in V
signal is emitted and the
(volt).
Ua2003V x a 5.1 ms
initial information and
Actual time constant
the set parameters
READY SINCE 1:36
O xa: used,
in ms
appear in the display.
(milliseconds). Values
The actual parameters
<0.8 are shown as
U a and xa appear in the
0.8 ms.
third line
of the display.
The time which has
any key has been
disappears from the
display.
69
5 Mode of operation
5.3 Mode for cell fusion (optional)
5.3.1 Function: Cell alignment
The functions for alignment are indicated by the symbols UL (before the
pulse) and U"_ (after the pulse) in lines 2 and 4 of the display.
Step 1 - Entering / changing parameters
13:42 Example of the display for
to the mode for
cell alignment U'_ withU'_ 5V t 60s
fusion by pressing
Un OV t 15s n2 out activation of pulse Un
the MODE key.
and alignment U"_.
U" OV t 30s
€3
Press the SET key
to select the
appear in larger letters
parameter desired
and in bold print.
(the parameter will
be underlined).
Alternating voltage, in
Use the arrow keys
V (volts). Can be set
to "0" and in increto modify the
ments of 0.1 V beparameter in the
tween 1.0 V and 10 V.
direction required.
If a value in lines
t: Duration of alignment
UL/U"_/Ur.are
0-95 s, in s (seconds).
set to "0", the
Can be set in increfunction in question
ments of 5 seconds.
is not carried out.
This enables U'^ /
U n : Voltage,
U"_ to be triggered
(square-wave pulse)
individually or
unit V (volts).
consecutively
Can be set to "0" and
without the fusion
pulse being
between 5 V and
activated.
100 V, and in
increments of 10 V
Terminate the
between 100 V and
entering procedure.
300 V.
The parameters
are effective
t: Duration of pulse,
immediately and
Unit us
do not have to be
(microseconds).
stored.
Can be set in
increments of 5 us
between 0 us and
300 us.
n: Number of pulses
0-99. Can be set in
one-pulse increments.
70
5 Mode of operation
Step 2 - Starting cell alignment
-
-
Trigger alignment
U'_ by pressing
the START key.
The information
\ A » appears in
the fourth line of the
display; alternating
voltage is applied
for the duration
selected.
12.AUG.00
13:42
U'
5V t 60s
Up OV t 15s n2
U"_ OV t 30s
/
At the end of the
experiment, an acoustic
signal is emitted and an
initial display appears
with the parameters that
have been set and used.
In addition, the time that
has elapsed (in minutes
and seconds) since the
end of the experiment is
shown in the bottom line.
This display disappears
after 99 minutes or when
any key is pressed.
71
5 Mode of operation
5.3.2 Procedure for cell fusion
Step 1 - Entering I modifying parameters
-
Press the SET
12.AUG.00
13:42 Example of a display of
key to select the
electrofusion with activaU'_ 5V t 30s
parameters desired Un 30V t 15us n2 ted alignments U'_ / U'L(the parameter will U"_ 5V t 30s
be underlined).
-
Use the arrow
keys to modify the
12.AUG.00
13:42
parameter in the
U'_ OV t 30s
direction required.
Un 30V t 15|is n2
According to the
5V t 30s
parameters selected U"
©
for U'_
and U"_ , fusion
can be carried out
without alignment or
in combination with
one or both
alignment functions
as required.
-
Terminate the
entering procedure.
The parameters
are effective
immediately and
do not have to be
stored.
Example of the display
for carrying out electrofusion with inactivated alignment U'_.
appear in the display in
print.
U n : Voltage, in V (volt).
between 5 V and
100 V, and in increments of 10 V between 100 V and
300 V.
t: Duration of pulse,
in us (microseconds).
Can be set in
increments of 5 us
between 0 us and
300 us.
U'_ / U"_:
Alternating voltage, in
V (volt).
in increments of 0.1 V
in the range 1.0-10 V.
n: Number of pulses
0-99.
Can be set in onepulse increments.
72
5 Mode of operation
Step 2 - Starting cell fusion
-
Trigger the cell
fusion process
by Pressing the
START key.
"Charge" appears
briefly in the fourth
line of the display.
Charging
commences.
12.AUG.00
13:42
U'_ 5V t 30s
Up 30V t 15|js n2
Charge
During the charging
procedure,
12.AUG.00
13:42
alternating voltage U'~ 5V t 30s
U'_ is applied for the Up 30V t 15|JS n2
A
selected duration.
r
The alternating
I 0:23
voltage is
I
represented by the
symbol ~ (sine-wave
oscillation).
Discharge occurs
after the precounted alignment
time (0-95
seconds). This is
in the fourth line of
the display.
If the number n
which has been
entered is n >1,
a further discharge
occurs each time
after one second.
73
5 Mode of operation
-
After the discharging
procedure has
ended, the
alternating voltage
U"_ is applied for
the set duration
(0-99 seconds).
The overall time
remaining for the
experiment is
constantly visible
on the bottom line
of the display.
After the experiment has 12.AUG.00
13:42
ended, a double acoustic U'_ 5V t 30s
signal is emitted and the Ur, 30V t 15MS n2
initial menu appears in
U"_ 5V t 30s
the display with the
READY SINCE 1:36
parameters which have
been set and used.
The time which has
any key has been
disappears from the
display.
Note: With the setting U'_ / U"_ = 0 the square-wave pulse - which is
normally only accessible for fusion - can also be used for electroporation.
In this case, electroporation is carried out with the fusion module and the
corresponding parameters. The square-wave pulse cannot be used
without the fusion module.
74
6 Error messages
In the event of an error, the Multiporator® emits an acoustic signal and an
error message appears in the display or via the printer (optional). These
error messages refer to device errors or to applicational errors. Errors 1-4
and 9 may occur in the mode for bacteria, errors 1-7 in the mode for
eukaryotic cells and errors 1-8 in the mode for cell fusion.
Error Error message Cause
no.
Solution
01
No Display
Display is not
controlled.
Contact SERVICE.
02
No RTC /
NVRAM
Electronic module
for the internal
clock is defective.
Contact SERVICE.
03
High Current
The current was
too high during
the discharging
process (pulse).
Reduce the conductivity
of the solution used.
04
No Cuvette
Cuvette has not
been inserted.
Check whether the
correct cuvette type has
been inserted.
Insert a cuvette.
Restart the device.
Push cuvette insert fully
into the device.
05
Timeout Charge The capacitor was
unable to be
charged in within
the allotted period
of time.
Contact SERVICE.
06
Timeout Charge During repeated
pulsing, the
capacitor was
Check whether the
unable to be
correct
cuvette type has
charged within the
period between the been inserted.
individual pulses.
75
6 Error messages
76
Error Error message Cause
no.
Solution
07
Short x
The capacitor
was completely
emptied; it is
uncertain whether
the x has been
executed. The
limiting element
was the capacitor
and not the pulse
regulator.
Check whether the
correct cuvette type has
been inserted.
08
Low Resistance The current in the
cuvette is too high
and the alternating
voltage cannot be
maintained.
09
Timeout
Measuring x
Contact SERVICE.
Bacteria
module
x a = 0.8 ms,
U a is
considerably
lower than the
parameter U
which has been
set.
Timeout for the xmeasurement of
the bacteria
module.
-
Sparks in the
cuvette.
-
Use a cuvette which
has a greater
distance between the
electrodes.
-
The current
during
discharge
(pulse) was too
high.
-
Reduce the
conductivity of the
solution.
-
Technical error.
-
Contact SERVICE.
7 Maintenance and servicing
The device does not require regular maintenance.
Warranties and servicing are the responsibility of the distributor.
7.1 Disinfection
Before disinfecting the Multiporator®, disconnect the device from the main
power supply.
All parts of the Multiporator®, including the accessories and the
connecting cable, must undergo wipe disinfection.
The cuvette insert can also undergo spray disinfection.
However, it is not advisable to carry out spray disinfection on the entire
device, as disinfectant may enter the device.
7.2 Cleaning
Before cleaning the Multiporator®, disconnect the plug.
Ensure that no fluids enter the Multiporator®, as this could cause shortcircuits in the electrical installation as well as corrosion.
Wipe painted parts and aluminum surfaces using a cloth and mild
detergent and then wipe with a dry cloth.
Warning: Do not use any corrosive, solvent or abrasive detergents or
polishes.
77
8 Technical data
Voltage/frequency:
Fuses:
Power consumption:
Excess-voltage category:
Protection class:
Degree of contamination:
Voltage range
for the following modules:
Eukaryotic cells:
100-240 V ±10 %, 50-60 Hz
TO, 1.0 A - 5 x 20 mm (2 pcs.)
60 W
II
I
2
20- 100 V, in increments of 1 V
100-1,000 V, in increments of 10V
1,000-1,200 V, in increments of 100 V
Interval between pulses: 1 minute
Cell fusion:
0, 5 - 100 V, in increments of
1V
100- 300 V, in increments of 10V
Interval between pulses: 1 second
Alternating voltage 0,1.010 V, in increments of 0.1 V
Bacteria:
Capacitor:
Resistance:
200-1,000 V, in increments of 10V
1,000-2,500 V, in increments of 100 V
No multiple pulse
10 uF, 2,500 V impulse discharge
600 Q. parallel
56 Q series
Charging time:
<30 seconds
No. of pulses (n):
0-99
Time constant T of discharge:
Eukaryotic cells:
15-500 us, in increments of 5 us,
fading e-function
Bacteria:
Nominal 5 ms,
with an impedance of the sample of 3.3 kil
Measurement and display from 0.8-6.0 ms
Duration of alignment:
0-95 s, in increments of 5 s
Duration t of pulse:
Cell fusion:
0-300 us, in increments of 5 us,
square-wave pulse
RS 232 interface:
9,600 baud, 8 bits, no parity,
2 stop bits, XON/XOFF
Ambient temperature:
max. 40 °C
Relative ambient humidity: max. 80 %
78
8 Technical data
Weight:
Dimensions:
max. 5.5 kg (according to modification level)
Width:
25.2 cm
Depth:
34.2 cm
Height:
12.0 cm
The device is
-approved and has UL and CSA authorization
( c U L E 158089).
Technical specifications subject to change!
79
9 Ordering information
Order no.
4308 000.015
4308 000.023
4308 000.031
4308 000.040
4308 070.510
4308 070.528
4308 070.536
Accessories
Buffer
Hypo-osmolar buffer for electroporation (PH),
100 ml
Iso-osmolar buffer for electroporation (PI), 100 ml
Hypo-osmolar buffer for cell fusion (FH), 100 ml
Iso-osmolar buffer for cell fusion (Fl), 100 ml
4307 000.569
4307 000.593
4307 000.623
Electroporation cuvettes
1 mm gap width, aluminum, sterile, 50 pcs.
4308 070.501
4308 078.006
4308 070.072
4308 021.004
4308 012.005
4308 014.008
4308 030.003
4308
4308
0013
0013
024.003
017.007
608.148
608.172
0013 608.164
80
Multiporator®,
basic version, for eukaryotic cells,
100-240 V, 50-60 Hz
Multiporator®, eukaryotic cells,
and modification level "bacteria mode"
Multiporator®, eukaryotic cells
and modification level "cell fusion"
Multiporator®, eukaryotic cells and modification
level "bacteria mode" and "cell fusion"
Cuvette stand for 16 electroporation cuvettes
Insert for electroporation cuvettes
Insert (electroporation / electrofusion)
for connecting to external electrodes
Insert for helix fusion chambers
(gap between electrodes: 0.2 mm)
Micro-fusion chamber
(gap between electrodes: 0.2 mm)
Insert for micro-fusion chamber
Stand for 10 helix fusion chambers
Thermal printer DPU-414
Power unit (230 V)
for thermal printer DPU-414
Power unit (115 V)
for thermal printer DPU-414
9 Ordering information
6547 001.018
0013 610.517
0013 610.525
0013.610.533
4308 010.002
4308 011.009
Thermal paper (10 rolls)
Connecting cable
(9-pin socket, 9-pin plug, cable guide 1:1)
Zero-modem cable for PC connection
(9-pin socket, 9-pin socket)
Zero-modem cable for matrix printer
(9-pin socket / 25-pin plug)
Conversion kit for mode for bacteria
(to be installed by SERVICE)
Conversion kit for mode for cell fusion
(to be installed by SERVICE)
81
Sommaire
1
Generalites
83
2
Destination de I'appareil
84
3
Consignes de securite
85
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
Descriptifde I'appareil
Envergure de livraison
Mise en service
Logette pour cuve
Clavier a touches
Touches et commandes de combinaison
87
88
89
89
90
90
4.6
Cadran
93
4.7
4.9
Electroporation de cellules d'eucaryotes
et de bacteries / levures
Module enfichable (electroporation)
pour la connexion d'electrodes externes (option)
Fusion cellulaire (option)
Optimisation de la fusion cellulaire
(controle sous microscope)
Nettoyage de la micro-chambre de fusion
Chambre de fusion helicoidale
Remplissage de la chambre de fusion helicoidale
et installation dans le module de fusion enfichable
Realisation de la fusion
et prelevement de la suspension cellulaire
Nettoyage et disinfection
de la chambre de fusion helicoidale
Connexion de I'imprimante (option)
101
101
5
5.1
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
Techniques de travail
Mode cellules d'eucaryotes
Mode bacteries et levures (option)
Mode fusion cellulaire (option)
Fonction: Alignement (Orientation cellulaire)
Execution de la fusion cellulaire
105
105
107
109
109
111
6
Messages d'erreurs
114
7
7.1
7.2
Maintenance, service apres-vente et entretien
Disinfection
Nettoyage
116
116
116
8
Specifications techniques
117
9
Nomenclature de commande
119
4.7.1
4.8
4.8.1
4.8.2
4.8.3
4.8.4
4.8.5
4.8.6
82
94
95
96
96
97
98
99
100
1 Generalites
Le Multiporator® de base est destine a I'eiectroporation de cellules
d'eucaryotes. Des modules complementaires en option permettent
I'extension de son utilisation a I'eiectroporation sur bacteries et levures
ainsi qu'a la fusion cellulaire. Le present mode d'emploi traite de
I'ensemble des possibilites d'utilisation du Multiporator®.
Le Multiporator® se caracterise par le fait qu'il permet, lors de
I'eiectroporation sur cellules eucaryotes ou de la fusion cellulaire, de
respecter scrupuleusement les parametres programmes grace a un calcul
rigoureux de la courbe de decharge.
83
2 Destination de I'appareil
La loi (allemande) sur la securite des instruments et les normes
industrielles prescrivent que:
84
-
Le present appareil ne doit etre utilise que pour
/'experimentation cytotechnologique
Le domaine d'utilisation inclut I'electroporation de levures, de
bacteries et de cellules d'eucaryotes alnsi que la fusion cellulaire.
-
N'utiliser que des accessoires garantis d'origine, de marque
Eppendorf
Seule I'utilisation d'accessoires d'origine est autorisee. Ces elements
sont adaptes a I'utilisation optimum du Multiporator®. Certains
elements complementaires peuvent cependant etre autorises par le
fabricant.Tout agissement contraire a ces regies entrame la nullite de
la garantie et exclut tout recours en dommages et interets.
3 Consignes de securite
II convient de respecter tres strictement les consignes ci-apres pour
assurer la securite des personnes:
•
II convient de toujours respecter le mode d'emploi,
et d'agir conformement a ses directives!
•
Le raccordement electrique au secteur doit toujours comporter une
protection a la terre et la continuity doit etre assuree.
•
Avant d'effectuer la mise sous tension de Pappareil, il convient de
verifier les indications portees sur la plaquette d'identification et de
s'assurer de la compatibility des tensions avec celles du secteur.
•
Avant toute intervention a I'interieur de I'appareil, toujours retirer le
cordon secteur!
•
L'utilisation de l'appareil dans des locaux comportant un risque
explosif n'est pas autorisee!
•
Dans toute manipulation, s'assurer qu'aucun liquide ne puisse
penetrer a I'interieur de l'appareil ou dans la logette du module
enfichable!
•
L'appareil n'est destine qu'a ('experimentation in vitro\
•
L'appareil doit etre utilise conformement a sa destination initiale.
Les seuls appareils, accessoires et outils autorises sont dument listes
et repertories par Eppendorf AG, a I'exclusion de tout autre, en
particulier en ce qui conceme la logette de la cuve sous haute
tension!
•
N'utiliser que les accessoires repertories.
L'utilisation de tout autre accessoire doit etre sujet a caution s'il n'est
pas expressement autorise par un document Eppendorf AG, certifiant
son innocuite et I'absence de risque technique pour la securite des
personnes!
•
Branchement electrique d'appareils.
Tout branchement electrique qui n'est pas expressement mentionne
dans le present mode d'emploi necessite I'autorisation explicite du
fabricant!
85
3 Consignes de securite
86
•
Traiter les chambres de fusion helicoi'dale avec douceur et precaution!
Lorsque les electrodes sont endommagees ou detachees, la securite
de la procedure n'est plus assuree. Dans ce cas, il convient de ne plus
utiliser la chambre de fusion helicoidale en question.
En cours de fusion, ne jamais ouvrir la chambre de fusion helicoidale:
toujours attendre la fin de I'operation!
•
Traiter les chambres de micro-fusion avec douceur et precaution!
Introduire la suspension cellulaire avec soin. Si possible, eviter de
toucher ou de decaler les electrodes avec la pointe de la pipette, au
risque de les endommager!
Au cours de la manipulation de I'alignement ou de la fusion cellulaire,
eviter tout contact direct avec les electrodes!
•
L'alignement cellulaire et la fusion ne doivent s'effectuer qu'avec une
cellule de micro-fusion connectee.
Le cable n'est prevu que pour sa connexion a la chambre de microfusion. Toute autre connexion est interdite. Ne jamais tremper le
connecteur dans un liquide!
•
La responsabilite civile concernant le fonctionnement de I'appareil est
reportee sur le proprietaire ou I'utilisateur.
La responsabilite civile concernant le fonctionnement de I'appareil est
le fait du proprietaire ou de I'utilisateur, dans la mesure ou cet appareil
est maintenance ou repare par un personnel n'appartenant pas au
Service Apres-Vente Eppendorf, ou encore s'il est utilise pour une
manipulation qui ne correspond pas a la destination initiale de
I'appareil. Eppendorf AG n'est pas tenu pour responsable pour les
dommages causes par I'inobservation des instructions. Les presents
propos n'ont pas pour objet une quelconque extension des conditions
commerciales ou de garantie, ni des responsabilites civiles.
•
La reproduction partielle ou complete du present mode d'emploi est
interdite, sauf autorisation expresse de la Societe Eppendorf AG!
•
La Societe Eppendorf AG se reserve le droit de proceder a toute
modification technique qu'elle jugerait utile sur le present produit!
4 Descriptif de I'appareil
L'appareil est presente en quatre versions qui se distinguent par leur
equipement. La version de base est destinee a I'electroporation de
cellules d'eucaryotes. Dotee d'equipements complementaires, la seconde
version permet I'electroporation de levures et de bacteries. Un troisieme
module integre permet la fusion cellulaire. La quatrieme variante est
constitute par la synthese des deux precedentes.
Le Multiporator® est pilote par un clavier simplifie en dialogue avec un
ecran. La logette de la cuve d'electroporation est situee a cote du bloc
de commande.
IS
Fig. 1: Multiporator®, vue de face
87
4.1 Envergure de livraison
Appareil de base:
Multiporator® pour I'electroporation de cellules
eucaryotes, avec cordon secteur
Module enfichable pour cuves d'electroporation
Cuves d'electroporation
(fente d'eiectrodes d'un ecart de 2 mm et 4 mm).
Tampons hypo et isoosmolaire pour eiectroporation
Mode d'emploi
et manuel d'applications de base
Option module bacterien:
Appareil de base
avec accessoires et module bacterien integre
Cuves d'electroporation supplementaires;
(ecart des fentes d'eiectrodes: 1 mm)
Option fusion cellulaire:
Appareil de base avec accessoires
et module de fusion cellulaire integres
Chambre de fusion helicoTdale
(ecart de fente d'electrode de 0,2 mm)
Module enfichable
pour chambre de fusion helicoTdale
Micro-chambre de fusion (ecart d'electrode de
0,2 mm) avec module enfichable special
Tampons hypo et isoosmolaire pour fusion cellulaire
Option fusion et module bacterien:
Appareil de base avec accessoires specifiques
et module fusion et bacterien integres
88
4.2 Mise en service
A I'arriere du Multiporator® se trouvent le connecteur d'entree secteur
avec ses fusibles et le bouton de mise sous tension. Brancher le cordon
secteur a I'arriere de I'appareil et le raccorder a une prise pour la mise en
service. Mettre en marche en actionnant le bouton secteur.
1 1 1 1 1 e 11
Fig. 2: Multiporator®, face arriere
Cote gauche: branchement secteur
Cote droit:
branchement pour imprimante
4.3 Logette pour cuve
La logette destinee a recevoir la cuve d'electroporation se trouve a I'avant,
a cote du bloc de commande. Pour extraire une cuve, tirer sur la logette
de la cuve. Pour enficher une cuve, veiller a bien engager le nez dans la
fente qui se trouve au fond du receptacle.Toujours pousser a fond la cuve
sur son portoir, dans son receptacle. L'appareil comporte un detecteur
identifiant la presence d'un module enfichable pour cuve.
Nota: Pour le transport de I'appareil, le module enfichable doit etre garni
d'une cuve, sinon le transporter separement.
L'extension pour fusion cellulaire utilise des modules enfichables
differents.
89
4.4 Clavier a touches
Les touches du clavier permettent de programmer les parametres, de
choisir les differents modes d'electroporation et de demarrer une
electroporation. Selon I'equipement de I'appareil, le nombre de modes
disponibles peut aller jusqu'a quatre. Les touches permettent par ailleurs
de programmer I'heure et la date, et de regler I'intensite sonore du signal
acoustique.
Multiporator
eppendoif
12.OKT.87
13:37
U 500V T 220 us
n
1
VOLUME
100%
Fig. 3: Bloc de commande avec touches du clavier
4.5 Touches et commandes de combinaison
SET
La touche SET permet de choisir le parametre souhaite.
Ce dernier est repere au cadran par un trait souligne. Pour
passer d'un parametre a un autre, il convient d'actionner la
touche SET autant de fois que necessaire. Pour terminer
une sequence SET, on actionne la touche SET jusqu'a
disparition du trait souligne au cadran, ou on actionne la
touche MODE ou START. (Nota: la touche MODE fera
basculer vers d'autres modes s'ils sont disponibles.) Les
touches de fleches montantes ou descendantes permettent
de modifier en boucle les parametres respectifs: arrive sur
la valeur la plus faible,
on passe a la valeur la plus forte pour en redescendre,
et inversement.
90
MODE
La touche MODE permet d'activer le mode souhaite
pour realiser I'electroporation. II n'est possible de
selectionner que les seuls modes qui correspondent
au degre d'equipement de I'appareil. Ceci revient a
dire que I'appareil dont le degre d'equipement est le
plus eleve comporte trois modes et la version de
base ne comporte que le mode destine aux cellules
d'eucaryotes.
Le cadran indique alors les symboles
correspondants:
0
: mode pour cellules d'eucaryotes:
niveau d'equipement: appareil de base;
impulsion utilisee: fonction e decroissante
O
: mode pour bacteries et levures:
niveau d'equipement: module bacterien;
impulsion utilisee: fonction e decroissante
(J3:
Start
mode pour fusion cellulaire
niveau d'equipement: module de fusion;
impulsion utilisee: impulsion rectangulaire
START
La solicitation de la touche START provoque le
declenchement de Papplication correspondante.
Les touches flechees
Les touches flechees permettent d'incrementer ou
de decrementer les valeurs du parametre souligne.
91
Reglage de la date
La pression simultanee de la touche SET et de la
touche MODE permet d'acceder au programme de
reglage de la date et de I'heure. En actlonnant
ensuite la seule touche SET, le trait de soulignement
passe en boucle de la date a I'heure. Les touches
flechees permettent alors de monter ou de
descendre les valeurs des affichages.
Pour terminer la mise a I'heure et le reglage de la
date, soit on actionne la touche SET jusqu'a
disparition du soulignement, soit on actionne la
touche START ou MODE. (Nota: la touche MODE
renvoie sur un autre mode le cas echeant).
Start
Reglage du son
La pression simultanee des touches MODE et
START permet de regler le son du signal
acoustique. Sur la ligne inferieure apparait le
message "VOLUME" avec une valeur en
pourcentage. Ce chiffre represente Pintensite
sonore du signal acoustique. La valeur peut etre
augmentee ou diminuee a I'aide des touches
flechees.
Pour terminer cette programmation, on peut
actionner au choix la touche SET, MODE ou START
(Nota: la touche MODE renvoie sur un autre mode
le cas echeant). Le message "VOLUME" disparaTt
alors.
Reset
Si un essai devait necessiter une interruption, il
convient d'actionner le bouton marche / arret sur
position arret. Ce bouton sert par ailleurs de touche
"reset" (remise a I'etat initial).
92
4.6 Cadran
Sur les lignes 2 jusqu'a 4, le cadran indique en gras les parametres
importants pour une experience donnee. Les parametres et leur nombre
sont fonction du mode choisi. La ligne superieure indique toujours la date
et I'heure. Sur la droite de la ligne inferieure figure un symbole qui indique
le mode choisi:
0
: mode pour cellules d'eucaryotes:
niveau d'equipement: appareil de base
O
: mode pour bacteries et levures:
niveau d'equipement: module bacterien
CD: mode pour fusion cellulaire:
niveau d'equipement: module de fusion
Surcette ligne pourra figurer le cas echeant le message "VOLUME" ou le
residuel pour I'experience en cours.
12.AUG.00
U 500V
13:37
T
n
VOLUME 100%
220us
1
Presentation d'un ecran pour
le reglage du son
©
Au cours et a la fin d'un essai, Paffichage change et donne les
informations correspondant a chaque situation.
93
4.7 Electroporation de cellules d'eucaryotes
et de bacteries /levures
Les essais s'effectuent dans des cuves a usage unique. Le materiel
biologique est introduit dans la fente inter-electrodes. II convient de
respecter le volume de remplissage present pour chaque cuve. Un
excedent de volume au-dessus des electrodes n'affecte pas I'essais en
soi, mais en diminue I'efficacite.
Une surface depolie permet le marquage.
La cuve comporte une protrusion en plastique qui est destinee a faciliter
son installation correcte sur le module enfichable. Le couvercle assure la
fermeture de la cuve. Une fermeture hermetique de ce couvercle n'est
pas prevue pour eviter d'eventuelles surpressions. En raison de cette
absence d'etancheite, les cuves remplies seront toujours transportees en
position debout pour eviter de repandre le materiel biologique de facon
incontrolee.
Couvercle
Cuve en matiere plastique
•
It )
Protrusion en plastique
Electrodes
Fente
Fig. 4: Illustration schematique de la cuve d'electroporation
Saisir le module enfichable par sa poignee moulee et le retirer du
Multiporator®. Remplir la cuve en evitant la presence de bulles d'air.
Poser la cuve dans le renfoncement situe dans la partie arriere du module
enfichable en I'orientant pour que sa protrusion s'engage dans la fente
prevue a cet effet et que la cuve repose bien sur la base du module
enfichable. Prendre le module enfichable et sa cuve, puis engager
I'ensemble dans la logette de I'appareil pour le pousser ensuite jusqu'en
butee.
Le module enfichable peut etre conserve au froid.
II est a noter que le module enfichable sans cuve n'est pas maintenu, et
qu'il peut s'echapper de sa logette au cours d'un transfert de I'appareil.
94
4.7.1 Module enfichable (electroporation)
pour la connexion d'electrodes externes (option)
Les accessoires hors serie (voir nomenclature de commande) component
un module d'electroporation enfichable qui permettent la connexion
d'electrodes externes (symbole © , decharge de la tension par une
fonction e decroissante).
La connexion externe doit s'effectuer par une fiche de laboratoire
classique de 4 mm comportant une protection isolante!
Ce module enfichable peut egalement s'utiliser en mode fusion cellulaire
(symbole G 3 ; impulsions rectangulaires) si le reglage de tension pour
I'alignement cellulaire est en position "0".
1 Douille de connexion de masse (noir)
2 Douille de connexion du pole positif (rouge)
Les consignes de securite (haute tension) et les directives
de la compatibility electromagnetique (CEM) relatives au
branchement d'electrodes externes sont soumises a la
reglementation locale du pays utilisateur. II convient de les
appliquer et de les respecter.
Tous les appareils ainsi connectes relevent de la
responsabilite exclusive de I'utilisateur!
95
4.8 Fusion cellulaire (option)
4.8.1 Optimisation de la fusion cellulaire
(controle sous microscope)
Une micro-chambre de fusion est specif iquement prevue pour optimiser,
sous microscope, les parametres de la fusion cellulaire concernant les
cellules a analyser.
La micro-chambre de fusion est reliee au module enfichable par
I'intermediaire d'un cable (1 m).
1
2
Module enfichable de la micro-chambre de fusion
1 Contacts
2 Ressort de mise a la terre
Micro-chambre de fusion
1 connecteur coaxial
Important: Manipuler les micro-chambres de fusion avec precaution!
Charger la suspension cellulaire avec soin. II convient de veiller a ne pas
toucher les electrodes avec la pointe de la pipette, de maniere a ne pas
les decaler ni a les endommager.
Les dommages peuvent etre irreversibles.
Au cours de la manipulation de I'alignement ou de la fusion cellulaire, eviter tout contact direct avec les electrodes.
La fusion ne doit s'effectuer qu'avec une micro-chambre de fusion dument
connectee!
96
-
Engager le module enfichable de la micro-chambre de fusion jusqu'a
sa butee dans le Multiporator®.
-
Poser la micro-chambre de fusion contenant environ 50 ul de
suspension cellulaire sur la platine du microscope.
Observation: Si le depot de la suspension cellulaire s'effectue a I'aide
de la pipette a proximite immediate des electrodes, on accroTt les
chances de disposer d'un nombre maximum de cellules entre les
electrodes.
Pour bloquer le systeme sur la
platine, on peut utiliser les griffes
du microscope, qui s'utilisent
habituellement, pour immobiliser
les lames porte-objet.
Connecter le cable de liaison a la micro-chambre de fusion.
Assurer la mise au point sur les electrodes et les cellules.
Declencher START de maniere a faire activer les parametres programmes et les observer sous microscope.
200 um
Cellules en
alignement entre
les electrodes
Cellules apres fusion et sous-produits de la fusion
La capacite de remplissage maximum de la micro-chambre de fusion est
d'env. 200 ul.
Les parametres determines et programmes sont directement
transmissibles a la chambre de fusion helicoidale pour y etre utilises.
4.8.2 Nettoyage de la micro-chambre de fusion
Pour evacuer le contenu de la micro-chambre de fusion, utiliser une
pissette d'eau bidistillee. Les depots cellulaires tenaces peuvent etre
enleves a I'aide d'une brosse a dents douce, en ayant soin de pas
endommager les electrodes. Passer sur les electrodes dans le sens de
leur longueur. Leur ecart ne pas etre altere. Un ringage consecutif par
une solution d'alcool non modifie a 70 % permet d'accelerer le sechage.
97
4.8.3 Chambre de fusion helicoi'dale
Pour effectuer une fusion ceiluiaire d'un nombre important de cellules, on
utilise la chambre de fusion helicoTdale.
Schema de la chambre de fusion helicoi'dale
La chambre de fusion helicoTdale est constituee d'une cuve et d'un noyau
comportant des electrodes sous forme d'un enroulement parallele de fils
de platine. Cet enroulement autour du noyau est en fait une double helice.
Les deux composantes sont vissees en elements concentriques.
L'espace entre le noyau et la cuve a une capacite de remplissage
de 250 u.1.
La chambre de fusion helicoTdale est connectee au module enf ichable par
I'intermediaire d'un connecteur coaxial pour realiser la fusion ceiluiaire.
98
Cuve
Noyau
1 Filetage
1 Electrode
2 Connecteur
coaxial
Chambre de
fusion helicoTdale
1 Espace pour
fusion ceiluiaire
Module enfichable
pour fusion
1 Contacts
2 Connecteur coaxial
L'ecart entre les filaments de platine enroules parallelement est d'environ
200 urn.
Fig. 5: Image microscopique des electrodes de la chambre de fusion
helicoidale
Important: Traiter la chambre de fusion helicoidale avec beaucoup de
precaution!
En effet, un fonctionnement normal et en securite de la procedure n'est
pas garanti lorsque les filaments sont detaches ou endommages. Une
telle chambre deterioree ne doit plus etre utiliseel
4.8.4 Remplissage de la chambre de fusion helicoidale
et installation dans le module de fusion enfichable
Introduire 250 ul de suspension ceilulaire dans la chambre de fusion
helicoidale. II convient de veiller a ce que le depot de la suspension soit
effectue dans la partie la plus basse de la cuve a I'aide de la pipette.
Eviter de mouiller le col ainsi que les parois car ceci entrainerait un
mauvais remplissage de la chambre de fusion helicoidale. II se formerait
alors des bulles d'air qui jouent defavorablement sur le rendement de
I'essai.
La cuve etant placee verticalement dans un portoir, on y introduit
doucement le noyau pour le visser ensuite. Le vissage a pour effet de
repousser la suspension ceilulaire vers le haut, I'espace se reduisant de
plus en plus par le vissage et I'enfoncement du noyau.
99
Lors du vissage, veiller a eviter la formation de bulle d'air.
En attendant de proceder a la fusion, poser la chambre de fusion
helicoTdale a I'envers, debout sur la connexion coaxiale.
4.8.5 Realisation de la fusion
et prelevement de la suspension cellulaire
- Engager fermement le module enfichable de fusion dans I'appareil.
100
-
Poser la chambre de fusion helicoTdale sur le connecteur coaxial du
module de fusion enfichable, puis la bloquer en lui imprimant une
rotation d'un quart de tour.
-
Realiser la fusion selon les parametres programmes (voir chap. 5.3).
-
Debloquer doucement la chambre de fusion helicoTdale par une
rotation d'un quart de tour sur le connecteur coaxial puis la retirer.
-
Avant d'ouvrir, poser verticalement la chambre dans un portoir.
-
Devisser doucement le noyau et I'extraire de la cuve.
-
EntraTner la suspension cellulaire se trouvant collee contre le noyau
par un petit volume du milieu utilise.
-
La suspension cellulaire de la cuve et celle recuperee sur le noyau
sont reunies et utilisees pour la suite des operations.
4 Deschptif de I'appareil
4.8.6 Nettoyage et disinfection de la chambre de fusion helicoidale
Immediatement apres chaque essai, il convient de bien rincer la cuve et
le noyau de la chambre de fusion helicoidale a I'aide d'eau distillee pour
eviter I'incrustation de depots sees.
Lorsque les pieces se trouvent fortement souillees, on peut les
decontaminer brievement dans un bain a ultrasons (avec ajout eventuel
d'un detergent tel que I'Edisonite Super), ou les brosser delicatement
avec une brossette (brosse a dents) douce. Dans la technique du
brassage, toujours aller dans le sens des spirales, sous peine de deplacer
les fils d'electrodes et de rendre ainsi la chambre de fusion helicoidale
inutilisable.
L'etape suivante consiste a desinfecter les pieces a I'aide d'alcool
ethylique non denature a 70 %. Deposer ensuite les pieces traitees sur
un support et laisser secher en conditions steriles a I'abri de la poussiere.
Apres sechage, la chambre de fusion helicoidale est a nouveau prete a
I'emploi.
4.9 Connexion de I'imprimante (option)
Le Multiporator® est capable de livrer un protocole imprime relatif a
chaque essai. Ce protocole comporte les parametres utilises, la date et
I'heure. Par ailleurs, on peut faire figurer sur ce protocole d'autres parametres tels que le tampon, la concentration, la lignee cellulaire, etc. Les
anomalies eventuelles y sont egalement enregistrees. Le protocole ciapres constitue un exemple d'impression pour les differentes applications:
18.Aug.00 16:03:04
eppendorf
Multiporator 4308
Cuvette Gap Width
1 mm
x = 50 us,
2mm
V4.00
n= 1
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
101
18.Aug.00 16:42:47
eppendorf
Multiporator 4308
V4.00
Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, xa= 5.0 ms
Cuvette Gap Width
1mm
2mm
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
18.Aug.00 16:17:49
eppendorf
Cell Density A
Cell Density B
Buffer
Temperature
102
n
II
Fusion Chamber
U'_ = 8.0 V,
U = 15V,
U"_ = 4.0 V,
II
Cell Fusion
Multiporator 4308
20 s
100 us,
10s
V4.00
n= 3
18.Aug.97 15:59:08
eppendorf
Multiporator 4308
V1.00
* ERROR 07 ********
1
Short x *
L'interface serielle pour imprimante situee a I'arriere de I'appareil permet
de connecter une imprimante serielle. II est egalement possible de
connecter un ordinateur PC pourtraiter les donnees et les imprimer. Cette
connexion s'effectue par un cable modem (douille 9 broches /
douille 9 broches; code commande 0013 610.525).
Eppendorf AG propose la thermo-imprimante ci-apres. Le descriptif ciapres donne egalement les positons des microcommutateurs pour une
imprimante compatible IBM:
Code
commande
Type
imprimante
Thermo-imprimante DPU-414
0013 608.148
Accessoires
Bloc secteur (230 V)
0013 608.172
Bloc secteur (115 V)
0013 608.164
Papier thermoimprimable
(les 10 rouleaux)
6547 001.018
douille 9 broches /
fiche 9 broches
cable brin a brin
(pour thermo-imprimante
DPU-414)
0013 610.517
Cable de
raccordement
douille 9 broches /
0013 610.533
fiche 25 broches
cable de raccordement imprimante
matricielle nullmodem (compatible
avec IBM; pour imprimante
matricielle Seikhosha SP 2400,
papier en alimentation continue)
103
DIPSW
settings
Pour thermo-imprimante
DPU-414
Pour imprimante
matricielle Seikosha SP
2400, papier en
alimentation continue
Dip SW-1
Dip SW-1
= Enable
6 (OFF): Printing
7 (ON) : Density
8 (ON) : = 100%
1 (OFF) : USA
2 (OFF) : USA
3 (OFF) : USA
4 (ON) : IBM
6 (ON) : 12 inches
7 (OFF) : LF only
8 (ON) : CR = CR + LF
Dip SW-2
Dip SW-2
= ON
= Normal
6 (ON) : Character
7 (ON) : Set
8 (OFF): = USA
1 (ON)
2 (ON)
3 (ON)
4 (OFF)
5 (OFF)
6 (OFF)
7 (ON)
8 (OFF)
Dip SW-3
= Odd
= XON/XOFF
5 (OFF): Baud
6 (ON) : Rate
7 (ON) : Select
8 (ON) : = 9600 bps
104
: 9600 Baud
: 9600 Baud
: XON/XOFF
: No Parity
: No Parity
: 8 bits
: Serial
: No single sheet
5 Techniques de travail
5.1 Mode cellules d'eucaryotes
Ce mode est symbolise par le signe 0 sur I'ecran.
Premiere etape: programmation ou modification des parametres
programmer le
12.AUG.00
MODE pour cellules U 500V
d'eucaryotes si
necessaire.
Taper la touche SET
pour choisir le
parametre souhaite
(souligne).
Augmenter ou
diminuer les
parametres a I'aide
des touches
flechees.
Au besoin, modifier
d'autres parametres
avec la touche SET
et les touches
flechees.
Terminer la
programmation. Les
parametres sont a
effet immediat et ne
necessitent pas la
mise en memoire.
X
n
13:37 Presentation de I'ecran
220us pour I'electroporation de
cellules d'eucaryotes.
2
Les parametres
0 importants sont donnes
en caracteres plus
grands et en gras.
U: Tension; unite: V
(volt); programmable
par increment de
1 volt sur la gamme
de 20-100 V, par
increment de 10 V
sur la gamme de
100-1000 V, et par
increment de 100 V
sur la gamme de
1000-1200 V.
x: Constante de temps;
unite: us
(microsecondes)
reglable par
increment de 5 us
sur une gamme de
15-500 us.
n: Nombre d'impulsions
au cours de I'essai;
reglable de 1-99; un
temps d'attente de
une minute est
marque entre chaque
impulsion.
Nota: Les parametres programmes sont effectivement utilises. Le deroulement de I'impulsion est mis au point par un calcul interne, de telle sorte
que la courbe de decharge (fonction e) respecte tous les parametres programmes.
Pour I'application d'une impulsion rectangulaire, on peut utiliser le module
pour fusion (voir chap. 5.4).
105
Deuxieme etape: demarrage de I'electroporation
-
Declencher
I'electroporation en
tapant la touche
START.
-
Le cadran indique
13:37
12.AUG.00
"Charge" sur la
U 500V X 220|JS
troisieme ligne: la
Charge
charge est en cours.
-
Au terme de la
phase de charge,
arrive la phase
de decharge,
symbolisee par un
eclair sur le cadran
(3e ligne).
0
Si le nombre
12.AUG.00
13:37
d'impulsions programme U 500V x 220us
est superieur a un, le
Wait
cadran fait apparaitre
le message "Wait"
I 0:57
0
(attendre) avec le
compte a rebours de ce
temps d'attente jusqu'a
Pimpulsion suivante.
Lorsque I'essai est
12.AUG.00
13:37
definitivement termine, U 500V X 220|iS
I'appareil emet un
n
2
double signal sonore.
L'ecran se remet a sa
READY SINCE 1:36
©
position de depart avec
la mention des differents
parametres programmes
et utilises.
Dans la ligne inferieure,
un chronometre indique
le temps ecoule depuis
la fin de I'essai. Ce
message disparait apres
99 minutes ou apres
sollicitation d'une
touche.
106
5.2 Mode bacteries et levures (option)
Le mode est symbolise par le signe OPremiere etape: programmation ou modification des parametres
-
-
Programmer le
12.AUG.00
MODE pour
U 2000V
bacteries et levures,
si necessaire.
Taper la touche SET
pour choisir le
parametre tension
(U) (souligne).
-
Augmenter ou
diminuer les
parametres a I'aide
des touches
flechees
-
Terminer la
programmation. Les
parametres sont a
necessitent pas la
mise en memoire.
X
5 ms pour I'electroporation de
cellules bacteriennes ou
de levures.
O Les parametres
importants sont donnes
en caracteres plus
grands et en gras.
U: Tension; unite:
V (volt);
programmable par
increment de 10 V
sur la gamme de
200-1000 V, et par
increment de 100 V
sur la gamme de
1000-2500 V.
t : Constante de temps;
unite: ms
(millisecondes)
Valeur fixe de 5,0 ms.
107
Deuxieme etape: demarrage de I'electroporation
-
Declencher
I'electroporation
en tapant la touche
START.
-
13:42
12.AUG.00
Le cadran indique
"Charge" sur la
U 2000V % 5 ms
troisieme ligne: la
Charge
-
Lorsque la phase de
charge est terminee,
elle est sulvie par la
phase de decharge,
symbolisee par un
eclair sur le cadran
(3e ligne).
O
Lorsque I'essai est
13:42 U a : Tension mesuree,
12.AUG.00
termine, I'appareil emet U 2000V X 5 ms
effectivement utilisee;
un double signal sonore.
unite: V (volt).
Ua2003V X a 5.1 ms
Constante de temps
position de depart avec READY SINCE 1:36
O xa: mesuree
et
effectivement utilisee;
unite: ms
et utilises. Sur la 3e ligne
(milliseconde); les
figurent les valeurs
valeurs < 0,8 sont
effectives U a et x a .
representees par
0,8 ms.
99 minutes ou apres
sollicitation d'une
touche.
108
5.3 Mode fusion ceilulaire (option)
5.3.1 Fonction: Alignement (Orientation ceilulaire)
Les fonctions de I'alignement sont representees par les symboles U'_
(avant I'impulsion) et U"_ (apres Pimpulsion) aux lignes 2 et 4 du cadran.
Si necessaire,
programmer la
fonction Fusion
a I'aide de la
touche MODE.
pour I'alignement U'_
5V t 60s
Un OV t 15s n2 sans activation de
I'impulsion Un et de
U"_ OV t 30s
I'alignement U"_:
12.AUG.00
U'_.
Taper la touche SET
pour choisir
les parametres
souhaite (souligne).
Les parametres
en caracteres gras de
grande taille.
Augmenter ou
diminuer les
parametres a I'aide
des touches
flechees. Si une
valeurest regleesur
"0" dans les cellules
U L / U ' ^ / U n , la
fonction concernee
n'est pas executee.
U'_ / U"_ peuvent
de cette maniere
etre declenches
individuellement
ou I'un apres I'autre
sans activation de
I'impulsion de
fusion.
U'_/U'L:
Tension alternative,
unite V (volt);
programmable :
"0" et une gamme
de1,0a10Vpar
increments de 0,1 V.
Terminer la
programmation. Les
parametres sont a
necessitent pas la
mise en memoire.
t: Duree de I'alignement
de 0-95 s,
unite: s (secondes)
par increment de 5 s.
Un:Tension, (impulsion
rectangulaire),
unite: le Volt (V)
programmable:
"0" et sur la gamme
de5-100Vpar
increment de 1 V,
sur la gamme
d e l 00-300 V par
increment de 10 V.
t: Duree de I'impulsion,
unite: useconde (us)
programmable sur la
gamme de 0-300 u.s
par increment de 5 us.
0-99, programmable
par increment de 1.
109
Deuxieme etape: Demarrage de I'alignement
-
-
Declencher
I'alignement U'_
en appuyant sur
la touche START.
La quatrieme ligne
de I'afficheur fait
apparaitre le
message / \A/! la
tension alternative
est activee pour la
duree programmee.
Au terme de I'essai
apparatt un double
message sonore et
I'afficheur revient a sa
presentation d'entree
de base avec les
et utilises.
De plus, la ligne
inferieure indique le
temps, en minutes et
secondes, ecoule depuis
la fin de I'essai. Cette
information disparaft
apres 99 minutes ou
des la sollicitation d'une
touche.
110
12.AUG.00
13:42
U'_ 5V t 60s
Un
U\_
OV t 15s n2
OV t 30s
5.3.2 Execution de la fusion ceiiulaire
-
Taper la touche S ET 12.AUG.00
13:42
pourchoisir
U'_ 5V t 30s
les parametres
Un 30V t 15|JS n2
souhaite (souligne). U"~ 5V t 30s
Augmenter ou
diminuer les
parametres a I'aide
12.AUG.00
13:42
des touches
U'
t 30s
ov
flechees. En
un 30V t 15MS n2
fonction de la
U"~ 5V t 30s
programmation
des parametres
UL et U"_, la fusion
peut etre associee,
au choix, sans
alignement, avec
une seule fonction
d'alignement ou
avec les deux
fonctions
d'alignement.
Terminer la
programmation. Les
parametres sont a
necessitent pas la
mise en memoire.
Illustration du cadran
pour Pexecution de
I'electrofusion avec
activation de
I1alignementl)1_/U"_.
Illustration du cadran
pour I'execution de
I'electrofusion sans
activation de I'alignement
Les parametres
en caracteres gras de
grande taille.
Un: Tension; unite: V
(volt); programmable:
"0" et sur la gamme
de5-100Vpar
increment de 1 V,
sur la gamme
d e l 00-300 V par
increment de 10 V.
t: Duree d'impulsion;
unite: us
(microsecondes),
programmable sur la
gamme de 0-300 us
par increment de 5 us.
U'^/U"^:
Tension alternante;
unite: le V (volt);
programmable:
"0" et sur la gamme
de 1,0 a 10 V par
increment de 0,1V.
0-99, programmable
par increment de 1.
111
Deuxieme etape: demarrage de la fusion cellulaire
-
Declencher la fusion
cellulaire en tapant
la touche START.
-
Le cadran indique
12.AUG.00
13:42
brievement
"Charge" sur la
U'_ 5V t 30s
quatrieme ligne: la Un 30V t 15|is n2
Charge
-
Au cours du
12.AUG.00
13:42
processus de
charge, la premiere U'_ 5V t 30s
alternance de
Un 30V t 15MS n2
tension U'^ est
deja presente
2 0:23
G5
pour la duree
programmee.
L'altemance de
tension est indiquee
par le signe ~
(oscillations
sinusoidales).
-
112
Au terme de la
duree d'orientation
programmee
(0-95 secondes), la
decharge intervient,
representee par un
eclairalaquatrieme
ligne. En fonction du
nombre n
programme, et si
n >1, la decharge
suivante aura lieu
une seconde apres.
-
Au terme des
decharges,
I'altemance de
tension U"_ est
presente pour la
duree programmee
(0-99 secondes).
Dans la ligne
inferieure, un
chronometre indique
en permanence le
temps ecoule depuis
le debut de I'essai.
A la fin de I'essai,
13:42
12.AUG.00
I'appareil emet un
U'_ 5V t 30s
double signal sonore.
U n 30V t 15MS n2
U'~ 5V t 30s
position de depart avec
READY SINCE 1:36
et utilises.
99 minutes ou apres
sollicitation d'une
touche.
Nota: Dans le cas d'une programmation U'_/ U"_ = 0, on peut utiliser une
impulsion rectangulaire pour I'electroporation, alors que ce type d'impulsion n'est habituellement accessible que dans la fusion. Dans ce cas
d'espece, I'electroporation a lieu avec le module de fusion ainsi que tous
les parametres y afferents. L'utilisation de Pimpulsion rectangulaire n'est
pas possible en dehors du module pour fusion.
113
6 Messages d'erreurs
En cas de constat d'anomalie, le Multiporator® emet un signal sonore et
indique un message d'erreur a I'ecran ou sur I'imprimante branchee en
option. Ces messages d'anomalie se rapportent soit a une anomalie
technique de I'appareil ou concernent son utilisation. Les messages 1-4
et 9 peuvent se presenter avec le module bacterien, les messages 1-7
avec les cellules d'eucaryotes, et 1-8 avec la fusion cellulaire.
Anomalie
N°
Message
d'erreur
Origine
Remede
01
No Display
Le cadran est hors
commande.
Faire appel au service
apres-vente.
02
No RTC /
NVRAM
Composant
electronique de
Phorloge interne
defectueux.
apres-vente.
03
High Current
Le courant de
decharge
(impulsion) a ete
trap fort.
Diminuer la conductivity
de la solution,
Verifier si le type de
cuve convenait a cette
utilisation.
04
No Cuvette
Absence de cuve.
Mettre en place une
cuve et rectemarrer
I'essai.
Bien engager la logette.
114
05
Timeout
Charge
Le condensateur
n'a pas reussi la
apres-vente.
charge au cours du
temps imparti
depuis le debut de
la charge.
06
Timeout
Charge
Le condensateur
n'a pas reussi sa
charge au cours du
temps imparti dans
le cas compulsions
multiples.
Diminuer la conductivity
de la solution,
utilisation,
6 Messages d'erreurs
Anomalie
N°
Message
d'erreur
Origine
Remede
07
Short x
Le condensateur
s'est completement decharge. II
n'est pas sur que le
x programme ait ete
realise. Le facteur
limitant n'a pas ete
la programmation
de I'impulsion, mais
le condensateur.
Diminuer la conductivite
de la solution.
utilisation.
08
Low Resistance Courant trop fort
dans la cuve; la
tension alternative
n'a pas pu etre
maintenue.
Diminuer la conductivite
de la solution utilisee.
09
Timeout
Measuring x
apres-vente.
Module xa= 0,8 ms,
bacte- U a notablement
trop faible par
rien
rapport au
parametre U
programme
Depassement de
temps lors de la
mesure de x sur le
module bacterien.
-
Saut d'etincelle
dans la cuve.
-
Le courant a
ete trop fort
lors de la
decharge
(impulsion).
-
Anomalie
technique.
-
Utiliser une cuve
avec une fente
d'electrode plus
grande.
-
Diminuer la
conductivite de la
solution utilisee.
-
Faire appel au
service apresvente.
115
7 Maintenance, service apres-vente et entretien
L'appareil ne necessite pas de maintenance reguliere.
La prise en charge de la garantie et de I'apres-vente est assuree par votre
revendeur.
7.1 Disinfection
Avant de proceder a la disinfection du Multiporator®, retirer le cordon
secteur.
Toutes les parties du Multiporator® sont a desinfecter en frottant avec un
produit disinfectant, y compris les accessoires et les cables de
raccordement.
Le module enfichable peut etre desinfecte par pulverisation.
La disinfection par pulverisation de I'ensemble de l'appareil n'est pas
recommandee, le produit disinfectant pouvant penetrer a I'interieur de
l'appareil.
Le produit disinfectant doit etre conforme a la reglementation et les
directives en vigueur.
7.2 Nettoyage
Avant de proceder au nettoyage du Multiporator®, retirer le cordon
secteur.
II convient de bien veiller a ce qu'aucun produit de nettoyage ne penetre
a I'interieur du Multiporator®. Cette precaution permet d'eviter les courtscircuits electriques ainsi que la corrosion.
Les parois peintes et les surfaces en aluminium peuvent etre essuyees
a I'aide d'un chiffon et d'un produit nettoyant doux. Finir le nettoyage en
passant un chiffon sec.
Attention: Ne jamais utiliser de produits corrosifs ou abrasifs, ou encore
de produits a polir.
116
8 Specifications techniques
Tension d'alimentation
et frequence:
Fusibles:
Puissance:
Categorie surtension:
Classe de protection:
Degre de pollution:
Tensions programmables
Module pour
cellules d'eucaryotes:
100-240 V ±10 %, 50-60HZ
TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 fusibles)
60 W
II
I
2
20- 100 V par increment de 1 V
100-1000 V par increment de 10V
1000-1200 V par increment de 100 V
Intervalle entre impulsions: 1 minute
Fusion cellulaire:
0, 5 - 100 V par increment de
1V
100- 300 V par increment de 10 V
Intervalle entre impulsions: 1 seconde
Tensions alternatives : 0, 1,0- 10 V par increment de 0,1 V
200-1000 V par increment de 10V
Bacteries:
1000-2500 V par increment de 100 V
Pas d'impulsions multiples
Condensateur:
10 uF, 2500 V decharge de I'impulsion
600 Q. parallele
Resistance:
56 £2 precedente
< 30 secondes
Duree de charger:
0-99
Nombre d'impulsions n:
Constante de temps x de la decharge:
cellules d'eucaryotes: 15-500 us par increment de 5 us,
fonction decroissante,
5 ms (nominal),
bacteries:
avec une impedance de 3,3 kQ
de Pechantillon,
mesure et affiche de 0,8-6,0 ms
Duree de I'alignement
(Orientation cellulaire):
Programmable sur la gamme 0-95 s
par increment de 5 s
Duree t de I'impulsion
0-300 us par increment de 5 us,
(fusion cellulaire):
impulsion rectangulaire
9600 baud, 8 bit, sans parite,
Interface RS 232:
2 bit stop, XON/XOFF
117
8 Specifications techniques
Temperature ambiante:
Humidite relative ambiante:
Poids:
Dimensions:
40 CC max.
80 % max.
5,5 kg, max.; selon equipement
largeur:
25,2 cm
profondeur: 34,2 cm
hauteur:
12,0 cm
L'appareil comporte marquage •(* £ et I'homologation UL et CSA
(cUL E 1 8089).
Toutes modifications reservees!
118
9 Nomenclature de commande
Code commande
4308 000.015
4308 000.023
4308 000.031
4308 000.040
4308 070.501
4308 070.510
4308 070.528
4308 070.536
4307 000.569
4307 000.593
4307 000.623
4308 078.006
4308 070.072
4308 021.004
4308 012.005
4308 014.008
4308 030.003
4308 024.003
4308 017.007
Multiporator®
version de base pour cellules d'eucaryotes
100-240 V, 50-60 Hz
Multiporator®, pour cellules d'eucaryotes
et module bacterien
Multiporator®, pour cellules d'eucaryotes
et module fusion
Multiporator®, pour cellules d'eucaryotes,
module bacterien et fusion cellulaire
Accessoires
Tampons
Tampon hypo-osmolaire pour electroporation (PH),
les 100 ml
Tampon iso-osmolaire pour electroporation (PI),
les 100 ml
Tampon hypo-osmolaire pour fusion cellulaire (FH),
les 100 ml
Tampon iso-osmolaire pour electroporation (Fl),
les 100 ml
Cuve d'electroporation
Cuve aluminium, sterile, fente de 1 mm, (50 pieces)
Porte-cuve pour 16 cuves d'electroporation
Module enfichable pour electroporation
Module enfichable (electroporation / electrofusion)
pour connexion d'electrodes extemes
Module enfichable pour chambre de fusion
helicoidale
Chambre de fusion helicoidale
fente d'electrode de 0,2 mm
Micro-chambre de fusion cellulaire,
fente d'electrode de 0,2 mm
Module enfichable pour micro-chambre de fusion
cellulaire
Portoir pour 10 chambre de fusion helicoidale
119
9 Nomenclature de commande
0013 608.148
0013 608.172
0013 608.164
6547 001.018
0013 610.517
0013 610.525
0013 610.533
4308 010.002
4308 011.009
120
Thermo-imprimante DPU-414
Bloc secteur pour thermo-imprimante DPU-414;
230 V
Bloc secteur pour thermo-imprimante DPU-414;
115V
Papier thermoimprimable (les 10 rouleaux)
Cable de raccordement
(9 broches, douille, 9 broches fiche, brin a brin)
Cable de raccordement PC nullmodem
(9 broches, douille, 9 broches douille)
Cable de raccordement imprimante
matricielle nullmodem
(9 broches, douille, 25 broches fiche)
Module complementaire pour bacteries
(installation par service apres-vente)
Module complementaire pour fusion cellulaire
(installation par service apres-vente)
Indice
1
Generality
122
2
Uso secondo destinazione
123
3
Avvertenze di sicurezza
124
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.7.1
126
127
128
128
129
129
132
133
4.8.6
4.9
Descrizione dell'apparecchio
Dotazione di fornitura
Messa in esercizio
Camera portacuvetta
Tastiera
Tasti e combinazioni di tasti
Display
Elettroporazione di cellule eucariotiche e batteri / lieviti . . .
Modulo (di elettroporazione)
per il collegamento di elettrodi esterni (optional)
Fusione cellulare (optional)
Ottimizzazione della fusione cellulare
(controllo al microscopio)
Pulizia della micro-camera di fusione
Camera di fusione elicoidale
Riempimento della camera di fusione elicoidale
ed impiego nel modulo di fusione
Esecuzione della fusione
e rimozione della sospensione di cellule
Pulizia e disinfezione della camera di fusione elicoidale...
Collegamento della stampante / Stampante (optional) . . . .
139
140
140
5
5.1
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
Metodologie di lavoro
Modalita per cellule eucariotiche
Modalita per batteri e lievito (optional)
Modo fusione cellulare (opzionale)
Funzione: Alignment (orientamento delle cellule)
Esecuzione della fusione cellulare
144
144
146
148
148
150
6
Messaggi di errore
153
7
7.1
7.2
Manutenzione, assistenza e pulizia
Disinfezion
Pulizi
155
155
155
8
Dati tecnici
156
9
Informazioni per I'ordinazione
158
4.8
4.8.1
4.8.2
4.8.3
4.8.4
4.8.5
134
135
135
136
137
138
121
1 Generality
II Multiporator® e stato appositamente costruito per I'elettroporazione
di cellule eucariotiche con la possibility optional di eseguire
I'elettroporazione di batteri e lievito nonche la fusione cellulare
applicandovi moduli supplementari. Nelle presenti istruzioni per I'uso
vengono illustrate tutte le possibility di impiego del multiporatore.
II Multiporator® si distingue dagli altri apparecchi per il fatto che i
parametri impostati per I'elettroporazione di eucarioti e la fusione cellulare
vengono mantenuti con estrema precisione grazie al calcolo interno della
curva di scarica.
122
2 Uso secondo destinazione
Conformemente a quanto prescritto dalla legge sulla sicurezza delle
apparecchiature e dalle normative industriali:
-
L'apparecchio pud essere utilizzato unicamente
per gli esperimenti di tecnologia cellulare
Lo spettro di applicazione comprende Pelettroporazione di lievito e
batteri e cellule eucariotiche nonche la fusione cellulare.
-
Si devono utilizzare esclusivamente accessor! originali
Eppendorf
Si devono utilizzare esclusivamente accessori originali, poiche
soltanto questi sono stati appositamente costruiti per garantire il
funzionamento ottimale del multiporatore. Le uniche eccezioni sono
costituite dalle apparecchiature supplementari consigliate dal
produttore. In caso contrario si estinguono immediatamente qualsiasi
garanzia e responsabilita dovesse derivare da eventuali danni.
123
3 Avvertenze di sicurezza
Per garantire la sicurezza personale degii operatori e assolutamente
necessario osservare le seguenti avvertenze!
•
Osservare le istruzioni per I'uso
Intervenire unicamente dopo aver letto attentamente le istruzioni per
I'uso!
•
L'apparecchiatura puo essere collegata unicamente a reti di
alimentazione di corrente dotate di conduttore di protezione.
•
Prima della messa in esercizio e necessario controllare che la
tensione indicata sulla targhetta di identificazione dell'apparecchio
corrisponda a quella della rete di alimentazione!
Prima di aprire I'alloggiamento, staccare la spina dalla presa di
corrente!
•
Uapparecchiatura non deve essere utilizzata in ambienti in cui
sussista il pericolo di esplosione!
•
Assicurarsi sempre che nell'apparecchio e nei moduli non possano
penetrare liquidi!
L'apparecchiatura puo essere utilizzata unicamente per applicazioni
in vitro!
Utilizzare I'apparecchio soltanto conformemente alia sua
destinazione!
Non introdurre nella camera portacuvetta component!, apparecchi,
utensili ecc. diversi da quelli descritti dalla Eppendorf AG!
Alta tensione!
124
•
Utilizzare unicamente gli accessori indicati.
Accessori di altri produttori possono essere utilizzati unicamente
dietro rilascio di un nullaosta di compatibilita di impiego dal punto di
vista della sicurezza tecnica da parte della Eppendorf AG!
•
Collegamenti elettrici con apparecchiature non citate nelle presenti
istruzioni per I'uso sono consentiti unicamente dietro colloquio ed
autorizzazione del produttore!
3 Avvertenze di sicurezza
Manipolare con cautela la camera di fusione elicoidale!
Qualora gli elettrodi si fossero staccati o danneggiati, non e piu
garantita alcuna sicurezza di funzionamento! In questo caso, non
utilizzare piu la camera di fusione elicoidale!
Non aprire mai la camera di fusione elicoidale durante la fusione
stessa, bensl attendere il termine della fusione!
Manipolare con cautela la micro-camera di fusione!
Riempire con cautela la sospensione contenente cellule! Se possibile,
non toccare e non spostare gli elettrodi con il puntale della pipetta!
Pericolo di danneggiamento!
Evitare il contatto diretto con gli elettrodi durante I'allineamento/la
fusione cellulare!
L'allineamento/la fusione cellulare possono avvenire unicamente se
la micro-camera di fusione e collegata!
II cavo e previsto soltanto per il collegamento della micro-camera di
fusione! Non sono consentiti altri tipi di collegamento! Non immergere
la spina in liquidi!
La responsabilita per il funzionamento dell'apparecchio viene
sempre trasmessa al proprietario o alPutente dello stesso, purche
I'apparecchio venga sottoposto a manutenzione o riparato da
personale non facente parte del servizio assistenza eppendorf
e venisse impiegato non conformemente alia sua destinazione.
La ditta Eppendorf AG non e responsabile per i danni derivanti
dall'inosservanza delle avvertenze. Le disposizioni previste dalle
condizioni di vendita e consegna della Eppendorf AG riguardanti
garanzia e responsabilita non vengono ampliate dalle precedenti
avvertenze.
La ristampa delle istruzioni per I'uso oppure di parte di esse e
consentita unicamente dietro autorizzazione scritta della
Eppendorf AG!
La ditta Eppendorf AG si riserva il diritto di apportare modifiche
tecniche al presente prodotto!
125
4 Descrizione dell'apparecchio
II multiporatore e disponibile in quattro versioni, e cioe nella versione di
base per I'elettroporazione di cellule eucariotiche, nella prima versione
ampliata con la possibility di effettuare I'elettroporazione di batteri e
lievito, come modulo integrate per la fusione cellulare e nella quarta
versione ampliata, costituita da una combinazione delle altre due.
II multiporatore viene pilotato tramite una tastiera di semplice utilizzo,
accanto alia quale e installata la camera o modulo per la cuvetta da
elettroporazione.
... \
Fig. 1: Multiporator®, vista anteriore
126
I
4 Descrizione deli'apparecchio
4.1 Dotazione di fornitura
Apparecchio di base: Multiporator® per I'elettroporazione di cellule
eucariotiche con cavo di alimentazione
Camera per le cuvette da elettroporazione
Cuvette da elettroporazione
(distanza inter-elettrodo 2 mm, 4 mm)
Sistema tampone iposmolare ed isosmolare per
I'elettroporazione
e manuale di applicazioni base
Modulo batteri optional:
Apparecchio di base compresi gli accessori
con modulo batteri integrato
Cuvette da elettroporazione
(distanza inter-elettrodo 1 mm)
Modulo fusione cellulare optional:
con modulo fusione cellulare integrato
(distanza interelettrodo 0,2 mm))
Modulo per camera di fusione elicoidale
Micro-camera di fusione (distanza interelettrodo 0,2 mm) con vano speciale
Sistema tampone iposmolare ed isosmolare per
la fusione cellulare
Modulo fusione e batteri optional:
con modulo fusione e batteri integrato
127
4.2 Messa in esercizio
Sul retro del multiporatore e installato un connettore dotato dl fusibile
integrato e I'interruttore generale. Per la messa in funzione
dell'apparecchio occorre collegare il cavo di alimentazione a questo
connettore ed, infine, collegarlo alia rete di corrente. Per accendere
I'apparecchio basta azionare I'interruttore generale.
I
1 1 1 1 1 e 11
Fig. 2: Multiporator®, retro
a sinistra
collegamento alia rete
a destr
connettore per la stampante
4.3 Camera portacuvetta
II modulo che alloggia le cuvette per elettroporazione si trova sul lato
frontale dell'apparecchio, accanto alia tastiera. Per estrarre la cuvetta
occorre sfilare il modulo, mentre per inserirne una nuova e necessario
introdurre la punta della cuvetta nella fessura posteriore, quindi si dovra
spingere completamente la camera portacuvetta nell'apparecchio. Inoltre,
nel multiporatore e installato un sensore che rileva la presenza di una
cuvetta nella camera portacuvetta.
Osserva: se occorre spostare I'apparecchio, nella camera portacuvetta
dovra essere inserita una cuvetta vuota oppure la camera dovra essere
trasportata separatamente.
Per le versioni ampliate per la fusione cellulare si utilizzano camere
diverse.
128
4.4 Tastiera
Tramite la tastiera e possibile impostare i parametri necessari, selezionare la modalita di elettroporazione desiderata nonche avviare il procedimento di elettroporazione. A seconda della versione di cui si dispone, si
possono selezionare sino a 4 modalita operative. Inoltre, attivando alcune
combinazioni di tasti si possono impostare la data e I'orario nonche regolare il volume del segnale acustico.
Multiporator
eppendorf
12.OKT.97
13:37
U 500V T 220 MS
1
n
VOLUME
100%
©
Fig. 3: Pannello utente con tasti e display
4.5 Tasti e combinazioni di tasti
SET
Con il tasto SET e possibile selezionare il parametro
desiderato che verra rappresentato sul display con una
sottolineatura. Per selezionare un altro parametro si dovra
premere piu volte il tasto SET sino al parametro desiderato.
Per terminare una sequenza SET, si pud premere
ripetutamente il tasto SET finche la sottolineatura sul
display non scompare oppure si puo premere il tasto
MODE o START (Osserva: il tasto MODE attiva un'altra
modalita, se presente). Con i tasti direzionali, cioe le frecce
su e giu, e possibile modificare corrispondentemente i
parametri desiderati. Una volta raggiunto il valore minimo,
si passa al valore massimo. Lo stesso accade nella
direzione opposta.
129
4 Descrizione deU'apparecchio
MODE
Con il tasto MODE si pud attivare la modalita
operativa con cui si desidera effettuare
I'elettroporazione. Si possono selezionare soltanto
tre modalita, a seconda della versione di cui si
dispone. Cio significa che con il modello piu
avanzato si possono selezionare 3 modalita e con
la versione di base sara disponibile soltanto la
modalita di elettroporazione per cellule eucariotiche.
Sul display verra visualizzato il simbolo
corrispondente:
O
: Modalita per cellule eucariotiche
Versione: apparecchio di base
Impulso utilizzato: funzione esponenziale
decrescente
O
: Modalita per batteri e lievito
Versione: modulo batteri
Impulso utilizzato: funzione esponenziale
decrescente
(£•): Modalita per fusione cellulare
Versione: modulo fusione
Impulso utilizzato: impulso rettangolare
Start
START
Con il tasto START si attiva la corrispondente
funzione.
Tasti direzionali
Con i tasti direzionali, ovvero a freccia, modificano i
parametri selezionati (sottolineati) aumentandoli o
diminuendoli.
130
Impostazione della data
Premendo contemporaneamente i tasti SET e
MODE e possibile attivare la funzione di
impostazione della data e deH'orario. Premendo
ancora il tasto SET, il trattino che sottolinea la data
e I'orario si sposta da sinistra a destra. In questo
modo si possono modificare le impostazioni
utilizzando i tasti direzionali.
Per uscire dalla modalita di impostazione della data
si puo premere ripetutamente il tasto SET finche il
trattino sul display non scompare oppure si puo
premere il tasto MODE o START {Osserva: il tasto
MODE attiva un'altra modalita, se presente).
Start
Regolazione del volume
Premendo contemporaneamente i tasti MODE
e START e possibile attivare la funzione di
regolazione del volume dei segnali acustici.
Premendo questi tasti, neH'ultima riga in basso
sul display viene visualizzato "VOLUME" con una
percentuale. Questa percentuale indica il volume
e puo essere modificata con i tasti direzionali.
Per uscire dalla modalita di regolazione del volume
si puo premere il tasto SET, MODE oppure START
(Osserva: il tasto MODE attiva un'altra modalita, se
presente). L'indicazione "VOLUME" scompare dal
display.
Reset
Per annullare un tentativo di impostazione si puo
soltanto agire sulPinterruttore generate, che funge
anche da tasto di reset.
131
4.6 Display
Nel display i parametri di rilievo per I'esperimento vengono rappresentati
dalla riga 2 alia 4 in scrittura piu grande e in grassetto. I parametri stessi
ed il loro numero dipendono dalla modalita operativa selezionata. Nella
riga piii in alto vengono costantemente visualizzati la data e I'orario,
mentre a destra nella riga piu bassa viene visualizzato il simbolo che
contraddistingue la modalita operativa selezionata:
0
: Modalita per cellule eucariotiche
Versione: apparecchio di base
O
: Modalita per batteri e lievito
Versione: modulo batteri
<£•): Modalita fusione cellulare
Versione: modulo fusione
In questa riga si possono visualizzare anche la funzione "VOLUME"
oppure il tempo residuo dell'esperimento.
12.AUG.00
U 500V
13:37
X
n
VOLUME 100%
220us
1
Esempio di visualizzazione
per la regolazione del volume
0
Durante e dopo resperimento, il display cambia visualizzando di volta in
volta tutte le informazioni necessarie.
132
4.7 Elettroporazione di cellule eucariotiche e batteri/lieviti
I relativi esperimenti vengono eseguiti in cuvette monouso predisponendo
il materiale biologico nella fessura presente tra gli elettrodi, denominata
distanza inter-elettrodo. Non e consentito superare il volume indicato sulla
cuvetta, poiche un livello di riempimento superiore all'altezza degli
elettrodi non compromette I'esperimento di per se, ma ne riduce
notevolmente I'efficacia.
Su un riquadro satinato e possibile scrivere per contrassegnare la
cuvetta.
La punta in plastica sulla cuvetta consente di introdurre la cuvetta
correttamente nella camera portacuvetta. II tappo chiude la cuvetta.
Per proteggere la cuvetta da un'eventuale sovrappressione, il tappo
non e a chiusura ermetica; pertanto, una cuvetta piena dovrebbe essere
trasportata soltanto in verticale, altrimenti potrebbe fuoriuscire materiale
biologico.
r-A-x
Tappo
Cuvetta in plastica
Punta in plastica
Elettrodi
Fessura
Fig. 4: Rappresentazione schematica della cuvetta per elettroporazione
La camera portacuvetta viene estratta dal multiporatore tirandola
dall'apposita impugnatura. La cuvetta viene riempita senza la formazione
di bolle.
La cuvetta viene introdotta nella cavita posteriore della camera
portacuvetta in modo che la punta della cuvetta si inserisca nella fessura
allungata e la cuvetta poggi sul fondo della camera portacuvetta.
Dopodiche, quest'ultima viene spinta nell'apparecchio con la cuvetta cosi
applicata sino alia battuta di arresto.
La camera portacuvetta puo essere conservata refrigerata.
Durante il trasporto dell'apparecchio occorre ricordare che una camera
portacuvetta senza cuvette potrebbe scivolare fuori dall'apparecchio.
133
4.7.1 Modulo (di elettroporazione)
per il collegamento di elettrodi esterni (optional)
Tra gli accessori non di serie (si vedano le informazioni per I'ordinazione)
vi sono un modulo di elettroporazione (simbolo © , scarica di tensione
tramite una funzione esponenziale decrescente) a cui possono essere
collegati elettrodi esterni.
Gli elettrodi devono essere collegati tramite una spina da laboratorio da
4 mm con protezione contra le scariche!
Questo modulo pud essere utilizzato anche nella modalita di fusione
cellulare (simbolo £ • ) , impulso rettangolare) se la tensione alternata
per Pallineamento ("alignement") cellulare viene impostata su "0".
1 Presa di terra (nera)
2 Presa polo positivo (rossa)
Per il collegamento di elettrodi esterni occorre osservare le
avvertenze di sicurezza (alta tensione) e le normative di
compatibilita elettromagnetica nazionali vigenti in material
Tutte le apparecchiature collegate rientrano nella sfera di
responsabilita dell'utente!
134
4.8 Fusione cellulare (optional)
4.8.1 Ottimizzazione delta fusione cellulare
(controllo al microscopio)
Per ottimizzare i parametri della fusione cellulare per le cellule da
analizzare, con una speciaie micro-camera di fusione e possibile seguire
al microscopio sia I'allineamento che la fusione delle cellule.
La micro-camera di fusione viene collegata al modulo con I'apposito cavo
(ca. 1 m).
1
2
Modulo della micro-camera di fusione
1 Contatti
2 Mode di terra
micro-camera di fusione
1 Connettore coassiale
Attenzione: manipolare con cautela la micro-camera di fusione!
Riempire con cautela la sospensione contenente cellule! Se possibile,
non toccare ne spostare gli elettrodi con il puntale della pipetta! Pericolo
di danneggiamento!
Evitare il contatto diretto con gli elettrodi durante rallineamento/la fusione
cellulare!
La fusione puo avvenire unicamente se la micro-camera di fusione e
collegata!
-
Inserire saldamente la micro-camera di fusione nel Multiporator®.
-
Collocare la micro-camera di fusione riempita con ca. 50 ul di
sospensione di cellule sul microscopio.
Avvertenza: pipettando con cautela la sospensione contenente
cellule sugli elettrodi e possibile massimizzare il numero di cellule
tra gli elettrodi.
135
Per fissare la sospensione al banco
del microscopio, si possono
utilizzare, ad esempio, le clip che
vengono utilizzate anche per il
fissaggio di un vetrino.
Collegare la micro-camera di fusione con il cavo.
Mettere a fuoco gli elettrodi e le cellule.
Attivare i parametri impostati con il tasto START continuando
I'osservazione al microscopio.
200
Cellule tra gli elettrodi
nell'allineamento
cellulare (alignement)
Cellule dopo la fusione e prodotti della fusione
La capacita massima della micro-camera di fusione e di ca. 200 uj.
I parametri calcolati ed impostati possono essere impostati ed applicati
direttamente sulla camera di fusione elicoidale.
4.8.2 Pulizia della micro-camera di fusione
Per rimuovere il contenuto della micro-camera di fusione si effettua un
lavaggio con acqua bidistillata (flacone spray), mentre i residui piu
resistenti potranno essere eliminati passando delicatamente uno
spazzolino da denti a setole morbide in direzione longitudinale rispetto
agli elettrodi (attenzione a non modificare la distanza inter-elettrodol).
Per accelerare il processo di asciugatura si puo effettuare un risciacquo
supplementare con alcool etilico (70 %, non denaturato).
136
4.8.3 Camera di fusione elicoidale
La fusione cellulare di un numero maggiore di cellule viene effettuata in
una apposita camera di fusione elicoidale.
Schema delta camera di fusione elicoidale
La camera di fusione elicoidale si compone di un contenitore e di un
nucleo con fili di platino ad avvolgimento parallelo, gli elettrodi. Questi fili
sono avvolti a doppia elica intorno al nucleo. Entrambi i componenti sono
awitati e la fessura tra il contenitore ed il nucleo presenta una capacita
di 250 ul.
La camera di fusione elicoidale viene collegata al modulo di fusione cellulare tramite un connettore coassiale.
Contenitore
Nucleo
1 Filettatura
1 Elettrodi
2 Connettore
coassiale
Camera di fusione
elicoidale
1 Fessura per
fusione cellulare
Modulo di fusione
1 Contatti
2 Connettore
coassiale
137
La distanza tra gli elettrodi in platino avvolti e di ca. 200 |im.
Fig. 5: Immagine al microscopio degli elettrodi della camera di fusione
elicoidale
Attenzione: manipolare con cautela la camera di fusione elicoidale!
Qualora gli elettrodi si fossero staccati o danneggiati, non e piu garantita
alcuna sicurezza di funzionamento! In questo caso, non utilizzare piu la
camera di fusione!
4.8.4 Riempimento della camera di fusione elicoidale
ed impiego nel modulo di fusione
La camera di fusione elicoidale viene riempita con 250 ul di sospensione
contenente cellule. II liquido deve essere pipettato esattamente nella
parte piu profonda del contenitore. Inoltre occorre evitare sempre di
bagnare il bordo o la parete del contenitore, poiche cio potrebbe causare
un riempimento scorretto della camera di fusione elicoidale e si
potrebbero formare bolle d'aria che riducono Pefficacia deH'esperimento.
Tenendo il contenitore in posizione verticale (nel supporto), introdurre con
cautela il nucleo ed awitarlo con cautela nel contenitore. Awitando il
nucleo, la sospensione di cellule viene spinta verso I'alto nella fessura che
diventa sempre piu sottile.
138
Quando si avvita il nucleo occorre assicurarsi che non si formino bolle
d'aria.
Lasciare la camera di fusione elicoidale chiusa e capovolta sul connettore
coassiale sino al momento dell'esecuzione della fusione.
4.8.5 Esecuzione della fusione
e rimozione della sospensione di cellule
- Spingere saldamente il modulo di fusione nell'apparecchio.
-
Applicare la camera di fusione elicoidale (camera elicoidale) chiusa al
connettore coassiale del modulo di fusione e bloccaria ruotandola di
un quarto di giro.
-
La fusione viene eseguita con i parametri impostati (vedi Cap. 5.3).
-
Allentare con cautela la camera di fusione elicoidale ruotando il
connettore coassiale di un quarto di giro e rimuovere la camera.
-
Per aprire, posizionare la camera in verticale, ad esempio nel
supporto.
-
Svitare con cautela il nucleo dal contenitore.
-
Rimuovere la sospensione di cellule dal nucleo sciacquandola con
una piccola quantita di mezzo idoneo.
-
Aggiungere la sospensione di cellule del contenitore alia
sospensione di cellule cosl risciacquata e procedere idoneamente.
139
4.8.6 Pulizia e disinfezione della camera di fusione elicoidale
Subito dopo I'esperimento, il contenitore ed il nucleo della camera di
fusione elicoidale devono essere lavati con acqua distillata per evitare che
i residui possano essiccarsi.
In caso di forte imbrattamento, la camera di fusione elicoidale puo essere
lavata brevemente in un bagno ad ultrasuoni (eventualmente con aggiunta di un detergente, p.e. Edisonite-Super) oppure con uno spazzolino
(da denti) a setole estremamente morbide. Se si utilizza uno spazzolino,
spazzolare in direzione dell'awolgimento, altrimenti si potrebbero
spostare gli elettrodi rendendo inutilizzabile la camera di fusione
elicoidale.
Infine, i componenti dovranno essere disinfettati con alcool etilico (70 %,
non depurato). Per I'asciugatura, collocare la camera in condizioni di
sterilita sul supporto assicurandosi che non vi sia polvere. Una volta
asciutta, la camera di fusione elicoidale potra essere riutilizzata.
4.9 Collegamento della stampante /Stampante (optional)
Per ogni esperimento condotto, il Multiporator® pu6 stampare un
protocollo riportante tutti i parametri applicati, la data e I'orario. Inoltre,
nel protocollo possono essere registrati anche altri parametri riguardanti
resperimento, ad esempio il tampone, la concentrazione, la linea cellulare
ecc, ed in caso di errore vengono stampati sul protocollo anche i relativi
messaggi. Di seguito sono riportati alcuni esempi di protocolli stampati
per le diverse applicazioni:
18.Aug.00 16:03:04
eppendorf
Multiporator 4308
Cuvette Gap Width
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
140
1 mm
T = 50 US,
2mm
V4.00
n= 1
4mm
4 Descnzione dell'apparecchio
18.Aug.00 16:42:47
eppendorf
Multiporator 4308
Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V,
Cuvette Gap Width
1mm
2mm
V4.00
xa = 5.0 ms
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
18.Aug.00 16:17:49
eppendorf
nn
U"_ = 8.0 V,
U = 15 V,
U"_= 4.0 V,
II
Cell Fusion
Multiporator 4308
20 s
100 us,
10 s
V4.00
n=3
Fusion Chamber
Cell Density A
Cell Density B
Buffer
Temperature
141
18.Aug.97 15:59:08
eppendorf
Multiporator 4308
V1.00
* ERROR 07 ********
Short T *
AH'interfaccia seriale della stampante sul retro dell'apparecchio si
possono collegare stampanti seriali ed, inoltre, e possibile stampare
i protocolli con un programma terminale PC per la documentazione.
Per questo programma e necessario un cavo per modem nullo
(presa a 9 poli / presa a 9 poli, codice 0013 610.525).
La Eppendorf AG fornisce le seguenti stampanti termiche. A titolo
esemplificativo e riportata anche la configurazione DIP per una
stampante IBM compatibile:
Codice
Tipo
di stampante
ThermoprinterDPU-414
0013 608.148
Accessor!
Alimentatore (230 V)
0013 608.172
Alimentatore(115V)
0013 608.164
Carta termica (10 rotoli)
6547 001.018
Cavo
Presa a 9 poli / spina a 9 poli
di allacciamento Guidacavo 1:1
(perThermoprinter DPU-414)
0013 610.517
Presa a 9 poli / spina a 25 poli
0013 610.533
Cavo per modem nullo
(IBM compatibile)
ad esempio per stampante
a matrice
Seikosha SP 2400 (moduli continui)
142
4 Descrizione deU'apparecchio
DIPSW
settings
Per Thermoprinter DPU-414
p.e. per stampante
a matrice
Seikoshi1SP2400
(moduli continui)
Dip SW-1
Dip SW-1
= Enable
6 (OFF) : Printing
7 (ON) : Density
8 (ON) : = 100%
1 (OFF) : USA
2 (OFF) : USA
3 (OFF) : USA
4 (ON) : IBM
6 (ON) : 12 inches
7 (OFF) : LF only
8 (ON) : CR = CR + LF
Dip SW-2
Dip SW-2
1 (OFF) : Printing Columns = 80
= ON
= Normal
6 (ON) : Character
7 (ON) : Set
8 (OFF) : = USA
1 (ON)
2 (ON)
3 (ON)
4 (OFF)
5 (OFF)
6 (OFF)
7 (ON)
8 (OFF)
: 9600 Baud
: 9600 Baud
: XON/XOFF
: No Parity
: No Parity
: 8 bits
: Serial
: No single sheet
Dip SW-3
= Odd
4 (OFF) : Busy Control
= XON/XOFF
5 (OFF): Baud
6 (ON) : Rate
7 (ON) : Select
8 (ON) : = 9600 bps
143
5 Metodologie di lavoro
5.1 Modalita per cellule eucariotiche
Questa modalita viene visualizzata sul display con II slmbolo © .
Fase 1 - Impostazione e modifica dei parametri
Se necessario,
commutare sulle
cellule eucariotiche
con il tasto MODE.
Premere il tasto
SET per selezionare
il parametro
desiderato
(sottolineatura).
Aumentare o
diminuire i valori dei
parametri per mezzo
dei tasti freccia.
All'occorrenza,
modificare altri
parametri con il
tasto SET e i tasti
direzionali.
Terminare
I'impostazione.
I parametri sono
immediatamente
attivi e non e
necessario
memorizzarli.
12.AUG.00
U 500V
13:37
t
n
2
Esemplo di
visualizzazione per
I'elettroporazione di
cellule eucariotiche.
0 I parametri rilevanti
vengono visualizzati in
grassetto e a caratteri
grandi.
U: Tensione,
unita di misura V
(Volt), regolabile nel
range da 20 a 100 V
a passi di uno,
da 100 a 1000 V
a passi di dieci e
da 1000 a 1200 V
a passi di cento.
v. Costante di tempo,
unita di misura us
(microsecondi),
regolabile nel range
da 15 a 500 us
a passi di 5 us.
n: Numero di impulsi
durante
I'esperimento,
regolabile nel range
da 1 a 99. Tra gli
impulsi vi e un
intervallo di attesa
di un minuto.
Osserva: i parametri impostati vengono effettivamente adottati.
Landamento deH'impulso viene calcolato internamente in modo che
I'andamento della curva di scarica (funzione esponenziale) venga
mantenuto in funzione dei parametri impostati.
Per I'utilizzo di un impulso rettangolare e possibile impiegare il modulo di
fusione (a tale proposito, si veda il Cap. 5.4).
144
Fase 2 - Avvio dell'elettroporazione
-
Avviare
I'elettroporazione
premendo il tasto
START.
-
Nella terza riga
del display viene
visualizzata
I'informazione
"Charge", la carica
viene avviata.
-
12.AUG.00
U 500V
13:37
x
220|JS
Charge
©
Al termine della
carica ha luogo
la scarica,
rappresentata da
un fulmine nella
terza riga.
Se e stato impostato piu 12.AUG.00
13:37
di un impulso, sul display U 500V x 220us
viene visualizzato il
Wait
messaggio "Wait"
(Attendi) con il tempo di
g 0:57
©
attesa rimasto.
Al termine
13:37
12.AUG.00
delPesperimento si
U 500V X 220us
inserisce un segnale
2
n
acustico doppio e viene
nuovamente visualizzata READY SINCE 1:36
0
la videata iniziale con i
parametri impostati ed
applicati.
Inoltre, nella riga piu in
basso del display viene
indicato il tempo in
minuti e secondi
trascorso dalla fine
delPesperimento. Dopo
99 minuti oppure dopo
aver attivato un tasto,
questa indicazione
sparisce.
145
5.2 Modalita per batteri e lievito (optional)
Questa modalita viene visualizzata sul display con il simbolo OFase 1 - Impostazione e modifica dei parametri
Se necessario,
commutare su
batteri e lieviti con
il tasto MODE.
Premere il tasto
SET per selezionare
il parametro
desiderato Tensione
(U) (sottolineatura).
Aumentare o
parametri per mezzo
dei tasti freccia.
Terminare
I'impostazione.
I parametri sono
immediatamente
attivi e non e
necessario
memorizzarli.
146
U 2000V
Esempio di
visualizzazione
per
5 ms
Pelettroporazione di
batteri e lievito.
13:42
12.AUG.00
T
O I parametri rilevanti
grandi.
U: Tensione,
unitadi misuraV
(Volt), regolabile nel
range da 200 a 1000 V
a passi di dieci e
a 1000 a 2500 V
a passi di cento.
T: Costante di tempo,
unita di misura ms
(millisecondi),
regolazione fissa
su 5,0 ms.
Fase 2 -Avvio dell'elettroporazione
-
Avviare
I'elettroporazione
premendo il tasto
START.
-
Nella terza riga
del display viene
visualizzata
Pinformazione
"Charge", la carica
viene avviata.
-
12.AUG.00
U 2000V
13:42
x 5 ms
Charge
O
Al termine della
carica ha luogo
la scarica,
rappresentata da
un fulmine nella
terza riga.
12.AUG.00
13:42 U : Tensione misurata
Al termine
a
effettivamente
dell'esperimento si
U 2000V t 5 ms
applicata, unita di
misura V (Volt).
acustico doppio e viene Ua2003V Ta5.1 ms
O
nuovamente visualizzata READY SINCE 1:36
xa: Costante di tempo
misurata
effettivamente
applicati. Nella terza riga
applicata, unita
del display vengono
visualizzati i parametri
QI misura ms
effettivi LL e T~
(millisecondi), i valori
< 0,8 vengono
visualizzati come
0,8 ms.
minuti e secondi
dell'esperimento. Dopo
questa indicazione
sparisce.
^J I 1 x^ I I I
V1
%^ r% ^ ^
rt
B
147
5.3 Modo fusione cellulare (opzionale)
5.3.1 Funzione: Alignment (orientamento delle cellule)
Le funzioni per I'alignment vengono rappresentate con i simboli U'_
(prima dell'impulso) e U"_ (dopo I'impulso) nelle righe 2 e 4 del display.
Se necessario
commutare su
fusione per mezzo
del tasto MODE.
Premere il tasto
SET perselezionare
i para-metri
desiderato
(sottolineatura).
Aumentare o
parametri per mezzo
dei tasti freccia. Se
nelle righe U 1 ../IT./
Un un valore viene
impostato su "0",
la relativa funzione
non viene eseguita.
In tale maniera e
possibile attivare U'_
/ U"_ singolarmente
0 in successione
senza dover attivare
I'impulso di fusione.
Terminare
I'impostazione.
1 parametri sono
immediatamente
attivi e non e
necessario
memorizzarli.
13:42 Esempio del display per
I'esecuzione
5V t 60s
OV t 15s n2 dell'alignment U'_ senza
attivazione dell'impulso
OV t 30s
CD Un e dell'alignment U"_.
12.AUG.00
U'_
Un
U".
I parametri rilevanti
grandi.
UL / U"_:
Tensione alternata,
unita di misura
V (Volt), regolabile:
"0" e nel range
da1,0a10V
apassi di 0,1 V.
t: Durata dell'alignment
0-95 s, unita s
(secondi) a passi di 5.
U n : Tensione,
(impulso rettangolare), unita di misura
V (Volt), regolabile:
"0" e nel campo
5-100 V in passi
da1 V, da 100-300 V
in passi da 10 V.
t: Durata dell'impulso,
unita di misura us
(microsecondi)
regolabile 0-300 us
in passi da 5 us 0-99.
0-99, regolabile in
passi singoli.
148
Fase 2 - Partenza dell'alignment (orientamento delle cellule)
-
-
Provocare
Pallineamento U'_
premendo il tasto
START.
12.AUG.00
13:42
U'_
5V t 60s
un OV t 15s n2
U"_ OV t 30s
Nella quarta riga del
display viene
visualizzata
I'informazione / \ A / !
la tensione alternata
verra applicata per
la durata
selezionata.
Al termine
deU'esperimento si
acustico doppio e
viene nuovamente
visualizzata la videata
iniziale con i parametri
impostati ed applicati.
basso del display
viene indicato il tempo
in minuti e secondi
deU'esperimento. Dopo
questa indicazione
sparisce.
149
5.3.2 Esecuzione della fusione cellulare
Premere il tasto
12.AUG.00
13:42
SET perselezionare U'_ 5V t 30s
i para-metri
Ur, 30V t 15|js n2
desiderato
U",. 5V t 30s
(sottolineatura).
CD
Aumentare o
diminuire i valori
dei parametri per
mezzo dei tasti
freccia. A seconda
dei parametri
selezionati per U'_
e U"_ la fusione
pud avvenire
a scelta senza
alignment, con
solo una o
con entrambe
le funzioni di
alignment.
Terminare
I'impostazione.
I parametri sono
immediatamente
attivi e non e
necessario
memorizzarli.
12.AUG.00
U'_
OV t 30s
Un 30V t 15MS
U".
5V t 30s
Esempio del display per
I'esecuzione dell'elettrofusione con alignment
U1.. / U\ attivato.
Esempio del display per
I'esecuzione dell'elettrofusione con alignment
n2 U'_ disattivato.
13:42
I parametri rilevanti
CD vengono
visualizzati in
grandi.
UrfTensione, unita
di misuraV(Volt),
regolabile:
"0" e nel campo
5-100 V in passi
da 1V, da 100-300 V
in passi da 10 V.
t: Durata dell'impulso,
unita di misura us
(microsecondi),
regolabile 0-300 u.s
in passi da 5 us.
U'_ / U"j.
Tensione alternata,
unita di misura V
(Volt), regolabile:
"0" e nel range
da1,0a10V
a passi di 0,1 V.
0-99, regolabile in
passi singoli.
150
5 Metodologie di ilavoro
Fase 2 - Avvio delta fusione eellulare
-
Avviare la fusione
cellulare premendo
il tasto START.
-
13:42
Nella quarta riga del 12.AUG.00
display compare
U'_ 5V t 30s
brevemente
Up 30V t 15|JS n2
Pinformazione
Charge
"Charge", la carica
viene generata.
-
13:42
Durante il processo 12.AUQ.00
di carica per la
U'_ 5V t 30s
durataselezionatae U n 30V t 15|/s n2
gia applicata la
tensione altemata
§ 0:23
<S3
I L . La tensione
alternata viene
mostrata anche
tramite ~
(oscillazione
sinusoidale).
-
Dopo il tempo
di alignment
conteggiato
(0-95 secondi)
avviene la scarica,
rappresentata da un
fulmine nella quarta
riga. A seconda del
numero n inserito,
nel caso n >1 ogni
volta dopo un
secondo avviene
una ulteriore
scarica.
151
-
Al termine delle
scariche, per la
durata impostata
(0-99 secondi) e
presente la tenslone
alternata U"_.
II tempo
complessivo rimasto
per I'esperimento
vlene visualizzato
costantemente nella
riga piu In basso del
display.
Al termine
13:42
12.AUG.00
dell'esperimento si
U'_ 5V t 30s
Un 30V t 15|js n2
acustico doppio e viene U"_ 5V t 30s
nuovamente visualizzata
READY SINCE 1:36
applicati.
Inoltre, nella riga piii in
minuti e secondi
delPesperimento. Dopo
questa indicazione
sparisce.
Awertenza; se UL / U"_ e impostato su "0", per I'elettroporazione si
potra utilizzare anche l'impulso rettangolare altrimenti accessibile soltanto
per la fusione. In questo caso, I'elettroporazione awiene con il modulo di
fusione adottando i rispettivi parametri. L'impulso rettangolare non puo
essere utilizzato senza il modulo di fusione.
152
6 Messaggi di errore
In caso di anomalie di funzionamento, il Multiporator® emette un segnale
acustico e visualizza un messaggio di errore sul display oppure lo stampa
tramite la stampante eventualmente collegata (optional). Questi messaggi
si riferiscono ad anomalie di funzionamento dell'apparecchio oppure ad
errori che si verificano in seguito ad un impiego errato. Gli errori 1-4 e 9
possono presentarsi durante I'impiego del modulo batteri, mentre gli errori
1-7 con le cellule eucariotiche e 1-8 per la fusione cellulare.
Errore Messaggio
n.
Causa
01
No Display
II display non viene Avvisare il servizio
attivato.
assistenza tecnica.
02
No RTC /
NVRAM
II modulo
Avvisare il servizio
elettronico del timer assistenza tecnica.
interno e difettoso.
03
High Current
L'amperaggio
durante la scarica
(impulso) era
eccessivo.
04
No Cuvette
Non e stata inserita Inserire la cuvetta,
la cuvetta.
avviare di nuovo.
Rimedio
Ridurre la conduttivita
della soluzione
utilizzata.
Assicurarsi di aver
inserito il tipo di cuvetta
idoneo.
Spingere la camera
portacuvetta
completamente
nell'apparecchio.
05
Timeout Charge Non e stato
possibile caricare i
condensatore nel
tempo di carica
previsto.
assistenza tecnica.
06
Timeout Charge Con I'impostazione Ridurre la conduttivita
ad impulsi multipli, della soluzione
utilizzata.
non e stato
Assicurarsi di aver
possibile caricare
per tempo il
idoneo.
condensatore tra
i singoli impulsi.
153
6 Messaggi di errore
Errore Messaggio
n.
Causa
Rimedio
07
II condensatore si e
completamente
scaricato. Non e
possibile stabilire
se il valore x
impostato e stato
effettivamente
applicato. II
componente di
limitazione non era
la regolazione degli
impulsi, bensi il
condensatore.
Ridurre la conduttivita
della soluzione
utilizzata.
Short x
08
Low Resistance Corrente eccessiva Ridurre la conduttivita
della soluzione
nella cuvetta. Non
utilizzata.
e possibile
mantenere
costante ia
tensione alternata.
09
Timeout
Measuring x
Modul x a = 0,8 ms,
o
Ua
batteri notevolmente
inferiore al
parametro U
impostato
Time-out nella
misurazione di x
del modulo batteri.
assistenza tecnica.
Scintille nella
cuvetta.
Utilizzare una
cuvetta con una
distanza interelettrodo maggiore.
L'amperaggio
durante la
scarica
(impulso) era
eccessivo.
Ridurre la
conduttivita della
soluzione utilizzata.
Guasto di
natura tecnica.
154
Assicurarsi di aver
idoneo.
-
assistenza tecnica.
7 Manutenzione, assistenza e pulizia
Non e indispensabile sottoporre I'apparecchio ad una manutenzione
regolare.
La garanzia e I'assistenza sono di competenza del fornitore.
7.1 Disinfezion
Prima di procedere alia disinfezione del multiporatore occorre staccare la
spina dalla presa di corrente.
Tutti i componenti del multiporatore, compresi gli accessori ed il cavo di
collegamento devono essere sottoposti ad una disinfezione superficiale.
La camera portacuvetta puo essere sottoposta ad una disinfezione a
spruzzo.
La disinfezione a spruzzo non e consigliabile per I'apparecchio, poiche
all'interno del multiporatore potrebbe penetrare disinfettante
II metodo di disinfezione applicato deve essere conforme alle normative
ed alle disposizioni vigenti in materia di disinfezione sul luogo di utilizzo.
7.2 Pulizi
Prima di procedere alia pulizia del multiporatore occorre staccare la spina
dalla presa di corrente.
Assicurarsi che non penetrino liquidi all'interno del multiporatore, poiche
si potrebbero verificare cortocircuiti nell'installazione elettrica e si
potrebbe provocare la corrosione.
I componenti vemiciati e le superfici in alluminio dovranno essere
strofinati con un panno morbido ed un detergente delicato ed asciugati
con un panno asciutto.
.Attenzione: non utilizzare detergenti o prodotti lucidanti corrosivi,
solventi o abrasivi.
155
8 Datitecnici
Tensione/Frequenza:
Fusibili:
Potenza assorbita:
Categoria di sovratensione:
Classe di protezione:
Grado di imbrattamento:
Tensione regolabile
(Modulo per):
Cellule eucariotiche:
100-240 V ±10 %, 50-60 Hz
TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 pezzi)
60 W
II
I
2
2 0 - 100 V a passi di
1V
100-1 000 V a passi di 10 V
1000-1 200 V a passi di 100 V
Intervallo di impulso: 1 minuto
Fusione cellulare:
0,
Batteri:
200-1 000 V a passi di 10 V
1 000-2 500 V a passi di 100 V
Nessun impulso multiplo
10 uF, 2 500 V scarica impulsi
5- 100 V a passi di
1V
100- 300 V a passi di 10 V
Intervallo di impulso: 1 secondo
Tensione alternata: 0, 1,010 V a passi di 0,1V
Condensatore:
Resistenza:
600 LI parallela
56 Q a monte
Durata di carica:
<30 secondi
Numero di impulsi n:
0-99
Costante di tempo x della scarica:
Cellule eucariotiche: 15-500 us regolabile a passi di 5 us,
funzione esponenziale decrescente
Batteri:
nominale 5 ms
con un'impedenza del campione di 3,3 ka
Misurazione e visualizzazione di 0,8-6,0 ms
Durata delPalignment
(orientamento delle cellule): 0-95 s regolabile in passi da 5 s
Durata t dell'impulso
(Fusione cellulare):
0-300 us regolabile a passi di 5 us,
impulso rettangolare
Interfaccia RS 232:
9 600 baud, 8 bit, nessuna parita,
2 bit di stop, XON/XOFF
max. 40 °C
Temperatura ambiente:
Umidita ambiente relativa: max. 80 %
156
8 Datitecnici
Peso:
Dimensioni:
max. 5,5 kg
Larghezza:
Profondita:
Altezza:
L'apparecchio e dotato del marchio
( c l I L E 158089).
(a seconda della versione)
25,2 cm
34,2 cm
12,0 cm
e della certificazione UL e CSA
Con riserva di modifiche tecniche!
157
9 Informazioni per I'ordinazione
Codice
4308 000.015
4308 000.023
4308 000.031
4308 000.040
4308 070.501
4308 070.510
4308 070.528
4308 070.536
4307 000.569
4307 000.593
4307 000.623
4308 078.006
4308 070.072
4308 021.004
4308 012.005
4308 014.008
4308 030.003
158
Multiporator®
Versione base per cellule eucariotiche
100-240 V, 50-60 Hz
Multiporator®, per cellule eucariotiche ed
ampliamento con modulo batteri
ampliamento con modulo fusione cellulare
ampliamento con modulo batteri e fusione cellulare
Accessori
Tamponi
Tampone iposmolare per elettroporazione (PH),
100 ml
Tampone isosmolare per elettroporazione (PI),
100 ml
Tampone iposmolare per fusione cellulare (FH),
100 ml
Tampone isosmolare per fusione cellulare (Fl),
100 ml
Cuvette per elettroporazione
Distanza inter-elettrodo 1 mm, alluminio, sterile,
50 pezzi
50 pezzi
50 pezzi
Supporto per 16 cuvette per elettroporazione
Camera per cuvette per elettroporazione
Modulo (di elettroporazione / elettrofusione)
per il collegamento di elettrodi esterni
Modulo per la camera di fusione elicoidale
(distanza inter-elettrodo 0,2 mm)
Micro-camera di fusione
(distanza inter-elettrodo 0,2 mm)
9 Informazioni per I'ordinazione
4308
4308
0013
0013
024.003
017.007
608.148
608.172
0013 608.164
6547 001.018
0013 610.517
0013 610.525
0013 610.533
4308 010.002
4308 011.009
Modulo per micro-camera di fusione
Supporto per 10 camera di fusione elicoidale
Stampante termica DPU-414
per stampante termica DPU-414
per stampante termica DPU-414
Carta termica (10 rotoli)
Cavo di allacciamento
(presa a 9 poli / spina a 9 poli, guidacavo 1:1)
Cavo per modem nullo di collegamento PC
(presa a 9 poli / presa a 9 poli)
Cavo per modem nullo per stampante a matrice
(presa a 9 poli / spina a 25 poli)
Kit di ampliamento batteri
(installazione a cura del servizio assistenza tecnica)
Kit di ampliamento fusione cellulare
(installazione a cura del servizio assistenza tecnica)
159
Contenido
1
Generates
161
2
Aplicaciones
162
3
Avisos de seguridad
163
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
165
166
167
167
168
168
171
4.8.5
4.8.6
4.9
Description del aparato
Volumen de suministro
Puesta en servicio
Unidad 'plug-in' de cubeta
Teclado
Teclas y combinaciones de teclas
Display
Electroporacion de celulas eucariotas
y de bacterias / levaduras
Unidad 'plug-in' (Electroporacion)
para la conexion de electrodos externos (Opcion)
Fusion celular (Opci6n)
Optimacion de la fusion celular
(Control bajo el microscopio)
Limpieza de la micro-camara de fusion
Camara de fusion Helix
Llenar la camara de fusion Helix y colocar
en la unidad 'plug-in' de fusion
Realizar la fusion y toma de la suspension celular
Limpieza y desinfeccion de la camara de fusion Helix . . . .
Conexion de impresora / Impresora (Opcion)
177
178
179
179
5
5.1
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
Tecnicas de trabajo
Modo Celulas eucariotas
Modo Bacterias y levaduras (Opcion)
Modo fusion celular (Opcion)
Funcion: alineacion celular (alineamiento)
Ejecucion de la fusion celular
183
183
185
187
187
189
6
Mensajes de error
192
7
7.1
7.2
Mantenimiento, servicio y cuidado
Desinfeccion
Limpieza
194
194
194
8
Datos tecnicos
195
9
Informaciones depedido
197
4.7.1
4.8
4.8.1
4.8.2
4.8.3
4.8.4
160
172
173
174
174
175
176
1 Generales
El Multiporator® esta concebido para la electroporacion de celulas
eucariotas. Como option existe la posibilidad de realizar la
electroporacion en bacterias y levaduras asf como la fusion celular con
otros modulos. En estas instrucciones se tratan todas las variantes del
uso del Multiporator®.
El Multiporator® se caracteriza porque en la electroporacion de celulas
eucariotas y en la fusion celular los parametros programados deben
cumplirse exactamente mediante calculo interno de la curva de descarga.
161
2 Aplicaciones
La ley sobre seguridad de aparatos y las normas industriales prescriben:
162
-
Usar el aparato solo para experimentos tecnologico celulares
El espectro de aplicaciones comprende la electroporacion de
levaduras y de bacterias y de celulas eucariotas asf como la fusion
celular.
-
Usar solo accesorios originales Eppendorf
Solo deben usarse piezas accesorios originales. Estan adaptadas
al funcionamiento optimo del Multiporator. Solo se excluyen los
aparatos complementarios recomendados por el fabricante. De lo
contrario se pierden inmediatamente todos los derechos de garanti'a
y de responsabilidad.
3 Avisos de seguridad
jLas normas siguientes deben cumplirse necesariamente por seguridad
personal!
•
Observar las instrucciones de uso
jProceder solamente segun las instrucciones de uso !
•
El aparato solo debe ponerse en servicio en redes de abastecimiento
con toma de tierra.
jAntes de la puesta en servicio deben compararse los datos de
tension indicados en la placa de caracterfsticas con las condiciones
de la red!
•
jAntes de abrir la carcasa desconectar el enchufe de red!
•
jEl aparato no debe ponerse en servicio en locales sujetos a
explosion!
•
jHa de garantizarse que no penetren Ifquidos en el aparato o en las
unidades 'plug-in'!
•
|EI aparato esta previsto solamente para aplicaciones invitro!
•
Usar el aparato solo para el uso descrito.
jNo meter en la unidad 'plug-in' de la cubeta otras piezas, aparatos,
herramientas etc. que las descritas por Eppendorf AG!
jAlta tension!
•
Usar solo los accesorios indicados.
jUsar solamente otro tipo de accesorios, si se dispone de un
certificado de aplicacion sin problemas desde el punto de vista de la
tecnica de seguridad de Eppendorf AG!
•
jSolo se permiten acoplamientos electricos con aparatos que no
esten mencionados en esas instrucciones de uso, tras consulta previa
y autorizacion del fabricante!
163
3 Avisos de seguhdad
jTratar con sumo cuidado la camara de fusion Helix!
i Estando los electrodos sueltos o deteriorados, no puede garantizarse
mas un proceso seguro! jEn este caso no usar mas la camara de
fusion Helix!
jNo abrir la camara de fusion Helix durante la fusion sino esperar a
que finalice esta!
jTratar con sumo cuidado la micro-camara de fusion!
iLlenar con cuidado suspension celular! jA ser posible, no tocar ni
mover los electrodos con la punta de la pipeta! jPeligro de lesion!
iEvitar el contacto directo con los electrodos durante la alineacion
celular/fusion!
164
•
jLa alineacion celular/fusion solo debe tener lugar estando conectada
la micro-camara de fusion!
|EI cable esta concebido solamente para la conexion a la microcamara de fusion! jProhibidas todas las demas conexiones! jNo
meter el enchufe en li'quidos!
•
En cualquier caso, la responsabilidad del aparato pasa a! propietario
o cliente, en caso de que el aparato sea mantenido o reparado por
personas, que no pertenezcan al servicio tecnico de Eppendorf, y si
se maneja de una manera que no corresponda con el uso adecuado.
La empresa Eppendorf AG no se responsabiliza de danos resultantes
del incumplimiento de las indicaciones. Las reglas de garanti'a y de
responsabilidad de las condiciones generales de venta y de
suministro de la empresa Eppendorf AG no seran complementadas
con las indicaciones anteriores.
•
jSolo se permite la reproduction total de las instrucciones de uso o
de partes de ellas con autorizacion escrita de Eppendorf AG!
•
j Eppendorf AG se reserva el derecho de realizar modificaciones
tecnicas en bien del producto!
4 Description del aparato
El aparato se ofrece en cuatro fases de capacidad. Como aparato base
para la electroporacion de celulas eucariotas, como fase con la
posibilidad adicional de electroporar bacterias y levaduras. Como fase
siguiente se dispone de un modulo integrado para la fusion celular. Estas
dos fases tambien pueden adquirirse juntas como cuarta variante.
El Multiporator® se maneja con un teclado bien compresible equipado
con display. Junto al bloque del teclado se encuentra la unidad 'plug-in'
para la cubeta de electroporacion.
Fig. 1: Multiporator®, vista frontal
165
4.1 Volumen de suministro
Aparato base:
Multiporator® para la electroporacion de celulas
eucariotas con cable de red
Unidad 'plug-in' para cubetas de electroporacion
Cubetas de electroporacion
(distancia de electrodos 2 mm, 4 mm)
Amortiguacion hiposmolar
e isosmolar para electroporacion
y manual de aplicacion basico
Opcion modulo de bacterias:
Aparato base incl. accesorios
con modulo de bacterias integrado
adicionalmente cubetas de electroporacion
(distancia de electrodos 1 mm)
Opcion modulo de fusion celular:
con modulo de fusion celular integrado
Camara de fusi6n Helix
(distancia de electrodos 0,2 mm))
Unidad 'plug-in' para camara de fusidn Helix
Micro-camara de fusion (distancia de electro
dos 0,2 mm) con unidad 'plug-in' especial
Amortiguacion hiposmolar e isosmolar
para fusion celular
Opcion mddulo de fusion y de bacterias:
con modulo de fusion y de bacterias integrado
166
4.2 Puesta en servicio
En el trasero del Multiporator® se encuentra la clavija de entrada de red
con fusible e interruptor de red. Para la puesta en servicio, insertar el
cable de red en la clavija de entrada de red y unir a continuacion con la
red. Conectar el aparato con el interruptor de red.
IIIIMII
•;:,'?
Fig. 2: Multiporator®, trasero
Lado izquierdo conexion de red
Lado derecho
conexion de impresora
4.3 Unidad'plug-in'de cubeta
La unidad 'plug-in' para las cubetas de electroporacion se encuentra en el
frente del aparato junto al bloque del teclado. Para quitar la cubeta, sacar
la unidad 'plug-in'. Una nueva cubeta se coloca de tal modo que la
pestana de la cubeta ajusta en la ranura trasera. Introducir la unidad de
cubetas 'plug-in' completamente en el aparato con la cubeta. En el
aparato se encuentra un sensor, que comprueba si hay una cubeta en la
unidad de cubetas 'plug-in'.
Anotacion: Si se debe transportar el aparato, deberia estar equipada la
unidad 'plug-in' con una cubeta vacfa o transportarse por separado.
Para la fase de capacidad Fusion celular se usan otras unidades 'plug-in1.
167
4.4 Teclado
A traves del teclado se introducen parametros y se seleccionan los
modos deseados de electroporacion y se arranca tambien la
electroporacidn. Segun la fase de capacidad pueden seleccionarse de
1 a 4 modos. Mediante combinaciones de teclas se pueden ajustar
ademas la fecha y la hora asi como el volumen de la serial acustica.
Multiporator
eppendoif
U 500V x 220 us
/PLUME
n
1
100%
Fig. 3: Superficie de manejo con teclas y display
4.5 Teclas y combinaciones de teclas
SET
Con la tecla SET se selecciona el parametro deseado.
Se representa este con una subraya en el display. Para
seleccionar otro parametro, se pulsa a menudo la tecla
SET. Para finalizar una secuencia SET, se puede pulsar
la tecla SET tan a menudo hasta que la subraya en el
display no este mas o pulsando la tecla MODE o START
(Anotacion: la tecla MODE conmuta a otro modo, si esta
disponible). Con las teclas de fecha arriba/abajo se
cambian los parametros correspondientes. Una vez
alcanzado el valor mmimo, se salta al valor maximo.
Lo mismo ocurre en el otro sentido.
168
MODE
Con la tecla MODE se activa el modo deseado, con
el que se debe realizar la electroporacion. Solo se
pueden seleccionar Ios modos que corresponden a
la fase de capacidad del aparato. Es decir, para la
fase maxima de ampliation se encuentran
disponibles de 3 modos y para la version base, el
modo para celulas eucariotas.
En el display aparece entonces el sfmbolo
correspondiente:
0
: Modo para celulas eucariotas
Fases de capacidad: aparato base
Impulso empleado: funcion - e
de decrecimiento
O
: Modo para bacterias y levaduras
Fases de capacidad: modulo de bacterias
Impulso empleado: funcion - e
de decrecimiento
G 3 : Modo para la fusion celular
Fases de capacidad: Modulo de fusion
Impulso empleado: impulso rectangular
Start
START
Con la tecla START se dispara la aplicacion
correspondiente.
Teclas de flecha
Con las teclas de flecha se cambian creciente o
decrecientemente Ios parametros seleccionados
(subrayados).
169
Ajustar la fecha
Pulsando simultaneamente las teclas SET y MODE
se puede activar el ajuste de fecha y de hora.
Pulsando de nuevo la tecia SET, la subraya salta de
izqulerda a derecha en la indicacion de fecha y
hora. De este modo pueden cambiarse los ajustes
con las teclas de flechas.
Para finalizar el ajuste de la fecha, se puede pulsar
la tecia SET tantas veces hasta que la subraya no
aparezca mas en el display o pulsando la tecia
MODE o START (Anotacion: La tecia MODE
conmuta a otro modo, si esta disponible).
Start
Regular el volumen
Pulsando simultaneamente las teclas MODE y
START se puede activar la regulaci6n de volumen
para las senales acusticas. Con ello aparece en la
Imea inferior del display la indicacion "VOLUME"
con un porcentaje. Esta cifra indica el volumen. La
cifra se puede cambiar con las teclas de flecha.
Para finalizar la regulacion de volumen, se pueden
pulsar alternativamente la tecia SET, MODE o
START (Anotacion: La tecia MODE conmuta a otro
modo, si esta disponible). Se apaga la indicacion
"VOLUME".
Reset
Si se debe interrumpir un ensayo, s6lo es posible
con el interruptor de red. Este sirve tambien como
interruptor Reset.
170
4.6 Display
En el display estan representados los parametros relevantes para el
experimento en las Ifneas 2 a 4, en grande y en negrita. Los parametros
y su numero se diferencian en dependencia del modo seieccionado. En
la li'nea superior se representan siempre la fecha y la hora. En la h'nea
inferior, el modo seieccionado se simboiiza siempre a la derecha con un
si'mbolo:
0
: Modo para celulas eucariotas
Fases de capacidad del aparato: aparato base
O
: Modo para bacterias y levaduras
Fases de capacidad del aparato: modulo de bacterias
(z3: Modo para fusion celular
Fases de capacidad del aparato: Modulo de fusion
En esta li'nea se pueden mostrar adicionalmente tambien la indicacion
"VOLUME" o el tiempo restante del experimento.
13:37
12.AUG.00
U 500V
X
n
VOLUME 100%
220us
1
Ejemplo del display
para la regulacion de volumen
©
Durante y despues de un experimento la indicacion cambia y emite las
informaciones correspondientes.
171
4.7 Electroporacion de celulas eucariotas y de bacterias/levaduras
Los experlmentos respectlvos se ejecutan en cubetas desechables. El
material biologico se coloca en la hendldura entre los electrodos. Ha de
mantenerse la cantidad prescrita en las cubetas. Un exceso por encima
de los electrodos no influyen en el experimento, pero se reduce la eficacia
del experimento.
Una ventana mate permite rotular la cubeta.
La masa de plastico que se encuentra en la cubeta sirve para la
colocacion correcta en la unidad de cubetas 'plug-in'. La tapa cierra la
cubeta. Como proteccion contra el exceso de presion, la cubeta no se
cierra hermeticamente con la tapa. Por consiguiente solo debe
transportarse verticalmente una cubeta llena pues de lo contrario existe
el peligro de que el material biologico se saiga.
Tapa
Cubeta de plastico
y
•
Pestana de plastico
I
Electrodos
y& /
Hendidura
Fig. 4: Representacion esquematica de la cubeta de electroporacion
La unidad de cubetas 'plug-in' se saca del Multiporator® de la
empuhadura representada. La cubeta se llena sin burbujas.
La cubeta se pone en la cavidad trasera de la unidad 'plug-in' de tal modo
que la pestana de la cubeta encaje en la ranura larga y la cubeta se
encuentre en el fondo de la unidad 'plug-in1. La unidad 'plug-in' se mete
hasta el tope en el aparato con la cubeta instalada.
La unidad 'plug-in' se puede guardar fn'a.
Para el transporte del aparato ha de tenerse en cuenta que la unidad
'plug-in' puede resbalar del aparato sin cubeta.
172
4.7.1 Unidad 'plug-in' (Electroporacion)
para la conexion de electrodos externos (Opcion)
En el accesorio no de serie (ver informaciones de pedido) hay una unidad
'plug-in' para la electroporacion (simbolo 0 , descarga de tension a
traves de una funcion e decreciente), a la que se pueden conectar
electrodos externos.
jEsto debe ocurrir con un enchufe de laboratorio de 4 mm con proteccion
de contacto!
Esta unidad 'plug-in' tambien se puede usar en modo de Fusion celular
(Si'mbolo G 3 , impulso rectangular), si el ajuste de tension se pone a "0"
para la alineacion celular ("alineamiento").
1 Conector para masa (negro)
2 Conector para polo positivo (rojo)
j En la conexion de electrodos externos, son decisivas y
deben respetarse las normas de seguridad (alta tension)
y las normas EMV del pafs (EMV: compatibilidad
elect romagnetica)!
jTodos los aparatos conectados estan bajo la
responsabilidad el usuario!
173
4.8 Fusion celular (Option)
4.8.1 Optimacion de la fusion celular (Control bajo el microscopio)
Para optimar los parametros de la fusion celular para las celulas a
examinar, la alineacion celular y la fusion celular pueden seguirse bajo el
microscopio con una micro-camara especial de fusion.
La micro-camara de fusion se une con la unidad 'plug-in' con el cable
(aprox. 1 m).
1
Unidad 'plug-in' de la micro-camara de fusion
1 Contactos
2 Muelles de tierra
Micro-camara de fusion
1 Conexion coaxial
Atencion: iTratar la micro-camara de fusion con cuidado!
jLlenar con cuidado la suspension celular! A ser posible, no tocar ni
mover los electrodos con la punta de la pipeta! jPeligro de lesion!
jEvitar el contacto directo con los electrodos durante la alineacion
celular/fusion!
jLa fusion solo debe tener lugar con micro-camara de fusion conectada!
174
-
Meter bien fiia la unidad 'plug-in' de la micro-camara de fusion en el
Multiporator®.
-
Poner la micro-camara de fusion llena con aprox. 50 uJ de
suspension celular en el microscopio.
Indication: Mediante un pipeteo cuidadoso de la suspension celular
en la zona de los electrodos puede maximarse la cifra de las celulas
entre los electrodos.
-
Para el bloqueo en la mesa del
microscopio se puede usar por
ejemplo pinzas, que se usan
tambien para sujetar un
portaobjetos.
Q
Unir la micro-camara de fusion con el cable.
Enfocar los electrodos y las celulas.
Pasar los parametros ajustados con la tecia START bajo observacion
microscopica.
200 urn
Celulas entre los
electrodos en la alineacion
celular (alineamiento)
Celulas despues de la fusion
y productos de fusion
El volumen de llenado maximo de la micro-camara de fusion es de
aprox. 200 ul.
Los parametros calculados y ajustados son transmisibles y aplicables
directamente en la camara de fusion Helix.
4.8.2 Limpieza de la micro-camara de fusion
El contenido de la micro-camara de fusion se lava con Aqua bidest.
(botella pulverizadora), los restos difi'ciles de celulas pueden quitarse con
cuidado con un cepillo de dientes suave en sentido longitudinal de los
electrodos (jNo debe cambiarse la separacion de electrodos!). Un
enjuagado con etanol (70 %, sin desnaturalizar) acelera el proceso de
secado.
175
4.8.3 Camara de fusion Helix
La fusion celular de una gran cifra de celulas se ejecuta en una camara
de fusion Helix.
•Jr.
•
Esquema de la camara de fusion Helix
La camara de fusion Helix se compone de un vaso y de un nucieo con
alambres de platino bobinados en paralelo, los electrodos. Estan
bobinados como Helix doble alrededor del nucieo. Las dos partes se
atornillan entre si. La hendidura entre vaso y nucieo tiene un volumen de
llenado de 250 ul.
La camara de fusion Helix se une con la unidad 'plug-in' para la fusion
celular mediante una conexion coaxial.
1 —EJ
176
Vaso
Nucieo
1 Rosca
1 Electrodos
2 Conexibn
coaxial
Camara de fusion
Helix
1 Hendidura para
la fusion celular
Unidad 'plug-in'
de fusion
1 Contactos
2 Conexibn coaxial
La separacion de los electrodos de platino bobinados es de aprox.
200 urn.
Fig. 5: Vista de microscopio de los electrodos de la camara de fusion
Helix
Atencion: jTratar con cuidado la camara de fusion Helix!
i Estando los electrodos sueltos o deteriorados, no puede garantizarse
mas un proceso seguro! jEn este caso no usar mas la camara de fusion
Helix!
4.8.4 Llenar la camara de fusion Helix y colocar
en la unidad 'plug-in' de fusion
La camara de fusion Helix se llena con 250 uJ de suspension celular. Ha
de tenerse en cuenta que el li'quido se pipetee exactamente en el punto
mas profundo del vaso. Evitar las humectaciones en el borde o en la
pared. Ello Neva a un mal llenado de la camara de fusion Helix. Se forman
eventualmente burbujas de aire, que reducen la efectividad del
experimento.
El nucleo se pone con cuidado en el vaso de pie (en el soporte) y se
enrosca con cuidado en el vaso. Con el movimiento roscante la
suspension celular se comprime hacia arriba en la hendidura, que es
cada vez mas estrecha.
177
Al enroscar cuidar de que no se formen posibles burbujas.
Hasta la realizacion de la fusion dejar la camara de fusion Helix cerrada
cabeza abajo en la conexion coaxial.
4.8.5 Realizar la fusion y toma de la suspension celular
- La unidad 'plug-in' de fusion se mete bien fija en el aparato.
178
-
Insertar la camara de fusion Helix cerrada en la conexion coaxial de
la unidad 'plug-in' de fusion y encastrar con un cuarto de vuelta.
-
La fusion se realiza con los parametros ajustados (ver cap. 5.3).
-
Soltar la camara de fusion Helix con cuidado con un cuarto de giro de
la conexion coaxial y quitar.
-
Para abrir mantener vertical, p. ej. en el soporte.
-
Desenroscar el nucleo con cuidado del vaso.
-
Lavar la suspension celular que se encuentra en el nucleo con una
cantidad mfnima del medio correspondiente.
-
La suspension celular del vaso se limpia con la suspension celular
lavada y tratada de forma correspondiente.
4.8.6 Limpieza y desinfeccion de la camara de fusion Helix
Los vasos y el nucleo de la camara de fusion Helix deben lavarse bien
directamente despues del experimento con agua destilada para evitar un
secado.
Ante una fuerte suciedad, la camara de fusion Helix puede limpiarse
brevemente en un bano de ultrasonido (eventualmente con aditivo de
limpieza, p. ej. Edisonite-Super) o con un cepillo de dientes muy suave.
En la limpieza con el cepillo ha de cuidarse de que se cepille en sentido
del bobinado. En otro caso los electrodos pueden moverse y no servir
para nada la camara de fusion Helix.
A continuacion se desinfectan las piezas con etanol (70 %, sin
desnaturalizar). Para secar colocar en el soporte sin polvo bajo
condiciones esteriles. La camara de fusion Helix se puede usar de nuevo
despues de secar.
4.9 Conexion de impresora / Impresora (Opcion)
El Multiporator® puede suministrar un protocolo de impresion para cada
experimento, en el que se introducen los parametros empleados, la fecha
y la hora. Ademas se pueden introducir en el protocolo de impresion otros
datos afectantes al experimento tales como solucion tampon,
concentracion, linea de celula etc. En caso de error tambien se imprimen
los mensajes de error. A continuacion se representan impresiones
ejemplares para las diferentes aplicaciones:
18.Aug.00 16:03:04
eppendorf
Multiporator 4308
Cuvette Gap Width
1 mm
x = 50 us,
2mm
V4.00
n= 1
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
179
4 Descripcion del aparato
18.Aug.00 16:42:47
eppendorf
Multiporator 4308
Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, xaCuvette Gap Width
1 mm
2mm
V4.00
5.0 ms
4mm
Strain / Cell Line
Cell Density
Transfer Substance
Concentration
Buffer
Temperature
18.Aug.00 16:17:49
eppendorf
Cell Fusion
Fusion Chamber
Cell Density A
Cell Density B
Buffer
Temperature
180
UL = 8.0 V,
U = 15 V,
U"_= 4.0 V,
Multiporator 4308
t = 20 s
t=100us,
t = 10 s
V4.00
n=3
18.Aug.97 15:59:08
eppendorf
Multiporator 4308
V1.00
' ERROR 07
Short x
En la interface de serie de impresora en el trasero del aparato pueden
acoplarse impresoras de serie. Tambien se pueden clasificar los
protocolos con un programa de terminal de PC para la documentacion.
Para ello se necesita un cable de modem cero (clavija de 9 polos / clavija
de 9 polos, N° de pedido 0013 610.525).
Eppendorf AG le ofrece las siguientes termoimpresoras. Como ejempio
esta descrita adicionalmente la posicion de selectores DIP para una
impresora compatible IBM:
N° pedido
Tipo
de impresora
Termoimpresora DPU-414
0013 608.148
Accesorios
Equipo de red (230 V)
0013 608.172
0013 608.164
Papel termo (10 rollos)
6547 001.018
Clavija de 9 polos /
conector de 9 polos
pasacables 1:1
(para termoimpresora DPU-414)
0013 610.517
Clavija de 9 polos /
conector de 25 polos
cable de modem cero
(compatible IBM,
p. ej. para impresora de matrices
Seikosha SP 2400 (papel sin fin)
0013 610.533
Cable
de conexion
181
4 Descripcion del aparato
Ajustes
DIP SW
Para termoimpresora DPU-414
P. ej. para impresora
de matrices Seikosha
SP 2400 (papel sin fin)
Dip SW-1
Dip SW-1
4 (ON) :AutoLF = ON
= Enable
6 (OFF): Printing
7 (ON) : Density
8 (ON) : = 1 0 0 %
1 (OFF)
2 (OFF)
3 (OFF)
4 (ON)
5 (OFF)
6 (ON)
7 (OFF)
8 (ON)
Dip SW-2
Dip SW-2
= ON
= Normal
6 (ON) : Character
7 (ON) : Set
8 (OFF): =USA
1 (ON)
2 (ON)
3 (ON)
4 (OFF)
5 (OFF)
6 (OFF)
7 (ON)
8 (OFF)
Dip SW-3
= Odd
= XON/XOFF
5 (OFF): Baud
6 (ON) : Rate
7 (ON) : Select
8 (ON) : = 9600 bps
182
: USA
: USA
: USA
:IBM
: Character Set 1
: 12 inches
: LF only
:CR = CR + LF
: 9600 Baud
: 9600 Baud
: XON/XOFF
: No Parity
: No Parity
: 8 bits
: Serial
: No single sheet
5 Tecnicas de trabajo
5.1 Modo Celulas eucariotas
Este modo se simboliza en el display con el caracter © .
1. Paso - Introducir / cambiar parametros
-
-
Conmutar en caso
necesario con la
tecla MODE a
celulas eucariotas.
Pulsar la tecla SET
para seleccionar el
parametro deseado
(subraya).
-
Cambiar los
parametros, de
forma creciente o
decreciente, con las
teclas de flecha.
-
Cambiar igualmente
otros parametros
con las teclas SET y
de flecha.
-
Finalizar la entrada.
Los parametros
tienen efecto rapido
y no tienen que
memorizarse.
13:37
12.AUG.00
U 500V
X
n
220|JS
2
Ejemplo del display a la
electroporacion de
celulas eucariotas.
Los parametros
© relevantes estan
representados en
grande y en negrita.
U: Tension,
unidad V (voltio),
regulable en la gama
de 20-100 V en
pasos de uno,
d e l 00-1000 V
en pasos de diez,
d e l 000-1200 V
en pasos de cien.
x: Constante de tiempo,
unidad us
(microsegundos),
de 15-500 us
en pasos de 5 \xs.
n: Numero de los
impulsos durante
el experimento,
regulable de 1-99.
Entre los impulsos
se espera un minuto
respectivamente.
Anotacion: Los parametros configurados se aplican realmente. El
desarrollo del impulso se calcula internamente de modo que el desarrollo
de la curva de descarga (funcion e) se mantiene de acuerdo con los
parametros entrados.
Para la aplicacion de un impulso rectangular se puede usar el modulo de
fusion (ver para ello cap. 5.4).
183
2. Paso - Iniciar la electroporacion
-
Activar la
electroporacion
con la tecla START.
-
En el display
aparece la
informacion
"Charge" en la
tercera Ifnea, la
carga se genera.
-
12.AUG.00
U 500V
13:37
x
220us
Charge
©
Despues de
concluida la carga
se pasa a la
descarga,
representada con
un relampago en
la tercera Ifnea.
Si se ha ajustado mas
de un impulso, aparece
el aviso "Wait" con el
tiempo a esperar
todavfa.
12.AUG.00
U 500V
13:37
T
Wait
! 0:57
220ns
©
Despues de acabado el 12.AUG.00
13:37
experimento se da una U 500V T 220MS
serial acustica doble y
n
2
aparece de nuevo la
READY
SINCE
1:36
pantalla inicial con los
©
parametros conf igu rados
y utilizados.
Adicionalmente en la
linea inferior aparece el
tiempo en minutos y
segundos desde que ha
acabado el experimento. Despues de
99 minutos o al accionar
una tecla se borra esta
indicacion
184
5.2 Modo Bacterias y levaduras (Opcion)
Este modo se simboliza en el display con el caracter O1. Paso - Introducir / cambiar parametros
-
-
Conmutar en caso
necesario con la
tecla MODE a
bacterias y
levaduras.
Pulsar la tecla SET
para seleccionar el
parametro ajustable
Tension (U)
(subraya).
-
Cambiar los
parametros, de
forma creciente o
decreciente, con las
teclas de flecha.
-
Los parametros
y no tienen que
memorizarse.
12.AUG.00
U 2000V
Ejemplo del display a la
electroporacion
de
5 ms
bacterias y levaduras.
13:42
X
Los parametros
O relevantes estan
representados en
U: Tension,
unidad V (voltio),
de 200-1 000 V
en pasos de diez,
de 1 000-2 500 V
en pasos de cien.
x: Constante de tiempo,
unidad ms
(milisegundos),
ajustada fija a 5,0 ms.
185
2. Paso - Iniciar la electroporacion
-
Activar la
electroporacion con
la tecla START.
-
En el display
aparece la
informacion
"Charge" en la
tercera Ifnea, la
carga se genera.
-
12.AUG.00
U 2000V
13:42
x
5 ms
Charge
O
Despues de
concluida la carga
se pasa a la
descarga,
representada con
un relampago en
la tercera Ifnea.
Despues de acabado
12.AUG.00
13:42 U a : Tension medida
el experimento se da
realmente usada,
U 2000V X 5 ms
una senal acustica doble
unidad V (voltios).
Ua2003V 1^5.1 ms
y aparece de nuevo la
Constante de tiempo
READY SINCE 1:36
O t a : medida
realmente
parametros
usada,
unidad
ms
configurados. En la
(milisegundos),
tercera Ifnea se
valores < 0,8 se
representan los
representan como
parametros reales U a
0,8 ms.
linea inferior aparece el
tiempo en minutos y
acabado el experimento.
Despues de 99 minutos
o al accionar una tecla
se borra esta indicacion.
186
5.3 Modo fusion celular (Opcion)
5.3.1 Funcion: alineacion celular (alineamiento)
Las funciones para el alineamiento se representan mediante los si'mbolos
U'_ (antes del impulso) y U"_ (despues del impulso) en las lineas 2 y 4 del
display.
-
En caso necesario,
se puede conmutar
a fusion mediante
la tecla MODE.
-
Pulsar la tecla SET
para marcar los
parametros
deseados
(subraya).
-
-
Cambiar los
parametros, de
forma creciente o
decreciente, con
las teclas de flecha.
Si un valor en las
lineas U L / I T . / U r ,
se situa en "0", la
funcion
correspondiente no
se ejecuta. De esta
forma es posible
activar U'_/U'L,de
forma individual o
consecutivamente,
sin activar el
impulso de fusion.
Los parametros
y no tienen que
memorizarse.
12.AUG.00
13:42 Ejemplo del display para la
ejecucion del alineamiento
U'_ 5V t 60s
U n OV t 15s n2 U'~ sin activar el impulso
U n y para la ejecucion del
U"_ OV t 30s
alineamiento U"~.
Los parametros relevantes
estan representados en
U'_/U"_:
Tension alterna,
unidad V (voltios),
regulable: "0" y en
lagamade 1,0-10 V
en pasosdeO,1 V.
t: Duracion del alineamiento 0-95 s, unidad
s (segundos) en pasos
de 5 s.
Un: Tension,
(impulso rectangular),
unidad V (voltios),
regulable:
"0" y en la gama de
5-100 V en pasos
de 1 V; de 100-300 V
en pasos de 10 V.
t: Duracion de impulsos,
unidad us
(microsegundos),
regulable para
0-300 u.s en pasos
de 5 us.
n: Numero de los
impulsos 0-99,
regulable en pasos
de uno.
187
2. Paso - Iniciar la alineacion celular (alineamiento)
-
-
Activar el alineamiento U'_ con la
tecla START.
En la cuarta Ifnea
del display aparece
la informacion ' W ;
hay tension alterna
para la duracion
seleccionada.
Despues de acabado el
experimento se da una
aparece de nuevo la
parametrosconfigurados
y usados.
Knea inferior aparece
el tiempo en minutos y
segundos desde que
ha acabado el
experimento. Despues
de 99 minutos o al
accionar una tecla se
borra esta indicacion.
188
12.AUG.00
13:42
5V t 60s
Un OV t 15s n2
U"_ OV t 30s
5.3.2 Ejecucion de la fusion celular
13:42 Ejemplo del display
para la ejecucion de la
5V t 30s
electrofusion con
30V
t
15MS
n2
un
alineamientos U'~ / U"~
5V t 30s
U"
activados.
12.AUG.00
-
Pulsar la tecla SET
para marcar los
parametros
deseados
(subraya).
-
Cambiar los
Ejemplo del display
parametros, de
13:42 para la ejecucion de
12.AUG.00
forma creciente o
Mi
n\l +
UV
I ous
la electrofusion con
decreciente, con
Up 30V t
15MS n2 alineamiento U '~ no
las teclas de flecha.
activado.
Segun la seleccion U"_ 5V t 30s
ae los parametros
para U'_ y U"_,
la fusion
opcionalmente sin
alineamiento puede
combinarse
unicamente con una
o con las dos
funciones de
alineamiento.
-
Los parametros
y no tienen que
memorizarse.
Los parametros
relevantes estan
representados en
Un: Tension,
unidad V (voltios),
regulable:
"0" y en la gama
de 5-100 V en pasos
d e l V;del00-300V
en pasos de 10 V.
t: Duracion de impulso,
unidad [is
(microsegundos),
regulable para
0-300 (JS
en pasos de 5 [is.
Tension alterna,
unidad V (voltios),
regulable:
"0" y en la gama
de 1,0-10 V
en pasos de 0,1 V.
n: Numero de los
impulsos,
0-99, regulable
en pasos de uno
189
2. Paso - Iniciar la fusion celular
190
-
Activar la fusion
celular con la tecla
START.
-
En el display
aparece brevemente
la informacion
"Charge" en la
cuarta Ifnea, la
carga se genera.
-
Durante el proceso
de carga, la tension
alterna U'_ se
mantiene para
la duracion
seleccionada. La
tension alterna se
indica mediante ~
(oscilacion
sinusoidal).
-
Transcurrido el
tiempo contado
de alineamiento
(0-95 segundos)
se procede a la
descarga,
representada
mediante un
relampago en
la cuarta Ifnea.
Dependiendo
del numero n
introducido se
produce, en el
caso de n >1, una
descarga adicional
transcurrido un
segundo.
-
Una vez concluidas
las descargas, la
tension alterna U"_
se mantiene para la
duracion establecida
(0-99 segundos).
El tiempo total
restante del
experimento se
muestra
permanentemente
en la Ifnea inferior.
Despues de acabado el 12.AUG.00
13:42
experimento se da una U'_ 5V t 30s
U n 30V t 15|JS n2
aparece de nuevo la
U"_ 5V t 30s
READY SINCE 1:36 G3
parametros configurados
y utilizados.
Ifnea inferior aparece
el tiempo en minutos y
acabado el experimento. Despues de
99 minutos o al accionar
una tecla se borra esta
indicacion.
Indication: En el caso de U'_ / U"_ = 0 se puede usar el impulso
rectangular solo accesible en la fusion tambien para la electroporacion.
En este caso tiene lugar la electroporacion con el modulo de fusion y con
los parametros correspondientes. El impulso rectangular no puede
usarse sin el modulo de fusion.
191
6 Mensajes de error
En caso de error, el Multiporator® emite una serial acustica asi como
un mensaje de error a traves del display o de la impresora acoplada
(opcion). Estos mensajes de error se refieren a fallos del aparato o a
fallos, que se dan por la aplicacion. Los fallos 1-4 y 9 pueden aparecer al
usar el modulo de bacterias, 1-7 en celulas eucariotas y 1-8 en la fusion
celular.
Mensaje
Causa
Solucion
01
No Display
El display no se
activa.
Llamar al servicio tecnico.
02
NoRTC/
NVRAM
Componente
electronico para
reloj interno
defectuoso.
03
High Current
La potencia
Reducir la conductibilidad
electrica durante la de la solucion usada.
descarga (impulso) Controlar si se empleo el
era muy grande.
tipo de cubeta correcto.
04
No Cuvette
No hay puesta una
cubeta.
fallo
Poner cubeta, arrancar de
nuevo.
Meter completamente la
unidad de cubeta 'plug-in'
en el aparato.
192
05
Timeout Charge El condensador no
puede cargarse en
el tiempo previsto
para el inicio de
carga.
06
Timeout Charge Ante una pulsacion
varia no pudo
cargarse el
condensador a
tiempo entre cada
uno de los
impulsos.
de la solucion usada.
Controlar si se empleb el
6 Mensajes de error
N°
fallo
Mensaje
Causa
07
Short T
El condensador
se vacio
completamente. No
puede asegurarse Controlar si se empleo el
que tambien se
realizo la x
introducida. El
elemento limitador
no era la regulation
de impulso, sino el
condensador.
08
Low Resistance Demasiada
corriente en la
cubeta. La tension
alterna no puede
mantenerse.
09
Timeout
Measuring x
Modulo
de
bacterias
x a = 0,8 ms,
U a mucho
menor que el
parametro
ajustad U.
Timeout en la
medicion x del
modulo de
bacterias.
Solution
-
Golpe de
chispas en
la cubeta.
-
Usar una cubeta con
una separation
mayor de electrodos.
-
La potencia
electrica
durante la
descarga
(impulso) era
muy alta.
-
Reducir la
conductibilidad de la
solucion usada.
-
Fallo tecnico.
-
Llamar al servicio
tecnico.
193
7 Mantenimiento, servicio y cuidado
No es necesario un mantenimiento regular.
El proveedor asume la garantfa y el servicio.
7.1 Desinfeccion
Antes de realizar la desinfeccion del Multiporator®, sacar el enchufe de
red.
Deben someterse a una desinfeccion de lavado todas las partes del
Multiporator®, inclusive los accesorios y el cable de union.
La unidad 'plug-in' tambien se puede someter a una desinfeccion
pulverizadora.
No se recomienda una desinfeccion pulverizadora del aparato, ya que el
agente desinfectante podrfa penetrar al interior del Multiporator®.
El metodo de desinfeccion aplicado debe corresponder con las normas y
directrices legales vigentes para la desinfeccion.
7.2 Limpieza
Antes de realizar la limpieza del Multiporator®, sacar el enchufe de red.
Cuidar de que no penetren li'quidos en el interior del Multiporator®. Con
ello se evitan cortocircuitos en la instalacion electrica y la corrosion.
Limpiar las partes bamizadas y las superficies de aluminio con un pano y
detergentes suaves y frotar con un pano seco.
Atencion: No usar detergentes ni pulidores causticos, solventes o
esmerilantes.
194
8 Datos tecnicos
Tension/Frecuencia:
Fusibles:
Consumo:
Categorfa de sobretension:
Clase de proteccion:
Grado de suciedad:
Tension regulable
(Modulo para):
Celulas eucariotas:
Fusion celular:
Tension alterna:
Bacterias:
Condensador:
Resistencia:
100-240 V ±10%, 50-60 Hz
TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 unidades)
60 W
II
I
2
20- 100 V en pasos de 1 V
100-1 000 V en pasos de 10V
1 000-1 200 V en pasos de 100 V
Separacion de impulso: 1 minuto
0, 5 100 V en pasos de 1 V
100- 300 V en pasos de 10V
Separacion de impulso: 1 segundo
0,1,010 V en pasos de 0,1 V
200-1 000 V en pasos de 10V
1 000-2 500 V en pasos de 100 V
sin impulso multiple
10 u.F, 2 500 V descarga de impulso
600 Q. paralela
56 Q. preconectada
Duracion de carga:
<30 segundos
Numero de impulsos n:
0-99
Constante de tiempo x de la descarga:
Celulas eucariotas:
15-500 us regulable en pasos de 5 us,
Funcion e decreciente
nominal 5 ms
Bacterias:
con una impendancia de muestra de 3,3 k£2
Medicion e indicacion 0,8-6,0 ms
Duracion de la alineacion celular
0-95 s regulable en pasos de 5 s
(alineamiento):
Duracion t del impulso
0-300 us regulable en pasos de 5 us,
(Fusion celular).
Impulso rectangular
9 600 Baudios, 8 bit, sin paridad,
Interface RS 232:
2 Stopbits, XON/XOFF
max. 40 °C
Temperatura ambiente:
max. 80 %
Humedad relativa:
195
8 Datos tecnicos
Peso:
Medidas:
max. 5,5 kg (segun fases de capacidad)
Anchura: 25,2 cm
Fondo:
34,2 cm
Altura:
12,0 cm
El aparato Neva el sfmbolo f f y la autorizacion UL y CSA
(cULE 158089).
i Reservados los cambios tecnicos!
196
9 Informaciones de pedido
N°pedido
4308 000.015
4308 000.023
4308 000.031
4308 000.040
4308 070.501
4308 070.510
4308 070.528
4308 070.536
4307 000.569
4307 000.593
4307 000.623
4308 078.006
4308 070.072
4308 021.004
4308 012.005
4308 014.008
4308 030.003
4308 024.003
4308 017.007
Multiporator®
Version base para celulas eucariotas
100-240 V, 50-60 Hz
Multiporator®, celulas eucariotas y fase
de capacidad Modulo de bacterias
de capacidad Fusion celular
de capacidad Modulo de bacterias y Fusion celular
Accesorios
Amortiguacion
Amortiguacion
(PH), 100 ml
Amortiguacion
(PI), 100 m!
Amortiguacion
(FH), 100 ml
Amortiguacion
100 ml
hiposmolar para la electroporacion
isosmolar para la electroporacion
hiposmolar para la fusion celular
isosmolar para la fusion celular (Fl),
Cubetas de electroporacion
1 mm hendidura, aluminio, esteril, 50 unidades
Portacubetas para 16 cubetas de electroporacion
Unidad 'plug-in' para cubetas de electroporacion
Unidad 'plug-in' (Electroporacion / Electrofusion)
para la conexion de electrodos externos
Unidad 'plug-in' para camara de fusion Helix
Camara de fusion Helix
(0,2 mm de separacion de electrodos)
Micro-camara de fusion
(0,2 mm de separacion de electrodos)
Unidad 'plug-in' para micro-camara de fusion
Soporte para 10 camara de fusion Helix
197
9 Informaciones de pedido
0013 608.148
0013 608.172
0013 608.164
6547 001.018
0013 610.517
0013 610.525
0013 610.533
4308 010.002
4308 011.009
198
Termoimpresora DPU-414
para termoimpresora DPU-414
para termoimpresora DPU-414
Papel termico (10 rollos)
Cable de conexion
(Clavija de 9 polos / conector de 9 polos,
pasacables 1:1)
Cable de m6dem cero para conexion a PC
(Clavija de 9 polos / clavija de 9 polos)
Cable de modem cero para impresora de matrices
(Clavija de 9 polos / conector de 9 polos)
Equipo de reequipamiento Bacterias
(Montaje por medio del servicio tecnico)
Equipo de reequipamiento Fusion celular
(Montaje por medio del servicio tecnico)
EG-Konforrnitatserklarung
EC Conformity Declaration
Das bezeichnete Gerat entspricht den einschlagigen grundlegenden Anforderungen der
aufgefuhrten EG-Richtlinien und Normen. Bei einer nicht mit uns abgestimmten Anderung des
Gerates verliert diese Erklarung ihre Gultigkeit.
The device named below fulfills the relevant fundamental requirements of
the EC directives and standards listed. In the case of unauthorized modifications to the device,
this declaration becomes invalid.
Geratebezeichnung, Device name:
Multiporator 4308
Geratetyp, Device type'
Elektroporator / electroporator
Einschlagige EQ-Rlchtlinien/Normen, Relevant EC directives/standards: *
73/23/EWG, EN 61010-1
89/336/EWG, EN 55011, EN 50082-1, EN 61000-3-2, EN 61000-3-3
&•
Vorstand, Board of Management:
A
ProjektmanagGment, Project Management;
25.09.2000
Hamburg, Date:
eppenclorf
Eppendorf AG • Barkhausenweg 1 • 22339 Hamburg • Germany
0015 0033 509 0)
4308 900 997-00
Eppendorf AG
22331 Hamburg • Germany
Phone: +49 40-5 38 01-0
Fax:
+49 40-5 38 01-556
e-mail: [email protected]
eppendorf home page:
http://www.eppendorf.com
Application Hotline:
Phone: +49 180-3 66 67 89
e-mail:
[email protected]
Printed in Germany
eppendorf
eppendorf'11 is a registered trademark

4 Descriptif de I`appareil

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