SAPIENZA Università di Roma - Dipartimento di Medicina Interna e

SAPIENZA
Università di Roma
Domanda di finanziamento per Progetti di AVVIO ALLA RICERCA
Anno 2015 - prot. C26N1592PS
1. Dati Generali /General Information
Responsabile della ricerca / Principal Investigator
PICARELLI
(cognome)
Giovanna
(nome)
Specializzando
(qualifica)
08/04/1985
(data di nascita)
Medicina interna e specialità mediche
(Dipartimento)
V.le del Policlinico, 155
00161 ROMA
(indirizzo)
C
Macroarea (delibera del S.A del 15.2.2011)
(telefono)
(fax)
[email protected]
(e-mail)
Curriculum del proponente/Curriculum of the Principal Investigator
La sottoscritta Dott.ssa Giovanna Picarelli dichiara, ai sensi e per gli effetti delle disposizioni contenute nel D.P.R. 445/2000, consapevole delle conseguenze penali in
caso di dichiarazioni mendaci, quanto segue:
-Di essere nata a Roma l'8/4/85, C.F. PCRGNN85D48H501W, residente in Viale Cesare Pavese 173, email [email protected], tel. 3334088365
-Di aver conseguito la laurea in Medicina e Chirurgia presso l'Università “Sapienza” di Roma il 29/07/11, con la votazione di 110/110 e lode, discutendo la tesi dal
titolo: “Sindrome di Sjogren: ruolo dell'IL-32” Relatore Prof. Guido Valesini
- Di aver conseguito l'abilitazione come Medico Chirurgo nella sessione di novembre 2011
-Di essere iscritta al III anno della Scuola di Specializzazione in Reumatologia di Roma Università “Sapienza” Direttore Prof. Guido Valesini
-Di aver frequentato per 4 mesi come Research Fellow il laboratorio del “Barts and The London School of Medicine and Dentistry” presso il “Centre for Experimental
Medicine and Rheumatology” nell'anno 2010, seguita dal Prof. Pitzalis
-Di aver frequentato come tirocinante, nell'anno 2009, il Laboratorio di Malattie Immunomediate, Infettive e Parassitologiche dell'Isituto Superiore di Sanità seguita
dalla Dott.ssa Boirivant
-Di aver frequentato per 2 mesi come Research Fellow il laboratorio del “Barts and The London School of Medicine and Dentistry” press oil “Centre for Infectious
Disease and Immunology” nell'anno 2008,...
Classe dimensionale di finanziamento / Funding class of the proposal
Per il TIPO 1: il proponente dovrà essere di età minore o uguale a 32 anni.
Per il TIPO 2: il proponente dovrà essere di età minore o uguale a 35 anni.
TIPO 1: n. 150 progetti da 2000 euro
Data conseguimento Laurea Magistrale
Validità per il TIPO 1: dal 9 maggio 2011 (meno di 4 anni dalla laurea magistrale) e età minore o uguale a 32 nni.
Validità per il TIPO 2: dal 8 maggio 2005 (max 10 anni dalla laurea magistrale) e età minore o uguale a 35 anni.
29/07/2011
Titolo del progetto / Project title
“IDENTIFICAZIONE DI VARIANTI DI SUSCETTIBILITA NELLA SINDROME DI SJÖGREN: ANALISI DI CORRELAZIONE GENOTIPO FENOTIPO”
Abstract (max 2000 caratteri)/Abstract (max 2000 characters)
BACKGROUND: La sindrome di Sjögren (SS), è una patologia infiammatoria cronica caratterizzata da un infiltrato linfocitario a livello delle ghiandole esocrine.
L'interferone di tipo I (IFN I) ha un ruolo chiave nella patogenesi. In corso di SS si realizza un' up-regolazione di diversi geni mediata da IFN I (“IFN signature”) e il
STAT4 è tra questi. Uno specifico polimorfismo di STAT4 (rs7574865), è stato individuato come fattore di rischio per l'artrite reumatoide, il lupus eritematoso
sistemico (LES) e anche per la SS. STAT4 codifica per un fattore di trascrizione che interferirebbe con il signaling dell'IFN I, dell'IL-12 e dell'IL-23, citochina che
stimola i linfociti Th17. Tali linfociti sono responsabili della produzione di IL-17, iper-espressa a livello delle ghiandole salivari in corso di SS. Il nostro gruppo ha
dimostrato che i polimorfismi rs33980500 e rs13193677 del gene TRAF3IP2, si associano ad un'aumentata suscettibilità per il LES. Tale gene codifica per una
molecola, Act1, che funge da regolatore negativo della risposta umorale e promuove le risposte IL-17.
SCOPO DELLO STUDIO: valutare l'associazione dei polimorfismi di STAT4 (rs7574865) e TRAF3IP2 (rs33980500, rs13190932, and rs13193677), con la
suscettibilità per la SS, con il decorso clinico e la risposta alla terapia.
MATERIALI E METODI: Verranno arruolati 200 pazienti con SS afferenti presso la Sjögren Clinic della UOC di Reumatologia del Dipartimento di Medicina Interna
e Specialità Mediche e 300 controlli sani. I pazienti saranno sottoposti alle seguenti valutazioni: anamnesi, esame clinico, durata e attività di malattia, indici di danno e
terapia. Verranno eseguiti un ELISA per il dosaggio di Act1 e la genotipizzazione dei polimorfismi di TRAF3IP2 e STAT4.
RISULTATI ATTESI: L'identificazione delle vie responsabili dello sviluppo della malattia permetterebbe di agire precocemente attraverso una prevenzione mirata dei
danni mediante lo sviluppo di terapie specifiche.
2. Informazione sull'attività di ricerca / Information about the research activity
2.1 Parole chiave / Key words
1. SINDROME DI SJOGREN
2. GENETICA
3. AUTOIMMUNITÀ
4. INTERFERONE TIPO I
5. INTERLEUCHINA 17
2.2 Ambito della ricerca / Research ambit
Dipartimento
2.4 Inquadramento della ricerca proposta (in ambito nazionale ed internazionale) / National - international framing of the
research program
La sindrome di Sjögren (SS), è una patologia infiammatoria cronica caratterizzata dalla presenza di un infiltrato linfocitario a livello delle ghiandole esocrine. Tale
infiltrato si associa ad una progressiva perdita di funzionalità delle ghiandole e l'insorgenza di sintomi quali: secchezza degli occhi e della bocca. In corso di SS è
possibile individuare due differenti subsets di pazienti: con prevalente impegno ghiandolare e con prevalente impegno sistemico (artrite, acidosi tubulare renale,
neuropatia periferica e linfoma). Per quanto concerne l'eziopatogenesi, i meccanismi fisiopatologici che sottendono questa patologia sono ancora oscuri. Ciò che
sembra ormai certo è che allo sviluppo della SS concorrano diversi fattori fra cui la presenza di un background genetico predisponente e l'intervento di fattori
ambientali scatenanti, tra cui agenti infettivi. L'infiltrato infiammatorio ghiandolare è prevalentemente costituito da linfociti T, macrofagi, plasmacellule e cellule
dendritiche (CD). Queste ultime si dividono in: CD mieloidi e CD plasmacitoidi. Le CD plasmocitoidi rappresentano una delle principali fonti di Interferone di tipo I
(IFN I) che offre un contributo alla formazione di foci infiammatori. La produzione di IFN di tipo I determina infatti una up-regolazione di diversi geni la cui
espressione incrementa a sua volta la produzione di tale citochina: “IFN signature”. Il gene STAT4 (“signal transducer and activator of transcription 4”) rientra, fra i
geni up-regolati dalla produzione di IFN I. Il prodotto di STAT4, è una molecola di trasduzione del segnale presente nei linfociti e coinvolta nel signaling dell'IL-12 e
dell'IL-23. Uno specifico aplotipo, relativo ad un polimorfismo a carico di un singolo nucleotide (SNP) (rs7574865), è stato identificato come fattore di rischio per lo
sviluppo di artrite reumatoide e di lupus eritematoso sistemico (LES). Successivamente è stato dimostrato come tale polimorfismo sembri essere associato anche con
la SS. Nello specifico, STAT4 codifica per un fattore di trascrizione che, come precedentemente detto, viene attivato da diverse citochine tra cui IFN I, IL-12 e IL-23,
quest'ultima coinvolta nella stimolazione dei Th17.
A livello delle ghiandole salivari dei pazienti affetti da SS è stata riscontrata la presenza di linfociti Th17, responsabili della produzione di IL-17, una delle citochine
chiave nella patogenesi di tale malattia. Dati recenti suggeriscono un ruolo chiave dell'asse citochinico di IL-17 e delle cellule che producono tale citochina in diverse
fasi della patogenesi della SS quali: induzione di un'epitelite autoimmune, mantenimento dell'infiammazione, linfoneogenesi ectopica e formazione di centri
germinativi (CG).
Act1 è una proteina codificata da gene TRAF3IP2 che, oltre ad essere un regolatore negativo della risposta umorale B mediata, esercita un effetto positivo sulla
cascata di IL-17. Modelli murini con deficit di Act1 presentano non solo un fenotipo autoimmune mediato da cellule B (aumento periferico dei linfociti B,
linfoadenopatie, splenomegalia, ipergammaglobulinemia e SS o nefrite lupica) ma anche una resistenza alla encefalomielite autoimmune sperimentale e alle patologie
infiammatorie intestinali Th17 dipendenti. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato come i seguenti polimorfismi rs33980500 e rs13193677 sono associati con la
suscettibilità al LES e che rs13190932 sono risultata associato con lo sviluppo di pericardite. Tale lavoro ha dimostrato per la prima volta il contributo della variabilità
genetica a carico di questo gene nella suscettibilità al LES nonché nel determinare il fenotipo clinico di malattia. Tali polimorfismi non sono mai stati valutati in
pazienti affetti da SS.
2.5 Sintesi del programma di ricerca e descrizione dei compiti dei singoli partecipanti / Synthesis of the research program
and description of the duties of each participant
Scopo dello studio
L'obiettivo primario del nostro studio è la valutazione dell'associazione dei polimorfismi rs7574865 di STAT4 e rs33980500, rs13193677, rs13190932 di TRAF3IP2
con la suscettibilità per la SS. Obiettivi secondari saranno sia la valutazione dell'eventuale associazione di questi polimorfismi con il decorso clinico e con la risposta
alla terapia, che la costruzione di aplotipi specifici di suscettibilità alla SS. Infine, verrà eseguito il dosaggio sierico di Act1.
Reclutamento e numero pazienti
Verranno arruolati 200 pazienti affetti da SS diagnosticato secondo i criteri rivisiti Euro Americani del 2002, seguiti presso la Sjögren Clinic, UOC di Reumatologia,
Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, Sapienza Università di Roma (Responsabile, Dr. Roberta Priori) e 300 controlli sani. Ciascuno dei singoli
partecipanti lavora attivamente presso la Sjögren Clinic, ed è coinvolto personalmente nella valutazione del paziente, somministrazione di questionari, inquadramento
diagnostico e terapeutico. Tutti i pazienti verranno sottoposti a valutazione anamnestica ed esame clinico completo. Inoltre verranno registrate le patologie
concomitanti, la durata di malattia, l'attività di malattia (SSDAI - Sjogren Syndrome disease activity score), gli indici di danno (SSDDI - Sjogren Syndrome Damage
Index) e la terapia in atto.
Tutti i dati verranno inseriti su supporto computerizzato.
Il follow-up prevedrà controllo clinico (incluse le scale di attività di malattia) e dei parametri ematochimici ogni quattro mesi. Nel corso della prima visita i pazienti,
previo consenso informato scritto, verranno sottoposti a prelievo ematico (5 ml addizionato con EDTA 0.5%) al fine di eseguire estrazione del DNA. Saranno quindi
registrate le caratteristiche demografiche, i risultati dei principali esami ematochimici (emocromo, protidogramma con elettroforesi proteica, crioglobulinemia,
complementemia; autoanticorpi quali: anticorpi anti-nucleo, anti-Ro/SSA, anti-La/SSB, fattore reumatoide) e i dati clinici (presenza assenza di: xerostomia,
xeroftalmia, storia di tumefazione delle parotidi, linfoma, artrite)
Materiali e metodi
1) Verrà eseguito un test ELISA per il dosaggio di Act1.
Il metodo è basato sul principio di “sandwich ELISA”. Il fondo di ciascun pozzetto è coperto con un anticorpo policlonale anti-Act1. Dopo incubazione con il siero o
con un ricombinante standard di Act1, viene aggiunto un secondo anticorpo monoclonale biotinilato in grado di legare la molecola. Il riconoscimento di quest'ultimo
avviene mediante l'aggiunta di un complesso streptavidina-HRP. Infine, utilizzando come substrato per l'enzima HRP la tetrametilbenzidina, si procede alla
quantificazione di Act1.
2) Verrà analizzato il DNA genomico, dopo estrazione da sangue periferico, mediante Kit di estrazione ed estrattore automatico Qiagen. Verrà eseguita la
genotipizzazione dei polimorfismi rs7574865 di STAT4 e rs33980500, rs13193677, rs13190932 di TRAF3IP2. L'analisi dei polimorfismi sarà eseguita mediante
saggio di discriminazione allelica con tecnologia TaqMan, usando l'ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System. Tale sistema è il risultato della combinazione, in
un unico strumento, di un "thermal cycler", di un rilevatore a fluorescenza laser, di software applicativi specifici e della rivoluzionaria tecnologia "TaqMan". La
tecnologia del TaqMan assay (5' exonuclease detection assay) consente la rilevazione dell'amplificato simultaneamente alla sua amplificazione. È un saggio di
amplificazione modificato in cui, grazie al particolare disegno delle sonde marcate con i fluorocromi e all'attività 5'-3' esonucleasica della AmpliTaq Gold® DNA
Polymerase, è possibile produrre durante la PCR un segnale fluorescente con intensità direttamente proporzionale al target di reazione. Al termine della reazione i
risultati sono immediatamente disponibili sul computer, senza ulteriori manipolazioni del campione, eliminando il rischio di contaminazione.
Chimica del TaqMan Assay: due coloranti fluorescenti, un colorante reporter (R) e un colorante quencher (Q), sono legati alle sonde costruite in modo complementare
al filamento contenente lo SNPs da discriminare. Per ogni SNPs vengono disegnate due sonde:
1. Sonda 1 complementare all'allele A
2. Sonda 2 complementare all'allele B
Il disegno delle sonde e dei primer avviene mediante utilizzo del programma Primer express. 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Forster, 1948; Lakowicz,
1983). Durante la reazione di PCR le sonde fluorogeniche si annilano alle sequenze complementari tra i siti dei primers forward e reverse. Al momento dell'estensione
del filamento solamente le sonde che si sono ibridizzate saranno tagliate dall'attività 5'-3' esonucleasica dell'AmpliTaq Gold DNA Polymerase ed emetteranno la
fluorescenza. Infatti il clivaggio delle sonde ibridizzate determina la separazione del reporter dal quencer cui segue un aumento del segnale di emissione del reporter
che sarà registrato ad ogni ciclo dall'ABI 7000. Al termine della reazione di PCR verrà eseguito un saggio di discriminazione allelica post-corsa. Ultimato anche
questo ultimo "step" con l'impiego dell'ABI7000 SDS software sarà possibile determinare rapidamente la componente allelica di ciascun campione analizzato.
Analisi Statistica
Si procederà quindi ad analisi statistica dei dati che si svolgerà in tre fasi (fase di analisi univariata, fase di analisi di interazione tra le variabili e fase di analisi
multivariata).
Gli aplotipi verranno costruiti usando il programma Mendel Software o Arlequin. Le differenze tra le frequenze genotipiche, alleliche ed aplotipiche nei casi e nei
controlli o nei vari sottogruppi fenotipici, nonché le differenze fra le frequenze genotipiche fra gli osservati e gli attesi assumendo il modello di Hardy-Weinberg
verranno valutate tramite il Test d'indipendenza di Pearson. L'associazione lineare verrà calcolata mediante Test di Mantel-Haenszel. L'analisi dei fattori di rischio
verrà inoltre calcolata tramite il Test del Chi quadrato e l'analisi multivariata (regressione logistica). Verranno usati programmi software specifici (Statistical Package
for Social Sciences 16.0, SPSS 16.0).
Risultati attesi
L'identificazione delle vie responsabili dello sviluppo della malattia potrebbe permettere di agire precocemente attraverso una prevenzione mirata dei danni mediante
lo sviluppo di terapie specifiche.
3. Elenco delle migliori pubblicazioni negli ultimi 5 anni / List of the best publications of the last 5 years
H-INDEX e Database di riferimento/H-INDEX and reference Database
H-INDEX
Database
4
scopus
Pubblicazioni del responsabile della ricerca / Publications of the Principal Investigator
(Le pubblicazioni dall'anno 2014 non riportano l'impact factor)
nº
Descrizione
1.
Scrivo R, Priori R, Coppola M, Minniti A, Brandt J, Picarelli G, Cruciani V, Luzi P, Valesini G. (2014). Use of a contact center telephone helpline in
rheumatology outpatient management: a five-year experience analysis and patients' perception.
. MODERN RHEUMATOLOGY, ISSN: 1439-7595
Elisa Astorri, Rossana Scrivo, M. Bombardieri, Giovanna Picarelli, Irene Pecorella, Alessandra Porzia, Guido Valesini, R. Priori (2014). CX3CL1 and
CX3CR1 expression in tertiary lymphoid structures in salivary gland infiltrates: fractalkine contribution to lymphoid neogenesis in Sjogren's
syndrome. RHEUMATOLOGY, vol. 53, p. 611-620, ISSN: 1462-0324, doi: 10.1093/rheumatology/ket401
Priori R, Colafrancesco S, Picarelli G, Di Franco M, Valesini G. (2012). Adult-onset Still's disease: not always so good.. CLINICAL AND
EXPERIMENTAL RHEUMATOLOGY, ISSN: 0392-856X
Quartuccio L, Maset M, Baldini C, Priori R, Bartoloni E, Carubbi F, Isola M, Luciano N, Picarelli G, Alunno A, Giacomelli R, Gerli R, Valesini G,
Bombardieri S, De Vita S. (2012). COMPLICANZE LINFOPROLIFERATIVE IN CORSO DI SINDROME
DI SJÖGREN PRIMARIA: PREVALENZA E ASPETTI COMUNI IN UN'AMPIA
CASISTICA DI PAZIENTI. In: XLIX Congresso Nazionale Società Italiana di Reumatologia. REUMATISMO, vol. 64 (Numero Speciale 1), ISSN:
0048-7449, Milano, 21-24 Novembre 2012
S. Colafrancesco, R. Priori, G. Picarelli, A. Gattamelata, A. Minniti, G. Valesini (2012). MALATTIA DI STILL DELL'ADULTO: UNA CASISTICA
ITALIANA. In: XLIX Congresso della Società Italiana di Reumatologia. REUMATISMO, vol. 64 (Numero Speciale 1), ISSN: 0048-7449, Milano,
21-24 Novembre 2012
Serena Colafrancesco, Roberta Priori, Cristiano Alessandri, Carlo Perricone, Monica Pendolino, Giovanna Picarelli, Guido Valesini (2012). IL-18
Serum Level in Adult Onset Still's Disease: A Marker of Disease Activity. INTERNATIONAL JOURNAL OF INFLAMMATION, vol. 2012, p. 1-6,
ISSN: 2042-0099, doi: 10.1155/2012/156890
Picarelli A, Di Tola M, Sabbatella L, Mercuri V, Pietrobono D, Bassotti G, D'Amico T, Donato G, Picarelli G, Marino M, Borghini R, Centanni M,
Gargiulo P. (2011). Type 1 diabetes mellitus and celiac disease: endothelial dysfunction.. ACTA DIABETOLOGICA, ISSN: 0940-5429
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Impact
Factor
2,655
2,784
Pubblicazioni scientifiche di altri partecipanti alla ricerca / Publications of the other participants
(Le pubblicazioni dall'anno 2014 non riportano l'impact factor)
nº Descrizione Docente
4. Richiesta di finanziamento del progetto / Financial request
4.1 Dettaglio richiesta di finanziamento del progetto / Details of the funding request
SPESA IN
EURO /
COST
Descrizione / Description
Materiale inventariabile (comprese le pubblicazioni da
acquisire)/Durable Equipments (publications included)
2.000,00
Materiale di consumo e funzionamento / Materials &
Consumables
Sonde:
TRAF3IP2-AS1, TRAF3IP2, SNP ID: rs33980500;
TRAF3IP2-AS1, TRAF3IP2 SNP ID: rs760563;
TRAF3IP2-AS1, TRAF3IP2 SNP ID: rs760563
STAT4 SNP ID: rs7574865
Lifetechnologies TaqMan® SNP Genotyping
Assay, human: 331, 20 cadauno (1324,8 euro)
TRAF3IP2 (Act1) elisa kit: 675,20 euro
Spese per calcolo ed elaborazione dati / Computing & Data
Processing Cost
Missioni e partecipazioni a convegni / Travels & participation to
conferences & workshops
Altro (voce da utilizzare solo in caso di spese non riconducibili
alle voci sopraindicate - es. over head) / Other costs
TOTALE
2.000,00
Nominativo di uno strutturato (professore/ricercatore) di riferimento
Cognome
SCRIVO
Nome
Rossana
Qualifica
40
Dipartimento
DIP. Medicina interna e specialità mediche
E-Mail
[email protected]
Informazioni aggiuntive/Additional information
In caso di assegnazione del finanziamento il sottoscritto accetta che titolo della ricerca, abstract
e finanziamento assegnato vengano resi pubblici
Indirizzo e-mail del Direttore di Dipartimento
Indirizzo e-mail del Segratario amministrativo di Dipartimento
Firma
......................................
SI
[email protected]
[email protected]
Data 07/05/2015 15:34