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❚ Ortopedia
Applicazione clinica di medium condizionato
derivato da cellule mesenchimali amniotiche
nella terapia teno-desmica del cavallo sportivo
Stefano Tassana, Fausto Cremonesib, Enza Sanzognia, Roberta Peregob,
Claudia Perrinib, Anna Lange-Consigliob
a
b
Libero professionista, Milano, Italia
Università degli Studi di Milano, Ospedale dei Grandi Animali, Sezione di Riproduzione, Lodi, Italia
INTRODUZIONE
RIASSUNTO
Recenti riscontri indicano che le cellule staminali mesenchimali possono promuovere la guarigione tendinea secernendo molecole ad azione paracrina capaci di modulare la risposta infiammatoria e trofica. Per avvalorare questa
ipotesi abbiamo studiato il potenziale terapeutico del medium condizionato secreto da cellule equine di derivazione amniotica (AMCs-CM)
in sedici diverse lesioni spontanee di tendini e
legamenti di cavalli sportivi. Un attento monitoraggio dei pazienti ha permesso di provare la sicurezza di questi trattamenti. I risultati clinici si
sono rivelati favorevoli e la bassa percentuale di
recidive (12,5%), rispetto ai soggetti trattati con
cellule staminali da midollo osseo (BM-MSC),
suggerisce che il trattamento con AMC-CM
possa avere una provata efficacia. In conclusione, questo studio identifica AMC-CM come un
innovativo trattamento terapeutico acellulare
per le tendinopatie e desmopatie del cavallo
sportivo.
Le lesioni teno-desmiche rappresentano un capitolo molto importante della traumatologia del cavallo sportivo, soprattutto nell’ambito di
atleti impegnati in competizioni di alto livello, in quanto estremamente
frequenti e spesso di difficile risoluzione. Nella storia dell’ortopedia ippiatrica si sono alternati vari protocolli terapeutici, più o meno coadiuvati da trattamenti chirurgici (Bramblage et al., 1986) o da altri ausili
ortopedici quali, ad esempio, le ferrature kinesiologiche (Denoix et al.,
2007). Nessuno di questi trattamenti ha dimostrato risultati ideali (Dyson, 2004): i tessuti danneggiati, infatti, tendono ad un processo di guarigione spontaneo orientato alla fibrosi, con formazione di aree cicatriziali (Caniglia et al., 2011), caratterizzate da prevalenza di collagene di
tipo III ed assenza di fibre larghe, che predispongono ad ulteriori lesioni (Smith et al., 2011). Per questo motivo negli ultimi anni la sfida terapeutica si sta orientando verso strategie biotecnologiche. I tendini, come tutti i tessuti di un individuo adulto, dispongono di una nicchia di
cellule staminali ma la loro capacità rigenerativa è limitata (Carter-Arnold et al., 2013). Al fine di attivare queste cellule e favorire una rigenerazione tissutale si è pensato ad un impianto intra-lesionale di elementi cellulari con potenzialità staminale (Hertel et al., 2001; Smith et
al., 2003), nel tentativo di implementare i processi rigenerativi in aree
lesionate e con l’obiettivo di ottenere una qualità di tessuto quanto più
simile all’originale (Smith et al., 2010). Le cellule staminali autologhe,
ottenute da diversi tessuti, hanno dimostrato un ottimo potenziale in
questo senso, ma il loro utilizzo è spesso limitato dai costi e dalla loro
limitata capacità proliferativa in vitro, che comporta lunghi periodi di attesa per l’espansione (Lange-Consiglio et al., 2013a). Lo slittamento
dall’ottimale finestra temporale di impianto comporta, nella compagine lesionale, delle intrinseche evoluzioni ultrastrutturali legate alla migrazione fibroblastica, che va a minare l’efficacia del processo di “replacement” (Guest et al., 2010). Si ritiene pertanto possibile ridurre la
percentuale di recidive anticipando il trattamento (Smith 2014).
Per questo motivo, e per andare incontro alle esigenze del veterinario
pratico, gli autori hanno sviluppato un protocollo per l’utilizzo di cellule staminali eterologhe, derivate dalla membrana amniotica (AMCs)
(Lange-Consiglio et al., 2012), dimostrandone gli effetti rigenerativi su
lesioni tendinee spontanee di cavalli sportivi. In un uno studio comparativo con l’utilizzo di cellule staminali derivanti da midollo osseo (BM-
“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 14/02/2014 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 14/05/2014”.
Ippologia, Anno 25, n. 2, Giugno 2014
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MSCs), le AMCs hanno rivelato assenza di effetti
collaterali, pari efficacia alle BM-MSCs e minore
percentuale di recidive, presumibilmente per il minor grado di fibrosi che si realizza grazie alla riduzione dell’intervallo fra l’evento traumatico ed il
trattamento (Lange-Consiglio et al., 2013a).
Non appare, però, ancora chiaro quale sia il meccanismo attraverso il quale gli elementi mesenchimali multipotenti favoriscono la guarigione tendinea. In
particolare, non è noto se prevalga la capacità di differenziazione in tenociti, la possibilità di fornire fattori immunomodulatori e trofici, oppure, se avvenga una combinazione di questi due fenomeni.
È stato dimostrato che le BM-MSCs equine
(Schnabel et al., 2009) e le AMCs umane (Evangelista et al., 2008), manifestano capacità immunomodulatoria in vitro.
Recentemente è stato evidenziato (Lange-Consiglio et al., 2013b) che anche le AMCs equine sono
in grado di inibire la proliferazione delle cellule
mononucleate di sangue periferico (PBMC) non
solo quando coltivate in vitro in contatto cellulacellula con le cellule rispondenti, ma anche quando separate da queste mediante una membrana.
L’effetto inibitorio è risultato ancora più evidente
quando un maggiore numero di AMCs è stato addizionato alla coltura, suggerendo un effetto dosedipendente. La scoperta che l’inibizione della proliferazione dei PBMC, attribuibile alle AMCs, avveniva anche nel sistema con membrana ha suggerito che in questo fenomeno fossero implicati fattori solubili. Questa ipotesi è stata supportata ulteriormente dalla dimostrazione che la proliferazione di PBMC era inibita anche dal medium condizionato (CM) secreto dalle AMCs (AMCs-CM).
Questi risultati hanno portato all’ipotesi che le
cellule staminali mesenchimali, in particolare quelle di derivazione amniotica, agiscano attraverso
micro-molecole ad azione paracrina, che una volta secrete possono svolgere azioni tissutali modulatorie e trofiche attraverso l’espressione bioattiva di fattori di crescita bio-solubili (Magatti et al.,
2008, Rossi et al., 2012; Lange-Consiglio et al.,
2013b). Le micromolecole svolgerebbero attività
poliedriche in qualità di citochine (Denison et al.,
1998; Menon et al., 2006), di fattori angiogenici
(Steed et al., 2008) nonché di fattori proliferativi e
differenziativi (Koizumi et al., 2000; Steed 2008),
favorendo, forse più delle cellule staminali mesenchimali stesse, i processi di rigenerazione tissutale
(Walter et al., 2010; Osugi et al., 2012).
Il presente lavoro nasce dalle conclusioni dei risultati in vitro del lavoro di Lange-Consiglio et al.
(2013b) e dall’osservazione di Leung et al. (2006)
di come i tessuti lesionati o degenerati rappresentino un micro-ambiente inospitale alle cellule e di
come un’ampia maggioranza degli elementi staminali impiantati vada incontro ad apoptosi (necrosi
cellulare) nel breve periodo post-impianto. Si pensa, infatti, che solo un esiguo numero di cellule ri-
4
manga vitale, rendendo difficile ottenere una differenziazione in fenotipi cellulari adulti (Huang et al.,
2013). La necrosi della maggior parte delle cellule
impiantate giustifica l’analogia di risultati ottenuti
impiantando 10 milioni di cellule (Godwin et al.,
2012) o solo 1 milione di cellule, come da protocollo di un nostro precedente studio (Lange-Consiglio et al., 2012). Ciò suggerisce che meccanismi
diversi dalla differenziazione delle cellule trapiantate intervengano nella rigenerazione tissutale
(Satija et al., 2009).
Alla luce di queste considerazioni, lo scopo di questo lavoro è stato quello di indagare, in vivo, gli effetti rigenerativi del CM ottenuto durante il processo di coltura in vitro di cellule staminali equine
di derivazione amniotica. Al tempo stesso, sono
state valutate e documentate l’efficacia terapeutica e le potenzialità neo-angiogenetiche del CM in
cavalli con lesioni tendinee e legamentose.
MATERIALI E METODI
Come descritto dettagliatamente da Lange-Consiglio et al. (2012) l’allantocorion, ricavato da fattrici durante il parto spontaneo a fine gestazione, è
stato addizionato con antibiotici e conservato in
PBS alla temperatura di 4°C per un massimo di 12
ore. In laboratorio, la membrana amniotica è stata
separata, tagliata in piccoli frammenti e sottoposta
a digestione enzimatica secondo il protocollo descritto da Lange-Consiglio et al. (2012). Gli elementi cellulari ottenuti sono stati filtrati attraverso membrane da 100 µm, centrifugati e contati in
camera di Burker, quindi, le AMSCs sono state seminate utilizzando un medium ad alto contenuto
di glucosio (high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM; Euroclone) addizionato
con siero fetale bovino (Sigma-Aldrich, Milan, Italy), epidermal growth factor (Sigma-Aldrich), antibiotici e L-glutamina (Sigma-Aldrich) (Lange-Consiglio et al., 2012). Il medium è stato sostituito dopo 72 ore per rimuovere le cellule non aderenti e,
successivamente, due volte alla settimana fino a
che le cellule non raggiungevano l’80% di confluenza. Dopodiché le cellule sono state distribuite in nuove fiasche di coltura per l’espansione fino
al terzo passaggio. A questo stadio le cellule sono
state coltivate per 5 giorni consecutivi senza sostituire il terreno di coltura. Quest’ultimo, dopo
questi 5 giorni è stato raccolto, centrifugato a 700
g per eliminare i detriti cellulari e filtrato con
membrane di 0,2 µm di diametro per garantirne la
sterilità. Il medium condizionato così ottenuto è
stato successivamente liofilizzato, ricostituito in
acqua sterile ad una concentrazione 4 volte superiore a quella iniziale e conservato a -80°C fino al
momento dell’utilizzo.
In conformità all’autorizzazione 9.12/11 del Comitato Bioetico dell’Università di Milano, è stato
Applicazione clinica di medium condizionato derivato da cellule mesenchimali amniotiche nella terapia teno-desmica del cavallo sportivo
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A
B
FIGURA 1 - A) Area di iniezione intradermica a tempo 0. B) Risultato dopo 24 ore, si noti l’assenza di qualsiasi alterazione cutanea.
condotto un test di tolleranza e sicurezza in vivo al
fine di verificare l’assenza di fenomeni indesiderati. Previa autorizzazione scritta dei proprietari,
un’area di 10 cm2 nella regione dei pettorali di 4
cavalli sani, con storia clinica conosciuta, è stata
tosata e sottoposta a disinfezione chirurgica, successivamente, 2 ml di AMCs-CM sono stati inoculati per via intradermica (Fig. 1A e B) ed i soggetti monitorati per 1 anno.
Per lo studio in vivo delle proprietà rigenerative di
AMCs-CM, questo è stato inoculato all’interno di
lesioni tendinee o legamentose spontanee in 16
cavalli sportivi riferiti al co-autore libero professionista per un consulto ortopedico. I soggetti utilizzati per il presente studio sono stati descritti,
analogamente alle relative lesioni ed al follow up
nella tabella 1. In considerazione della concentrazione quattro volte superiore a quella iniziale, il
AMCs-CM, ricostituito con acqua sterile dopo liofilizzazione, è stato impiegato in un volume di 2
ml. Questo volume, fissato per esigenze di standardizzazione, permette di ottenere un’osmolarità bio-compatibile, oltre a colmare adeguatamente la maggior parte delle lesioni. Le lesioni tenodesmiche sono state documentate mediante esame
ecografico (Medison Sonovet Pico, GE Logiq e) in
scansione longitudinale e trasversale. Il Power
Doppler (PD) è stato utilizzato sistematicamente
al fine di documentare la microcircolazione all’interno delle lesioni. Per lo studio sono stati selezionati solo soggetti che presentavano lesioni acute e unilaterali, con l’unica eccezione di un soggetto che manifestava una recidiva acuta di una lesione precedentemente trattata a carico del tendine
flessore superficiale delle falangi (SDFT). La gravità delle lesioni è stata graduata in sei categorie, secondo una valutazione quantitativa (Rantanen,
2003) e sono state considerate solo le strutture
che presentavano lesioni comprese fra i gradi 4 e
6 della scala sopracitata. Seguendo la stessa classi-
ficazione, la successiva evoluzione ecografica delle
lesioni a carico di SDFT e delle branche del legamento sospensore (SLB) è stata quantificata in base alle dimensioni, al grado di ecogenicità e al grado di allineamento delle fibre in scansione longitudinale, come riportato nelle Tabelle 2 e 3.
Prima di procedere all’inoculazione di AMCs-CM
è stato richiesto il consenso informato dei proprietari.
In tutti i soggetti sottoposti a trattamenti intra-lesionali è stato seguito il medesimo protocollo nella preparazione e disinfezione del campo chirurgico. L’area da trattare è stata tricotomizzata con lama n° 40, ed è stata effettuata un’ecografia di controllo prima di procedere all’inoculo dell’AMCsCM; è stata, quindi, praticata un’anestesia tronculare o cerchiante prossimalmente al sito di lesione, impiegando una soluzione di Mepivacaina al 2%
(Galenica Senese, Italia). L’area di interesse è stata
delimitata con un bendaggio (Fig. 2) e sottoposta
a disinfezione chirurgica con clorexidina e clorexidina alcoolica. I cavalli sono stati sedati con Detomidina (Pfizer Italia, Latina, Italia, 0,01 mg/kg). Le
iniezioni sono state eseguite sotto diretto controllo ecografico dopo aver inserito la sonda dell’ecografo all’interno di una guaina sterile, o di un
guanto sterile, per mantenere l’asepsi. La sonda
così protetta e l’area da iniettare sono state cosparse di alcool a 90% per permettere il contatto.
I tendini flessori superficiali delle falangi sono stati iniettati con tecnica longitudinale (Fig. 3) (preferita in questi casi dall’operatore) con un ago 20
gauge e 70 mm, in direzione prossimo-distale. Le
iniezioni a carico di tutte le altre strutture sono
state eseguite con tecnica trasversale usando un
ago 21 gauge e 40 mm, inserito lateralmente. Nei
casi di entesiopatia distale del legamento collaterale della articolazione interfalangea distale l’iniezione è stata eseguita mediante guida radiografica
(Cuattro DR Equine) (Werpy 2011) (Fig. 4A, 4B).
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Tutti i soggetti sono stati monitorati clinicamente,
ecograficamente e radiologicamente (quando richiesto) ad intervalli mensili per tutto il periodo di
convalescenza e riabilitazione. Tutte le immagini in
scansione trasversale e longitudinale delle aree
trattate sono state archiviate, così come i relativi
studi Power Doppler (PD) (de Vos et al., 2007).
Questi sono stati condotti in assenza di sedazione
(al fine di non modificare la dinamica del circolo)
in scansione trasversale e longitudinale con sonda
lineare alla frequenza di 10 MHz, senza cuscinetto
acustico ma con l’interposizione di gel, avendo
l’attenzione di porre la minima pressione necessaria sulla sonda, al fine di non occludere alcun vaso.
In maniera semi-quantitativa i riscontri PD sono
stati valutati con una scala a 3 gradi (Murata et al.,
2012). I tre gradi definiscono come grado 1: minima attività di colore intermittente in una posizione fissa; grado 2: attività inequivocabile e flusso misurabile in PD; grado 3: linee di colore inequivocabilmente conformate e riconducibili a neovasi con
flusso identificabile (Fig. 5). I programmi di esercizio sono stati adattati alle esigenze individuali dei
pazienti in considerazione del grado di evoluzione
delle lesioni.
Il criterio di successo consisteva nel raggiungimento della guarigione funzionale, con ripresa di
un’attività sportiva al livello precedente l’infortunio, e nell’assenza di recidive per un anno dal trattamento: quest’ultimo è considerato come il metodo valutativo più significativo (Smith e McIlwraith 2012).
RISULTATI
Nel test intradermico non sono state osservate
FIGURA 2 - Arto preparato per l’iniezione del SDFT.
Dopo l’inoculazione, l’arto è stato fasciato con cotone garzato sterile e fasce elastiche autoadesive
(Vetrap®). Tale medicazione è stata mantenuta per
le prime 48 h, periodo durante il quale i cavalli sono stati confinati in box.
Per il periodo di convalescenza sono stati prescritti 15 minuti di passo a mano per 15 giorni,
aumentati a 30 minuti per un medesimo periodo. In nessun caso sono stati somministrati antibiotici o farmaci antiinfiammatori non steroidei
(FANS).
6
reazioni avverse acute locali o generali e non è
stato evidenziato, nel periodo di osservazione di 1
anno, nessun fenomeno di sensibilizzazione o di
metaplasia nel punto di inoculo.
I dettagli riguardanti il segnalamento dei soggetti
coinvolti in questo studio, la localizzazione e la gravità delle lesioni nonché il follow up sono mostrati in Tabella 1. Le strutture anatomiche coinvolte
sono le seguenti: tendine flessore superficiale delle
falangi (SDFT - 5 soggetti), branche del legamento
sospensore del nodello (SLB - 6 soggetti, di cui 1
con associata una desmopatia con avulsione parziale del legamento sesamoideo distale obliquo opposto alla branca), corpo del legamento sospensore (2 soggetti), legamento collaterale dell’articolazione interfalangea distale (DIP - 3 soggetti, 2 legamenti mediali e 1 laterale).
Tutte le procedure svolte sono state ben tollerate e non si sono verificate reazioni collaterali all’iniezione del AMCs-CM; i pazienti sono stati in
grado di deambulare senza problemi dopo l’impianto e non è stato necessario l’uso di antinfiammatori. Inoltre, non sono stati prescritti antibioti-
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ci in fase peri-operatoria, avendo mantenuto
l’asepsi in tutte le fasi della procedura. Nel corso
del follow up non si sono riscontrate evoluzioni
tissutali anomale a nessuno stadio post-trattamento: l’assenza di isole fibrotiche, metaplastiche
o mineralizzate nell’area trattata è da considerarsi una caratteristica di sicurezza. Una diminuzione
dell’area di sezione trasversa (CSA) nel punto di
maggior lesione è stata documentata già nel breve periodo, così, come un consistente miglioramento dell’ecogenicità e dell’architettura del tratto lesionato come mostrato nelle Tabelle 2 e 3;
inoltre, la modalità PD (Fig. 6A e 6B) ha permesso di confermare la presenza di un’aumentata
neovascolarizzazione già 30 giorni post-trattamento. Questa ha sempre manifestato il suo picco nello stesso periodo, per poi regredire spontaneamente, sino a scomparire, nel periodo finale
del processo di guarigione. È da sottolineare che
questa osservazione è stata considerata il punto
chiave nel processo decisionale in fase di riabilitazione. Sei dei 16 cavalli hanno ripreso la loro attività al quarto mese dal trattamento, 1 (caso n. 1)
con lesioni multiple ha iniziato l’attività agonistica
dopo 10 mesi ed 1 (caso n. 16) è stato venduto
dopo 5 mesi, non appena in grado di riprendere
l’attività agonistica. Per questo soggetto si è dovu-
FIGURA 3 - Iniezione ecoguidata SDFT.
to ricorrere ad informazioni contenute nei database elettronici e ai contatti telefonici per coprire la successiva finestra di “follow up”. Per quanto riguarda le lesioni a carico del SDFT (5 in totale) si è riscontrata una recidiva a 5 mesi (caso
n. 3), nella fase finale della riabilitazione, in un sog-
FIGURA 4A - Confronto tra immagini radiografiche e di risonanza magnetica in sequenza T1 GRE della entesiopatia distale del legamento collaterale mediale dell’articolazione interfalangea distale.
FIGURA 4B - Inserimento dell’ago nella fossa collaterale della falange distale per l’iniezione e controllo del posizionamento mediante radio-guida.
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FIGURA 5 - Immagini Power Doppler di SDFT in scansione longitudinale rappresentati gradi di attività classificate rispettivamente da 1 a 3.
TABELLA 1
Caso n°
Razza,
età (anni),
sesso
Disciplina
Arto
n° 1
SI, 8 aa, C
SO
LF
SDFT
III prox MC +
n° 2
KWPN,
15 aa, C
volteggio
RH
SLB
n° 3
SI, 5 aa, C
SO
LF
Struttura
lesionata
Localizzazione
Intervallo
Grado lesione-impianto
(gg)
Esito
5
20
sport
branca laterale
4
14
recidiva a
1 anno
SDFT
III medio MC
5
15
recidiva a
5 mesi
intratecale
n° 4
SI, 6 aa, C
SO
RF
SDFT
III medio MC
4
8
sport
n° 5
PRE, 12aa, M
dressage
LF
SDFT
III medio MC
5
8
sport
n° 6
BWP,
12 aa, C
SO
RF
SLB
branca mediale
5
20
sport
n° 7
PRE, 8 aa, M
dressage
RF
SLB
branca mediale
5
20
sport
n° 8
PSA, 6 aa, F
endurance
RF
SLB + LSO
branca mediale
+ terzo prox
LSO mediale
4
10
120 km
n° 9
PSA, 6 aa, F
endurance
RF
SL
corpo
4
10
120 km
n° 10
Hannover,
10 aa, C
dressage
RH
SLB
branca mediale
6
10
sport
n° 11
SI, 7 aa, M
SO
LF
DIP
leg coll. med
entesiopatia distale
e avulsione parziale
30
sport
n° 12
SI, 9 aa, M
dressage
LF
SDFT
III medio MC
5
15
sport
n° 13
PSA, 7 aa, F
endurance
RF
SL
corpo
4
12
training
n° 14
GV, 4 aa, C
attacchi
LF
DIP
leg coll. med
15
sport
n° 15
PSA, 8 aa, F
endurance
LF
DIP
leg coll. med
60
training
20
sport cavallo
venduto
n° 16
SI, 10 aa, F
SO
RH
SLB
branca lat e med
4
BWP, Belgian Warmblood; PSA, purosangue arabo; SI, sella italiano; GW, gipsy wanner ; KWPN, Koninklijk Warmbloed Paardenstamboek Nederland; PRE, pura razza spagnola.
SO, salto ostacoli; C, castrone; M, maschio; F, femmina; LF, anteriore sinistro; LH, posteriore sinistro; RF, anteriore destro; RH, posteriore
destro; SDFT, tendine flessore superficiale delle falangi; SL, legamento sospensore del nodello; SLB: branca del legamento sopsensore; OSL,
legamento sesamoideo obliquo; DIP, articolazione interfalangea distale; MC, metacarpo; med, mediale; lat, laterale; prox, prossimale.
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FIGURA 6A - Esame ecografico e PD di una lesione longitudinale di una branca del legamento sospensore in un arto anteriore. Si può notare un
notevole aumento di segnale Doppler dopo 35 giorni dall’iniezione. Non vi è più riscontro di neovascolarizzazione a guarigione avvenuta a 150
giorni circa.
FIGURA 6B - Esame ecografico e PD di una severa core lesion di un SDFT. Anche in questo caso si evidenzia uno spiccato aumento del segnale
Doppler a 30 giorni, l’intensità è poi diminuita progressivamente sino a scomparire a 120 giorni circa.
TABELLA 2
Classificazione ecografica delle lesioni a carico del SDFT
Casi SDFT
Vol mm3
Eco T0
Eco T1
All T0
All T1
PD T0
n° 1
1200
3
1
2
1
1
2
n° 3
360
3
1
2
1
1
2
n° 4
1000
3
1
2
1
1
3
n° 5
480
3
0
2
1
1
2
n° 12
790
3
1
2
1
1
2
PD T1
Vol: volume espresso in mm3 - Eco: ecogenicità - All: allineamento longitudinale delle fibre
PD: grado di attività Power Doppler - T0: momento della diagnosi - T1: 30 giorni dall’inoculazione
TABELLA 3
Classificazione ecografica delle lesioni a carico del SLB
Casi SLB
Vol mm3
Eco T0
Eco T1
All T0
All T1
PD T0
PD T1
n° 2
1500
3
1
2
1
1
2
n° 6
1240
3
1
3
2
1
3
n° 7
3000
3
1
2
1
1
3
n° 8
832
2
1
2
1
1
2
n° 10
440
3
1
2
1
1
2
n° 16
108
2
1
2
1
1
3
Vol: volume espresso in mm3 - Eco: ecogenicità - All: allineamento longitudinale delle fibre
PD: grado di attività Power Doppler - T0: momento della diagnosi - T1: 30 giorni dall’inoculazione
Ippologia, Anno 25, n. 2, Giugno 2014
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getto utilizzato per il salto ostacoli. La percentuale di recidiva all’interno delle lesioni del SDFT è
del 20%. Gli altri soggetti (2 cavalli da salto ostacoli e 2 da dressage) hanno ripreso una regolare
attività agonistica in un tempo variabile tra 6 e 8
mesi. Il soggetto n° 1, in cui sono state riscontrate severe core-lesion multiple in sede metacarpale e intratecale, è stato riportato al precedente livello di attività nell’arco di un anno; il soggetto è
l’unico dello studio precedentemente trattato
con altre metodiche rigenerative.
I soggetti con lesioni a carico del legamento sospensore sono in totale 8, di cui 2 con lesioni a carico del corpo, 4 con lesioni localizzate nella branca mediale, 1 con lesioni di entrambe le branche
su un posteriore e 1 con lesione sia della SLB mediale sia del legamento sesamoideo distale obliquo
corrispondente. In questo gruppo sono rappresentati soggetti impiegati in diverse discipline: salto ostacoli (2), dressage (2), volteggio (1), endurance (3). Dei due soggetti con lesioni al corpo del
SL (entrambi impiegati in gare di endurance su distanze di 90-120 km) uno ha ripreso il precedente livello di impegno sportivo nell’arco di un anno,
l’altro risulta attualmente ancora in allenamento.
Nei 6 casi con lesioni alle branche si è riscontrata
una recidiva (pari ad una percentuale del 16,66%).
I 3 casi di entesiopatia distale del legamento collaterale della DIP, curiosamente molto simili tra loro, sono stati monitorati clinicamente e radiologicamente. Si è riscontrato scomparsa della zoppia
dopo mediamente 45 giorni ed il ritorno al precedente livello agonistico si è verificato nell’arco dei
successivi 180 giorni.
Tutti i soggetti utilizzati per l’endurance hanno
progressivamente ripreso l’allenamento sulla lunga distanza (120 km), mentre due cavalli (casi n. 8
e 15) con lesioni particolarmente gravi e zoppia di
grado elevato hanno recuperato con successo il
precedente livello di impegno sportivo.
In totale sono stati registrati due casi di recidiva,
un SDFT ed un SLB. La tendenza evolutiva globale
è apparsa in linea con l’impiego delle sole AMCs
(Lange-Consiglio et al., 2013a). Dopo un anno, la
percentuale di successo si è assestata all’87,5%.
DISCUSSIONE
Tendini e legamenti, quando subiscono un trauma,
vanno incontro ad un processo di guarigione molto lento e spesso si assiste alla formazione di un
tessuto cicatriziale fibroso, caratterizzato da ipercellularità e scarsità di matrice extra-cellulare. Il
risultato è una maggiore rigidità del tratto tendineo lesionato, con perdita delle caratteristiche di
elasticità originarie. La tendenza alla fibroplasia risulta particolarmente svantaggiosa nelle strutture
a maggior componente elastica, come il tendine
flessore superficiale delle falangi ed il legamento
10
sospensore del nodello, che statisticamente sono
i tessuti molli più soggetti a sviluppare lesioni nei
cavalli sportivi (Caniglia et al., 2011). A livello pratico ciò si traduce in tempi di recupero e riabilitazione prolungati ed in frequenti recidive una volta
riportato il cavallo in piena attività. Soprattutto in
quei soggetti impegnati in competizioni sportive di
alto livello, la prognosi per un completo recupero
delle performance atletiche è spesso riservata.
Nel corso del tempo sono stati utilizzati diversi
trattamenti, sia medici sia chirurgici, nel tentativo
di ridurre i tempi di recupero delle lesioni tenodesmiche e, soprattutto, con l’intento di ottenere
una migliore guarigione ed una riduzione della
percentuale di recidive.
Negli ultimi anni, gli studi sul trattamento delle lesioni teno-desmiche si sono orientati sulla ricerca
di fattori di rigenerazione che favorissero, nei tessuti lesionati, la restituzione di una struttura ed
una biomeccanica il più possibile vicine a quelle fisiologiche. In quest’ambito, ha assunto sempre
maggiore importanza l’utilizzo di componenti biologiche come fonte di fattori di rigenerazione: nel
capitolo delle terapie biotecnologiche, che comprendono il trapianto di midollo in toto, il siero
condizionato (IRAP) ed il plasma arricchito di piastrine (PRP), un ruolo particolarmente importante spetta alle cellule staminali mesenchimali
(MSCs) perché ritenute in grado di differenziarsi
in tenociti, indurre produzione di fattori di crescita e stimolare la neoangiogenesi (Di Santo et al.,
2009, Alves et al., 2011).
La ricerca si è principalmente concentrata sull’impiego di MSCs autologhe, onde evitare reazioni
immunitarie di rigetto: le cellule staminali possono essere ricavate da diversi tessuti, ma la fonte
privilegiata è il midollo osseo. Le cellule staminali
da midollo (BM-MSCs) hanno dimostrato ottimi
risultati nel trattamento di varie patologie ortopediche (Crovace et al., 2010, Godwin et al.,
2012), fra cui le lesioni teno-desmiche, ma il loro
utilizzo nella pratica ippiatrica ha evidenziato alcuni svantaggi, che spesso ne limitano l’uso. Il prelievo stesso di midollo, che generalmente nel cavallo viene eseguito mediante un ago di Jamshidi
a livello sternale, risulta una procedura piuttosto
semplice, eseguibile anche in anestesia locale, ma
pur sempre invasiva e non esente da complicazioni (pneumopericardite) (Durando et al., 2006). Il
limite principale nell’utilizzo delle cellule staminali autologhe risiede nel tempo variabile fra 3 e 4
settimane (Guest et al., 2010) per la coltura e relativa espansione delle cellule stesse: ciò comporta un ritardo nel trattamento della lesione che
permette ai processi di guarigione spontanea di
agire sui tessuti lesionati, aumentando il rischio di
fibroplasia e limitando il potenziale rigenerativo
apportato dalle cellule staminali. Per ottimizzare
questo intervallo temporale è stata indagata la
possibilità di utilizzo di cellule staminali eterolo-
Applicazione clinica di medium condizionato derivato da cellule mesenchimali amniotiche nella terapia teno-desmica del cavallo sportivo
❚ Ortopedia
ghe, in particolare le cellule di derivazione amniotica (Lange-Consiglio et al., 2012) in quanto prive
di attività immunogenica. Queste si sono rivelate
non solo efficaci quanto le cellule di derivazione
autologa ma hanno fatto registrare tassi di recidiva più contenuti, come probabile conseguenza di
poter intervenire prima della manifestazione di
evoluzioni intra-lesionali spontanee (Lange-Consiglio et al., 2013a).
Studi più recenti sui meccanismi di azione delle
cellule staminali mesenchimali indicherebbero che
il loro effetto in vivo dipenda non tanto dalla diretta differenziazione in elementi cellulari specifici
ma, principalmente, dalla capacità di secernere fattori solubili bioattivi (Tetta et al., 2012). Queste
micro-molecole, dette secretomi, potrebbero essere in grado di inibire la fibrosi e l’apoptosi cellulare, di stimolare l’angiogenesi e la mitosi, di indurre la differenziazione di cellule staminali intrinseche (Caplan et al., 2006) nonché modulare la risposta immunitaria (Yagi et al., 2010). Il ruolo chiave dei fattori solubili prodotti da cellule di derivazione amniotica è stato dimostrato in un modello
di fibrosi polmonare nel topo (Cargnoni et al.,
2012). Il trapianto di cellule amniotiche, ma soprattutto l’iniezione del loro medium condizionato, riduceva la gravità e la progressione della malattia sottolineando l’effetto antinfiammatorio del
medium stesso. Numerosi altri esperimenti su patologie indotte hanno confermato questa ipotesi
(Di Santo et al., 2009; Timmers et al., 2007).
L’identità dei singoli fattori solubili rimane parzialmente sconosciuta sebbene sia stato dimostrato
che le MSC producono TGF-b1, hepatocyte
growth factor, prostaglandin E2, interleukin-10, heme oxygenase-1, interleukin-6, e human leukocyte
antigen-G5 (Aggarwal et al., 2005; Chabannes et
al., 2007).
Gli studi precedenti sulle proprietà del CM sono
stati condotti in soggetti sperimentali con patologie indotte. A nostra conoscenza, il nostro studio
è il primo lavoro in cui AMCs-CM è stato testato
in patologie teno-desmiche spontanee di un gruppo di soggetti sportivi. Sono stati trattati 16 pazienti di razza, sesso, età e attitudine sportiva diversa (Tab. 1) che sono stati monitorati per almeno 1 anno dalla ripresa dell’attività. Le valutazioni
cliniche ed ultrasonografiche seriali non hanno rivelato evidenze di tessuti etero-sostitutivi nella
compagine tendinea trattata, a conferma di quanto precedentemente indicato dai test intracutanei.
Non avendo somministrato terapie farmacologiche in fase peri-impianto, il mancato riscontro di
reazioni locali, l’alto grado di benessere dimostrato da tutti i cavalli, unitamente alla precoce riduzione di volume dell’area lesionale e della sua
CSA, sono suggestive di una correlata attività antinfiammatoria di AMCs-CM. La potenzialità di
modulare gli effetti deleteri della flogosi locale in
fase acuta collocherebbe il medium condizionato
fra i metodi d’elezione nel trattamento precoce
delle tendinopatie.
Particolarmente significativo l’esame ecografico
con PD. Questo, rispetto alla modalità Color
Doppler, dimostra una maggior sensibilità ai flussi
lenti (in particolare al micro-circolo all’interno di
organi e tessuti) e una conveniente indipendenza
dell’angolo sonoro di incidenza, rendendo possibile un esame accurato di strutture che non mantengono, nel loro decorso, il parallelismo con la
superficie di appoggio della sonda ecografica. Rispetto al Color Doppler, vengono perdute informazioni circa la direzione e la velocità del flusso,
che in questo contesto non forniscono, però, dati documentali significativi. Una difficoltà tecnica
reale consiste nel limitare gli artefatti da movimento avendo deciso di non ricorrere a sedazione durante l’esame, per non alterare l’emodinamica periferica. L’esame PD ha, ormai, confermato la sua estrema importanza ed è ora considerato un parametro valutativo ancora più significativo della misurazione della CSA, in quanto permette di valutare e monitorare l’attività intra-tendinea e la sua evoluzione (Smith 2014). La neovascolarizzazione, interpretata come uno stadio
funzionale del processo di guarigione, è stata costantemente riscontrata dopo i nostri trattamenti con AMCs-CM, sia nei tendini sia nei legamenti. Il PD ha permesso di individuare la formazione
di nuovi vasi già un mese dopo l’impianto. Questo
è in accordo con i risultati di altri autori (Bosch
et al., 2011) basati su altri trattamenti rigenerativi, come ad esempio il PRP. Il prolungato riscontro di un’aumentata vascolarizzazione spiegherebbe come dopo una singola iniezione locale di
fattori trofici, che permangono per un breve periodo in loco, possa conseguire un significativo
miglioramento della qualità della rigenerazione.
La neoangiogenesi sarebbe mediata da una maggiore espressione del vascular endothelial growth
factor (VEGF), che fisiologicamente non è espresso in tendini adulti ma solo in tendini fetali (Petersen et al., 2002).
Nei soggetti trattati con AMCs-CM, l’ampiezza e
la quantità dei vasi diminuiva con il migliorare dell’ecogenicità e dell’architettura della struttura, sino a scomparire in stadi più tardivi, intorno al
quarto mese, con lievi variazioni individuali. Questo pattern, compatibile con l’azione locale di citochine angio-attive e fattori di crescita vascolari,
costituisce, a nostro avviso, un passaggio essenziale del processo di guarigione tissutale e deve essere considerato come un importante indicatore
temporale nella fase di ripresa dell’attività sportiva. La presenza di un concreto segnale PD è, infatti, da considerarsi come indicativa di vasi nella
compagine del tessuto di granulazione infiammatorio che occupa la sede lesionale (Murata et al.,
2012). In questo senso, l’evoluzione del microcircolo può essere utilizzata come metodo per indi-
Ippologia, Anno 25, n. 2, Giugno 2014
11
❚ Ortopedia
viduare il programma di riabilitazione ottimale per
ogni singolo soggetto: infatti, un’attenta impostazione dell’esercizio fisico e, di conseguenza, un
adeguato carico meccanico del tendine rappresentano un fattore chiave per ottimizzare la riorganizzazione della matrice connettivale extracellulare e prevenire la fibroplasia (Egerbacher et al.,
2006, Butler et al., 2008). Gli autori, infatti, considerano l’esercizio fisico precoce una condizione
fondamentale per permettere al tendine di riacquistare caratteristiche meccaniche di resistenza
ed elasticità soddisfacenti; ciò necessita, però, di
un’attenta valutazione ciclica e di esercizi con carico dinamico progressivo, al fine di stimolare gradualmente le capacità propriocettive (Denoix e
Paillou, 2011). Per queste ragioni non si sono predilette fasi fisioterapiche in aqua-treadmill dove è
dimezzato il carico e annullata la componente inerente l’attività biologica di meccano-transduzione
dei propriocettori.
Dei 16 cavalli trattati, 14 avevano ripreso il precedente livello di attività prima del termine del periodo di osservazione e monitoraggio, indicando
una percentuale di successo pari al 87,5%, sebbene il campione ristretto e le variabili legate a lesioni di diverse strutture non possano consentire
un’analisi statistica significativa dei risultati. Le due
recidive riscontrate in fasi avanzate di riabilitazione erano a carico di un SDFT anteriore e di una
SLB in un posteriore. La percentuale di recidiva
(20%) a carico del SDFT risulta sovrapponibile ad
altri riscontri (Godwin et al., 2012) a seguito di
trattamenti con BM-MSC.
La percentuale di recidiva, in assoluto ed all’interno di ogni categoria (16,66% per le SLB), risulta in
linea con i risultati ottenuti in studi precedenti sulle terapie rigenerative, condotti su un numero statisticamente significativo di soggetti. La recidiva a
carico della SLB era relativa ad un cavallo da volteggio di grossa taglia che svolgeva prevalentemente lavoro alla longe in circolo a mano sinistra,
come richiesto da questo tipo di attività sportiva,
il che si traduce in un sovraccarico della struttura
interessata. È ben documentato che le SLB contribuiscono alla stabilizzazione articolare metacarpofalangea, nell’esercizio in circolo, agendo sinergicamente ai legamenti collaterali (Crevier-Denoix
et al., 2005). Ciò significa che la SLB laterale dell’arto all’esterno del circolo (in questo caso il posteriore destro) sostiene un maggior grado di
stress biomeccanico e, di conseguenza, un secondo infortunio a questo livello può essere considerato come risultato di sovraccarico ciclico. Inoltre,
è noto come nel complesso delle lesioni a carico
dell’apparato sospensore intervengano anche
meccanismi di tipo degenerativo che alterano le
caratteristiche dell’intera struttura (Dyson, 2010).
Accanto a queste recidive possiamo, però, annoverare la ripresa completa dell’attività di un caso severo di core-lesion multiple in sede metacarpale
12
ed intratecale di un SDFT (caso 1) che, peraltro
era stato precedentemente trattato con altre metodiche rigenerative.
Nel complesso, i dati ottenuti sono sovrapponibili (in termini di percentuale di successo ed intervallo temporale necessario alla ripresa della completa attività sportiva) a quelli osservati in precedenza dagli stessi autori in un simile modello animale, ma utilizzando le sole AMCs. Questo confermerebbe l’ipotesi che anche negli studi precedenti, probabilmente, le cellule abbiano espletato
la loro funzione rigenerativa attraverso meccanismi paracrini. Pertanto, si profila la possibilità di
sostituire il trattamento cellulare con CM derivante dalla coltura delle stesse cellule.
CONCLUSIONI
Sulla base dei risultati ottenuti, il CM derivante da
cellule staminali mesenchimali amniotiche sembra
dimostrare un ottimo potenziale nel trattamento
delle lesioni teno-desmiche nel cavallo ed evidenzia un significativo stimolo dell’angiogenesi. Il potenziale rigenerativo di AMCs-CM è da attribuirsi
ad una secrezione paracrina delle cellule durante
il processo di coltura in vitro, con rilascio di molecole solubili che svolgono diverse attività biologiche sui tessuti bersaglio (Meirelles et al., 2009).
Le nostre osservazioni portano, inoltre, ad ipotizzare che le stesse molecole possano interagire
con le popolazioni di cellule residenti e stimolare
sia una risposta neo-angiogenetica, presumibilmente attraverso una attivazione del VEGF, sia la
differenziazione di elementi cellulari multipotenti,
avviando così il processo di rigenerazione/riparazione tissutale.
Da un punto di vista pratico ciò comporta la possibilità di effettuare dei trattamenti intralesionali
“cell-free”, con tutti i vantaggi che ne derivano. In
primis, la possibilità di non dover ricorrere ad impianti autologhi, con tempi particolarmente lunghi.
Inoltre, AMCs-CM può essere prodotto facilmente ed in grandi quantità; può essere conservato efficientemente in quanto mantiene le sue caratteristiche dopo la liofilizzazione; riduce drasticamente
il rischio di reazione immunitarie avverse, il rischio
di infezioni ed altri effetti negativi a lungo termine
in quanto trattamento a-cellulare. Inoltre, AMCsCM è stato gestito in modo sicuro attraverso iniezione endovenosa, evitando la formazione di coaguli e trombi nei capillari polmonari, come riportato in un modello sperimentale (Cargnoni et al.,
2009), profilando future applicazioni per altre patologie e sedi di inoculo. I limiti di questo studio
pratico sono da ricercare nel numero limitato di
campioni, nell’eterogeneità delle lesioni, dei soggetti e delle loro attitudini, che però riteniamo rispecchino la nostra popolazione sportiva e le relative principali patologie teno-desmiche. Inoltre,
Applicazione clinica di medium condizionato derivato da cellule mesenchimali amniotiche nella terapia teno-desmica del cavallo sportivo
❚ Ortopedia
sono assenti un gruppo di controllo e, per ovvie
ragioni, esami istologici dei singoli tessuti trattati,
per cui l’analisi dei risultati è stata effettuata con
metodi strumentali dipendenti dall’operatore; tuttavia il paragone con metodiche terapeutiche di
acquisita efficacia permette di supplire a una popolazione statisticamente più significativa (Smith,
2014), che viene identificata in un gruppo di almeno 88 cavalli (Smith e McIlwraith, 2012).
Riteniamo, comunque, che i nostri riscontri permettano di proporre AMCs-CM come il più evoluto approccio biotecnologico alle tendinopatie,
introducendo, inoltre, nuove acquisizioni circa alcuni aspetti del meccanismo di rigenerazione tendinea prodotto da elementi staminali e consentendo di focalizzare l’attenzione sul ruolo particolare dei fattori ad azione neo-angiogenetica. Di
particolare interesse pratico è il meticoloso esame ecografico mediante tecnica Power Doppler
quale elemento discriminante nell’analisi dell’evoluzione della lesione e relative decisioni sulle variazioni del grado di esercizio da proporre nella
delicata fase riabilitativa.
RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia il Dr. Matteo Toniato per la collaborazione diagnostica riguardo gli esami per Risonanza Magnetica e Lorenzo Redaelli per aver seguito
i test intracutanei.
Parole chiave
Cavallo, tendini, medium condizionato, Power Doppler.
❚ Clinical application of amniotic
derived mesenchimal cells
conditioned medium in tendon
and ligament injuries of sport
horses
S ummary
Growing evidences are indicating that mesenchimal stem cells may promote tendon repair via paracrine-acting molecules targeting inflammatory
and trophic processes. To test this hypothesis we
have studied the therapeutic potential of conditioned medium secreted by equine amniotic derived
cells (AMCs-CM) in sixteen spontaneous different
tendon and ligament injuries. Careful monitoring
has proved the safety of these implants. Clinical
outcomes were favorable and the significantly lower rate (12.5%) of re-injuries observed, compared to horses treated with bone marrow MSC,
suggests that treatment with AMCs-CM has a
proven efficacy. In conclusion, this study identifies
AMCs-CM as a novel therapeutic biological cellfree product in the treatment of horse tendon
and ligament diseases.
Key words
Horse, tendon, conditioned medium, Power Doppler.
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