Ropolo

IL CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI:
CAMPIONAMENTO,INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO, FLUSSI INFORMATIVI e GESTIONE DELLE NC
I CONTROLLI SULLE ACQUE
Luciana Ropolo
Torino,10 giugno 2013
Acque potabili
ll controllo ufficiale delle acque per il consumo umano viene
effettuato in base al Decreto Legislativo
2 febbraio 2001, n.31.
Dall’entrata in vigore del decreto, le ASL eseguono
ogni anno oltre 20.000 campionamenti
sui quali i laboratori di Arpa effettuano i controlli
Il controllo delle acque è un processo che si articola in:
FASI PREANALITICHE
(campionamento)
FASI ANALITICHE
FASI POST ANALITICHE
programmazione
preparazione verbali e materiali
analisi in campo
prelievo
trasporto campioni
accettazione campioni
analisi microbiologiche
analisi chimiche
analisi fisiche
calcolo incertezza di misura
espressione risultato
valutazione conformità
redazione rapporto di prova
CAMPIONAMENTO: procedura definita secondo cui una
parte di sostanza, materiale o prodotto, è prelevata per fornire un
campione rappresentativo della totalità…. Le procedure di
campionamento dovrebbero descrivere i criteri di selezione, il piano di
campionamento, di ritiro e di preparazione di uno o più campioni a
partire da una sostanza, da un materiale o da un prodotto per ottenere
l’informazione richiesta (UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005)
PRELIEVO: fase del campionamento in cui le modalità
operative sono descritte nel dettaglio da norme, procedure di
campionamento etc e il cui svolgimento non comporta discrezionalità
da parte dell’operatore che la esegue.
Rapporti ISTISAN 07/5
MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO E CONSERVAZIONE
DEI CAMPIONI
0. Generalità e definizioni
L’insieme dei procedimenti e delle operazioni che intercorrono tra il
momento del prelievo del campione e lo svolgimento di un’analisi
microbiologica rappresenta una delle fasi più delicate dell’intero
procedimento analitico. I risultati analitici, e in particolare quelli
microbiologici, infatti,devono permettere di stabilire le caratteristiche
della matrice analizzata nelle condizioni in cui essa si trova nel
momento in cui viene effettuato il prelievo.
La fase pre-analitica, raccolta del campione,trasporto e sua
conservazione, incide in misura non trascurabile sull’incertezza totale
del risultato dell’analisi, diventando quindi strumento indispensabile per
ottenere risultati analitici attendibili e affidabili.
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Campioni rappresentativi possono essere ricavati solo sulla base di
piani di campionamento che prevedano:
obiettivi del prelievo,
individuazione delle stazioni di prelievo,
tempi e frequenze con cui debbono essere raccolti i campioni,
le modalità di manipolazione e conservazione dei campioni,
gli eventuali parametri da determinare in situ e
i criteri di valutazione e gestione dei dati.
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Programmazione
Nell’ambito della collaborazione ASL/Arpa Piemonte per la costruzione
dell’anagrafica comune dei punti di prelievo per la matrice “acque
potabili”, l’Assessorato Tutela della Salute e Sanità ha attivato il sito
http://sian.reteunitaria.piemonte.it con il nuovo programma per la
gestione dei dati delle acque potabili in ambiente web.
Con D.D. n. 201 del 15/03/2011 sono state approvate le ”Linee Guida
per la gestione dei dati del Sistema informativo regionale in materia di
acque destinate al consumo umano”.
•Anagrafica condivisa tra Asl e Arpa
•Possibilità di accesso al portale agli operatori di entrambi i servizi
•Archivio dati
•Programmazione attività
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Preparazione verbali
Nel sito http://sian.reteunitaria.piemonte.it si trovano i
modelli di verbale:
Verbale per prelievi fiscali
Scheda di campionamento per campioni non fiscali
Verbale per prelievi a pagamento
Scheda di campionamento per prelievi di acqua
superficiale da potabilizzare
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Preparazione verbali
Uniformare la tipologia:
1° campione sempre conoscitivo, 2° campione fiscale (in caso di non
conformità del 1°) e nei casi in cui la legge obbliga la fiscalità sempre.
Necessità di piena corrispondenza tra n° bottiglie consegnate e n° bottiglie
inserite su programma; volume idoneo.
Sul verbale di prelievo va riportata ogni notizia utile alla interpretazione dei
risultati delle analisi (ad esempio dati riguardanti gli eventuali trattamenti di
potabilizzazione in corso, la concentrazione del cloro libero in rete al punto di
prelievo, la data dell'ultima disinfezione o pulizia effettuata in caso di controllo
su vasche di raccolta, ecc.).
Etichette: utilizzo esclusivo di quelle stampabili dal programma in quanto
legate al verbale; utilizzo di un’etichetta per ogni bottiglia
Preparazione materiale :
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Preparazione materiale
Analisi microbiologiche:
Bottiglie sterili volume circa 500 ml
in plastica monouso (verificare data scadenza sterilizzazione)
o in vetro pirex (utilizzo entro 3 mesi dalla sterilizzazione)
con tiosolfato di sodio 10% nella quantità di 0,1 mL per ogni 100 mL di capacità
della bottiglia in grado di neutralizzare fino a 5 mg/L di cloro residuo libero e
combinato.
Analisi chimiche:
Bottiglie in vetro o plastica secondo le indicazioni del laboratorio
Materiale vario: termometro, flambatore, disinfettante, contenitori refrigerati……
È a carico del committente l’approvvigionamento dei materiali per il
prelievo ed il trasporto dei campioni, salvo accordi locali o particolari
esigenze analitiche (Accordo Arpa-Sanità prot. 15289 del 16/4/2010).
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Analisi in campo
Misurazione T° acqua
Misurazione cloro libero
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Prelievo
Istantaneo (raccolta di un unico campione in un’unica soluzione, in punti
rappresentativi e in un tempo breve)
Evitare qualsiasi contaminazione e alterazione della qualità del campione
da esaminare.
Non sciacquare mai, all’atto del prelievo, le bottiglie/contenitori utilizzati per
prelevare campioni per analisi microbiologiche. Il risciacquo oltre ad esporre
i recipienti a possibili contaminazioni, asporterebbe il sodio tiosolfato
eventualmente presente.
È opportuno disinfettare il rubinetto esternamente e internamente rimovendo,
se presenti, tubi di plastica e gomma.
Prima del campionamento flambare i rubinetti metallici e/o disinfettare con
una soluzione di sodio ipoclorito o analoghi disinfettanti: possono essere
utilizzate soluzioni al 10% di sodio ipoclorito commerciale o di sodio
dicloroisocianurato.
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Prelievo
Eseguire il prelievo dopo avere fatto scorrere dal rubinetto l’acqua
per 1-3 minuti evitando di modificare la portata del flusso durante la
raccolta del campione.
All’atto del prelievo, aprire la bottiglia sterile avendo cura di non
toccare la parte interna del tappo che andrà a contatto con il
campione prelevato, né l’interno del collo della bottiglia e provvedere
all’immediata chiusura della stessa subito dopo il prelievo, avendo
cura di non riempirla completamente al fine di consentire una
efficace omogeneizzazione del campione, in laboratorio, al momento
dell’analisi.
Per i campioni destinati all’analisi chimica i contenitori devono essere
sufficientemente risciacquati con la stessa acqua da prelevare
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Trasporto campioni
Durante il trasporto e la conservazione di campioni di acqua per l’analisi
microbiologica è necessario mantenere la rappresentatività del campione da
analizzare e quindi prevenire il decadimento o la ricrescita dei microrganismi
presenti.
Per quanto possibile, si devono quindi limitare alterazioni che sono spesso
inevitabili in un’aliquota ridotta di acqua mantenuta in un contenitore chiuso.
Le alterazioni cui possono andare incontro campioni di acqua prelevati
possono avere origine, non solo dalla condizione di spazio confinato in cui si
ritrovano, ma anche da fattori fisici-chimici biologici (composizione chimica
dell’acqua, pH, azoto proteico, qualità e quantità della flora batterica
presente, fenomeni di fagocitosi, ecc.) e dalla inosservanza dei tempi e/o
delle modalità di trasporto.
Il campione deve essere protetto sia dalla luce (ultravioletta e visibile) sia
dalle alte temperature e deve essere trasportato in laboratorio in idonee
condizioni igieniche.
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Trasporto campioni
Durante il trasporto le bottiglie devono essere collocate nel contenitore in
modo da impedire il loro rovesciamento e, fra esse devono essere collocati
idonei sistemi di separazione per evitare rotture
Tutti i campioni, dall’atto del prelievo sino all’arrivo in laboratorio, vanno
conservati ad una temperatura inferiore a 10 °C
Consigliabile l’uso di frigoriferi portatili a batteria con termocoppie registranti
la temperatura
Tuttavia, è almeno necessario usare contenitori termoisolanti che
contengano piastre eutettiche, evitando comunque il congelamento del
campione
Inserire sempre nel contenitore di trasporto un boccetto testimone” (provetta
contenente acqua o altro liquido idoneo ) sul quale viene effettuata la
misurazione della temperatura da parte dell’ufficio accettazione campioni
dell’Arpa.
FASI PREANALITICHE(campionamento)
Trasporto campioni
Nonostante la necessità di mantenere la temperatura dei campioni di acqua
nell’intervallo di valori consigliati, qualora le condizioni ambientali e quelle
intrinseche del campione non lo consentano, si raccomanda di verificare che la
temperatura di conservazione del campione non superi mai quella rilevata
all’atto del prelievo.
Fermo restando che il tempo che intercorre tra prelievo e analisi dei campioni,
indipendentemente dalla loro natura, deve essere il più breve possibile, nel
caso di acque destinate al consumo umano, corre l’obbligo di non superare le
24 ore.
FASI ANALITICHE
Accettazione campioni
Al momento dell’accettazione, vengono verificati da parte delle strutture che
ritirano i campioni gli elementi relativi al campionamento ed al trasporto riportati
nel verbale.
Qualora la temperatura rilevata risulti al di fuori dei criteri di accettabilità, o
qualora non sia presente il boccetto testimone, il campione viene comunque
accettato e sottoposto a prova; nel rapporto di prova vengono riportati in nota
gli esiti negativi delle verifiche qualora possano aver avuto influenza sui risultati
di prova e la dichiarazione finale di conformità viene effettuata solo
limitatamente agli esiti delle prove non condizionate da tali situazioni.
FASI ANALITICHE
Analisi microbiologiche
La matrice acqua costituisce un elemento di relativa facile
manipolazione a livello analitico, ma le sue caratteristiche chimicofisiche-microbiologiche, specifiche per ogni tipologia, possono costituire
fonte di instabilità quali-quantitativa dei suoi costituenti.
La variazione casuale dovuta alla distribuzione non uniforme delle
particelle tra campioni paralleli, persino nelle sospensioni perfettamente
miscelate, è una caratteristica dei metodi microbiologici.
La variazione casuale di base è inevitabile e non ha niente a che
fare con le competenze tecniche o l’apparecchiatura.
Essa segue una legge matematica nota, la distribuzione di Poisson.
FASI ANALITICHE
Analisi microbiologiche
Il tempo di sopravvivenza dei microrganismi nelle acque può essere
condizionato, oltre che dal loro stato di vitalità, anche dall’adesione a
materiale particolato.
Infatti, l’acqua, e quella disinfettata in particolare, rappresenta una
matrice non favorevole alla sopravvivenza delle forme microbiche.
Cellule batteriche sottoposte a condizioni di stress ambientale possono
comunque sopravvivere e permanere a stadi diversi di vitalità, ma più
spesso, pur restando metabolicamente attive, possono perdere la
capacità di moltiplicarsi in condizioni standard di laboratorio, rimanendo
quindi vitali ma diventando non coltivabili.
FASI POST ANALITICHE
Calcolo incertezza di misura
Parametro associato al risultato di una misurazione che caratterizza la
dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando
Concettualmente….
L’incertezza di misura può essere intesa come la stima dell’intervallo di
valori entro cui cade il valore vero di una misura.
Il valore di una caratteristica numerica è sempre incerto
La conoscenza dell’ampiezza di tale incertezza è indispensabile per
utilizzare al meglio i risultati delle misure
FASI POST ANALITICHE
Valutazione conformità (dati chimici)
Limite di
legge
non
conforme
conforme
Procedura Tecnica U.RP.T077:
Linee guida per individuazione conformità/non conformità in relazione ad
incertezza di misura e limiti normativi
Arpa Piemonte adotta il criterio cautelativo “in dubio pro reo” , tramite il
quale la non conformità viene espressa solo quando vi è la certezza oltre
ogni ragionevole dubbio del superamento del valore di riferimento.
FASI POST ANALITICHE
Valutazione conformità (dati microbiologici)
non conforme
i
ii
iii
Limite
di legge
iv
conforme
L’incertezza di misura viene associata al risultato per valori ≥10 U.F.C.
Arpa Piemonte adotta il criterio cautelativo per la salute pubblica , tramite il
quale la non conformità viene espressa quando viene superato il limite di
legge, indipendentemente dall’incertezza.
FASI ANALITICHE
Analisi microbiologiche
FASI ANALITICHE
Analisi microbiologiche
L’incertezza casuale aumenta rapidamente con la riduzione della conta
delle colonie.
Nell’intervallo di conteggio sotto a 10 circa, che è di considerevole
interesse per la salute pubblica, le singole misurazioni sono così
imprecise che possono essere a malapena caratterizzate come migliori
che semiquantitative.
FASI POST ANALITICHE
Espressione risultati microbiologici <10 U.F.C.
Nel caso di numero di colonie tra 4 e 9, la precisione diminuisce
quindi il risultato calcolato con la formula, viene espresso come “UFC
stimate/volume di campione” senza associare il valore
dell’incertezza di misura.
Nel caso di numero di colonie da 1 a 3, la precisione è così bassa
che il risultato dovrebbe essere riportato senza un dato numerico, ma
con l’espressione: “microrganismi presenti nel volume analizzato”;
in base ad accordi con il cliente, anche in questo caso si può esprimere
il dato numerico come“UFC stimate/volume di campione”, senza
associare il valore dell’incertezza di misura.
Se non vengono rilevate colonie il risultato è espresso come 0
UFC/volume di campione o <1 UFC/volume di campione a seconda di
quanto previsto dalla legislazione di riferimento.
FASI POST ANALITICHE
Redazione rapporto di prova
Il rapporto di prova è il documento con il quale i risultati delle analisi sono
trasmessi al committente; esso riporta, tra l’altro, tutte le indicazioni
identificative del campione e l’eventuale accreditamento.
Nel rapporto di prova i risultati sono riportati con un numero di cifre significative
compatibile con il metodo adottato, con le relative unità di misura e corredati
dell’incertezza di misura se significativa per la valutazione di conformità e/o se
richiesta dal Committente.
Il rapporto di prova è accompagnato, di norma, da una “dichiarazione di
conformità/non conformità” specifica dell’ambito di competenza (chimico,
fisico, biologico), che rappresenta una verifica di conformità/non conformità dei
dati prodotti in relazione ai requisiti di legge in caso di normativa specifica o a
valori guida concordati, e che specifica i parametri non regolamentari . In questi
ultimi casi e qualora ritenuto necessario, può essere emesso un “parere
tecnico”, che esprime il giudizio dell’analista in merito alle analisi effettuate.
GRAZIE PER L’ATTENZIONE