Original article - Blood Transfusion

Original article
Comparison of two different red cell panels for automated
detection of irregular antibodies
Elisabetta Vitali, Nerina Muffatti, Erminia Ciapponi, Roberto Parolo, Claudio Velati
Dipartimento di Medicina Trasfusionale e di Ematologia della Provincia di Sondrio
Background. The aim of this study was to compare the
sensitivity and specificity of two fully automated column
agglutination test (CAT) systems, one employing a 3%
screening panel and the other a 0.8% concentration of
red cells.
Materials and methods. Fifty-four frozen samples,
containing 60 known irregular alloantibodies, were
tested with an automatic system (AutoVue Ortho CD),
both with the 3% and the 0.8% screening panels
(Surgiscreen 3% and 0.8%, Ortho CD). The titre of
each antibody was determined with specific cells of the
two panels. Overall, 2,572 random samples were
screened with AutoVue, 1,551 using the 3% screening
panel and 1,021 with the 0.8% one.
Results. All the known 54 samples reacted with the
specific cells of the two panels. The reaction scores were
higher with the 0.8 % system in 23 cases (43%) and
with the 3% system in 6 cases (11%); in 25 samples
(46%) the reaction score was the same with both panels.
Fifty antibodies (83%) showed higher titres with the
0.8% cells and 10 (17%) with the 3% ones. Thirty-three
of the 1,551 random samples (2.1%) reacted with the 3%
panel and 22 out of 1,021 (2.3%) with the 0.8% panel.
Thirteen of the 33 (0.8%) and 12 of the 22 (1.2%) positive
results were not confirmed.
Conclusions. The known antibodies were confirmed
in all the samples with both methods. In 83 % of the cases
the titre was higher with the 0.8% panel.
Received: 18 February 2004 - Accepted: 29 March 2004
Correspondence:
Dott. Claudio Velati
Dipartimento di Medicina Trasfusionale e di Ematologia
della Provincia di Sondrio
Via Stelvio 25
23100 Sondrio - Italy
E-mail: [email protected]
Blood Transfus 2004; 2: 125-30
1
Da oltre un decennio le tecniche di agglutinazione su
microcolonna (Column Agglutination Technology, CAT)
sono state introdotte nei laboratori di Immunoematologia e
hanno progressivamente sostituito le tecniche tradizionali
in provetta (Standard Tube Tests, STT) nell'esecuzione
routinaria dei test immunoematologici: tipizzazione gruppoematica, test di Coombs Diretto e Indiretto (TCD e TCI) e le
ricerche finalizzate all'identificazione anticorpale. Queste
metodiche si sono dimostrate più vantaggiose rispetto alle
tecniche tradizionali in provetta per la maggiore obiettività
della lettura, la possibilità di conservare i risultati più a
lungo, l'eliminazione dei classici tre lavaggi nei test
all'antiglobulina e, soprattutto, la loro standardizzazione e
facilità d'uso2-5. Le CAT si sono inoltre rivelate più sensibili,
rispetto alle STT, in particolare nello screening degli
anticorpi irregolari di rilevante significato trasfusionale6.
La successiva introduzione di apparecchiature
semiautomatiche e automatiche per l'esecuzione dei test
pre-trasfusionali su microcolonna, ha ulteriormente
incrementato il livello di standardizzazione di queste
procedure7,8. L'affidabilità e la standardizzazione indotte
dalle tecniche di agglutinazione su microcolonna e dal loro
utilizzo con sistemi automatici consente di limitare ai casi di
effettiva necessità l'impiego di ricerche
immunoematologiche tradizionali che, per la necessaria
tecnologia manuale, richiedono molto tempo e personale
da dedicare. Un tale risultato sarà maggiormente conseguito
e sarà, al contempo, maggiormente garantita la necessaria
sicurezza della trasfusione se la sensibilità e la specificità
delle procedure adottate saranno più elevate. Per il sistema
automatico AutoVue (AutoVue System, Ortho-Clinical
Diagnostics, Raritan, NJ, USA), che già aveva dato risultati
affidabili con l'impiego di emazie test alla concentrazione
del 3%9,10 è stato proposto l'utilizzo di emazie test alla
concentrazione dello 0,8% al fine di aumentare la sensibilità
125
E Vitali et al.
The specificity study showed that both panels produced
a similar percentage of false positive results. The 0.8%
panel revealed higher titres of irregular antibodies,
previously identified with the 3% panel, without lowering
the specificity of the procedure.
delle procedure. Scopo di questo lavoro è stato il confronto
delle prestazioni del sistema AutoVue, in termini di sensibilità
e specificità, nell'impiego routinario dei pannelli eritrocitari
alla concentrazione del 3% rispetto a quelli allo 0,8%.
Key words: automation, red cell alloantibodies, Column
Agglutination Technology
Materiali e metodi
Introduction
Column agglutination technology (CAT) was
introduced in Immunohaematology laboratories over a
decade ago1 and is gradually replacing the standard tube
tests (STT) for routine immunohaematological
investigations: blood group typing, direct and indirect
Coombs' tests (DCT and ICT) and antibody detection.
This technology has been demonstrated to have several
advantages over traditional test-tube methods: more
objective reading of results, the possibility of storing
results for longer, elimination of the three classical washes
in the antiglobulin tests, but above all, their standardisation
and ease of use2-5.
Furthermore, column agglutination tests are more
sensitive than STT, particularly in screening for
transfusionally relevant irregular antibodies 6. The
subsequent introduction of semiautomatic and automatic
equipment for carrying out pre-transfusion tests on
microcolumns has further raised the level of standardisation
of these procedures7,8.
The reliability and standardisation of automated
microcolumn agglutination techniques have allowed the
traditional immunohaematological methods, which given
the manual steps involved are very time-consuming and
staff-intensive, to be limited to the few essential cases.
This effect could be enhanced and at the same time
stronger guarantees of the essential safety of transfusions
could be made if the sensitivity and specificity of the
procedures were higher.
It has been proposed that the AutoVue automatic
system (AutoVue System, Ortho-Clinical Diagnostics,
Raritan, NJ, USA), which already gives reliable results with
Nel nostro Centro la ricerca degli anticorpi irregolari
anti-emazie nei donatori e nei riceventi viene effettuata, da
alcuni anni, con procedura completamente automatica
utilizzando il sistema AutoVue e schedine CAT BioVue
contenenti siero di Coombs polispecifico della ditta OrthoClinical Diagnostics. Per due anni sono stati utilizzati per lo
screening pannelli a 3 cellule con una concentrazione al 3
% di emazie. Successivamente e fino ad oggi sono stati
utilizzati pannelli, della stessa ditta, ma ad una
concentrazione di emazie dello 0,8%. I pannelli allo 0,8%
non necessitano dell'aggiunta di LISS, in quanto già
presente nella soluzione diluente, ed hanno una scadenza
di una settimana più lunga rispetto a quelli al 3%.
Preliminarmente all' introduzione in routine dei pannelli
allo 0,8%, è stato effettuato uno studio di sensibilità
utilizzando 54 campioni congelati a –80 °C, 25 di siero e 29
di plasma, che erano risultati precedentemente positivi alla
ricerca anticorpale, dimostrando la presenza di 60 anticorpi
irregolari (Tabella I).
I campioni sono stati scongelati a 37 °C e testati su
AutoVue utilizzando contemporaneamente il pannello al
3% e il pannello allo 0,8 %. Sono state quindi allestite
diluizioni per raddoppio di ciascun campione, che sono
state testate in parallelo (con procedura manuale e dallo
stesso operatore) con cellule opportunamente scelte dei
due pannelli, per la determinazione del titolo anticorpale.
Dopo la valutazione dei risultati dello studio di
sensibilità è stato impostato uno studio di specificità: 2.572
campioni di plasma provenienti da donatori e riceventi sono
stati sottoposti al test di screening per la ricerca degli
anticorpi irregolari su AutoVue. Per 1.551 campioni è stato
utilizzato il pannello Surgiscreen al 3%, mentre per i restanti
1.021 campioni è stato utilizzato il pannello Surgiscreen
allo 0,8%. Sui campioni risultati positivi sono stati quindi
effettuati, con procedura manuale, i test per l'identificazione
Table I - Red cell antibody specificity of the samples examined
Specificity
D
C
E
M
K
c
k
Cw
Le a
Leb
Jk a
Jk b
Fya
Jk b
E
K
E
Jk a
C
D
s
Tot.
n° samples
18
1
6
5
4
4
1
3
2
1
1
1
1
1
1
3
1
54
126
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Automated screening for red cell antibodies
Table II - Comparison between the scores obtained with the 3% and 0.8% red cell panels. Line A reports the number of samples for
which the score resulted higher using the 3% red cell panels, line B reports the number of samples with a higher score using
the 0.8% panels and line C the number of cases for which the scores were the same with both panels
Specificity
D
A
3
B
10
C
5
n° samples
18
C
E
M
K
c
Cw
k
Le a
Le b
Jk a
Jk b
Fya
Jk b
E
K
E
Jk a
C
D
s
2
1
1
1
5
1
3
1
6
5
1
4
3
1
3
1
4
4
1
3
2
1
1
1
1
1
6
(11%)
23
(43%)
25
(46%)
54
1
1
1
1
1
2
1
1
1
3
1
Table III - Comparison between the titres obtained with the 3% and 0.8% red cell panels. Line A reports the number of antibodies
showing a higher titre using 3% red cell panels, line B the number of antibodies with a higher titre using 0.8% panels and
line C the number of cases for which the titres were the same with both panels
C
E
M
K
C
k
Cw
Le a
Le b
Jk a
Jk b
Fya
E
C
s
4
5
4
3
1
1
2
1
2
2
1
2
3
1
1
1
5
4
2
1
2
2
1
2
3
Specificity
D
A
B
18
C
3
1
2
n° of
antibodies
21
1
6
5
2
1
3
test blood cells at a concentration of 3%9,10 could be used
with test cells at a concentration of 0.8% in order to increase
the sensitivity of the procedure.
The aim of this study was to compare the performance,
in terms of sensitivity and specificity, of the AutoVue
system with routine use of red cell panels at concentrations
of 3% and 0.8%.
Materials and methods
For some years now the search for irregular antibodies
to donor and recipient red blood cells has been carried out
by a completely automated procedure using the AutoVue
system and CAT BioVue cards containing polyclonal
Coombs' sera from the Ortho-Clinical Diagnostics company.
For two years a 3-cell screening panel with a 3%
concentration of red blood cells had been used.
Subsequently, panels from the same company, but at a
blood cell concentration of 0.8% have been used. The 0.8%
panels do not require addition of LISS, in that this is already
present in the diluting solution and they have a shelf-life
that is one week longer than that of the 3% panels.
Before introducing 0.8% panels into routine use, we
carried out a sensitivity study using 54 samples (25 of
serum and 29 of plasma) frozen at –80 °C, which had
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0
50
(83%)
10
(17%)
1
60
anticorpale (pannello a 11 cellule) e il titolo. L'interpretazione
dei risultati sierologici è data dalla lettura automatica dello
strumento che utilizza uno score che va da negativo a 4+. Per
la lettura visiva dei risultati è stato utilizzato lo stesso score.
Risultati
Studio di sensibilità. Tutti i 54 campioni analizzati
hanno reagito positivamente con le cellule specifiche dei
due pannelli. 23 campioni, pari al 43% del totale, hanno
dimostrato "scores" di reazione più elevati quando
investigati con le emazie allo 0,8%, 6 campioni, pari all'11%,
con le emazie al 3 %, mentre in 25 casi, pari al 46%, lo score
di reazione è stato lo stesso con i due pannelli.
Il confronto tra gli "scores" di reazione, ottenuti con i
due pannelli e suddiviso per specificità anticorpale dei
campioni testati è rappresentato nella tabella II.
Per 50 anticorpi, pari all'83% dei casi, il titolo anticorpale
è risultato più elevato con le emazie allo 0,8%, Per 10
anticorpi, pari al 17%, il titolo è risultato uguale con i due
tipi di emazie, mentre in nessun caso il titolo è stato maggiore
con le emazie del pannello al 3 % (Tabella III). In 7 casi il
titolo ottenuto con le emazie allo 0,8 % è stato di almeno
due diluizioni più elevato rispetto a quello ottenuto con il
pannello al 3%. Studio di specificità. Dei 1.551 campioni
127
E Vitali et al.
Table IV - Specificity study results
Red cell panel concentration
3%
0.8%
Total
Samples tested
Reactive samples
Not confirmed samples
1,551
1,021
2,572
33 (2.1%)
22 (2.3%)
55
13 (0.8%)
12 (1.2%)
25
previously been found to be positive for 60 irregular
antibodies (Table I). The samples were thawed to 37 °C
and tested on the AutoVue using both the 3.0% and 0.8%
panels, simultaneously. Doubling dilutions were then
prepared of each sample and these were tested in parallel
(with a manual procedure by the same person) with cells
appropriately chosen from the two panels, in order to
determine the antibody titre. After evaluating the results
of the sensitivity study, a specificity analysis was
performed: 2,572 plasma samples from donors and
recipients underwent an AutoVue screening test to search
for irregular antibodies. For 1,551 samples the Surgiscreen
3% panel was used, while the remaining 1,021 samples were
tested using the Surgiscreen 0.8% panel. Samples that were
positive then underwent manual testing to determine the
identity of the antibody (11-cell panel) and its titre.
The serological results were interpreted by automatic
reading of the instrument, which uses a score from negative
to 4+. The same score was applied for the visual reading.
Results
Sensitivity. All 54 samples analysed reacted positively
with specific cells of the two panels. We found that 23
samples (43% of all the samples) showed a higher reaction
score when investigated with the 0.8% panel, 6 samples
(11%) reacted more strongly with the blood cells at a 3 %
concentration, while 25 cases (46%) showed the same
reaction score with both panels. Table II presents a
comparison of the reaction scores obtained with the two
panels, divided according to the antibody specificity of
the samples tested. For 50 antibodies (83% of cases), the
antibody titre was higher with 0.8% cells, whereas for 10
antibodies (17%) the titre was the same with the two panels
of red cells. In no case was the titre higher with the 3%
panel (Table III). In 7 cases the titre was measurable with
the 0.8 % red cells at least two more dilutions than that
possible with the 3% panel.
Specificity. of the 1,551 samples tested with the 3 %
panel, 33 (2.1%) were found to be positive. Of the 1,021
samples investigated with the 0.8% panel, 22 (2.3%) were
128
indagati con il pannello al 3 %, 33, pari al 2,1% sono risultati
positivi. Dei 1.021 campioni indagati con il pannello allo
0,8% ne sono risultati positivi 22, pari al 2,3%. Il numero di
campioni la cui positività non è stata confermata, è stato
rispettivamente di 13 (0,8%) per il primo gruppo e di 12
(1,2%) per il secondo gruppo. I risultati dello studio di
specificità sono illustrati nella tabella IV.
Conclusioni
L'utilizzo dei test classici in immunoematologia deve
essere considerato un percorso necessario e irrinunciabile
in tutti i casi complessi. L'introduzione di procedure
automatiche o semi-automatiche a partire dagli anni '6011,12
ha, però, teso a limitare, nelle procedure routinarie, l'errore
"clericale" attraverso una standardizzazione delle
metodologie, mentre l'introduzione delle tecniche di
agglutinazione su colonna ha reso più sensibili ed affidabili
le ricerche immunoematologiche.
Uno specifico gruppo di lavoro della ISBT (International
Society of Blood Transfusion) ha recentemente prodotto linee
guida sulla validazione dei sistemi automatici nel Servizio
Trasfusionale nelle quali viene chiaramente indicato che un
sistema automatico è considerato critico se il suo uso è
direttamente legato al processo decisionale inerente il
sangue, la sua lavorazione, i test legati alla sua distribuzione
a fini trasfusionali e viene utilizzato per gestire le informazioni
correlate ai suddetti processi13. Lo studio effettuato si
inserisce, pertanto, in uno scenario che già vede introdotti
l'automazione e il perfezionamento delle tecniche
diagnostiche e che vede come obiettivo il miglior
abbinamento della sensibilità e della specificità di tecnologie
che sono già ad elevati livelli di affidabilità.
Lo studio ha evidenziato che tutti gli anticorpi,
precedentemente trovati e identificati, sono stati confermati
con entrambe le metodiche.
La sensibilità del pannello allo 0,8% sembra essere più
elevata: infatti nell'83% dei casi il titolo eseguito utilizzando
le emazie allo 0,8% è stato maggiore rispetto a quello
ottenuto con le emazie al 3 % e in alcuni casi anche di due
o più diluizioni. Anche gli score di reazione sono stati più
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Automated screening for red cell antibodies
positive. Thirteen samples (0.8%) in the first group and 12
(1.2%) in the second group were not confirmed to be
positive. The results of the specificity study are illustrated
in table IV.
Conclusions
Traditional tube tests are essential and unavoidable
in all complex cases. Nevertheless, the introduction of
automatic and semiautomatic procedures, starting back
in the 1960s11,12 has tended to limit ‘clerical' errors in
routine procedures through standardisation of methods,
while the development of column agglutination
techniques has made immunohaematological research
more sensitive and reliable.
A working group specifically established by the
International Society of Blood Transfusion (ISBT)
recently produced guidelines on the validation of
automatic systems in Transfusion Services. These
guidelines clearly indicated that an automated system is
considered critical if its use is directly linked to the
decisional processes concerning blood, product
processing, the tests associated with issuing
components for transfusion or if it is used to manage
information related to the above mentioned processes13.
We, therefore, carried out our study in the context of
current automated and refined diagnostic techniques with
the intention of determining whether the already high levels
of reliability of the technology could be combined with
greater sensitivity and specificity.
This study showed that all the previously found and
identified antibodies were detected by both the panels.
The 0.8% panel seemed to be more sensitive: in fact, in
83% of the cases, the titre measured using red blood
cells at a concentration of 0.8% was higher than that
recorded with blood cells at 3 % and in some cases
reached two or more dilutions. Furthermore, for an
equivalent antigenic dose on the specific cells, the
reaction scores were higher with the 0.8% cell
concentration. The specificity of the test was not
significantly different according to whether the 3% or
the 0.8% panel was used.
This study does have the limitations of not having been
carried out double blind and completely on the same
samples. These drawbacks, particularly relevant to the
specificity study, could be overcome by evaluating a larger
number of samples which would give greater statistical
significance to the preliminary observations reported here.
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elevati con le cellule allo 0,8 % a parità di dose antigenica
rappresentata sulle specifiche cellule. I risultati relativi allo
studio di specificità non sono significativamente diversi
per i campioni testati con il pannello al 3% rispetto a quelli
cimentati con il pannello allo 0,8%.
Il lavoro, in particolar modo per ciò che concerne lo studio
di specificità, presenta il limite di non essere stato effettuato
in doppio cieco e integralmente sugli stessi campioni. A ciò
può essere posto rimedio con una valutazione su un maggior
numero di campioni che potrebbe dare maggior significato
statistico alla preliminare osservazione fin qui effettuata.
Riassunto
Introduzione. Lo scopo dello studio è stato di
confrontare la sensibilità e la specificità di due sistemi
automatici, entrambi basati su metodiche di agglutinazione
su colonna, ma che utilizzano pannelli cellulari con diversa
concentrazione di emazie (3% e 0,8%).
Materiali e metodi. 54 campioni congelati, contenenti
60 anticorpi irregolari, sono stati testati in parallelo con
procedura automatica (Autovue Ortho CD) sia con il
pannello di screening di emazie al 3%, sia con il pannello
allo 0.8% (Surgiscreen 0,8% e 3% Ortho CD). Il titolo di
ciascun campione è stato determinato con specifiche
cellule dei due pannelli. 2.572 campioni random sono
stati testati con Autovue, 1.551 utilizzando il pannello al
3% e 1.021 con il pannello allo 0,8%.
Risultati. Tutti i 54 campioni già noti hanno reagito
positivamente con le cellule specifiche dei due pannelli.
In 23 casi, pari al 43% del totale, gli score di reazione
sono stati più alti con il pannello allo 0,8%, in 6 casi
(11%) con il pannello al 3% mentre in 25 casi (46%) lo
score è stato lo stesso con i due pannelli. Il titolo
anticorpale è stato più elevato con le emazie allo 0,8%
per 50 anticorpi (83%), con le emazie al 3% per 10
anticorpi (17%). Dei 1551 campioni random esaminati
con il pannello al 3%, 33 (2,1%) sono risultati positivi,
mentre, dei 1021 esaminati con il pannello allo 0.8%, ne
sono risultati positivi 22 (2,3%). I risultati non confermati
sono stati rispettivamente 13/33 (0,8%) e 12/22 (1,2%).
Conclusioni. Gli anticorpi già noti sono stati
confermati in tutti i campioni con i due metodi. Con le
cellule allo 0,8% sia gli score, sia i titoli anticorpali si
sono rivelati più elevati. Lo studio di specificità non ha
dato risultati significativamente diversi per i due sistemi.
Parole chiave: automazione, anticorpi antieritrocitari, CAT
129
E Vitali et al.
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130
Blood Transfus 2004; 2: 125-30