Review - Blood Transfusion

Review
Current diagnosis and management
of Thrombotic Thrombocytopenic Purpura:
utility of von-Willebrand Factor cleaving protease (ADAMTS 13)
Hande H Tuncer, Charles A Mayfield, Marisa B Marques
Department of Pathology, University of Alabama, Birmingham, AL, USA
Thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) is a
haematologic disorder involving the formation of platelet
aggregates in the microvasculature1,2. The consumption of
platelets in these aggregates results in severe
thrombocytopenia. Occlusive platelet thrombi form in many
organs including the brain, kidneys, heart, spleen,
pancreas, adrenal glands, and gastrointestinal tract,
causing tissue ischaemia and release of large amounts of
lactate dehydrogenase (LDH). In addition, erythrocytes
are fragmented as they transverse small vessels narrowed
by platelet thrombi leading to haemolysis and the formation
of schistocytes.
La Porpora Trombotica Trombocitopenica (PTT) è una
malattia ematologica che comporta la formazione di
aggregati piastrinici nella microcircolazione1,2. La
distruzione delle piastrine (plt) in tali microaggregati
determina una severa trombocitopenia. Si formano, in
numerosi organi (cervello, reni, cuore, milza, pancreas,
surreni, tratto gastroenterico), trombi piastrinici occludenti,
che causano ischemia tessutale e che rilasciano notevoli
quantità di latticodeidrogenasi (LDH). Inoltre, gli eritrociti
si frammentano quando attraversano i piccoli vasi stenosati
dalla presenza dei trombi piastrinici, con conseguente
emolisi e formazione di schistociti.
Clinical Features of TTP
Quadri clinici della PTT
The clinical features and severity of TTP are related to
the extent of microvascular involvement. The characteristic
pentad of thrombocytopenia, haemolytic anemia, fever,
fluctuating neurological symptoms, and renal dysfunction
are the hallmarks of TTP1, 2. However, the pentad is present
in varying percentages in patients with TTP3. In fact, only
40% of patients present with the complete pentad4. More
recently the clinical criteria for diagnosis of TTP have been
simplified to thrombocytopenia and haemolytic anemia
without an otherwise identifiable cause5. The annual
incidence of TTP is 3.7 cases per 100,000 with a slight
predominance in females (female/male ratio 3:2)6.
Thrombocytopenia is present in more than 90% of cases
I quadri clinici e la gravità della PTT sono in diretto
rapporto con il coinvolgimento microvascolare. La pentade
caratteristica (piastrinopenia, anemia emolitica, febbre,
variabilità dei sintomi neurologici e scompenso renale) è
l'emblema della PTT1,2. Tuttavia, tale sintomatologia è
presente in percentuali variabili nei colpiti3. Infatti, soltanto
il 40% dei pazienti presenta la pentade nella sua interezza4.
Di recente, i criteri clinici per la diagnosi di PTT si sono
ridotti alla trombocitopenia e all'anemia emolitica, senza
cause altrimenti identificabili5. L'incidenza annuale della PTT
è di 3,7 casi su 100.000/abitanti, con una leggera prevalenza
nel sesso femminile (rapporto femmine/maschi: 3:2)6. La
piastrinopenia è presente in oltre il 90% dei casi e può
essere da modesta a grave, con una conta al di sotto delle
20.000 plt/µL durante gli episodi acuti e un concomitante
aumento di megacariociti nel midollo. Una anemia emolitica
Coombs-negativa è presente virtualmente in tutti i pazienti
ed è, di norma, severa. L'emolisi contribuisce a elevare l'LDH
così come all'aumento della bilirubina e a una aptoglobina
Correspondence:
Dr. Hande H Tuncer
Department of Pathology
University of Alabama at Birmingham
West Pavillon 220
Birmingham, AL, USA
32
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
Diagnosis and management of TTP
and can be moderate to severe with platelet counts typically
below 20,000/µL in acute episodes and an associated
increase in megakaryocytes in the bone marrow. Coombs
negative haemolytic anemia is present in virtually all
patients with TTP and is usually severe. The haemolysis
contributes to elevated LDH as well as increased bilirubin
and low or undetectable haptoglobin. The peripheral blood
smear shows schistocytes and helmet cells products of
the fragmentation of erythrocytes. Ten to 40% of patients
experience a prodrome of flu-like symptoms within 2 weeks
preceding the diagnosis4. Approximately 50% of patients
with TTP present with fever which is occasionally very
high. Neurologic symptoms are present in as many as 90%
of patients. Symptoms may initially be mild with headache,
agitation, and confusion but can progress rapidly to
sensory and motor deficits, seizures, coma and death.
Gastrointestinal symptoms may include severe abdominal
pain, nausea, vomiting and diarrhoea. Patients with TTP
usually have only mild renal dysfunction with moderate
increases in serum creatinine, which may contribute to the
elevation in LDH.
Thrombotic thrombocytopenic purpura can be classified
into different types based predominantly on age at onset
and clinical course1,2. The most common form of TTP is
acquired idiopathic TTP which occurs in adults and
adolescents. Although usually limited to a single acute
episode, acquired TTP can recur at unpredictable intervals
in 10 to 30 percent of patients7. Familial TTP is rare and
usually presents in infancy or childhood. Most patients
with the familial form have recurring episodes at regular
intervals of 3 to 4 weeks. TTP that follows this recurring
course is also referred to as chronic relapsing TTP. In
addition, acute episodes of TTP have been associated with
various clinical conditions such as pregnancy, bone marrow
transplantation, autoimmune disorders and HIV-1 infection.
Further, a small percentage of patients receiving the platelet
ADP receptor inhibitors ticlopidine (Ticlid®) and
clopidogrel (Plavix®) for prevention of arterial thrombosis
have developed TTP8-15.
Pathogenesis of TTP
The occlusive thrombi in TTP are composed
predominantly of platelets without underlying perivascular
inflammation or other vessel wall damage.
Immunohistochemical studies have demonstrated that the
platelet thrombi also contain a large amount of von
Willebrand factor (vWf) with little or no fibrin or
fibrinogen16. Normal vWf mediates the adhesion of platelets
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
bassa o non determinabile. Lo striscio di sangue periferico
mostra schistociti e cellule con "elmetto", prodotti dalla
frammentazione degli eritrociti. Dal 10 al 40% dei pazienti
presenta una sintomatologia prodromica simil-influenzale,
che precede di 2 settimane la diagnosi4. Circa il 50% dei
colpiti presenta febbre che, occasionalmente, può essere
molto alta. La sintomatologia neurologica si riscontra in
oltre il 90% dei malati. Inizialmente, i sintomi possono essere
modesti, con mal di testa, agitazione e confusione, ma che
possono via via aggravarsi, inducendo deficit sensoriali e
motori, accessi epilettici, coma, morte. I sintomi
gastrointestinali comprendono violenti dolori addominali,
nausea, vomito, diarrea. Solo raramente si riscontra uno
scompenso renale lieve, con un modesto aumento della
creatininemia, che può, a sua volta, contribuire
all'innalzamento dell'LDH.
La PTT si può classificare in tipi differenti a seconda
dell'età all'esordio e all'andamento clinico1,2. La forma più
comune è quella acquisita idiopatica, che colpisce
adolescenti e adulti. Benché di solito limitata a un singolo
episodio acuto, questa forma può, nel 10-30% dei casi,
recidivare a intervalli non prevedibili7. Le forme familiari
sono rare e, usualmente, presenti nell'infanzia e nella
giovinezza. La maggior parte dei colpiti da forme familiari
recidiva a intervalli regolari, ogni 3-4 settimane. Le PTT
ricorrenti vengono anche definite PTT croniche recidivanti.
Inoltre, episodi acuti di PTT sono stati associati a varie
situazioni cliniche come gravidanza, trapianti di midollo
osseo (BMT), malattie autoimmuni, infezioni da HIV-1. Una
piccola percentuale di pazienti trattati, per la prevenzione
delle trombosi arteriose, con gli inibitori del recettore
piastrinico dell'ADP, quali la ticlopidina (Ticlid®) o il
clopidogrel (Plavix®) può sviluppare PTT8-15.
Patogenesi della PTT
Nella PTT, i trombi che occludono i piccoli vasi sono
composti essenzialmente da plt senza una sottostante
infiammazione perivascolare né altri danni alle pareti vasali.
Studi di immunoistochimica hanno dimostrato che i trombi
piastrinici contengono anche larghe quantità di fattore von
Willebrand (vWf) con scarsa o nessuna presenza di fibrina
o di fibrinogeno16. Il normale vWf media l'adesione delle plt
alle lesioni endoteliali dei vasi ed è il vettore proteico del
fattore VIII. Esso contiene siti di legame per le glicoproteine
(GPs) piastriniche Ibα IIb-IIIa e per il collageno e circola nel
plasma sotto forma di multimeri, che variano in dimensione
da 500 a 20.000 kilodaltons (kDs). I multimeri di vWf sono
rilasciati soprattutto dai corpi di Weibel-Palade presenti
33
HH Tuncer et al.
to vascular endothelial lesions and is the carrier protein for
coagulation factor VIII. The vWf protein contains binding
sites for platelet glycoprotein (GP)s Ibα and GPIIb-IIIa, as
well as collagen and it circulates in plasma as multimers
ranging in size from 500 to 20,000 kilodaltons. The vWf
multimers are released predominantly from Weibel-Palade
bodies in vascular endothelial cells and composed of 280
kilodalton monomers linked by disulfide bonds. The largest
multimers are referred to as unusually large vWf (ULvWf)
and bind with higher affinity than smaller multimers to the
GP Ibα portion of the GP Ibα-IX-V and GP IIb-IIIa complexes
on the platelets, inducing aggregation under conditions of
increased fluid shear stress17-19. Increased amounts of these
highly adhesive ULvWf multimers have been found in
patients with chronic relapsing TTP17, 20, 21. In these patients
the ULvWf multimers disappear as the acute episode
progresses consistent with incorporation into platelet
aggregates, reappear during remission and are predictive
of relapse. Indeed, patients with both a single acute episode
of TTP and those with recurrent TTP have been shown to
display increased binding of vWf to platelets and contain
increased numbers of circulating platelet aggregates
compared to periods of remission22.
In normal plasma, a vWf cleaving protease (vWf-CP)
cleaves the ULvWf multimers between tyrosine 842 and
methionine 843 within the monomeric vWf subunits
producing a series of smaller fragments23, 24. The action of
vWf-CP may serve to regulate multimer size preventing the
release or accumulation of ULvWf multimers in plasma and
thus averting the spontaneous interaction of the UL
multimers with platelets. vWf-CP is a member of the
ADAMTS family of metalloprotease enzymes and is
designated ADAMTS 1325-27. It is a 190 kilodalton zinc and
calcium dependent protein that is synthesized
predominantly in the liver.A severe deficiency ofADAMTS
13 in acute TTP was demonstrated by two separate groups
in 1998 and also in patients with chronic relapsing TTP28-31.
The plasma of the chronic relapsing TTP patients contained
ULvWf multimers and low ADAMTS 13 activity without
any identifiable inhibitor of the protease. Two of these
patients were brothers whose asymptomatic parents both
possessed below normal activity of ADAMTS 13
suggesting a hereditary nature of this type of TTP.
Subsequently, a number of studies by Furlan and others
have shown extremely low ADAMTS 13 activity in both
familial and acquired forms of TTP3, 28, 29, 32.ADAMTS 13 in
these patients is usually <5% and often undetectable during
single acute episodes and recurrences. In familial and
chronic relapsing TTP, the deficient protease activity has
been attributed to mutations in the ADAMTS 13 gene
34
nelle cellule endoteliali dei vasi; sono composti da monomeri
di 280 kDs, uniti da ponti disulfurici. I multimeri più ampi
sono denominati ULvWf (unusually large vWf) e si legano
con maggiore affinità dei multimeri più piccoli alla porzione
GP Ibα dei complessi GP Ibα-IX-V e GP IIb-IIIa sulle plt,
inducendo aggregazione sotto lo stress da flusso
intravascolare17-19. Aumentate quantità di questi multimeri
ULvWf, altamente adesivi, sono state rinvenute in pazienti
affetti da PTT cronica recidivante17,20,21. In tali pazienti, i
multimeri ULvWf scompaiono durante il progredire degli
episodi acuti, in seguito a una loro incorporazione negli
aggregati piastrinici, per poi riapparire durante la
remissione; essi sono predittivi di ricadute. In realtà, si è
dimostrato che i malati con singoli episodi acuti di PTT e
quelli con forme ricorrenti mostrano un aumentato legame
del vWf alle plt e un numero accresciuto di aggregati
piastrinici circolanti, in comparazione a quanto si ritrova
nei periodi di remissione22.
Nel plasma di soggetti normali, una proteasi che cliva il
vWf (vWf-CP), determina il clivaggio degli ULvWf fra la
tiroxina 842 e la metionina 843, all'interno delle subunità
monomeriche vWf, producendo una serie di frammenti
minori23,24. L'azione della vWf-CP può servire a regolare le
dimensioni dei multimeri, prevenendo il rilascio o l'accumulo
nel plasma di multimeri ULvWf, impedendo, quindi, la
spontanea interazione dei multimeri UL con le plt. La vWfCP è un membro della famiglia ADAMTS (A Disintegrinlike And Metalloprotease with ThromboSpondin) e viene
designata come ADAMTS 1325-27. Si tratta di una proteina
di 190 kDs, zinco e calcio-dipedente, sintetizzata
prevalentemente nel fegato. Una grave deficienza di
ADAMTS 13 è stata dimostrata nella PTT acuta da due
gruppi separati nel 1998 e anche in pazienti con PTT cronica
recidivante28-31. Il plasma di pazienti affetti da PTT cronica
recidivante contiene multimeri ULvWf e una bassa attività
di ADAMTS 13, senza che si possa individuare un inibitore
della proteasi. Due di questi pazienti erano fratelli i cui
genitori, asintomatici, possedevano una ridotta quantità di
ADAMTS 13, facendo così supporre una ereditarietà in
questo tipo di PTT. In seguito, studi condotti da Furlan e
da altri Autori hanno dimostrato attività molto basse di
ADAMTS 13 nelle forme sia familiari che acquisite3,28,29,32.
Il livello di ADAMTS 13 in questi pazienti è, di solito,
inferiore al 5% e spesso indeterminabile, durante singoli
episodi acuti o ricorrenti. Nelle PTT familiari o croniche
recidivanti, l'attività deficiente della proteasi è stata
attribuita a mutazioni del gene ADAMTS 13 sito sul
cromosoma 9, in posizione q3433. Invece, nelle forme acute
idiopatiche o acquisite, la diminuita attività di ADAMTS
13 è dovuta all'azione inibente di IgG presenti in più dell'83%
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
Diagnosis and management of TTP
located on chromosome 9q3433. In contrast, the decreased
ADAMTS 13 activity in acute idiopathic or acquired TTP
is due to inhibition by IgG antibodies present in as much
as 83% of patients3, 28-30, 32. An antibody inhibitor of
ADAMTS 13 has also been found in patients with
ticlopidine and clopidogrel induced TTP9,10. These findings
strongly support the hypothesis that platelet aggregates/
thrombi leading to TTP are a result of the presence or
persistence of high affinity ULvWf multimers secondary
to severely deficient ADAMTS 13 activity, with or without
an antibody inhibitor.
Diagnosis of TTP
Despite the characteristic pentad (or triad) of clinical
features found in patients with TTP, it is often difficult to
distinguish it from other clinical conditions, including other
thrombotic microangiopathies. Varying degrees of
thrombocytopenia, haemolysis, and schistocytosis are also
present in disseminated intravascular coagulation (DIC),
overwhelming sepsis, pre-eclampsia or eclampsia, HELLP
syndrome, malignant hypertension, Evans syndrome, severe
vasculitis, systemic lupus erythematosus and scleroderma
which may manifest with hypertension and renal failure, and
in patients with a dysfunctional prosthetic heart valve.
Certain laboratory findings may be used to differentiate TTP
and Haemolytic Uremic Syndrome (HUS) from other
disorders with similar clinical presentation (Figure 1).
However, the distinction between TTP and HUS can be
much more obscure as these two disorders have very similar
clinical presentations and laboratory findings, including
thrombocytopenia, haemolytic anemia with schistocytosis,
and renal dysfunction. This distinction, though, is critical,
as the treatments for TTP and HUS differ significantly.
Without prompt initiation of plasmapheresis, there is a
substantial risk of mortality associated with TTP. On the
other hand, there has been no randomized clinical trial
demonstrating the efficacy of plasmapheresis (or plasma
infusion) in patients with HUS. Until recently the distinction
between TTP and HUS has been arbitrary, based largely
on clinical features. Patients with TTP are more likely to
present with neurologic symptoms, while patients with HUS
often have more severe renal dysfunction with acute renal
failure.
While numerous studies have demonstrated a dramatic
decrease or absence of ADAMTS 13 activity in patients
with TTP, several of these studies have showed that the
protease activity is only moderately decreased and often
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
degli affetti3,28-30,32. Un anticorpo inibente ADAMTS 13 è
stato ritrovato anche nei pazienti con PTT indotta da
ticlopidina o clopidogrel9.10. Tali reperti avallano fortemente
l'ipotesi che gli aggregati e i trombi piastrinici che
determinano la PTT siano il risultato della presenza o della
persistenza di multimeri ULvWF ad alta affinità, secondari
a una attività di ADAMTS 13 gravemente deficitaria, con o
senza presenza di anticorpi inibitori .
Diagnosi di PTT
Nonostante i quadri clinici della pentade (o della triade)
descritti in pazienti con PTT, è spesso difficile distinguerli
da altre condizioni morbose, ivi comprese alcune
microangiopatie trombotiche. Vari gradi di piastrinopenia,
emolisi e schistocitosi sono, infatti, presenti nella CID, in
stati settici gravi, nelle pre-eclampsie o nelle eclampsie,
nella sindrome HELLP (Haemolysis, Elevated Liver enzyme
levels and a Low Platelet count), nell'ipertensione maligna,
nella sindrome di Evans, nelle vasculite gravi, nel LES e
nella sclerodermia, che si può manifestare con ipertensione
e scompenso renale, nonché in pazienti con protesi valvolari
cardiache che funzionano male. Per differenziare la PTT e la
sindrome emolitica-uremica (HUS) da altre forme con
sintomatologia consimile, si possono utilizzare alcuni
risultati di laboratorio (Figura 1).
Tuttavia, la distinzione fra PTT e HUS può essere assai
difficoltosa, dato che entrambe queste forme presentano
quadri clinici e di laboratorio molto simili, ivi compresi
trombocitopenia, anemia emolitica con schistociti e
disfunzione renale. Peraltro, la distinzione fra PTT e HUS è
essenziale, dato che la terapia delle due forme differisce
sostanzialmente. Nella PTT, se non si iniziano prontamente
le plasmaferesi, vi è un alto rischio di mortalità. D'altro canto,
non esistono studi clinici randomizzati che dimostrino una
efficacia della plasmaferesi (o di infusioni di plasma) nella
HUS. La distinzione fra le due forme è, sinora, arbitraria,
largamente fondata sui quadri clinici. I pazienti con PTT
hanno maggiori probabilità di presentare sintomi
neurologici, mentre quelli con HUS hanno più
frequentemente gravi disfunzioni renali con scompenso
acuto.
Mentre molti studi hanno dimostrato drammatiche
cadute o totale assenza di attività ADAMTS 13 in pazienti
con PTT, altri studi hanno mostrato un'attività della proteasi
soltanto modicamente diminuita o addirittura normale nella
HUS3,28,32,34. È emerso, quindi, che la determinazione
dell'attività ADAMTS 13 rappresenta uno strumento
diagnostico valido per distinguere PTT e HUS. È anche
35
HH Tuncer et al.
Figure 1 - Algorithm to distinguish TTP/HUS from other clinical conditions.
normal in HUS3,28,29,32,34. Thus, measurement of ADAMTS
13 activity has emerged as a valuable diagnostic means to
distinguish TTP and HUS. It is important to note that partial
and sometimes complete deficiencies of ADAMTS 13 have
been reported in a small number of patients having
thrombotic microangiopathies secondary to various clinical
conditions, such as neoplasia, infections, immunological
disorders, and pregnancy3. Interestingly, most patients with
TTP associated with bone marrow transplantation have
normal or only slightly decreased ADAMTS 13 activity3,35.
ADAMTS 13 activity is also moderately decreased in
patients with metastatic neoplasms, decompensated liver
cirrhosis, acute inflammatory conditions (such as bacterial
respiratory infections) and chronic renal insufficiency on
haemodialysis, as well as pregnant women, newborns and
in patients status post major surgery (4 days post
operative), while mild decreases are observed in older
patients (>65 years old)36. The most severe deficiencies in
36
importante sottolineare che deficienze parziali o talora totali
di ADAMTS 13 sono state segnalate in un numero ristretto
di pazienti con microangiopatie trombotiche secondarie a
varie situazioni cliniche, quali neoplasie, infezioni, disordini
immunologici o gravidanza3.
Degno di nota il fatto che la maggioranza dei pazienti
con PTT associata a BMT hanno un'attività ADAMTS 13
normale o soltanto lievemente diminuita3,35.
Questa attività è anche moderatamente diminuita in
soggetti con neoplasie metastatizzanti, con cirrosi epatica
scompensata, con infiammazioni acute (quali infezioni
respiratorie batteriche), con insufficienze renali in
emodializzati, in gravide, in neonati e in pazienti operati (4
giorni dopo l'intervento), mentre diminuzioni di media entità
si riscontrano nei pazienti più anziani (oltre 65 anni d'età)36.
Le deficienze più gravi si manifestano nei soggetti con
cirrosi scompensata o con stati infiammatori acuti, nei quali
la media dell'attività proteasica è sul 40-50% di quella
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
Diagnosis and management of TTP
ADAMTS 13 activity are in those individuals with
decompensated cirrhosis and acute inflammatory states in
which the average protease activity is 40 to 50% of normal.
This is in comparison to an activity of 0 to 10% in patients
with TTP. Thus, an extremely low or absent ADAMTS 13
activity can still be a valuable criteria in helping to establish
a diagnosis of TTP. In addition, the presence or absence of
an inhibitor will further differentiate the type of TTP and
allow more specific treatment options (Table I and case
below).
normale. Ciò in confronto a un'attività dallo 0 al 10% nei
pazienti con PTT.
Ne consegue che un'attivitàADAMTS 13 estremamente
bassa o assente può ancora essere un criterio valido nello
stabilire una diagnosi di PTT.
Inoltre, la presenza o l'assenza di un inibitore
differenzierà ulteriormente i tipi di PTT e permetterà
l'adozione di trattamenti terapeutici più specifici (Tabella I
e il caso segnalato più sotto).
Table I - ADAMTS 13 in thrombotic microangiopathies
ADAMTS 13
TTP
Acute idiopathic
Recurrent
Chronic relapsing
Bone marrow transplant associated
Clopidogrel & ticlopidine associated
HUS
*
Severely decreased *
Antibody Inhibitor
yes
yes
yes
no
yes
no
yes
yes
no
no
yes
no
usually < 5% of normal activity
Principles of current ADAMTS 13 assays
ADAMTS 13 activity can be determined by measuring
the ability of the patient's plasma to degrade vWf multimers.
Initial assays involved the incubation for up to 24 hours of
large vWf multimers purified from normal human
cryoprecipitate or supernatant from endothelial cell cultures
with dilutions of patient plasma in the presence of Ba+2 and
urea10,28,29,31,32. Subsequently, the appearance of the vWfCP dimers of 176 and 140 kilodaltons, resulting from
cleavage at the tyrosine 842-methionine 843 site, were
measured by immunoblotting following by sodium dodecyl
sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis.
Alternatively, the disappearance of the ULvWf multimers
could also be checked on the same gels.
A simpler test currently being utilized is the collagen
binding assay37, based on the ability of the largest vWf
multimers to selectively bind collagen compared with
smaller forms of the protein. The degradation of the largest
vWf multimers by ADAMTS 13 gives rise to the smaller
vWf multimers that bind less collagen. Specifically,
dilutions of patient's plasma are incubated with normal
human plasma in which the protease has been inactivated.
The products resulting from proteolytic degradation of vWf
in the normal plasma byADAMTS 13 in the patient's sample
are then captured on microtiter plates coated with human
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
Principi dei metodi attuali per la determinazione
di ADAMTS 13
L'attivitàADAMTS 13 può essere misurata dalla capacità
del plasma del paziente di degradare i multimeri di vWf. I
primi test contemplavano l'incubazione per più di 24 h di
numerosi multimeri vWf purificati, partendo o da un
crioprecipitato ottenuto da plasma normale o da
supernatanti di culture di cellule endoteliali, diluiti con
plasma di pazienti in presenza di Ba+2 e di urea10,28,29,31,32.
Successivamente, la disponibilità di dimeri di vWf-CP di
176 e 140 kDs, ottenuti per clivaggio fra tiroxina 842 e
metionina 843, ha permesso la misurazione impiegando un
immunoblotting in gel elettroforesi con Sodio-DodecilSolfato(SDS)-poliacrilamide. In alternativa, può anche
essere controllata la scomparsa di multimeri di ULvWf,
impiegando lo stesso gel.
Un esame più semplice, oggi in uso, è il test di legame
del collageno (collagen binding assay, CBA), basato sulla
capacità dei multimeri di vWf di maggiori dimensioni di
associarsi al collageno, a differenza delle forme minori della
proteina37. La degradazione dei multimeri maggiori di vWf
da parte diADAMTS 13 determina la formazione di multimeri
più piccoli che legano il collageno in misura minore. Le
diluizioni del plasma dei pazienti si incubano con plasma
umano normale, nel quale la proteasi è stata inattivata. I
37
HH Tuncer et al.
collagen type III and the bound vWf multimers are detected
with a peroxidase-conjugated antibody to human vWf and
quantitated from standard curves. Inhibitor levels are
determined by measuring the ability of patient's plasma to
inhibit ADAMTS 13 activity in normal human plasma. The
reference range for ADAMTS 13 activity in this assay is
50-178%. Depending on the reference laboratory, an
ADAMTS 13 activity of < 6% indicates a severe deficiency,
which has a sensitivity of 70 to 100% for the diagnosis of
idiopathic TTP38. Inhibitor levels are calculated in Bethesda
units, with a reference interval of ≤ 0.3 inhibitor units in at
least one reference laboratory. The collagen binding assay
is reportedly more sensitive in distinguishing very low
ADAMTS 13 activity (0 to 5%), while the immunoblot assay
measuring the disappearance of large multimers on SDSagarose gels is more accurate in the normal and moderately
low ranges of protease activity 37. The assay for ADAMTS
13 is not yet widely available and is still a relatively lengthy
procedure, thus it still does not influence initial clinical
decisions. However, the assay does currently have a role
in the diagnosis and subsequent management of patients
with TTP.
Clinical Utility of ADAMTS 13
ADAMTS 13 activity levels and the presence or
absence of an antibody inhibitor are proving to be valuable
laboratory data in establishing a diagnosis in patients with
suspected TTP. An ADAMTS 13 activity of 0 to 10%
strongly supports a diagnosis of TTP over other thrombotic
microangiopathies and can differentiate TTP from HUS even
in the absence of distinguishing clinical features. In cases
of suspected TTP, low or absent ADAMTS 13 activity and
the presence of an inhibitor can confirm the diagnosis. An
example of the use of these assays follows: a 38 year-old
woman presented to our institution with severe
thrombocytopenia (platelet count of 12,000/µL), haemolytic
anemia with moderate schistocytosis, and extremely
elevated LDH (2,020 IU/L). A definitive diagnosis could
not be established and she was treated empirically with
plasmapheresis (27 procedures) for presumable TTP. She
gradually improved and was discharged approximately one
month after admission with normalized laboratory values.
During the following two months, she required readmission
twice. Her only presenting sign prior to both hospitalizations
was severe thrombocytopenia. Workup for the isolated
thrombocytopenia included platelet IgG antibody, heparin
antibody, and a bone marrow aspirate/biopsy, which were
38
prodotti della degradazione proteolitica del vWf nel plasma
normale, da parte del ADAMTS 13 presente nel plasma del
paziente, sono poi trasferiti in piastre da microtitolazione, i
cui pozzetti sono rivestiti da collageno umano tipo III: i
multimeri di vWf che si legano vengono evidenziati da un
anticorpo coniugato con perossidasi, diretto contro il vWf
umano. La quantificazione si ottiene usando curve
standard. I livelli di inibitore vengono determinati
misurando la capacità del plasma del paziente di inibire
l'attività diADAMTS 13 in plasmi umani normali. La gamma
di riferimento per l'attività ADAMTS 13 in questo test varia
dal 50 al 178%. Sia pure in rapporto al laboratorio di
riferimento, un'attività ADAMTS 13 inferiore al 6% indica
una deficienza grave e conferma la diagnosi di PTT
idiopatica, con sensibilità compresa fra il 70 e il 100%38. Il
livello dell'inibitore viene stimato in unità Bethesda con un
intervallo ≤ 0,3 unità di inibitore definito in almeno un
laboratorio di riferimento. Il test CBA è riferito come il più
sensibile nel distinguere un'attività molto bassa di
ADAMTS 13 (da 0 al 5%), mentre l'immunoblotting che
misura, in gel SDS-agarosio, la scomparsa dei multimeri di
maggior dimensione, è più preciso nel determinare una
attività proteasica normale o moderatamente bassa37. I test
per ADAMTS 13 non sono ancora largamente disponibili e
richiedono procedure tuttora relativamente lunghe; non
sono, quindi, in grado di influenzare decisioni cliniche
precoci. Tuttavia, essi sono in grado di giocare, attualmente,
un ruolo nella diagnosi e nel conseguente trattamento dei
pazienti affetti da PTT.
Utilità clinica di ADAMTS 13
I livelli di attività diADAMTS 13 e la presenza o l'assenza
di anticorpi inibitori si sono dimostrati dati di laboratorio
validi per giungere a una diagnosi in pazienti con sospetta
PTT. Un'attività di ADAMTS 13 compresa fra 0 e 10%
indirizza decisamente verso una diagnosi di PTT, rispetto
ad altre microangiopatie trombotiche, ed è in grado di
differenziare, anche in assenza di quadri clinici specifici,
una PTT da una HUS. Quando si sospetta una PTT, una
bassa o assente attività di ADAMTS 13 e la presenza di un
inibitore possono confermare la diagnosi. Il caso seguente
illustra l'impiego di questi test: una donna di 38 anni si è
presentata nel nostro Istituto con una piastrinopenia grave
(12.000 plt/µL), un'anemia emolitica con modesta
schistocitosi e un alto livello di LDH (2.020 UI/L).Non si è
potuto stabilire una diagnosi definitiva e la donna è stata,
empiricamente, trattata con plasmaferesi (27 sedute) per
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
Diagnosis and management of TTP
all within normal limits. Finally, an ADAMTS 13 assay
showed a complete absence of protease activity and the
presence of a strong inhibitor. The ADAMTS 13 assay
was critical in establishing the diagnosis in this patient
with an unusual presentation of recurrent TTP. Following
additional plasmapheresis procedures and
immunosuppressive treatment, she improved dramatically
and was discharged with a platelet count of 472,000/µL.
She has had no more relapses for over a year.
ADAMTS 13 assay can also allow differentiation
between chronic relapsing TTP due to an intrinsic
deficiency of the protease and acquired idiopathic TTP
resulting from the presence of an antibody inhibitor of the
enzyme. This distinction has important therapeutic
implications and may indicate the likely course of the
disease.
Infants or young children with familial chronic relapsing
TTP generally respond well to transfusion with plasma or
cryosupernatant which provides ADAMTS 13. Adults with
acute episodes of TTP require daily plasmapheresis using
fresh frozen plasma as replacement fluid. Therapeutic
plasmapheresis improves survival dramatically in acute TTP
presumably by removing ULvWf multimers and replacing
ADAMTS 1339. Cyclophosphamide and splenectomy are
adjuvant therapies in refractory or recurrent cases40, 41.
Recently, it has been shown that severe ADAMTS 13
deficiency is most common in idiopathic TTP cases and
correlated with a better initial response to plasmapheresis
and lower mortality, but a higher relapse rate42. The patients
with such characteristics were mostly female, AfricanAmerican and obese.
The higher mortality in patients with non-idiopathic
TTP without severe deficiency of ADAMTS 13 may be
multifactorial. Most of these patients have underlying
medical conditions, such as bone marrow transplant, sepsis
or cancer, which affect their survival and the response to
plasmapheresis.
Another study demonstrated that the presence of IgG
antibodies against ADAMTS 13 in the setting of severe
ADAMTS 13 deficiency correlated with an increased
relapse rate43. This is probably because of persistence of
high antibody titer despite normalization of platelet count
with plasmapheresis. Therefore, rituximab, a monoclonal
antibody against CD20 on B-lymphocytes, is being
increasingly used as a potential therapy for refractory TTP44.
The clinical utility of rituximab was shown in a case
report describing a 19 month history of relapsing TTP
despite treatment with plasmapheresis and multiple other
therapies, including splenectomy 43. She was found to have
Blood Transfus 2005; 3: 32-41
presumibile PTT. Gradualmente migliorata, è stata dimessa
un mese dopo il ricovero con i dati di laboratorio nella norma.
Nei successivi due mesi, essa ha dovuto essere nuovamente
ricoverata, per due volte. L'unico dato prima delle due
riammissioni era una piastrinopenia grave. Gli esami di
approfondimento per la trombocitopenia comprendevano la
ricerca di anticorpi anti-plt IgG, quella di anticorpi anti-eparina,
una biopsia midollare, con risultati tutti nella norma. Da
ultimo, il testADAMTS 13 ha mostrato una totale assenza di
attività proteasica e la presenza di un forte inibitore. In questa
malata, con un quadro clinico di PTT recidivante inusuale, il
test ADAMTS 13 si è dimostrato essenziale per stabilire la
diagnosi. Trattandola, poi, con ulteriori procedure
plasmaferetiche e con terapia immunosoppressiva, la paziente
è migliorata consistentemente ed è stata dimessa con una
conta di 472.000 plt/µL. Non ha avuto più ricadute per oltre
un anno. Il testADAMTS 13 può anche consentire la diagnosi
differenziale fra una PTT cronica recidivante, dovuta a una
deficienza intrinseca di proteasi, e una PTT acquisita idiopatica,
dovuta alla presenza di un anticorpo che inibisce l'enzima.
Questa distinzione ha importanti implicazioni terapeutiche e
può far prevedere il probabile decorso della malattia. I bambini
e gli adolescenti con PTT cronica familiare recidivante
rispondono, in genere, alle infusioni di plasma o di supernatanti
da crioprecipitati in grado di fornire ADAMTS 13. Gli adulti
affetti da PTT acuta richiedono plasmaferesi quotidiane con
plasma fresco congelato come liquido di sostituzione. La
plasmaferesi terapeutica migliora consistentemente la
sopravvivenza nelle forme acute, presumibilmente rimuovendo
i multimeri ULvWf e apportando ADAMTS 1339.
Ciclofosfamide e splenectomia rappresentano terapie
adiuvanti nelle forme refrattarie e ricorrenti40,41.
Recentemente, si è dimostrato che una deficienza grave
di ADAMTS 13 è più comune nei casi di PTT idiopatica e
correla con una migliore risposta iniziale alla plasmaferesi e
con una mortalità più bassa, ma con ricadute più frequenti42.
I pazienti di questo tipo sono prevalentemente donne, afroamericane e obese. La maggiore mortalità in pazienti con
PTT non idiopatica, senza deficienza grave di ADAMTS
13, può essere multifattoriale. La maggior parte di questi
pazienti hanno situazioni cliniche concomitanti, quali BMT,
sepsi o neoplasie che influenzano la sopravvivenza e la
risposta alle plasmaferesi. Un altro studio ha dimostrato
che la presenza di anticorpi IgG anti-ADAMTS 13, nel
quadro di una deficienza grave di ADAMTS 13, correlava
con un'accresciuta incidenza di recidive43. Ciò è
probabilmente dovuto alla persistenza di un alto titolo di
anticorpi, nonostante la normalizzazione della conta di plt,
ottenuta con plasmaferesi. Pertanto, si sta usando sempre
39
HH Tuncer et al.
complete deficiency of ADAMTS 13 activity due to an
inhibitor. After initiation of therapy with rituximab and
cyclophosphamide, the inhibitor promptly disappeared,
protease activity normalized, and symptoms of TTP
resolved. The patient subsequently had complete remission
with no required treatment over a 13 month follow-up
period. Currently, at our institution, all patients with
suspected TTP have plasma samples drawn for ADAMTS
13 activity and inhibitor levels prior to initiation of empiric
plasmapheresis. We anticipate that continued accumulation
of ADAMTS 13 data along with clinical correlation will
further define the role of this enzyme and its inhibitor in the
diagnosis and management of patients with TTP-HUS.
più, quale potenziale terapia delle forme refrattarie di PTT, il
rituximab, un anticorpo monoclonale diretto contro
l'antigene CD20 sui linfociti B44. L'utilità terapeutica del
rituximab è stata dimostrata in una storia clinica, lunga 19
mesi, relativa a una PTT recidivante, nonostante un
trattamento con plasmaferesi e numerose altre terapie, ivi
compresa la splenectomia43. La paziente è stata trovata
totalmente priva di attività ADAMTS 13, per la presenza di
un inibitore. Iniziata la terapia con rituximab e ciclofosfamide,
l'inibitore è rapidamente scomparso, l'attività proteasica si
è normalizzata e la sintomatologia si è risolta. La paziente
ha ottenuto una remissione completa e non ha avuto più
necessità di cure (13 mesi di follow-up). Attualmente, nel
nostro Istituto, prima di iniziare un trattamento
plasmaferetico su base empirica, a tutti i pazienti con
sospetta PTT viene prelevato un campione di plasma, sul
quale determinare l'attività ADAMTS 13 e il livello di
inibitori. Noi prevediamo che il continuo accumularsi di
dati su ADAMTS 13, insieme a quelli sulle correlazioni
cliniche, definirà ulteriormente il ruolo di questo enzima e
del suo inibitore nella diagnosi e nel trattamento di pazienti
con PTT o HUS.
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