View - Società Italiana di Diagnostica di Laboratorio Veterinaria

Transcript

XV Congresso Nazionale S.I.Di.L.V. - Monreale (PA), 23-25 Ottobre 2013
shift nel gene katA. La presente nota rappresenta la prima
segnalazione di un ceppo di S. aureus catalasi negativo e
meticillino-resistente, isolato da animali. L’enzima catalasi è
un importante fattore di virulenza negli stafilococchi, in quanto
neutralizza l’attività del perossido di idrogeno, intermedio
reattivo dell’ossigeno e responsabile dell’attività battericida
all’interno dei macrofagi. Conseguentemente, gli stafilococchi
catalasi negativi dovrebbero essere meno virulenti. Tuttavia,
in un studio effettuato su di un modello murino, è stato
osservato che alcuni ceppi di S. aureus catalasi negativi
avevano un grado di virulenza assimilabile a quello di ceppi
catalasi positivi (11). Inoltre, i ceppi catalasi negativi che sono
stati segnalati nell’uomo erano prevalentemente isolati clinici,
associati a setticemia o infezioni sistemiche (2). La resistenza
alla meticillina negli stafilococchi rappresenta un problema
aggiuntivo, in quanto, come nel presente caso, allunga i tempi
di guarigione e facilita le infezioni persistenti. Per quanto
concerne l’epidemiologia molecolare degli MRSA, nell’ambito
degli animali da reddito è stata dimostrata la circolazione di
cloni ospite-adattati, come MRSA ST398 isolato da bovini e
suini (14). Sono sporadiche invece le segnalazioni di MRSA
isolati da cani e gatti. La caratterizzazione genetica in questi
casi ha messo in relazione i cloni animali con quelli circolanti
nella popolazione umana, suggerendo una trasmissione
dall’uomo all’animale (10). Il pattern mostrato dal ceppo MRSA
catalasi negativo (ST5, t002) è stato evidenziato in Francia e
USA, in cani, nelle stesse zone geografiche in cui era descritto
un clone endemico nell’uomo (6,8). Inoltre la presenza della
cassette SCCmec I e l’assenza della PVL sono caratteristiche
dei ceppi umani circolanti in ambito ospedaliero (Hospital
acquired), il che rafforza l’ipotesi di un flusso di ceppi dall’
uomo agli animali domestici (10). Sfortunatamente, la fonte
del ceppo MRSA catalasi negativo identificato in questo studio
è rimasta incerta, dato che non è stato possibile effettuare il
campionamento in altri cani o nel personale del canile.
La prova della catalasi è un test di routine utilizzato per
l’identificazione di stafilococchi nei laboratori di microbiologia.
I risultati di questo studio dimostrano che il riscontro di
stafilococchi catalasi negativi, e in particolare di MRSA,
rischia di essere sottostimato, e che nell’algoritmo diagnostico
delle patologie da stafilococchi andrebbe contemplata questa
possibilità. E’ auspicabile inoltre che venga effettuata l’analisi
genetica di tali ceppi, ai fini di un monitoraggio epidemiologico,
e per valutare le alterazioni funzionali del gene katA, in
rapporto alle possibili ripercussioni sulla virulenza di tali
microrganismi.
BIBLIOGRAFIA
1. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2012.
Performance standards for antimicrobial disk susceptibility
tests; approved standard, 11th ed. CLSI document M02-A11.
Wayne, PA.
2. Del’Alamo, L., d’Azevedo, P.A., Strob, A.J., RodriguezLopez, D.V., Monteiro, J., Andrade, S.S., Pignatari, A.C.C.,
Gates, A.C. 2007. An outbreak of catalase-negative meticillinresistant Staphylococcus aureus. J. Hosp. Infect. 65, 226-230.
3. Deurenberg, R.H., Vink, C., Kalenic, S., Friedrich, A.W.,
Bruggeman, A.C., Stobberingh, E.E. 2007. The molecular
evolution of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin.
Microbiol. Infect. 3, 222-235.
4. Enright, M.C., Day, N.P.J, Davies, C.E., Peacock, S.J., Spratt,
B.J. 2000. Multilocus sequence typing for characterization
of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of
Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 38, 1008-1015.
5. Grüner, B.M., Han, S.R., Meyer, H.G., Wulf, U., Bhakdi, S.,
Siegel, E.K. 2007. Characterization of a catalase- negative
methicillin resistant Staphylococcus aureus strain. J. Clin.
Microbiol. 45, 2684-2685.
6. Haenni, M., Saras, E., Châtre, P., Médaille, C., Bes, M.,
Madec, J.Y., Laurent, F. 2012. A USA300 variant and other
human-related methicillin-resistant Staphylococcus aureus
strains infecting cats and dogs in France. J Antimicrob
Chemother. 67, 326-329.
7. Kanati, H., Martin, S.E. 1985. Catalase and superoxide
dismutase activities in virulent and nonvirulent Staphylococcus
aureus isolates. J. Clin. Microbiol. 21, 607-610.
8. Lin, Y., Barker, E., Kislow, J., Kaldhone, P., Stemper, M.E.,
Pantrangi, M., Moore, F.M., Hall, M., Fritsche, T.R., Novicki, T.,
Foley, S.L., Shukla, S.K. 2011. Evidence of multiple virulence
subtypes in nosocomial and community-associated MRSA
genotypes in companion animals from the upper midwestern
and northeastern United States. Clin. Med. Res. 9, 7-16.
9. Lina, G., Piémont, Y., Godail-Gamot, F., Bes, M., Peter, M.O.,
Gauduchon, V., Vandenesh, F., Etienne, J. 1999. Involvement
of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus
aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin. Infect.
Dis. 29, 1128-1132.
10. McCarthy, A.J., Lindsay, J.A., Loeffler, A. 2012. Are all
meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) equal in
all hosts? Epidemiological and genetic comparison between
animal and human MRSA. Vet. Dermatol. 23, 267-276.
11. Messina, C.G.M., Reeves, E.P., Roes, J., Segal, A.W.
2002. Catalase negative Staphylococcus aureus retain
virulence in mouse model of chronic granulomatous disease.
FEBS Lett. 518, 107-110.
12. Murakami, K., Minamide, W., Wada, K., Nakamura, E.,
Teraoka, H., Watanabe, S. 1991. Identification of methicillinresistant strains of staphylococci by polymerase chain
reaction. J. Clin. Microbiol. 29, 2240-2244.
13. Oliveira, D.C., de Lencastre, H. 2002. Multiplex PCR
strategy for rapid identification of structural types and variants
of the mec element in Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Antimicrob. Agents Chemoter. 46, 2155-2161.
14. Pantosti, A. 2012 Methicillin resistant associated with
animals and its relevance to human health. Front. Microbiol.
3, 127.
15. Piau, C., Jehan, J., Leclerq, R., Daurel, C. 2008. Catalase
negative Staphylococcus aureus strain with point mutations in
the katA gene. J. Clin. Microbiol. 46, 2060-2061.
16. Sasaki, T., Tsubakishita, S., Tanaka, Y., Sakusabe,
A., Ohtusuka, M., Hirotaki, S., Kawakami, T., Fukata, T.,
Hiramatsu, K. 2010. Multiplex-PCR method for species
identification of coagulase-positive staphylococci. J. Clin.
Microbiol. 48, 765-769.
17. Shopsin, B., Gomez, M., Montgomery, O., Smith, D.H.,
Waddington, M., Dodge, D.E., Bost, D.A., Riehman, M., Naidich,
S., Kreiswirth, B.N. 1999. Evaluation of protein A polymorphic
region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus
strains. J. Clin. Microbiol. 37, 3556-3563.
18. To, K.K., Cheng, V.C.C., Chan, J.F.W., Wong, A.C.C.,
Chau, S., Tsang, H.F., Lau, S.K.P., Yuen, K-Y., Woo, P.C.Y.
2011. Molecular characterization of a catalase-negative
Staphylococcus aureus subsp. aureus strain collected from a
patient with mitral valve endocarditis and pericarditis revealed
a novel nonsense mutation in the katA gene. J. Clin. Microbiol.
49, 3398-3402.
200
INDAGINE SULLA PRESENZA DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS E DI MRSA NEL LATTE DI
MASSA DI ALLEVAMENTI CAPRINI DELLA LOMBARDIA
Cortimiglia C.1, Franco A.2 , Battisti A.2, Colombo L.3, Stradiotto K.3, Vezzoli F.1, Luini M.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Lodi;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio Toscana, CRN Antibioticoresistenza, Roma;
3
Associazione Regionale Allevatori Lombardia, Crema.
1
2
Key words: MRSA, goat, MLST
SUMMARY
Staphylococcus aureus is an important cause of mastitis in goats,
but few data are available about the presence of MRSA in this
species. Our study is a survey of S.aureus and MRSA prevalence
in bulk milk of Lombardia goat farms. Eighty-five of 197 bulk milk
samples from different farms were found positive for S. aureus
(43,1%) with counts ranging from 10 to 36.000 ufc/ml. S.aureus
isolates from direct plating and after selective enrichment were
tested for methicillin resistance and confirmed by specific mecA
PCR. Four samples were found MRSA positive. MLST analysis
revealed 3 typical livestock-associated ST398 and 1 strain ST1.
Our study showed an high prevalence of S.aureus infected herds
and demonstrated that dairy goats carried MRSA of the same
genotypes common in other livestock in Italy. The application of
stringent control measures against S.aureus mastitis in goats are
suggested in order to minimize the risk of human occupational or
foodborne exposure and colonization by MRSA.
INTRODUZIONE
Staphylococcus aureus è un importante agente mastitogeno
nei bovini e nei piccoli ruminanti nei quali può causare mastiti
contagiose prevalentemente di natura subclinica. Anche nelle
capre l’infezione può diffondersi negli animali in lattazione, influendo negativamente sulla produzione di latte, sia dal punto di
vista quantitativo, che qualitativo. Oltre a questo, la presenza di
S.aureus rende il latte stesso e i prodotti derivati una fonte di pericolo di tossinfezione alimentare, soprattutto considerando che
la maggior parte dei prodotti lattiero-caseari caprini originano da
latte crudo.
Negli ultimi 10 anni è emersa la diffusione anche negli allevamenti zootecnici di S. aureus meticillino-resistenti (MRSA, methicillinresistant Staphylococcus aureus), ceppi multiresistenti agli antibiotici, responsabili di infezione umana in ambito ospedaliero o
diffusi nelle comunità. LA-MRSA (Livestock Associated MRSA),
sono frequentemente riportati negli allevamenti suini e più recentemente negli allevamenti bovini dove ceppi appartenenti al
Sequence Type 398 sono quelli maggiormente rappresentati (2).
Studi successivi hanno poi messo in luce il potenziale zoonosico
di tali ceppi, che si sono dimostrati in grado di causare infezione
nell’uomo, in particolare negli addetti agli allevamenti come infezione di tipo occupazionale (9). L’isolamento di MRSA nel latte
di capra è segnalata molto raramente (1,3,10) ed in particolare
nessuno studio condotto in Italia, ha evidenziato la presenza nel
latte di capra di ceppi meticillino-resistenti, confermati per la presenza del gene mecA (6).
Il presente lavoro ha lo scopo di valutare la prevalenza di
S.aureus e di MRSA in allevamenti di capre da latte della regione
Lombardia.
MATERIALI E METODI
Campioni – Sono stati presi in esame 197 campioni di latte di
massa di altrettanti allevamenti caprini presenti nella regione
Lombardia, prelevati tra Luglio e Ottobre del 2012 in occasione del monitoraggio di routine della qualità del latte svolto dalla
Associazione Regionale Allevatori (ARAL). Durante la lattazione
successiva, tra giugno e luglio del 2013, il latte di massa di 4
aziende è stato prelevato per un secondo controllo. Contemporaneamente, in 2 delle 4 aziende è stato effettuato il prelievo del
latte individuale di ciascuna emi-mammella, rispettivamente dei
95 e 240 soggetti in lattazione presenti.
Esame batteriologico per ricerca di S. aureus - Sono stati seminati 100ml di ciascun campione tal quale e diluito 1:10 su Baird Parker - Rabbit Plasma Fibrinogen agar (BP-RPF); dopo 48
ore di incubazione a 37°C è stata effettuata la conta delle Unità
Formanti Colonia (UFC/ml) considerando le colonie tipiche nere
con alone di opacamento; contemporaneamente le diluizioni del
campione sono state seminate su Agar Globuli + Esculina (ASE)
e sono state prese in considerazione le colonie emolitiche. Colonie riferibili a S. aureus sono state confermate con il test della
coagulasi in provetta.
Ricerca di MRSA – Per ogni campione positivo dalla semina
diretta su BP-RPF e su ASE, sono state selezionate fino a 4 colonie confermate come S. aureus e sono state sottoposte al test
di sensibilità all’oxacillina con dischetti da 1 mg, secondo Kirby
Bauer. Per aloni di inibizione ≥ a 13 mm i ceppi sono stati considerati sensibili, per aloni compresi fra 12 e 11 mm intermedi e
≤ di 10 mm resistenti. Tre ml di latte sono stati inoltre sottoposti ad un doppio arricchimento selettivo per 24 ore a 37 C° in
Mueller-Hinton+6,5% NaCl e successivamente in TSB+5mg/L di
oxacillina; la piastratura è stata effettuata sui terreni selettivi Brilliance MRSA agar (Oxoid, UK) e Oxacillin Resistance Screening
Agar Base (ORSAB) (Oxoid, UK) per incubazione di 24/48 ore a
37 C°. Le colonie sospette sono state confermate con test della
catalasi, coagulasi in provetta e con il sopraccennato test di sensibilità all’oxacillina. Tutti i ceppi oxacillina-resistenti e intermedi,
sono stati sottoposti a PCR di conferma per MRSA, utilizzando
primers per il gene nuc e mecA riportati in letteratura (4,7).
Genotipizzazione – Tutti i ceppi MRSA sono stati sottoposti a
genotipizzazione mediante Multilocus Sequence Typing (MLST)
secondo il protocollo riportato in letteratura (5).
RISULTATI E CONCLUSIONI
Esame batteriologico per ricerca di S. aureus - Su 197 campioni di latte di massa analizzati nell’anno 2012, 85 sono risultati
positivi per S.aureus (43,1%, CI 95%: 36,2%-50,1%). In particolare 32 campioni presentavano una conta compresa fra 10 e 100
UFC/ml, 34 compresa fra 101 e 1000 UFC/ml, 17 compresa fra
1001 e 10000 UFC/ml e 2 una conta > 10000 UFC/ml (Tabella
1).
Ricerca di MRSA - Complessivamente abbiamo riscontrato 4
campioni positivi per MRSA corrispondenti al 4,7% dei campioni
positivi per S.aureus, di cui 3 individuati per semina diretta e uno
individuato solo in seguito ad arricchimento. Per quanto riguarda
i primi, in 2 campioni, 4 colonie su 4 testate sono risultate MRSA,
201
mentre in un campione solo 1 colonia su 4 si è rivelata MRSA
(Tabella 2).
Genotipizzazione - La genotipizzazione con MLST dei ceppi
MRSA ha messo in luce la presenza di ST398 in 3 dei 4 campioni
di latte di massa analizzati e di ST1 nel restante campione.
Campionamenti nelle aziende positive – Dall’analisi batteriologica del latte di massa delle 4 aziende risultate positive per
MRSA campionate durante la lattazione successiva, 3 sono
risultate ancora positive per S.aureus con conte comprese tra
100-800 UFC/ml, ma solo una di queste si è confermata positiva per MRSA, solo dalla semina per arricchimento (Tabella 2).
In questa azienda è stato possibile effettuare il campionamento
individuale, dal quale S. aureus è stato isolato da 16 capi su 240,
di cui 3 si sono rivelati MRSA e i rimanenti 13 meticillino sensibili
(MSSA). In analogia a quanto riscontrato nel latte di massa della
stessa azienda, l’analisi MLST dei 3 isolati da latte individuale ha
evidenziato ST398.
Nella seconda azienda dove è stato effettuato il campionamento
individuale, non è stato possibile isolare MRSA, né dal latte di
massa, né dal latte individuale, mentre 5 soggetti sono risultati
positivi per MSSA.
Tabella 1 – Risultati della conta di S.aureus nel latte di massa
delle 197 aziende ed esito della ricerca di MRSA.
S. aureus ufc/ml
N.
MRSA +
< 10
112
-
10 - 100
32
-
101 - 1000
34
1
1001 - 10000
17
2
> 10000
2
1
85
4
(43,1%)
(4,7%)
Totale positivi
Tabella 2 – Risultati della conta di S.aureus nelle 4 aziende positive per MRSA, esito della coltura diretta (n. colonie MRSA/n.
colonie testate), dell’arricchimento e dell’analisi MLST.
Coltura per MRSA
Azienda
A
B
C
D
Anno
S.aureus
MLST
ufc/ml
Diretta
Arrich.
2012
1.200
+ (1/4)
nd
ST1
2013
540
-
-
-
2012
5.300
+ (4/4)
nd
ST398
2013
<10
-
-
-
2012
3.500
-
+
ST398
2013
100
-
+
ST398
2012
36.000
+ (4/4)
+
ST398
2013
800
-
-
-
I nostri risultati mettono in evidenza una prevalenza elevata di
campioni di latte di massa positivi per S. aureus a dimostrazione
del fatto che questa infezione mammaria è molto diffusa negli
allevamenti caprini del territorio considerato. La prevalenza è più
elevata rispetto a quella riscontrata in uno studio svizzero nel
quale è risultata pari al 32 % (8).
Per la prima volta in Italia, la conferma della presenza di MRSA
nel latte di massa di capra è stata messa in evidenza dal nostro
studio. Studi precedenti condotti in Sicilia avevano riportato l’isolamento un fenotipo di resistenza all’oxacillina, ma erano privi
del gene mecA (6). Due dei campioni risultati positivi nel nostro
studio avevano alte conte di S. aureus e tutte le colonie testate
erano mecA positive. In questo caso è altamente probabile che
MRSA rappresentassero la quasi totalità degli S. aureus presenti
nel latte di massa e che questi originassero da mastiti presenti nel gruppo. Per quanto riguarda gli altri due campioni, in cui
MRSA sono stati dimostrati solo per arricchimento o in proporzione minore (1 sola colonia su 4 indagate), possiamo ritenere che
tali ceppi fossero responsabili di infezione mammaria sporadica
o piuttosto di origine ambientale. Analoghe considerazioni possono essere fatte per i campionamenti eseguiti nelle stesse 4
aziende nel corso della lattazione successiva, dei quali uno solo
è risultato positivo per MRSA, solo dopo arricchimento. In questo allevamento, l’indagine eseguita su tutti i capi in lattazione
ha messo in evidenza solo 3 capi con infezione mammaria da
MRSA. Complessivamente nei 4 allevamenti si poteva registrare un abbassamento anche della conta di S. aureus nel latte di
massa, probabile indice di miglioramento della gestione sanitaria delle mastiti e della riforma della maggior parte degli animali
problema.
L’analisi MLST ha identificato gli isolati da 3 dei quattro campioni positivi per MRSA come ST398, tipicamente circolante nelle
produzioni zootecniche (LA-MRSA), mentre il quarto ceppo è risultato ST1, un clone frequentemente associato a colonizzazioni
ed infezioni nell’Uomo, ma già riscontrato in Italia anche da latte
di massa bovino, da mastiti bovine e da suini (2, 9).
L’alta prevalenza di positività per S. aureus negli allevamenti caprini e la presenza, sia pure sporadica di MRSA nel latte
confermano l’importanza di adottare severe misure di contenimento dell’infezione da S. aureus in questa specie. In funzione
anche della possibile rilevanza per la salute pubblica il nostro
studio suggerisce di porre una maggiore attenzione alla qualità igienico-sanitaria dei prodotti lattiero caseari caprini, anche
in considerazione del fatto che sono frequentemente prodotti a
partire da latte crudo.
5. Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, Spratt BG.
2000. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol.;38(3):1008-15.
6. Foti M, Fisichella V, Conte F, Passantino A, Giacopello C.
2012. Indagine sulla presenza di Staphylococcus aureus meticillino resistenti (MRSA) in animali da reddito e in personale
addetto agli allevamenti in Sicilia. Large Animal Review, Vol. 18
No. 4 pp. 177-182
7. McClure JA, Conly JM, Lau V, Elsayed S, Louie T, Hutchins
W, Zhang K (2006). Novel multiplex PCR assay for detection
of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leu-
kocidin genes and simultaneus discrimination of methicillinsusceptible from resistent staphylococci. J. Clin. Microbiol.,
44:1141-1144
8. Muehlherr JE, Zweifel C, Corti S, Blanco JE, Stephan R.
2003.Microbiological quality of raw goat’s and ewe’s bulk-tank
milk in Switzerland. J Dairy Sci.;86(12):3849-56
9. Pantosti A. 2012. Methicillin Resistant Staphylococcus aureus associated with animals and its relevance to human health.
Front Microbiol.; 3:127
10. Statskova Z., Karpiskova S., Karpiskova R. 2009. Occurrence of methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus
at goat breeding farm. Veterinarni Medicina, 54:429-426.
BIBLIOGRAFIA
1. Aras Z, Aydin I, Kav K.2012. Isolation of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus from caprine mastitis cases .Small Ruminant Research Volume 102, Issue 1 , Pages 68-73,
2. Battisti A, Franco A, Merialdi G, Hasman H, Iurescia M, Lorenzetti R, Feltrin F, Zini M, Aarestrup FM. 2010. Heterogeneity
among methicillin-resistant Staphylococcus aureus from Italian
pig finishing holdings. Vet Microbiol.;142(3-4):361-6.
3. Chu C, Yu C, Lee Y, Su Y. 2012. Genetically divergent methicillin-resistant Staphylococcus aureus and sec-dependent mastitis
of dairy goats in Taiwan. BMC Vet Res.;8:39.
4. Cremonesi P, Luzzana M, Brasca M, Morandi S, Lodi R, Vimercati C, Agnellini D, Caramenti G, Moroni P, Castiglioni B.
2005. Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated
from milk and dairy products. Mol Cell Probes ;19(5):299-305.
202
203
LARVE DI ANISAKIDAE ISOLATE DA PRODOTTI ITTICI D’IMPORTAZIONE:
IDENTIFICAZIONE MORFOLOGICA E MOLECOLARE
Costa A.1, Palumbo P.1, Graci S.1, Cammilleri G.1, Fischetti R. 2, Marconi P. 3, Ferrantelli V.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Centro di Referenza Nazionale per le Anisakiasi, Palermo
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Pisa
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Firenze
1
Key words: zoonotic disease, Anisakis spp., Pseudoterranova spp
SUMMARY
The authors report data on the occurrence of Anisakidae larvae
in imported fishery products. Out of 10 fish fillets examined,
with visual inspection and digestion method, 4 samples were
positive:a total of 76 larval forms of Anisakidae were collected
(Anisakis and Pseudoterranova). The morphological analysis
has classified the larvae isolated from Brosme brosme as L3
stages of Anisakis Type I (sensu Berland 1961): in the molecular
analysis, digestion profiles has allowed the identification of the
larvae of Anisakis simplex s.s., based on the combination of
RFLP patterns. The larvae isolated by Gadus morhua and
from other fish fillets (species not indicated) were identified
Pseudoterranova decipiens s.l.: the molecular approach based
on mtDNA-cox2 sequence analysis identified the larvae as P.
decipiens s.s and P. krabbei. It is known the economic and
public health repercussion of the presence of parasites in
fishery products as well as the Regulations for the prevention
of consumers.
INTRODUZIONE
L’anisakidosi è una zoonosi dovuta a forme larvali di nematodi
anisakidi appartenenti ai generi Anisakis e Pseudoterranova.
Le forme adulte vivono nello stomaco di mammiferi marini
(ospiti definitivi),
principalmente cetacei per Anisakis e
pinnipedi per Pseudoterranova, che si infestano ingerendo
pesci e/o cefalopodi parassitati: l’uomo si inserisce in questo
ciclo biologico come ospite accidentale e può contrarre la
zoonosi in seguito al consumo di prodotti ittici crudi o poco cotti
o sottoposti a trattamenti (salagione, marinatura, affumicatura)
che non siano stati idonei a devitalizzare le larve.
Le larve infestanti L3 di Anisakidae possono essere identificate
a livello di genere mediante lo studio dei caratteri morfologici
al microscopio ottico (MO) (estremità cefalica, aspetto del
ventricolo, estremità caudale) (1,2) mentre l’identificazione
della specie può essere effettuata solo mediante tecniche di
genetica molecolare (5,8).
Negli ultimi decenni l’uso di metodi molecolari quali multi
locus allozyme electrophoresis (MAE) e più di recente, di
metodi basati sul DNA quali PCR restriction fragment lenght
polymorphism (PCR-RFLP ITS regions) e sequenziamento
del DNA nucleare ribosomiale (28S) e mitocondriale (mtcox2), hanno fornito un contributo significativo allo studio della
sistematica e della biologia dei nematodi anisakidi (7).
Studi genetico-molecolari hanno evidenziato che le morfospecie
Anisakis simplex e Pseudoterranova decipiens, ritenuti i
principali responsabili dell’anisakidosi umana, sono in realtà
composte da più specie gemelle, caratterizzate da differente
distribuzione geografica, ciclo biologico e preferenza per
l’ospite (5,7). Riguardo il genere Anisakis, le forme larvali, in
base alla presenza o meno del mucrone all’estremità caudale,
si distinguono in Tipo I e Tipo II (2).
Mediante metodi molecolari, attualmente in Anisakis Tipo I
rientrano sei specie distinte (A. simplex s. s., A. pegreffii, A.
simplex C, A. typica, A. ziphidarum e Anisakis sp A mentre in
Anisakis Tipo II sono state descritte tre specie: A. physeteris, A.
brevispiculata e A. paggiae (5,7).
Nel complesso P. decipiens rientrano le specie: P. decipiens
s.s, - range geografico Nord Est Atlantico, Atlantico e
Pacifico canadese, P. krabbei nel Nord Est Atlantico (Scozia,
Norvegia,Islanda),P.bulbosa nel Mar di Norvegia e di Barents,
Atlantico canadese e Mare del Giappone, P. azarasi nei mari del
Giappone, P. decipiens E nelle coste dell’Antartico e P.cattani
nell’Oceano Pacifico sud-orientale (7).
La presenza di Anisakis in specie ittiche di importanza
commerciale anche nel Mar Mediterraneo (oltre che nell’Oceano
Atlantico e Pacifico) è ampiamente noto così come la malattia
nell’uomo (9): due al momento le specie (A. simplex s.s., A.
pegreffii) associate a casi umani nel mondo.
Le larve di Pseudoterranova possono essere reperite in
prodotti ittici d’importazione (es merluzzi atlantici, coda di
rospo, halibut): più rari i casi di Pseudoterranoviasi riportati, in
bibliografia, in Giappone, Stati Uniti e Cile, spesso con la tipica
localizzazione oro-faringea (8). Un solo caso è documentato in
Italia (6).
Nel presente lavoro vengono riportati i risultati di una nostra
indagine sulla presenza di forme larvali di anisakidi zoonotici in
campioni di filetti di pesce confezionati, reperiti al commercio,
importati (zona di pesca Atlantico), e giunti all’osservazione
presso il nostro laboratorio: i reperti larvali ritrovati sono stati
sottoposti ad identificazione morfologica al MO e successiva
identificazione biomolecolare mediante marcatori del DNA
ribosomiale (ITS)e mitocondriale(mt-cox2).
MATERIALI E METODI
Nel periodo gennaio-maggio 2013 sono stati sottoposti ad
analisi per ricerca larve di nematodi Anisakidae, un totale di
10 prodotti ittici d’ importazione, filetti confezionati e forniti di
etichetta, di cui n. 6 congelati (n. 5 di nasello atlantico (Merluccius
hubbsi) e n. 1 di merluzzo sudafricano(Merluccius capensis), n.
1 di merluzzo nordico refrigerato (specie e provenienza non
indicata), n. 2 filetti salati e refrigerati (Brosme brosme e Gadus
morhua) e n. 1 filetti di gallinella cotta (specie non indicata). I
campioni congelati e refrigerati freschi riportavano la dicitura
“da consumare previa cottura”. I campioni esaminati, con le
indicazioni riportate in etichetta, non sempre complete riguardo
la denominazione di specie e la zona di provenienza, sono
riportati in Tab 1.
Sui campioni di filetti di pesce si è proceduto all’esame visivo
e/o mediante stereomicroscopio per la ricerca di larve di
Anisakidae: sui campioni è stata effettuata inoltre la digestione
enzimatica (secondo Reg 2075/2005).
Tra le fibre muscolari di alcuni campioni sono state reperite
204
n. 76 forme larvali L3 di nematodi riferibili ad Anisakidae.
I parassiti sono stati puliti in soluzione fisiologica, fissati
in etanolo 70% ed identificati a livello di genere, mediante
MO previa chiarificazione in glicerolo, in base alle chiavi
identificative esistenti in letteratura (1,2). I reperti larvali sono
stati quindi conservati in alcool etilico al 70% per la successiva
identificazione molecolare effettuata, dopo estrazione del DNA,
mediante PCR-RFLP per i nematodi riferibili al genere Anisakis
e successiva lettura dei profili di restrizione (5) e mediante
marcatori mt-cox2 e successivo sequenziamento per i riferibili al
genere Pseudoterranova (8,10). Estrazione del DNA. Le larve
sono state accuratamente lavate in acqua sterile, frammentate
con un bisturi, quindi congelate a -20°C per 24 ore. Per
l’estrazione degli acidi nucleici sono stati impiegati appositi kit
che si basano sull’uso di colonnine di affinità (SIGMA ALDRICH).
PCR-RFLP. Si è proceduto all’amplificazione delle regioni ITS
del rDNA nucleare e successiva restrizione enzimatica con i
due enzimi di restrizione (HhaI, Hinf), per l’identificazione di
specie di Anisakis, previsti in bibliografia (5). La procedura è
riportata in nostri precedenti lavori (4). Mitochondrial cox2
region. La regione mitocondriale cox2 è stata amplificata
usando i primers 210 (5’-CACCAACTCTTAAAATTATC-3’)
e 211(5’-TTTTCTAGTTATATAGATTGRTTYAT-3’), unendoli
ad acqua RNAsi e DNAsi free in un sistema pronto all’uso
(Ready to go PCR beads Illustra) ed infine aggiungendo 2,5
µl del DNA estratto da ciascun campione in un volume finale
di 25 µl. Sono state impostate le seguenti condizioni di PCR:
3 min a 94°C, 34 cicli di 30 s a 94°C, 30 s a 46 °C e 90 s
a 72°C ed un estensione finale a 72°C per 10 min (Termal
Cycler 2720 Applied Biosystems) (5,10). I prodotti derivanti
dall’amplificazione della regione cox2, corrispondente ad una
porzione del gene di 629 bp, sono stati visualizzati tramite
elettroforesi su gel di agarosio all’1,5% con Syber Safe
DNA Gel Stain (Invitrogen). Sequenziamento. I frammenti
amplificati sono stati purificati con colonnine GFX Microspin
e sottoposti a reazione di sequenza utilizzando il Kit Big Dye
Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). I prodotti
di sequenza purificati con l’impiego di colonnine G50 (GE),
sono stati denaturati e analizzati per elettroforesi capillare su
sequenziatore automatico 3130 Biotec 69. Le sequenze della
regione di DNA mitocondriale risultanti sono state allineate con
le sequenze più similari disponibili su GenBank utilizzando il
software Nucleotide BLAST.
(dimensione, presenza del cieco intestinale, colorazione
rosso-brunastra) (1, 2).
L’applicazione del markers genetico mitocondriale cox2 (mtDNA cox2) seguita dal sequenziamento e dall’allineamento
delle sequenze specifiche reperite in GenBank (8) ha permesso
di identificarne la specie come P. decipiens sensu strictu (s.s.)
and P. krabbei (Tab 1). Le identificazioni ottenute sono in
accordo con i dati noti riguardo le distribuzioni geografiche (7).
CONCLUSIONI
Le attuali normative comunitarie (Reg CE 853/2004 e s.m.i.,
Reg CE 2074/2005 e s.m.i.) e nazionali (OM 12/05/92) nonché
le Note del Ministero della Salute, definiscono gli obblighi per
gli OSA in relazione alla presenza di parassiti nei prodotti della
pesca, tra i quali il controllo visivo prima dell’immissione sul
mercato. I prodotti ittici d’importazione, congelati, surgelati
e preparazioni crude, devono essere accompagnati da un
documento sanitario attestante tale controllo, per verificare
l’assenza di parassiti ed trattamenti di bonifica in caso di
presenza. Un recente documento EFSA (EFSA Journal 2011;
9(7):2320) riconosce la presenza di anisakidi zoonotici in specie
catturate nel Mar Baltico ed il potenziale rischio per la salute
umana, raccomandando: la raccolta di dati epidemiologici
sulla diffusione delle specie di anisakidi con l’applicazione di
metodi genetico-molecolari e la sorveglianza dell’anisakiasi e
delle altre infezioni parassitarie nella popolazione. Alcuni lavori
recenti evidenziano l’aumento della prevalenza di infestazione
in specie ittiche, reperibili al commercio, provenienti anche da
queste zone marine (3).
In ultimo si evidenzia l’importanza dell’’applicazione delle
metodiche di conferma biomolecolari per una corretta
identificazione dei parassiti zoonotici riscontrabili nei prodotti
della pesca sia freschi che conservati (salati, affumicati o
cotti), importante altresì per studi epidemiologici la cui raccolta,
nell’ambito della sicurezza alimentare, riveste sicuramente
grande importanza per un approccio sulla valutazione del
rischio.
Tab 1 Campioni esaminati, indicazioni in etichetta e risultati
RISULTATI
Sul totale dei campioni di filetti di pesce d’importazione sono
state rilevate larve di nematodi Anisakidae in n. 4 campioni
come indicato in Tab 1, per un totale di n. 76 larve isolate.
I nematodi ritrovati nel brosme all’osservazione morfologica
al MO sono risultati riferibili a larve L3 appartenenti al genere
Anisakis di tipo I (sensu Berland). In questo campione diverse
larve apparivano al MO alterate dalla salatura e l’aspetto del
ventricolo non sempre era ben evidenziabile. L’applicazione
della metodica PCR-RFLP, sulla base dei patterns delle bande
di restrizione ottenute, lette mediante le chiavi esistenti in
bibliografia (5), ha permesso di identificarne la specie come
Anisakis simplex sensu strictu. Alcuni di questi amplificati
sono stati inoltre confermati con il marcatore mitocondriale
cox2 e successivo allineamento delle sequenze ottenute
con le sequenze depositate in GenBank (5). Le forme larvali
recuperate dagli altri campioni di filetti di pesce (Tab 1)
sono state identificate morfologicamente al MO come larve
L3 appartenenti al genere Pseudoterranova decipiens s.l
205
Tipo
campione/
filetti
Specie ittica e zona
di pesca
Totale
esamin e
positivi
nasello
atlantico
Merluccius hubbsi
Atlantico sud occ
- FAO 41
5
-
merluzzo
sudafricano
Merluccius capensis
Atlantico sud orien
- FAO 47
1
-
baccalà
salato
Gadus morhua
Atlantico Nord
(Faroe Islands)
1
merluzzo
nordico
-
Brosme
salato
gallinella
Totale
n.
larve
Id specie
1
30
P. krabbei
1
1
2
P. decipiens
s.s.
Brosme brosme
Atlantico Nord
-FAO 27
1
1
40
Anisakis
simplex s.s.
Atlantico NordOrientale
1
1
4
P. krabbei
10
4
76
BIBLIOGRAFIA
1) Anderson RC Nematodes Parasites of Vertebrates, Their
Development and Trasmission 2nd ed,CABI Publ Wallingford, 2000.
2) Berland B. (1961) Nematodes from some Norwegian
marine fishes. Sarsia 2:1-503.
3) Buchmann K, Kania P.(2012) Emerging Pseudoterranova
decipiens (Krabbe 1878) problems in Baltic cod, Gadus morhua,
associated with grey seal colonization of spawning grounds J
Fish Dis 35: 861-866.
4) Costa A., Di Noto A.M., Marino F., Palumbo P., Sciortino S.,
Caracappa S. (2010) Occurrence and molecular identification
of Anisakis spp in marine fishes from the Sicilian coasts. SOIPA
XXVI Abstracts, Parassitologia 52 (No 1-2): 349
5) D’Amelio S., Busi M.., Ingrosso S., Paggi L., Giuffra E.
(2010) Anisakis in Molecular detection of foodborne pathogens
54:757-768
6 Fioravanti ML, Pampiglione S., Riva R. (2004)
Pseudoterranova decipiens (Nematoda, Anisakidae) human
infection in Italy. SOIPA XXIII Abstracts Parassitologia 46
(Suppl 1):112
7) Mattiucci S, Nascetti G. (2008) Advances and trends in the
molecular systematics of anisakid nematodes with implication
for their evolutionary ecology and host-parasite co-evolutionary
processes Advances in Parasitology vol 66:47-148
8) Mattiucci S, Paoletti M, Webb SC, Nascetti G. (2012)
Pseudoterranova and Contracaecum in Molecular detection of
human parasitic pathogens 62: 645-656
9) Mattiucci S., Fazii P., Paoletti M., De Rosa A., Salomone
Megna A., Glielmo A., Bruschi F., De Angelis M., Costa A.,
Meucci C., Sorrentini L., Calvaruso V., Nascetti G. (2013)
Anisakiasis and gastroallergic reactions associated with
Anisakis pegreffii infection, Italy. Emerg Infect Dis Mar;
19(3):496-9
10) Valentini A, Mattiucci S, Bondanelli P, Webb SC,
Mignucci-Giannone AA, Colom-Llavina MM, Nascetti G. (2006)
Genetic relationships among Anisakis species (Nematoda:
Anisakidae) inferred from mitochondrial cox2 sequences, and
comparison with allozyme data . J Parasitol. Feb;92(1):156-66.
APPLICAZIONE DELLA PCR REAL TIME PER LA RILEVAZIONE DI
ANISAKIDAE IN PRODOTTI ITTICI: PRIMI RISULTATI
Costa A., Sciortino S., Migliazzo A., Giangrosso G., Ferrantelli V.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia “A.Mirri” Palermo
Centro di Referenza Nazionale per le Anisakiasi
Key words: PCR Real Time, Anisakis spp, foodborne allergen
SUMMARY
Anisakis spp has been recognized as an important cause of disease
in humans caused by the consumption of raw or undercooked fish
and as a food-borne allergen source. Adequate cooking will kill
anisakid larvae, however, killed or inactivated larvae can still cause
sensitization and immunoglobulin E-dependent hypersensitivity.
This work describes the application of a commercial kit based on
a Real-Time PCR method to detect and quantify the presence of
DNA of Anisakis spp. and Pseudoterranova spp. in fish and fishderived products, including fish fillets, surimi, fish sticks, canned
fish and baby food. Out of 73 fish products examined, in 16
samples was detected DNA of Anisakidae: the highest prevalence
has occurred in the anchovy paste. This molecular test is useful
to detect the presence of traces of this parasite in fish and fishderived products and to quantify the level of contamination along
the food chain, with potential applications for fish farms, fish
markets, and food producers.
INTRODUZIONE
Parassiti nematodi del genere Anisakis sono ritenuti responsabili,
oltre che di infestazioni umane legate al consumo di prodotti ittici,
di sensibilizzazione e di ipersensibilità IgE- dipendente. L’allergia
all’Anisakis viene studiata circa da una decina di anni e, data
la diffusione di questi parassiti, potrebbe essere sottostimata.
Sono state infatti osservate reazioni allergiche che vanno dalla
sindrome orticaria alla dermatite da contatto, all’asma, allo shock
anafilattico, conseguenti sia ad ingestione sia a manipolazione
di pesce infestato. Attualmente solo il genere Anisakis viene
ritenuto responsabile di reazioni allergiche (10). Diversi lavori
bibliografici mostrano il potere allergizzante delle forme larvali
di Anisakis, altamente stabili al calore e all’azione della pepsina:
alcuni autori ipotizzano che la reazione allergica potrebbe essere
scatenata non soltanto dalle forme larvali vitali (10) ma anche
dalle larve devitalizzate da trattamenti quali congelamento,
salagione o cottura nonché da frammenti o residui larvali che
possono permanere in prodotti della pesca preparati (1,2,3).
Studi recenti mostrano l’applicabilità di metodiche biomolecolari,
quali la PCR Real Time, per determinare la contaminazione da
nematodi Anisakidae, in particolare da Anisakis pegreffii (5)
specie maggiormente isolata nei prodotti della pesca del Mar
Mediterraneo ed identificata in diversi casi di anisakiasi in Italia (8).
Alcuni studi ne mostrano l’applicazione oltre che su prodotti della
pesca freschi, anche sui prodotti ittici cotti, affumicati o sottoposti
a salagione o anche a omogeneizzati di pesce (4,6,7). Tra le
metodiche di rilevazione dei parassiti nei prodotti ittici, oltre al
metodo visivo, alla transilluminazione UV e al metodo digestivo, la
metodica di PCR-Real Time di recente sviluppo (7,9), combinata
con una procedura di estrazione del DNA, viene considerata
altamente specifica e sensibile e applicabile a prodotti ittici freschi
e processati (10).
La procedura è stata di recente automatizzata su apparecchiature
di laboratorio, con l’utilizzo di kit reperibili in commercio. Nel
presente lavoro riportiamo i risultati dell’applicazione della PCRReal Time su diversi prodotti ittici freschi e trasformati, pervenuti
206
presso il nostro laboratorio e campionati nell’ambito di un progetto
di Ricerca.
MATERIALI E METODI
Nel periodo gennaio-agosto 2013 sono stati sottoposti alla
metodica di rilevazione qualitativa di DNA di Anisakidi mediante
PCR-Real Time, un totale di 73 campioni di prodotti ittici, di cui
13 di filetto di pesce congelato confezionato (filetto merluzzo, di
platessa, bastoncini di pesce), 2 di surimi, 4 di omogeneizzato di
pesce, 2 condimento per pasta con le sarde e 52 tra conserve
e semiconserve ittiche, cosi’ come riportato in dettaglio in Tab
1. Sui alcuni prodotti dove è stato possibile (filetti di pesce, alici
marinate, filetti di sgombro, acciughe e sardine sott’olio) è stato
prima eseguito il controllo visivo (Reg 2074/2005) e mediante
stereomicroscopio, per verificare la presenza di larve di Anisakis
o di Pseudoterranova (Tab 1). Per la PCR Real Time è’ stato
utilizzato un kit di recente commercializzazione, pronto per l’uso
e di rapida esecuzione (InCura): la reazione mediante PCR Real
Time riconosce una specifica regione di DNA di Anisakis spp. e
Pseudoterranova spp., dando origine ad un prodotto di PCR di
56bp rilevabile in tempo reale (fluoroforo FAM) mediante una
sonda di ibridazione fluorescente. Il sistema include inoltre un test
di controllo di amplificazione che riconosce una regione universale
di DNA eucariotico dando origine ad un prodotto di PCR di 73bp
rilevabile in tempo reale col fluoroforo YAK. Il controllo positivo è
fornito dal kit di amplificazione. Estrazione del DNA. Il campione
(50 g) viene accuratamente omogeneizzato con un frullatore a
lama: 0.35 g dell’omogeneizzato verrà sottoposto ad estrazione
del DNA. Per l’estrazione del DNA viene usato un apposito kit
che si basa sull’uso di colonnine di affinità (Grees DNA Kit Food
-InCura).Una stima approssimativa della quantità di DNA estratto
viene effettuata mediante lettura spettrofotometrica alla lunghezza
di 260 nanometri diluendo 10 µl dell’estratto di DNA in 490 µl di
acqua Nuclease free (GeneQuant 100 Biochrom). PCR REALTIME La fase di amplificazione viene effettuata mediante un kit
commerciale (Anisakids PCR Real Time Kit – InCura). Per ogni
campione, una singola estrazione di DNA è analizzata in due
repliche. Il volume totale della miscela di reazione è di 25 µl: in
ogni pozzetto della microplate si dispensano 20 µl di Mix Test
Anisakids e 5 µl di DNA da testare. Contestualmente si allestiscono
le reazioni di controllo negativo e positivo sostituendo il DNA da
testare, rispettivamente, con 5 µl di Acqua sterile e 5 µl di DNA
Positive Control. La microplate viene inserita nel termociclatore
(Stratagene) e viene impostato il seguente ciclo di PCR: 5 min a
95°C, 40 cicli di 15 s a 95°C, 60 s a 60 °C e ramp rate massima.
I risultati attesi per i controlli di reazione positivo e negativo
ed i valori di Ct per determinare la positività o la negatività del
campione testato, sono indicati dalla casa produttrice. Il kit
consente la rivelazione fino allo 0.001% di DNA di Anisakis
spp. e Pseudoterranova spp. (9). Il risultato potrebbe essere
invalidato dalla presenza nel campione di inibitori quali olio
o alte concentrazioni di sale: tale situazione si è verificata in
alcuni campioni di pasta d’acciughe e di acciughe sott’olio ed in
questi caso si è proceduto ad una preventiva diluizione del DNA
207
amplificato 1:1000 con acqua sterile.
La sensibilità diagnostica è stata valutata infestando
sperimentalmente con residui larvali di Anisakis spp e di
Pseudoterranova spp (materiale di riferimento del Centro)
del tessuto muscolare di pesce non contaminato; i campioni
positivizzati sono stati analizzati in condizioni di ripetibilità.
La procedura è attualmente in via di validazione presso il Centro.
Nell’ambito della sicurezza alimentare, tra l’altro, le attuali
normative intendono garantire ai cittadini, soprattutto a quelli con
sensibilità nota a componenti od additivi alimentari, il diritto ad
un’informazione più approfondita sul contenuto degli alimenti. In
ambito di autocontrollo bisogna prestare particolare attenzione
affinchè il confezionamento e i dati riportati in etichetta siano
adeguati al prodotto alimentare realizzato, al fine di evitare che
alimenti contenenti potenziali sostanze allergeniche vengano
immessi in commercio privi di indicazioni specifiche.
VALUTAZIONE COMPARATIVA FRA TRE METODICHE DI LABORATORIO PER
L’IDENTIFICAZIONE DI LIEVITI DI ORIGINE ANIMALE
1
Crotti S., 1Agnetti F., 1Maresca C., 1Scoccia E., 1D’Angelo G., 2Palmieri M., 3Morganti G., 1Papa P., 2Pitzurra L.
1
IZS Umbria e Marche, Perugia; 2Istituto di Microbiologia, Fac. di Medicina e Chirurgia, Perugia
3
Dip.to di Scienze Biopatologiche ed Igiene delle Produzioni Animali ed Alimentari, Perugia
Key words: lieviti, identificazione, laboratorio
Tab 1 Tipologia campioni esaminati e risultati
Tipo campione
RISULTATI
Sul totale dei campioni esaminati è stato rilevato DNA di Anisakidae
in 16 campioni (21.9%), come indicato in Tab 1.
Le semiconserve ittiche sono risultate più contaminate, in
particolare la pasta d’acciughe (5/11) e le acciughe sott’olio (3/7).
Positivo un campione di condimento di pasta con sarde. Negativi
i campioni di omogeneizzati di pesce, destinati ad un pubblico
infantile, ed i bastoncini di pesce ed alcune preparazioni quali patè
di tonno ed il tonno sott’olio.
Riguardo il confronto con il metodo visivo, è da rilevare che in
alcuni campioni, nei quali il DNA è stato rilevato con la PCR Real
Time, era stata evidenziata la presenza di larve di Anisakis, quali
alici marinate e acciughe sott’olio, devitalizzate dal trattamento
ma potenzialmente responsabili di fenomeni allergici in soggetti
sensibilizzati.
Di interesse la positività riscontrata in diversi campioni di pasta
d’acciughe esaminati, tra l’altro alcuni della stessa Ditta produttrice,
il che fa ipotizzare l’utilizzo di materie prime contaminate da residui
larvali.
CONCLUSIONI
Negli ultimi anni l’avvento e lo sviluppo delle tecniche di PCR Real
Time quantitativa ne ha permesso l’utilizzo in varie applicazioni,
compresa la ricerca di patogeni batterici, virali e parassitari.
L’applicazione di tecniche identificative di PCR-Real Time
quantitativa permetterebbe di dare un ulteriore contributo alla
ricerca di contaminazioni da DNA di parassiti zoonotici nelle matrici
ittiche, responsabili di sensibilizzazioni e/o di forme allergiche,
argomento attualmente di attualità.
Dai risultati preliminari ottenuti in questa nostra indagine, si può
affermare che la metodica di PCR Real Time applicata alle matrici
ittiche si rileva sensibile e di rapida esecuzione.
Ulteriori approfondimenti sarebbero necessari per valutarne
l’applicabilità che sembra più opportuna per quei prodotti ittici
destinati al consumo umano, lavorati o processati (baby food a
base di pesce, in scatola o patè ecc) dove l’identificazione visiva
del nematode non è più possibile.
E’ da sottolineare che pesce e prodotti derivati rientrano nell’elenco
delle sostanze considerate allergeni dalle attuali
normative (direttiva 2003/89CE, recepita dall’’Italia con il DL.vo
114/2006).
Filetto di merluzzo
n.
esamin
6
Esame
visivo
N
Presenza
DNA
-
Assenza
DNA
6
Filetto di platessa
5
N
2
3
Bastoncini di pesce
Omogeneizzato di
pesce
Condimento pasta
con sarde
Pasta d’acciughe
2
N
-
2
4
-
-
4
2
-
1
1
11
-
5
6
Sgombro sott’olio
7
N
-
7
Tonno sott’olio
9
N
-
9
Acciughe sott’olio
7
2P
3
4
Sardine sott’olio
5
P
1
4
Patè di tonno
3
-
-
3
Alici marinate
10
2P
4
6
Surimi
2
-
Totale
73
-
2
16
57
BIBLIOGRAFIA
1) Audicana MT, Ignacio J.A., Fernandez de Corres L., Kennedy
MW (2002) Anisakis simplex: dangerous-dead and alive? Trends in
Parasitology 18 (1):20-25
2) Audicana L., Audicana MT.,Fernandez de Corres L.,Kennedy
MW (1997) Cooking and freezing may not protect against allergenic
reactions to ingested Anisakis simplex antigens in humans Vet Rec
Mar;140(9):235
3) Baeza Ochoa y M.L., San Martin M.S. (2000) Heat stability of Anisakis
simplex larvae antigens Allergol Immunol Clin 15:240-246
4) Capra E., D’Amelio S., Bandi C., Manfredi M.T., Piccolo G.,
Gomez Morales M.A., Pozio E., Giuffra E. (2006) Use of Real Time PCR
to detect different species of Anisakidae and to reveal contaminants in
fish product Parassitologia 48, No 1-2 :282
5) Fang W , Liu F., Zhang S., Lin J., Xu S., Luo D. (2011) Anisakis
pegreffii: a quantitative fluorescence PCR assay for detection in situ.
Experimental Parasitology 127: 587-592
6) Herrero B., Vieites JM, Espineira M. (2011) Detection of anisakids in
fish and seafood products by Real Time PCR Food Control 22;933-939
7) Lopez I. Pardo MA (2010) Evaluation of a Real Time Polymerase
Chain Reaction (PCR) Assay for Detection of Anisakis simplex Parasite
as a food borne allergen source in seafood products J Agric Food Chem,
58, 1469-1477
8) Mattiucci S., Fazii P., Paoletti M., De Rosa A., Salomone Megna A.,
Glielmo A., Bruschi F., De Angelis M., Costa A., Meucci C., Sorrentini
L., Calvaruso V., Nascetti G. (2013) Anisakiasis and gastroallergic
reactions associated with Anisakis pegreffii infection, Italy. Emerg Infect
Dis Mar; 19(3):496-9
9) Mossali C, Palermo S, Capra E, Piccolo G, Botti S, Bandi C, D’Amelio
S, Giuffra E. (2010) Detection and Quantification of Anisakid Parasite
Residues in Food Products. Foodborne Pathog Dis 2010 Apr;7(4):391-7
10) Scientific Opinion on risk assessment of parasites in fishery products.
EFSA Journal 2010; 8(4):1543).
Ricerca finanziata dal Ministero della Salute RC IZS SI 12/11
208
ABSTRACT
Three yeast identification systems, API ID 32C, Vitek-2 System
and MALDI-TOF MS, were evaluated using 39 strains, isolated
from samples of different animal species. Preliminary data
obtained were elaborated through the Cohen test and the scale
of Altman, comparing API ID 32C system vs Vitek-2 and API ID
32C system vs MALDI-TOF MS, respectively. Data obtained
by the first comparison provided a good degree of correlation,
while the comparison between API ID 32C and MALDI-TOF MS
provided a sufficient degree of correlation. Further investigations
are necessary to compare additional yeast strains, isolated
from animals and previously identified by sequencing, also with
references strains.
INTRODUZIONE
Le infezioni dovute a lieviti patogeni o ad organismi lievito-simili
possono spaziare da blande irritazioni delle mucose a patologie
più severe e/o invasive. Come nel corso di altri processi infettivi,
la rapida identificazione dell’agente causale e l’allestimento di
test di suscettibilità agli antifungini svolgono un ruolo chiave per
una gestione proficua e risolutiva del caso (1). Gli attuali metodi
di identificazione per lieviti e organismi lievito-simili si basano
prevalentemente sulle caratteristiche fisiche e biochimiche degli
isolati. Ad esempio, test semplici e rapidi come il germ-tube sono
spesso usati, in medicina umana, per l’identificazione rapida e
presuntiva di Candida (C.) albicans; tuttavia, non tutti i ceppi di
C. albicans producono tubuli germinativi, ed altre specie, come
C. tropicalis e C. dubliniensis, possono comunque produrre
strutture simili ai tubuli, erroneamente interpretabili come tali
(2). Allo stesso modo, il test di assimilazione rapida del trealosio
(RAT) può consentire l’identificazione presuntiva di C. glabrata,
ma molte specie, come C. tropicalis, possono generare falsi
positivi (3). I test rapidi vanno dunque spesso confermati con
ulteriori metodiche, alcune delle quali basate principalmente
su proprietà biochimiche, quali la capacità di fermentare i
carboidrati. A tal scopo, in commercio, sono presenti pannelli in
formato manuale (API ID 20C e API ID 32C) e semiautomatico
(Vitek ID YST e Phoenix Yeast ID) (bioMérieux, Marcy l’Etoile,
Francia, e BD, Sparks, MD); tali test identificano correttamente
dal 90% al 98% degli isolati di origine umana (4). Tuttavia, il
loro tempo di risposta può durare da 24 a 72 ore, che, unite al
tempo necessario per l’isolamento del lievito in coltura pura, può
interferire con la necessità clinica di avere una diagnosi rapida
e di impostare una terapia mirata (4, 5). Metodi più rapidi per
l’identificazione dei lieviti nella pratica clinica comprendono
i terreni cromogeni e i saggi basati sugli acidi nucleici. I primi
consentono un’identificazione presuntiva, grazie all’impiego
differenziale di substrati cromogeni aggiunti al medium, con il
risultato di avere singole colonie di ciascuna specie diversamente
colorate. Tuttavia, l’impiego di un cromogeno può essere limitato
da due fattori: in primis, la capacità di discriminare un numero
limitato di lieviti; in secundis, più specie di lieviti possono
sviluppare colori simili sullo stesso terreno (6). Il PNA FISH
(Peptide Nucleic Acid Fluorescence in situ Hybridization), invece,
rispetto al terreno cromogeno, non presuppone lo sviluppo
in coltura del microrganismo, ma consente l’identificazione
direttamente dalla matrice positiva in appena due ore, con livelli di
sensibilità dal 97,5% al 100% (7). Sebbene più specifico rispetto
al cromogeno, il PNA FISH è comunque limitato nel numero
di specie identificabili ed in letteratura sono anche riportati
casi di cross reattività fra specie e specie (7). I recenti sviluppi
nel campo della spettrometria di massa hanno aperto nuove
possibilità diagnostiche in microbiologia, potendo comportare
una rapida individuazione e differenziazione di patogeni; a tale
riguardo, la tecnica MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser
Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry)
ha fornito un importante contributo nell’identificazione e
nella differenziazione di microrganismi, miceti compresi (8).
In diagnostica veterinaria, può essere fondamentale giungere ad
una corretta identificazione di lieviti potenzialmente patogeni, sia
nel campo della sanità animale (per individuare l’esatta eziologia
di un determinato processo morboso) che in quello della
sicurezza alimentare (per evidenziare l’agente contaminante di
un determinato alimento di origine animale).
Nel presente lavoro, a scopo preliminare, sono state messe
a confronto tre metodiche di laboratorio (sistema manuale in
micrometodo API ID 32C, semiautomatico Vitek-2 System e
MALDI-TOF MS) per l’identificazione di lieviti, a partire da isolati
di origine animale.
MATERIALI E METODI
Miceti: oggetto di indagine sono stati 39 ceppi di lieviti e
organismi lievito-simili, isolati in Umbria da varie matrici di
diverse specie animali nel corso del 2012 e conservati a 25±1°C
attraverso passaggi colturali su Sabouraud Dextrose Agar
(SDA). Nello specifico: 3 Candida (C.) albicans, 8 C. famata, 2 C.
krusei, 1 C. incospicua, 3 C. sake, 3 C. lusitaniae, 2 C. silvicola,
1 C. laurentii, 1 C. dubliniensis, 1 C. rugosa, 2 C. zeylanoides,
3 Cryptococcus (C.) albidus, 2 Rhodotorula (R.) glutinis, 3 R.
mucilaginosa, 1 Saccharomyces (S.) cerevisiae, 1 Trichosporon
(T.) inkin, 2 Zygosaccharomyces spp. I suddetti ceppi sono stati
identificati tramite API ID 32C, metodica considerata come gold
standard (9).
API ID 32C e Vitek-2 System: i test di identificazione sono stati
allestiti secondo le procedure descritte dal produttore (4).
MALDI-TOF MS: l’analisi è stata condotta su colture di lievito
di 48 ore, dopo estrazione con etanolo al 70% e trattamento
con acido formico al 70% ed acetonitrile. L’analisi degli spettri
è stata eseguita mediante la procedura descritta da Buchanan
e Ledeboer (12).
Elaborazione statistica: sono stati messi a confronto i risultati
ottenuti con API ID 32 C rispetto a Vitek-2 System e con API ID
32C rispetto a MALDI-TOF MS, attraverso l’impiego del test k di
Cohen, valutato utilizzando la scala di Altman (11).
209
RISULTATI
API ID 32C vs Vitek-2 System: 26 dei 39 lieviti testati sono
stati identificati in modo simile dalle due prove. Il grado di
concordanza osservato è stato pari al 66,67% ed il valore della
statistica Kappa, di 0,64, esprime una concordanza buona
secondo la scala di Altman.
API ID 32C vs MALDI-TOF MS: 12 dei 38 lieviti testati (1 ceppo
non si è mostrato più vitale e quindi non è stato processato)
sono stati identificati in modo simile dalle due prove. Il grado di
concordanza osservato è stato pari al 28,95% ed il valore della
statistica Kappa, di 0,26, esprime una concordanza sufficiente
secondo la scala di Altman.
DISCUSSIONE
In medicina umana, un’accurata identificazione degli isolati
fungini è un punto cruciale nella pratica clinica, onde stabilire
una precisa diagnosi eziologica, scegliere un’appropriata
terapia antifungina, monitorare la possibilità di diffusione
dell’agente causale in popolazioni recettive e mapparlo dal
punto di vista epidemiologico (8, 12). In campo veterinario,
la necessità di identificare correttamente i miceti, nel caso
specifico i lieviti, non è sempre una finalità perseguita dal
clinico; tale bisogno è maggiormente sentito per gli agenti
batterici, soprattutto per conoscere la loro sensibilità ai diversi
antimicrobici in uso. In ambito micologico, solo negli ultimi anni
sta crescendo l’attenzione dei veterinari clinici verso una corretta
identificazione degli agenti fungini e della loro sensibilità agli
antimicotici. Pertanto, anche nella diagnostica di laboratorio
veterinaria, si stanno facendo sempre più strada i sistemi già
impiegati per identificare gli agenti fungini in campo umano.
Nel nostro lavoro abbiamo testato 39 ceppi di lieviti di origine
animale con API ID32C, Vitek-2 System e MALDI-TOF MS. Il
numero di ceppi considerati è sicuramente esiguo per poter
calcolare la specificità di ciascuna metodica nei confronti delle
singole specie di lievito. Tuttavia, seppur in termini preliminari,
il sistema API ed il Vitek hanno identificato similarmente 26 dei
39 ceppi testati, mostrando una concordanza buona; invece la
tecnica MALDI-TOF è riuscita a fornire risultati concordanti col
sistema API solo per 12 ceppi. Ciò, probabilmente, potrebbe
essere causato dal fatto che la capacità di MALDI-TOF MS
di identificare correttamente una grande varietà di ceppi e di
discriminare tra quelli strettamente correlati, è direttamente
dipendente dalla ampiezza del database di riferimento utilizzato
per il confronto (ad oggi quello comprendente i ceppi di origine
animale è sicuramente inferiore rispetto a quello comprendente
i ceppi di origine umana). Nonostante ciò, però, un vantaggio di
molte piattaforme di identificazione MALDI-TOF MS è quello di
poter integrare i database di riferimento, qualora si individuino
delle specifiche carenze (12). In conclusione, si può affermare
che per i ceppi di lieviti di origine animale qui testati, è risultata
una migliore concordanza fra le metodiche API ID 32C e Vite2 System; ulteriori indagini in tal senso sono necessarie su
un numero maggiore di organismi fungini di origine animale,
preventivamente sequenziati, confrontando i risultati anche con
ceppi di riferimento.
Bibliografia
1) Wisplinghoff H., Bischoff T., Tallent S.M., Seifert
H., Wenzel R.P., Edmond M.B., 2004. Nosocomial
bloodstream infections in US hospitals: analysis
of 24,179 cases from a prospective nationwide
surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39:309 –317.
2) Dealler S.F., 1991. Candida albicans colony
identification in 5 minutes in a general microbiology
laboratory. J. Clin. Microbiol. 29:1081–1082.
3) Willinger B., Wein S., Hirschl A.M., Rotter M.L.,
Manafi M., 2005. Comparison of a new commercial
test, GLABRATA RTT, with a dipstick test for rapid
identification of Candida glabrata. J. Clin. Microbiol.
43:499–501.
4) Ramani R., Gromadzki S., Pincus D.H., Salkin I.F.,
Chaturvedi V., 1998. Efficacy of API 20C and ID 32C
systems for identification of common and rare clinical
yeast isolates. J. Clin. Microbiol. 36:3396 –3398.
5) Verweij P.E., Breuker I.M., Rijs A.J., Meis J.F., 1999.
Comparative study of seven commercial yeast
identification systems. J. Clin. Pathol. 52:271–273.
6) Hospenthal D.R., Beckius M.L., Floyd K.L., Horvath
L.L., Murray C.K., 2006. Presumptive identification
of Candida species other than C. albicans, C.
krusei, and C. tropicalis with the chromogenic
medium CHROMagar Candida. Ann. Clin. Microbiol.
Antimicrob. 5:1. doi:10.1186/1476-0711-5-1.
7) Hall L., Le Febre K.M., Deml S.M., Wohlfiel S.L.,
Wengenack N.L., 2012. Evaluation of the Yeast Traffic
LightPNAFISH probes for identification of Candida
species from positive blood cultures. J. Clin. Microbiol.
50:1446–1448.
8) Kolecka A., Khayhan K., Groenewald M., Theelen B.,
Arabatzis M., Velegraki A., Kostrewa M., Mares M.,
Taj-Aldeen S.J., Boekhout T., 2013. Identification of
medically relevant species of Arthroconidial yeasts by
use of Matrix-Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry. J. Clin. Microbiol.,
51(8): 2491-2500.
9) Freydiere A.M., Guinet R., Boiron P., 2001. Yeast
identification in the clinical microbiology laboratory:
phenotypical methods. Med. Mycol., 39: 9-33.
10) Meletiadis J., Arabatzis M., Bompola M., Tsiveriotis
K., Hini S., Petinaki E., Velegraki A., Zerva L.,
2011. Comparative evaluation of three commercial
identification systems using common and rare
bloodstream yeast isolates. J. of Clin. Microbiol.,
49(7): 2722-2727.
11) Altman D.G., 1991. Pratical Statistics for Medical
Research. Chapman and Hall, London.
12) Buchanan B.W., Ledeboer N.A., 2013. Advances in
identification of clinical yeast isolates by use of MatrixAssisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight
Mass spectrometry. J. of Clin. Microbiol., 51(5): 13591366
A FAST REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE DETECTION OF CHLAMYDIA SPECIES
FROM ANIMAL SAMPLES
Curcio L., Sebastiani C., Ciullo M., Biagetti M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche
Key words: Chlamydia, Fast Real-time PCR, animal disease
ABSTRACT: The most clinically important intracellular parasites and endosymbionts of eukaryotic hosts are the Chlamydiales; they cause a wide spectrum of diseases in humans and
animals. Veterinary diagnostic assays of Chlamydiaceae allow identifying animal disease, reducing economic losses for
breeders and risks for human health. In this paper we report
the set up and validation of a Fast Real-time PCR protocol that
provides a powerful analytical tool for rapid, safer and more
specific Chlamydiaceae detection.
INTRODUZIONE: Alla famiglia delle Chlamydiaceae appartengono nove specie di rilevante importanza clinica veterinaria ed
umana: C. trachomatis (uomo, topo), C. suis (suino), C. muridarum (topo, criceto), C. psittaci (uccelli), C. felis (gatti), C.
abortus (bovini, ovini, caprini), C. caviae (cavia), C. pecorum
(bovini, ovini), C. pneumoniae (uomo) (2,9).
Una recente revisione della classificazione della famiglia ha
ricondotto i due generi Chlamydia e Chlamydophila all’unico
genere Chlamydia.
I microrganismi appartenenti a questo genere sono Gram negativi, intracellulari obbligati con un ciclo riproduttivo bifasico
caratterizzato da una fase replicativa intracellulare (corpi reticolari non infettanti) ed una fase extracellulare (corpi elementari
infettanti) (7). Tra le specie patogene Chlamydia trachomatis,
Chlamydia abortus e Chlamydia psittaci sono responsabili di
un’ampia gamma di malattie sia dell’uomo che degli animali.
Diversi sono i tipi di approccio alla diagnosi della clamidiosi, tra
cui la rilevazione diretta dell’agente mediante PCR, isolamento e identificazione, metodi di colorazione in tessuti, tamponi,
organi. I metodi molecolari, in particolare la PCR (Polymerase Chain Reaction), permettono di identificare direttamente il
patogeno con tempi di diagnosi brevi. La PCR comparata ad
altre tecniche diagnostiche è il metodo di elezione per la sua
rapidità, sensibilità, specificità, rapporto costo-beneficio. Per
rilevare tutte le specie di Chlamydia, si utilizzano protocolli in
PCR aventi come target le regioni geniche codificanti il RNA
ribosomiale 16S o 23S, oppure il gene ompA (2,9,7). Tra le
analisi basate sulla PCR la più vantaggiosa è la PCR Realtime in quanto è una tecnica rapida e specifica, che permette il
rilievo e la quantificazione del patogeno d’interesse (1,3,4,5,6).
L’obiettivo dello studio è stato quello di sostituire un’analisi in
PCR end-point con una Fast PCR Real-Time con lo scopo di
ridurre il rischio delle possibili contaminazioni da amplificato e
quindi i falsi positivi.
In questo lavoro il target scelto per l’identificazione di Chlamydia
spp. è il gene codificante il rRNA 23S. Per la validazione del
metodo è stato calcolato il LOD (Limit of Detection) e sono stati
valutati i parametri di sensibilità, specificità e robustezza.
per la messa a punto del metodo in PCR Real-time.
I primers e la sonda utilizzati sono tratti dallo studio di Ehricht
et. al (2006), da cui si ottiene un amplificato pari a 110 bp (1).
La reazione è stata allestita utilizzando una concentrazione 1x
di TaqMan® Universal PCR Master Mix in un volume finale di
20 µl dei quali 2 µl di templato; la concentrazione 0,5 pM è
risultata ottimale per entrambi i primers mentre quella adottata
per la sonda è 0,2 pM. Il profilo di amplificazione adottato è il
seguente: step iniziale a 95°C per 20 secondi, seguito da 40
cicli a 95°C per 1 secondo e 60°C per 20 secondi.
Per il calcolo del LOD (Limit of Detection), la sequenza target
è stata amplificata con i primers pubblicati da Ehricht et. al
(2006) (1) tramite un protocollo PCR touch-down (8) allestita
in un volume finale di 25 µl di cui 5 µl di templato: 1X Buffer,
2 mM MgCl2, 0,5 mM dNTP, 0,4 µM di ciascun primer e 1U di
AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Life Technologies); il profilo
di amplificazione adottato era costituito uno step iniziale di denaturazione a 95°C per 15 min seguito da 5 cicli a 94°C per
30 sec, 60°C per 30 sec e 72°C per 30 sec e successivamente
35 cicli a 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec, e 72°C per 30 sec;
infine uno step a 72°C per 5 min.
L’amplificato ottenuto è stato purificato con il kit commerciale
QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen®) e successivamente
quantizzato con lettura al biofotometro. E’ stato poi stimato il
numero di copie genomiche (c.g.) (10). Sono state allestite 8 diluizioni seriali 1:2 da 6.7 c.g. a 0.05 c.g. Per ciascuna diluizione
sono stati saggiati 10 replicati in modalità Fast PCR Real-time
sulla piattaforma StepOne Plus Real-Time PCR System (Life
Technologies).
Per valutare la sensibilità e la specificità sono stati testati 10
campioni risultati positivi per Chlamydia spp dalle analisi di routine e 10 campioni appartenenti ad altre specie come riportato
in tabella 1.
Per la stima della robustezza, la stessa prova è stata eseguita
sugli stessi campioni utilizzando una differente piattaforma di
PCR Real-time, lo strumento ABI 7900HT Fast Real-Time PCR
System (Life Technologies).
MATERIALI E METODI: il DNA è stato estratto da omogenati
d’organo (feti, annessi fetali) e da tamponi vaginali di ruminanti
e volatili con il kit commerciale QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen®).
I campioni sono stati analizzati con il protocollo di PCR endpoint per Chlamydia spp. utilizzato per l’attività di routine diagnostica (8); i campioni risultati positivi sono stati poi utilizzati
210
211
Tabella 1. Ceppi di campo negativi al target 23 S.
CAMPIONI NEGATIVI
C. perfringens TOSSINOTIPO A
C. perfringens TOSSINOTIPO A + β2
S. aureus Mec A+
M. agalactiae
M. gallisepticum
M. synoviae
E. coli (coniglio)
E. coli (coniglio)
E. coli (bovino)
Neospora caninum
mydophila psittaci ompA gene reveals a new genotype,
E/B, and the need for a rapid discriminatory genotyping
method. Journal of Clinical Microbiology; 43(5): 24562461.
RISULTATI E CONCLUSIONI: Il LOD è stato determinato a 3,6
c.g. (36 Ct) dove per tutti i dieci replicati si è registrato il segnale di amplificazione. I risultati ottenuti dai 10 campioni risultati
positivi per Chlamydia spp dalle analisi di routine e dai 10 campioni negativi concordano al 100% per sensibilità e specificità.
Dalle prove di robustezza, il risultato ottenuto su entrambe le
apparecchiature soddisfa a pieno il criterio di accettabilità.
L’adozione della Fast PCR Real-Time apporta dei miglioramenti
sia rispetto alla PCR end-point sia rispetto alla PCR Real-Time
standard. Infatti, la Fast PCR Real-Time consente di eliminare
la fase di lettura degli amplificati su gel d’agarosio come previsto per la PCR end-point, consentendo una maggiore rapidità
di esecuzione dell’analisi e garantisce una maggiore sicurezza
per l’operatore, escludendo l’utilizzo di bromuro d’etidio. Rispetto ad una PCR Real-Time standard la Fast PCR Real-Time
permette di ridurre i tempi di analisi di circa 1/3.
Nell’immediato futuro il Laboratorio si pone come obiettivo principale lo sviluppo della metodica Fast Real-time PCR anche
per altri patogeni abortigeni al fine di allestire nella stessa analisi uno screening multi-target con il vantaggio di dare in tempi
brevi più risposte diagnostiche contemporaneamente.
4) Geens T., Dewitte A., Boon N., Vanrompay D. (2005b).
Development of a Chlamydophila psittaci species specific and genotype-specific Real-Time PCR. Veterinary
Research; 36(5-6): 787-797
.
5) Pantchev A., Sting R., Bauerfeind R., Tyczka J., Sachse
K. (2009). New real-time PCR tests for species-specific
detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila
abortus from tissue samples. Veterinary Journal; 181(2):
145-150.
6) Pantchev A., Sting R., Bauerfeind R., Tyczka J., Sachse
K. (2010). Detection of all Chlamydophila and Chlamydia spp. of veterinary interest using species-specific realtime PCR assays. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases; 33(6): 473-484.
BIBLIOGRAFIA
1) Ehricht R., Slickers P., Goellner S., Hotzel H., Sachse
K. (2006). Optimized DNA microarray assay allows detection and genotyping of single PCR-amplifiable target
copies. Molecular and cellular Probes. 20:60-63.
2)
3)
7) Rodolakis, A., Mohamad, K.Y.(2010). Zoonotic potential
of Chlamydophila, Veterinary Microbiology 140 (3-4)
382-391
8) Vicari, N., Santoni, R., Vigo, P.G., Magnino, S. (2004).
A PCR-RFLP assay targeting the 16S ribosomal gene
for the diagnosis of animal chlamydioses. Proceedings,
5th Meeting of the European Society for Chlamydia Research (Ed.: Judith Deak), Budapest, Hungary, 1-4 September 2004, p. 297
Everett K.D., Bush R.M., Andersen A.A. (1999).
Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus,
revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards
for the identification of organisms. International Journal
of Systematic Bacteriology; 49 (Pt 2): 415-440
Geens T., Desplanques A., Van Loock M., Bönner
B.M., Kaleta E.F., Magnino S., Andersen A.A., Everett
K.D., Vanrompay D. (2005a). Sequencing of the Chla-
9) Zocevic A., Vorimore F., Vicari N., Gasparini J., Jacquin
L., Sachse K., Magnino S., Laroucau K. (2013). A Realtime PCR Assay for the Detection of Atypical Strains of
Chlamydiaceae from Pigeons. Plos ONE 8(3): 1-5.
10) http://www.thermoscientificbio.com/webtools/copynumber/
RILIEVI PARASSITOLOGICI IN VOLPI IN SICILIA
Currò V., Antoci F., Disclafani R., Galluzzo P., Randazzo V., Lo Biundo G., Barreca S., Galuppo L., Caracappa S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia “A. Mirri”
Key words: red fox, parasites, PCR
SUMMARY
The red fox ( Vulpes vulpes) is the only widely distributed wild
carnivores in Italy. The high spread of foxes in the country and especially in the northern regions, the capacity to adapt to environmental changes contributes to determine the role of this canids
which tank bacterial diseases, viral and parasitic diseases, some
zoonotic (5, 6).Often attend the peri-urban areas by significantly
increasing the likelihood of interaction with humans and domestic animals. In Iran, for example (Dalimi A. et al. (2006), the four
species of canids such as wild or stray dogs, sheep dogs, foxes
and jackals, threaten public health. In this context, taking more
and more importance as the parasitic species in the complex
host-parasite relationship, they adapt not only to the host species, but also the environment, understood as a complex of interrelations with the entire ecological chain in which host and live
parasite (3).The purpose of this study was the evaluation of the
parasitic state of a sample of hunting foxes from the operations
during the year 2012.
INTRODUZIONE
La volpe rappresenta la specie di carnivoro selvatico più diffusa in Italia anche per la spiccata capacità di adattamento ai
cambiamenti ambientali. Questo canide è stato più volte indicato come un resevoir di malattie batteriche, virali e parassitarie,
alcune a carattere zoonosico ed attenzionato in quanto spesso
si avvicina alle aree peri-urbane aumentando le probabilità di interazione con l’ uomo e gli animali domestici. Dalimi A. et al., ha
riportato come cani selvatici o randagi, cani da pastore , volpi e
sciacalli, costituiscono una seria minaccia per la salute pubblica
e per il patrimonio zootecnico L’obiettivo di questo studio, ancora preliminare è stato quello di una prima la valutazione circa
la fauna parassitaria in un campione di volpi provenienti dalle
attività venatorie durante l’anno 2012 da alcune provincie della
Sicilia. Il lavoro fa parte di uno studio più ampio che coinvolge
tutto il territorio regionale
MATERIALI E METODI
Durante Gennaio e Luglio 2013 sono state esaminate 120 volpi
(Vulpes vulpes) provenienti da 4 diverse provincie della Sicilia:
Ragusa, Palermo, Trapani, Agrigento. Gli animali provenienti
dalle attività venatorie erano conferiti ai laboratori dell’ Istituto
Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia sede di Palermo. In
sede di esame autoptico venivano prelevate feci ove possibile
ed intestini prelevati per intero o porzioni di essi. Sui campioni di
feci sono stati condotti esami copromicroscopici qualitativi con la
tecnica dell’ arricchimento mediante flottazione e sugli intestini
si ricercavano forme di parassiti adulti. Per la flottazione è stata
utilizzata mediante una soluzione densa composta da nitrato di
sodio e glucosio avente densità 1300/1350.Tutti gli intestini delle
volpi pervenuti sono stati analizzati per la ricerca di forme adulte
di parassiti gastrointestinali.
Si è proceduto alla separazione del tratto del piccolo intestino
dal grosso intestino e sono stati tutti lavati accuratamente sotto
un lento flusso di acqua di fonte e l’eventuale contenuto ritrovato, è stato raccolto in setacci da 500 µm. I parassiti ritrovati,
212
sono stati conservati in alcol etilico al 70%. Tutti gli intestini delle
volpi pervenuti sono stati analizzati per la ricerca di forme adulte
di parassiti gastrointestinali. Si è proceduto alla separazione del
piccolo intestino dal grosso intestino, si è proceduto al lavaggio
degli stessi e il contenuto è stato raccolto in setacci da 500 µm.
I parassiti ritrovati, sono stati conservati in alcol etilico al 70%.
Per quanto riguarda i cestodi è noto che il rilevamento di uova
nelle feci non è un metodo per una diagnosi specifica , dal momento che le uova di tutti i cestodi taenidi di volpi e cani sono
morfologicamente indistinguibili .
Nella ricerca di metodi alternativi per la diagnosi diinfezioni da
Echinococcus spp . le tecniche sierologiche ( ospiticontenente le
tenie adulte) , anticorpo sierologia hanno dato risultati non soddisfacenti. Si è ricorso alle tecniche di biologia molecolare.
Sulle porzioni di duodeno di 80 volpi sono state condotte indagini
di biologia molecolare consistenti nell’applicazione di una PCR
multplex per la ricerca contemporanea di Echinococcus multilocularis, Echinococcus granulosus e Taeniaspp.(11). I primers
utilizzati sono riassunti in Tabella 1 (Trachsel D. et al 2006).
Tab. 1 Primers utilizzati per le indagini molecolari
Parassita
Nome
primer
Sequenza Primer
E. multilocularis.
Cest1
Cest2
TGC TGATTTGTTAAAGTTAGTGATC
CATAAATCAATGGAAACAACAACAAG
E. granulosus
Cest4
Cest5
GTTTTTGTGTGTTACATTAATAAGGGTG
GCGGTGTGTACMTGAGCTAAAC
Taeniaspp.
Cest3
Cest9
YGAYTCTTTTTAGGGGAAGGTGTG
GCGGTGTGTACMTGAGCTAAAC
RISULTATI
Le specie parassitarie rinvenute grazie alle indagini microscopiche sono riportate nelle tabelle 2 e tabella 3
Tab. 2 classi di parassiti individuati
PROV
NEMATODI
COCCIDI
CESTODI ADULTI
RG
39%
5%
28%
PA
62%
15%
46%
AG
57%
29%
14%
TP
50%
0%
0%
Tab 3 specie parassitarie ritrovate
213
Trichiuris
Capillaria
PROV
spp
spp
Dipylidium
Spirocerca
spp
spp
Echinococcus
Moniezia
spp
spp
Eristalis
RG
27%
0%
1%
1%
1%
0%
0%
PA
38%
15%
0%
0%
0%
0%
0%
AG
14%
29%
0%
0%
0%
0%
14%
TP
0%
50%
0%
0%
0%
50%
0%
Nel duodeno e nelle feci delle 120 volpi, le indagini di biologia
molecolare hanno rilevato la presenza di Tenia spp. rispettivamente nel 73% e nel 35,9% dei casi. E. granulosus, invece, è
stato ritrovato con una prevalenza del 35,9% nel duodeno e del
23,1%. Si è riscontrata una sola positività per E. multilocularis
nel duodeno di una volpe proveniente da Ragusa. I risultati ottenuti sono riassunti in Figura 1.
Fig.1 risultati delle indagini con PCR multiplex
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Duodeno E. granulosus Feci E. granulosus
Duodeno Teniae spp
AG
I
AN
O
AP
TR
RI
GE
NT
O
RM
LE
PA
RA
GU
SA
Feci Teniae spp.
Duodeno E. mul6locularis
Feci E. mul6locularis
DISCUSSIONE
Il presente lavoro costituisce una parte preliminare di uno studio sulla fauna parassitaria in carnivori selvatici nel territorio
della regione. In questa prima esperienza il campione di volpi
più numeroso proveniente dalla provincia di Ragusa ha permesso di osservare la maggior parte delle specie parassitarie
rinvenute. Queste variazioni, essenzialmente qualitative, sono
probabilmente in relazione alla diversa disponibilità alimentare
negli ecosistemi considerati. In pianura e montagna l’ambiente
meno ricco di risorse favorisce “home-ranges” più ampi, una
dieta molto varia per il raggiungimento delle calorie necessarie
al sostentamento, con maggiori probabilità di acquisire parassiti, in accordo con lo studio condotto da Capelli G., et al., 2003.
L’applicazione poi di tecniche di biologia molecolare si è dimostrata anche nel campo degli studi di parassitologia un ottimo
ausilio diagnostico li dove le tecniche tradizionali non riescono
a fornire un risultato conclusivo.
BIBLIOGRAFIA
1.Dalimi A., Sattari A. and Motamedi G., 2006. Vet. Parasitol.,
142:129 – 133.
2. Sattari A., MotamediGh.VeterinaryParasitology 142
(2006)129-133).
3. Guberti V. e Poglayen G.; Hystkr, (as.) 3 (1991): 167-173 Atti
I Simp. Ital. Carnivori).
4. Manfredi M. T., Giacometti A., Fraquelli C., Piccolo G. J. Mt.
Ecol., 7 (Suppl.):2003
5. Capelli G., Stancampiano L., Magi M., Poglayen G., Guberti
V.; J. Mt. Ecol., 7 (Suppl.): 199 – 205)
6. Guberti V. e Poglayen G.; Hystkr, (as.) 3 (1991): 167-173 Atti
I Simp. Ital. Carnivori).
7.M.Genchi G. Traldi; C. Genchi. Manuale di parassitologia veterinaria.
8.D. Trachsel, P. Deplazes and A. Mathis Parasitology. 2007
Jun;134(Pt 6):911-20. Epub 2007 Feb 9.
MIELOPATIA DEGENERATIVA NEI CANI
Cutarelli A.*, De Roma A.*, Cecere B.*, Mandato D.*, Polli M.**, Riva J.**, Guarino A.*, Galiero G.*, Corrado F.*
*Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
** Vetogene srl, Milano
Keywords: Degenerative Myelopathy, SOD1, Real Time PCR
Abstract
Canine Degenerative Myelopathy (DM) is a fatal
neurodegenerative disease prevalent in several dog breeds. It
is progressive disease of the canine spinal cord that is similar
in many ways to amyotrophic lateral sclerosis. The disorder is
strongly associated with a gene mutation in SOD1. This work
concerns the study of the genetic disease with the identification
of the causal mutation, in order to develop a rapid test for his
detection, avoiding its transmission to the future generations.
1. Introduzione
La Mielopatia Degenerativa (MD) è una grave patologia che
colpisce il midollo spinale, descritta per la prima volta nel Pastore
Tedesco nel 1973. Gli studi eseguiti negli anni successivi hanno
evidenziato che molte razze canine sono soggette alla DM, in
particolar modo i cani di taglia grande, ma è stata riscontrata
anche in soggetti non di razza pura. Questa malattia colpisce
solitamente cani di età compresa tra i 5 e i 14 anni attraverso
una progressiva ed irreversibile interruzione degli stimoli
nervosi dagli arti al cervello e viceversa, provocando la totale
incapacità deambulatoria dell’animale.
Studi precedenti hanno individuato una correlazione tra
questa malattia e la mutazione di un gene (1, 2). In particolare
è stato possibile individuare in tutti i cani malati la presenza
di una mutazione di un singolo nucleotide da guanina (G) ad
adenina (A) nell’esone 2, posizione 118, della regione terminale
del gene canino che codifica la SOD1( proteina superossido
dismutasi1). Ciò causa la sostituzione di un amminoacido da
glutammato a lisina (pE40K), responsabile della malattia.
Le analisi volte ad identificare precocemente malattie genetiche
come la MD sono spesso richieste da molti allevatori e dagli
iscritti ENCI (Ente Nazionale per la Cinofilia d’Italia) come
servizio agli Istituti Zooprofilattici e/o a laboratori privati. Tali
esami si effettuano attualmente solo all’estero e il loro costo
elevato ne limita tantissimo la richiesta da parte degli allevatori.
2.1 Campionamento
Le analisi per la messa a punto del test sono state svolte su
un totale di 40 campioni raccolti dall’’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Mezzogiorno durante manifestazioni canine
organizzate dall’ ENCI o inviati allo stesso da veterinari
liberi professionisti. I campioni di DNA di controllo positivo
(CP) e controllo negativo (CN) sono stati forniti dalla società
VETOGENE Srl di Milano.
2.2 Analisi Real Time PCR
Il DNA è stato estratto utilizzando il QIAamp DNA Mini kit
(Qiagen).
La PCR è stata preparata utilizzando 1-2 µL di DNA genomico
e ciascuno dei seguenti primers e sonde:
Primer forward: TGGGCCTGTTGTGGTATCAG
Primer reverse: CAAACTGATGGACGTGGAATCC
Sonda wild type: VIC, CTCGCCTTCAGTCAGC
Sonda mutato: FAM, CTCGCCTTTAGTCAGC
Il profilo termico della PCR consiste in una fase
di
predenaturazione a 95°C per 20 secondi e in 50 cicli di
amplificazione costituiti ciascuno da una denaturazione a 95°C
per 3 secondi e una fase di annealing ed estenzione di 30
secondi a 58°C.
3. Risultati e conclusioni
Il test Real time ha permesso di discriminare tra i 3 possibili
genotipi fornendo i seguenti risultati:
-amplificazione esclusiva della sonda wild type G/G
(omozigote sano), immagine A in figura 1.
-co-amplificazione delle due sonde G/A (eterozigote),
immagine B in figura 1.
-amplificazione esclusiva della sonda mutata A/A (omozigote
malato), immagine C in figura 1.
Obiettivo del presente lavoro è stato la messa a punto di un
test genetico per la mielopatia degenerativa e la proposta di
impiego (a costi contenuti) come screening massivo neonatale
e/o di pre-accoppiamento.
2. Materiali e metodi
Il metodo che si vuole sviluppare si basa sull’utilizzo della Real
Time PCR, un tecnica molecolare che sfrutta la reazione a
catena della polimerasi (PCR), in grado di quantificare il DNA
di una sequenza target in un campione. Nel saggio Realtime di tipo “TaqMan” si usano 2 primers specifici (forward e
reverse) ed un oligonucleotide sonda, che si appaia ai prodotti
di amplificazione nella regione compresa tra i primers. La
sonda è dotata di un fluorocromo “reporter” e di un fluorocromo
“quencher”. Appositi software acquisiscono lo spettro di
emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR
e convertono la variazione di fluorescenza del reporter in una
rappresentazione in tempo reale della cinetica d’amplificazione.
214
215
Fig.1
Le analisi svolte hanno permesso di individuare con successo
la malattia nei campioni in esame. Questi dati preliminari
consentiranno la messa a punto di un metodo a costi contenuti
per l’analisi genetica della Mielopatia Degenerativa allo scopo
di individuare:
1)razze canine in cui la malattia si manifesta con maggior
frequenza.
2)razze canine in cui la malattia è ad oggi sconosciute,
con particolare attenzione alle razze tipiche italiane.
I risultati genetici in correlazione alle cartelle cliniche dei
soggetti in studio, permetteranno di ottenere una casistica
dell’incidenza della malattia nelle razze canine.
Bibliografia
(1) Tomoyuki Awanoa, Gary S. Johnsona,1, Claire M.
Wadeb,c, Martin L. Katza,d, Gayle C. Johnsona, Jeremy F.
Taylore, Michele Perloskib, Tara Biagib, Izabella Baranowskaf,
Sam Longg, Philip A. Marchh, Natasha J. Olbyi, G. Diane
Sheltonj, Shahnawaz Khana, Dennis P. O’Brienk, Kerstin
Lindblad-Tohb,l, and Joan R. Coatesk. 2009 Genome-wide
association analysis reveals a SOD1 mutation in canine
degenerative myelopathy that resembles amyotrophic lateral
sclerosis. PNAS, 2794–2799 February 24, vol. 106 no. 8
(2) Hye-Sook CHANG, Hiroaki KAMISHINA, Keijiro
MIZUKAMI, Yasuyuki MOMOI, Masaaki KATAYAMA,
Mohammad Mahbubur RAHMAN, Mohammad Mejbah
UDDIN, Akira YABUKI, Moeko KOHYAMA and Osamu
YAMATO. 2013 Genotyping Assays for the Canine
Degenerative Myelopathy-Associated c.118G>A (p.E40K)
Mutation of the SOD1 Gene Using Conventional and RealTime PCR Methods: A High Prevalence in the Pembroke
Welsh Corgi Breed in Japan. J. Vet. Med. Sci. 75(6): 795–
798.
SERRATOSPICULOSI
(SERRATOSPICULUM TENDO) NEI RAPACI DIURNI DEL SUD ITALIA CON LA PRIMA
SEGNALAZIONE D’INFEZIONE IN UN ASTORE (ACCIPITER GENTILIS)
D’Alessio N.1, Di Prisco F.1, Troisi S.2, Degli Uberti B.1, Fusco G.1, D’Amore M.1, Guarino A.1, Veneziano V.3, Santoro M.4
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
2
Istituto Gestione della Fauna Onlus
3
Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzioni Animali, Università di Napoli Federico II
4
Dipartimento di Salute Pubblica e Malattie Infettive, Università La Sapienza di Roma
1
Key words: Serratospiculosis, Serratospiculum tendo, Falco peregrinus, Accipiter gentilis
SUMMARY
Filarial nematodes of Serratospiculum genus include
nine species parasitizing birds. Of these at least eight are
parasites of Falconiformes belonging to Falco spp., while
just one Serratospiculum amaculata (syn. Serratospiculoides
amaculata) also infect a member within Accipitriformes,
i.e. Cooper’s hawk (Accipiter cooperii) in North America.
Serratospiculum tendo is the main species in the genus
reported in Europe. It is characterized by high prevalence
of infection and pathogenicity. Here we performed a survey
on a large sample of birds of prey including 11 species of
Accipitriformes and six of Falconiformes for investigating
features of S. tendo infection from southern Italy, including
host specificity and pathological changes.
INTRODUZIONE
Nematodi del genere Serratospiculum includono un totale di
nove specie che parassitano i sacchi aerei degli uccelli. Di
queste almeno otto sono parassiti di uccelli rapaci dell’ordine
Falconiformes, mentre solamente una Serratospiculum
amaculata (syn. Serratospiculoides amaculata) infetta
raramente un membro dell’ordine Accipitriformes (Accipiter
cooperii) in Nord America (1,2). Serratospiculum tendo è la
specie piú frequentemente riportata nel falco pellegrino (Falco
peregrinus) in Europa. L’infezione è caratterizzata da alta
prevalenza e patogenicità (3,4). Il ciclo biologico di S. tendo
non è completamente conosciuto. Larve del nematode sono
state rinvenute in Geotrupes sylvaticus e Locusta migratoria
infettate sperimentalmente con le uova del parassita (5).
In una specie affine (S. seurati) diffusa nei falchi tenuti in
cattività in Medio-Oriente, almeno sei specie di coleotteri
e una di isopode costituiscono gli ospiti intermedi del
nematode (6). I parassiti adulti rilasciano le uova nei sacchi
aerei dell’ospite, quindi le uova embrionate sono ingerite ed
eliminate con le feci. Quando le uova sono ingerite da un
insetto sviluppano come larva di terzo stadio all’interno della
cavità corporea dell’insetto. Il falco si infetta predando gli
insetti infetti presenti nel paddock in cui viene tenuto. Poiché
il falco pellegrino in natura si alimenta quasi esclusivamente
di uccelli di piccola e media taglia (7), è ipotizzabile che
in natura tali ospiti possano infettarsi predando su uccelli
che servono come ospite di trasporto per le larve del
parassita. Nella seguente presentazione noi riportiamo i dati
di prevalenza, intensità d’infezione, patogenicità e ospitespecificità di S. tendo. Inoltre segnaliamo per la prima volta
a livello mondiale l’infezione di un astore (Accipiter gentilis)
con S. tendo. Tali dati riguardano uno studio effettuato su un
significativo numero di carcasse di rapaci diurni deceduti nei
centri di recupero di Calabria e Campania.
216
Tabella 1 - Rapaci diurni (Accipitriformes and
Falconiformes) esaminati dalla Calabria e Campania per la
ricerca di nematodi dell’apparato respiratorio.
Ospite
Nome
scientifico
Nome comune
Area geografica
Calabria
Campania
Totale
Accipitriformes
Accipiter gentilis
Astore
2
1
3
A. nisus
Sparviero
33
1
34
Buteo buteo
Poiana
97
9
106
Falco di palude
17
-
17
C. cyaneus
Albanella reale
1
-
1
C. macrourus
Albanella pallida
1
-
1
C. pygargus
Albanella minore
1
-
1
Gyps fulvus
Grifone
3
-
3
Aquila minore
1
-
1
Milvus migrans
Nibbio bruno
2
-
2
Pernis apivorous
Falco pecchiaiolo
23
-
23
Smeriglio
1
-
1
F. naumanni
Grillaio
3
-
3
F. peregrinus
Falco pellegrino
20
2
22
F. subbuteo
Lodolaio
4
-
4
F. tunninculus
Gheppio
64
6
70
F. vespertinus
Falco cuculo
3
-
3
276
19
295
Circus
aeruginosus
Hieraaetus
pennatus
Falconiformes
Falco
columbarius
Totale
MATERIALI E METODI
Un totale di 295 rapaci diurni deceduti tra gennaio 1998 e
giugno 2013 in 2 centri di recupero animali selvatici di Calabria
e Campania (tab. 1) furono esaminati per la ricerca di nematodi
nel tratto respiratorio. A tal fine la trachea, i bronchi, i polmoni
e i sacchi aerei furono isolati da ciascun ospite ed esaminati
seguendo le tecniche di Santoro et al. (3,4). Campioni di tessuti
da animali infetti furono prelevati e conservati in formalina 10%
per le analisi istopatologiche.
217
Dei rapaci esaminati, solamente i falchi pellegrini provenienti
dalla Calabria e un astore proveniente dalla Campania
(provincia di Benevento) furono infettati da S. tendo. In Calabria,
17 dei 20 (85%) falchi pellegrini furono infettati con intensità
d’infezione di 7.2 e un numero di individui parassitari che oscillò
da 1 a 35. Nell’astore furono contati 17 individui di S. tendo.
Nei falchi pellegrini, S. tendo fu più frequentemente rinvenuto
nei sacchi aerei toracici. In 3 falchi pellegrini e nell’astore i
nematodi penetravano anche nel parenchima polmonare. In
presenza dei parassiti era evidente l’ispessimento dei sacchi
aerei mentre i polmoni apparivano congesti e edematosi.
Nell’astore l’infezione fu associata anche al distacco del
polmone sinistro che si presentava in evidente stato di necrosi.
Microscopicamente, negli organi interessati le sezioni del
parassita erano circondate da aree necrotiche con edema
generalizzato ed infiltrati infiammatori di natura linfocitaria. Le
uova embrionate del parassita furono rinvenute nell’intero tratto
respiratorio.
Dai risultati qui ottenuti appare evidente che S. tendo
presenta una spiccata specie-specificità per il falco pellegrino
caratterizzata da alta patogenicità. Poiché e stato osservato
come l’infezione da altri membri nel genere Serratospiculum
in falchi di cattività sia in grado di determinare gravi sintomi
clinici come dispnea, perdita di velocità in volo, perdita di
peso, anoressia, vomito e tremori (8), è plausibile ritenere che
l’infezione da S. tendo nei falchi in natura possa causare una
sintomatologia similare. Il falco pellegrino alimentandosi in
natura di prede cacciate in volo necessità di una condizione
fisica eccellente, che chiaramente gli individui parassitati da
S. tendo non possono avere. L’azione debilitante dell’infezione
riducendo considerevolmente le performances del volo possono
quindi facilmente predisporre a lesioni traumatiche secondarie,
spesso con conseguenze letali. Questo studio è stato condotto
nell’ambito della Ricerca Corrente n° IZSME 06/10 RC.
BIBLIOGRAFIA
1. Sterner MC, Espinosa RH (1988) Serratospiculoides
amaculata in a Cooper’s hawk Accipiter cooperii Journal of
Wildlife Diseases. 24:378-379.
2. Taft JS, Suchow K, Van Horn M (1993) Helminths from
Minnesota and Wisconsin Raptors. Journal of Helminthol ogical
Society of Washington 60:260-263.
3. Santoro M, Tripepi M, Kinsella JM, Panebianco A, Mattiucci
S (2010) Helminth infestation in birds of prey (Accipitriformes
and Falconiformes) in southern Italy. Veterinary Journal 186:
119–122.
4. Santoro M, Kinsella JM, Galiero G, degli Uberti B, Aznar
FJ (2012) Helminth community structure in birds of prey
(Accipitriformes and Falconiformes) in southern Italy. Journal of
Parasitololy 98: 22–29.
5. Bain O, Vassiliades G (1969) Evolutive cycle of
Dicheilonematinae, Serratospiculum tendo, parasitic filaria
of falcons. Annales de Parasitologie Humaine et Comparée.
44:595-604.
6. Samour JH, Naldo JN (2001) Serratospiculiasis in captive
falcons in the Middle East: a review. Journal of Avian Medicine
and Surgery 15:2-9.
7. Ratcliffe D (2000) The peregrine falcon. Second Edition. T &
AD Poyser Ltd, London, 454 p.
8. Tarello, W., 2006. Serratospiculosis in falcons from Kuwait:
incidence, pathogenicity and treatment with melarsomine and
ivermectin. Parasite 13, 59–63.
MASTITE DA PROTOTHECA ZOPFII GENOTIPO 2 NEL BUFALO
(BUBALUS BUBALIS) IN UN ALLEVAMENTO CAMPANO
1
1
De Carlo E., 1 Muto M., 1Alfano D., 2 Lucibelli MG., 2 Gallo A., 2Guarino A., 1Martucciello A.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Sezione Diagnostica di Salerno - Centro di Referenza Nazionale
sull’igiene e le tecnologie dell’allevamento e delle produzioni bufaline, Salerno;
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Direzione , Portici .
Key words: mastite, Prototheca zopfii, bufalo.
ABSTRACT. This study describes the results of an investigation
undertaken to determine the cause of an atipical mastitis in
water buffalo (Bubalus bubalis) from a dairy farm (buffaloes
and cows) located in southern Italy . The outbreak began
in October 2010. A total of 111 buffalo milk and 12 cow milk
samples were examined. In two buffalo milk and four cow
milk samples collected from animals with clinical mastitis and
negative for other pathogens, Prototheca zopfii genotype 2 was
isolated. Each isolate was identified by means of RT-PCR. The
entry and transmission of Prototheca zopfii may be explaned
by the presence of a group of cattle rared on the farm, however
further studies are necessary to define both the role of buffaloes
as a reservoir for Prototheca zopfii and the relevance of this
pathogen in buffalo.
INTRODUZIONE. Le mastiti sostenute dalla microalga
Prototheca spp. sono considerate un problema di crescente
gravità su scala mondiale. La diffusione di questa patologia
in Italia è testimoniata dalle numerose segnalazioni nella
specie bovina avvenuta negli ultimi anni (1,7). Il genere
Prototheca include organismi unicellulari lievito-simili, privi di
clorofilla (tassonomicamente correlabili al genere Chlorella),
a riproduzione asessuata, ampiamente diffusi nell’ambiente,
dove vivono allo stato saprofitico. Attualmente al genere
Prototheca vengono riconosciute 6 specie: P. stagnora, P.
zopfii, P. wickerhamii, P. blaschkeae, P.ulmea, P. cutis (6). La
specie P. zopfii è stata differenziata in due genotipi: genotipo
1 e genotipo 2. Solo quest’ultimo genotipo è considerato
altamente patogeno nel caso di mastite bovina (2). La mastite
da Prototheca spp. si manifesta come una patologia della
ghiandola mammaria di tipo cronico evolutivo e determina un
calo produttivo di latte. Il rischio d’insorgenza d’infezione è
strettamente correlato alla presenza in allevamento di fattori
predisponenti, quali scarsa igiene ambientale e d insufficiente
igiene della mungitura, e ristagno di liquido di lavaggio. Inoltre,
è da evidenziare che la mastite da Prototheca spp. risulta
resistente ai comuni trattamenti antibiotici manifestando così
tendenza alla cronicizzazione, inducendo l’allevatore alla
eliminazione dei capi infetti (5).
MATERIALI E METODI. Nella seconda decade del 2010
un campione di latte bufalino, prelevato da un soggetto con
evidente calo produttivo, proveniente da un’azienda sita nella
provincia di Salerno, è stato sottoposto alla ricerca di agenti
mastitogeni, risultando positivo alla ricerca di Prototheca spp.
E’ stata effettuata la raccolta dei dati anamnestici inclusi i dati
inerenti le produzioni e la provenienza degli animali presenti in
azienda Sono stati quindi sottoposti ad esame batteriologico
tutti i campioni di latte provenienti dai capi bufalini e bovini
presenti in allevamento. L’indagine microbiologica sui campioni
di latte è stata eseguita seminando 0.01 ml di latte sui terreni
218
di coltura previsti dai protocolli applicati nella diagnostica di
routine della mastite (Agar TSI al 5% di sangue di montone,
Micoplasma agar, Baird parker agar, Mac Conkey senza sale).
Per l’isolamento di Prototheca spp. sono stati utilizzati i terreni
Sabouraud dextrose agar e Prototheca isolation medium (PIM)
(3). Le piastre sono state incubate in condizioni di aerobiosi a
37°C per 48-72h, e in condizioni di microaerofilia al 5% di CO2
a 37°C per 10 giorni per il Micoplasma agar. Successivamente
si è proceduto all’identificazione delle colonie sospette di
Prototheca spp attraverso caratterizzazione morfologica
microscopica e tipizzazione biochimica Vitek2. Le colonie
identificate come Prototheca zopfii sono state sottoposte a
conferma in RT- PCR , utilizzando una metodica associata
ad analisi della curva di melting modificata, come descritta da
Ricchi et al., 2009 (4), utilizzando un ceppo di controllo n° 8830
di DBVPG di Prototheca zopfii genotipo 2.
Per la preparazione genomica del DNA è stata utilizzata una
coltura batterica isolata su terreno agarizzato. Una singola
colonia è stata prelevata con un’ansa per batteriologia sterile,
e risospesa in 200 µl di acqua Dnase-Rnase free e bollita per
12 minuti a 100°C. Il campione è stato centrifugato a 12.000
rpm per 5 minuti a 4°C e prelevato il surnatante per gli step
successivi. I primers utilizzati, 5’- CTTGTCAGGTTGATTCC-3’
forward e
5’- AGCAGTCCCTCTAAGAAG-3’reverse,
amplificano una regione comune a Prototheca spp.. Per la
mix di reazione è stata utilizzata la Sybr Green Master Mix di
Biorad.
Per la mix sono stati utilizzati 10 µl di SYBR Green, 1,25 µl
per ogni primer, 7.5 µl di acqua Dnase-Rnase free, 5 µl di
DNA, per un volume finale di reazione di 25 µl. Le condizioni
del profilo termico sono state: denaturazione/attivazione a 95°
per 3 minuti, 40 cicli con 10 secondi di denaturazione a 95°
e 30 secondi di annealing a 53°. I campioni sono stati quindi
riscaldati da 65° a 95° con incremento di 0,3° per step di 5
secondi.
RISULTATI E CONCLUSIONI. Dallo
studio condotto
nell’azienda da un totale di 111 campioni di latte bufalino e
12 campioni di latte bovino esaminati sono risultati positivi alla
ricerca di Prototheca zopfii genotipo 2, due campioni di latte
bufalino e quattro campioni di latte bovino. I campioni risultati
positivi a Prototheca sono risultati negativi alla ricerca di altri
agenti mastitogeni.
Secondo quanto evidenziato dalle curve di melting del
campione e del controllo positivo, (figura 1 e 2) questo sono
perfettamente sovrapposte ed infatti il valore della Tm è lo
stesso per entrambi (84,90 °C) , ciò confermando la positività
del campione anche all’indagine in PCR. I bufali risultati positivi
alla ricerca di Prototheca spp e tutti i bovini, sono stati inviati
al macello. Successivamente l’impianto di mungitura è stato
sottoposto a disinfezione con prodotti a base di ozono. Per
219
valutare l’entità della contaminazione ambientale, dopo tre
mesi dall’avvenuta disinfezione, l’acqua di lavaggio della sala
mungitura e il latte prelevato dai capi bufalini ancora presenti
in allevamento sono stati sottoposti nuovamente ad indagine
microbiologica. Tutte le indagini hanno dato esito negativo per
Prototheca spp..
La metodica da noi utilizzata è una Real Time PCR associata a
melting resolution analysis , come proposta da Ricchi et al. nel
2009 (6) ed ha il vantaggio di essere semplice e molto veloce,
relativamente poco costosa e di non richiedere manipolazioni
successive all’allestimento della reazione di PCR. La possibilità
di confermare in Prototheca spp. la causa di mastite e di
poter identificare il genotipo in caso di Prototheca zopfii, è
di fondamentale importanza nella gestione del problema in
allevamento, dato il diverso significato patogeno delle diverse
specie di Prototheca.
Dal punto di vista clinico solo uno dei bufali campionati
presentava calo produttivo, senza alterazioni evidenti
della mammella. I bovini presenti in azienda, introdotti da
un’allevamento estero, pluripari, venivano utilizzati al solo
scopo di fornire latte per gli annutoli prima dello svezzamento,
pertanto il dato produttivo non era tenuto sotto stretto controllo.
L’impianto di mungitura utilizzato era il medesimo per entrambe
le specie e non veniva utilizzato un disinfettante attivo sulla
specie algale.
Non si può escludere la trasmissione dell’infezione dai capi
bovini ai bufali, considerando che l’allevamento bufalino
era comunque sotto controllo per l’insorgenza di mastite nei
due anni precedenti l’introduzione delle bovine, non isolando
mai l’agente patogeno oggetto di studio. Ad ogni buon
fine l’eliminazione dei capi infetti e l’uso settimanale di un
disinfettante a base di ozono, nonché l’ottimizzazione delle
pratiche igienico sanitarie in sala mungitura, ha portato a non
isolare Prototheca spp. per due controlli consecutivi a distanza
di 3 mesi l’uno dall’altro.
Ulteriori indagini saranno necessarie a chiarire il ruolo
dell’infezione da Prototheca spp. nelle patologie mammarie nel
bufalo, nonché l’epidemiologia della patologia in tale specie.
BIBLIOGRAFIA
1. Arrigoni N., Belletti G.L., Cammi G., Garbarino C., Ricchi
M. 2010. Mastite bovina da Prototheca. Large animal
review 2010; 16:39-43.
2. Moller A., Truyen U., Roesler U. Prototheca zopfii
genotype 2 :the causative agent of bovine protothecal
mastitis? 2007. Research in Veterinary Microbiology
120 (2007) 370-374.
3. Pore R.S. 1998. Prototheca Kruger. In: Kurtzman, C.P. ,
Fell, J.W.(Eds), The Yeats, 4th ed. Elsevier, Amsterdam,
pp.883-887.
4. Ricchi M., Cammi G., Merenda M., Garbarino C., Belletti
G.L., Arrigoni N. . 2009. Tipizzazione molecolare di
specie di Prototheca mediante Real Time pcr associata
ad analisi della curva di melting. Atti XI Congresso
Nazionale SIDILV, 62-63.
5. Rosignoli C., Nigrelli A.D., Franzini G., Faccini S.,. Nard
M i, Favalli F., Bottoli E., Costa A. 2006. La mastite
da Prototheca zopfii nel bovino. Praxis vet.vol.XXVII,
N.2/2006.
6. Satoh K., Ooe K., Nagajyama H. and Makimura K.
Prototheca cutis sp. Nov., a mewly discovered pathogen
of protothecosis isolated from inflamed human skin
International Journal of systestematic and Evolutionary
Microbiology(2010), 60, 1236-1240.
7. Scatassa M.L., Miraglia V., Giosuè C., Brignano S.,
Randazzo V., Carrozzo A., Ducato B., Fiorenza G.,
Mancuso I., Caracappa S.2010
Prototheca spp.:
indagine preliminare sulla diffusione nella Sicilia
occidentale e relazione fra le cellule somatiche ed
isolamenti in campioni di latte bovino. XII Congresso
Nazionale S.I.Di.L.V. 27-29 ottobre 2010.
Fig. 1-2 : Curve di melting del campione e del ceppo controllo
220
RHDV2 IN ALLEVAMENTI CUNICOLI PIEMONTESI
De Somma D.1, Lavazza A.2, Caruso C.1, Zoppi S.1, Cerrina P.3, Cavadini P.2, Giorgi I.1, Masoero L.1, Capucci L.2, Dondo A.1
1
I.Z.S. del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (Sezione di Torino). 2I.Z.S della Lombardia e dell’Emilia-Romagna (CdR nazionale malattie virali dei
lagomorfi, Brescia). 3Veterinario aziendale Ferrero Mangimi
Key words: RHDV, MEV, rabbits
SUMMARY
Rabbit Haemorragic Disease (RHD) was first described in
domestic rabbits in China in 1984; the virus causes necrosis
of the liver followed by disseminated intravascular coagulation,
with congestion of lungs, trachea and spleen. It is caused by
a lagovirus and there are actually three recognized strains :
RHDV1, RHDV1a and RHDV2 (Fra10). RHDV2 appears for
the first time in France on spring 2010 involving the wild rabbits,
and then spreads in the North-West of France interesting the
industrial farms causing high mortality among breeders and
fattening rabbits, even vaccinated. In Italy RHDV2 was firstly
detected in the summer 2011 in two industrial farms in Friuli
Venezia Giulia, and then disease spreads in many others
regions involving rural, industrial and wild rabbits. In Piedmont
region, from November 2012 to July 2013 we reported 8 cases
of positivity for RHDV and 3 of these were positive for RHDV2.
The animals showed typical lesions of RHDV: diagnosis was
conducted by means of a sandwich MAbs-based ELISA and RT
PCR that allows to discriminate between different strains. Even
if subjects were normally and corrected vaccinated, outbreaks
spread in the herds, thus demonstrating the high capacity of
diffusion of RHDV2 strain and arising the question for the use of
autovaccines.
INTRODUZIONE
La malattia emorragica virale del coniglio (MEV o RHD
dall’acronimo inglese) è stata osservata per la prima volta in Cina
nel 1984 in conigli domestici [1] ed in Europa alla fine nel 1986,
interessando inizialmente i conigli selvatici e rurali e diffondendosi
poi all’allevamento del coniglio domestico. Il coniglio europeo
(Oryctolagus cuniculus) è ritenuto l’unica specie suscettibile.
L’agente eziologico è un virus ad RNA a singola catena (RHDV),
privo di envelope, appartenente al genere Lagovirus, famiglia
Caliciviridae. Ad oggi vengono riconosciuti 3 tipi di RHDV: RHDV1
(ceppo classico o wild type), RHDV1a (variante a) e RHDV2.
Quest’ultima è anche denominata RHDVFra10, in quanto i primi
casi di malattia sono stati riscontrati nel nord-est della Francia
nel 2010, prima in conigli selvatici e poi in allevamenti intensivi
[2]. In Italia, RHDV2 è stato identificato la prima volta nell’estate
2011 nella province di Udine e successivamente in Sardegna
(ottobre-dicembre 2012) e ad inizio 2012 a Trento. A partire dal
novembre 2012 si sono poi susseguite le segnalazioni in tutto il
territorio nazionale, sia in allevamenti industriali e a carattere
rurale/familiare che in conigli selvatici. Un picco a carattere
epidemico si è quindi registrato nella primavera 2013 nelle zone
del Nord a maggior produzione cunicola [3].
La patologia “classica” da RHDV1 si manifesta solo nei riproduttori
e nei giovani di età superiore ai 40-50 giorni, con percentuali
di morbilità e mortalità dell’80%; il decorso è rapido (36-48h) e
quasi sempre letale; all’ esame autoptico si rileva: imbrattamento
sieroemorragico delle narici, spleno-megalia, epatomegalia,
emorragie diffuse a tutti gli organi, congestione polmonare e
tracheale [4]. RHDV2 causa una malattia caratterizzata da
lesioni simili ma caratteristiche epidemiologiche differenti, infatti,
ammalano anche i conigli lattanti (15-20 giorni), l’incubazione e
il decorso sono più protratti e, a fronte di una morbilità del 100%,
la mortalità è più bassa e variabile (5-60%), con il coinvolgimento
anche di soggetti già vaccinati per RHDV1 [2,5]. Inoltre, si è visto
che RHDV2 infetta almeno un’altra specie oltre al coniglio, in
particolare la lepre sarda (L.capensis var mediterranues) [6].
Il Piemonte è la terza regione italiana, dopo Veneto ed Emilia
Romagna, per importanza nella produzione cunicola (11,2%
della produzione nazionale), con circa 350 allevamenti che
ospitano 5 milioni di capi annui, superando i 45 milioni di euro di
fatturato annuale [7].
Indagini diagnostiche effettuate negli anni precedenti, hanno
permesso di dimostrare la circolazione sul territorio piemontese
della MEV (soggetta a denuncia secondo l’Art 1 del RPVDPR 320/54). Nel presente lavoro, viene riportata la prima
segnalazione di RHDV2 in allevamenti cunicoli piemontesi.
MATERIALI E METODI
Da Gennaio 2012 a Luglio 2013 sono state sottoposte ad
esame autoptico, presso il Lab. di Diagnostica Generale
IZS PLV, 101 gruppi di carcasse di conigli deceduti con un
quadro sintomatologico imputabile a MEV, provenienti tutti
da allevamenti piemontesi di tipo industriale. I campioni di
fegato sono stati processati presso la S.C. Virologia mediante
metodiche immunoenzimatiche di screening (ELISA) e tecniche
biomolecolari differenziali (RT- PCR) che hanno permesso
l’identificazione della variante RHDV2, successivamente
confermata dal Centro di referenza CReMaViLa mediante ELISA
Ag utilizzando un pannello di anticorpi monoclonali (MAbs)
specifici sia per RHDV1 che RHDV2.
ELISA Ag - Brevemente, 2,5 grammi di fegato sono stati
omogenizzati meccanicamente in 25 ml di PBS (diluizione 1/10),
centrifugato a 5000 rcf x 15’ e il surnatante analizzato mediante
kit ELISA tipo sandwich che utilizza Ac monoclonali per la
proteina capsidica VP60, messo a punto dal Centro di Referenza
Nazionale per le Malattie dei Lagomorfi dell’IZS di Brescia. Il kit
di screening non permette la differenziazione tra i diversi ceppi
di RHDV.
RT PCR L’indagine biomolecolare RT PCR, è stata effettuata
a partire da 50-100 mg di tessuto epatico. L’estrazione dell’
RNA totale è avvenuta mediante Trizol (Sigma) seguendo le
istruzioni della casa produttrice con eluizione in 50 μl di acqua
RNasi free. La retrotrascrizione è stata effettuata con 7 µl di
RNA diluito 1/50 mediante kit MultiScribe Reverse transcriptase
(Applied Biosystems). L’amplificazione del cDNA è stata
realizzata utilizzando il kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen).
La presenza di genoma virale di RHDV nel campione è stata
determinata mediante allestimento di PCR end point rivolta verso
il gene della proteina VP60 utilizzando mix e primers specifici
riportati in tabella 1. I frammenti genomici prodotti sono stati
sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio 2% e visualizzati
mediante transilluminatore GEL - DOC (Bio-Rad Laboratories),
dopo colorazione con GelGreen Nucleic Acid Stain (Invitrogen).
221
Tabella 1. Sequenze dei primers utilizzati per amplificare una
porzione del gene che codifica per la proteina VP60
Primers
Sequenza
Posizione
RHDV-F
5’-CCTGTTACCATCACCATGCC-3’
493-512nt
RHDV-Rnew
5’-CAAGTTCCARTGSCTGTTGCA-3’
820-841nt
FRANCIA-F
5’-GTTACCCTGGAAGCAGGTTCGT-3’
908-928nt
FRANCIA-R
5’-CAAACAACCCGGCTGTTGCC-3’
1239-1258nt
BS89-F
5’-TGCCCTTCAACGGTCCCGGT-3’
1025-1044nt
BS89-R
5’ACAGGTGCAGCGGCTGGAGTG-3’
1344-1364nt
Caratterizzazione antigenica
La diagnosi differenziale di tipo virale è state effettuata
utilizzando un ELISA sandwich con un pannello di MAbs a
diversa specificità (RHDV1, RHDV1a, RHDV2) [5].
RISULTATI E CONCLUSIONE
Dei 101 campioni sospetti sottoposti ad ELISA sandwich, 36
(36%) sono risultati positivi per MEV. In particolare, nei campioni
di fegati di 3 gruppi di conigli che all’esame necroscopico
presentavano quadri di tracheite emorragica, degenerazione
epatica ed evidente splenomegalia (Figura 1), l’analisi con RT–
PCR ha permesso l’identificazione di RHDV2 (Figura 2).
Figura 1. Lesioni macroscopiche in conigli deceduti per
infezione da RHDV2
Figura 2. Elettroforesi applicata alla RT PCR di tre campioni
sospetti per RHDV-MEV. Nella prima corsa i campioni sono
stati sottoposti a PCR MEV-tutte le varianti: i tre campioni sono
positivi per RHDV, ma non differenzia le tre varianti (banda
attesa 390 bp). Nella seconda corsa i campioni sono stati
sottoposti a PCR RHDV2: 2 dei tre campioni sono positivi per
RHDV2 (banda attesa 350 bp). Nella terza corsa i campioni
sono stati sottoposti a PCR per ceppo Wild type.
I tre campioni risultati positivi provenivano da 2 allevamenti
situati nella provincia di Cuneo ed uno di essi era costituito
da un pool di fegati di soggetti con età inferiore ai 50-60 gg.
Entrambe le aziende erano allevamenti misti, a ciclo chiuso,
con programmi di vaccinazione effettuati correttamente,
frequenti interventi di pulizia e di disinfezione (8volte/anno
e 50volte/anno rispettivamente nel primo e nel secondo
allevamento), assenza di sovraffollamento nel reparto
ingrasso e gabbie adeguate nel reparto riproduttori. Gli
allevamenti acquistavano fattrici provenienti dalla Francia.
I dati epidemiologici e di georeferenziazione, hanno inoltre
evidenziato la presenza nelle vicinanze (<10 km) di altre
realtà zootecniche e industriali (macello, allevamenti rurali).
La tipizzazione antigenica con il pannello di anticorpi
monoclonali ha evidenziato per i tre campioni un pattern di
reattività riferibile a RHDV2.
I risultati ottenuti dimostrano che RHDV2 è una problematica
emergente anche negli allevamenti cunicoli piemontese,
forse correlata all’acquisto di fattrici dalla Francia, dove la
malattia è stata segnalata. Nonostante i due allevamenti
ricorressero a piani di profilassi diretta e indiretta corretti e
regolarmente messi in atto, non sono stati in grado di evitare
e contenere l’insorgenza del focolaio, a prova dell’elevata
capacità di diffusione del virus. Inoltre, le differenze
antigeniche e genomiche del nuovo virus RHDV2, rispetto
ai ceppi classici, sono tali da renderlo di fatto equiparabile
ad un nuovo sierotipo. Pertanto la protezione indotta dalla
vaccinazione con vaccini RHDV1 è in grado di conferire una
cross-protezione solo parzialmente in grado di proteggere
dal rischio di contagio e dalla malattia. In tale contesto in via
provvisoria, in attesa di disporre di vaccini omologhi registrati,
potrebbe risultare utile l’allestimento di vaccini stabulogeni
prodotto con i fegati dei conigli provenienti da focolai
accertati e notificati, in modo da aumentare l’efficacia della
copertura immunitaria sia dell’ingrasso che dei riproduttori.
Il comparto cunicolo piemontese conta un elevato numero di
allevamenti, la maggior parte a ciclo chiuso, in cui l’adozione
di misure di profilassi efficaci (applicazione rigida delle norme
di biosicurezza e puntuale rispetto dei piani di vaccinazione)
risulta spesso complicata, oltre che dall’elevata contagiosità
e diffusibilità della malattia, anche dalla presenza di conigli
selvatici e di realtà rurali che costituiscono una sorgente
continua di virus, peraltro dotato di elevata resistenza
ambientale, difficile da controllare. Proprio gli allevamenti
rurali, spesso a conduzione familiare, non riescono ad
adeguarsi alle misure di profilassi e prevenzione dettate dalle
autorità sanitarie e l’applicazione delle norme di biosicurezza
è vanificata dalla realtà territoriale e socio-economica.
A. Lavazza, S. Bertagnoli , F. Zwingelstein, P. Cavadini, N.
Martinelli, G. Lombardi, J-L. Guérin, E. Lemaitre, A. Decors,
S. Marchandeau, L. Capucci. Emergence of a new lagovirus
related to Rabbit Haemorrhagic Disease virus. Veterinary
Research, in press. [6] Puggioni G., Cavadini P., Maestrale
C., Scivoli R., Botti G., Ligios C., Le Gall-Reculé G., Lavazza
A., Capucci L. The new French 2010 variant of the rabbit
hemorrhagic disease virus causes an RHD-like disease in
the Sardinian Cape hare (Lepus capensis mediterraneus).
Veterinary Research, in press. 7] Macchi E, Prola L, Lazzarato
V, Cornale P, Renna M, Perona G, Mimosi A. Il benessere dei
conigli da allevamento e l’efficienza aziendale. Agricoltura
73-documenti.
BIBLIOGRAFIA [1] Liu SJ, Xue XP, Pu BQ, Quian NH. A
new viral disease in rabbits. Animal Husb Vet Med 1984;
[2] Le Galle-Reculé G., F. Zwingelstein, S. Boucher, B. Le
Normand, G. Plassiart, Y. Portejoie, A. Decors, S. Bertagnoli,
J-L Guerin, S. Marchandeau. Detection of a new variant
of rabbit haemorragic disease virus in France. Veterinary
Record 2011. [3] CReMaViLa -News- N°4 – 18/04/2013,
Centro di Referenza Nazionale per le Malattie dei Lagomorfi,
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e
dell’Emilia Romagna “Bruno Ubertini”- Via Bianchi, 9 25124
Brescia (Italy). [4] Marcato PS, Benazzi C, Vecchi G, et
al. Clinical and pathological features of viral haemorrhagic
disease of rabbits and the European brown hare syndrome.
Rev Sci Tech Off Int Epizoot 1999. [5] Le Gall-Reculé G.,
222
223
CANINE PNEUMOVIRUS IN CANI CON MALATTIA RESPIRATORIA
Decaro N., Pinto P., Mari V., Elia G., Larocca V., Camero M., Terio V., Losurdo M., Martella V., Buonavoglia C.
Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Bari, Valenzano (BA)
Key words: Cane, Pneumovirus, Malattia respiratoria
SUMMARY
An outbreak of canine infectious respiratory disease (CIRD)
associated to canine pneumovirus (CnPnV) infection is reported.
The outbreak occurred in a shelter of the Apulia region and involved
37 out of 350 dogs that displayed cough and/or nasal discharge
with no evidence of fever. The full-genomic characterisation
showed that the causative agent (strain Bari/100-12) was closely
related to CnPnVs that have been recently isolated in the USA,
as well as to murine pneumovirus (MVP), which is responsible for
respiratory disease in mice. The present study represents a useful
contribution to the knowledge of the pathogenic potential of CnPnV
and its association to CIRD in dogs. Further studies will elucidate
the pathogenicity and epidemiology of this novel pneumovirus,
thus addressing the eventual need for specific vaccines.
INTRODUZIONE
La malattia infettiva respiratoria del cane (CIRD) è una patologia
multifattoriale che colpisce cani di tutte le età ed è causata
generalmente da infezioni di natura virale e batterica, spesso
associate (1). Recentemente, tra gli agenti emergenti di CIRD è
stato segnalato negli USA uno pneumovirus del cane (CnPnV), il
quale presentava una stretta correlazione genetica con l’analogo
virus del topo (MPV) (2, 3). Sebbene CnPnV sia stato isolato da
più di 4 anni, al momento non ci sono ulteriori segnalazioni, né è
disponibile la sequenza dell’intero genoma degli stipiti isolati.
Nel presente lavoro si riportano l’identificazione e la
caratterizzazione molecolare dell’intero genoma di uno stipite
CnPnV associato ad un focolaio di malattia respiratoria in Italia.
MATERIALI E METODI
La malattia respiratoria è stata osservata in un canile della Puglia
nel 2012 ed ha interessato 37 dei 350 cani ospitati presso tale
struttura. Gli animali erano sottoposti a regolari vaccinazioni nei
confronti delle comuni malattie infettive del cane, ma nessuna
profilassi specifica per CIRD era attuata. I sintomi respiratori, in
genere moderati, erano caratterizzati da tosse e/o scolo nasale,
mentre la febbre era assente. Da due soggetti, un maschio di 7
mesi ed una femmina di 3 anni, erano prelevati tamponi nasali e
faringei per le successive analisi di laboratorio.
Gli agenti responsabili di CIRD erano ricercati mediante test
molecolari effettuati sugli estratti RNA e DNA. Per la ricerca di
CnPnV era utilizzato un test RT-PCR precedentemente messo a
punto (3), mentre la quantificazione dell’RNA virale nei campioni
clinici era ottenuta mediante un test real-time RT-PCR (Tabella 1).
Le prove di isolamento virale sono state condotte su cellule A-72
(3) e per la ricerca degli antigeni virali nelle colture infette era
utilizzato un test di immunofluorescenza indiretta con anticorpo
monoclonale per virus respiratorio sinciziale dell’uomo (HRSV)
(Monosan®, Sanbio BV, Uden, Paesi Bassi).
Il genoma virale dello stipite prototipo dog/Bari/100-12/ITA/2012 è
stato determinato mediante successive prove di RT-PCR, come
precedentemente descritto (2, 3). Ulteriori oligonucleotidi, disegnati
sulle sequenze di MPV, sono stati utilizzati per sequenziare le
regioni genomiche non determinate in precedenza. Le regioni
leader 3’ e trailer 5’ sono state amplificate mediante un kit 5’ RACE
(Invitrogen Ltd, Milano).
I prodotti PCR sono stati inviati alla BaseClear B.V. (Leiden, Paesi
Bassi) per il sequenziamento diretto in entrambe le direzioni. Le
sequenze ottenute sono state assemblate ed analizzate utilizzando
il software BioEdit e gli strumenti di analisi dell’NCBI (htttp://www.
ncbi.nlm.nih.gov) e dell’EMBL (http://www.ebi.ac.uk). La sequenza
dell’intero genoma (numero di accesso GenBank KF015281)
e delle single regioni genomiche sono state confrontate con le
analoghe sequenze di stipiti Pneumovirus di riferimento. L’analisi
filogenetica è stata condotta utilizzando il software MEGA4 (4) ed
i metodi neighbor-joining e massima parsimonia e fornendo un
supporto statistico mediante bootstrapping pari a 1000.
RISULTATI
Entrambi i cani sono risultati positivi al test RT-PCR per la ricerca
di CnPnV (3), mostrando una identità nucleotidica (nt) del 100%
a livello del gene target SH. I titoli virali rilevati nei mix di tamponi
nasali e faringei erano pari a 2,06 × 105 e 1,59 × 104. Non sono
stati messi in evidenza altri patogeni respiratori del cane. Le prove
di isolamento virale di CnPnV hanno fornito esito costantemente
negativo, nonostante ripetuti passaggi seriali.
L’analisi di sequenza dell’intero genoma virale del virus prototipo
dog/Bari/100-12/ITA/2012 (Bari/100-12) ha mostrato la stessa
organizzazione genomica di MPV, con 10 geni che codificano
per un totale di 12 proteine. Il genoma del virus Bari/100-12 è
lungo 14.884 nt ed è organizzato nel seguente ordine genico:
3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’ (Fig. 1). Le regioni leader 3’
e trailer 5’ sono presenti alle estremità del genoma. Il genoma è
risultato rispettivamente più corto di 1 e 3 nt rispetto a quello degli
stipiti MPV J3666 e 15, mentre non è stato possibile effettuare
alcun confronto con gli stipiti CnPnV esistenti, dei quali non è
attualmente disponibile l’intera sequenza genomica (4). La più
elevata correlazione genetica (95,7-95,8% di identità nt) è stata
osservata nei confronti di MPV, mentre i valori di identità nt sono
scesi al di sotto del 50% nei confronti di HRSV e virus respiratorio
sinciziale bovino (BRSV). Per includere nell’analisi gli stipiti
CnPnV Brne17 e Ane4 è stata successivamente considerata
una sequenza più corta (8.598-8.600 nt), che va dall’estremità 3’
del gene L all’estremità 5’ della regione leader. In questa regione
è stata evidenziata un’identità nt del 96,5-96,6% tra lo stipite
Bari/100-12 e gli altri ceppi CnPnV. Tale correlazione non è molto
distante da quella riscontrata verso MPV (94,8-96% di identità nt).
Le correlazioni genetiche tra CnPnV Bari/100-12 e gli altri membri
del genere Pneumovirus nelle diverse regioni genomiche sono
riportate nella Tabella 2.
L’analisi filogenetica, condotta su un frammento genomico di
8.598 nt, ha dimostrato che lo stipite Bari/100-12 segrega con
gli altri ceppi CnPnV e con il ceppo murino J3666, mentre l’altro
stipite MPV/15 è filogeneticamente più lontano (Fig. 2).
CONCLUSIONI
Sebbene CnPnV sia stato isolato più di 4 anni fa, finora solo due
terzi del genoma virale sono stati sequenziati. Nel presente lavoro
abbiamo riportato i risultati dell’analisi dell’intero genoma di uno
stipite CnPnV associato a malattia respiratoria in Italia. Si tratta
224
della prima segnalazione di CnPnV in Europa. Lo stipite italiano
è risultato geneticamente correlato ai prototipi americani ed ai
ceppi MPV. In base ai dati attualmente disponibili non è possibile
determinare se MPV sia l’ancestore di CnPnV oppure i due virus
si siano evoluti parallelamente da un ancestore comune. Ulteriori
studi sono necessari per retrodatare la comparsa di CnPnV
mediante l’analisi genetica di sequenze di origine murina e canina.
Nonostante la presenza di titoli virali discreti nei campioni clinici,
non è stato possibile isolare nessuno dei due stipiti italiani,
probabilmente per una non idonea conservazione degli stessi
durante il trasporto al laboratorio o per una scarsa sensibilità del
clone di A-72 utilizzato per le prove di isolamento.
Attualmente il potere patogeno di CnPnV non è completamente
noto. Un certo ruolo nell’insorgenza della CIRD può essergli
riconosciuto in base a recenti studi su infezioni naturali nel cane
(3) e sperimentali nel topo (5). L’azione patogena sull’apparato
respiratorio è supportata dal presente studio, in quanto CnPnV
è stato identificato nel corso di un focolaio di CIRD in assenza di
altri patogeni respiratori. Studi futuri contribuiranno a chiarire le
caratteristiche patogenetiche ed epidemiologiche di questo nuovo
pneumovirus, definendo la necessità o meno di allestire vaccini
specifici.
BIBLIOGRAFIA
1. Buonavoglia C, Martella V. Canine respiratory viruses. Vet Res
2007;38:355-73.
2. Renshaw RW, Zylich NC, Laverack MA, Glaser AL, Dubovi EJ.
Pneumovirus in dogs with acute respiratory disease. Emerg Infect
Dis 2010;16:993-5.
3. Renshaw R, Laverack M, Zylich N, Glaser A, Dubovi E.
Genomic analysis of a pneumovirus isolated from dogs with acute
respiratory disease. Vet Microbiol 2011;150:88-95.
4. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol
Biol Evol. 2007;24:1596-9.
5. Percopo CM, Dubovi EJ, Renshaw RW, Dyer KD, Domachowske
JB, Rosenberg HF. Canine pneumovirus replicates in mouse lung
tissue and elicits inflammatory pathology. Virology 2011;416:26-31.
Fig. 1. Organizzazione genomica dello stipite CnPnV Bari/10012. Mappa del genoma virale (non in scala) disegnata
dall’estremità 3’ a quella 5’, in modo che la direzione della
trascrizione è da sinistra a destra. I geni sono rappresentati
da rettangoli, mentre le barre laterali indicano I segnali di inizio
e fine trascrizione genica. La linea orizzontale rappresenta
le regioni extrageniche, in particolare le sequenza leader 3’
(Le), la sequenza trailer 5’ (Tr) e le sequenze intergeniche.
Le dimensioni in nucleotidi (nt) delle regioni extrageniche
sono riportate nella parte superiore; nella parte inferiore sono
indicate le coordinate geniche, la lunghezza degli mRNA e le
dimensioni in aminoacidi (aa) delle corrispondenti proteine. I
geni P e M2 codificano ciascuno per due proteine distinte.
Fig. 2. Analisi filogenetica dello stipite CnPnV Bari/100-12 e
degli altri membri del genere Pneumovirus. Albero costruito con
il metodo della massima parsimonia su un frammento di 8.598
nt del genoma virale. Il metapneumovirus umano (HMPV)
CAN97-83 (NC_004148) è stato utilizzato come outgroup. Il
supporto statistico è stato ottenuto mediante bootstrapping su
1.000 repliche.
100 CnPnV/Brne17
100
CnPnV/Ane4
100
100
CnPnV/Bari/100-12
MPV/J3666
MPV/15
HRSV/B1
100
BRSV/ATue51908
HMPV/CAN97-83
200
Tabella 1. Sequenza, posizione e specificità degli oligonucleotidi utilizzati nello studio.
Riferimento
bibliografico
Test
a
Real-time
RT-PCR
Questo studio
RT-PCR
3
Primer/sonda
Sequenza (5’ - 3’)
Senso
CnPnV-For
CnPnV-Rev
AAGATAAATTCTTCTATGAAAACAGAATGA
CCCATCGTAAGTGAGGTTTCTATT
+
-
CnPnV-Pb
6FAM-CTGCCTAAATACTATCCAGCCATACTGC-BHQ1
-
SH1F
SH187R
ATGGATCCTAACATGACCTCACAC
GATTGGGATGAACCGTGCATTG
+
-
Target
Posizionea
8065-8094
8151-8174
M2
8100-8127
4104-4127
4290-4311
SH
Dimensioni
prodotto
110 bp
208 bp
La posizione degli oligonucleotidi si riferisce alla sequenza dello stipite CnPnV dog/Ane4/USA/2008 (GenBank HQ734815).
Tabella 2. Identità nucleotidiche (%) dello stipite CnPnV Bari/100-12 con pneumovirus di riferimento nelle diverse regioni genomiche.
Stipite Pneumovirus
(GenBank)
CnPnV/Brne17
(GU247050)
Leader
NS1
NS2
N
P
M
SH
G
F
M2
L
Trailer
Genoma
intero
Frammento
di 8598 nt
NA
94.7
94.7
97.2
97.4
96.8
95.5
96.4
97.4
96.4
N.A.
NA
NA
96.5
CnPnV/Ane4 (HQ734815)
NA
94.7
94.7
97.1
97.4
96.9
95.5
96.6
97.4
96.4
N.A.
NA
NA
96.6
MPV/strain 15
(AY729016)
78.6
94.2
94.2
95.9
94.8
95.3
89.4
94.1
96.8
95.1
96.7
94.5
95.7
94.8
MPV/J3666 (NC_006579)
83.3
94.2
94.2
95.8
95.6
95.4
90
94.4
96.9
95.1
96.6
95.6
95.8
95
HRSV/B1 (NC_001803)
68.2
39.6
39.9
61.4
45.8
49.5
44.7
36.8
49.1
44.6
54
52.7
48.7
51.1
BRSV/ATue51908
(NC_001989)
72.7
36.7
38.6
60
44.8
50.9
32.5
35.3
50.5
45
54
47.3
48.6
51.5-
RINGRAZIAMENTI: Il presente studio è stato realizzato grazie ai finanziamenti della Ricerca corrente 2009, progetto IZS VE
21/09 RC “Definizione di una procedura validata per la selezione di cani per programmi di Interventi Assistiti dagli Animali (IAA)”.
225
REPORT DI UN CASO DI MENINGIOMA IN UNA TIGRE DELLO ZOO DI NAPOLI
Fig.1: Colorazione E- E Panoramica
Degli Uberti B. 1, D’Amore M. 1, Laricchiuta P. 2, Campolo M. 2, Mizzoni V. 3, Rosato G. 3
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno - Portici (NA); 2 Centro Veterinario Einaudi - Bari (Zoo Healt
Management); 3 ASL NA1 Centro Servizi Veterinari - Napoli
2 Journal of neurology, Neurosurgery, and Psychiatry,
1979, 42, 529 – 535 Xanthochromic cysts associated with
meningioma; H.J.W. Nauta, W.S. Tucker, W.J. Horsey, J.M.
Bilbao, and Gonsalves;
Keywords: tigre, tumori intracranici, meningioma
ABSTRACT
A tiger from the zoo in Naples,14 years old, during clinical
examination showed sensory depression and neurological
symptomatology. The animal is dead and the autopsy has
revealed a cardiovascular collapse as cause of death . At a
macroscopic examination, during histological reduction, was
found a globular submeningea mass. H-E staining showed
its neoplastic nature, to departure from the pia mater .The
immunohistochemical investigations led to the diagnosis of
meningioma. The Meningioma is the most common type of
intracranial tumor in the cat, but has never been mentioned a
case in the tiger.
INTRODUZIONE: Una tigre dello zoo di Napoli, di 14 anni di
età, manifestava depressione del sensorio e sintomatologia
neurologica con incoordinazione motoria, decubiti prolungati,
assunzione di posizione antalgica presso gli angoli della
struttura. Il Veterinario, ai fini diagnostici, eseguiva un prelievo
di sangue in EDTA ed emosiero, previa sedazione. Alla seconda
visita, l’animale mostrava peggioramento delle condizioni
generali ed uno stato semicomatoso. Dopo pochi giorni
l’animale è deceduto ed è stato sottoposto a necroscopia con
prelievo di organi per esame istologico. In sede necroscopica
si valutava come causa di morte un collasso cardio-circolatorio.
Ad un esame macroscopico in sede di riduzione istologica si
identificava una massa sub meningea di 2 cm di grandezza
a livello della corteccia prefrontale, ben circoscritta, globulare
circondata da emorragie multiple, grigia e compatta in
superficie di taglio, traslucida, a partenza dalla pia madre e con
accrescimento intracerebrale.
MATERIALI E METODI : La tigre è stata sottoposta a ripetute
visite cliniche durante le quali il veterinario ha riscontrato
ottundimento del sensorio e stato stuporoso che permetteva di
effettuare diagnosi di sospetto di lesione neoplastica a livello di
SNC (1). E’ stato eseguito un esame ematochimico al fine di
effettuare diagnosi differenziale con encefalite batterica, virale
o da toxoplasma. La morte è sopraggiunta dopo poche giorni
dall’inizio della sintomatologia. In seguito è stata sottoposta a
necroscopia da operatori del Servizio Veterinario della ASL NA1
Centro; durante i rilievi necroscopici si sono effettuati prelievi
multipli di organi con e senza lesioni anatomo – patologiche
evidenti, che sono stati immersi in formalina tamponata al 10 %
ed inviati al Laboratorio di Istopatologia dell’I.Z.S.M.
In sede di riduzione istologica, all’esame macroscopico, si è
riscontrata una massa a livello della corteccia prefrontale che
è stata sottoposta a totale macroriduzione, processata, inclusa
in paraffina, tagliata in microsezioni di 3-4 μ e sottoposta
a colorazione Ematossilina – Eosina. Quindi, esaminata
al microscopio ottico. In seguito a diagnosi presuntiva, si
sono effettuati approfondimenti diagnostici mediante esami
immunoistochimici utilizzando un pannello anticorpale della
Dako s.r.l. Vimentina Clone V9, Sinaptofisina, Citocheratina
BIBLIOGRAFIA
1 Can. Vet J 1995; 36: 230 – 232 Paradoxical vestibular
syndrome in a cat with a cerebellar meningioma; Andréè D
Quesnel, Joane M. Parent;
Clone AE1/AE3, S-100 pervenendo alla diagnosi. Sono stati
analizzati istologicamente anche prelievi di fegato, milza, rene,
surrene, stomaco, ghiandole salivari, polmone, cuore, muscolo
temporale, muscolo quadricipite femorale prelevati in sede
autoptica.
RISULTATI E CONCLUSIONI:
Visita Clinica
Dai risultati emersi dalle visite cliniche il veterinario ha
ritenuto opportuno trattare l’animale in maniera sintomatica
in attesa di proseguire l’iter diagnostico (T.A.C e R.M.). Sono
stati somministrati Cefotaxime e Clindamicina, Mannitolo e
Furosemide per un ipotetico edema cerebrale da compressione.
Gli esami del sangue risultavano tutti nella norma per la specie.
Necroscopia
Il quadro necroscopico evidenziava: stato congestizio di molti
distretti, aspetto degenerato del fegato, ipertrofia surrenale
sinistra, aree di polmonite, cuore degenerato e sfiancato,
congestione meningea.
Esami Istopatologici
Gli esami clinici e necroscopici,
correlati all’esame
istopatologico hanno permesso di evidenziare un meningioma
(2) a livello cerebrale con ampi fenomeni congestizioemorragici, degenerazione ed encefalomalacia a carico delle
strutture adiacenti la lesione neoplastica.
La colorazione ematossilina eosina (Fig. 1,2) mostrava una
massa di natura neoplastica, a partenza dalla pia madre
e ad accrescimento intracerebrale. Gli approfondimenti
immunoistochimici portavano alla diagnosi di meningioma.
La neoplasia, pur essendo circoscritta, determinava
compressione nei confronti delle strutture circostanti e
risultavano presenti nell’ambito del tessuto neoformato, emboli
e stravasi ematici. Le cellule mostravano microscopicamente
un notevole grado di pleomorfismo, citoplasma abbondante
finemente granulare senza margini distinti , atipia nucleare.
Accrescimento variabile a formare foglietti, risultavano presenti
vortici di cellule al cui centro si evidenziava sostanza ialina, dando
fisionomia psammomatosa. Inoltre, si evidenziava presenza
di cellule giganti multinucleate. L’esame immunoistochimico
(Fig.3 ) mostrava i seguenti risultati: espressione positiva con
la Vimentina e negativa con la Sinaptofisina. Infine S-100 e
Citocheratina davano risultato positivo ma con espressione
da sparsa a moderata come da letteratura. Dall’analisi degli
altri organi si è pervenuti alla causa di morte che risultava
essere collasso cardio-circolatorio in seguito ad insufficienza
ventricolare destra, sostituzione di porzioni di tessuto
miocardico con tessuto connettivo fibroso, ipotrofia. Tale
evenienza aveva determinato congestione passiva a livello
epatico. Il decubito prolungato dell’animale aveva determinato
fenomeni di necrosi ischemica a livello muscolare. A livello della
ghiandola surrenale si identificavano fenomeni degenerativi dei
fasci di fibre nervose poste in posizione extracapsulare ed un
fenomeno di iperplasia a carico della zona glomerulare.
226
Fig.2: Colorazione E-E Ingr.20x
Fig.3: IHC Vim Cl. V9. Ingr.40x
227
INDAGINI TOSSICOLOGICHE VETERINARIE (parte I):
CASI DI AVVELENAMENTO IN LIGURIA
Dellepiane M., Arossa C., Mignone W., Ercolini C., Ferrari A., Gili M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (IZS PLVA)
Keywords: Avvelenamenti, sostanze, Liguria
ABSTRACT
The accidental intake of toxics from domestic or wild animals
is a serious problem in urban and rural areas. Cats, dogs and
pigeons represent the most important goals of intentional
poisoning and also they have a greater probability of an
accidental intake, so these species are prevalently involved in
poisoning cases.
This statement, was confirmed in this study, conducted between
January 2009 and December 2012 , and it was possible to
delineate the maps of poisoning cases in the four counties of
Liguria. It is also possible the accidental involving of protect
wild species like wolf (two confirmed cases in Liguria during the
study period).
Furthermore, only in two cases poisoning seems aimed to kill
a particular specie; so the dissemination of poisoned baits is
almost indiscriminate.
La suddivisione per specie è riportata nella tabella 1.
La maggior parte delle positività sono state riscontrate negli
animali domestici e nei volatili selvatici o sinantropi che
rappresentano in parte il bersaglio della disseminazione dolosa
di bocconi avvelenati e in parte le specie che in aree urbane
hanno maggiore possibilità di assumere accidentalmente
sostanze tossiche utilizzate per le derattizzazioni.
Negli animali da reddito è risultato positivo ad un anticoagulante
cumarinico solo un suino per probabile assunzione accidentale
di un esca utilizzata per la derattizzazione.
Si sono poi verificati due casi di avvelenamento nel lupo a
conferma delle gravi conseguenze che la disseminazione
indiscriminata di esche o bocconi avvelenati può avere anche
sulla fauna selvatica protetta.
specie
INTRODUZIONE
Il problema della dispersione di esche e bocconi avvelenati
sul territorio è sempre più di attualità a causa della costante
presenza del fenomeno e della maggiore attenzione da parte
della cittadinanza e dei media.
L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e
Valle d’Aosta già da molti anni fornisce un servizio diagnostico
per individuare i casi di avvelenamento ed individuarne le
sostanze responsabili; a seguito della emanazione della
ordinanza ministeriale del 18 dicembre 2008 tale servizio è
stato ulteriormente potenziando ampliando il pannello dei
principi attivi ricercati.
Anche il numero di campioni conferiti ai nostri laboratori è
aumentato negli anni ed è ora possibile tracciare una mappa
dei ritrovamenti sul territorio Ligure.
La mappatura dei casi rappresenta uno strumento utile per
individuare le aree a maggior rischio dove eventualmente
intensificare i controlli allo scopo di allontanare le esche prima
che vengano ingerite dagli animali domestici, sinantropi o
selvatici.
MATERIALI E METODI
Sono stati raccolti i dati di tutti i campioni conferiti, per sospetto
avvelenamento, alle sezioni diagnostiche liguri e sottoposti a
ricerca di sostanze tossiche presso il laboratorio di Tossicologia
dell’IZS PLVA.
In particolare sono stati presi in considerazione la tipologia di
campione, la specie animale ed il luogo di ritrovamento.
Complessivamente sono state sottoposte ad analisi 371
campioni di cui 256 carcasse o materiali biologici di animali,
110 esche e 5 campioni di acqua di abbeverata o mangime
provenienti dalle diverse province liguri.
I risultati sono stati suddivisi per specie e per provincia ed i
campioni positivi sono stati riportati sulle cartine provinciali.
Complessivamente sono risultati positivi 166 campioni di cui 122
carcasse o materiali biologici di animali, 41 esche e 2 mangimi.
Animali
d’affezione
Animali da
reddito
Animali
selvatici
Volatili
Esche
Mangimi ed
acqua
Cani
gatti
equini
ovini
caprini
suini
bovini
polli
conigli
lupi
cinghiali
pesci
mustelidi
ricci
selvatici
sinantropi
totali
Totale
esaminati
78
84
positivi
%
42
52
25.45
31.50
5
2
5
3
1
3
1
3
3
2
1
1
32
32
110
0
0
0
1
0
0
0
2
0
0
0
0
11
14
41
5
2
1.20
371
165
100%
ad essere sistematicamente avvelenati sono i piccioni.
In provincia di Genova la quasi totalità dei casi è concentrata
in ambito urbano nelle città di Genova e Chiavari con il
coinvolgimento di diverse specie.
Analogamente
anche in
provincia di La
gli avvelenamenti
I dati raccolti
evidenziano
cheSpezia,
il fenomeno
della
o il ritrovamento
di
esche
è
circoscritto
al
distribuzione sul territorio di esche e bocconicapoluogo
avvelenati èe al
comune
di Sarzana.
ancora
diffuso anche se con intensità differente nelle
quattro province
Nell’Imperiese
la liguri.
distribuzione territoriale dei casi è
La presenza dicostiera
sostanzema
tossiche
fatto abbandonate
prevalentemente
non si, dievidenziano
aree con
per loconcentrazioni
più indiscriminatamente,
sia(cartine
in aree 1,
urbane
particolari
di positività
2, 3 esia
4).in
aree rurali rappresenta un rischio per gli animali domestici
I datie raccolti
evidenziano
il fenomeno
selvatici;
inoltre lache
dispersione
di della
tali distribuzione
sostanze
sul territorio
di esche
e bocconi
è ancora diffuso
nell’ambiente
può essere
ancheavvelenati
causa di avvelenamenti
anche se con intensità differente nelle quattro province liguri.
Legenda cartine:
esca
volatili selvatici
Gatto
piccioni
cane
suino
La presenza di sostanze tossiche , di fatto abbandonate
per lo più indiscriminatamente, sia in aree urbane sia in
aree rurali rappresenta un rischio per gli animali domestici e
selvatici; inoltre la dispersione di tali sostanze nell’ambiente
può
essere anche causa di avvelenamenti cronici ed espone
cronici ed espone ad un possibile rischio anche la
ad
un
possibile
rischio anche
la popolazione
popolazione
più sensibile
(ad esempio
i bambini). più sensibile (ad
esempio
i bambini).
Solo in pochi
casi si è potuto constatare una azione mirata
versoinalcune
come
i gatti (colonie
feline)una
o i piccioni
Solo
pochispecie
casi si
è potuto
constatare
azione mirata
(aree alcune
urbane);specie
in generale
che la distribuzione
verso
come sembra
i gatti (colonie
feline) o i piccioni
delle esche
sia indiscriminata
e, di conseguenza,
coinvolge delle
(aree
urbane);
in generale sembra
che la distribuzione
anche specie protette di elevato valore faunistico come il
esche sia indiscriminata e, di conseguenza, coinvolge anche
lupo (1 caso in provincia di Savona e 1 in provincia di
specie
protette di elevato valore faunistico come il lupo (1 caso
Genova).
in provincia di Savona e 1 in provincia di Genova).
mangime
lupo
Cartina 1: positività in provincia di Imperia
Cartina 3: positività in provincia di Genova
0.60
1.20
Cartina 2: positività in provincia di Savona
6.70
8.5
24.85
Cartina 4: positività in provincia di La Spezia
La diffusione dei casi sul territorio riguarda prevalentemente
aree rurali/silvestri o aree verdi urbane per quanto riguarda gli
avvelenamenti che hanno coinvolto cani, gatti e i lupi; e aree
prettamente urbane nei casi in cui sono stati coinvolti volatili
sinantropi.
Il maggior numero di positività è stato riscontrato in provincia di
Savona dove si evidenzia una concentrazione di casi soprattutto
nei territori a nord del capoluogo (Valle Bormida) con reperimento
di numerose esche e diverse specie animali coinvolte (cani,
gatti, piccioni) ad indicare una distribuzione “casuale” di
bocconi avvelenati, non mirata verso una determinata specie
come, al contrario, si è riscontrata nei comuni ad est di Savona
(Celle e Varazze) dove sono esclusivamente colpiti i gatti o nel
comune di Laigueglia (zona più a ponente della provincia) dove
228
229
INDAGINI TOSSICOLOGICHE VETERINARIE (parte II) : PRINCIPALI SOSTANZE
IDENTIFICATE NEI CASI DI AVVELENAMENTO IN LIGURIA
Dellepiane M., Arossa C., Mignone W., Ercolini C., Ferrari A., Gili M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (IZS PLVA)
Keyword: Tossicologia veterinaria, biocidi, Liguria
ABSTRACT
Knowledge of the most used toxics to poison domestic and
wild animals is very important to prevent and control this
occurrence. The results of this study, conducted between
January 2009 and December 2012, show that anticoagulants
are the most frequently found toxic substances in dead animals
even if in some cases, in particular in dogs and cats, is real
a suspect of a chronic poisoning. a-chloralose, pesticides,
metaldehyde, carbammates, strychnine and permethrin were
also found.
INTRODUZIONE
Nella lotta all’utilizzo di sostanze tossiche, causa di
avvelenamenti accidentali o volontari degli animali domestici
e selvatici, è di fondamentale importanza la conoscenza dei
principi attivi più frequentemente utilizzati. Tale informazione è
utile per mappare l’utilizzo dei diversi tipi di tossico sul territorio
al fine di adiuvare l’azione di controllo da parte degli enti preposti
e, in secondo luogo, ma non meno importante, di indirizzare
l’impostazione della terapia nei casi di avvelenamento. Di pari
rilievo è la valutazione degli avvelenamenti cronici riconducibili
alla dispersione di sostanze tossiche nell’ambiente.
MATERIALI E METODI
Sono stati raccolti i dati relativi a tutti i campioni conferiti ai
laboratori diagnostici distribuiti sul territorio e sottoposti a
ricerca di sostanze tossiche presso il laboratorio di Tossicologia
dell’IZS PLVA con esito positivo nel periodo compreso tra il 1
gennaio 2009 ed il 31 dicembre 2012. Il pannello di sostanze
ricercate è ampio e comprende diverse famiglie di biocidi:
- anticoagulanti cumarinici (acenocumarolo, brodifacoum,
bromadiolone, coumachlor, coumafuryl, coumatetralyl,
dicumarolo, difenacoum, warfarin) e indandionici (clorfacinone,
difacinone, flocumafen, pindone);
- pesticidi organoclorurati (α-endosulfano, β- endosulfano,
endosulfano solfato, lindano) e organofosforati (Chlopyrifos
metile, Chlopyrifos etile, Coumaphos, Diazinon, Dimethoate,
Ethion, Isofenphos, Malathion, Methamidiphos, Mevinphos,
Parathion etile, Parathion metile, Pirimiphos, Phorate,
Sulfotep, Terbufos);
- carbammati (Carbofuran, Desmediphan, Mercaptodimetour,
Oxamyl, Propoxur) e piretroidi (Cypermetrin, Decamethrin,
Permetrina I e II);
- altre sostanze (metaldeide, a-cloralosio, Lenacil,
Piperonylbutoxide,. stricnina).
In laboratorio ogni campione è stato sottoposto a una fase di
estrazione e purificazione e quindi analizzato sia in GC-MS (per
la ricerca di pesticidi, stricnina e metaldeide) che in LC-MS/
MS (per la ricerca di anticoagulanti e a-cloralosio). Di ciascun
campione è stata registrata la tipologia, la specie animale, il
luogo di ritrovamento e le sostanze identificate. Sono poi state
analizzate eventuali relazioni tra le positività ai diversi principi
attivi, la specie animale e il luogo di reperimento
In totale sono risultati positivi alle indagini tossicologiche 120
reperti autoptici animali e 42 esche (tabella 1). E’ inoltre stata
riscontrata la positività al pirimphos in due campioni di mangime
destinato agli equini. La maggior parte degli avvelenamenti
è stata causata dai cumarinici, usati singolarmente o in
associazione, con 98 casi di cui 80 nei cani e gatti. Se si
considerano anche le associazioni di anticoagulanti con
altre famiglie di principi attivi (organofosforati, metaldeide,
stricnina, a-cloralosio) il numero di positività sale a 104
e rappresenta l’85% di tutte le positività riscontrate negli
animali deceduti per sospetto avvelenamento. I restanti 16
casi sono attribuibili principalmente a a-cloralosio usato
singolarmente o in associazione con altri principi attivi quali
metaldeide, clorofacinone, permetrina. Anche nelle esche
i principi attivi maggiormente riscontrati sono i cumarinici da
soli o in associazione con altre sostanze; seguiti dai pesticidi
organoclorurati che, però, non hanno altrettanta frequenza negli
animali morti. A seguire si sono avute positività per a-cloralosio,
organofosforati, carbammati, metaldeide e stricnina. La
distribuzione sul territorio dell’utilizzo delle diverse sostanze
tossiche è riportata nelle cartine 1, 2, 3 e 4. Relativamente alla
specie, oltre l’83% dei casi in cui è stato usato a-cloralosio
riguardano piccioni in aree urbane; inoltre la percentuale di
piccioni avvelenati con questa sostanza rappresenta il 59%
di tutti i soggetti risultati positivi a sostanze tossiche. Questa
stretta relazione tra i piccioni e la positività all’a-cloralosio è
probabilmente dovuta alla elevata sensibilità di questa specie
al principio attivo (DL50 32 mg/kg).Tutti gli 8 campioni di
germani che sono stati sottoposti ad accertamenti per sospetto
avvelenamento sono risultati positivi per brodifacoum anche
se in almeno 2 casi la causa della morte è stata accertata
essere una intossicazione da Clostridium botulinum e in altri
due casi è stata fortemente sospettata. Nei cani e nei gatti
le sostanze maggiormente riscontrate sono stati i cumarinici
ed in particolare il coumatetralyl identificato in 29 cani su 40
risultati positivi e in 45 gatti su 52 positivi.E’ interessante notare
che i rodenticidi (anticoagulanti cumarinici e indandionici e
a-cloralosio) sono riscontrati molto più spesso negli animali
morti (15,4% sul totale di positività per tali sostanze) piuttosto
che nelle esche (84,6% sul totale di positività per tali sostanze);
mentre per i pesticidi (organoclorurati, organofosforati,
carbammati, piretroidi) il rapporto tra le positività nelle esce e
negli animali è quasi esattamente l’opposto (81% di positività
nelle esche e 19% negli animali). Probabilmente gran parte
degli avvelenamenti da cumarinici sono di natura accidentale
o le positività sono da collegare a fenomeni di accumulo e
conseguente intossicazione cronica; queste seconda ipotesi
sembra essere avvalorata dal fatto che sui 94 soggetti
sottoposti ad autopsia e successivamente risultati positivi agli
anticoagulanti solo 50 presentavano lesioni emorragiche.
230
Tabella
1: 1:
sostanze
riscontrate
Tabella
sostanze
riscontratenelle
nellediverse
diversespecie
specie
cane gatto
esca lupo
gatto passeri
lupo passeri
anatra anatra
cane esca
piccioni piccioni
suino suino
Totale Totale
Alfa-cloralosio
e
associazioni
con
cumarinici
Alfa-cloralosio e associazioni con cumarinici e pesticidi
5
2
10
15
e pesticidi
5
2
10
15
Pesticidi organoclorurati
1
12
13
Pesticidi organoclorurati
1
12
13
anticoagulanti cumarinici
8
34
9
46
1
1
7
1
107
anticoagulanti cumarinici
8
34
9
46
1
1
7
1
107
anticoagulanti cumarinici + indandionici
1
1
anticoagulanti cumarinici + indandionici
1
1
anticoagulanti cumarinici + metaldeide
1
1
2
anticoagulanti cumarinici + metaldeide
1
1
2
anticoagulanti cumarinici + stricnina
1
1
anticoagulanti cumarinici + stricnina
1
1
anticoagulanti cumarinici + organofosforati
1
5
1
7
anticoagulanti cumarinici + organofosforati
1
5
1
7
organofosforati
3
1
4
organofosforati
3
1
4
organofosforati, carbammati
1
1
organofosforati, carbammati
1
1
organofosforati, metaldeide
1
1
organofosforati, metaldeide
1
1
anticoagulanti indandionici
1
1
anticoagulanti indandionici
1
1
inibitori citocromo ossidasi, carbammati
1
1
inibitori citocromo ossidasi, carbammati
1
1
metaldeide
1
1
2
metaldeide
1
1
2
carbammati
2
2
carbammati
2
2
permetrina
1
1
permetrina
1
1
stricnina
1
1
stricnina
1
1
Totale complessivo
8
40
42
52
1
1
17
1
162
Totale complessivo
8
40
42
52
1
1
17
1
162
Cartina 2: sostanze identificate in provincia di Savona
Cartina 1: sostanze identificate in provincia di Imperia
Cartina 3: sostanze identificate in provincia di Genova
Cartina 4: sostanze identificate in provincia di La Spezia
Legenda cartine:
organoclorurati
alfa-cloralosio
cumarinici
carbammati
metaldeide
stricnina
permetrina
231
SCHMALLENBERG: MODALITA’ DI GESTIONE E DESCRIZIONE DELLA CASISTICA
IN REGIONE PIEMONTE
D’Errico V.1, Grattarola C.1, Giorgi I.1, Perosino M.1, Zoppi S.1, Monaco F.2, Dondo A.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino
Centro di Referenza Nazionale per lo studio delle Malattie Esotiche (CESME), Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo
e del Molise, Teramo
1
2
Key words: schmallenberg, abortion, Piedmont
ABSTRACT
Schmallenberg virus (SBV) is a novel Orthobunyavirus
recently associated with disease in ruminants (cattle,
sheep and goats) in Europe, including Italy. The
infection causes transient and mild clinical forms in adult
cattle and congenital malformation in newborn. The aim of this work is to report and analyze SBV cases in
the Piedmont Region. We detected the same pathological
findings already reported in other European outbreaks
(skeletal deviation, cerebellum hypoplasia) and the infected
herds were characterized by transhumance habits, active
trading with other herds or located in area already scenario
of Bluetongue outbreaks.
INTRODUZIONE
Il virus di Schmallenberg (SBV) è stato identificato per la
prima volta nell’autunno del 2011 in Germania, in alcuni
bovini con sintomatologia aspecifica. Le prime informazioni
sul genoma virale hanno permesso di collocare questo
nuovo agente eziologico nel sierogruppo Simbu, famiglia
Bunyaviridae, genere Orthobunyavirus (4).
Da allora un numero sempre crescente di Paesi europei
è stato interessato dalla circolazione virale (1). In Italia il
primo caso si è verificato in Veneto, in un feto caprino, a
febbraio 2012, e successivamente nell’autunno dello stesso
anno numerose aziende sarde di ovini hanno confermato la
presenza di SBV.
Il virus colpisce i ruminanti causando negli animali adulti
sintomi aspecifici quali ipertermia, abbattimento, anoressia,
calo della produzione lattea e diarrea, con guarigione
nell’arco di pochi giorni, e disturbi della sfera riproduttiva
quali aborti, natimortalità e malformazioni fetali.
Alla luce delle attuali conoscenze, l’infezione da virus di
Schmallenberg sembra avvenire per trasmissione verticale
transplacentare e per trasmissione indiretta da vettori del
genere Culicoides.
La gestione di caso sospetto/caso confermato e le attività
straordinarie e temporanee di controllo di SBV sul territorio
nazionale sono regolate dalla Nota Ministeriale DGSAF.
III/6764 del 4/4/2012, integrate, per la Regione Piemonte, da
specifiche indicazioni contenute nella Nota Regionale 1966/
DB2017 del 18/4/2012. Tali disposizioni sono strettamente
collegate e vanno a integrare il piano di sorveglianza sugli
aborti, attivo sul territorio piemontese, applicato in tutti gli
allevamenti bovini e di piccoli ruminanti. Questa attività
consolidata ha un duplice obiettivo: ottemperare ad un
requisito legato a territorio ufficialmente indenne da brucellosi
e consentire un monitoraggio sulle principali cause di aborto
infettivo, partendo dal presupposto che l’aborto ha un peso
notevole per l’economia aziendale e può avere importanti
In tutti i soggetti erano presenti artrogrifosi anteriore e posteriore
e deviazione del rachide (figura 1 e 2). In 4 su 6 si è rilevata
un’alterazione macroscopica a livello cerebellare (anomalia
nella morfologia e/o nella dimensione).
In due feti su 6, erano presenti malformazioni della scatola
cranica; in particolare, in un caso, sono state osservate
esostosi a livello del distretto cerebellare. In uno (feto ovino),
si evidenziava inoltre ipoplasia cerebrale e lissencefalia, come
illustrato in figura 3.
Figura 1- artrogrifosi in feto bovino
ripercussioni sulla Sanità Pubblica (2).
Il presente lavoro vuole descrivere i casi sospetti e
confermati di SBV pervenuti nel periodo 2012- agosto 2013
presso i Laboratori di Diagnostica Generale dell’Istituto
Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle
d’Aosta, sede di Torino (IZS PLV).
MATERIALI E METODI
Nel periodo dal 2012 ad agosto 2013, la Diagnostica Generale
dell’IZS PLV ha esaminato complessivamente 146 feti nel
2012 (109 bovini e 37 piccoli ruminanti) e 84 feti nel 2013
(64 bovini e 20 piccoli ruminanti). Nel periodo considerato,
complessivamente sono pervenuti 10 feti con sospetto SBV
(2 feti bovini e 4 feti ovini nel 2012 e 3 feti bovini e uno di
ovino nel 2013). Il sospetto è stato formulato per anamnesi
aziendale riferibile ad aborti ricorrenti con presenza di
malformazioni fetali. In un caso erano stati osservati, inoltre,
fenomeni di diarrea in animali adulti. Oltre all’applicazione
del protocollo diagnostico differenziale standardizzato, in
uso presso l’IZSPLV, per valutare l’eventuale presenza
d’infezione da SBV campioni di milza e SNC di tutti i feti sono
stati inviati al Centro di Referenza Nazionale per lo studio
delle Malattie Esotiche (CESME), presso l’IZS dell’Abruzzo
e del Molise, per diagnosi diretta con PCR Real Time; in
parallelo sono stati inviati campioni di siero e sangue intero
della madre, per la ricerca di anticorpi specifici con sieroneutralizzazione (SN).
Delle 9 aziende controllate per sospetto SBV, in quattro
l’infezione è stata confermata sierologicamente (positività
anticorpale con titoli da 1:16 a 1:128) e in una invece la
conferma è avvenuta sia con positività in RT-PCR (da SNC
di 2 feti ovini di gravidanza gemellare), sia sierologicamente
(titolo anticorpale della madre 1:16). Le lesioni anatomopatologiche riscontrate sui 6 soggetti coinvolti sono riportate
in tabella 1.
Tabella 1- Descrizione tipologia di lesione, numero di
feti con lesione e relativa percentuale
232
Lesione anatomo-patologica
Artrogrifosi
Deviazione rachide
Ipoplasia/agenesia cerebellare
Malformazioni scatola cranica e ossa testa
Ipoplasia cerebrale
n° feti con
lesione
% feti con
lesione
6
6
4
2
1
100%
100%
67%
33%
16%
Figura 2- feto ovino con deviazione del rachide
Figura 3- ipoplasia cerebrale e lissencefalia in feto ovino
Le lesioni descritte sono risultate in linea con quelle riportate in
altri Paesi europei (3).
Due dei feti di SBV provenivano da allevamenti che effettuavano
pascolo vagante e quindi sono da considerarsi a più alto rischio
di contatto con vettori infetti.
Le aziende in cui si sono verificati i restanti casi di positività
sono risultate concentrate nella provincia di Cuneo. Quest’area,
a elevata densità zootecnica, è caratterizzata da continui
scambi commerciali di animali con la Francia (Paese dove è
stata accertata elevata circolazione virale SBV) e la particolare
conformazione del territorio, come già dimostrato dalle
mappe del rischio elaborate per l’infezione da Blue Tongue
(5), costituisce un habitat ideale per la sopravvivenza dei
Culicoides, responsabili della trasmissione virale.
Gli eventi abortivi ascrivibili a SBV sono risultati distribuiti
temporalmente in due ondate successive, in inverno 2012 e in
primavera 2013; ciò confermerebbe l’ipotesi che la circolazione
virale, nel nostro territorio, sia avvenuta in estate e in tardo
autunno.
Dei rimanenti 4 casi sospetti SBV non confermati per
Schmallenberg virus dal CdR, in tre gli aborti, grazie
all’applicazione del protocollo differenziale, sono risultati
attribuibili ad altre cause (infezione da Listeria monocytogenes,
Chlamydophila abortus e ontogenesi con malformazione
cardiaca) ; nel restante caso (feto ovino abortito all’inizio del
2012) gli accertamenti sono invece risultati negativi a tutti gli
esami eseguiti per la ricerca di agenti abortigeni.
A seguito delle prime segnalazioni sul territorio nazionale
(Veneto e Sardegna) dall’inizio del 2012, i risultati descritti
nel presente lavoro hanno confermato la circolazione di SBV
anche in Piemonte nel 2012 e nel 2013.
Considerando che solo nel 30-40% dei casi è possibile
individuare la reale causa di aborto, per migliorare le
performance diagnostiche, è importante inserire nei protocolli
diagnostici gli approfondimenti per SBV, ogni volta che
anamnesi e/o riscontro di lesioni anatomo-patologiche facciano
ipotizzare un sospetto coinvolgimento di Orthobunyavirus.
Una efficiente diagnosi di laboratorio integrata all’intervento
dei servizi veterinari del territorio ricoprono infatti un ruolo
determinante per la realizzazione di un robusto sistema di
sorveglianza volto al controllo di malattie di vecchia e nuova
insorgenza.
BIBLIOGRAFIA
1. EFSA, 2013,”Schmallenberg” virus: analysis of the
epidemiological data 4erfdcv (May 2013)
2. Giorgi I., Grattarola C., Goria M., Garrone A., D’Errico
V., Perosino M., Zoppi S., Dondo A.,2012, Indagine sulle
cause infettive di aborto nei bovini in Piemonte, XIV
Congresso Nazionale SiDiLV, Sorrento
3. Herder V., Wohlsein P, Peters M, Hansmann F,
Maumgartner W, Vet Pathol, 2012, Salient lesions in
domestic ruminants infected with the emerging socalled Schmallenberg virus in Germany, Vet Pathol,
Jul;49(4):588-91
4. Bernd Hoffmann, Matthias Scheuch, Dirk Höper, Ralf
Jungblut, Mark Holsteg, Horst Schirrmeier, Michael
Eschbaumer, Katja V. Goller, Kerstin Wernike, Melina
Fischer, Angele Breithaupt, Thomas C. Mettenleiter,
and Martin Beer Novel, 2011, Orthobunyavirus in Cattle,
Europe, Em. Inf. Dis., Volume 18, Number 3—March
2012
5. Radaelli M.C., Chiavacci L., Barbaro A., Travaglio S.,
Masoero L., Accorsi A., Goria M., Monnier M., Vitale N.,
2009, Fattori di rischio per la distribuzione di Culicoides
spp. in Piemonte e relazione con le positività per Blue
Tongue sierotipo 8, XI Congresso Nazionale S.I.Di.L.V. Parma, 30 Settembre - 2 Ottobre 2009.
233
INDAGINE PRELIMINARE SULLA PRESENZA DI PROTOTHECA SPP. IN ALLEVAMENTI
BOVINI DELLA REGIONE VALLE D’AOSTA
Figura 1: distribuzione degli allevamenti bovini la latte
selezionati per la ricerca di Prototheca spp. nella regione Valle
d’Aosta
Dezzutto D.1, Bergagna S.1 , Gennero M.S.1 , Rosa R.1 , Vitale N.1 , Orusa R.1 , Vevey M.2 ,
Ruffier M.3 , Barbero R.1 , Domenis L. 1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta -Torino
ANA.Bo.Ra.Va. - Associazione Nazionale Allevatori Bovini di Razza Valdostana ~ Aosta
3
Regione Autonoma valle d’Aosta - Assesorato alla Sanità, salute e politiche socali ~ Aosta
1
2
Key words: Prototheca spp., mastiti, Valle d’Aosta
ABSTRACT
Prototheca species is a colorless unicellular microorganism
thought to be an achloric mutant of the green algae of the
genus Chlorella.
In the present study, 853 milk samples collected from 59 dairy
herds located in the Valle d’Aosta Region were analyzed for
the presence of Prototheca spp. All samples were cultured
on PIM at 37°C and analyzed after 48 and 72h. Analysis
detected the absence of Prototheca spp. in all herds tested.
The data obtained showed that the climate could be the
cause of the absence of Prototheca in Valle d’Aosta region.
In fact, during summer period animals are brought in high
mountains in pastures where the climate is more cool and
dry. Also farming conditions aren’t suitable for growth and
development of Prototheca. In fact, housing areas during the
winter period do not have external enclosures where mud
puddles are, frequently, the most important reservoir of this
algae.
INTRODUZIONE
La mastite bovina sostenuta dalla microalga Prototheca è
stata descritta per la prima volta da Lerche nel 1952 (6);
da allora è stata segnalata in innumerevoli parti del mondo.
Attualmente, nell’ambito del genere Prototheca, vengono
riconosciute 5 diverse specie: P. Zopfii (gen 1 e 2), P.
winckerhamii, P. blaschkeae, P. stagnora e P. Ulmea (1,8).
Gli isolamenti nelle bovine da latte sono spesso riconducibili
a P.zopfii e, più raramente, a P. Wickerhamii (6).
Prototheca è una microalga unicellulare eterotrofa,
filogeneticamente correlata al genere Chlorella; immobile,
priva di attività fotosintetica, a riproduzione asessuata,
spesso associata ad aree umide e paludose dove vive allo
stato saprofitico.
È stato spesso isolata anche in acque di fiume, acque
stagnanti, serbatoi di acqua, acque di scolo degli insilati
e nel letame. Nell’allevamento bovino può trovare habitat
favorevoli a livello di impianto di mungitura (guaine, tettarelle),
cute del capezzolo, mangiatoie, alimenti (mangimi, foraggi,
insilati), feci, foraggi, lettiere e liquami di percolazione (1,3).
L’infezione mammaria, nell’allevamento da latte, è spesso
associata ad una prolungata esposizione degli animali a
sorgenti di acqua contaminata all’interno dell’allevamento
(3). L’esordio della malattia generalmente è asintomatico
o sub-clinico, accompagnato solo dall’innalzamento del
valore delle cellule somatiche (1). Solo con il progredire
dell’infezione è possibile rilevare una compromissione del
parenchima ghiandolare a cui fa seguito lo sviluppo di segni
clinici tipici di una mastite cronico evolutiva. Pertanto, la
diagnosi di mastite da Prototheca, impossibile da un punto
di vista clinico, richiede il supporto di esami di laboratorio.
Negli ultimi anni risultano sempre più frequenti le segnalazioni
di malattia ad alta prevalenza in aree geografiche temperate
con clima di tipo continentale (5). La diffusione delle
infezioni mammarie da Prototheca spp è testimoniata, anche
nel nostro Paese, da numerose segnalazioni (2,3,10) a
conferma del fatto che il tipo di management aziendale e il
clima sono favorevoli alla diffusione dell’alga nell’ambiente.
Scopo del seguente lavoro è presentare i dati relativi alla
presenza di Prototheca spp. negli allevamenti bovini da latte
della regione Valle d’Aosta.
MATERIALI E METODI
Lo studio è stato effettuato nel periodo compreso tra
Febbraio e Luglio 2013. In totale sono stati analizzati per la
ricerca di Prototheca spp. 853 campioni di latte individuale
(pool proveniente dai quattro quarti mammari) prelevati in
59 allevamenti valdostani selezionati per la presenza di
problematiche sanitarie legate al comparto mammario.
L’analisi, eseguita in parallelo con la ricerca di mastidogeni
contagiosi (Streptococcus agalactiae e Staphylococcus
aureus) e ambientali più comuni (streptococchi, stafilococchi,
etc.), è stata eseguita inoculando, dopo opportuna agitazione
del campione, 0,01 ml di latte su PIM (Prototheca isolation
Medium), un terreno colturale selettivo, specifico per
Prototheca (9). Il PIM presenta un’ottima soglia di rilevabilità
(2ufc/ml di latte), consentendo di evidenziare bassi livelli di
escrezione di Prototheca, anche in presenza di un’eventuale
contaminazione da flora microbica aspecifica conseguente
ad un’ inadeguata asepsi del campione (1).
Successivamente all’inoculo, le piastre sono state poste in
condizioni di aerobiosi a 37°C ed esaminate dopo 48h e 72h
di incubazione. Terminato tale periodo, le colonie cresciute
sulle piastre sono state osservate al microscopio ottico per
valutarne la morfologia e quindi sottoposte a colorazione di
Gram. In caso di rilevamento di colonie sospette, il laboratorio
ha previsto l’identificazione di conferma mediante tecniche
biomolecolari.
Nessuna delle stalle analizzate è risultata positiva per
Prototheca spp.. Le cause degli inconvenienti sanitari
osservati nelle aziende è stata in genere ascritta alla
presenza di mastidogeni contagiosi e in minor misura a batteri
ambientali (streptococchi e stafilococchi coagulasi negativi);
come già evidenziato in precedenti lavori (4), anche in questo
caso Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus
si confermano come i principali agenti eziologici di mastite
bovina nel territorio regionale.
Per quanta riguarda il risultato favorevole riguardante
l’assenza di Prototheca spp., si potrebbe ottenere una possibile
spiegazione integrando gli aspetti epidemiologici di questa
specifica infezione con le peculiari caratteristiche sia del
clima locale sia dei sistemi di allevamento utilizzati in ambito
regionale. Come riferito da Janosi et al. (2001), la stagione
sembra costituire un importante fattore condizionante: nelle
zone temperate, infatti, la maggior incidenza di infezione si
riscontra nei mesi caldi: l’estate più breve e le temperature
meno elevate, caratteristiche delle zone montane, potrebbero
dunque rappresentare un fattore sfavorevole per la
proliferazione e diffusione dell’alga.
Per quanto riguarda il tipo di allevamento, in genere le
stalle valdostane non presentano aree esterne di esercizio,
caratterizzate da terreno umido, ristagno di liquami e pozze
d’acqua, condizioni che, come accennato nell’introduzione,
contribuiscono alla persistenza di Prototheca nell’ambiente. In
secondo luogo, durante i mesi caldi, ovvero proprio quelli che
potrebbero favorire la diffusione dell’infezione all’interno delle
stalle, i bovini vengono portati in alpeggio dove, per gran parte
della giornata, hanno la possibilità di pascolare all’aperto, su
prati drenati e privi di grosse concentrazioni di deiezioni.
BIBLIOGRAFIA
Arrigoni N., Belletti G. L., Cammi G., Garbarino C.,
(1)
Ricchi M. (2010) Mastite bovina da Prototheca. Lar. An. Rew.
16: 39-43.
(2)
Bertocchi L., Arrigoni N., Bolzoni G., Marchi V.,
Bronzo V., Varisco G. (2007) Prototheca zopfii intramammary
infections control in a high prevalence herd: preliminary results.
46th National Mastitis Council Meeting, Texas: 228-229
(3)
Buzzini P., Turchetti B., Facelli R., Baudino R.,
Cavarero F., Mattalia L., Mosso P. Martini A. (2004) First largescale isolation of Prototheca zopfii from milk produced by dairy
herds in Italy. Mycopathologia, 158: 427-430.
(4)
Domenis L., Doglione L., Orusa R., Gallina S., Bianchi
M., Vevey M., Vitale N., Dezzutto D., Gennero S., Bergagna S.
(2012) Agenti mastidogeni del bovino in Valle d’Aosta: risultati
del piano di monitoraggiocondotto nel triennio 2009-2011. XIV
Congresso Nazionale S.I.Di.L.V., Sorrento. 263-265.
(5)
Janosi S., Szigeti G., Ratz F., Lauco T., Kerenyi J.,
Tenk M., Katona F., Huszenicza A., Kulcsar M., Huszenica
G. (2001) - Prototheca zopfii mastitis in dairy hers under
continental climatic conditions. Vet. Quart., 23: 80-83.
(6)
Janosi S., Ratz F., Szigeti G., Kulcsar M., Kerenyi
J. Lauko T., Katona F. (2001) Review of the microbiological,
pathological, and clinical aspects of bovine mastitis caused by
the alga Prototheca zopfii. The vet. Quart., 23,2: 58-61.
(7)
Lerche M. (1952) Eine durch algen (Prototheca)
hervorgerufene mastitis der kuh. Berl. Tierarztl. Wschr., 65:
64-69.
(8)
Pore S. (1985) Prototheca taxonomy. Mycopathologia;
90: 187-189.
(9)
Pore S.R., Shahan T.A., Pore M.D., Blauwiekel R.
(1987). Occurrence of Prototheca zopfii, a mastitis pathogen,
in milk. Vet. Microbiol. 15, 315-323.
Rosignoli C., Nigrelli A.D., Franzini G., Nardi M.,
(10)
Guizzardi S., Bottoli E., Favalli F. (2006) - Indagine preliminare
sulla presenza ambientale di Prototheca zopfii in allevamenti
di bovine da latte. Buiatria. Journal of the Italian Association for
Buiatrics, 2:45-53.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Come illustrato in Figura 1, gli allevamenti contemplati nel
monitoraggio sono distribuiti, in maniera piuttosto omogenea,
lungo il fondovalle della regione.
234
235
PRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI
ANTI-IMMUNOGLOBULINE EQUINE PER LA DIAGNOSI DELLE MALATTIE
INFETTIVE DEGLI EQUIDI
Di Febo T., Luciani M., Ciarelli A., Bortone G., Di Pancrazio C., Rodomonti D., Teodori L., Tittarelli M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise “G. Caporale”, Via Campo Boario – 64100 Teramo
Key words: monoclonal antibodies, horse immunoglobulins, equine diseases
SUMMARY
Monoclonal antibodies (MAbs) against horse IgG were produced
by fusion of Sp2/O-Ag-14 mouse myeloma cells with spleen
cells of Balb/c mice immunized with purified horse IgG. Twentyone MAbs that showed a strong reaction with horse IgG were
characterized in indirect ELISA with purified immunoglobulins
from donkey, cow, buffalo, sheep, pig and chicken. Three
(1B10C9, 1B10C10 and 1B10E9) out of 21 MAbs reacted
only with horse and donkey IgG and IgM; characterization
by western blotting indicate that these 3 MAbs recognized
the Fc fragment of equine IgG. Among the 3 MAbs selected,
MAb 1B10E9 was used to develop a chemiluminescent
immunoblotting test for the diagnosis of dourine and an indirect
immunofluorescence assay (IFA) for the diagnosis of African
horse sickness (AHS). MAb 1B10E9 was also employed in IFA
for the diagnosis of dourine to evaluate its possible use as a
substitute of commercially available polyclonal anti-horse IgGFITC conjugated, currently used for diagnosis.
INTRODUZIONE
La maggior parte dei test utilizzati nella diagnosi delle malattie
infettive degli equidi prevede l’uso di anticorpi policlonali (PAb)
come anticorpi secondari (1, 4, 5, 6). Tuttavia i PAb possono
presentare reazioni aspecifiche che comportano un aumento
anche notevole del background nei test immunologici ed
eterogeneità tra i lotti prodotti, dovuta alla variabilità della
risposta immunitaria degli animali in cui viene prodotto il siero
policlonale. Scopo del presente lavoro è stato la produzione
e caratterizzazione di anticorpi monoclonali (MAb) anti-IgG
equine da utilizzare nella diagnostica delle malattie infettive
degli equidi in sostituzione dei Pab, sia in test già in uso che in
test da sviluppare.
Prove sierologiche
Il MAb-HRP è stato testato nell’immunoblotting test in
chemiluminescenza (cIB) sviluppato per studiare i pattern
antigenici riconosciuti dagli anticorpi presenti nei sieri di cavalli
naturalmente e sperimentalmente infetti da Trypanosoma
equiperdum (3), utilizzando 500 sieri equini negativi per dourine
(FdC < 1:80) e 15 sieri positivi (FdC > 1:80). Il MAb-FITC è stato
testato in immunofluorescenza indiretta (IFI) nella diagnosi di
dourine (5) e nello sviluppo di una IFI per la diagnosi di AHS,
utilizzando vetrini preparati con un monostrato di cellule Vero
infettate con il virus AHS sierotipo 9 (10 7,01 TCID50/ml).
Dalla fusione cellulare degli splenociti murini con le cellule di
mieloma sono stati ottenuti 21 cloni con densità ottica in ELISA
indiretta maggiore o uguale a 2.000. Diciotto dei 21 cloni crossreagiscono con le IgG e le IgM di specie diverse dagli equidi
(bovino, bufalo, pecora e maiale), mentre tre cloni (1B10C9,
1B10C10 e 1B10E9) reagiscono solo con le IgG e le IgM di
cavallo e asino. Questi ultimi 3 MAb hanno isotipo IgG2a,
catena leggera κ. I 3 MAb, caratterizzati in immunoblotting,
reagiscono con la catena pesante (50 kDa) e con una banda
di 80 kDa delle IgG equine intere, mentre reagiscono con il
frammento Fc (30 kDa) nel caso delle IgG digerite con papaina
(Figura 1).
Dai dati ottenuti utilizzando il MAb 1B10E9-HRP nel cIB con
i sieri equini negativi e i sieri positivi per dourine risulta che il
metodo sviluppato permette di discriminare tra animali sani e
animali infetti, nei quali sono presenti bande di peso molecolare
compreso tra 16 e 35 kDa non presenti negli individui sani
(Figura 2). Il cIB permette anche di studiare la cinetica
della risposta umorale nei cavalli a seguito di infezione con
Trypanosoma equiperdum come mostrato nella Figura 3, in cui
si evidenzia la comparsa nel tempo di bande a peso inferiore
di 37 kDa.
Figura 2 – cIB-dourine: sieri negativi (1-5) e sieri positivi (6-10)
Figura 5 – IFI-AHS
Figura 3 – cIB-dourine: andamento anticorpale in un cavallo
infettato sperimentalmente con T. equiperdum
.…..
(DBI: days before infection; DPI: days post infection)
Dai dati ottenuti risulta che il MAb 1B10E9 anti-IgG equine può
essere utilizzato in diagnostica, sia per lo sviluppo di nuovi metodi
sia per il miglioramento di metodi già in uso che prevedono
l’utilizzo di PAb anti-IgG equine. I MAb infatti hanno maggiore
specificità per l’antigene rispetto ai PAb e non presentano
cross-reazioni e variabilità tra lotti. Il presente lavoro costituisce
uno studio di fattibilità dell’uso di uno dei MAb prodotti nello
sviluppo di nuovi test diagnostici e nel miglioramento di test già
in uso; tali metodi saranno successivamente validati secondo
le indicazioni dell’OIE (7).
Figura 1 - Immunoblotting MAbs vs IgG equine
1A: IgG intere con MAb 1B10C9; 1B: IgG digerite con papaina
con MAb 1B10C9; 2A: IgG intere con MAb 1B10C10, 2B: IgG
digerite con papaina con MAb 1B10C10; 3A: IgG intere con
MAb 1B10E9; 3B: IgG digerite con papaina con MAb 1B10E9.
MATERIALI E METODI
Produzione e caratterizzazione MAbs
Topi Balb/c sono stati inoculati per via intraperitoneale con
IgG equine purificate e diluite in adiuvante di Freund. Dopo
l’eutanasia dei topi, gli splenociti sono stati fusi con cellule di
mieloma murino della linea Sp2/O-Ag-14 (ATCC) e gli ibridomi
secernenti anticorpi verso le IgG equine sono stati clonati
secondo il metodo delle diluizioni limite (2). I MAb sono stati
isotipizzati e le loro cross-reattività verso le IgG e le IgM di
altre specie (asino, bovino, bufalo, pecora e maiale) sono
state determinate in ELISA indiretta. Inoltre i MAb sono stati
caratterizzati in immunoblotting utilizzando come antigene IgG
equine intere ed IgG digerite con papaina alla concentrazione
di 0.1 mg/ml.
Purificazione e coniugazione MAbs
Uno dei MAb, purificato mediante cromatografia d’affinità con
proteina A, è stato coniugato con perossidasi di rafano (HRP) e
con isotiocianato di fluoresceina (FITC).
236
Figura 4 – IFI-dourine: confronto tra il MAb 1B10E9 ed un
anticorpo secondario commerciale
Il MAb 1B10E9-FITC utilizzato nei test IFI-dourine e IFI-AHS
permette un’ottima discriminazione tra i sieri positivi ed i sieri
negativi e non presenta reazioni aspecifiche con l’antigene
legato ai vetrini (assenza di background) (Figure 4, 5) come
avviene invece per il PAb commerciale nel caso della IFI
dourine (Figura 4)
BIBLIOGRAFIA
1.Clausen P.H., Chuluun S., Sodnomdarjaa R., Greiner M.,
Noeckler K., Staak C., Zessin K.H., Schein E., 2003. A
field study to estimate the prevalence of Trypanosoma
equiperdum in Mongolian horses. Vet. Parasitol., 115:
9-18.
2.Luciani M., Armillotta G., Magliulo M., Portanti O., Di Febo
T., Di Giannatale E., Roda A., Lelli R. 2006. Production
and characterisation of monoclonal antibodies specific for
Escherichia coli O157:H7. Vet. Ital., 42 (3),173-182.
3.Luciani M., Di Pancrazio C., Di Febo T., Tittarelli M., Podaliri
Vulpiani M., Puglielli M.O., Naessens J., Sacchini F. 2013. IgG
antibodies from dourine infected horses identify a distinctive
Trypanosoma equiperdum antigenic pattern of low
molecular weight molecules. Vet. Immunol. Immunopathol.,
151: 140-146.
237
4.Toledo Piza A.S., Pereira A.R., Terreran M.T., Mozzer
O., Tanuri A., Brandão P.E., Richtzenhain L.J. 2007.
Serodiagnosis of equine infectious anemia by agar gel
immunodiffusion and ELISA using a recombinant p26 viral
protein expressed in Escherichia coli as antigen. Prev.
Vet. Med., 78: 239-245.
5.World Organisation of Animal Health (Office International
des Épizooties: OIE) 2008. Dourine. In: Manual of diagnostic
tests and vaccines for terrestrial animals, OIE, Paris, 845851.
ESPRESSIONE DELL’ENZIMA 5-LOX NEL CERVELLO DI STENELLE STRIATE
(STENELLA COERULEOALBA) SPIAGGIATE E CON O SENZA
(MENINGO)-ENCEFALITI DI NATURA INFETTIVA
6.World Organisation of Animal Health (Office International des
Épizooties: OIE). 2012. African horse sickness. In: Manual
of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, OIE,
Paris, 1-12.
7.World Organisation for Animal Health (Office International des
Épizooties: OIE) 2013. Principles and methods of validation
of diagnostic assays for infectious diseases. In Manual of
diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. OIE,
Paris, 1-16.
Di Guardo G.1*, Di Francesco A.1, Falconi A.1, Baffoni M.1, Di Francesco C.E.1, Marsilio F.1,
Mazzariol S.2, Centelleghe C.2, Casalone C.3, Mignone W.4, Cocumelli C.5, Eleni C.5, Petrella A.6,
Troiano P.6, Marsili L.7, Maccarrone M.8, Giacominelli-Stuffler R.1
2
1
Facoltà di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Teramo, Teramo;
Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione, Università degli Studi di Padova, Agripolis, Legnaro (Padova);
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale (IZS) del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino;
4
IZS del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Imperia;
5
IZS delle Regioni Lazio e Toscana, Roma;
6
IZS della Puglia e della Basilicata, Foggia;
7
Dipartimento di Scienze Fisiche, della Terra e dell’Ambiente, Università degli Studi di Siena, Siena;
8
Università Campus Bio-Medico di Roma, Roma;
*Indirizzo per corrispondenza: [email protected].
Key words: Striped dolphin, neuropathology, stranded cetaceans.
ABSTRACT
We report herein the Western-blot (WB) characterization of
the expression of 5-lipoxygenase (5-LOX) enzyme in the brain
from 8 striped dolphins, 2 of which with no evidence of central
neuropathies and the remaining 6 ones either with Dolphin
Morbillivirus-, Toxoplasma gondii-, or Brucella ceti-associated
(meningo)-encephalitis. All the 6 animals with (meningo)encephalitis showed a more pronounced intensity of 5-LOX
bands than that of the 2 dolphins without brain lesions, the most
prominent band intensity being detected in the B. ceti-infected
animal. The higher expression of 5-LOX in the striped dophins
with infectious (meningo)-encephalitis is of interest, since
5-LOX is considered a putative neurodegeneration marker in
humans and in experimental animal models.
INTRODUZIONE
Dolphin Morbillivirus (DMV) è considerato, unitamente a
Toxoplasma gondii e a Brucella ceti, un agente patogeno di
notevole rilevanza per i Cetacei, soprattutto per la specie
Stenella coeruleoalba, un Odontocete pelagico di assai comune
riscontro nel Mediterraneo (2, 3). Nonostante il loro documentato
neurotropismo, scarsissime risultano le informazioni sulla
patogenesi delle lesioni encefaliche indotte dai succitati agenti,
ivi comprese le popolazioni cellulari, neuronali e non, coinvolte
nell’infezione ed i meccanismi molecolari responsabili del
danno cerebrale.
MATERIALI E METODI
Scopo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare,
mediante la tecnica del Western blot (WB), l’espressione della
5-lipossigenasi (5-LOX) - un enzima-chiave nella patogenesi
delle infezioni dei mammiferi - nel tessuto cerebrale di 8
stenelle striate, 2 delle quali non presentavano alcuna evidenza
morfologica di neuropatie centrali, mentre le rimanenti 6
risultavano affette da encefaliti/meningo-encefaliti di variabile
entità, eziologicamente riconducibili a DMV 1 animale), a T.
gondii (4 animali), oppure a B. ceti (1 animale). Il programma
“ImageJ” è stato utilizzato per l’analisi densitometrica
dell’intensità delle bande ottenute applicando la tecnica del WB.
238
Tutti i 6 individui affetti da encefalite/meningo-encefalite, con
particolare riferimento all’esemplare infetto ad opera di B. ceti,
hanno mostrato un’intensità delle suddette bande di grado più
marcato rispetto ai 2 individui che non presentavano lesioni
cerebrali.
Seppur preliminare, riteniamo comunque interessante il
dato relativo ai maggiori livelli di espressione della 5-LOX
osservati nel cervello di tutte le 6 stenelle con encefalite/
meningo-encefalite. Tale enzima, infatti, è considerato un
“marker” di neurodegenerazione sia nell’uomo che in adeguati
modelli sperimentali animali (1). In conclusione, si sottolinea
l’opportunità di ulteriori studi sull’argomento.
BIBLIOGRAFIA
1. Chu, J., Giannopoulos, P.F., Ceballos-Diaz, C., Golde,
T.E., Pratico, D., 2012. Adeno-associated virus
mediated brain delivery of 5-lipoxygenase modulates
the AD-like phenotype of APP mice. Molecular
Neurodegeneration 7,1.doi:10.1186/1750-1326-7-1.
2. Di Guardo, G., Mazzariol, S., Fernández, A., 2011.
Biologically threatened dolphins and whales.
Environmental Microbiology 13, 2833-2834.
3. Van Bressem, M.-F., Raga, J.-A., Di Guardo, G.,
Jepson, P.D., Duignan, P.J., Siebert, U., Barrett, T.,
Santos, M.C., Moreno, I.B., Siciliano, S., Aguilar,
A., Van Waerebeek, K., 2009. Emerging infectious
diseases in cetaceans worldwide and the possible
role of environmental stressors. Diseases of Aquatic
Organisms 86, 143-157.
Lavoro eseguito nell’ambito del Progetto di Ricerca
“Contaminanti ambientali e relativi effetti sul sistema nervoso
centrale e sul sistema immunitario nei cetacei spiaggiati, le
sentinelle del mare”, finanziato dal Ministero dell’Ambiente e
della Tutela del Territorio e del Mare (Responsabile scientifico:
Prof. Giovanni DI GUARDO).
239
PROFILI DI ANTIBIOTICO-RESISTENZA IN sTAFILOCOCCHI coagulasi positivi
ISOLATI DA MASTITE OVINA IN ALLEVAMENTI SICILIANI: RISULTATI PRELIMINARI
Emanuele M.C., Agnello S., Bosco R., Piraino C., Vicari D., Scatassa L.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Palermo
Keywords: antimicrobial resistance, mastitis, S. aureus
Abstract
Antimicrobial agents are commonly used in dairy farm to
control bacterial infections in lactating sheep. Antimicrobial
resistance of clinical Staphylococcus ( N. 95 S. aureus and N.
3 S. intermedius ) isolated from ovine mastitis and intended to
produce vaccines was investigated by disk diffusion method.
12 antibiotics among those used in livestock were tested. All
the strains were susceptible to vancomycin, enrofloxacin,
gentamycin and cefotaxime. 16 (16,3%) out of 98 strains showed
resistance to two of the antimicrobials tested. The highest
resistance rate was found against penicillin group (37,8%) and
tetraciclyne (21,4%).
The finding of high antibiotic resistance to penicillin and
tetracycline is likely to be related to the selective pressure
exerted by the antimicrobial treatment. Preliminary data on a
monitoring project are reported.
vancomicina (VA 30µg). I controlli di qualità sono stati effettuati
con il ceppo di riferimento S. aureus ATCC® 25923.
A partire da colture pure degli isolati in agar sangue, sono
state preparate le sospensioni in soluzione fisiologica, di
concentrazione pari a 0,5 dello standard McFarland. Le
sospensioni sono state seminate entro 15 minuti tramite l’ausilio
di un tampone sulla superficie di piastre di Mueller-Hinton agar.
Una volta posti i dischetti di antibiotici sulla superficie dell’agar, le
piastre sono state incubate a 35°C±1°C in aerobiosi per 24 ore.
La lettura delle prove è stata eseguita manualmente tramite un
calibro e per l’interpretazione delle misure degli aloni d’inibizione
sono state utilizzate le tabelle del CLSI (2), determinando la
categoria di appartenenza (Sensibile-Intermedio-Resistente).
I ceppi che presentavano aloni d’inibizione borderline ed
espressioni eterogenee di resistenza per l’oxacillina sono stati
testati con i dischetti di cefoxitina (FOX 30µg).
Introduzione
Le mastiti stafilococciche rappresentano dal punto di vista
sanitario ed economico una delle problematiche più insidiose,
sia per le forme acute che per le forme subcliniche, responsabili
di alterazioni quantitative e qualitative della produzione lattea,
con conseguenti ripercussioni a livello della filiera lattierocasearia.
I trattamenti antibiotici sono frequentemente impiegati e
rappresentano un fattore di rischio per l’instaurarsi di resistenze
batteriche multiple, a causa della pressione selettiva esercitata
(1).
Il presente lavoro riporta i dati preliminari di un’indagine sulla
presenza e sulla diffusione di resistenze negli allevamenti ovini
siciliani nei riguardi alcune molecole antibiotiche comunemente
usate in zootecnia.
Risultati e discussione
Tutti gli stipiti sono risultati sensibili alla vancomicina, al
cefotaxime all’enrofloxacina ed alla gentamicina.Le percentuali
di resistenza più elevate, superiori a quelle riportate da altri
Autori (6), sono state riscontrate per le tetracicline (21,4%) e per
le penicilline (37,8%). Il 16% dei ceppi è risultato resistente ad
almeno 2 diversi gruppi di antibiotici, penicilline e tetracicline. E’
stata riscontrata la presenza di resistenza all’eritromicina (4/98),
in associazione con betalattamici e penicillina. (tabella 1).
L’emergenza di tali resistenze potrebbe essere spiegata
considerando l’uso diffuso di altre molecole appartenenti
al gruppo dei macrolidi, come la tilosina, per il controllo
dell’agalassia contagiosa.
Per quanto riguarda l’oxacillina, non sono state rilevate resistenze
fenotipiche, in quanto tutti i ceppi che esibivano resistenza,
spesso con aloni borderline, sono risultati pienamente sensibili
alle prove di conferma. Le frequenze e le tipologie di resistenza
riscontrate sono probabilmente ascrivibili alla pressione selettiva
esercitata dall’impiego diffuso di tetracicline e penicilline negli
allevamenti zootecnici.
Il rischio di diffusione e trasmissione di stipiti multiresistenti
e le conseguenti implicazioni nella sanità pubblica, anche
considerando la possibilità di fallimenti dei trattamenti
terapeutici, richiedono l’attivazione di programmi sistematici
di monitoraggio e sorveglianza dell’antibiotico-resistenza dei
ceppi batterici isolati da animali, al fine di ottenere dati sulla
situazione epidemiologica del territorio siciliano e valutare il
trend di resistenza nel tempo.
La presente indagine è stata realizzata nell’ambito delle fasi
preparatorie del progetto di Ricerca Corrente RC IZS SI 03/2009
(“Trend di antibiotico-resistenza nella filiera lattiero-casearia:
studio dei profili genotipici e fenotipici di stafilococchi coagulasi
positivi e negativi”).
Materiali e Metodi
Sono stati esaminati 98 stipiti (n. 95 Staphylococcus aureus,
e n. 3 S. intermedius) provenienti da latte ovino, tamponi
cutanei e mammari, collezionati negli anni 2002-2004 da 72
aziende delle province AG, CL, EN, PA, TP ed utilizzati per la
preparazione di vaccino stabulogeno.
Dopo l’esame colturale gli isolati sono stati identificati sulla base
della morfologia delle colonie, emolisi, esame microscopico,
test della catalasi, produzione di coagulasi e fermentazione del
mannitolo.
Le prove di sensibilità “in vitro” sono state eseguite con la
metodica della diffusione in agar (Kirby-Bauer), utilizzando i
seguenti antibiotici (Oxoid): amoxicillina/ac clavulanico (AMC
30µg), ampicillina (AMP 10µg), cefotaxime (CTX 30µg),
clindamicina (DA 2µg), enrofloxacina (ENR 5µg), eritromicina
(E 15µg), gentamicina (CN 10µg), ossitetraciclina (OT 30µg),
oxacillina (OX 1µg), penicillina (P 10 UI), tetraciclina (TE 30µg),
240
Bibliografia
1. Aarestrup F.M. (2005) Veterinary drug usage and
antimicrobial resistance in bacteria of animal origin; Basic
Clin Pharmacol Toxicol 96 (4):271-281
2. CLSI 2008- Performance Standards for Antimicrobial
Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated
from Animals; Approved Standard-third edition. CLSI
Document M31-A3, Wayne, Pennsylvania, USA
3. Erskine R.J, Walker R.D., Bolin C.A., Bartlett P.C., While
D.G. (2002) Trends in Antibacterial Susceptibility of
Mastitis Pathogens during a seven-year period. J. Dairy
Sc Ass 85:1111-1118
4. Goni P., Vergara Y., Ruiz J., Albizu I., Vila J., Gomez-Lus
R. (2004)
Antibiotic resistance and epidemiological
typing of Staphylococcus aureus strains from ovine and
rabbit mastitis. Int J Antimicrobial Agents 23:268-272.
5. ITAVARM 2003 - Monitoraggio dell’antibioticoresistenza in
Medicina Veterinaria, primo report, IZS Lazio e Toscana,
Centro di Referenza per l’Antibioticoresistenza
6. Lollai S.A., Ziccheddu M.,Di Mauro C., Manunta D.,
Nudda A., Leori G. (2008) Profile and Evolution of
Antimicrobial Resistance of Ovine Mastitis Pathogens
(1995-2004). Small Rum Res 74: 249-254.
Tabella 1-Dati complessivi ceppi 2002-2004
N. ceppi
R
S
Tot= 98
%R
%S
OX AMP AMC
8
37
14
90
61
84
P
37
61
TE
21
77
8,2 37,8 14,3 37,8 21,4
91,8 62,2 85,7 62,2 78,6
VA
0
98
E
4
94
ENR CN CTX
0
0
0
98
98
98
0 4,1
0
100 95,9 100
241
0
100
OT DA
21
2
77
96
0 21,4
2
100 78,6
98
Determinazione di Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA)
in Molluschi (Mytilus galloprovincialis) e Pesci (Trachurus trachurus)
prelevati nell’area marina di taranto
Esposito M.1, Urbani V. 1, Marigliano L.1, Seccia G.1, Casamassima F.2, Gesualdo G. 2, Mambelli P. 2, Nardelli V.2
2
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, via Salute, 2 - 80055 Portici
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, via Manfredonia, 20 - 71121 Foggia
Keywords: PAHs, mussel, fish
SUMMARY
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous
environmental contaminants classified as carcinogenic.
The Taranto’s sea is one of the most important mussel farming
area in Italy but it is located near a great industrial pole identified
as pollution source. A monitoring study of PAHs was carried out on
mussel and fish samples, coming from Taranto’s sea (Mar Piccolo
and Mar Grande) in the period between 2012-2013.
The PAH concentration was determined by an HPLC-FLD method
and the results were evaluated according to the maximum levels
fixed by EU Commission for food products. Low levels of PAHs
were found in mussel, none exceeding the maximum limits while
in the fish, concentrations were always below the LOQ. The
degree of food contamination in this area resulted very low and as
such also the environmental pollution.
INTRODUZIONE
Gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA) sono composti generati
da processi di combustione incompleta di sostanze organiche
durante lavorazioni industriali e attività civili. Le principali fonti di
questi inquinanti sono il traffico autoveicolare ma anche navale,
i sistemi di riscaldamento domestico e di cottura quali barbecue
e affumicatura, ma il contributo più importante alla diffusione di
IPA è fornito dagli impianti industriali del settore petrolchimico e
siderurgico, dagli impianti di produzione di energia termoelettrica
nonché da processi di incenerimento.
Nell’ambiente, gli IPA risultano principalmente adsorbiti al
particolato atmosferico, per cui sulla base della riconosciuta
attività cancerogena per l’uomo del benzo[a]pirene (BaP) con il
decreto legislativo 3 Agosto 2007, n. 152 sono stati fissati i valori
obiettivo per il benzo[a]pirene (1 ng/m3), riferiti al tenore totale di
inquinante presente nelle polveri PM10 (1).
In considerazione della loro e sulla base dell’azione sinergica
dimostrata (2), l’Agenzia per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha
classificato, come probabili (classe 2A) o possibili (classe 2B)
cancerogeni per l’uomo, alcuni IPA. Pertanto, la Commissione
Europea ha fissato dei tenori massimi per il BaP e per la somma
di quattro IPA in alcuni prodotti alimentari tra cui i molluschi bivalvi
(3).
Riguardo alla loro produzione e diffusione, la zona marina di
Taranto rappresenta un’area di elevato interesse ambientale, per
la presenza di numerose e rilevanti fonti industriali di emissione di
idrocarburi policiclici aromatici, tra cui spicca l’impianto siderurgico
a ciclo integrale più grande d’Europa. L’emissione totale di IPA della
provincia di Taranto è stimata essere circa il 75% dell’emissione
dell’intera regione Puglia e il 23% dell’emissione nazionale
(4). Taranto rappresenta anche una delle più importanti aree di
molluschicoltura in Italia, e quindi la determinazione dei livelli di
IPA nei mitili può costituire un valido sistema sia per la valutazione
dell’inquinamento ambientale che della contaminazione degli
alimenti, a garanzia e tutela della salute dei consumatori.
Pertanto, oltre al monitoraggio ambientale garantito dagli Enti
preposti, gli organismi di controllo hanno avviato un Piano di
Monitoraggio anche per gli alimenti prodotti nell’area citata.
In questo lavoro sono riportati i dati relativi alla determinazione
di sei IPA, tra cui i quattro normati, in prodotti della pesca e mitili
raccolti in alcuni siti dell’area marina di Taranto.
MATERIALI E METODI
L’indagine è stata effettuata su un totale di 39 campioni tra mitili
(Mytilus galloprovincialis) e suri (Trachurus trachurus) prelevati dai
Servizi Veterinari delle ASL di competenza territoriale, nel periodo
compreso fra ottobre 2012 e luglio 2013. I campioni di pesci (n=5)
sono rappresentativi del pescato giornaliero mentre i campioni di
mitili (n=34) sono stati prelevati presso impianti di molluschicoltura,
situati nell’area del golfo di Taranto. In Figura 1 sono evidenziate
le aree di prelievo ossia: Mar Grande Nord Tarantola (14), Mar
Piccolo Secondo Seno (13 ), Mar Grande Sud Tarantola (5), Mar
Grande Lungomare (2), Mar Grande S. Vito (5), ed in parentesi è
indicata la numerosità campionaria.
Figura 1 – Aree di prelievo
Tutti i campioni pervenuti presso l’Istituto Zooprofilattico della Puglia
e Basilicata, sede di Foggia, sono stati sottoposti all’iniziale fase di
pretrattamento e successivamente inviati all’Istituto Zooprofilattico
del Mezzogiorno di Portici, dove sono stati conservati a -20°C fino
all’esecuzione delle analisi.
Per la determinazione degli IPA è stato utilizzato un metodo di
analisi in HPLC con rivelazione in fluorescenza (5), validato
secondo i criteri di performance stabiliti dal Regolamento CE
836/2011 (6) e accreditato dall’Ente Accredia.
Reagenti e materiali di riferimento
I solventi cicloesano, etanolo 98% e acetonitrile (ACN) tutti di
grado HPLC e i reattivi potassio idrossido (KOH) e sodio solfato
anidro (Na2SO4) sono stati forniti dalla Ditta Carlo Erba (Milano,
Italia) mentre l’acqua ultrapura è stata prodotta in laboratorio
mediante un sistema Milli-Q (Millipore Corp., Bedford, MA). La
cartucce Sep-Pak (500 mg/3 ml) Vac Silica sono state fornite dalla
Waters (Milford, MA).
Le soluzioni dei materiali di riferimento di benzo[a]anthracene
(BaA), chrysene (Chr), benzo[b]fluoranthene (BbF), benzo[k]
fluoranthene (BkF), benzo[a]pyrene (BaP), dibenzo[a,h]
242
anthracene (dBahA) standard a 10 µg/ml sono prodotte dalla Ditta
Dr. Ehrenstorfer (Ausburg, Germany). Da queste soluzioni madre,
per diluizione con ACN, è stata preparata la soluzione di lavoro a
0,1 µg/mL dei sei IPA.
Procedimento
Per la saponificazione, a 2 g di campione si aggiungono 10 ml di
KOH 2N in etanolo, e si lasciano in bagnomaria a 80 °C per 2h.
Il campione viene portato a temperatura ambiente, si aggiungono
10 mL di acqua ultrapura e si procede all’estrazione, ripetuta per
tre volte, con l’aggiunta di 20 mL di cicloesano e successivo
passaggio in centrifuga a 3000rcf per 5 minuti a 4°C. Si riuniscono
le fasi organiche (circa 60 ml), e si filtrano su filtro di carta
contenente solfato di sodio anidro. La soluzione si riduce a piccolo
volume (circa 0,2 mL) mediante evaporatore rotante a 40°C. Si
riprende il residuo con 3 mL ACN, si carica su Sep-Pak cartuccia
pre-attivata con 3 mL ACN e si eluisce con 3 mL ACN. L’eluato
viene portato a secco sotto flusso d’azoto alla temperatura di 50°C
e quindi ripreso con 1 mL di ACN.
L’analisi strumentale è stata effettuata utilizzando un sistema
HPLC Waters con rivelatore FLD gestito dal software Empower.
Per la separazione cromatografica è stata utilizzata una
colonna Envirosep PP 125´3.2mm´5µm (Phenomenex), munita
di precolonna C18 e termostatata a T = 25°± 2°C, secondo un
programma di eluizione in gradiente con fase mobile costituita da
Acqua e ACN a un flusso di 0,5 mL/min, con volume di iniezione
di 50 µL.
La rivelazione è stata eseguita in fluorescenza alle lunghezze
d’onda di eccitazione λecc=294nm e di emissione λem=404nm.
La determinazione quantitativa è stata effettuata mediante la
tecnica della standard esterno, allestendo per ciascuna seduta
analitica le rette di taratura mediante soluzioni di materiali di
riferimento degli IPA a concentrazioni comprese fra 0,005 a 0,020
µg/mL.
Validazione
Il metodo sviluppato è stato ottimizzato e validato secondo i criteri
di prestazione previsti dal Regolamento CE 836/2011.
Il limite di quantificazione (LOQ) corrispondente a una
concentrazione di 0,5 µg/kg è stato determinato per ciascun analita
utilizzando un campione esente da contaminazione e fortificato
con la miscela dei sei standard. La precisione del metodo è stata
valutata attraverso il calcolo del coefficiente di Horrat per ciascun
IPA alla concentrazione di 5,0 µg/kg, in condizioni di ripetibilità (r)
e riproducibilità (R).
In particolare, per lo studio di ripetibilità, sono stati analizzati cinque
replicati di bianchi campione a due livelli di fortificazione (2,0 – 5,0
µg/kg), utilizzando la miscela dei sei standard alla concentrazione
di 0,1 µg/mL. Per valutare la riproducibilità intralaboratorio, le
sedute analitiche di precisione sono state eseguite sullo stesso
campione, in giorni diversi, con operatori diversi, con lotti diversi
di solventi e reattivi, in modo che la variabilità dei risultati fosse
influenzata dal maggior numero di fattori possibili.
Per l’accuratezza è stato calcolato il recupero medio per tutti i
singoli IPA analizzati e le relative percentuali di recupero ottenute,
rientrano nell’intervallo di accettabilità previsto dal Reg. 836/2011
(50-120%).
La specificità è stata determinata verificando l’assenza di
interferenti significativi, nell’intervallo di tolleranza massima pari a
± 2,5%, per le tecniche HPLC per i tempi di ritenzione degli analiti.
Le concentrazioni di IPA determinate nei campioni di mitili analizzati
sono riportate in tabella 1, espresse in µg/kg come media, valore
minimo e massimo. I livelli di Benzo[a]pirene sono compresi tra il
valore di LOQ (0,5 µg/kg) e 4,0 µg/kg, valore più alto riscontrato
nel punto Lungomare presso il sito “Mare Grande Nord”. Il BaP
è risultato presente in quasi tutti i campioni di mitili prelevati sia
nella zona Nord che nella zona Sud del Mar Grande, mentre nel
Mar Piccolo i valori riscontrati sono inferiori al LOQ. L’andamento
dei dati conseguiti relativamente agli altri IPA, è sovrapponibile
e confrontabile a quello del BaP. Tra i due IPA attualmente non
normati, ma oggetto ugualmente della nostra indagine, il dBahA è
risultato assente nella quasi totalità dei campioni mentre il BkF è
presente in concentrazioni dello stesso ordine di grandezza degli
altri analiti. In nessun campione di mitili i valori di benzo[a]pirene
e della somma dei quattro IPA, sono risultati superiori ai tenori
massimi fissati.
Media
Mediana
Max
Minimo
B[a]A
Chry
2,8
3,2
4,8
<0,5
2,3
2,1
4,2
<0,5
B[b]
F
1,8
1,9
2,8
<0,5
B[k]
F
1,2
0,8
4,0
<0,5
B[a]P
dbB[ah]A
sum
0,9
1,0
1,2
<0,5
4,2
3,6
12,4
<0,5
2,8
3,2
4,8
<0.5
Tabella 1. Livelli di IPA in µg/kg nei campioni di mitili (n=34)
I valori di IPA e in particolare di BaP riscontrati nei mitili oggetto del
presente lavoro, sono risultati inferiori a quelli riportati da Perugini
(7) su mitili raccolti nel mare Adriatico e confrontabili con quelli
riscontrati da Storelli (8) su campioni di mitili prelevati nell’area
marina di Taranto. Per quanto concerne invece la presenza di IPA
nei pesci, per i quali non esistono limiti normativi, le concentrazioni
rilevate sono tutte inferiori al LOQ, a conferma di una scarsa
contaminazione, attribuibile anche alla rapida metabolizzazione di
tali contaminanti nel pesce fresco, senza conseguente accumulo
nel muscolo.
Al fine di confrontare i risultati conseguiti in questo studio mediante
analisi in HPLC, gli stessi campioni sono stati analizzati anche in
GC-MS/MS, previa purificazione con SPE-MIP. I dati conseguiti
sono il risultato di un’indagine preliminare.
In conclusione, se da un lato i dati ottenuti nel presente
monitoraggio risultano inferiori ai limiti previsti dalle normative
sugli alimenti, dall’altro lato hanno fornito una importante
valutazione dell’inquinamento ambientale da IPA nell’area marina
di Taranto, in quanto le matrici analizzate sono utili bio-indicatori
per monitorare l’ esposizione umana.
BIBLIOGRAFIA
1) Decreto legislativo 3 Agosto 2007, n. 152 (attuazione della
Direttiva 2004/107/CE) G.U. 213 del 13/09/2007
2) Hermann, M. (1981). Synergistic effects of individual polycyclic
aromatic hydrocarbons on the mutagenicity of their mixtures.
Mutation Research, 90(4),399–409.
3) Regolamento della Commissione (EU) 835/2011 del 19
Agosto 2011. Gazzetta Ufficiale dell’Unione Europea L 215/4
del 20/8/2011
4) ISPRA - Emissioni disaggregate a livello regionale, per
macrosettore, per il 1990, 1995, 2000 e 2005: http://www.
sinanet.apat.it/it/inventaria/disaggregazione_prov2005/3
5) Regolamento della Commissione (EU) 836/2011 del 19
Agosto 2011. Gazzetta Ufficiale della Comunità Europea L
215/9 del 20/8/2011
6) Perugini M., Visciano P., Giammarino A., Manera M., Di Nardo
W., Amorena M. 2007 Polycyclic aromatic hydrocarbons in
marine organisms from the Adriatic Sea, Italy. Chemosphere
66: 1904-1910
7) Storelli MM, Marcotrigiano GO. Polycyclic aromatic
hydrocarbons in mussels (Mytilus galloprovincialis) from the
Ionian Sea, Italy. J Food Prot. 2001 Mar;64(3):405-9.
243
APPLICAZIONE DEL TRIAGE IN UN ISTITUTO ZOOPROFILATTICO – ANALISI, ENTRATA
IN PRODUZIONE E RISULTATI PRELIMINARI
Faccenda L., Pecorelli I., Berretta C., Biasini G., Capuccella M., Costarelli S., Olivieri E., Saccoccini R.,
Tonazzini S., Cenci T., Mingolla A.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, Perugia
Key words: triage, laboratorio analisi, Istituti Zooprofilattici
ABSTRACT
At Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle
Marche (IZSUM) emerged the need of a tool with features
similar to the triage, commonly used to sort the patients of first
aid unit and to assign to the samples in the reception a priority
grade different form the time of arrival.
The aim of this work is to describe the different stages that led
to create a decision tree to be used in the reception, to codify
workroom behavior and to start the production of a new function
integrated with the IT system SIGLA 4.0.
In addition, preliminary figures for the first three months of
activity (June - August 2013) will be presented.
INTRODUZIONE
Il triage è un sistema di classificazione del livello di urgenza che
viene comunemente utilizzato per smistare i pazienti del pronto
soccorso ospedalieri ed in tutte quelle situazioni nelle quali non è
possibile trattare simultaneamente un elevato numero di pazienti.
Il grado di urgenza è determinato dai sintomi e dal quadro clinico
del soggetto e classificato con un codice colore assegnato
all’arrivo, dopo una prima valutazione da parte di personale
professionale specificatamente formato allo scopo (1).
Nel 2010 dai laboratori dell’ IZSUM nasceva l’esigenza di avere
a disposizione uno strumento analogo al triage, che permettesse
di attribuire ai campioni in accettazione un livello di priorità
diverso dal semplice ordine di arrivo, determinato dall’ effettiva
urgenza del responso analitico. Questo avrebbe permesso
ai laboratori di conoscere con precisione il livello di urgenza di
qualsiasi campione da analizzare, con conseguente adozione
di comportamenti differenti nell’ordine di esecuzione dell’attività
analitica e maggiore garanzia all’utente di rispetto dei tempi di
risposta. Per realizzare questo strumento era necessario trasferire
la logica del triage in un ambito in cui non era mai stato applicato.
Ciò significava innanzitutto stabilire le modalità di applicazione
ed i criteri per l’assegnazione delle priorità (diagramma di
flusso) e, sulla base di queste, realizzare le modifiche al
sistema informativo sanitario (SIGLA), affinché i campioni
venissero accettati ed analizzati secondo la logica del triage. Per
raggiungere questo obiettivo nel 2011 veniva costituito un gruppo
di lavoro rappresentato da laboratoristi, informatici, responsabili
delle accettazioni, responsabili della qualità e amministratore del
sistema informativo sanitario, coordinati da Direttore Sanitario. Il
presente lavoro ha come obiettivo principale quello di illustrare
le varie fasi che il gruppo di lavoro ha seguito, dall’analisi alla
realizzazione dell’applicativo. Inoltre vengono presentati alcuni
dati preliminari relativi ai primi tre mesi di attività del triage nella
sua versione definitiva.
MATERIALI E METODI
Qui di seguito vengono riportate le 4 fasi che hanno caratterizzato
l’attività svolta.
1 - Valutazione delle esigenze e definizione dei comportamenti
da adottare in accettazione ed in laboratorio: la prima attività
del gruppo di lavoro ha riguardato la stesura del diagramma
decisionale (Fig.1), cioè le indicazioni sulla base delle quali
l’operatore dell’accettazione deve assegnare un codice di priorità.
Contestualmente si è definito il comportamento del laboratorio in
caso di conferimento di campioni con diverso codice di urgenza
(Fig. 2).
2 - Analisi e realizzazione delle modifiche del sistema
informativo SIGLA: sulla base dello studio effettuato nella
prima fase, sono state analizzate le modifiche necessarie da
apportare al sistema informativo SIGLA (2). La Ditta Produttrice
(Krene S.r.l) ha modificato i moduli di accettazione campione
e di presa in carico dell’esame da parte del laboratorio. In
particolare nel modulo di accettazione e assegnazione esami
operatori è stato inserito un radio group colorato per definire le
diverse classi di urgenza: rosso, giallo, verde e bianco (in ordine
di urgenza decrescente). Grazie a questo strumento l’operatore
dell’accettazione, inserendo il codice corretto, attribuisce il codice
di priorità previsto dal diagramma di flusso. Il livello di urgenza del
campione viene anche riportato nel foglio di accompagnamento
dei campioni al laboratorio, sotto forma di bollino del colore
corrispondente al codice di priorità. Inoltre, la registrazione di
una richiesta caratterizzata da un codice giallo o rosso comporta
l’inoltro agli indirizzi dei responsabili di laboratorio di un messaggio
mail di notifica dell’avvenuta accettazione di un campione per il
quale si richiedono esami urgenti. Al fine di agevolare la messa
in produzione dei campioni, in fase di produzione (laboratorio)
nella maschera di assegnazione esami ad operatore è riportato il
codice assegnato e le accettazioni vengono visualizzate in ordine
di priorità.
3 - Fase di sperimentazione e criticità riscontrate: una volta
installate le modifiche necessarie all’applicazione del triage, è
iniziata una fase sperimentale in cui sono state coinvolte tutte le
accettazioni dell’IZSUM e due laboratori della sede centrale (L.
Contaminanti ambientali e L. Sierologia), che per la particolare
natura delle analisi che svolgono potevano essere considerati
laboratori pilota.
Alla fine della fase di sperimentazione le criticità riscontrate
hanno evidenziato:
- errori di attribuzione dei codici di priorità in fase di accettazione:
da ricondursi alla scarsa confidenza con la nuova funzione;
- mancata attribuzione di codici bianchi: il sistema prevedeva
l’attribuzione di default dei codici verdi, mentre per alcuni
campioni (ricerche) il codice corretto è il bianco che consente di
non considerare il tempo massimo di risposta;
- necessità di cambiare la priorità in corso di analisi: quando il
campione che è stato accettato con codice non prioritario diventa
positivo in corso d’opera e necessita di ulteriori determinazioni
analitiche da effettuare in altri laboratori, il responsabile del
laboratorio dovrebbe essere avvertito della nuova urgenza che il
campione ha assunto.
4 - Risoluzione delle criticità ed entrata in produzione del
244
triage modificato: sono state implementate alcune modifiche per
risolvere il problema della mancata attribuzione dei codici bianchi
e per la gestione del campione diventato urgente in corso d’opera.
In particolare è stato aggiunto l’attributo “ricerca” al quesito
diagnostico (motivo del prelievo) in modo che il sistema attribuisca
alle accettazioni registrate con questa tipologia di quesiti il codice
bianco di default. Per le altre accettazioni non urgenti invece, il
codice attribuito automaticamente continua ad essere il verde.
Per quanto riguarda il cambiamento dell’urgenza di un campione
accettato senza priorità, la modifica in SIGLA permette al primo
laboratorista di marcare l’urgenza del campione che deve essere
inviato ad un altro laboratorio. Contestualmente alla marcatura
dell’urgenza, il sistema invia una mail di segnalazione con oggetto
“esami urgenti” al responsabile del laboratorio di destinazione
del campione. Dal 1 giugno 2013, contestualmente all’entrata in
produzione di SIGLA 4.0, le nuove funzionalità del triage vengono
utilizzate nei moduli di accettazione e di produzione.
RISULTATI E CONCLUSIONI: la versione definitiva del triage
è attiva da un periodo troppo limitato per permettere una
valutazione conclusiva della sua reale efficacia. Tuttavia, si
può già affermare che le modifiche tecniche apportate in corso
di sperimentazione hanno reso la funzione triage (integrata
solo nella versione di SIGLA 4.0. dell’IZSUM), attinente e
funzionale ad una realtà quale quella che si riscontra negli Istituti
Zooprofilattici. Per quanto riguarda l’analisi dei dati del periodo
(giugno-agosto 2013), una prima rappresentazione dell’attività
mostra che su 157.863 analisi svolte i codici attribuiti sono così
distribuiti: verdi 95%, bianchi 3.3.%, gialli 1.6% e rossi 0.1%. Si
è inoltre cercato di valutare il rispetto del diagramma decisionale
in accettazione (da cui deriva la corretta attribuzione del codice
di priorità) e l’impatto della nuova funzione sui tempi di risposta
in laboratorio. Da una prima analisi è emerso che le diverse sedi
accettanti hanno un comportamento non ancora completamente
uniforme, soprattutto nell’attribuzione dei codici gialli. Per quanto
riguarda i tempi di risposta, i primi dati evidenziano che rientrano
nei tempi stabiliti il 98% delle analisi con codice rosso ed il 98.2%
di quelle con codice verde, mentre i codici gialli conformi ai tempi
di risposta sono l’88.8%. In conclusione si può affermare che,
dal punto di vista tecnico, la funzione del triage è ormai entrata
nella prassi operativa delle accettazioni e dei laboratori e che
non rappresenta più una criticità. Per quanto riguarda invece
l’aspetto organizzativo, le criticità riscontate nell’attribuzione dei
codici triage, evidenziano la necessità di rivedere insieme alle
accettazioni l’approccio all’albero decisionale, in modo da rendere
uniforme il comportamento di tutte le sedi accettanti. Inoltre, nei
mesi futuri sarà fondamentale il monitoraggio costante dei dati,
come è prassi per tutte le nuove funzionalità che modificano
l’approccio alla gestione dei campioni.
BIBLIOGRAFIA
Kenneth V. I., John C. M., 2007, Triage in Medicine,
1.
Part I: concept, history and types, Annals of emergency Medicine,
Volume 49, p. 275-281
2.
Nappo C., Pizzoni E., Manai R., Izzo P., Desantis E,
Virdis A., Cenni G., Faccenda L., 2012, Utilizzo ed evoluzione
di un sistema informativo per la gestione dei laboratori di analisi
(SIGLA): Atti XIV Congresso Nazionale S.I.Di.L.V., Sorrento, p.
36-37
Fig. 1: diagramma di flusso per l’attribuzione del codice triage
Campione in
accettazione
Rosso
SI
Sospetto pericolo grave
per la salute pubblica
O
Sospetto malattie
a rapida diffusione
SI
NO
Impatto mediatico
SI
Sospetto pericolo
per la salute pubblica
E
matrice o
analita/microrganismo
ad alta deperibilità
NO
NO
Prodotto in prossimità di scadenza
O
Sospetto pericolo per la salute
pubblica/salute animale
O
Matrici deperibili per analisi microbiologiche
O
Accordi formalizzati col Cliente
SI
Giallo
Verde
NO
SI
Sequestro/Vincolo sanitario
SI
NO
NO
Allerta
NO
Campione per
Ricerca IZSUM
Bianco
SI
Fig. 2: comportamento del laboratorio in base ai diversi codici di urgenza
Codice
Significato del codice
Cosa comporta per il laboratorio
Rosso
EMERGENZA
Le attività di laboratorio in corso della linea analitica interessata vengono immediatamente
interrotte per iniziare a processare il campione con codice rosso.
Giallo
Verde
Bianco
URGENZA
URGENZA MINORE
CAMPIONI DELLA RICERCA
Il laboratorio interessato prende in carico il campione non appena terminate le attività analitiche
in corso nella linea analitica interessata
I campioni processati dal laboratorio interessato in ordine di accettazione, in assenza di campioni
con codice rosso o giallo
Autogestione del laboratorio, i campioni vengono gestiti come da accordi con il responsabile
della Ricerca
245
CASE REPORT: TUBERCOLOSI DA MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP. HOMINISSUIS
IN UN CANE DI RAZZA BASSET HOUND
Ferraro G.1, Sandri C.2, Masserdotti C.3, Varello K.1, Zoppi S.1, Goria M.1, Perosino M.1, Dondo A.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino;
2
Med. Vet. Libero professionista, Vicenza;
3
Laboratorio Veterinario San Marco, Padova
Keywords: tubercolosi aviare, M. avium subsp. hominissuis, Basset Hound
SUMMARY
We describe an integrated diagnostic pathway applied to diagnose a generalized avian tuberculosis in a Basset Hound dog. Certain breeds of dog, such as Basset Hound, appear to be predisposed to Mycobacterium avium infection, although the basis of this
breed is unclear.
Rapid diagnoses followed by an early and appropriate treatment
are very important to improve the life expectancy of the animal
affected by mycobacteriosis, as well as to reduce the potential zoonotic transmission of these microorganisms.
INTRODUZIONE
Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAH) è compreso
nel Mycobacterium avium complex (MAC), un complesso di microrganismi a crescita lenta, con differenti gradi di patogenicità,
spettro d’ospite e diffusione ambientale. Generalmente i cani sono
poco sensibili all’infezione da parte di MAC, tuttavia alcune razze
(Schnauzer nani, Basset Hound) sembrano essere maggiormente
predisposte all’infezione. La malattia sembra essere dovuta a un
deficit del sistema immunitario cellulo-mediato dell’ospite (1). Con
la depressione del sistema immunitario, i micobatteri sopravvivono nel corpo dell’animale ospite e si moltiplicano nelle sue cellule istiocito-macrofagiche per l’incapacità dei fagociti di eliminarli.
Comunemente l’infezione da MAC si manifesta con lesioni focali:
gastroenteriche, respiratorie o cutanee, ma eccezionalmente può
provocare anche una forma d’infezione disseminata con prognosi
generalmente infausta. A oggi, molti aspetti legati all’infezione da
MAH nel cane sono poco conosciuti. Una diagnosi e un trattamento precoce risultano essere molto importanti sia per migliorare le prospettive di vita dell’animale affetto da micobatteriosi sia
per le implicazioni legate al potenziale zoonotico riconosciuto a
questi microrganismi (MAC). Nel presente lavoro sono descritti i diversi aspetti clinici e diagnostici utilizzati per formulare una
diagnosi di tubercolosi aviare generalizzata in un cane di razza
Basset Hound. Il quadro clinico riferito era legato ad un grave
deperimento organico associato ad aumento di volume di diversi distretti linfonodali, pertanto l’animale veniva sottoposto a una
serie di esami e in particolare tramite l’esame citologico veniva
emessa una diagnosi di micobatteriosi. E’ pertanto stata pianificata l’asportazione chirurgica di un linfonodo interessato per effettuare la diagnosi eziologica differenziale con l’applicazione di un
protocollo diagnostico integrato basato su esami istolopatologici,
batteriologici e biomolecolari. Inoltre sul ceppo isolato, al fine di
individuare un protocollo terapeutico mirato, è stato eseguito un
antibiogramma specifico per micobatteri.
MATERIALI E METODI:
Caso clinico e campionamento: un cane di razza Basset Hound
(età 11 mesi, maschio intero) veniva presentato alla visita clinica
per abbattimento, anoressia, dimagrimento e zoppia migrante. Il
proprietario riferiva che il cane proveniva da un allevamento privato con annessa stabulazione di animali da cortile e che presentava
tale condizione, seppur in modo intermittente, da diversi mesi. Ripetuti trattamenti con enrofloxacina portavano a transitori, parziali
miglioramenti. Successivamente il quadro clinico si è complicato
e il soggetto presentava a visita clinica dispnea, tachipnea, soffio
labiale, respiro superficiale con 57 atti respiratori/minuto. Nell’approccio clinico è stata ripetuta una radiografia al torace con rilievo
di versamento pleurico ed effettuata una TAC total body.
Campioni linfonodali prescapolari (destro e sinistro), retromandibolare sinistro e popliteo destro sono stati prelevati mediante
ago infissione per l’esecuzione dell’esame citologico a livello linfonodale; successivamente si è proceduto a biopsia escissionale
del linfonodo popliteo destro per approfondimenti batteriologici. Il
linfonodo, asportato in toto, seguendo le normali regole di asepsi
chirurgica, è stato sezionato a metà: una parte posta a secco in un
contenitore sterile e congelato immediatamente per l’esecuzione
del protocollo microbiologico e biomolecolare per micobatteriosi;
una parte fissata in soluzione di formaldeide al 4% per l’esame
istologico.
Esame citologico: eseguito su campioni linfonodali dopo fissazione all’aria e colorazione con metodica di Wright –Giemsa.
Esame istopatologico: La porzione di linfonodo fissata è stata
sottoposta alle procedure standard di inclusione in paraffina ed
al taglio al microtomo di sezioni di 4±2 μ di spessore. Parte delle
stesse è stata destinata alla colorazione con Ematossilina-Eosina
(EE) e parte alla colorazione Ziehl Neelsen (ZN). I preparati istologici sono stati esaminati al microscopio ottico a ingrandimenti
crescenti (10x, 20x, 40x).
E’ stata eseguita colorazione specifica che ha previsto il passaggio a freddo in fucsina fenicata di Ziehl Neelsen (Bio-Optica Milano
S.p.A.), previo trattamento delle sezioni con acido periodico 1%
p/v. Per valutare l’idoneità della colorazione è stato utilizzato un
linfonodo bovino confermato positivo all’esame colturale per M.
bovis. I preparati istologici sono stati esaminati nell’intera sezione
a ingrandimento 40x e valutati come positivi in base alla presenza
di uno o più batteri alcool-acido resistenti.
Esame batteriologico: il linfonodo è stato accuratamente privato
di tessuto adiposo e connettivale prima di procedere con le fasi
successive per l’esame colturale.
Previo sminuzzamento, l’omogeneizzazione del campione avveniva in Stomacher: l’omogenato veniva suddiviso in due aliquote
per essere sottoposto a due differenti metodi di decontaminazione: idrossido di sodio 2% e acido esadecilpiridinio 1,5% rispettivamente. Ciascuna aliquota decontaminata, dopo concentrazione in
centrifuga, veniva seminata su una batteria di terreni selettivi che
prevedeva: Stonebrink, Lowenstein Jensen Medium, Lowenstein
Jensen w/o glicerina. L’incubazione avveniva per i primi 15 giorni
a 37°C in atmosfera modificata con l’aggiunta di 5% CO2 e per il
restante periodo a 37°C in atmosfera normale.
Al fine di aumentare le probabilità d’isolamento di micobatteri a
lenta crescita, l’esame batteriologico si considerava concluso a 60
giorni.
Antibiogramma: la metodica consiste nella preparazione di una
246
sospensione batterica a densità nota (1x10^5 UFC/ml) secondo
quanto riportato sulla norma CLSI M24-A (1) e all’inoculo di 50
µl di sospensione batterica in 10 ml di brodo Mueller-Hinton con
OADC che viene successivamente dispensato in ogni pozzetto
(100µl /pozzetto). Per permettere la lettura dell’antibiogramma
senza l’ausilio di strumenti ottici, vengono aggiunti 10 µl /pozzetto
di Alamar blue, un prodotto in grado di rendere visibile la crescita
batterica. Per evitare l’evaporazione dell’inoculo, le piastre vengono ricoperte da un foglio plastico adesivo. Le piastre così preparate vengono incubate per 7 giorni a 37°C, fino a quando il pozzetto
del controllo positivo non ha presentato una crescita visibile e si
osserva un viraggio del colore da blu a fucsia. Le molecole testate
sono contenute nel pannello commerciale SLOMYCO (Sensititre®, Trek Diagnostic Systems, Cleveland, Ohio, USA): streptomicina (0,5-64 µg/ml), ethionamide (0,3-20 µg/ml), etambutolo
(0,5-16 µg/ml), amikacina (1-64 µg/ml), ciprofloxacina (0,12-16
µg/ml), rifampicina (0,12-8 µg/ml), moxifloxacina (0,12-8 µg/ml) e
claritromicina (0,06-64 µg/ml). I valori di MIC sono stati determinati
per ciascun antibiotico testato sulla base del primo pozzetto che
mantiene la colorazione blu, ciò indica la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita del ceppo batterico
in esame. L’interpretazione delle MIC è stata effettuata in accordo
con quanto riportato in bibliografia (2,5,8), tuttavia il dato di MIC
per MAC interpretabile è, in particolare, quello relativo alla claritromicina .
Identificazione e tipizzazione molecolare: il ceppo isolato è stato
identificato e tipizzato per via molecolare. Previa inattivazione, il
DNA è stato estratto mediante trattamento termico e analizzato
per l’identificazione di specie mediante Multiplex PCR, variazione
“in house” del metodo descritto da Kulski et al. (4) e da Sinclair et
al. (6). Il ceppo, identificato in questo modo come M. avium, è stato quindi sottoposto ad analisi per la presenza della regione IS901
(143 paia di basi) e della regione IS1245 (472 paia di basi) al fine
della differenziazione di sottospecie in M. avium subsp. avium / M.
avium subsp. hominissuis (7-3).
All’esame clinico il soggetto si presentava cachettico con tonicità muscolare, stato d’idratazione, mucose apparenti, caratteri del
polso e del respiro nella norma. Si riscontrava ipertermia (39,8°C)
e linfoadenomegalia generalizzata, più pronunciata a livello di linfonodi sottomandibolari e prescapolari, con dolorabilità alla palpazione. In considerazione del quadro clinico si decideva di eseguire
un esame citologico a livello di linfonodi prescapolare, retromandibolare e popliteo. L’esame evidenziava l’esfoliazione, su fondo
diffusamente detritico modicamente ematico, di elementi linfoidi
polimorfi, dominati da piccoli linfociti maturi od in maturazione,
associati a massiccia componente infiammatoria, rappresentata
da granulociti neutrofili segmentati e da macrofagi, singoli od in
aggregati di dimensioni variabili con aspetto epitelioide. La componente macrofagica manifestava frequente attività di fagocitosi di
batteri bastoncellari a profilo acromatico, morfologicamente riferibili ad agenti del genere Mycobacterium spp. Il quadro citologico
imponeva pertanto una diagnosi differenziale per stabilire l’esatta
eziologia. Si procedeva quindi all’asportazione chirurgica di un
linfonodo popliteo al fine di applicare un protocollo diagnostico integrato per identificare e caratterizzare l’agente eziologico. Con il
peggioramento del quadro clinico, l’esame tomografico e radiologico eseguito rilevava a livello toracico la presenza di abbondante
versamento pleurico bilaterale (figura 1).
Il quadro istopatologico riferiva che la normale architettura del
linfonodo appariva quasi completamente alterata da un diffuso
infiltrato di cellule epitelioidi e macrofagi con foci di granulociti
neutrofili. Si osservavano inoltre aree di fibrosi. A livello intracellulare erano presenti numerosi bastoncelli alcool-acido resistenti
positivi alla ZN confermando un quadro compatibile con linfadenite granulomatosa diffusa da micobatteri. Per definire le possibilità
di eseguire una terapia mirata e per avere elementi in riferimento
alla prognosi dell’animale si procedeva ad esami batteriologici che
evidenziavano la crescita di colonie batteriche acido-alcool resistenti. Il ceppo, mediante tecniche molecolari, veniva identificato
come M. avium e successivamente tipizzato come Mycobacterium avium subsp. hominissuis per la presenza della sequenza
IS1245 e l’assenza dell’elemento di inserzione IS901(3) (figura
2). Al fine di realizzare il possibile trattamento terapeutico veniva
eseguito un antibiogramma e il ceppo risultava sensibile alla Claritromicina e Moxifloxacina. Il trattamento farmacologico con la
due molecole individuate portava ad un netto miglioramento, dopo
pochi giorni, delle condizioni generali, aumento dell’appetito e diminuzione graduale del versamento pleurico. Il presente lavoro
rappresenta pertanto un contributo per affrontare, in modo integrato nei diversi aspetti clinici, laboratoristici e terapeutici, patologie a
carattere zoonotico da M. avium che sempre più frequentemente
sono diagnosticate nell’uomo e negli animali, compresi gli animali
d’affezione che rappresentano un possibile rischio di infezione.
Figura 1 - Proiezione radiografica LL torace, dove si nota versamento pleurico
Figura 2 - Simplex PCR per IS901 e IS1245 del ceppo isolato. In
posizione 1 ceppo M. avium; in posizione 2 ceppo di riferimento
MAA, in posizione 3 ceppo di riferimento MAH, in posizione 4 controllo negativo
247
BIBLIOGRAFIA
1. Campora L, Corazza M, Zullino C, Ebani VV, Abramo F,
2011. Mycobacterium avium subspecies hominissuis disseminated infection in a Basset Hound dog. J Vet Diagn Invest.;
23(5):1083-7
2. Deshpande D, Srivastava S, Meek C, Leff R, Hall GS, Gumbo
T., 2010. Moxifloxacin pharmacokinetics/pharmacodynamics
and optimal dose and susceptibility breakpoint identification for
treatment of disseminated Mycobacterium avium infection. Antimicrob Agents Chemother. 54(6):2534-9
3. Guerrero C, Bernasconi C, Burki D, Bodmer T, Telenti A,
1995. A novel insertion element from Mycobacterium avium,
IS1245, is a specific target for analysis of strain relatedness. J
Clin. Microbiol. 33(2), 304–307
4. Kulski JK, Khinsoe C, Pryce T, Christiansen K, 1995. Use of
a Multiplex PCR to detect and identify M. avium and M. intracellulare in blood culture fluid of AIDS patients. J Clin Microbiol.
33(8), 668-674
5. Siddigi SH, Heifets LB, CynamonMH, Hooper NM, Laszlo A,
Limonati JP, Lindholm-Levy PJ, Pearson N, 1993. Rapid Broth
Macrodilution Method for Determination of MICs for Mycobacterium avium Isolates. Journal of Clinical Microbiology, 31(9):
2332-2338
6. Sinclair K, Challans JA, Kazwala RR, Hewinson RG, Sharp
JM, 1995. A multiplex polymerase chain reaction for distinguishing Mycobacterium tuberculosis from Mycobacterium tuberculosis complex. Mol Cell Probes 9(5), 291–295
7. Slana I, Kaevska M, Kralik P, Horvathova A, Pavlik I, 2010.
Distribution of Mycobacterium avium subsp. avium and M. a.
hominissuis in artificially infected pigs studied by culture and
IS901 and IS1245 quantitative real time PCR. Vet Microbiol.
144, 437–448
8) Woods GL, 2000. Susceptibility Testing for Mycobacteria.
Clinical Infectious Diseases 31:1209–15
STENURUS GLOBICEPHALAE BAYLIS ET DAUBNEY, 1925 (NEMATODA: PSEUDALIIDAE)
E CRASSICAUDA GRAMPICOLA (NEMATODA: SPIRURIDA) IN DUE GRAMPUS GRISEUS
(G. CUVIER, 1812) SPIAGGIATI SULLA COSTA TOSCANA
Fichi G.1, Manfredi M.T.2, Gazzonis A.L. 2, Mazzariol S.3, Centellegre C. 3, Carratori S. 1,
Di Guardo G. 4, Fischetti R. 1, Terracciano G. 1
3
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana – Pisa; 2 DIVET, Università degli Studi di Milano;
Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione, Università di Padova – Legnaro, Padova; 4 Dipartimento di Scienze
Biomediche Comparate, Università di Teramo.
Key words: Stenurus globicephalae; Crassicauda grampicola; Grampus griseus
Abstract
Stenurus globicephalae (Nematoda: Pseudalidae) and
Crassicauda grampicola (Nematoda: Spirurida) were found in
the pterygoid sinuses of two Risso’s dolphins, Grampus griseus
(G. Cuvier, 1812), stranded on the coast of Tuscany in 2012.
The gross lesions of two animals showed catarrhal sinusitis of
paranasal sinuses, thickening and hyperaemia of meninges.
These lesions were linked to the presence of these parasites.
S. globicephalae has been already reported in Risso’s dolphin
intestine as accidental event. The present report confirms the
presence of this parasite in the pterygoid sinuses of this marine
mammal. Pterygoid parasitism can be an important factor in
natural mortality because of proximity of the ear and the brain.
The presence of these two parasites could have contributed to
the stranding of the two Risso’s dolphins.
Introduzione
In generale la presenza di parassiti in cetacei spiaggiati
è rilevamento frequente e non viene attribuita ad essa un
ruolo determinante nella morte dell’animale (2). Gravi lesioni
o mortalità nei cetacei possono essere spiegate in presenza
solo di determinate condizioni: patogenicità del parassita, alta
carica parassitaria, stato di salute dell’ospite e competizione
con altri patogeni (2).
I grampi, Grampus griseus (G. Cuvier, 1812), sono cetacei
odontoceti distribuiti in tutto il mondo nelle aree temperate e
tropicali incluso il mar Mediterraneo. Non esistono però stime
sulla popolazione presente in Italia (10).
Alcuni parassiti che infestano G. griseus possono avere gravi
effetti sulla salute di questi animali (1). Uno di questi è Crassicauda
grampicola (Nematoda: Spirurida) con localizzazione a livello
dei seni pterigoidei e dei condotti uditivi di G. griseus. Questo
parassita causa erosioni dell’osso pterigoideo e per la sua
localizzazione in prossimità dell’orecchio e del cervello è stato
ipotizzato come causa di mortalità (9).
La stenurosi, malattia causata da Stenurus spp. (Nematoda,
Pseudaliidae) è un’altra parassitosi ritenuta causa di mortalità
nei delfini (7, 12). In genere, le forme adulte degli Pseudaliidi
provocano infiammazioni granulomatose nei polmoni dei
cetacei (broncopolmonite verminosa) e le larve focolai di
polmonite purulenta acuta o subacuta. Per quanto riguarda le
specie di Stenurus che si localizzano nei polmoni, nei seni aerei
(S. globicephalae) e nel sistema uditivo, queste determinano
lievi risposte infiammatorie nei bronchi e bronchioli, lievi
infiammazioni croniche non purulente con ispessimento della
mucosa dei seni e raramente sinusiti purulente a livello sia
dei seni craniali sia dell’orecchio medio (3, 12). In particolare
questi parassiti, spesso presenti in ampio numero, sono stati
associati con l’ostruzione dei dotti uditivi e con lesioni ossee,
giustificando l’ipotesi che tale parassitosi possa rappresentare
248
una causa potenziale di spiaggiamento degli Odontoceti (7,
12). Nel presente studio viene descritta l’infestazione da C.
grampicola e S. globicephalae in due esemplari G. griseus sia
dal punto di vista anatomopatologico che parassitologico
Figura1: Grampus griseus
Materiali e metodi
In data 15 aprile 2012, sulla spiaggia di Viareggio (LU)
(coordinate geografiche 43,885 N 10,229 E) sono stati rinvenuti
due esemplari di grampo. Un soggetto era ancora in vita ma in
gravissimo stato di sofferenza, pertanto si è resa necessaria
l’eutanasia effettuata dal Servizio veterinario della USL 12
Versilia. Sugli animali è stato effettuato l’esame necroscopico
in accordo al protocollo previsto dalla Ricerca corrente 2010
(IZS PLV 16/10RC). Per entrambi i soggetti è stata compilata
la relativa scheda di segnalamento. Sono stati effettuati prelievi
da organi e tessuti per indagini istologiche, microbiologiche,
virologiche, parassitologiche, tossicologiche e genetiche. I
parassiti raccolti e conservati in alcool sono stati esaminati al
microscopio ottico (Axioskop 2, ZEISS) previa chiarificazione in
lattofenolo. L’identificazione è stata effettuata confrontando le
chiavi morfometriche disponibili (4, 12). Per l’esame istologico,
porzioni dei principali organi sono state fissate in formalina
al 10 %, incluse in paraffina, sezionate a 4 μm e colorati con
ematossilina-eosina.
Figura 2: encefalo e seni pterigoidei
Risultati
L’esemplare deceduto (G1) presentava uno stato di nutrizione
scarso, con un peso e una lunghezza rispettivamente di 300
kg e 320 cm e uno stato di conservazione pari a 2 (6) (Fig.
249
1). L’esemplare soppresso (G2) presentava buono stato di
nutrizione (peso 400 kg, lunghezza 305 cm, blubber 2,8 cm) ed
entrambi erano di sesso femminile (Fig. 1). All’esame anatomopatologico, entrambi i soggetti presentavano una sinusite
catarrale associata ad infestazione da nematodi a livelli dei seni
paranasali pterigoidei (Fig. 2), con contestuali ispessimento ed
iperemia delle meningi e plessi corioidei che apparivano altresì
edematosi (Fig. 2).
Inoltre erano evidenti quadri infiammatori dell’apparato
gastrenterico e dell’apparato genitale questi ultimi caratterizzati
da fenomeni erosivo-ulcerativi. Infine a livello del sistema
nervoso centrale (SNC) si notava la presenza di estese aree
di fibrosi meningea multifocale con occasionali macrofagi. Gli
ulteriori rilievi necroscopici sono indicati in Tabella 1.
I nematodi localizzati nei seni sono stati identificati come
C. grampicola e S. globicephalae. Le crassicaude studiate
avevano una lunghezza tra i 12 e 19 cm e le femmine erano
caratterizzate da una estremità posteriore lunga mediamente
2 mm e delimitata da una caratteristica strozzatura, in
corrispondenza della quale si trovava l’apertura vulvare. I
nematodi appartenenti al genere S. globicephalae misuravano
tra 3,5 e 5 cm; i maschi erano caratterizzati da una piccola
borsa caudale con raggi corti e tozzi e una coppia di spicoli,
lunghi 139-145 μm, curvati e con estremità prossimali
appuntite. Le femmine terminavano con una estremità tronca,
l’apertura vulvare sita a breve distanza da quella anale (59 μm)
presentava una dilatazione cuticolare discoide (Fig. 3)
Figura 3: estremità posteriori di S. globicephalae
Conclusioni
S. globicephalae è riportato in diverse specie di cetacei tra
cui Globicephala sp., Pseudorca crassidens, Peponocephala
electra (8, 11, 12).
Nei grampi, S. globicephalae è già stato riportato in
letteratura da Fernández e collaboratori (2003) in un soggetto
spiaggiato lungo le coste Spagnole (5). In quell’occasione S.
globicephalae è stato rinvenuto a livello intestinale. Il sito di
infestazione era stato considerato accidentale in quanto se
il parassita è molto abbondante a livello dei seni può essere
ingerito accidentalmente dall’ospite (5). Il ritrovamento di S.
globicephalae nei due grampi esaminati conferma l’infestazione
e la localizzazione per la prima volta di questo parassita a livello
dei seni pterigoidei di G. griseus.
La patogenicità di Crassicauda spp. a carico dei nervi e dei
seni craniali con erosione della parete ossea nel grampo (9,
13) giustificherebbe l’origine delle lesioni osservate a livello del
SNC.
In conclusione, non è da escludere che la congiunta infestazione
da S. globicephalae e C. grampicola abbiano contribuito allo
spiaggiamento dei due animali.
Bibliografia
1. Bearzi G., Reeves R.R., Remonato R., Pierantonio
N., Airoldi S. 2010 Risso’s dolphin Grampus griseus in the
Mediterranean Sea. Mammalian Biology. In press.
2. Carvalho V.L., Bevilaqua C.M.L., Iňiguez A.M., MathewsCascon H., Ribeiro F.B., Pessoa L.M.B., de Meirelles A.C.O.,
Borges J.C.G., Marigo J., Soares L., de Lima Silva F.J. 2010
Metazoan parasites of cetaceans off northeastern coast of
Brazil. Veterinari Parasitology, 173: 116-122
3. Dailey M.D., Stroud R., 1978. Parasites and associated
pathology observed in cetacean stranded along the Oregon
coast. J. Wild. Dis., 14:503-511
4. Delyamure SL 1955. Helminthofauna of Marine Mammals
(Ecology and Phylogeny). KI Skrjabin, Izdatel’stvo Akademii
Nauk SSSR, Moscow. (versione inglese del Israel Program for
Scientific Translation, Jerusalem, 1968).
5. Fernández M., Aznar C.A.F.J., Raga J. A. 2003
Gastrointestinal helminths of Risso’s dolphin Grampus
griseus from the Western Mediterranean. Diseases of Aquatic
Organisms, 55: 73-76
6. Geraci J.R., Lounsbury V.J. 2005. Marine mammals
ashore: A filied guide for strandings. 2nd Ed. National Aquarium,
Baltimore, Mariland, p. 372.
7. Measures LN. 2001. Lungworms of marine mammals. In:
Parasitic diseases of wild mammals, Samuel WM, Pubus MJ,
Kocan AA eds, Second Edition, Iowa State University Press:
279-300
8. Mignucci-Giannoni A.A., Rodriguez-Lopez. M.A., MontoyaOspina R.A., Williams E.H. 1998 First record of melonhead
whale (Peponocephala electra) for Puerto Rico. Mammalia, 62
(3): 452-457
9. Morimitsu T., Kawano H., Torihara K., Kato E., Koono M.
1992 Histopathology of eight cranial nerve of mass stranded
dolphins at Goto Islands, Japan. Journal of Wildlife Diseases,
28 (4): 656-658
10. Red List. Grampus griseus (Mediterranean subpopulation)
http://www.iucnredlist.org/details/16378423/0
11.Scott E.O.G, Green R.H. 1975 Recent whale stranding in
Northen Tasmania. Paper and Proceending of Royal Society of
Tasmania, 109: 91-96
12. Zylber M.I., Failla G., La Bas A. 2002 Stenurus
globicephalae Baylis et Daubney, 1925 (Nematoda:
Pseudaliidae) from a false killer whale, Pseudorca crassidiens
(Cetacea : Delphinidae), stranded on the Coast of Uruguay.
Mem. Inst. Oswalo Cruz, Rio de Janeiro, 97 (2): 221-225
13. Zucca P, Di Guardo G, Pozzi-Mucelli R, Scaravelli D,
Francese M. 2004. Use of computer tomography for imaging
of Crassicauda grampicola in a Risso’s dolphin (Grampus
griseus). J Zoo Wildl Med., 35 (3): 391-4.
250
Tabella n 1: Lesioni anatomopatologiche nel grampo deceduto (G1) e nel grampo soppresso (G2)
Grampus griseus (G1)
Grampus griseus (G2)
Organi e tessuti
Lesioni
Lesioni
Cute e annessi
cutanei
Elementi parassitari (Pennella sp.), edema
gelatinoso della fascia superficiale, banda
iperemica nello spessore del blubber
Ndr
Muscolatura assiale Marcata atrofia
Ndr
Cavità addominale
Formazioni nodulari riferibili a larve
merocercoidi di cestodi a carico della sierosa e
dei mesi, neoformazione cistica peduncolata a
carico dell’omento
Apparato
respiratorio
Sinusite catarrale parassitaria, degenerazione
cistica grave della tonsilla laringea, edema
polmonite fibrinosa, linfadenopatia
Apparato
gastroenterico
Gastroenterite catarrale diffusa acuta, fegato e
pancres diffusamente iperemici
Gastroenterite catarrale diffusa grave con meteorismo,
fegato e pancres diffusamente iperemici
Milza
Diffusa iperemia con numerose milze
accessorie
Diffusa iperemia
Tessuti linfoidi
Linfonodi aumentati di volume, iperemici ed
edematosi
Linfonodi aumentati di volume, iperemici ed edematosi
SNC
Aree di ispessimento biancastro del tessuto
meningeo alternate ad aree iperemiche, plessi
corioidei diffusamente iperemici ed edematosi
Aree di ispessimento biancastro del tessuto meningeo
alternate ad aree iperemiche, plessi corioidei
diffusamente iperemici ed edematosi
Apparato genitale
Utero dilatato e flaccido, edema grave e diffuso Utero dilatato e flaccido, edema grave e diffuso
dell’endometrio, di colore rosso-violaceo,
dell’endometrio di colore rosso-violaceo, cervice
lesione ulcerativa con fondo verdastro in vagina pervia con fuoriuscita di materiale in vagina
251
Modico versamento siero-emorragico, numerose cisti
riferibili a larve merocercoidi di cestodi
Sinusite catarrale parassitaria, noduli polmonari
RISULTATI DEI CONTROLLI UFFICIALI EFFETTUATI SU ALIMENTI DI ORIGINE VEGETALE
PRESSO L’IZS PLV NEL PERIODO 2009-2012
Tabella 1. Determinazioni e norme di riferimento
Gruppo
Galleggiante Crisafulli A., Vencia W., Decastelli L., Abete M.C., Brusa F., Pistone G., Ferrari A., Ercolini C.,
Caramelli M., Chiavacci L., Barbaro A.
Key words: vegetables, contaminant, pathogen
Abstract
Since 2008 (GU 197 of August 23, 2008) Italian Ministry of
Health officially charged II.ZZ.SS. of the official control of
foodstuffs of vegetable origin, for chemical, microbiological
and radioactive analyses. The present work presents the
results of analyses carried out at the IZS PLV in the frame of
official control activity on vegetable foodstuffs, in the period
2009-2012.
704 samples were analysed and a total of 5085 tests
were performed. Among samples, fresh-cut ready-to-eat
vegetables were frequently collected (48.9%) followed
by vegetable and fruit preparations (21.9%); fresh fruits,
vegetables and frozen vegetables were less frequently
(1.1%) delivered to laboratory for analyses.
High percentage (91.4%) of required analyses were
represented by microbiological investigations, while only
1.7% were virological and chemical. In 4 samples (1 basil and
3 fresh-cut ready-to-eat vegetables) pathogen or potentially
pathogen bacteria were isolated.
Introduzione
I prodotti di origine vegetale sono, nell’immaginario collettivo,
correlati all’ambiente naturale, all’idea di campagna
incontaminata e pertanto godono presso il consumatore di
una maggiore fiducia rispetto agli alimenti di origine animale.
Negli ultimi anni il consumo dei vegetali di IV gamma è
aumentato per la loro praticità di utilizzo. Infatti, come
prodotti pronti al consumo si prestano ai ritmi di lavoro e
ai nuovi stili di vita, permettendo un notevole risparmio di
tempo (5)
I vegetali di IV gamma si distinguono dai prodotti freschi
in quanto devono essere conservati a temperature basse
(0-4°C); sono imballati in contenitori dotati di specifiche
caratteristiche negli scambi gassosi; presentano una shelflife compresa tra i 5 e gli 8 giorni; presentano caratteristiche
microbiologiche definite per legge.
Il Reg. CE 2073/2005 e ss.mm.ii. stabilisce per tali prodotti
dei limiti microbiologici che mirano a valutare l’igiene di
processo di lavorazione del prodotto e i criteri di sicurezza
alimentare. La destinazione al consumo diretto, rendono
sicurezza e igiene requisiti qualitativi fondamentali dei
prodotti di IV gamma e un fattore determinante per la
commercializzazione.
Nel documento ”Microbiological hazard in fresh fruit and
vegetables”, pubblicato da WHO e FAO nel 2008 vengono
identificati differenti livelli di priorità rispetto al rischio di
contaminazione dei prodotti vegetali. Il livello 1 di priorità
è rappresentato dalle verdure a foglia larga; il livello 2 di
priorità dai frutti di bosco, cipolle, meloni e semi germogliati
e il livello 3 di priorità è rappresentato da ortaggi poco
implicati in episodi tossinfettivi (6). Negli ultimi anni si è
assistito ad un aumento di epidemie dovute al consumo di
prodotti di origine vegetale: il “European Union Summary
Report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents
and food borne outbreaks 2009” riporta che 43 (4.4%) delle
epidemie occorse era dovuta al consumo di frutta e vegetali
in particolare lamponi surgelati contaminati da Norovirus
(3); nel maggio 2011 in Germania è esplosa un’epidemia
causata dal consumo di germogli di soia contaminati da E.
coli O104:H4 che ha provocato la morte di oltre 50 persone
(2); nel settembre 2011 negli USA un’epidemia di listeriosi
dovuta al consumo di meloni cantalupo contaminati ha
registrato 29 morti.
Inoltre, la recente epidemia di epatite A dovuta al consumo di
frutti di bosco surgelati contaminati (7) ha innalzato il livello
di guardia su questa tipologia di prodotti.
Il rischio non è legato solo alla contaminazione batterica e
virale, ma anche chimica in quanto i raccolti agricoli possono
essere esposti a sostanze tossiche legate alla contaminazione
dell’acqua e all’utilizzo improprio di fitofarmaci.
Il Decreto del Ministero della Salute del 27 febbraio 2008
(GU 197 del 23 agosto 2008) ha ufficialmente demandato agli
II.ZZ.SS. il controllo ufficiale degli alimenti di origine vegetale
non trasformati per le analisi chimiche, microbiologiche e
radioattive, indicando i tempi per l’adeguamento di strutture
e risorse strumentali e per la programmazione del piano di
controllo.
Con il presente lavoro si descrivono i risultati delle analisi
effettuate presso l’IZS PLV nell’ambito del controllo ufficiale
sugli alimenti di origine vegetale nel periodo 2009-2012.
Materiali e Metodi
I campioni sono stati prelevati nel periodo 2009-2012
presso esercizi di commercializzazione presenti sul
territorio di competenza dell’IZS PLV. L’attività di prelievo
è stata compiuta dai Servizi Veterinari (SVet), dai Servizi
Igiene degli Alimenti e della Nutrizione (SIAN) e dai Nuclei
Antisofisticazione e Sanità (NAS). Sono stati campionati
anche prodotti all’importazione (PIF).
Presso i laboratori dell’IZS PLV sono state eseguite analisi
batteriologiche per la ricerca e il conteggio di patogeni e
germi indicatori; analisi per muffe, lieviti e filth test (queste
ultime eseguite su campioni indipendenti o contestualmente
ad alcune analisi batteriologiche).
Su alcune tipologie di prodotti il set analitico prevedeva la
ricerca di virus enterici quali Epatite A e Norovirus. Le analisi
chimiche sono state dirette ai metalli pesanti (Pb, Cd, Cr, As,
Hg), alcuni campioni sono stati analizzati per Sudan.
La maggior parte delle metodiche utilizzate sono validate e
accreditate (ACCREDIA) e condotte in accordo alle norme
ISO, per altre determinazioni sono stati impiegati metodi
che hanno seguito un protocollo di validazione interno. La
successiva tabella 1 riporta il quadro riepilogativo.
252
Determinazione
Anaerobi solfito riduttori
B. cereus
Ca mpylobacter termofili
Ca rica mesofi la
Cl . botulinum
Cl . perfringens
Co liformi
E. coli O157 e altri STEC
Analisi
batteri ologiche
E. coli �-glucuronodasi positivi
Enterobatteri
L. monocytogen es
Salmonella sp p
Stafilococchi coagulasi positivi
Y. enterocolitica
Arsenico
Ca dmio
Cro mo
Analisi chimiche
Mercurio
Piombo
Sudan
Analisi
virologiche
Epatite A
No rovirus
Filth test
Altre an alisi
Lieviti e Muffe
Aw
pH
sulle produzioni per i noti rischi di accumulo dei metalli pesanti
nell’organismo e per gli effetti cancerogeni e genotossici del
sudan che è stato bandito dalla Decisione CE 402/2005.
Norma di riferimento
ISO 15213 :2003
ISO 7932:2004
ISO 10272 -1:2006
ISO 4833:2003
CNRB POMIAC
ISO 7937:2005
ISO 4832:2006
ISO 13136 :2011; AFNOR
BIO 12/8-07/00; EU-RL
POMIZA
ISO 16649 -2:2001
ISO 21528 -2:2004
Tabella 2. Campioni prelevati e analisi eseguite
Tipo campione
Erbe aromatiche fresche
%
%
campioni N.
anali si
N.
sul
sul
ca mpioni
analisi
totale
totale
32
4,5
204
4,0
Erbe aromatiche secche
Frutta fresca
Frutta secca essiccata o to stata
ISO 11290 -1/-2 qualitativo e
quantitativo, PCR AFNOR
BRD 07/10 -04/05, ELFA
AFNOR BIO 12/11-03/04
7,8
493
9,7
1
0,1
7
0,1
10
1,4
36
0,7
Legumi radici e tuberi non p reparati
1
0,1
2
0,0
Ortaggi a bulbo non preparati
2
0,3
39
0,8
154
21,9
685
13,5
85
12,1
685
13,5
48,9 2 .852
56,1
Ortaggi e frutta prepa rati
ISO 6579, PCR AFNOR BRD
07/06-07/04,AFNOR ABI
29/01-09/07, ELFA AFNOR
BIO 12/10-09/02
ISO 6888- 2:1999/Amd
1:2003
ISO 10273 :2003
Metodo inte rno - AAS
Metodo inte rno - ICP-MS
Metodo inte rno - DMA8 0
Metodo inte rno - HPLC
Metodo inte rno: RTHemine sted PCR
Draft CEN/TC275 WG6 N
465
AOAC 955.46; 960.51;
974.33
ISO 21527 -1/-2:2008
ISO 21807 :2004
MF HPB - 03
55
Spezie
Vegetali di IV gamma
Vegetali surgelati
Verdure a foglia non preparate
Totale
344
6
0,9
37
0,7
13
1,8
45
0,9
100,0 5 .085
100,0
704
Tabella 3. Tipologie di analisi eseguite
Gruppo
N. analisi
Analisi batteriologiche
Altre a nalisi *
Analisi chimiche
Analisi virologiche
Totale
4.647
353
60
25
5.085
% analisi
sul totale
9 1,4
6,9
1,2
0,5
10 0,0
* Lieviti , Muffe, Filth test, Aw e pH
Risultati e conclusioni
Nel periodo 2009-2012 sono stati analizzati 704 campioni di
origine vegetale sui quali sono state eseguite 50.085 analisi.
I prodotti prelevati con maggiore frequenza sono stati i vegetali
di IV gamma (344/704; 48,9%) seguiti da ortaggi e frutta
preparati (154/704; 21,9%); frutta fresca, legumi e vegetali
surgelati sono stati prelevati meno frequentemente (8/704,
1,1%) (dati in tabella 2).
I dati riportati nella successiva tabella 3 evidenziano che il
91,4% delle analisi effettuate sono batteriologiche. Il numero
di determinazioni chimiche e virologiche è invece molto basso,
rispettivamente 1,2% e 0,5%.
Le determinazioni batteriologiche eseguite su un totale di
623 campioni hanno evidenziato 4 campioni non conformi (1
basilico fresco e 3 vegetali di IV gamma) rispettivamente per S.
Singapore, S. Blockley, L. monocytogenes e Y. enterocolitica
biotipo 1A non patogena.
Tali risultati (0,6% di campioni non conformi), fotografando un
periodo temporale di 4 anni, mostrano che questa tipologia
di prodotti gode di una buona sicurezza dal punto di vista
batteriologico.
I dati sulle analisi virologiche, 23 campioni analizzati in 4 anni
suggeriscono di aumentare, alla luce delle recenti allerte, il
livello di attenzione per questi rischi noti da sempre ma, fino
ad ora, poco considerati nei piani di campionamento nazionale
e regionali
Per quanto riguarda le analisi chimiche (32 campioni analizzati)
occorre ricordare che nel periodo considerato sono stati ricercati
presso l’IZS PLV solo metalli pesanti e sudan; i risultati seppur
favorevoli suggeriscono di mantenere un adeguato controllo
Bibliografia
1) AIT Austrian Institute of Technology GmbH; Food of plant
origin: production methods and microbiological hazards linked
to food-borne disease. Reference: CFT/EFSA/BIOHAZ/2012/01
Lot 1 (Food of plant origin with high water content such as fruits,
vegetables, juices and herbs). Supporting Publications 2013:
EN-402. [253 pp.]
2) European Food Safety Authority; Urgent advice on the
public health risk of Shiga-toxin producing Escherichia coli
in fresh vegetables. EFSA Journal 2011; 9(6):2274. [50 pp.]
doi:10.2903/j.efsa.2011.2274
3) European Food Safety Authority, European Centre for
Disease Prevention and Control; The European Union Summary
Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents
and Food-borne Outbreaks in 2009; EFSA Journal 2011;
9(3):2090. [378pp.] doi:10.2903/j.efsa.2011.2090
4) Eurobarometro Speciale 354, Rischi associati agli alimenti.
Sondaggio commissionato dall’“Autorità Europea per la
Sicurezza Alimentare”. Novembre 2010.
5) Lunati Fabio. Il mercato dei prodotti di “quarta gamma” in
Italia. Informatore fitopatologico - giugno 2007
6) Microbiological hazards in fresh fruits and vegetables
Food and Agriculture Organization of the United Nations World
Health Organization 2008
7) Rapid outbreak assessment-update. Outbreak of HAV
infection in Italy and Ireland, 09 July 2013. European Centre for
Disease Prevention and Control, Stockholm, 2013
253
SALMONELLA SPP. E LISTERIA MONOCYTOGENES IN prodotti a base di carne:
Risultati dei controlli EFFETTUATI in PiemontE nel biennio 2011-2012
monocytogenes di questi 215 campioni (72,6%) con entrambi i
metodi e 81 (27,4%) con metodica quantitativa.
Complessivamente i campioni non conformi sono stati 41; 32
(10,8%) per L. monocytogenes analizzati con entrambe le
metodiche (31/215 positivi solo all’analisi qualitativa ed 1/215
positivo ad entrambe) e 9 (3,2%) per Salmonella spp. (tabella 1).
Key words: Listeria monocytogenes, Salmonella spp., meat products
Tabella 1. Risultati prodotti a base di carne biennio 2011-2012
Galleggiante Crisafulli A., Bianchi D.M., Decastelli L., Monfardini S., Brusa F., Pistone G., Chiavacci L., Barbaro A.
Abstract
Regulation EC 2073/2005 amended by Regulation EC
1441/2007 lays down microbiological criteria for food, aimed
to define the acceptability of a product or a process; among
these, food safety criteria such as the detection of Salmonella
spp. and the detection and enumeration of L. monocytogenes
are included.
This study shows the results of official sampling carried out to
investigate the presence of L. monocytogenes and Salmonella
spp., in meat products, in the period 2011-2012.
Samples were collected by Piedmontese Veterinary Services
and analyzed by Food Control Laboratories of Istituto
d’Aosta.
Totally, 277 samples were analyzed for Salmonella spp. and
9 (3.2%) resulted non-compliant; 296 samples were tested for
L. monocytogenes and in 32 (10.8%) L. monocytogenes was
detected.
L’obiettivo del lavoro è mostrare i risultati delle analisi eseguite
per L. monocytogenes e Salmonella spp., sui prodotti a base
di carne prelevati nell’ambito del controllo ufficiale in Piemonte
nel periodo 2011-2012.
Introduzione
La produzione di carne è una delle principali attività in Europa
e costituisce uno dei motori trainanti dell’industria alimentare
italiana. Le principali tipologie di prodotti a base di carne sono
quelli a base di maiale (48,7%), di pollame (23,6%) e di carne
bovina (23,3%). I prodotti a base di carne rappresentano un
substrato ideale per la crescita di diversi batteri patogeni.
Fattori intrinseci come il pH e l’Aw influenzano la crescita e la
sopravvivenza di tali microrganismi, che possono contaminare
la carne attraverso le varie fasi della filiera produttiva (5).
Batteri come L. monocytogenes, grazie alla capacità di formare
biofilm sui piani di lavoro e sulle attrezzature, aumentano
il rischio di contaminazioni crociate. A livello comunitario, il
report EFSA 2011 riporta che le infezioni da Listeria nell’uomo
continuano a diminuire (-7,8% rispetto al 2010), con 1.476 casi
confermati. In Italia sono stati confermati 83 casi rispetto ai 95
del 2010. Nel 2011 è stato condotto uno studio di prevalenza
di L. monocytogenes in talune categorie di prodotti pronti al
consumo; il 2,1% di campioni di prodotti a base di carne prelevati
negli esercizi di vendita sono risultati non conformi all’analisi
qualitativa. Tuttavia il limite UE per la sicurezza alimentare (100
UFC/g) è stato superato solo nello 0,4% dei prodotti a base di
carne (2). Sempre il report EFSA 2011 conferma la salmonellosi
ancora la seconda malattia zoonotica segnalata nell’uomo nel
2011, con 95.548 casi. Salmonella spp. è stata riscontrata
con maggior frequenza nella carne di pollo fresca, così come
nella carne di pollo macinata e nei preparati a base di carne
di pollo (1). Il Reg. CE 2073/2005 (3) integrato dal Reg. CE
1441/2007 (4) demanda ai produttori la responsabilità di fornire
elementi utili a prevedere il comportamento di microrganismi
potenzialmente patogeni e stabilisce per tali prodotti come
criterio d’igiene di processo di lavorazione del prodotto la
ricerca di Salmonella spp. e come criteri di sicurezza alimentare
la ricerca di Salmonella spp. e la ricerca o il conteggio di L.
monocytogenes (categoria alimentare 1.2, 1.3).
Ricerca di L. monocytogenes
Per quanto riguarda L. monocytogenes, il protocollo della
regione Piemonte prevede che debbano essere eseguite
entrambe le analisi (valutazione qualitativa della presenza del
microrganismo e conteggio) se al momento del prelievo non è
possibile accertare che il produttore sia in grado di dimostrare
che il prodotto non supererà il limite di 100 UFC/g durante la
shelf life. Se il campione non rappresenta terreno favorevole
per la crescita di L. monocytogenes durante il periodo di
conservabilità, si esegue l’analisi quantitativa.
L’isolamento e l’identificazione di L. monocytogenes sono
stati eseguiti come previsto dal Regolamento CE 1441/2007
secondo metodiche in accordo con le norme UNI EN ISO
11290-1:1996 e UNI EN ISO 11290-1:1996/Amendment
1:2004. Sui campioni si è inoltre proceduto alla numerazione
di L. monocytogenes, secondo la norma UNI EN ISO 112902:1998/Amendment 1:2004.
Materiali e metodi
Nel biennio 2011-2012 sono stati prelevati, presso esercizi
commerciali di piccole, medie e grandi dimensioni dai Servizi
Veterinari e dai Servizi Igiene degli Alimenti e della Nutrizione
(SIAN) della regione Piemonte campioni di prodotti a base di
carne per essere sottoposti alla ricerca di Salmonella spp. e
alla ricerca e conteggio di L. monocytogenes.
I prelievi sono stati eseguiti secondo le procedure previste nei
piani di campionamento ufficiali, prevedendo 4 o 5 aliquote,
ciascuna formata da una unità campionaria.
Le analisi sono state eseguite presso i Laboratori Controllo
Alimenti dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta.
Ricerca di Salmonella spp.
Per i campioni sottoposti all’analisi per Salmonella spp., sono
state utilizzate metodiche basate sul riferimento della norma
ISO 6579: 2002/Corr. 2004.
I campioni positivi sono stati avviati alla tipizzazione
sierologica e le Salmonelle risultate appartenenti al sierotipo
S. Typhimurium sono state inviate al Laboratorio Nazionale
di Riferimento dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle
Venezie (Padova) per la fagotipizzazione.
In questo lavoro il risultato considerato ai fini della classificazione
del campione come conforme o non conforme è stato il risultato
della prima analisi prescindendo, per L. monocytogenes dal
tipo di analisi eseguita.
Determinazioni
L. monocytogenes
Salmonella spp.
N. campioni N. campioni % campi oni
analizzati
non conformi non conformi
296
32
10,8
277
9
3,2
Le successive tabelle 2 e 3 mostrano in dettaglio i risultati per
le determinazioni considerate.
Tabella 2. Biennio 2011-2012: campioni analizzati per L.
monocytogenes
Tipo campione
Salame
Prosciutto cotto
Altri prodotti a base di carne
Mortadella
Prosciutto crudo
Pancetta affumicata
Bresaola
N. campioni
N. campioni % campioni
analizzati
17,9
151
27
63
47
15
9
6
5
1
3
0
0
1
0
1,6
6,4
0,0
0,0
16,7
0,0
Tabella 3. Biennio 2011-2012: campioni analizzati per
Salmonella spp.
Tipo campione
Salame
Altri prodotti a base di carne *
N. campioni
N. campioni
% campioni
analizzati
136
8
5,9
57
1
1,7
Wurstel di pollame
48
Prosciutto cotto
28
Prosciutto crudo
8
* bresaola, mortadella, arrosto di tacchino, speck
0
0
0
0,0
0,0
0,0
Il prodotto maggiormente contaminato è risultato essere il
salame (35/41; 85,4%): in particolare 27 campioni per L.
monocytogenes (17,9%) e 8 per Salmonella spp. (5,9%).
Tutti gli isolati di Salmonella sono stati sottoposti a
sierotipizzazione con i seguenti risultati: S. Typhimurium (N=3);
S. Typhimurium variante monofasica 1,4,[5],12:I:-. (N=5); S.
Nchanga (N=1). La fagotipizzazione di S. Typhimurium ha
evidenziato 1 fagotipo DT110 e 1 U302 mentre per un ceppo
non è stato possibile stabilirlo.
I nostri dati confermano che i prodotti a base di carne non sono
quindi esenti da questi importanti rischi microbiologici.
Occorre ricordare che la qualità dei prodotti a base di
carne dipende dalla qualità delle materie prime utilizzate,
dall’efficienza della tipologia di processo produttivo, dalla
corretta conservazione del prodotto finito durante le varie fasi
di deposito, trasporto e commercializzazione.
Poiché sono prodotti trasformati, più di altri possono
rappresentare un ottimo substrato per lo sviluppo di
microrganismi anche patogeni.
Alle ditte produttrici, il cosiddetto “Pacchetto igiene”, fornisce tutti
gli strumenti per un’idonea gestione del rischio e in particolare
all’Operatore del Settore Alimentare (OSA) affida la garanzia
del rispetto dei requisiti di sicurezza per gli alimenti in regime
di autocontrollo e l’obbligo d’informazione ai consumatori e alle
autorità circa il rischio rilevato. Il fatto che il 72,6% di campioni
siano stati analizzati per L. monocytogenes con entrambe le
metodiche evidenzia come elemento di criticità la difficoltà a
reperire in fase di prelievo le informazioni fondamentali che
devono permettere la scelta dell’analisi appropriata.
La scelta delle materie prime, il rispetto delle buone pratiche di
produzione, adeguati programmi di pulizia e sanificazione e un
attento controllo delle temperature di stoccaggio, sono azioni
fondamentali nel prevenire la contaminazione del prodotto al
fine di garantire il consumatore finale.
Bibliografia
1. EFSA, (European Food Safety Authority), ECDC
(European Centre for Disease Prevention and
Control), 2013. The European Union Summary
Report on Trends and Sources of Zoonoses,
Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in
2011; EFSA Journal 2013,11(4):3129, 250pp.
doi:10.2903/j.efsa.2013.3129.
2. European Food Safety Authority; 2013. Analysis
of the baseline survey on the prevalence of
Listeria monocytogenes in certain ready-to-eat
(RTE) foods in the EU, 2010-2011 Part A: Listeria
monocytogenes prevalence estimates. EFSA
Journal 2013;11(6):3241, 75 pp. doi:10.2903/j.
efsa.2013.3241
3. Gazzetta ufficiale dell’Unione europea del 22
dicembre 2005: Reg. (CE) 2073/2005 della
Commissione del 15 novembre 2005 sui criteri
microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.
4. Gazzetta ufficiale dell’Unione europea del 7
dicembre 2007: Reg. (CE) 1441/2007 della
Commissione del 5 dicembre 2007 che modifica
il Reg. (CE) 2073/2005 sui criteri microbiologici
applicabili ai prodotti alimentari.
5. Mataragas, M., Drosinos, E.H., Siana, P., Skandamis,
P., Metaxopoulos, I., 2006. Determination of
the growth limits and kinetic behavior of Listeria
monocytogenes in a sliced cooked cured meat
product: validation of the predictive growth model
under constant and dynamic temperature storage
conditions. Journal of Food Protection 69, 1312–
1321.
Nel biennio 2011/2012 sono stati analizzati 277 campioni
di prodotti a base di carne per Salmonella spp. e 296 per L.
254
255
RICERCA DI RESIDUI DI AVERMECTINE E MILBEMICINE IN TESSUTI E LATTE:
CONFRONTO TRA DIVERSE FASI STAZIONARIE PER LA
PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE
Tabella 2 – Tempo di ritenzione degli analiti
Tempo di ritenzione (min)
ANALITA
7,4
EPRINOMECTINA
14,3
MOXIDECTINA
16,8
EMAMECTINA
19,8
ABAMECTINA
22,6
DORAMECTINA
27,2
IVERMECTINA
Gamba V.1), Abete M.C.2), Borra A.1), Massafra S.2), Giomi A.2), Stella P.2), Dusi G.1), Gili M.2)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia ed Emilia Romagna, Via Bianchi 7, 25124 Brescia
2)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna 148, 10154 Torino
1)
Key words: avermectine, tessuti e latte, purificazione SPE
SUMMARY
Avermectins and milbemycins are antiparasitic agents widely
used as veterinary drugs. The European Community established
maximum residues limits (MRLs) in some foods and imposed
their residue control to Member States.
To detect their residues in foods of animal origin, liquid
chromatography coupled to fluorimetric detection (HPLCFLD) proved to be effective due to its high sensitivity, good
reproducibility and low cost. Most of Istituti Zooprofilattici
Sperimentali use this analytical technique and related sample
preparation methods for official analysis of avermectins and
milbemycins. However it has been discovered a critical factor
in SPE (solid phase extraction) purification step, which can be
a source of serious risk for the analytical results: some lots of
amino columns causing a total loss of ivermectin. The aim of
this work is to compare the performances of anion-exchange
cartridges with both silica and polymeric supports obtained from
different firms.
INTRODUZIONE
Le avermectine e le milbemicine sono lattoni macrociclici,
isolati da Streptomyces avermitilis e dotati di potente attività
insetticida, acaricida ed antielmintica: appartengono a questa
classe abamectina, eprinomectina, doramectina, emamectina
e ivermectina, mentre la moxidectina è una milbemicina. Tali
farmaci sono usati in medicina veterinaria per il trattamento
sia di animali di allevamento che di animali da compagnia. A
causa della tossicità mostrata ad alti dosaggi, l’Unione Europea,
mediante il Regolamento 2010/37/EC, ha stabilito per queste
sostanze dei limiti massimi residuali (LMR) in tessuti e latte ed
ha imposto agli Stati Membri l’obbligo di inserire tale ricerca tra
i controlli ufficiali previsti dal Piano Nazionale Residui (PNR) ed
effettuati dagli Istituti Zooprofilattici Sperimentali (II.ZZ.SS.).
Grazie alla elevata sensibilità, alla buona riproducibilità e al
basso costo, la cromatografia liquida con rivelatore fluorimetrico
(HPLC-FLD) risulta la tecnica strumentale ottimale per la ricerca
e la determinazione quantitativa di avermectine e milbemicine
(1,2); infatti le tecniche immunochimiche ELISA non sono in
grado di rilevare tutti gli analiti, mentre le tecniche HPLC con
rivelatore a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) sono
molto più costose. Recentemente è stato pubblicato uno
studio relativo allo sviluppo e validazione di un metodo per la
ricerca di avermectine (ivermectina, doramectina, abamectina,
emamectina, eprinomectina) e milbemicine (moxidectina)
in fegato, muscolo e latte mediante HPLC-FLD idoneo alla
esecuzione di analisi sia di screening che di conferma nell’ambito
dei controlli ufficiali (3). Durante le prove di trasferimento del
metodo ad altri laboratori della Rete II.ZZ.SS. è emerso che un
punto critico nella preparazione del campione è rappresentato
dalla fase di purificazione SPE.
Con alcuni lotti di colonnine SPE amminiche si verificava la
perdita pressoché totale della ivermectina; è stata avanzata
l’ipotesi che il problema fosse correlato alla presenza nella fase
stazionaria silicea di metalli in grado di dare origine a chelati con
il macrolattone. Per i laboratori che eseguono controlli ufficiali
nell’ambito della sicurezza alimentare è di primaria importanza
che il metodo di analisi utilizzato sia robusto, al fine di contenere
i tempi di risposta. Il presente lavoro descrive i risultati di uno
studio comparativo effettuato su colonnine SPE a scambio
anionico di diverse ditte e con fase stazionaria sia silicea che
polimerica.
MATERIALI E METODI
La procedura di analisi prevede le seguenti fasi: a)
omogeneizzazione e pesata (5 g di tessuto e latte); b) estrazione
con 2x10 ml di acetonitrile e 5 g di sodio solfato anidro in agitatore
ad inversione per 10’; c) sgrassatura (2x5 ml di n-esano); d)
evaporazione (10 ml di estratto sono evaporati in corrente di
azoto a 60°C ed il residuo è sciolto in 200 ml di acqua + 2.5 ml di
etile acetato); e) purificazione mediante filtrazione su colonnine
SPE amminiche (500 mg); f) concentrazione (evaporazione
in corrente di azoto a 55°C); g) derivatizzazione mediante
aggiunta sequenziale di 400 ml di acetonitrile, 100 ml di miscela
1-metilimidazolo / acetonitrile (1 + 1 v/v), 50 ml di trietilamina,
150 ml di miscela anidride trifluoroacetica / acetonitrile (1 +
2 v/v), 50 ml di acido trifluoroacetico e incubazione in stufa a
70°C per 30 minuti; h) analisi strumentale HPLC-FLD condotta
secondo le condizioni analitiche riportate in tabella 1. L’ordine di
eluizione degli analiti è riportato in tabella 2.
Tabella 1 – Condizioni analitiche HPLC
256
Colonna
Precolonna
Temperatura forno
Volume di iniezione
Flusso
Stop time
Detector FLD
Gain
Eluenti
Programma di
eluizione a gradiente
Phenomenex LUNA C8(2) (150 x
4.6 mm i.d., 3 mm)
RP-18 (4 x 3 mm i.d., 5 mm)
30°C
20 mL
0.8 mL/min
30 minuti
λecc = 365 nm, λemis = 470 nm
16
A = acqua B = acetonitrile
Tempo (min)
%A
%B
0.00
10
90
10.00
10
90
13.00
5
95
26.00
5
95
27.00
10
90
30.00
10
90
Durante lo studio comparativo sono state confrontate colonnine
SPE a scambio anionico di differenti ditte (tab. 3).
Per ogni tipologia di colonne oltre al recupero è stata
verificata la specificità, testando in parallelo campioni bianchi
e i corrispondenti fortificati per ognuna delle matrici. Per
eliminare variabili legate alla fase di estrazione e sgrassatura
e focalizzare l’attenzione sulle prestazioni delle cartucce SPE,
l’aggiunta degli analiti è stata effettuata sull’estratto prima del
caricamento in colonna.
Tabella 3 – Tipologie colonne SPE confrontate
TIPOLOGIA
FASE
Quantità
Phenomenex Strata NH2
Silicea
500 mg
J. T. Baker NH2
Silicea
500 mg
Biotage IST NH2
Silicea
500 mg
M.N. Chromabond NH2
Silicea
500 mg
Agela Cleanert NH2
Silicea
500 mg
Phenomenex Strata X-AW
polimerica
200 mg
Phenomenex Strata X-AW
polimerica
500 mg
Durante lo studio comparativo sono state confrontate dapprima
colonnine SPE Phenomenex Strata NH2 di lotti diversi; come
evidenziato in Figura 1, le prestazioni sono notevolmente lottodipendenti, in alcuni casi con perdita totale della ivermectina.
Figura 1: cromatogrammi di estratti di fegato purificati su
lotti diversi di colonne Phenomenex NH2.
Analogo comportamento si rileva con le cartucce J.T. Baker
NH2.
Nella fase successiva, sulla matrice fegato sono state testate in
parallelo colonne SPE amminiche a base silicea di differenti ditte
(Biotage IST NH2, M.N. Chromabond NH2 e Agela Cleanert
NH2) e SPE a scambio anionico debole su fase stazionaria
polimerica rispettivamente da 500 e 200 mg (Phenomenex
Strata X-AW).
La scelta della fase stazionaria polimerica deriva dalla
considerazione che essa dovrebbe esser esente da metalli;
tuttavia le colonne a base polimerica richiedono una attenta
valutazione, in quanto lo scambiatore anionico è coperto da
brevetto e non è noto se sia un gruppo amminico; inoltre va
verificata la prassi generale secondo cui è sufficiente una
quantità di fase stazionaria minore rispetto alla silicea per
ottenere risultati equiparabili, per cui è stata fatta anche una
prova comparativa tra cartucce 200 mg e 500 mg.
Da queste prove è emerso che le prestazioni migliori in termini
di recupero e ripetibilità si hanno con le SPE amminiche a base
silicea IST Biotage 500 mg e con le SPE a base polimerica
Phenomenex Strata X-AW 200 mg.
Infine, in una prova più ampia comprendente le varie matrici
e specie sono state confrontate le prestazioni di queste due
tipologie di colonne (IST 500 mg e Strata X-AW 200 mg).
Per quanto concerne la specificità, le colonnine a base silicea
IST Biotage 500 mg si sono rivelate nettamente migliori per
la matrice fegato e muscolo, come evidenziato in FIGURA 2,
mentre sono equiparabili per la matrice latte (FIGURA 3): i
cromatogrammi degli estratti di fegato e muscolo purificati su
cartucce Strata X-AW presentano un fondo molto più elevato
soprattutto nei primi 10 minuti di corsa, sebbene non si rilevino
picchi di interferenti che potrebbero mascherare il segnale
della eprinomectina. Si rileva che le provette dell’estratto
derivatizzato per fegato e muscolo presentano una colorazione
più brunastra e opaca quando si utilizza le cartucce Strata
X-AW rispetto alle IST.
Figura 2: cromatogrammi di estratti di fegato bianchi
purificati rispettivamente su IST e Strata X-AW.
257
Figura 3: cromatogrammi di estratti di latte bianchi
purificati rispettivamente su IST e Strata X-AW
Relativamente al recupero e alla ripetibilità, certamente il
confronto non è semplice, in quanto una variabile significativa
è rappresentata dalla fase di derivatizzazione che segue la
purificazione. In generale si nota che la ripetibilità tra repliche
è buona per tutte le matrici (CV% < 15). I valori di recupero di
prove eseguite per la matrice fegato sono simili per le diverse
specie considerate (bovino, suino, pollo e coniglio) e non
indicano significative differenze tra le tipologie di colonnine.
Analogo comportamento è stato riscontrato per la matrice
muscolo. I valori di recupero per la matrice latte sono simili per
le diverse specie considerate (bovino, ovicaprino e bufalino) e
non indicano significative differenze tra le tipologie di colonnine.
BIBLIOGRAFIA
1)Danaher M., O’Keeffe M., Glennon J.D., Howells L. (2001)
Development and optimisation o fan improbe derivatisation
procedure for the determination of avermectins and
milbemycins in bovine liver. Analyst, 126, 576-580
2)Danaher M., Howells L., Crooks S.R., Cerkvenik-Flajs
V., O’Keeffe M. (2006) Review of methodology for the
determination of macrocyclic lactone residues in biological
matrices. J. Of Chromatogr. B, 544, 175-203
3)Galarini R., Saluti G., Moretti S., Giusepponi D., Dusi G.
(2013) Determination of macrocyclic lactones in food and
feed Food Add. and Contam., 2, 2-12
RILEVAMENTO DI LARVE DI TOXOCARA SPP. IN MUSCOLI DI CORVIDI SOTTOPOSTI A
DIGESTIONE ARTIFICIALE PER LA RICERCA DI TRICHINELLA SPP.
Garbarino C.1, Rubini S.2, Merialdi G.3, Merenda M.4, Bolognesi E.2, Licata E.5, Genchi C.6, Marucci G.7, Pozio E. 7
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia-Romagna “Bruno Ubertini”
1
Sezione di Piacenza; 2Sezione di Ferrara; 3 Sezione di Bologna;; 4Sezione di Parma;
5
Regione Emilia Romagna, Bologna;
6
Università degli studi, Facoltà di Medicina Veterinaria, Milano;
7
Istituto Superiore di Sanità, Roma
Key words: Toxocara spp., Trichinella spp., Corvidae.
ABSTRACT
In the Emilia Romagna region (Northern Italy), birds of the
family Corvidae have been considered as “indicator” species for
Trichinella pseudospiralis to recognize pig herd as Trichinella
free. From 2011 to 2013, about 1,000 Corvidae were submitted
for Trichinella testing by artificial muscle digestion on pooled
samples (3 - 10 animals) and 28 of them (most European
magpie, Pica pica) from Ferrara, Parma and Piacenza provinces,
were positive for nematode larvae identified as Toxocara spp.
or Toxocara cati by PCR and sequencing of specific molecular
markers. Corvidae roaming on soil contaminated by dog and cat
faeces, can ingest Toxocara embrionated eggs and larvae can
invade their muscle tissues. The high prevalence of Toxocara
spp. larvae in magpies stresses the need to provide a correct
larva identification at the species or genus level to avoid the
report of false Trichinella spp. larvae causing an unnecessary
alarm for the veterinary and public health services.
INTRODUZIONE
Il monitoraggio nella fauna selvatica delle patologie trasmissibili
agli animali domestici e all’uomo è essenziale per la valutazione
del rischio. In zone in cui coabitano animali selvatici ed
allevamenti di suini candidati alla qualifica di “azienda esente da
Trichinella”, il Regolamento comunitario (Reg. CE 2075/2005)
(3) prevede, accanto alla soddisfazione di altri requisiti, il
monitoraggio di questo parassita in animali selvatici individuati
come indicatori. Dal 2006, la Regione Emilia Romagna ha
individuato nell’ambito del Piano di controllo della fauna
selvatica quali animali indicatori i corvidi (cornacchia grigia,
Corvus cornix corona; gazza, Pica pica) e la volpe (Vulpes
vulpes). Le larve di Trichinella spp. sono ricercate nel tessuto
muscolare mediante digestione artificiale. Successivamente le
larve di nematodi isolate devono essere identificate a livello di
specie o di genere per la valutazione del rischio.
MATERIALI E METODI
In Emilia Romagna circa 1.000 corvidi sono annualmente
sottoposti alla ricerca di larve di Trichinella spp. tramite
digestione artificiale. Le carcasse degli uccelli provengono
dall’attività venatoria, da piani provinciali di controllo autorizzati
, o da soggetti rinvenuti morti sul territorio.
La ricerca di larve di Trichinella spp. viene effettuata secondo
quanto indicato nell’Allegato I Capitolo I e nell’allegato III del
Regolamento CE n°2075/2005.
Prelievo del muscolo: sono stati prelevati i muscoli del capo
(collo e masticatori) e, se non veniva raggiunto il peso di
almeno 10 g, ulteriori porzioni di tessuto muscolare sono state
prelevate da altri distretti. Il test è stato effettuato su pool di
tessuto muscolare proveniente da 3 - 10 animali. In caso di
esito positivo, è stato effettuato un esame sui singoli animali
258
per verificare il numero di animali infestati.
Digestione artificiale: i muscoli sono stati sminuzzati e sottoposti
all’azione di una soluzione di acido cloridrico e pepsina
mantenuta in agitazione a 45°C per 30 minuti.
Lettura: il sedimento del liquido di digestione è stato sottoposto
ad osservazione allo stereomicroscopio entro 30 minuti.
Tipizzazione delle larve: Le larve reperite sono state
conservate in alcool etilico a 70-90% per l’identificazione della
specie o del genere presso l’Istituto Superiore di Sanità (ISS).
L’identificazione delle larve è stata effettuata mediante PCR e
sequenziamento di marcatori molecolari specifici (12S mtDNA;
COI, 18S rDNA e ITS1) (1).
Tra maggio e settembre 2011, in 4 comuni della provincia di
Piacenza, sono state rilevate larve di nematodi in 4 pool di
muscoli di cornacchie su 14 esaminati. Le larve sono state
identificate come Toxocara cati. Nei primi 7 mesi del 2013 in
provincia di Ferrara, in 17 comuni, larve di nematodi sono state
reperite in 23 pool di gazze (solo in un pool oltre ai muscoli
delle gazze vi erano i muscoli di una cornacchia) su 28
esaminati. Tutte le larve sono state identificate come Toxocara
spp. Nel mese di aprile 2013, un pool esaminato, costituito da
corvi (Corvus frugilegus) provenienti dalla provincia di Parma è
risultato positivo per larve di Toxocara spp.
L’isolamento mediante digestione artificiale di tessuto
muscolare di larve di nematodi diverse da quelle del genere
Trichinella mette in evidenza la necessità di una corretta
identificazione delle larve per non creare falsi allarmi.
Trichinella pseudospiralis è l’unica specie del genere Trichinella
in grado di infettare gli uccelli oltre ai mammiferi, tuttavia questo
parassita è stato isolato dagli uccelli naturalmente infetti solo
sette volte a livello mondiale (2). In Italia, questo parassita è
stato isolato nelle Marche da due uccelli notturni carnivori,
in Friuli da cinghiali d’allevamento, in Emilia Romagna da un
cinghiale oggetto di attività venatoria e in Toscana da una volpe
e da un cinghiale anch’esso proveniente dall’attività venatoria.
L’elevata prevalenza di Toxocara spp. nelle gazze ed in alcuni
corvi è compatibile con le abitudini alimentari di questi animali
onnivori che possono svolgere il ruolo di ospiti paratenici di
Toxocara spp. Le larve rinvenute nel tessuto muscolare possono
avere tre diverse origini: 1. ingestione di uova embrionate
eliminate nell’ambiente dagli ospiti definitivi (cani o gatti) da cui
fuoriescono le larve che migrano nei tessuti dell’ospite (larva
migrans viscerale) (4); 2. ingestione di piccoli roditori già ospiti
paratenici di Toxocara spp.; e 3. contaminazione del tessuto
muscolare con larve presenti in altri distretti (ad esempio il
fegato) a causa dell’azione traumatica di proiettili.
Le dimensioni delle larve di Toxocara spp. sono inferiori rispetto
a quelle di Trichinella spp. ed anche la morfologia delle due
259
Figura 3. Larva di Trichinella spp. al microscopico ottico.
larve è differente: le larve di Toxocara spp. mostrano maggior
dimorfismo tra l’estremità cervicale e caudale ed in particolare
quest’ultima (Figura 1 e 2) si assottiglia maggiormente
rispetto alle larve di Trichinella spp. (Figura 3). Tuttavia
apprezzare queste differenze richiede specifica attrezzatura ed
esperienza e l’identificazione su base morfologica deve essere
successivamente confermata mediante analisi molecolare
(ad esempio PCR) e sequenziamento di marcatori molecolari
specifici. In relazione all’alta prevalenza di larve di Toxocara
spp. nei corvidi, si sottolinea l’importanza di inviare comunque
le larve al Laboratorio di riferimento (ISS), come previsto dal
Regolamento, per arrivare ad una corretta identificazione delle
stesse a livello di specie o genere, ed evitare inutili allarmismi.
DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA LEPTOSPIROSI IN FAUNA DOMESTICA E
SELVATICA DEL TERRITORIO PALERMITANO
Gargano V., Vesco G., Sciacca C., Arnone M., Lo Giudice V., Villari S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia “A. Mirri” - via Gino Marinuzzi, 3 90129 Palermo, Italy
Keywords: Leptospirosis, MAT, PCR
Figura 1. Larva di Toxocara cati al microscopio ottico.
BIBLIOGRAFIA
1. Marucci G., Interisano M., La Rosa G., Pozio E.,
(2013) Molecular identification of nematode larvae
different from those of Trichinella genus detected by
muscle digestion – 117- 120, Veterinary Parasitology.
2. Pozio E., Zarlenga D.S., (2013). New pieces of the
Trichinella puzzle .New. Int. J. Parasitol. (in press)
3. Regolamento (CE) n. N. 2075/2005 della
Commissione
del 5 Dicembre 2005 che definisce norme specifiche
applicabili ai controlli ufficiali relative alla presenza di
Trichine nelle carni. GU CE L 338 del 22.12.2005 .
4 Soulsby: (1982) 7th edition Helminths, Arthropods
and protozoa of domesticated animals – 152-155
Figura 2. Larva di Toxocara cati al microscopio ottico.
260
SUMMARY
Leptospirosis is caused by pathogenic spirochetes belonging
to genus Leptospira, responsible for a worldwide zoonosis
with humans as occasional hosts in a cycle involving wild
and domestic animals. The main reservoirs are rodents; they
excrete leptospires by urine, contaminating hydric environment
and transmitting the disease to other animals or humans.
Leptospirosis is mainly diagnosed by serological tests, but
antibodies are detected quite late, more than one week after
the onset of symptoms. Bacteriological diagnosis is complex
because it requires fresh tissue or urine samples and a
long time of incubation, thus inducing a late result (several
weeks). Nevertheless, early PCR bacterial DNA detection on
biological samplings tends to replace serological tests. So
far, leptospirosis remains a major public health issue in many
developing Countries, and it is expected to become even more
serious due to: rapid urbanization (slums), global warming, and
extreme climatic events (floods).
Introduzione
Gli agenti eziologici delle leptospirosi sono i batteri appartenenti
all’ordine Spirochetales, ed in particolare Leptospira interrogans,
di cui si conoscono più di 200 sierovarianti raggruppate in 23
sierogruppi di parentela antigenica. Tra le varianti che più
frequentemente colpiscono l’uomo e l’animale vi sono: L.
interrogans var. icterohaemorragiae, canicola, autumnalis,
hebdominis, australis, pomona e hardjo. La leptospirosi è una
patologia a diffusione mondiale che colpisce molte specie
animali. Nelle aree in cui la leptospirosi è endemica la maggior
parte delle infezioni decorre in forma subclinica o comunque in
forma troppo lieve per essere diagnosticata: ciò dipende dalla
sierovariante coinvolta nell’infezione. La Leptospira sopravvive
per settimane o mesi negli ambienti umidi, ma non nei climi
secchi; la malattia può essere trasmessa per contatto diretto
con urine o tessuti di animali infetti, o indirettamente attraverso
la contaminazione ambientale di acque e terreni, specie in
presenza di acqua stagnante. I batteri sono capaci di penetrare
attraverso soluzioni di continuo di mucose e cute e di replicarsi
nel sangue, nell’epitelio dei tubuli renali e nel fegato, causando
lesioni in molti organi parenchimatosi, in particolare rene e
fegato, (1). Si tratta di una malattia diffusa in tutto il mondo,
in aree urbane come in zone rurali, in aree sviluppate come
in aree in via di sviluppo, con l’unica eccezione delle regioni
polari. Per via del rischio professionale è una malattia che
colpisce prevalentemente gli adulti, anche se sembra essere in
aumento nei bambini nelle città. Dal punto di vista della sanità
pubblica veterinaria, l’incidenza della leptospirosi in specie
domestiche e selvatiche in Sicilia non è nota. Sporadicamente
si presentano focolai di infezione negli allevamenti, e titoli
significativi sono stati rilevati anche in assenza di manifestazioni
cliniche, indicando che l’infezione è diffusa ma sottostimata. Per
quanto concerne la fauna selvatica, un’evidenza che riguarda
la diffusione di questa zoonosi è data dalla maggior incidenza
di questa sindrome riscontrata in tarda estate-autunno, in
concomitanza con l’attività venatoria e l’aumento delle piogge.
Alla luce di quanto premesso, lo scopo del nostro lavoro è
stato quello di valutare la presenza di tale infezione nella fauna
selvatica e cittadina del Palermitano per evidenziare il possibile
ruolo dei selvatici nella sua diffusione (2, 3). A tale scopo, è
stata messo a punto anche un sistema di diagnosi molecolare
tramite Real-Time PCR, da eseguire su reperti autoptici e su
campioni di urine laddove non fosse possibile effettuare l’esame
colturale ed i test sierologici di Microscopic Agglutination test
(MAT), già validamente applicati presso i nostri laboratori. A tale
scopo è stata scelto come target il gene lipL32, che codifica per
una proteina della membrana esterna presente solo nei ceppi
patogeni (4).
Materiali e Metodi
Esame Sierologico MAT
Questo test si fonda sulla reazione di agglutinazione del
complesso antigene anticorpo per la cui visualizzazione si
rende necessario l’utilizzo del microscopio in campo oscuro,
dato il ridotto diametro delle leptospire. La prova è specifica
per la sierovariante di Leptospira spp. e per quelle ad essa
correlate antigenicamente (sierogruppo). Il siero in esame è
direttamente messo a contatto con colture vive di Leptospira
spp, coltivate in terreno E.M.J.H. (Ellinghausen-McCulloghJohnson-Harris) a 30°C per 4-8 giorni, costituite da ceppi
tipizzati da laboratori di referenza nazionale o internazionale
e rappresentativi degli 8 sierogruppi di rilevanza veterinaria
presenti in Italia (v. tabella 1).
Tabella 1 - Sierogruppi di L. interrogans impiegati nei test
sierologici
Specie
Sierogruppo
Sierovariante
L. interrogans
Australis
Bratislava
L. borgpetersenii
Ballum
Ballum
L. interrogans
Canicola
Canicola
L. kirschneri
Grippotyphosa
Grippotyphosa
L. interrogans
Icterohaemorrhagiae
Copenhageni
L. interrogans
Pomona
Pomona
L. interrogans
Sejroe
Hardjo
L. borgpetersenii
Tarassovi
Tarassovi
Il metodo si articola in due parti: Screening e Titolazione.
Screening: pari volumi del campione sierologico (previamente
diluito) e degli antigeni vengono messi a contatto su piastra,
che una volta agitata viene incubata a 30±2 °C per 2 – 4 ore.
Titolazione: i campioni risultati positivi allo screening vengono
diluiti scalarmente e messi in contatto, nelle stesse condizioni
della prima parte della prova, con il/gli antigene/i nei confronti
del/i quale/i è stata evidenziata la reazione. In entrambe
viene valutata l’entità della reazione considerando sia le
261
leptospire agglutinate (per confronto con controlli realizzati con
ciascun antigene messo in contatto con il rispettivo antisiero
omologo), sia la densità delle leptospire libere (per confronto
con controlli allestiti con i soli antigeni diluiti). Su ogni piastra
vengono allestiti i seguenti controlli: 1. controllo di lettura (50%
agglutinazione): 50 μl di ogni antigene e 150 μl di soluzione
fisiologica; 2. controllo degli antigeni (0% agglutinazione): 100
μl di ciascun antigene più 100 μl di sol. fisiologica; 3. controllo
negativo: 100 μl di ciascun antigene più 100 μl di un siero
negativo; 4. controllo positivo: 100 μl di ciascun antigene più
100 μl del rispettivo antisiero omologo.
Esame Colturale: I materiali da sottoporre a coltura devono
essere prelevati asetticamente; sia i tessuti che i fluidi devono
pervenire in laboratorio tempestivamente per evitare l’autolisi
tissutale e lo sviluppo di una flora batterica contaminante.
Per una migliore conservazione del campione è opportuno
utilizzare terreno di coltura liquido contenente 1% di
sieroalbumina bovina con aggiunta di 100-200 microgrammi/
ml di 5-flurouracile, da utilizzare come mezzo di trasporto.
Il rene è l’organo di elezione del patogene e quindi il miglior
candidato per l’esecuzione dell’esame colturale, ma possono
essere utilizzate anche le urine. URINE: idealmente le urine
devono arrivare in laboratorio in tempi brevissimi ed essere
seminate in terreno colturale immediatamente, per evitare
variazioni del pH che potrebbero pregiudicare la sopravvivenza
delle Leptospire. Le urine possono essere seminate tal quali
o dopo filtrazione (con filtri per siringhe da 0,45 µm), e/o dopo
l’aggiunta di neomicina e 5-fluorouracile per ridurre la presenza
di contaminanti. RENE: con l’aiuto di un bisturi sterile si rimuove
la capsula esterna, si seziona il rene longitudinalmente e si
preleva un piccolo frammento dalla zona midollare, del peso
di circa 10 g. Il frammento di tessuto viene omogeneizzato in
circa 50 ml di soluzione salina, e dopo l’opportuna diluizione
viene seminato su terreno specifico. Le colture così ottenute
vengono incubate in termostato a 30°C per 16-26 settimane. Il
tempo di incubazione richiesto varia in base al tipo di serovar
ed al numero di organismi presenti nel campione, ma tutte le
colture devono essere trasferite in terreno fresco ad intervalli
regolari di un mese. Le leptospire in coltura vengono esaminate
ogni 1-2 settimane al microscopio in campo oscuro e sono
identificate sulla base della loro tipica morfologia e motilità.
Diagnosi Molecolare: Per la diagnosi molecolare di leptospirosi
è stata messa a punto un test di Real-Time PCR con sonda
ad idrolisi, scegliendo come target il gene lipL32, che codifica
per una proteina della membrana esterna del batterio presente
esclusivamente in specie patogene (5). Le sequenze dei
primers e della sonda sono riportate in tabella 2.
Tabella 2 Sequenze nucleotidiche dei primers e della sonda
ad idrolisi per l’amplificazione del gene lipL32
Oligonucleotide
Sequenza 5’-3’
Primer F
GGTCTTTACACAATTTCTTTCACT
Primer R
TGGGAAAAGCAGACCAACAGA
Sonda
AAGTGAAAGGATCTTTCGTTGTTGC
Come controllo positivo è stato utilizzato il DNA estratto da
un ceppo di riferimento certificato fornito dal Royal Tropical
Institute di Amsterdam e mantenuto in coltura presso i nostri
laboratori. Il DNA di Leptospira è stato standardizzato alla
concentrazione di 1 x 106 GE/μl; per valutare la sensibilità
della metodica è stato determinato il LOD (Limit Of Detection),
allestendo delle diluizioni seriali in base 10 di tale soluzione. La
diagnosi molecolare tramite PCR Real-Time è stata eseguita
su tutti i reperti autoptici pervenuti in laboratorio, secondo il
protocollo mostrato in tabella 3.
Tabella 3 Protocollo PCR Real-Time
Master Mix
Concentrazione per ciascuna
reazione
Ready Master Mix 5X
1X
Primers Forward lipL32
20mM
Primers revers lipL32
20mM
Bibliografia
1. Adler
B,
de
la
Peña
Moctezuma
A.
Leptospira and leptospirosis. Vet Microbiol. 2010 Jan 27;140(34):287-96. doi: 10.1016/j.vetmic.2009.03.012. Epub 2009 Mar
13. Review.
2. Andalusia, Spain. Millán J, Candela MG, López-Bao
JV, Pereira M, Jiménez MA, León-Vizcaíno L. Leptospirosis
in wild and domestic carnivores in natural areas in Vector
Borne Zoonotic Dis. 2009 Oct;9(5):549-54. doi: 10.1089/
vbz.2008.0081
3. Bengis RG, Leighton FA, Fischer JR, Artois M, Mörner
T, Tate CM. The role of wildlife in emerging and re-emerging
zoonoses. Rev Sci Tech. 2004 Aug;23(2):497-511. Review.
4. Musso D, La Scola B. Laboratory diagnosis of leptospirosis:
A challenge. J Microbiol Immunol Infect. 2013 Aug;46(4):24552. doi: 10.1016/j.jmii.2013.03.001. Epub 2013 Apr 29.
5. Stoddard RA. Detection of Pathogenic Leptospira spp.
Through Real-Time PCR (qPCR) Targeting the LipL32 Gene
Methods Mol Biol. 2013;943:257-66. doi: 10.1007/978-160327-353-4_17.
0.4 mM
0.4mM
Sonde ad isrolisi 10mM
0.2 mM
DNA
10 ng
Fino a volume finale di 25
microlitri
H2O
Il programma di amplificazione prevede, dopo 5 min di
denaturazione iniziale, 40 cicli di amplificazione (95°C per 20
sec e 60°C per 1 min). Come controllo interno di amplificazione
è stato usato usato il Kit QuantiFast Phatogenn PCR (QIAGEN).
Risultati e Conclusioni
Durante l’anno 2012 e il primo semestre 2013 sono stati
analizzati (presso l’IZS Sicilia, Area Diagnostica Sierologica,
laboratorio di Sierologia Generale) tramite test MAT un totale
di nr. 7277 sieri, 14 dei quali sono risultati positivi: nr. 11 sieri
bovini (per la sierovariante hardjo) e nr. 3 sieri canini (due per
la sierovariante copenhageni e uno per canicola). Per quanto
riguarda l’isolamento colturale sono stati eseguiti un totale di
nr. 120 esami, nessuno dei quali ha dato esito positivo. La
diagnosi molecolare è stata eseguita su tutti i reperti autoptici
ed i campioni di urine pervenuti in laboratorio per i quali non è
stato possibile eseguire l’esame colturale, a causa della cattiva
o non idonea conservazione del campione. In particolare,
sono stati sottoposti a PCR Real-Time nr. 50 campioni di DNA
proveniente da organi pervenuti in laboratorio in avanzato
stato di deterioramento; tutti i campioni analizzati sono risultati
negativi. La diagnosi molecolare è stata eseguita, inoltre,
su reperti autoptici provenienti da diversi esemplari di fauna
selvatica e cittadina ritrovati nel territorio Palermitano, per un
totale di nr. 123 campioni di rene di canide e nr. 26 campioni
di rene di ratto. Tra questi, sono risultati positivi un campione
appartenente alla specie Vulpes vulpes ed uno appartenente
alla specie Rattus rattus.
Tra gli obiettivi futuri del nostro laboratorio vi è quello di riuscire
ad eseguire questo tipo di analisi specificamente sugli organi e
sulle urine degli animali positivi al test sierologico. La presenza
di specie patogene di Leptospira nel, seppur esiguo, campione
preso in esame lascia ipotizzare un possibile ruolo della fauna
selvatica e cittadina nella diffusione di tale patologia, che
negli ultimi anni è stata considerata una zoonosi riemergente
a causa della confluenza di persone ed animali nello stesso
ambiente ed alla maggiore densità degli allevamenti, ma
anche della maggiore incidenza di disastri naturali dovuti al
surriscaldamento globale, con espansione della zona climatica
tropicale e subtropicale.
262
263
Sviluppo di marcatori mitocondriali per l’identificazione di specie
dalle matrici di esche avvelenate: un contributo alle indagini
forensi nei reati contro gli animali.
Garofalo L.1, Fanelli R.1, Fico R.2, Lorenzini R.1
Centro di Referenza Nazionale per la Medicina Forense Veterinaria, Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Lazio e Toscana,
Via Tancia, 21 - 02100 Rieti;
2
Centro di Referenza Nazionale per la Medicina Forense Veterinaria, Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Lazio e Toscana,
Viale Europa, 30 - 58100 Grosseto
1
Keywords: identificazione di specie, esche avvelenate, genetica forense
SUMMARY
European laws prohibit or restrict the use of poisoned baits.
However, their laying still represents a serious threat for wild
and domestic animals. A conspicuous number of poisoned
animals are delivered yearly to “Centro di Referenza Nazionale
per la Medicina Forense Veterinaria”, together with poisoned
baits found on the crime scene. Tissues that make up the baits
and food ingested by the victims are analysed to search for both
toxic and species composition. We designed new primer sets
to amplify and sequence small mitochondrial DNA segments
from degraded samples: four fragments in the 12S of different
species and two additional markers specific to mammals (CytB)
and birds (ND6). All the sequences obtained from reference
samples correctly identified the species. Genetic results can
link an alleged poisoner to the offence, and by delineating
the perpetrator’s “modus operandi” one can narrow the
investigation. The new markers were successfully used in 18
forensic cases during 2013.
INTRODUZIONE
L’utilizzo di esche e bocconi avvelenati è proibito o
regolamentato da leggi nazionali ed europee. Ciononostante,
questa pratica illegale continua ad essere diffusa in numerosi
paesi, Italia compresa. Il rilascio di esche avvelenate in natura
costituisce una seria minaccia per la fauna selvatica, mentre
nelle aree urbane è altamente pericoloso per animali da
compagnia, nonché per l’uomo (in particolare per i bambini).
Ogni anno vengono conferiti presso il “Centro di Referenza
Nazionale per la Medicina Forense Veterinaria” numerosi
animali avvelenati, insieme ad esche ritrovate sulla scena del
crimine o, in generale, sul territorio. Le esche ed i contenuti
stomacali, questi ultimi prelevati durante la necroscopia delle
vittime, vengono analizzati alla ricerca di sostanze tossiche e
inoltre, quando possibile, viene condotta una tipizzazione del
DNA delle specie che compongono la matrice organica dei
bocconi. Il DNA estratto dalle esche e dai contenuti stomacali è
spesso poco e di scarsa qualità, per questo l’identificazione di
specie non può essere condotta con i marcatori generalmente
impiegati per il DNA barcoding (2,3). Esso si basa, infatti, sul
sequenziamento di frammenti mitocondriali (mt) lunghi almeno
600 paia di basi (bp), i quali sono difficilmente amplificabili a
partire dall’esiguo materiale biologico rintracciabile nei reperti
forensi. Nel presente lavoro l’identificazione di specie è stata
condotta utilizzando un nuovo set di primer disegnati per
amplificare e sequenziare piccoli segmenti di DNA a partire da
campioni fortemente degradati.
MATERIALI E METODI
L’estrazione del DNA è stata condotta su varie matrici biologiche
utilizzando il DNA IQTM Casework Sample Kit e il Maxwell 16
LEV System (Promega). I campioni di riferimento su cui testare
inizialmente i nuovi primer sono stati scelti in modo da coprire
la gamma di specie più frequentemente analizzate dal nostro
Laboratorio di Genetica nel periodo 2009-2012: Bos taurus,
Sus scrofa, Ovis aries, Cervus elaphus, Capreolus capreolus,
Hystrix cristata, Equus caballus, Canis lupus, Felis catus,
Lepus europaeus, Vulpes vulpes, più altre meno comuni.
Tutte queste specie sono state incluse nei diversi allineamenti
creati per disegnare primer universali per l’identificazione
di specie. A questo scopo, sono state individuate all’interno
del DNA mitocondriale le regioni più informative, cioè quelle
in cui la variabilità inter-specifica fosse massimizzata. Al
contrario, i siti adatti all’annealing dei primer sono stati scelti
cercando i tratti di DNA maggiormente conservati tra le
specie considerate. Le sequenze sono state allineate tramite
il programma di allineamento multiplo incluso nel pacchetto
Vector NTI versione 9.1 (Invitrogen). Proprietà e compatibilità
dei primer disegnati (es. temperatura di melting, stabilità al 3’,
autocomplementarietà, %GC, ecc.) sono state verificate con il
programma Primer3 versione 0.4.0. (4). Alla fase di disegno
dei primer è seguita la messa a punto dei diversi protocolli
di amplificazione (disponibili su richiesta). La dimensione dei
frammenti amplificati è stata controllata tramite elettroforesi su
gel di agarosio. In ogni sessione di PCR sono stati introdotti
controlli negativi di estrazione ed amplificazione. I prodotti di
PCR sono stati purificati con il QIAquick PCR Purification Kit
(Qiagen). La reazione di sequenza è stata condotta con il BigDye
Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems),
seguendo le procedure standard per il sequenziamento con un
ABI Prism 3130-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
La reazione di sequenza è stata purificata con l’ Agencourt
CleanSEQ Dye Terminator Removal Kit (Beckman Coulter).
Fig. 1 – Posizione approssimativa dei 5 primer disegnati per
amplificare frammenti di diversa lunghezza nel 12S.
4 ° fram .: 4 2 7 b p
FWD 3
FWD 1
3 fram .: 3 2 7 b p
°
2 ° fram .: 2 6 7 b p
FWD 2
FWD 1
1 ° fram .: 2 3 1 b p
R E V1
R E V2
R E V2
R E V1
1 2 S
2° MARCATORE: un segmento di 483 bp nel gene CytB,
specifico per i mammiferi. In questa coppia di primer, il forward
è situato nel tRNAGlu (che negli uccelli non fiancheggia il CytB,
Fig.2a e b), mentre il reverse è localizzato in una regione
conservata del gene CytB. Il frammento così ottenuto è di 483
bp, e contiene una variabilità inter-specifica sufficiente per
l’identificazione delle diverse specie di mammiferi.
3° MARCATORE: un segmento di 387 bp nel gene ND6,
specifico per gli uccelli. Nella molecola circolare di mtDNA dei
mammiferi il gene ND6 viene direttamente dopo il gene ND5
ed è seguito dal tRNAGlu (Fig.2a). Al contrario, il gene ND6
nel mtDNA degli uccelli è fiancheggiato a sinistra dal tRNAPro
e a destra dal tRNAGlu (Fig.2b). Abbiamo quindi posizionato il
forward di questa coppia di primer nel tRNAPro ed il reverse
all’interno del gene ND6. In tal modo, solo il DNA di specie
aviarie viene amplificato con questo marcatore, producendo un
frammento di 387 bp su gel. Utilizzando questi primer, abbiamo
amplificato e sequenziato campioni di riferimento appartenenti
a: Passeriformes, Columbiformes, Anseriformes, Strigiformes,
Accipitriformes, Falconiformes e Galliformes.
Tutte le sequenze ottenute con i tre diversi marcatori hanno
correttamente identificato le specie dei campioni di riferimento.
Le sequenze sono state inoltre confrontate con quelle
depositate in database online, quali ad esempio GenBank
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
In conclusione, proponiamo qui una nuova combinazione di
marcatori genetici universali e specifici per scopi forensi. Nei
casi di avvelenamento i risultati derivanti dall’identificazione di
specie possono permettere di collegare un presunto colpevole
al crimine. Per esempio, dimostrare che il contenuto gastrico
delle vittime o l’esca avvelenata contiene carne appartenente
a specie animali possedute anche dal sospettato, oppure
se la carne utilizzata per veicolare il tossico appartiene ad
un animale imparentato con individui della stessa specie
posseduti dal sospettato, diviene un elemento basilare per
restringere il campo delle indagini ed arrivare alla soluzione del
caso. I nuovi marcatori sono stati impiegati con successo in 18
casi forensi analizzati nei primi mesi del 2013. Le metodologie
sviluppate per contrastare il fenomeno degli avvelenamenti
sono state applicate in altre indagini riguardanti crimini contro
la fauna selvatica (es. commercio illegale di specie protette,
bracconaggio, ecc.), nonché in analisi volte ad accertare reati
ai danni di specie domestiche (1).
BIBLIOGRAFIA
1. Fanelli R., Garofalo L., Fico R., Lorenzini R. (2013). Illegal
slaughter of domestic mammals unveiled by the forensic
analysis of mixed DNA traces. 87th Annual Meeting of the
German Society of Mammalogy. Prague, 8-12 September
2013.
2. Hebert P.D.N., Cywinska A.., Ball S.L., deWaard J.R.
(2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proc
R Soc Lond B, 270: 313–321.
3. Hebert P.D.N., Stoeckle M.Y., Zemlak T.S., Francis C.M.
(2004). Identification of Birds through DNA Barcodes. PLoS
Biol, 2(10): e312.
4. Untergrasser A., Cutcutache I., KÃµressaar T., Ye J.,
Faircloth B.C., Remm M., Rozen S.G. (2012) Primer3 - new
capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res 40(15):e115.
I bocconi avvelenati sono generalmente preparati con carne di
mammiferi o anche di uccelli; per tale motivo abbiamo ideato
un primo marcatore di screening che permetta di identificare
entrambe le categorie nei campioni incogniti. Per confermare
i risultati ottenuti con questa prima assegnazione, abbiamo
poi creato due ulteriori marcatori specifici, che amplifichino
selettivamente una classe oppure l’altra, sfruttando il differente
ordine di alcuni geni e RNA transfer nel mtDNA di mammiferi
e uccelli.
1° MARCATORE: quattro segmenti nel gene 12S di mammiferi
e uccelli. La lunghezza del gene ribosomale 12S varia dalle
950 alle 990 bp a seconda della specie esaminata. Le coppie
di primer sono state disegnate in modo da amplificare quattro
frammenti di dimensioni diverse all’interno della seconda parte
del gene, la più informativa (Fig.1).
264
Fig. 2 – Differente organizzazione dei geni nella molecola mitocondriale di mammiferi (a) e uccelli (b).
265
UNA SCELTA DA CONDIVIDERE: PIANO DI MONITORAGGIO REGIONALE DELLA
RISTORAZIONE COLLETTIVA
Garofalo F. 1, Pesce A. 1, De Marco G. 1, Romano M. 1, Salzano C. 1, De Felice A.1, Guarino A. 2
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno; Sezione Diagnostica di Caserta;
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno; Sede Centrale Portici;
Key words: catering, food safety, monitoring plan
Figura 1
266
% campioni positivi
5,1
2,6
RISTORAZIONE COLLETTIVA
i
ut
to
r
orid
ol
fit
ri
s
tte
ba
En
te
ro
b
ac
te
ria
E.
ce
ae
co
li
us
H7
7:
ce
re
O
15
co
li
E.
B.
es
en
la
el
yt
og
oc
lm
on
m
on
sp
p.
RISTORAZIONE PUBBLICA
Sa
Materiali e Metodi
Nel primo semestre dell’anno 2013 sono stati prelevati dai Servizi
Veterinari della ASL di Caserta 77 campioni, di cui 38 presso
ristorazione collettiva (mense scolastiche, ospedaliere, case
circondariali, etc.) e 39 presso ristorazione pubblica (ristoranti,
agriturismi, bar, etc.), inviati presso il nostro laboratorio per
effettuare un totale di 301 analisi. Le matrici prelevate erano le
più varie, raggruppate per classi in prodotti crudi, prodotti lattierocaseari e di pasticceria e prodotti di gastronomia cotti (preparazioni
e piatti composti).
Per ogni campione è stata richiesta la determinazione di un unico
parametro tra i seguenti: ricerca di Listeria monocytogenes,
Salmonella spp. ed E. coli O157:H7, numerazione di
Enterobacteriaceae, E. coli, Bacillus cereus e Anaerobi solfitoriduttori.
I campioni che prevedevano la ricerca della Listeria
monocytogenes, Salmonella spp. ed Escherichia coli O157:H7
food. Horizontal method for the enumeration of presumptive
Bacillus cereus. Colony count technique at 30°C.
6) Anonymous 2005. UNI EN ISO 11290-1:2005 Microbiology
of food. Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes. Part 1:Detection method
7) Anonymous 2008. UNI EN ISO 6579:2008 Microbiology of
food. Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
8) EFSA, (European Food Safety Authority), ECDC (European
Centre for Disease Prevention and Control), 2013.The
European Union Summary Report on Trends and Sources
of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in
2011; EFSA Journal 2013,11(4):3129, 250 pp. doi:10.2903/j.
efsa.2013.3129.
9) Regione Campania. 2011. Piano Regionale Integrato 20112013. Bollettino Ufficiale Regione Campania (BURC) n. 54
Tra i 77 campioni analizzati nel primo semestre dell’anno 2013,
nei 38 prelevati dalla ristorazione collettiva non è stata riscontrata
alcuna non conformità. Invece per quanto riguarda i 39 campioni
provenienti dalla ristorazione pubblica è stata riscontrata positività
per Escherichia coli in 1 campione di pesce cotto, e positività per
le Enterobacteriacee in 2 campioni di preparato di suino e bovino,
pari al 7,7 % dei 39 campioni prelevati in questo ambito. (fig. 1)
A fronte di un dato nazionale di 3887 casi di tossinfezioni
alimentari nel nostro paese nell’anno 2011 (8), con trend in ascesa
rispetto all’anno precedente, appare confortante il dato di totale
conformità emerso dalle analisi relative ai campioni prelevati nei
centri di ristorazione collettiva, soprattutto tenendo presente che si
è trattato, in massima parte, di prelievi presso mense scolastiche
ed ospedaliere. Anche le 3 positività riscontrate nella ristorazione
pubblica sono comunque esigue e da ricondurre probabilmente
alla preparazione delle pietanze, in quanto sono state rilevate
in piatti elaborati e manipolati, in cui è maggiormente possibile
la contaminazione da parte dei germi testimoni di igiene del
processo.
Si tratta comunque di dati preliminari, ma è importante che
l’Autorità Sanitaria abbia preso coscienza dell’importanza di
tenere sotto controllo il compartimento della ristorazione, in modo
da poter evidenziare in maniera tempestiva un eventuale calo
delle condizioni igienico-sanitarie di questo settore e prevenire
focolai di tossinfezioni alimentari.
er
ia
Introduzione
La ristorazione nelle collettività, nella società moderna, riveste una
crescente importanza per una coesistenza di fattori tra i quali l’età
e la tipologia degli utenti del servizio, il numero di pasti preparati/
somministrati e il conseguente potenziale ampio coinvolgimento
di utenti in episodi di infezione o intossicazione alimentare. La
necessità di allestire un certo numero di pasti in anticipo rispetto
al momento della somministrazione rende maggiormente possibili
e frequenti le contaminazioni dei germi patogeni e alterativi degli
alimenti ed esige elevate garanzie di sicurezza igienico-sanitaria.
Vista la peculiarità dell’utenza coinvolta in refezioni scolastiche,
ospedaliere e carcerarie, nonché il gran numero di attività di
ristorazione pubblica presenti nel nostro territorio, la Regione
Campania ha previsto nel Piano Regionale Integrato dei Controlli
2011-2013 un monitoraggio sui requisiti microbiologici dei pasti
prodotti in questo settore (9).
sono stati analizzati con metodo qualitativo con eventuale
isolamento e identificazione del microrganismo, quelli con richiesta
Enterobacteriaceae, Escherichia coli ed Anaerobi solfito-riduttori
sono stati analizzati con il metodo quantitativo per inclusione ed
infine i campioni con richiesta Bacillus cereus sono stati effettuati
sempre con metodo quantitativo ma per spatolamento. Anche per
le metodiche quantitative, a seconda della ISO di riferimento, per
ogni germe è previsto isolamento ed identificazione biochimica.
Tutti i metodi sono stati effettuati come metodica ISO accreditata
presso il nostro laboratorio (1,2,3,4,5,6,7).
Li
st
Abstract
Food safety is essential in mass catering due to the enormous
amount of meals served each day and for typology consumers
that often consist of children, elderly and hospitalized people.
Campania Region has implemented a plan for microbiological
monitoring of meals served in mass catering.
A total of 77 samples were collected: 38 from school, hospital
and prison canteens and 39 from other recreational catering
(f.e. restaurant, bar, pub, etc.). Each sample was analyzed using
standards methods to demonstrate the presence of Listeria
monocytogenes, Salmonella spp., Enterobacteriaceae, E. coli,
E. coli O157:H7, Bacillus cereus and anaerobic sulfite-reducing
bacteria.
The data obtained reveal no safety risks for consumers of canteens,
since samples analyzed are full negative. Instead in food collected
from recreational catering we observe three positives samples:
one shows the presence of E.coli and two of Enterobacteriacee.
These results suggest unhygienic food handling and processing.
Bibliografia
1) Anonymous 2001 UNI EN ISO 16649-2:2001 Microbiology of
food. Horizontal method for the enumeration of β-glucoronidasepositive. Escherichia coli. Part 2: colony count technique at
44°C using 5-bromo-chloro-3-indolyl β-D-glucoronide.
2) Anonymous 2003 UNI EN ISO 15213:2003 Microbiology of
food. Horizontal method for the enumeration of sulfite reducing
bacteria growing under anaerobic conditions.
3) Anonymous 2003. UNI EN ISO 16654:2003 Microbiology
of food. Horizontal method for the detection of Escherichia
coliO157
4) Anonymous 2004. UNI EN ISO 21528-2:2004 Microbiology
of food. Horizontal method for the detection o and enumeration
of Enterobacteriaceae. Part 2:Colony count method
5) Anonymous 2005 UNI EN ISO 7932:2005 Microbiology of
267
BRUCELLA CETI: BIOTIPIZZAZIONE E GENOTIPIZZAZIONE
TRAMITE MLVA-16 MLST E SNPs WGS
mentre ben 431 polimorfismi di cui 122 inserzioni/delezioni sono
stati ritrovati nei rimanenti 28 scaffold.
Garofolo G.1, Di Giannatale E.1, Ancora M.1, Marcacci M.1, Cammà C. 1, Orsini M.2, Persiani T.1, Marotta F.1, Zilli K.1
Discussione
In questo studio sono state approfondite le indagini diagnostiche
su due focolai di brucellosi in delfini provenienti dal mare Ionio
settentrionale. L’attività del nostro laboratorio si è basata sulla
conferma di un sospetto diagnostico attraverso metodologie
classiche e metodologie molecolari sia tradizionali come la PCR
e la RFLP sia estremamente innovative come la MLST, MLVA e
gli SNPs WGS. Le metodologie microbiologiche classiche, se
da una parte si basano su protocolli standardizzati, richiedono
tempo di esecuzione lunghi e personale estremamente
specializzato; inoltre, nel caso dei mammiferi marini, i risultati
potrebbero essere inconcludenti. Infatti, negli anni si è dimostrato
che alcune caratteristiche fenotipiche non sono riscontrabili su
colture primarie e possono dare risultati atipici. E’ quindi un dato
di fatto come la biotipizzazione debba essere supportata dalla
tipizzazione molecolare. L’analisi della RFLP ha evidenziato un
profilo caratteristico delle Brucelle marine, non assimilabile a
quelle terrestri (B. melitensis, B. abortus etc.). Purtroppo l’analisi
RFLP rimane inadeguata e puramente indicativa e non conclusiva.
I nostri risultati indicano come con la PCR bruce-ladder si giunga
ai medesimi risultati ottenuti con RFLP, con il vantaggio, però, di
una maggiore facilità d’esecuzione e interpretazione dei dati con
la PCR. L’attribuzione di specie è stata ottenuta attraverso l’analisi
MLST, metodo che si basa sul sequenziamento di nove geni
differenti; l’ampio pannello d’informazioni che se ne ottengono
permette di assegnare qualsivoglia ceppo sia alle specie
classiche sia a eventuali specie rare o sconosciute. L’analisi
filogenetica ha permesso di identificare i ceppi come B. ceti con
ST26, cluster A. Inoltre la MLVA ha consentito di ricostruire i focolai
inserendoli in un contesto globale e suggerendo una connessione
epidemiologica tra i due casi e una relazione tra gli animali che
probabilmente appartenevano allo stesso branco. Un ulteriore
prova è il fatto che gli animali sono stati rinvenuti a meno di 50 km
di distanza sebbene con 8 mesi di differenza. L’albero filogenetico
ha difatti dimostrato che 5 sub cluster per il ST26 con il sub cluster
U contente i soli ceppi studiati provenienti dal mar Mediterraneo.
I rimanenti sub cluster sono provenienti da isolati di mammiferi
marini dell’oceano Atlantico. Le analisi degli SNPs, sebbene siano
una sovrastima delle reali differenze, in quanto gli scaffold ottenuti
presentano un certo grado di ridondanza, dimostrano come
questa metodologia sia in grado di ritrovare eventi mutazionali per
ceppi che si poteva pensare essere semplici cloni. Il nostro report
fa altresì notare come la brucellosi dei mammiferi marini sia stata
letteralmente sottostimata per ben 20 anni; è quindi necessario
avere un approccio sistematico per la ricerca della Brucella
da cetacei, anche se, l’avanzato stato di decomposizione che
generalmente questi animali presentano al momento dell’esame,
potrebbe portare a isolamenti inconcludenti.
La soluzione di tale problema potrebbe concorrere l’utilizzo di
metodi di biologia molecolare come la PCR real-time. La recente
emergenza di spiaggiamenti in Italia, con più di 130 casi segnalati
in soli tre mesi del 2013, evidenzia come gli spiaggiamenti di
mammiferi marini sia un problema emergente. Le moderne attività
umane con il conseguente rilascio nell’ambiente di inquinanti
quali diossine e PCB agiscono sull’ecosistema dei cetacei sia
direttamente, sia indirettamente attraverso la contaminazione delle
loro risorse alimentari. Queste condizioni possono aumentare
la suscettibilità a rischi specifici e aspecifici con conseguente
aumento di focolai infettivi. Bisogna ricordare come la brucellosi
sia una malattia cronica che è in grado di attendere molto tempo
nell’ospite prima di causare gravi complicazioni. Questo studio
sebbene non sia il primo segnalamento assoluto in Italia, è
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise .Centro di Referenza Nazionale e OIE per la Brucellosi, Teramo, Italia
2
CRS4 - Laboratorio di Bioinformatica, Parco Tecnologico Polaris, Pula, Italia
1
Key words: Brucella ceti, delfini, MLVA, MLST, SNPs WGS, zoonosi
Abstract
Brucella ceti has been copiously studied in the last twenty years to
figure out the infection in dolphins and to demonstrate its zoonotic
potentiality. Here we shown the genotyping of two B. ceti strains
isolated from stranded striped dolphins (Stenella coeruleoalba)
at the southern Apulia coastline. B. ceti isolates were both
conventional typed and genotyped through MLST, MLVA and
SNPs WGS methodologies to infer correlation and phylogeny
from the South Mediterranean sea. The wide ST26 from MLST
was found, and MLVA assigned the strains to a novel genotype
within the cluster A and unique representative of a Mediterranean
sub cluster. Nevertheless several SNPs separated the two strains.
This investigation underlines the capability of using MLST, MLVA
and SNPs WGS for the epidemiological investigation of marine
mammals Brucellae and demonstrated that the outbreaks studied
were epidemiological linked.
Introduzione
Gli spiaggiamenti in Italia sono sistematicamente monitorati dal
1986 attraverso un network attivo che riporta e segnala questi
fenomeni in un sistema online interamente gratuito (http :/ /
mammiferimarini.unipv.it /). La banca dati è, inoltre, interamente
basata su software open source e, a fronte di 4.396 registrazioni
riportate, i primi casi di brucellosi sono stati segnalati nel 2012.
Brucella è batterio capace di infettare molti mammiferi terrestri ed
acquatici. La sua presenza è considerata abbastanza comune
nell’ecosfera dei mammiferi marini, ad oggi, si riconoscono due
specie: Brucella ceti tipica dei cetacei e B. pinnepidealis, tipica dei
pinnipedi. Tuttavia la prevalenza della brucellosi nell’ecosistema
marino non è nota poiché è impensabile attuare un sistema di
monitoraggio sistematico data la vastità delle aree geografiche entro
le quali si muovono questi animali selvatici. Nel 2009 sulla costa
settentrionale del nord della Puglia avvenne lo spiaggiamento di
nove capodogli (Physeter macrocephalus);evento che sensibilizzò
in maniera importante l’opinione pubblica italiana tanto da indurre
le autorità competenti a creare un gruppo multidisciplinare
“ad hoc” per eseguire tutte le indagini post-mortem. Anche per
questo, l’attività diagnostica per i mammiferi marini degli IIZZSS
ha introdotto la ricerca routinaria di Brucella. Questo ha portato
all’isolamento di ceppi riconducibili al genere Brucella che sono
pervenuti presso il laboratorio di riferimento nazionale e OIE per
la brucellosi. Il nostro studio riporta l’attività d’identificazione e di
tipizzazione di due isolati sospetti, provenienti da delfini spiaggiati
lungo la costa pugliese nel corso del 2012, proponendo un
approccio sistematico rivolto a identificare e caratterizzare isolati
di Brucella da mammiferi marini. La diagnosi convenzionale,
affiancata a nuovi metodi molecolari, ha consentito di identificarne
la specie di appartenenza e di comprenderne la filogenesi,
mentre l’analisi dei frammenti VNTR con lo studio dei polimorfismi
nucleotidici (SNPs WGS) ha permesso di ottenere una valutazione
epidemiologica estremamente raffinata dei focolai.
Materiali e metodi
B. ceti e biotipizzazione
Due ceppi di Brucella sono stati isolati da stenelle spiaggiate e
morte sulla costa pugliese in Italia nel corso del 2012. Il primo
delfino è spiaggiato a marzo 2012 a Gallipoli loc. Lido Pizzo (LE)
sul mare Ionio (Mediterraneo meridionale), mentre
il secondo delfino è stato ritrovato a novembre 2012 a Porto
Cesareo loc. Bacino Grande (LE) sul mare Ionio (Mediterraneo
meridionale). Gli isolamenti sono stati ottenuti dal cervello e
dalla milza nel primo caso (id ceppo 10759) e dal solo cervello
nel secondo caso (id ceppo 28753). I ceppi isolati sono stati
caratterizzati con i test biochimici e fenotipici secondo le procedure
OIE (OIE, 2012).
Saggi molecolari
L’estrazione del DNA è stata ottenuta utilizzando il kit Istagene
Matrix (Bio-Rad). L’assegnazione della specie è stata eseguita
con la PCR multiplex Bruce-ladder PCR[1], mentre la RFLP per i
geni omp2a e omp2b si è limitata agli enzimi PstI e HinfII (Promega
Corporation, Madison, Wisconsin) secondo la metodologia
precedentemente pubblicata [2].
MLST, MLVA e SNPs WGS
Gli isolati sono stati genotipizzati utilizzando lo schema a 9 geni
per la MLST[3] e il pannello a 16 loci per la MLVA utilizzando la
metodologia dell’elettroforesi capillare [4]. I dati ottenuti dall’analisi
MLST sono stati confrontati con i profili presenti in GeneBanck.
L’analisi di clusterizzazione MLVA è stata ottenuta con l’algoritmo
goeBURST implementato in PHILOViZ analizzando i nostri
risultati con i profili MLVA del cluster A presenti sul database
internazionale (http://mlva.u-psud.fr/). Si è deciso di definire sub
cluster quando uno o più isolati indipendenti condivideva 13
o più loci MLVA. Ad ogni sub cluster è stato assegnato il nome
del genotipo fondatore del gruppo per goeBURST, seguito dalla
parola “sub cluster”. Il sequenziamento è stato compiuto mediante
Ion Torrent PGM system con il chip 314 con librerie create con
il kit Ion Plus Fragment Library (Life Technologies). L’analisi dei
polimorfismi fra i due isolati è stata condotta con gli applicativi
mpileup e bcftools del pacchetto samtools. Le varianti sono state
confermate mediante “visual inspection” dei file di allineamento
effettuata con il visualizzatore TABLET. La nomenclatura dei
genotipi si rifà per MLST a Whatmore et al. (2007), per MLVA-11 si
riferisce alla banca dati internazionale, mentre per MLVA-16 è qui,
arbitrariamente assegnata, con lettere dalla A alla U.
Risultati
Le colture primarie si sono rilevate di forma circolare con profilo
convesso regolare, del diametro di 0,5-10 mm con caratteristiche
fenotipiche e biochimiche riportate in tabella 1. I profili di
restrizione RFLP confermano i risultati di Cloeckaert et al. (2001)
con il pattern Omp2b N (K) (Tabella 1). La Bruce-ladder PCR
assegna i due isolati al genere di Brucella dei mammiferi marini
(B. ceti o B. pinnepedialis). La MLST assegna i ceppi alla specie
B. ceti Sequence type 26 (ST26). MLVA-16 rivela un profilo nuovo,
mentre l’analisi dei cluster evidenzia 5 sub clusters con GtU sub
cluster proprio degli isolati studiati (figura 1). Infine le analisi dei
genomi hanno permesso la ricostruzione di 42 scaffold per i due
isolati con un’omologia nucleotidica del 100% per 14 scaffold
268
un primo studio che valuta in maniera appropriata la relazione
genetica tra ceppi di B. ceti isolati nel mare Mediterraneo. Si
sottolinea come in questi 8 mesi nessuna variazione genetica è
stata rilevata nei ceppi tra due focolai per MLVA e MLST mentre
qualche centinaia di polimorfismi sono stati rilevati da SNPs WGS.
Il nostro studio conferma la potenza di MLVA-16 per valutare
epidemiologicamente i focolai e apre nuove valutazioni per l’uso
di SNPs WGS. Tuttavia sono necessari ulteriori studi dal Mar
Mediterraneo per comprendere a pieno l’evoluzione molecolare di
Brucella in questo bacino marino.
Bibliografia
1.
López-Goñi, I., et al., Evaluation of a multiplex
PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of
all Brucella species, including the vaccine strains.
Journal of clinical microbiology, 2008. 46(10): p. 34843487.
2.
Cloeckaert, A., et al., Restriction site polymorphism
of the genes encoding the major 25 kDa and 36 kDa
outer-membrane proteins of Brucella. Microbiology,
1995. 141 ( Pt 9): p. 2111-21.
3.
Whatmore, A.M., L.L. Perrett, and A.P. MacMillan,
Characterisation of the genetic diversity of Brucella by
multilocus sequencing. BMC Microbiol, 2007. 7: p. 34.
4.
Garofolo, G., M. Ancora, and E. Di Giannatale, MLVA16 loci panel on Brucella spp. using multiplex PCR
and multicolor capillary electrophoresis. J Microbiol
Methods, 2013 92(2): p. 103-7.
Figura 1: Analisi dei cluster MLVA
Tabella 1: Profilo biochimico e biomolecolare
269
TEST
Lisi con fagi Tb-Wb-Iz-R/C
Ossidasi/Catalasi/Ureasi
Produzione di H2S
Crescita su Agar-tionina
Crescita su Agar-tionina
Agglutinazione anti-A
Agglutinazione anti-M
Agglutinazione anti-R
RFLP Omp2b
Profilo MLVA
Sequence type MLST
Whole Genome Sequencing
B. ceti ID 10759 e ID 28753
-/+/+/+/+/+
+
+
+
N(K)
2-5-8-13-2-2-4-2-6-12-9-914-6-7-3
ST26
122 indel/309 SNPs
SPIROCERCA LUPI: UN PARASSITA RARO O UNA PARASSITOSI OCCULTA?
DESCRIZIONE DI UNA CASO DI ANEURISMA AORTICO NELLA VOLPE
IDENTIFICAZIONE DEL PROFILO ENTEROTOSSICO DI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILLINO SENSIBILI (MSSA) E
STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILLINO RESISTENTI (MRSA) ISOLATI
DA LATTE BOVINO
Gavaudan S. 1; Morandi F.2; Tomasi V.3; Angelico G.1; Graziosi T.1; Moscatelli F.1; Fioranelli F.3
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche, via salvemini 1, 06100 Perugia;
2
Parco Nazionale dei Monti Sibillini, piazza del forno, 62039 Visso (MC).
3
Veterinario libero professionista.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana
Centro di Referenza Nazionale per l’ Antibioticoresistenza
Keywords: Spirocerca lupi; ecopathology; aortic aneurism
SUMMARY
in this work a case report of a parasitic borne aortic aneurysm in
red fox (Vulpes vulpes) is presented.
In the report, the body of young adult red fox, male, was found
in the Sibillini Mountains National Park (Marche region, Italy). At
necropsy an aneurysm was found and the rupture of thoracic
aorta results in mediastinic hemorrhage as certain cause of
acute death.
Spirocercosis is a parasitic diseases probably low reported and
low detected for its not obvious symptoms. Probably the disease,
for its cycle, is more common in wild canids and felids than in
domestics, however it could be more common than meets the
eyes and so, it will be taken into account for the possible serious
complications associated with.
Introduzione
La spirocercosi, malattia parassitaria causata da Spirocerca
lupi (Spirurida; Nematoda), ha una distribuzione mondiale,
particolarmente in aree temperate e tropicali; in italia è segnalata
in meridione e nelle Isole (2).
Il Ciclo biologico prevede diversi Ospiti Definitivi tra cui il cane,
la volpe, il lupo e altri canidi e felidi selvatici mentre gli Ospiti
Intermedi sono i coleotteri coprofagi. Una grande varietà di Ospiti
Paratenici (rettili, uccelli, roditori) svolgono un ruolo essenziale
per raggiungere l’ospite definitivo e completare il ciclo parassitario
attraverso la predazione. Il nematode adulto nell’ospite definitivo
emette uova larvate attraverso una sacca cistica aperta nel lume
dello stomaco. Possono essere presenti lesioni gravi causate
dalla migrazione larvale (L3) attraverso l’aorta e l’esofago.
Tali lesioni sono rappresentate dall’aneurisma aortico, dalla
calcificaazione della parete della stessa arteria, dalla spondilite
vertebrale toracica, dalla trasformazione sarcomatosa delle
lesioni esofagee (1).
Il ciclo parassitario può facilmente compiersi in ambiente
silvestre mentre è più raramente osservabile negli animali
domestici dove la malattia parassitaria può decorrere in maniera
paucisintomatica.
Materiali e metodi
L’esemplare in questione, Volpe rossa (Vulpes vulpes) giovane
maschio adulto, in buono stato di nutrizione, è stato ritrovato
morto in un’area isolata del Parco Nazionale dei Monti Sibillini a
ca. 1200m slm (N 47°56’32’’-E13°11’54’’).
Alla necroscopia è stato osservato un imponente emotorace
(foto 1) il cui coagulo era localizzato nel mediastino dorsale e
causato dalla rottura dell’aneurisma dell’aorta toracica (foto 2),
ca. 2-3 cm posteriormente all’arco aortico.
Sono stati osservati inoltre alcuni noduli granulomatosi (foto
3) delle dimensioni di 1-4 cm di diametro nello spessore della
mucosa dello stomaco sul cui lume sono stati rilevati uno o più
piccoli orifici (ca. 0,5-1 mm di diametro). Al loro interno erano
presenti alcuni nematodi di colore grigio-rossastro di ca. 4-8 cm
di lunghezza morfologicamente identificati come Spirocerca lupi.
La causa della morte è stata attribuita all’emorragia acuta
a seguito della rottura di un aneurisma aortico di origine
parassitaria.
La rilevanza del presente caso è dovuta essenzialmente a due
differenti aspetti: - Il parassita non è segnalato in questa area
ma la sua presenza potrebbe essere sottostimata, in particolare
nel cane; la predazione, comportamento abituale nei carnivori
selvatici può essere occasionale nella dieta degli animali
d’affezione.
- La volpe e altre specie di carnivori selvatici sono ospiti definitivi
noti di S.lupi, ma a differenza del cane, nella volpe e nei selvatici
non ci sono segnalazioni di decessi causati dal cedimento della
parete aneurismatica.
Foto 2: aneurisma aortico
Foto 1: emorragia
mediastinica
Foto 3: granuloma
gastrico
BIBLIOGRAFIA
- Van der Merwe LL et al.. Spirocerca lupi infection in the dog:
a review. Vet J. 2008 Jun;176(3):294-309.
- Ferrantelli V. et al.. Spirocerca lupi isolated from gastric
lesions in foxes (Vulpes vulpes) in Sicily (Italy). Polish J. of Vet.
Sci., 2010: 13-3; 465-471
270
Giacinti G., Sagrafoli D., Giangolini G., Rosa G., Tammaro A., Bovi E., Marri N., Carfora V.,
Franco A., Amatiste S.
Key words: Staphilococcal enterotoxins, mecA, bovine milk
SUMMARY
Staphylococcus aureus is one of the most important foodborne
pathogens and its pathogenicity is related to the production of
staphyloccocal enterotoxins (SEs). The use of antibiotics in
veterinary practices, could determine the selection of antibioticresistant clones of S. aureus, including methicillin-resistant S.
aureus
The aim of this research was to determine the prevalence of
enerotoxin genes (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, sep,
ser) in MRSA e MSSA isolated from 75 individual bovine milk from
seven different farms. The isolates positive to SEs genes were
tested for the presence of staphylococcal enterotoxins (SEASED) by using the reversed passive latex agglutination method.
Of 75 isolates examined, 20 (22,7 %) were found to be positive
for SEs genes, while SEs were observed in only one strain. Seh
was most commonly detected in MRSA isolates.
INTRODUZIONE
S. aureus produce un’ampia varietà di tossine extracellulari e
fattori di virulenza responsabili di diverse patologie sia nell’uomo
che negli animali. Nella bovina da latte è il principale agente
eziologico di infezione intramammaria di tipo contagioso
mostrando particolare resistenza alle terapie farmacologiche.
La patogenicità di alcuni isolati microbici è notevolmente
aumentata per acquisizione di geni di resistenza nei confronti
di molecole antibiotiche. Negli ultimi anni, alcuni cloni di MRSA
si sono diffusi tra gli allevamenti di animali zootecnici e negli
animali da compagnia (1, 2). Recentemente in Italia sono stati
isolati numerosi ceppi di MRSA da campioni di latte bovino e da
prodotti lattiero-caseari (3, 4).
Tra i diversi fattori di virulenza le enterotossine stafilococciche
(SEs) sono causa di tossinfezione alimentare nell’uomo; nella
bovina da latte contribuiscono ad aumentare la persistenza
del patogeno nella ghiandola mammaria incrementandone
la patogenicità (18). Ad oggi, sono state sierologicamente
identificate 23 SEs sulla base di sequenze genetiche omologhe.
Tutte le SEs agiscono come superantigeni, ma solo per alcune di
esse (sea-sei, ser, ses, set) è stata dimostrata attività emetica (5).
I geni codificanti le SEs sono localizzati su elementi genetici
accessori prevalentemente mobili (6), quali plasmidi, profagi,
isole di patogenicità (SaPIs), isola genomica nSa o in prossimità
della cassetta cromosomica staphylococcal chromosomal
cassette (SCC). Tali elementi mobili non sono uniformemente
distribuiti fra isolati di S. aureus mostrando una grande variabilità
genetica dovuta probabilmente a trasferimento orizzontale. La
maggior parte dei geni codificanti le SEs sono collocati sulle isole
di patogenicità (SaPIs). I geni sea sep, sek e seq sono associati a
batteriofagi (7), mentre sed, sej , e ser sono trasportate da diversi
plasmidi (8). Il gene seh è inserito insieme ad una trasposasi in
prossimità della cassetta cromosomica SCC (9).
Lo scopo di questo lavoro è stato di studiare il profilo enterotossico
da un punto di vista fenotipico e genotipico di S. aureus meticillino
resistente e S. aureus meticillino sensibile isolati da latte bovino
proveniente da allevamenti della regione Lazio.
MATERIALI E METODI
Durante il periodo 2011-2012, sono stati collezionati 75 S. aureus
isolati da campioni di latte individuale bovino provenienti da 7
allevamenti ubicati nella regione Lazio, risultati positivi a MRSA.
Dei 75 S. aureus, 13 sono stati identificati fenotipicamente
come MSSA e 62 identificati fentotipicamente come MRSA e
confermati per la presenza del gene mecA mediante PCR.
Gli isolati sono stati sottoposti a Multiplex-PCR (M-PCR) per il
rilevamento dei geni codificanti le enterotossine stafilococciche
(sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, sep, ser) secondo
il protocollo messo a punto dal Laboratorio Comunitario di
Riferimento (EU-RL CPS) (10-11). Sugli isolati positivi alla
presenza dei geni sea, seb, sec e sed è stata determinata
l’espressione in vitro delle enterotossine A, B, C, D mediante test
di agglutinazione passiva inversa al lattice (RPLA) utilizzando il
kit SET-RPLA (TD 9000, Oxoid, U.K.).
La distribuzione degli isolati MRSA e MSSA nei sette allevamenti
esaminati in questo studio è riportata in tabella 1. La presenza
di geni enterotossici è stata riscontrata in 3 aziende (75%).
Complessivamente, dai 75 S. aureus testati, la positività è stata
osservata in 20 (26,6%) isolati. In particolare il 22,7% (n°17) dei
ceppi è risultato positivo per il gene seh, mentre nei restanti 3
isolati, uno presentava geni codificanti per le SEA, SED, SER,
SEJ, un secondo per SEB e un terzo per SEG, SEI.
Tabella 1: distribuzione degli MRSA e MSSA nei 7 allevamenti
studiati e relativi isolati codificanti SEs
Allevamento
n°MSSA
n°MRSA
Totale
isolati
A
B
C
D
E
F
G
Totale
1
1
3
33
5
2
11
7
62
2
3
35
7
2
17
9
75
2
2
6
2
13
N° isolati
pos. a geni
codificanti SEs
2
6
12
20
L’espressione in vitro delle enterossine stafilococciche, mediante
test di agglutinazione (RPLA) è stata osservata in un solo isolato
(SEB) corrispondente al 5% del totale di S. aureus positivi ai
geni codificanti le SEs. Il test fenotipico non ha evidenziato la
produzione di ESA ESD in isolati con presenza dei relativi geni
271
codificanti. Questi risultati differiscono da quanto emerso da un
nostro precedente lavoro (12), nel quale le SEs furono prodotte
dal 28,4% degli isolati distribuiti nel 39,2% degli allevamenti
controllati. Occorre comunque sottolineare che esiste un’ ampia
variabilità geografica e di allevamento del profilo enterotossico di
S. aureus provenienti da mastiti bovine. (12, 13, 14, 15).
In questo studio (tabella 2), sono emerse differenze tra MRSA
e MSSA, dove la presenza del gene seh è stata rilevata solo
in isolati meticillino resistenti (27,4%). In particolare tale gene è
stato identificato in 3 allevamenti dei 7 studiati e ritrovato in tutti i
ceppi di S. aureus positivi al gene mecA isolati dalle tre aziende,
non risultando, invece, presente in MSSA co-presenti. Rispetto
a quanto osservato da altri autori (13, 14, 15, 16) in S. aureus
isolato da latte di bovine infette il numero di isolati positivi al gene
seh da noi trovato è risultato maggiore.
In un recente lavoro (17) effettuato su ceppi di MRSA ST398
isolati da latte bovino non fu osservata la produzione di tossine
stafilococciche, anche se il profilo dei geni enterotossici non fu
investigato.
Noto et al 2006 (9), ipotizzano che la presenza del gene seh in
alcuni ceppi di MRSA con SCCmec tipo IV potrebbe stabilizzare
l’integrazione cromosomica del SCCmec impedendone la
sua escissione, alterando così il meccanismo di trasferimento
orizzontale del gene.
Questo suggerisce, inoltre, che l’acquisizione di un ulteriore
fattore di virulenza è in grado di promuovere il mantenimento del
fenotipo meticillino-resistente (9).
Tabella 2: distribuzione dei geni codificanti le SEs tra gli isolati di
MRSA e MSSA (n° e %)
N° (%)
Geni codificanti SEs
sea sed ser sej
seb
seg sei
seh
negativi
Totale
MRSA
17 (27,4%)
45 (72,6%)
62
MSSA
1 (7,7%)
1 (7,7%)
1 (7,7%)
10 (76,9%)
13
L’importanza della capacità enterotossica di S. aureus e di MRSA
nella patogenesi della mastite risulta ancora poco chiara, tuttavia
l’attività superantigenica delle tossine enterotossiche sembra
indurre una immunosoppressione nelle bovine da latte (18).
Sulla base dei risultati emersi appare necessario effettuare
ulteriori indagini per valutare i rischi associati alla diffusione
di MRSA in ambiente zootecnico, come potenziale agente
zoonosico, nonché come potenziale causa di tossinfezione
alimentare. Sono inoltre necessari approfondimenti al fine di
comprendere l’ origine clonale di MSSA e MRSA.
Bibliografia
1-Walther B., Friedrich A.W., Brunneberg L., Wieler L.H.,
Lubke-Becker A.. 2006. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA)
in veterinary medicine: a new emerging pathogen. Berlin und
Munchener Tierarztliche Wochenschrift, vol 119,n°5-6, pp222232.
2- Pan A., Battisti A., Zoncada A., Bernieri F., Boldini M., Franco
A., Giorni M., Iurescia M., Lorenzotti S., Martinetti M., Monaci
M., Pantosti A., 2009. Community-acquired Methicillin Resistant
S.aureus ST398 infection, Italy. Emerging Infections Diseases.
Vol, 15.
3- Normanno G., Corrente M., Calandra L, Dambrosio A., Quaglia
Nc., Parisi A., Greco G., Bellacicco AL., Virgilio S., Celano GV.,
2007. S.aureus (MRSA) in foods of animal origin product in Italy.
Int.J.Food Microbiol., 117:219-222.
4- Giacinti G., Tammaro A., Sagrafoli D., Proietti A., Veschetti
M.C., Bicocchi R., Franco A., Carratù D., Battisti A., Cordaro G.,
Amatiste S. 2011. Indagine per S. aureus e S.aureus meticillinoresistente (MRSA) in latte crudo di massa bovino di allevamenti
della Regione Lazio. Sidilv 2011.
5- Fraser, J.D., Proft, T., 2008. The bacterial superantigen and
superantigen-like proteins. Immunological Reviews 225, 226243.
6- Malachowa, N., DeLeo, F., 2010. Mobile genetic elements of
Staphylococcus aureus. Cellular and Molecular Life Sciences 67,
3057-3071.
7- Baba, T., Takeuchi, F., Kuroda, M., Yuzawa, H., Aoki, K.,
Oguchi, A., Nagai, Y., Iwama, N., Asano, K., Naimi, T., Kuroda,
H., Cui, L., Yamamoto, K., Hiramatsu, K., 2002. Genome and
virulence determinants of high virulence communityacquired
MRSA. Lancet 359, 1819-1827.
8- Omoe, K., Hu, D.L., Takahashi-Omoe, H., Nakane, A.,
Shinagawa, K., 2003. Identification and characterization of a new
staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two
kinds of plasmids. Infection and Immunity 71, 6088-6094.
9- Noto, M.J., Archer, G.L., 2006. A subset of Staphylococcus
aureus strains harboring Staphylococcal Cassette Chromosome
mec (SCCmec) type IV is deficient in CcrAB-mediated SCCmec
excision. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50, 2782-2788.
10-Detection of genes encoding staphylococcal enterotoxins.
Multiplex PCR for sea to see and ser. Method of the EU-RL CPS,
Version 1, October 2009.
11-Detection of genes encoding staphylococcal enterotoxins.
Multiplex PCR for seg to sej and sep. Method of the EU-RL CPS,
Version 1, October 2009.
12-G.Giacinti, A.Tammaro, L.Gemma, G.L. Signoretti,
S.Amatiste.2008. Produzione di enterotossine da Staphylococcus
aureus isolati da latte di capezzolo bovino. X Congresso
Nazionale SIDILV.
13-Omoe K, Machik OI, Shimoda Y, Dong-Liang H, Ueda S (2002)
Detection of seg, seh and sei genes in Staphylococcus aureus
isolates and determination of the enterotoxin productivities of S.
aureus isolates harboring seg, seh or sei genes. J Clin Microbiol
40: 857-862.
14-Larsen HD, Aarestrup FM, Jensen NE (2002) Geographical
variation in the presence of genes encoding superantigenic
exotoxins and beta-hemolysin among Staphylococcus aureus
isolated from bovine mastitis in Europe and USA. Vet Microbiol
85: 61-67.
15-Akineden Ö, Annemüller C, Hassan AA , Lämmler C, Wolter
W, Zschöck M (2001) Toxin Genes and Other Characteristics of
Staphylococcus aureus Isolates from Milk of Cows with mastitis.
Clin Diagn lab Immunolo 89: 59-64.
16- A. Bendahou, M. Abid, N. Bouteldoun, D. Catelejine,
M. Lebbadi, 2009. Enterotoxigenic coagulase positive
Staphylococcus in milk and milk products, lben and jben, in
northern Morocco. J Infect Developing Countries: 3 (3): 169-176.
17- A. Feßler, C. Scott, K. Kadlec, R. Ehricht, S. Monecke,
S. Schwarz, 2010. Characterization of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus ST398 from cases of bovine mastitis.
Antimicrob Chemother 2010; 65: 619–625
18-Ferens W. A, W. C. Davis, M. J. Hamilton, Y. Park, C. F.
Deobald, L. Fox, G.bohach. 1998 Activation of bovine lymphocyte
subpopulations by staphylococcal enterotoxin C. Infect.
Immun.66:573-580.
272
VALUTAZIONE DELL’INCIDENZA DI AVVELENAMENTI DA CUMARINICI NELLA REGIONE
SICILIA MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESSIONE (HPLC/DAD)
Giangrosso G.1, 2, Migliazzo A.1, Vella A.1, Cicero A.1, Ferrantelli V.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia “A. Mirri” Palermo;
2
Università degli studi di Messina
Key words: cumarinici, avvelenamento, HPLC/DAD
SUMMARY
The poisoning of animals is a growing phenomenon that in
recent times has assumed proportions of very high concern
on the national territory.
In our work we evaluated the incidence of poisoning caused
by coumarin in Sicily in the period 2010-2012 using the High
Pressure Liquid Chromatography method (HPLC/DAD).
The “cumarinici” (warfarin, dicumerol, bromadiolone, etc.)
are direct inhibitors of vitamin K, needed for the hepatic
production of prothrombin (Factor II), an important component
of blood involved in the coagulation process.
INTRODUZIONE
L’avvelenamento degli animali è un fenomeno in continua
crescita che in tempi recenti ha assunto proporzioni
estremamente preoccupanti su tutto il territorio nazionale.
Sono migliaia gli animali domestici che ogni anno muoiono
a causa dell’ingestione di bocconi avvelenati e le cause
più diffuse sono da rintracciare, in particolare, nel controllo
della gestione della fauna selvatica, nei dissidi che si
sviluppano all’interno dei condomini, nel disturbo reale o
spesso solo ipotetico causato dagli animali e, da ultimo,
nell’intimidazione criminosa. I veleni più usati fino a poco
tempo fa erano il cianuro e la stricnina, attualmente di non
facile reperibilità. Oggi invece si fa ricorso a prodotti tossici
per uso agricolo, come gli antiparassitari, i rodenticidi, gli
antilumaca, i diserbanti, etc. Tali prodotti risultano essere
di facile reperibilità e di estrema efficacia procurando,
purtroppo al soggetto colpito, una morte lenta e dolorosa.
Nel nostro lavoro abbiamo voluto valutare l’incidenza, nella
regione Sicilia, degli avvelenamenti causati da cumarinici nel
triennio 2010-2012.
I cumarinici (warfarin, dicumarolo, bromadiolone, etc.)
sono inibitori diretti della vitamina K, necessaria per la
produzione epatica di protrombina (Fattore II), componente
importante della coagulazione del sangue (1) e (2). Altri
fattori direttamente coinvolti con la vitamina K sono i fattori
VII (protrombina acceleratore siero di conversione), IX
(tromboplastina componente del plasma) e X (Stuart-Prower
factor). Tali fattori vengono attivati dalle modificazioni posttraduzionali che consistono nella carbossilazione di alcuni
residui di acido glutammico al fine di generare l’acido
γ-carbossiglutammico. Durante la reazione di carbossilazione
la vitamina K, che fissa e poi cede la molecola di CO2, viene
trasformata in vitamina K epossido che viene poi riconvertita
nella forma precedente tramite una specifica riduttasi.
Questo enzima è il bersaglio dell’azione degli anticoagulanti,
i quali ne determinano l’inibizione. Quando questa cascata
è inibita, il risultato è un fallimento nella coagulazione del
sangue.
Affinché compaiano gli effetti anticoagulanti del farmaco è
necessario che il pool della vitamina K venga in buona parte
trasformato in epossido. Solo allora, infatti, i fattori della
coagulazione prodotti non verranno resi attivi e non saranno
in grado di esplicare la propria azione. Inoltre alcuni fattori
della coagulazione hanno un’emivita di alcuni giorni: si dovrà
attendere che vengano naturalmente consumati o degradati
per raggiungere un’azione farmacologica completa. È per tali
ragioni che gli effetti del farmaco iniziano a comparire dopo
8-12 ore dall’assunzione e raggiungono il massimo effetto
dopo 48-72 ore. Il quadro clinico che compare è quello
che consegue a una grave perdita di sangue. Purtroppo
la sindrome emorragica non ha sempre una localizzazione
precisa ed evidenziabile con facilità; di conseguenza ci
si deve spesso basare su sintomi indiretti come: forte
depressione del sensorio, anoressia, astenia, pallore delle
mucose, dispnea, tosse, ipotermia o al contrario febbre
(conseguente a cospicue emorragie interne), incapacità
a mantenere la stazione quadrupedale e atassia, sino al
manifestarsi in alcuni casi di vere e proprie convulsioni
(dovute ad emorragie intracraniche). A volte invece le
emorragie si rendono da subito ben evidenti e allora si può
osservare melena, epistassi, ematuria, sanguinamento
gengivale, copiose perdite di sangue da piccole ferite,
che si arrestano con difficoltà, emorragie interne (emartro,
emotorace o emoperitoneo).
MATERIALI E METODI
I campioni analizzati erano rappresentati dal fegato, dai reni,
dallo stomaco e dal suo contenuto, di carcasse di animali,
nonché dalle esche rinvenute nei pressi degli animali
deceduti, inviate dai Servizi Veterinari Ufficiali, da veterinari
libero professionisti e dalle forze dell’ordine (Carabinieri,
N.A.S., ecc).
Per la ricerca dei cumarinici la metodica utilizzata è quella
della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e le
misurazioni sono state effettuate tramite sistema binario in
gradiente Agilent modello 1200 HPLC-DAD.
La metodica di estrazione consiste nel pesare 5 gr di
campione in provette falcon da 50 ml, aggiungere 40 ml
di una soluzione Metanolo/TEA/NaOH (800ml/200ml/2ml),
vortexare per circa un minuto, porre in bagno ultrasuoni per
10 minuti, centrifugare per 10 minuti a 3000 rpm e filtrare
tramite filtri da 0,45 µm in vials da 1 ml. Il campione così
preparato viene iniettato nel sistema binario in gradiente
Agilent modello 1200 HPLC-DAD.
Le condizione cromatografiche sono:
- Velocità di flusso: 0.7 ml/min;
- Lunghezze d’onda: 260 e 303 nm;
-Tempo analisi: 15 min;
-Fase mobile: Tampone acetato pH 5/Metanolo 70/30 e
Acetonitrile.
La corsa cromatografica segue un andamento in gradiente
riportato nella tab. 1.
273
Tab. 1
Step
Tempo
(min)
Flusso
(ml/min)
0
0
0.7
Eluente A
(Tampone
acetato)
15%
1
6
0.7
70%
30%
2
13
1
70%
30%
3
14
0.7
15%
85%
4
15
0.7
15%
85%
Eluente B
(Acetonitrile)
85%
RISULTATI
Nei grafici successivi vengono riportati i risultati per provincia
delle 433 carcasse pervenute presso i laboratori dell’Area di
Chimica e Tecnologie Alimentari dell’Istituto Zooprofilattico
sperimentale della Sicilia nel triennio 2010-2012:
DISCUSSIONE
Il codice penale in particolare l’art 544 bis stabilisce che
“Chiunque, per crudeltà o senza necessità, cagiona la morte
di un animale è punito con la reclusione da tre mesi a diciotto
mesi”. La legge 189 del 2004, annoverando nel concetto di
animale qualsiasi essere vivente appartenente al genere
animale senza distinzione tra quelli di affezione e quelli che
non lo sono, permette l’applicazione della disposizione vietante
il maltrattamento di animali non solo nei confronti degli animali
domestici, bensì anche ad altri animali compresi i volatili,
spesso oggetto di avvelenamento. Inoltre, secondo l’art. 674
C.P. “chiunque getta o versa, in un luogo di pubblico transito
o in un luogo privato ma di comune o di uso altrui, cose
atte ad offendere le persone è punito con l’arresto fino ad
un mese o con l’ammenda fino a € 206. L’offesa recata alle
persone può dunque consistere sia in una lesione fisica, si
pensi all’eventualità che ad ingerire il veleno sia un bambino,
sia in un danno morale, come la perdita del proprio animale
domestico. Non può non rilevarsi come nonostante l’aumento
dell’attenzione tanto della popolazione, quanto delle istituzioni
al fenomeno dell’avvelenamento questo è, e continua ad
essere un problema irrisolto che necessita di un costante
monitoraggio.
Dai risultati ottenuti emerge una scarsa incidenza di
avvelenamenti da cumarinici (6% sul totale dei campioni
analizzati). C’è da dire però, che il loro meccanismo d’azione
più prolungato rispetto alle altre molecole, permette un
tempestivo intervento da parte del veterinario con maggiori
possibilità di evitare la morte dell’animale, giustificando così il
minore riscontro. Questi dati dimostrano in modo inequivocabile
come nonostante diverse restrizioni di utilizzo e vendita delle
varie sostanze, è ancora possibile riuscire a reperirle con una
certa facilità.
Conoscere il tipo di molecola impiegata negli episodi di
avvelenamento è importante per diversi motivi, tra cui avere
una mappatura dei principi attivi più utilizzati che consente un
controllo più preciso da parte delle Forze dell’Ordine deputate
al monitoraggio del fenomeno. Inoltre conoscere il tipo di
molecola consente in base alla casistica e alla sintomatologia
di poter intervenire tempestivamente nei casi in cui è possibile
sfruttare il fattore tempo quando un animale è ancora in vita.
Dall’attività di ricerca svolta emerge un quadro preoccupante
riguardo al fenomeno dell’avvelenamento, soprattutto perché
dimostra come questo non sia appartenente al passato ma
molto attuale e presente sul nostro territorio. L’uccisione
di animali per mezzo dei bocconi/esche avvelenate è una
barbara attività, figlia di una ancestrale concezione di controllo
del territorio; tale modalità, in aggiunta alle implicazioni morali
facilmente intuibili, non è assolutamente selettiva e determina
la dispersione di pericolose sostanze tossiche nell’ambiente
responsabili di gravi fenomeni a carico della popolazione
domestica e selvatica.
Quando le esche vengono posizionate nell’ambiente urbano, il
rischio si estende anche alla fascia di popolazione rappresentata
dai bambini.
BIBLIOGRAFIA
(1) Donoco, E., Haft, J.I., 1976. Thrombosis, Platelets,
Anticoagulation, and Acetylsalicylic Acid, Vol. 2. Stratton
International Medical Book Corporation. New York, NY, 200pp;
2) Seegars, W.H., Walz, D.A., 1986. Prothrombin and Other
Vitamin K Proteins, Vol. I. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL,
181pp;
274
DETECTION OF COCCIDIOSTATS AT CARRY-OVER IN FEED: RESULTS OF A SURVEY
PERFORMED IN THE PERIOD 2011-2012 IN PIEDMONT REGION
Gili M., Stella P., Ostorero F., Abete M.C.
Key words: coccidiostatici, carry-ver, mangimi
SUMMARY
During the production of feed containing coccidiostats as
additives, unavoidable carry-over of the coccidiostats from
target to non-target feed occur when the same production
lines are used. In the EU, the use of these substances is
under regulation (Reg 2011/574/CE, which sets maximum
levels for these coccidiostats for unavoidable carry-over in
feed), but residues are found in meat and eggs because
cross-contamination or misuse on farm. So, animals feedstuffs
must be controlled. Having an LC-MS/MS method developed
and validated according to Reg. 2004/882/EC criteria in our
laboratories, that allows the identification and quantitative
determination of eight coccidiostats (robenidine, nicarbazin,
diclazuril, lasalocid, monensin, narasin, salinomycin and
maduramycin) in feed at carry-over levels, was launched a
monitoring plan to trial.
This survey provides a collection of 400 samples feed in
Piedmont region during the period from January 2011 to
December 2012.
INTRODUZIONE
I coccidiostatici sono farmaci utilizzati negli allevamenti di
diverse specie di animali da reddito per contrastare l’insorgenza
della coccidiosi, malattia parassitaria causata da protozoi del
genere Eimeria appartenenti alla classe Sporozoa. Il Reg.
2003/1831/EC autorizza l’utilizzo come additivi nei mangimi dei
seguenti coccidiostatici: alofuginone bromidrato, decochinato,
diclazuril, lasalocid sodico, maduramicina ammonio, monesin
sodico, narasin sodico, nicarbazina, robenidina cloridrato,
salinomicina sodica, semduramicina sodica. Poiché queste
sostanze, anche a causa della elevata elettrostaticità della
molecola, sono tra i principali responsabili di fenomeni di carryover, l’Unione Europea ha emanato prima la Direttiva 2009/8/
EC (1) , seguita poi dal Reg. 2011/574/EC, che definisce i
tenori massimi di coccidiostatici presenti per effetto di carryover inevitabile in mangimi destinati a specie non bersaglio.
La “cross-contaminazione” o “carry-over” si verifica quando
quantità di farmaco molto inferiori alla dose terapeutica, rimaste
nell’impianto di lavorazione per una insufficiente procedura di
bonifica dopo la produzione di un lotto di mangime medicato,
contaminano un mangime “bianco”. Il fenomeno può esser
causato da diversi fattori, sia in PRODUZIONE (produzione
simultanea di mangimi medicati e non, scarsa pulizia
attrezzature e locali, emissione di polveri e liquidi, mancata
separazione di zone di stoccaggio, caratteristiche fisiche delle
sostanze, uso di premiscele in polvere anziché granulari), sia
in ALLEVAMENTO (mangimi medicati e bianchi nello stesso
silos, scarsa pulizia di attrezzature, mangiatoie o erogatori
acqua, contaminazione fra sacchi o recipienti aperti). Come
conseguenza si può avere presenza di residui del farmaco >
LMR in alimenti di origine animale. Il rischio maggiore si ha
con mangimi per animali in fase di finissaggio e mangimi per
animali da produzione diretta (uova e latte).
Al fine di un costante monitoraggio, il Piano Nazionale di
vigilanza e controlli sanitari sull’Alimentazione Animale (PNAA)
prevede la ricerca di coccidiostatici non solo per la verifica della
conformità al dichiarato ma anche a livello di contaminazione
crociata in mangimi destinati a specie non bersaglio. Nel 2010
presso il nostro laboratorio è stato sviluppato e validato un
metodo multiresiduo quantitativo per la ricerca di coccidiostatici
in alimenti ad uso zootecnico a livello di carry-over (robenidina,
nicarbazina, diclazuril, lasalocid, monensin, narasin,
salinomycina e maduramycina) mediante LC-MS/MS idoneo
alla esecuzione di analisi sia di screening che di conferma
nell’ambito dei controlli ufficiali. In seguito, nel periodo 20112012 questo metodo è stato utilizzato per l’esecuzione di
controlli ufficiali.
Nel presente lavoro sono riportati i risultati dei controlli
effettuati nel biennio 201-2012 in Piemonte per la ricerca di
coccidiostatici al livello di contaminazione crociata.
MATERIALI E METODI
L’attività di prelievo campioni è stata effettuata dai Servizi
Veterinari delle AA.SS.LL. del Piemonte, nell’ambito del PNAA
e di un extrapiano regionale.
Tutti i campioni prima dell’analisi sono stati accuratamente
macinati per avere uniformità di distribuzione dell’analita nel
campione; sono stati quindi analizzati presso il Laboratorio
Ricerca Residui dell’IZS PLV con un metodo multiresiduo
quantitativo per la ricerca di coccidiostatici in alimenti ad uso
zootecnico a livello di carry-over sviluppato dal Centro di
Referenza per l’Alimentazione Animale (C.Re.A.A.) e validato
in conformità ai criteri del Reg. 2004/882/EC.
Questo metodo, basato sulla Cromatografia Liquida accoppiata
alla Spettrometria di Massa tandem (LC-MS/MS), consente di
identificare e quantificare 8 degli 11 coccidiostatici autorizzati
(robenidina, nicarbazina, diclazuril, lasalocid, monensin,
narasin, salinomycina e maduramycina) in mangimi a livello
di carry-over, cioè a partire da concentrazioni di 0.250 mg/
kg per robenidina, nicarbazina, lasalocid, monensin, narasin,
salinomycina e di 0.005 mg/kg per diclazuril e maduramicina.
Il metodo sviluppato e validato risulta idoneo all’esecuzione di
analisi sia di screening che di conferma, in quanto consente
l a separazione, identificazione e quantificazione degli analiti
(fig. 1).
Il laboratorio IZS PLV ha partecipato nel 2012 a un proficiency
test organizzato dal laboratorio di riferimento europeo EURL
Feed Additives JRC- Geel con esito soddisfacente (tabella 1).
Nel periodo 2001-2012 sono stati analizzati 400 campioni di
mangimi completi per diverse specie animali (bovino, suino,
ovicaprino, equino, volatili, conigli): 358 campioni sono risultati
negativi, 26 campioni sultano contenere basse concentrazioni
di coccidiostatici (inferiori al limite massimo) e 14 campioni
sono risultati non conformi.
275
I valori riscontrati nei campioni non conformi sono comparabili
con un fenomeno di carry over inevitabile.
Gli analiti che si riscontrano con maggior frequenza sono la
robenidina, la nicarbazina e gli ionofori (monensin, salinomicina,
maduramicina e narasin).
Certamente il numero di campioni esaminati è rappresentativo
per avere una “fotografia” della realtà produttiva e della efficacia
delle bonifiche di processo attuate in produzione per evitare il
fenomeno del carry over.
Da segnalare che, in alcuni casi, sono state riscontrate criticità
nel campionamento:
1) In alcuni casi era richiesto un coccidiostatico in un mangime
che in etichetta dichiarava un altro principio attivo con pari
funzione e a volte appartenente alla stessa famiglia (es
RICHIESTO: lasalocid, DICHIARATO: monensin): si rileva
una incongruenza poiché l’efficacia delle procedure di
bonifica tra cicli di lavorazione dovrebbe esser verificata
solo nel passaggio a mangimi bianchi.
2) Si sono verificati casi di prelievo del campione in mangiatoia
senza campione in contraddittorio; in queste condizioni non
si può verificare se la causa è da ricercare nelle procedure
di bonifica tra cicli di lavorazione in stabilimento o in errori
a livello di allevamento.
Tabella 1: risultati del proficiency test 2012
Analita
Concentrazione
(mg/kg)
n. di
laboratori
% di risultati
soddisfacenti
Monensin
Lasalocid
Salinomicina
Narasina
Diclazuril
1.09
1.19
0.66
0.68
0.010
29
29
29
29
29
67
62
73
57
63
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1. Directive 2009/8/CE, Off. J. Eur. Communities L40/19
(2009)
2. REG. 2004/882/EC, Off. J. Eur. Communities L191/1
(2004)
3. W.J.Youden, E.H.Steiner, Statistical Manual of AOAC,
Association of Official Analytical Chemist, 33, 1975
4. Proceeding of 6TH MS-Pharmaday Milan 2010
Figura 1: cromatogrammi di estratti di mangime drogato
con tutti gli analiti
MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP. PARATUBERCULOSIS (MAP): VALUTAZIONI
PRELIMINARI SU PROTOCOLLO DIAGNOSTICO POST MORTEM IN BOVINI MACELLATI
DI ALLEVAMENTI INFETTI
Giorgi I., Goria M., Romano A., Garrone A., Bozzetta E., Varello K., Dondo A.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Piemonte Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna, 148 – 10154 Torino
Key words: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, cattle, standardized sampling
ABSTRACT
Faeces, portions of intestine and gut-associated lymph
nodes were collected at slaughter from 49 dairy cattle from
paratuberculosis infected herds and processed for MAP
detection (culture, PCR, histopathology). All of intestinal tracts
were positive for MAP. Based on these results it’s advisable
to analyze multiple intestinal tracts and lymph nodes to detect
infected animal. Moreover, 15 cattle positive for MAP in tissue,
resulted negative in faeces. Different factors, such as low
shedder condition, intermittent faecal excretion or early stage
of infection could affect the performance of MAP detection
on faeces. A standardized sampling protocol on slaughtered
animals of infected herds could increase the diagnostic success
on suspected animals. It could also be useful to discover infected
animals, which were negative for in vita tests. Better information
about health status of the herd could advise to perform an
appropriate prevention and a correct management in the infected
herds.
INTRODUZIONE
Mycobacterium avium subspecie paratuberculosis (MAP) è
l’agente eziologico della paratubercolosi, una malattia infettiva
che provoca diarrea cronica nei ruminanti domestici e selvatici.
L’infezione avviene prevalentemente per via oro-fecale, segue
poi un lungo periodo di incubazione. Nei bovini la manifestazione
clinica avviene di norma dopo i 2 anni di età: esordisce con
diarrea incoercibile, che porta a dimagrimento e decadimento
delle condizioni generali (1).
Le lesioni a livello intestinale sono rappresentate da ispessimento
della mucosa intestinale, che assume un aspetto cerebroide. I
linfonodi interessati appaiono aumentati di volume ed edematosi.
(2)
Questa malattia è una tra le più difficili da eradicare in allevamento,
principalmente a causa della presenza di animali eliminatori non
clinicamente manifesti. I Test diagnostici in vita disponibili (Elisa,
colturale, PCR) non sempre riescono ad individuare gli animali
infetti a causa della loro bassa specificità diagnostica. (3)
La paratubercolosi negli allevamenti delle bovine da latte
sta assumendo una importanza sempre maggiore a livello
internazionale, soprattutto a causa delle restrizioni commerciali
che attualmente sono in vigore in paesi con mercato emergente
(India e Cina). Per questo motivo nella U.E. alcuni paesi hanno
iniziato ad adottare dei piani obbligatori o volontari per il controllo
e riduzione della malattia. In Italia è attivo in Lombardia un piano
volontario per il controllo e la certificazione della paratubercolosi
bovina, con allo studio la possibilità di essere esteso a tutto il
territorio nazionale (4).
In questo scenario è quindi importante disporre di protocolli
diagnostici il più possibile accurati e sensibili per formulare la
diagnosi anche in modo precoce.
A tal fine sono stati effettuati test colturali, biomolecolari e
istologici su tessuti intestinali e su feci di bovini macellati.
Con l’esecuzione del protocollo diagnostico messo a punto
è stata valutata nei diversi tratti dell’apparato gastroenterico
la presenza di MAP e delle lesioni istopatologiche correlate.
276
Contemporaneamente i risultati sono stati messi in relazione con
gli esiti degli esami colturali e biomolecolari eseguiti a partire dal
materiale fecale prelevato dall’intestino degli stessi animali.
Il lavoro rappresenta un contributo per la valutazione di un set
di esami post mortem standardizzati, anche nell’ottica di un
miglioramento nella gestione e controllo della paratubercolosi in
allevamento.
MATERIALI E METODI
Campionamento: sono stati analizzati 218 campioni di organi
appartenenti a 49 animali macellati. Gli organi prelevati in
sede di macellazione sono stati: linfonodi meseraici, piccolo
intestino, valvola ileo-ciecale, intestino cieco, intestino retto.
Contestualmente dai 49 animali è stato eseguito un prelievo di
feci dall’ultimo tratto dell’intestino.
Esame colturale: Le feci e i tessuti prelevati sono stati sottoposti
a decontaminazione con HPC 0,75% e seminati su diversi terreni
antibiotati all‘uovo di herrold‘s (HEYM), in base ai protocolli del
manuale OIE 2008 (7). Le colture venivano controllate con
cadenza trisettimanale per 4 mesi. In caso di crescita di batteri
alcol-acido resistenti si procedeva all’identificazione con tecnica
PCR.
Diagnostica
molecolare:
il
protocollo
prevede
due
amplificazioni successive che amplificano la sequenza
d‘inserzione IS900 specifica per MAP
utilizzando
nel primo step la coppia di primer denominati P90
(5‘-GAAGGGTGTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3‘)
e
P91
(5‘-GGCGTTGAGGTCGATCGCCCACGTGAC-3‘), da cui si
ottiene un amplicone specifico di circa 400 bp. Al fine di aumentare
la sensibilità del saggio è stato disegnato il primer pEmiNPTBC-f
(5‘-TGGGTTGATCTGGACAATGACGGTTAC-3‘),
interno alla sequenza nucleotidica definita dai primers p90 e
p91, da utilizzare nel secondo step da cui si ottiene un amplicone
specifico della lunghezza di 229 bp. (5)
Diagnostica Istopatologica: i tessuti fissati sono stati sottoposti
alle procedure standard di inclusione in paraffina ed al taglio
al microtomo di sezioni di 4±2 μ di spessore. Sui preparati è
stata eseguita colorazione con Ematossilina-Eosina (EE) e
colorazione di Ziehl Neelsen (ZN).
Su 34/49 capi (69,4%), con il protocollo messo a punto, è stata
rilevata la positività per MAP ad uno degli esami eseguiti per
tratto intestinale o in un linfonodo.
Nel grafico 1 viene mostrata la positività per MAP per singolo
organo (espressa in percentuale) dei 34 capi con almeno un test
positivo.
In particolare 26 capi (76%) erano positivi al colturale per
almeno un organo, 32 (94,1%) alla PCR e 17 (50%) all’esame
istologico(isto).
Gli esami colturali e biomolecolari eseguiti dai campioni fecali
prelevati dall’intestino degli stessi 34 animali sono risultati
negativi in 15 casi (44,1%).
Nel grafico 2 sono mostrate le percentuali di positività per MAP
nei diversi organi dei 15 animali con esami negativi sulle feci.
277
Grafico 1 – percentuale di positività per MAP e lesioni
istopatologiche, per organo e per tipologia di esame, nei
capi positivi. (batt: esame colturale PCR: heminested PCR,
isto: esame istologico)
modo indiretto, informazioni per una ricerca mirata delle possibili
fonti di contaminazione (acquisto di animali, gruppi di animali,
figli di positivi, ecc) al fine della migliore messa a punto di misure
di prevenzione tempestive e adeguate.
Grafico 2 – percentuale di positività per MAP e lesioni
istopatologiche, per organo e per tipologia di esame, nei capi
con feci negative. (batt: esame colturale PCR: heminested
PCR, isto: esame istologico)
I linfonodi meseraici, il piccolo intestino e la valvola ileocecale
sono stati gli organi in cui è stato rilevato il maggior numero
di lesioni istologiche specifiche, mentre l’isolamento di MAP è
avvenuto più frequentemente dal retto, cieco e piccolo intestino.
La percentuale di positività alla PCR non ha evidenziato
differenze significative nei vari organi.
Analizzando i risultati ottenuti risulta quindi utile effettuare un
campionamento policostituito nei vari distretti intestinali (tessuti
e linfonodi meseraici), al fine di aumentare la possibilità di
successo diagnostico.
L’assenza di MAP nelle feci nei 15 animali in cui sono state
evidenziate lesioni istopatologiche specifiche o in cui è stata
rilevata la presenza di MAP potrebbe essere così spiegata:
presenza di animali infetti con escrezione fecale paucibacillare o
intermittente, animali in fase iniziale d‘infezione con escrezione
di MAP nelle feci ancora non presente. A supporto di questa
ultima ipotesi l’organo che ha presentato il maggior numero di
lesioni istologiche nel campionamento eseguito è stato il piccolo
intestino, che, come noto, è il sito di infezione primario di MAP
(6).
In 15 capi dei 49 animali inseriti nello studio non sono stati rilevati
MAP o lesioni specifiche nei tessuti e sono risultati negativi anche
gli esami effettuati dalle feci. Questo risultato, seppure ottenuto
su un esiguo numero di campioni, ci consente comunque di
considerare il protocollo diagnostico dotato di buona sensibilità
per la rilevazione di animali paratubercolotici con escrezione
attiva.
I risultati del lavoro permettono di evidenziare i possibili benefici
che si potrebbero ottenere con l’esecuzione di campionamenti
policostituiti standardizzati al macello di tessuti di animali
provenienti da allevamenti infetti.Infatti l’adozione di esami post
mortem può essere utile, in particolare, per svelare la presenza
in allevamento di animali infetti non eliminatori o negativi
all’esame colturale dalle feci. La possibilità di identificare i falsi
negativi è molto importante, nell’ottica di una valutazione della
diffusione reale nell’allevamento, soprattutto considerando le
basse sensibilità dei test in vita ad oggi disponibili. Inoltre, in
caso di macellazione diagnostica di animali positivi ai test in
vita, gli esami post mortem possono confermare l’infezione:
ad esempio confermando le positività all’Elisa escludendo che
si tratti di una risposta aspecifica, oppure nel caso di positività
per MAP in vita con esame batteriologico o PCR da feci dando
la possibilità di verificare l’eventualità che si tratti di un transito
passivo. Questo tipo di approccio permetterebbe una migliore
comprensione delle dinamiche di trasmissione e mantenimento
della paratubercolosi in un allevamento infetto e fornirebbe, in
DIAGNOSI DI LABORATORIO DI TOXOPLASMOSI SU UN ASINO
Giunta R.P., Salvaggio A., Alfonzetti A., Aparo A., Bauso R., Conti R., Marino A.M.F.
Centro di Referenza Nazionale per la Toxoplasmosi - Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia Catania
Key words: Donkey, Toxoplasma gondii, Nested-PCR
SUMMARY
The present work reasons about some sample’s positivity for
Toxoplasma gondii, either in circulating antibody form, both as
bradyzoites in tissue, in the Equidae’s. family
Horses and donkeys in fact have always been considered
“resistant” (1-2) to Toxoplasma gondii infection, but resistance
refers to the lack of pathological manifestations (3). The donkey
examined was found positive to equine infectious anemia, a
condition that could have led to the exacerbation of the disease,
resulting in positive serology. The importance of the results of
this investigation come along to the phenomenology of Catania,
as it is known there is a high consumption of horse meat.
Si ringrazia il Centro di Referenza Nazionale per la
Paratubercolosi (IZSLER) per il prezioso contributo e supporto
fornito per la realizzazione del lavoro.
Ricerca realizzata con fondi erogati dal Ministero della Salute
nell’ambito del programma ricerca corrente 2010 (Progetto
IZSPLV 10/08 RC).
BIBLIOGRAFIA
1.Arrigoni N., Alborali L., Bertoletti I., Boldini M., Fabbi M.,
Invernizzi A., Losini I., Luini M., Monaci C., Rosignoli C.,
Sacchi C.,Tamba M., Belletti G.L. 2006. Indagine sulla
prevalenza di Paratubercolosi negli allevamenti bovini da
latte della Lombardia. Atti del XXXIX Congresso Nazionale
della S.I.B. Buiatria 1 pp 7-12
2.Antognoli M.A., Garry F.B., Hirst H.L., Lombard
J.E., Dennis M.M., Gould D.H., Salman M.D. 2008.
Characterization of Mycobacterium avium subspecies
paratuberculosis disseminated infection in dairy cattle and
its association with antemortem test results. Veterinary
Microbiology 127 pp 300–308
3.Crossley BM, Zagmutt-Vergara FJ, Fyock TL, Whitlock
RH, Gardner IA., 2005. Fecal shedding of Mycobacterium a
vium subsp. Paratuberculosis by dairy cows. Vet Microbiol
107 pp 257-63
4.Ddg 18 luglio 2013n.6845 Piano regionale di contrllo e
certificazione nei confronti della paratubercolosi bovina.
Bollettino ufficiale Regione Lombardia. serie ordinaria num
30, pp 42-51
5.Garrone A., Fulghesu L., Benedetto A., Soncin A.R.,
Carlino F., Dondo A., Goria M., osservazioni preliminari per
la ricerca di m. avium subsp. paratuberculosis in campioni
fecali di bovino mediante l’allestimento in house di un
metodo heminested pcr Atti del X Convegno nazionale
SIDILV 2008 p 191
6.Dennis D.M, Antognoli M.C.,Garry F.B.,Hirsc H.L,.
Lombard J.E, Goulda D.H. 2008 Association of severity
of enteric granulomatous inflammation with disseminated
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
infection and antemortem test results for paratuberculosis
in dairy cows. Veterinary Microbiology 131, Pp 154–1636
7.OIE Terrestrial Manual 2008 pp 277-281
278
INTRODUZIONE
La toxoplasmosi negli equidi decorre, nella stragrande
maggioranza dei casi, in maniera asintomatica, anche se sono
stati descritti episodicamente febbre, encefalite, atassia e
degenerazione retinica. Vari studi a carattere sierologico condotti
sui cavalli in diversi Paesi del mondo hanno evidenziato un
ampio intervallo di positività, che va dall’ 1% al 37%, a seconda
della zona geografica e del metodo utilizzato. Per quanto
riguarda gli asini i dati sierologici sono ancora incompleti, ma le
positività risultano essere anche più elevate, con un massimo
del 62% in Turchia. A queste positività però, anche se a titoli
elevati, non corrispondono forme sintomatologiche evidenti.
Il presente caso descrive le positività per Toxoplasma gondii
rilevate agli esami di laboratorio su di un asino di razza
ragusana, di sesso femminile e dell’età di circa 17 anni,
macellato in seguito ad una precedente positività per Anemia
Infettiva Equina (AIE) evidenziata durante gli esami di routine
previsti dalla normativa vigente per gli equidi riproduttori.
Il soggetto alla visita ispettiva ante-mortem mostrava
ottundimento del sensorio, atassia locomotoria, difficoltà al
mantenimento della stazione quadrupedale e cachessia (fig.1).
Il quadro sintomatologico naturalmente era complicato dalla
sovrapposizione delle due patologie concomitanti.
Fig 1 Il soggetto si mostra cachettico e con difficoltà motorie
Erano evidenti inoltre diverse lesioni traumatiche sulla
superficie del corpo e nel sottocute, legate presumibilmente
alla mancanza di coordinamento nei movimenti. ( Fig 2)
Fig 2 Carcassa con evidenti ecchimosi nel sottocute
Durante la macellazione dell’animale, avvenuta nel rispetto della
normativa vigente, sono stati eseguiti diversi campionamenti di
sangue ed organi per l’esecuzione degli esami di laboratorio
da parte del Ce.Tox, Centro di Referenza Nazionale per la
Toxoplasmosi ubicato presso l’IZS della Sicilia Area Catania. Sul
sangue in toto è stato eseguito un esame sierologico mediante
l’impiego della metodica IFI per la diagnosi di Toxoplasma
gondii, mentre i restanti campioni (sangue con EDTA, occhio,
tronco encefalico, muscolo, diaframma e cuore) sono stati
sottoposti ad esame biomolecolare, mediante l’impiego della
Nested-PCR, come previsto dall’OIE Manual of Diagnostic
Test and Vaccines for Terrestrial Animals (4) per la diagnosi di
Toxoplasma gondii.
MATERIALI E METODI
Sul siero prelevato è stata effettuata una sierodiagnosi per
toxoplasmosi mediante una metodica di immunofluorescenza
indiretta. A tal fine sono stati impiegati dei vetrini a 12 pozzetti,
prodotti dalla ditta “Fuller Laboratories”, e sensibilizzati con
tachizoiti di T. gondii RH strain, secondo quanto previsto dal
Manuale OIE. Si è proceduto seguendo il protocollo previsto
dallo stesso Manuale “Protocol for the IFA test”, pur applicando
le varianti previste per specie diverse. E’ stato, inoltre, utilizzato
un coniugato specie-specifico (anticorpi anti -IgG) marcato con
FITC della stessa ditta. Il siero è stato saggiato dalla prima
diluizione di 1:16 sino alla diluizione di 1:128. Il mezzo di
montaggio dei vetrini conteneva il 50% di glicerolo in PBS.
Per quanto riguarda gli esami biomolecolari, l’occhio, il tronco
encefalico, il muscolo striato, il diaframma ed il muscolo
cardiaco, insieme ai campioni di sangue in toto con EDTA,
sono stati sottoposti a ricerca del DNA di Toxoplasma gondii
mediante tecnica Nested PCR, seguendo anche in questo caso
le indicazioni dettate dal Manual of Diagnostic Test and Vaccines
279
for Terrestrial Animals, O.I.E. ed. 2008, “Toxoplasmosis” Cap.
2.9.10. B 1.c. L’estrazione del Dna ha seguito le modalità
operative descritte nel Kit dell’Invitrogen PureLink™ Genomic
DNA, utilizzando colonnine di affinità. Il Kit prevede prima
dell’estrazione una fase di preparazione del campione durante
la quale vengono digeriti i tessuti. La durata della digestione
varia da poche ore a tutta la notte, a seconda della consistenza
del campione. Si passa quindi alla fase di estrazione vera e
propria ottenendo il DNA che verrà successivamente amplificato
con un kit taq polymerase (Euroclone).
La prima amplificazione viene condotta usando i primers P1
(Toxo Burg First Forward) e P4 ( Toxo Burg Nested Reverse)
per ottenere un amplificato di 194 bp, la seconda amplificazione
“nested” con i primers P2 (Toxo Burg Nested Forward) e P3
(Toxo Burg Nested Reverse) da cui si ottiene un frammento
di 97bp (5-6). Nella fase successiva si passa alla lettura degli
amplificati ottenuti, caricandoli su di un gel di agarosio al 2%
insieme ad un controllo positivo ATCC50838 coltivato su cellule
Human Foreskin Fetal e ad un controllo negativo. In aggiunta
viene adoperato come marcatore molecolare un ladder 100 bp
per segnalare l’altezza della banda positiva di riferimento di
97bp (fig 3).
Fig 3: i campioni positivi su gel d’agarosio confrontati con K+
e ladder 100 bp
All’osservazione al microscopio a fluorescenza il siero in esame
è risultato positivo alla prima diluizione (1:16) e debolmente
positivo alla seconda (1:32), mentre i campioni saggiati mediante
Nested PCR hanno dato i risultati descritti in tabella 1.
Tab 1: Campioni saggiati, Metodiche utilizzate e risultati
ottenuti, Riferimenti bibliografici
Emosiero
IFAT pos. 1:16
Manuale OIE
Sangue in
toto con
EDTA
PCR pos.
Manuale OIE
PCR pos.
Turner and Savva,1991
PCR pos.
Muscolo
striato
PCR pos.
Diaframma
PCR pos.
Munday,USA
Muscolo
cardiaco
PCR pos.
Turner and Savva, 1991
Occhio
Tronco
encefalico
In bibliografia viene riportato che gli equidi sono considerati
essere poco sensibili agli effetti patogeni del Toxoplasma gondii,
(3-4); che la siero-prevalenza varia in base all’età (massima
positività dopo i 10 anni, a causa del prolungato contatto con
le oocisti infettanti), all’area geografica (gli ambienti costieri
favoriscono l’infezione), alle condizioni igieniche ed alla
conduzione dell’allevamento (Riemann et al.,1975).
Considerata l’alta prevalenza e la scarsa sintomatologia, è
quindi necessario considerare gli equidi come un’importante
fonte di trasmissione della toxoplasmosi all’uomo, sia attraverso
il consumo di carni poco cotte, sia attraverso il consumo di latte
di asina non pastorizzato (7-8).
A sostegno di ciò riportiamo come la suscettibilità degli equidi
al toxoplasma sia stata dimostrata sin dal 1954 (Hasegawa et
al.,1954), e come nella review di P. Tassi si riferisca il caso di
ponies trattati con corticosteroidi e successivamente inoculati
con milioni di tachizoiti senza che abbiano manifestato alcuna
sintomatologia clinica se non piressia.
Di contro le abitudini alimentari della popolazione di numerose
regioni italiane, dove la carne di cavallo e di asina viene
consumata in quantità sempre maggiori e la caratteristica
inoltre di venire consumata “al sangue” impedendo in tal modo
che avvenga la distruzione di eventuali cisti, per la qual cosa
sarebbe necessario raggiungere una temperatura interna
di almeno 67°C (9), fanno in modo che il consumo di equidi
rappresenti sempre di più un serio problema di sanità pubblica
e rende necessario un aumento dei controlli sulle carni e sul
latte a motivo dei rischi che la toxoplasmosi può rappresentare
specialmente per alcune fasce di popolazione.
BIBLIOGRAFIA
1) Sonia BoughattasRamzi Bergaoui, Rym Essid1, Karim
Aounand Aida Bouratbine*” Seroprevalence of Toxoplasma
gondii infection among horses in Tunisia”
2) Seroprevalence of Toxoplasmosis in Donkeys in Eastern
Turkey
Balkaya, I.,1 Babur, C.,2 Celebi, B.2 and Utuk, A. E, Israel
Journal of Veterinary Medicine Vol. 66 (2) June 2011
3) P.Tassi “Toxoplasma gondii infection in horses”. A review,
Parassitologia 2007, vol. 49, n o 1-2, pp 7-15
4) Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial
Animals - O.I.E. ed. 2008, “Toxoplasmosis” Cap. 2.9.10. B1.c.
5) J. L. Burg, C. M. Grover, P. Pouletty and J. C. Boothroyd
(1989) “Direct and sensitive detection of a pathogenic
protozoan, Toxoplasma gondii, by polymerase chain reaction”.
Journal of Clinical Microbiol., 27 (8): 1787
6) J.P.Dubey,P.Thulliez,S.romand,O.C.H. Kwok, S.K.Shen,
H.R. Gamble ”Serologic prevalence of toxoplasma gondii
in horses slaughtered for food in North America”-Vetrinary
Parasitology 86(1999)235-238
7) HP Riemann, ME Meyer, JH Theis, G Kelso Toxoplasmosis
in an infant fed unpasteurized goat milk J Pediatr. 1975
Oct;87(4):573-6.
8) D. Hill and J. P. Dubey “Toxoplasma gondii: transmission,
diagnosis and prevention”- Clin Microbiol Infect 2002; 8: 634–
640
9) Muriel Cornet-“Toxoplasmosis and horse meat,France”Emerging Infectious Diseases,vol 17.n°7 july 2011
280
EFFETTI DELL’ IRRAGGIAMENTO CON RAGGI X DI BASSA ENERGIA SULLA
SOPRAVVIVENZA DI SALMONELLA SPP.
Goffredo E., Azzarito L., Mangiacotti M., Altieri P., Chiaravalle A.E.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e Basilicata, Foggia
Key words: irraggiamento, Salmonella spp, dosimetria
SUMMARY
The research studied, in vitro and on poultry meat, sensitivity
of three serotypes Salmonella spp. to x-rays irradiation,
calculating the D10 values. For each test, broth culture or spiked
meat sample were irradiated and analyzed with mini-MRSV
MPN method, to evaluate the bacteria count, at the same time
with non-irradiated samples.The doses of radiation were 0.1
and 0.5 kGy. For D10 calculation, data from each test were Log
transformed and the microbial charge reduction evaluated; the
regression analysis (Eq.1°) was then applied comparing the
reductions of charge against x-ray doses.The D10 resulted as
the reciprocal of the inverse of the slope (b) (D10 =-1/b).The
D10 were between 0,12-0,2, for the strains in broth-culture and
0,22-0,3 in meet. At the same time we defined primarily the
dosimetric system to quantify x-ray dose, and, secondarily,
validated Electron Spin Resonance method to the detection
of x-ray treatment on turkey meat. For the dosimetric system
(alanine-pellet and ESR spectrometer), we determined the
calibration curve in dose.The ERS method results fit for purpose
with LOQ =0.5 kGy and a good robustness.
INTRODUZIONE
Le radiazioni ionizzanti rappresentano senz’altro la nuova
frontiera delle tecniche di lavorazione e conservazione degli
alimenti. Tale tecnologia agendo sugli acidi nucleici cellulari, è
utilizzabile oltre che per bloccare i processi germinativi in taluni
vegetali, per ridurre le cariche microbiche di microrganismi
commensali o patogeni, rallentando i processi alterativi e
risanando gli alimenti, senza modificarne sostanzialmente le
caratteristiche organolettiche. Scopo della presente ricerca è
stato studiare in vitro e su matrice carne di pollame la sensibilità
di Salmonella spp. all’irraggiamento con raggi-x, con definizione
della dose D10. Contemporaneamente si intendeva individuare
il sistema dosimetrico da adottare per la quantificazione del
trattamento radiante ed estendere, validandolo, il metodo
di Risonanza Elettronica di Spin (ESR) al rivelamento
dell’avvenuto irraggiamento della matrice carne di pollame.
MATERIALI E METODI
Per lo studio della sensibilità in vitro a raggi-x sono state utilizzate
brodo-colture in TSB di S.Typhimurium ATCC14018 e di ceppi
di campo di S.Typhimurium e S.Senftenberg, a concentrazione
di 104-105 UFC/ml. Per le prove su carne di pollo, il campione è
stato preparato contaminando 25g di carne di pollo macinata,
esente da Salmonella spp. con 1 ml di una brodo-coltura di
Salmonella spp., distribuita omogeneamente nel campione, in
modo da ottenere una carica di circa 104 UFC/g. Per ciascuna
prova si procedeva ad irraggiamento della brodo coltura (15ml)
o del campione di carne contaminato (25g), e subito dopo
alla determinazione della carica batterica su brodo-colture o
campioni, irraggiati e non irraggiati (controllo); tutte le prove
erano effettuate in triplo. Si sono utilizzate dosi di irraggiamento
di 0,5 kGy e 0,1 kGy. L’irraggiamento dei campioni è stato
eseguito con irraggiatore a raggi-x Rad Source Inc. RS-2400
(150 kV,45 mA) preceduto dalla caratterizzazione dosimetrica
dell’irraggiatore: per il sistema dosimetrico scelto, costituito
da pellet ad alanina e spettrometro ESR (4), si è proceduto a
determinare la curva di
taratura in dose. Non essendo disponibili in commercio set
di riferimento (pellet) per raggi-x, è stato necessario valutare
il fattore di correzione rispetto ai dosimetri dello stesso tipo,
ma tarati con sorgente a C0-60, si è poi caratterizzata la
distribuzione della dose all’interno delle due tipologie di porta
campioni usate. Per determinare le cariche batteriche, si è
utilizzato il metodo mini-MRSV MPN (3), calcolando il numero
MPN mediante software “MPN calculator” disponibile on line
http:/www.wiwiss.fuberlin.de/institute/iso/mitarbeiter/wilrich/
index.html. Preventivamente sono stati determinati la
deviazione standard di ripetibilità e la sua capacità di
recupero rispetto al metodo di conta in piastra per inclusione,
utilizzando TSA, sia partendo da brodo colture non irraggiate
che irraggiate. Il confronto fra i due metodi è stato effettuato
applicando analisi di regressione lineare (eq.1°grado). Inoltre
per 20 prove, si è valutato il comportamento dei batteri rimasti
vitali: su brodo colture irraggiate e conservate a 5±3°C, è stata
determinata la carica di Salmonella spp. in triplo ad intervalli
di 7±1 giorni. Contestualmente è stata verificata la validità del
metodo fisico di conferma (ESR), per evidenziare l’avvenuto
trattamento radiante su carne di tacchino. Per calcolare la dose
D10 si è proceduto, dopo trasformazione logaritmica dei dati,
alla determinazione per ogni prova della riduzione di carica
microbica dovuta all’irraggiamento, (Log(N/N0)=LogN-LogN0
con N=carica dopo irraggiamento N0=carica iniziale); si è poi
applicata l’analisi di regressione (eq.1°grado) confrontando le
riduzioni di carica in funzione della dose di raggi-x.
La dose D10 è stata calcolata come il reciproco dell’inverso
del coefficiente angolare (b) ottenuto con l’equazione di
regressione (D10=- 1/b) (8). Per le elaborazioni statistiche sono
stati utilizzati i programmi Excell e Analyse-it. Il confronto fra
rette di regressione è stato effettuato con tests di parallelismo.
Le curve di riduzione di carica in funzione della dose sono state
costruite anche utilizzando il programma DMFIT (1).
Le radiazioni ionizzanti, ed in particolare i raggi-x, si stanno
diffondendo nei paesi emergenti, Cina in testa (5), mentre in
Europa rimangono valide le disposizioni delle Direttive 2/99 e
3/99, anche se le Scientific Opinion sulla sicurezza e i rischi
microbiologici e sui rischi chimici e lo Statment del 2011
sembrano aprire la strada ad una legislazione più permissiva.
In particolare la tecnologia a raggi-x è destinata ad ampia
diffusione, grazie alle nuove tecnologie disponibili (9,6,7).
In tale ottica i risultati ottenuti con questo studio, per quanto
parziali e bisognosi di ulteriori approfondimenti, possono essere
contributo valido alle conoscenze sull’argomento. Lo studio
di caratterizzazione dosimetrica ha consentito di estendere il
campo di utilizzo dei dosimetri ad alanina agli irraggiatori a raggi
x a bassa energia, in linea con quanto riportato in letteratura
281
(4): in assenza di sistemi di riferimento tarati con raggi-x è stato
determinato il fattore di correzione da applicare
Grafico 2
Prove su carne ceppo S.Senftemberg
1
Grafico 1 – Curve di taratura irraggiate a diverse qualità di
energia (Co-60 e RX)
Lin ear fit (-0.1835
0,5
-3.294x)
95% CI
R² = 0, 79
0
D10=0,304
Log(N/N0)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
dose KGy
(F=1,4), utilizzando come riferimento dosimetri ad alanina
tarati contro radiazioni a sorgente a C0-60 (Graf.1). Il metodo
ERS applicato alle carni di tacchino (Fig.1) è risultato in
grado di rilevare trattamenti ionizzanti anche a basse dosi
(LOQ=0,5 kGy) e di essere “robusto” (variazioni<2).
Figura 1 – Spettro ESR di un dosimetro irraggiato a 0,5 kGy
Ampiezza picco-picco
Tali risultati sono probabilmente da correlare alla maggior
capacità di recupero del metodo mini-MRSV MPN e al tipo di
radiazioni utilizzate. Anche Jeong (9), ritiene che i valori di D10,
da lui ottenuti in studi con raggi-x su E.coli O157:H7 e risultati
3.4 volte più bassi rispetto ad altri studi, debbano ascriversi alla
diversa fonte di radiazioni. Al contrario altri studi, condotti con
raggi-x (6,7) riportano D10 per S.Enteritidis e S.Typhimurium, più
alti di quelli da noi ottenuti. I controlli su brodo-colture irraggiate
indicano una riduzione della carica microbica a partire dal
7°giorno di conservazione a 5±°C.
Science 83, 320-327.
3.Fravalo P., Hascoet Y., Le Fellic M., Quegumer S.,
Petton J. and Salvat G., 2003.Convenient method for
rapid and quantitative assessment of Salmonella enterica
contamination: the mini-MSRV MPN technique. J. of Rapid
Methods and Automation in Microbiology 11,81-88.
4.Hayes R. B., Haskell E. H., Wieser A., Romanyukha
A. A., Hardy B. L., Barrus J. K., 2000. Assessment of an
alanine EPR dosimetry technique with enhanced precision
and accuracy. Nuclear Instrument and methods in Physics
Research A 440, 453-461.
5.Kume T., Futura M., Todoriki S., Uenoyama N., Kobayashi
Y., 2009. Status of food irradiation in the world. Radiation
Physics and Chemistry 78, 222-226.
6.Mahmoud B. S.M. 2010b. Effect of X-ray radiation
on Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes,
Salmonella enterica and Shigella flexneri inoculated on
shredded iceberg lettuce. Food Microbiology 27, 109-114.
7.Moosekian S. R., Jeong S., Marks B. P., Ryser E. T.,
Grafico 3
6
SFMC
(Carne,MPN, S.Senfenberg )
5
4
3
Il metodo mini-MSRV MPN, pur mostrando una precisione
minore rispetto al metodo di conta in piastra (deviazione
standard di ripetibilità 0,43 contro 0,16 per il metodo conta
in piastra) è risultato di pratico utilizzo, soprattutto quando
utilizzato su campioni di carne, permettendo la differenziazione
fra Salmonella spp. e batteri contaminanti. Inoltre il suo
recupero, decisamente migliore (40%) rispetto al metodo
di conta in piastra, permette di svelare cariche microbiche
più basse e microrganismi danneggiati, incapaci di crescere
su terreni solidi. Riguardo ai risultati ottenuti nelle prove di
irraggiamento (vedi tab.1, graf.2, graf.3) i D10 ottenuti su brodocolture risultano inferiori rispetto a quelli riscontrati da altri
autori (8). Anche i D10 ottenuti su carne, significativamente più
alti di quelli ottenuti su brodo-colture, rimangono più bassi di
quelli riscontrati in letteratura (2).
Tabella 1 – I valori di D10 contrassegnati con lettere maiuscole
diverse sono statisticamente differenti (P>0,95)
Matrice/Sierotipo
Brodocolture
S.Typhimurium ATCC14018
Brodocolture/ceppi
S.Senftenberg
Brodocolture/ceppi
S.Typhimurium
Carne
S.Typhimurium ATCC14018
Carne
S.Senftenberg /2672
Carne
S.Typhimurium/4477
D10
IC95%
R2
n.prove
(in triplo)
0,12 A
0,111
0,123 0,99
11
0,2
0,16
0,268
0,8
10
0,14 A
0,113 0,167 0,79
16
0,24 C
0,181 0,345 0,84
12
0,3
C
0,223 0,479 0,79
12
0,22 C
0,181 0,285 0,91
12
B
logc
Log MPN 2
Fit 1
1
0
0
0,2
0,4
0,6
dose KGy
Stando ai nostri risultati, per la riduzione di 5 Log di Salmonella,
parametro di rifermento per l’efficacia dei trattamenti di
sanificazione, sarebbe sufficiente l’applicazione di una dose
di 1,5 kGy, di gran lunga inferiore a quella applicata per la
decontaminazione di pollame (5-7 kGy). Benchè sia chiaro che
le dosi da impiegare a livello industriale debbano tener conto di
molti altri fattori, ci sembra ci siano margini per una riduzione
della dose di irraggiamento da utilizzare nella pratica, come
indicato anche nella già citata Scientific Opinion dell’EFSA.
Sicuramente dovranno essere approfonditi gli studi su matrice
carnea continuando ad utilizzare le basse dosi da noi utilizzate
nel presente studio, insieme a dosi più alte per confermare i
valori di D10 da noi ottenuti, e soprattutto valutare se l’ipotesi di
una riduzione proporzionale delle cariche di Salmonella spp.
all’aumentare delle dosi di irraggiamento sia effettivamente
applicabile.
BIBLIOGRAFIA
1.Baranyi, J. e Roberts, T.A.,1994. A dynamic approach to
predicting bacterial growth in food. Int. J. Food Microbiol.
23, 277-294.
2.Cabeza M.C., de la Hoz L., Velasco R., Cambero M.I.,
Ordonez J.A.,2009. Safety and quality of ready-to-eat dry
fermented sausages subjected to E-bean radiation. Meat
282
283
2012. X-ray irradiation as a microbial intervention strategy
for food. Annu Rev Food Sci Technology 3, 493-510.
8.Sherry A. E., Patterson M.F. and Madden R.H., 2004.
Comparison of 40 Salmonella enterica serovars injured by
thermal, high-pressure and irradiation stress. Journal of
Applied Microbiology, 96, 887–893.
9.Jeong S., Marks B. P., Moosekian S. R., 2010. Inactivation
of Escherichia coli O157H7 on lettuce, using low-energy
X-ray irradiation. Journal of Food Protection 73, 547-551.
10.Wieser A., Girzikowsky R., 1996. A Unique Calibration
Curve for Alanine EPR Dosimetry System. Appl. Radiat.
Isot. No. 11/12, 1269-1275.
Ringraziamenti: si ringraziano per la preziosa
collaborazione i Sig. Di Donna A., D’attoli L., Faleo S.,
Selicato P.,Giunta R., Mantuano A., Rignanese L.
Ricerca svolta con fondi RC Ministero della Salute IZSPB 02/09
SORVEGLIANZA PER EMOPLASMI FELINI IN SUD ITALIA 2007-2011
Greco G.1, Ventrella G.1, Lorusso E.1,
Decaro N. 1, Martella V.1, Valentini L. 2, Buonavoglia C. 1
Dipartimento di Medicina Veterinaria, Valenzano, Università di Bari;
2
Dipartimento dell’emergenza e dei trapianti di organi, Bari, Università di Bari
1
Key words: micoplasmi emotropici, anemia felina, Mycoplasma haemofelis (Mhf), Candidatus Mycoplasma haemominutum
(CMhm) e Candidatus Mycoplasma turicensis (CMt), Italia
SUMMARY
The prevalence of feline haemoplasma infections in blood samples collected from cats in southern Italy between 2007 and
2011 was evaluated. A convenience-sample of 314 cats (136
healthy; 178 non-healthy;) was screened by polymerase chain
reaction using several sets of primers. The overall prevalence
of Haemoplasma infections was 18,0% in the samples collection examined in this study. The prevalence was 9,5% for ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’, 6,5% for Mycoplasma
haemofelis and 2% for ‘Candidatus Mycoplasma turicensis’.
Interestingly, the prevalence was significantly higher in symptomatic (28%) rather than in healthy animals (6%). Also, freeranging male individuals older than 2 years were more exposed
to risks of infection by these pathogens. These findings indicate
that haemoplasma infections are common in Italy.
INTRODUZIONE
Con il nome comune di emoplasmi felini si fa riferimento a tre
specie di batteri, Mycoplasma haemofelis (Mhf), Candidatus
Mycoplasma haemominutum (CMhm) e Candidatus Mycoplasma turicensis (CMt), recentemente incluse nel genere Mycoplasma, che si caratterizzano per la proprietà di parassitare i
globuli rossi dell’ospite.
Tra gli emoplasmi, Mhf è considerato patogeno primario, capace di causare anemia emolitica grave, talvolta leucopenia e
trombocitopenia, e ittero. Questa specie a pieno titolo è considerata l’agente dell’anemia infettiva felina, mentre le altre specie, cMhm e cMt, sono considerate patogeni opportunisti (5).
L’infezione da emoplasmi è cosmopolita (4,5). Studi epidemiologici sono stati condotti anche in Italia settentrionale dove è
stata osservata una prevalenza del 5,9% per Mhf, del 17,3%
per CMhm, e pari a 1,3% per CMt (1). Nel Sud Italia non sono
note informazioni ufficiali sull’argomento. Il presente studio ha
lo scopo di documentare l’infezione da emoplasmi nella popolazione felina di Puglia.
MATERIALI E METODI
Tra il 2007 e il 2011 sono stati collezionati 314 campioni ematici. I campioni provenivano in parte da gatti di proprietà condotti
in ambulatori veterinari, da gatti sia di proprietà e sia stanziali (di quartiere / cortile) afferiti all’Ospedale Veterinario della
ex-Facoltà di Medicina Veterinaria di Bari, Sezione di Clinica
Ostetrica, al fine di essere sottoposti a sterilizzazione. Nello
studio sono stati inclusi, inoltre, campioni prelevati da animali
con patologie che richiedevano un diagnostico differenziale nei
confronti dei principali agenti di anemia e malattie sistemiche di
natura virale e batterica afferiti alla sezione di Malattie Infettive
del Dipartimento di Medicina Veterinaria.
Contestualmente al prelievo ematico, per ogni gatto sono stati annotati i dati relativi al segnalamento (età, razza, sesso) e
alla provenienza, i dati anamnestici (ambiente, coabitazione,
protocolli vaccinali) e i rilievi clinici (stato di salute, segni clinici
particolari).
Dei 314 animali oggetto dello studio, 159 erano femmine e 155
maschi. L’età è stata registrata per tutti i soggetti sottoposti a
campionamento: 144 gatti erano di età compresa tra 0.6 e 1
anno (a), 120 di età compresa tra 2 e 3 anni (b), 21 di età compresa tra 4 e 6 anni (c), 29 di età compresa tra 7 e 9 anni (d).
Sulla base dello stato di salute rilevato al momento del prelievo,
136 gatti sono stati classificati come sani (H) e, pertanto considerati gruppo di controllo, e 178 come affetti da patologie diverse (U). Nel dettaglio sono stati osservati sintomi quali: gengiviti
e stomatiti, disoressia, dimagrimento, anemia, linfadenopatia
e ittero.
Dall’analisi dello stile di vita è emerso che, dei 220 gatti di
proprietà, 76 vivevano in casa (indoor - I) di cui 41 gatti non
coabitanti con nessun altra tipologia di animale. I restanti 144
gatti di proprietà (mix - M) avevano la possibilità di accedere
all’esterno; 94 gatti, per la maggior parte afferiti alla sezione di
Clinica Ostetrica ai fini della sterilizzazione, erano gatti stanziali
(outdoor - O).
Tutti i 314 campioni sono stati esaminati per la ricerca e l’identificazione dei tre emoplasmi felini Mhf, CMhm e CMt, mediante
l’impiego di metodiche di biologia molecolare. Dai campioni di
sangue si è proceduto ad estrarre il DNA utilizzando il kit commerciale QIAmp DNA Blood Mini Kit, Qiagen, USA.
Per la ricerca di Mhf e CMhm è stata utilizzata una PCR one
step basata sulla amplificazione della sequenza nucleotidica
del gene 16S dell’RNA ribosomiale secondo quanto già riportato (6).
Una seconda PCR è stata utilizzata per la ricerca e la identificazione di CMt (3).
Lo stato di batteriemia rilevato nella popolazione oggetto di studio è stato confrontato con i fattori di rischio quali età, sesso,
stile di vita e stato di salute degli animali al momento della visita.
I dati sono stati inseriti in un database Excel (Microsoft Windows versione 2007). Le differenze tra le proporzioni sono state
determinate utilizzando il Test del chi-quadro, mentre i fattori di rischio, ove possibile, sono stati analizzati con il calcolo
dell’Odds Ratio con intervallo di confidenza al 95%. È stato
considerato significativo un p-value minore di 0.05.
La PCR condotta per la ricerca di Mhf e CMhm ha prodotto
amplificati delle dimensioni attese di 273 bp/202 bp specifici,
rispettivamente, per Mhf e CMhm in 52 (16.6%) campioni su
un totale di 314. Nel dettaglio 22 sono stati identificati come
infetti da Mhf, e 34 campioni sono stati identificati come infetti
da CMhm. In aggiunta, 4 campioni sono risultati coinfetti da
Mhf e CMhm (grafico 1).
La PCR condotta per la ricerca di CMt ha prodotto un ampli-
284
ficato delle dimensioni attese di 136 bp in 6 (2,3 %) campioni
sul totale di 314. Nel dettaglio 5 campioni sono stati identificati
come infetti da CMt mentre un campione è risultato contemporaneamente infetto anche da Mhf e CMhm (Grafico 1).
Questo è il primo studio che descrive la presenza e la prevalenza dell’infezione da Mhf, cMhm e cMt, nella popolazione felina
di Puglia e, parzialmente, Basilicata. Il 18% dei gatti è risultato
batteriemico a causa dell’infezione sostenuta da cMhm (9,5%
della popolazione), da Mhf (6,5%) e da cMt (2%).
Lo studio ha rilevato un’associazione significativa tra lo stato di
batteriemia e l’età degli animali. Dall’analisi del chi-quadro (χ2=
4,7, p = 0.02) è emerso che i gatti di età superiore ad un anno
hanno una probabilità 4,7 volte maggiore rispetto agli animali
di età inferiore di essere infetti da emoplasmi. Il dato è in linea
con quanto emerso da studi precedenti condotti in Giappone e
Stati Uniti (4,5).
Anche l’associazione tra lo stato di infezione e il sesso degli
animali è risultata molto significativa (χ2= 7.5, p= 0.006). Dall’analisi dell’Odds Ratio (OR = 2.40; IC95% = [1.3-4.4]) è emerso
che i gatti maschi hanno un rischio da 1,4 fino a 4,4 volte maggiore rispetto alle gatte di contrarre l’infezione.
Il dato è in accordo con i segni riportati in precedenza (4,5).
L’associazione tra lo stato di infezione e lo stile di vita “outdoor” è risultata significativa (χ2= 12.4, p = 0.0004). Dall’analisi
dell’Odds Ratio (OR = 7.1; IC95% = [2.16-23.56]) appare evidente che i gatti che hanno uno stile di vita libero contro quelli a
vita unicamente indoor hanno un rischio maggiore di 7 volte di
contrarre l’infezione, in accordo con quanto emerso da studi
condotti in Giappone, Irlanda, Canada e Regno Unito (2,4,5).
L’associazione tra lo stato di infezione e lo stato clinico è risultata significativa (chi-quadro = 23,1, p=1,51458E-06; OR =
6.1; IC95% = [2.8-13.4]). Quindi, nella popolazione felina pugliese l’infezione è risultata associata a malattia. Infatti, nel gruppo
di controllo solo il 6% è risultato batteriemico contro il 28% dei
gatti sintomatici, in accordo con quanto osservato in USA (4).
In conclusione, l’anemia è un problema comunemente riconosciuto nel gatto e può essere sospettata quando un gatto
presenta letargia, disidratazione, pelo opaco, riduzione dell’appetito e mucose pallide.
Sebbene tra i determinanti di anemia per il gatto vi siano cause tossiche, mediche e metaboliche, anche le malattie infettive
possono spesso esserne la causa. La presenza di emoplasmi
nel 18% della popolazione felina pugliese con punte del 28 %
nei gatti sintomatici, supporta il potenziale patogeno di questi
agenti e sottolinea la necessità di includere la diagnosi di emoplasmi nell’algoritmo diagnostico delle anemie feline in Puglia.
6-Tanahara M, Miyamoto S, Nishio T, Yoshii Y, Sakuma M, Sakata Y, et al. An epidemiological survey of feline hemoplasma
infection in Japan. J Vet Med Sci. 2010; 72 (12): 1575 – 81.
7-Watanabe M, Hisasue M, Souma T, Yamada T e Tsuchiya R.
Molecular detection of Mycoplasma haemofelis and ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’. Infection in cats by PCR using whole blood without DNA extraction. J. Vet. Med. Sc. , 2008;
vol. 70(10): 1095 – 1099.
8-Willi B, Boretti FS, Meli ML, Bernasconi MV, Casati S, Hegglin D, et al. Real-time PCR investigation of potential vectors,
reservoirs and shedding patterns of feline hemotropic mycoplasmas. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73: 3798 – 802.
Grafico 1. Prevalenza delle diverse specie di emoplasmi
nella popolazione infetta.
Legenda: le aree di sovrapposizione corrispondono alle coinfezioni.
BIBLIOGRAFIA
1-Gentilini F, Novacco M, Turba ME, Willi B, Bacci ML, Hofmann-Lehmann R. Use of combined conventional and realtime PCR to determine the epidemiology of feline haemoplasma infections in northern Italy. J. Feline. Med. Surg. 2009; 11:
277 – 85.
2-Juvet F, Lappin MR, Brennan S, Mooney CT. Prevalence of
selected infectious agents in cats in Ireland. J. Feline. Med.
Surg. 2010; 12 (6) 476 – 82.
3-Peters IR, Helps CR, Willi B, Hofmann-Lehmann R, 4-4-Tasker S. The prevalence of three species of feline haemoplasmas
in samples submitted to a diagnostics service as determined by
three novel real-time duplex PCR assays, Vet. Microbiol. 2008;
1; 126 (1-3): 142 – 50.
5-Sykes JE. Feline hemotropic mycoplasma., J. Vet. Emerg.
Crit. Care (San Antonio). 2010; 20 (1): 62 – 9.
285
2%
5%
VALUTAZIONE DELL’INTERFERENZA DELLA SINDROME ENTEROPATICA SULLA
QUALITA’ DELLE CARCASSE SUINE AL MACELLO
Grindatto A.1, Careddu M.E. 1, Burzio G.2, Tron S. 2, Gambino F.3, Apicella M. 3, Varello K.4, Meistro S. 4,
Monnier M.5, Goria M.5, Decastelli L. 6, Ru G.7
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta – Sezione di Cuneo;
2
ASL TO3;
3
ASL CN1;
4
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta – Istopatologia;
5
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta – Biotecnologie;
6
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta –Controllo alimenti;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta- Biostatistica, epidemiologia e analisi del rischio
1
7
Keywords: heavy swine, carcass quality, entheropathy
SUMMARY
Salmonella spp, Brachyspira hyodienteriae, Brachyspira
pilosicoli and Lawsonia intracellularis are relevant pathogens
for heavy pig breeding. They can cause both clinical and subclinical forms that result in decrease of daily weight gain and
feed conversion rate and, consistently, in delay of production
cycle. Longer cycles imply higher production costs due to
veterinary, feed and management expenses. Aim of this work
is to assess the diffusion of these pathogens and their impact
on carcass quality.
INTRODUZIONE
Le patologie enteriche, tra cui le infezioni da Salmonella
spp, Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodisenteriae e
Brachyspira pilosicoli, sono un problema fondamentale per
l’allevamento del suino pesante poiché, riducendo l’incremento
ponderale giornaliero e l’indice di conversione dell’alimento,
determinano non solo un aumento delle spese veterinarie, ma
anche l’incremento dei costi legati alla gestione degli animali.
Le patologie enteriche del suino si presentano in forma clinica
(1), o più frequentemente, in forma subclinica, esitando in
una diminuzione delle performances produttive degli animali.
In un contesto caratterizzato dal costante aumento dei costi,
soprattutto di quelli legati all’alimentazione, la massimizzazione
delle rese di ciclo ed il miglioramento qualitativo delle carcasse,
diventano un obiettivo irrinunciabile. Scopo di questo lavoro è
quantificare impatto e rilevanza sulla qualità delle carcassa
delle forme enteriche sub-cliniche determinate da Salmonella
Brachyspira pilosicoli.
MATERIALI E METODI
Campionamento. Il campionamento è stato effettuato in 2
macelli piemontesi che utilizzano il sistema Fat-O-Meater
per la classificazione delle carcasse. Poiché dalla bibliografia
emergono dati eterogenei sulla diffusione di Salmonella
Brachyspira pilosicoli, è stato effettuato un campionamento
multistadio: il primo stadio a livello di partita per svelare la
presenza dell’infezione nella singola azienda; il secondo
a livello di popolazione per stimare la prevalenza degli
allevamenti in cui è presente l’infezione. Per ogni azienda
sono stati campionati 20 animali, numero in grado di rivelare
l’infezione in azienda quando è colpito almeno il 15% dei capi.
Sono state invece campionate 64 aziende per stimare, con un
errore massimo dell’11% la prevalenza nei 500 allevamenti che
riforniscono i macelli . Per ogni animale (1280 suini pesanti)
sono stati prelevati linfonodi ileocecali, feci contenute nel cieco
e nell’ileo e porzioni di ileo e cieco.
Isolamento di Salmonella spp. L’isolamento di Salmonella
spp dai linfonodi ileocecali è stato effettuato secondo l’allegato
D alla norma ISO 6579:2002. La sierotipizzazione degli isolati
è stata effettuata con metodo Kauffmann-White.
Isolamento di Brachyspira spp. L’isolamento di Brachyspira
spp è stato effettuato a partire dalla semina delle feci aderenti
alla mucosa del cieco su SVC (Spectinomicina Vancomicina
Colistina) incubato in anaerobiosi con AnaeroGen (Oxoid, Uk)
per 5/7 giorni a 41°C. Eventuali patine emolitiche sono state
sottoposte a colorazione con safranina. Dopo un secondo
trapianto su SVC, le colonie sospette (spirochete gram
negative) sono state sottoposte a PCR con kit commerciale
(ADIAVET® Brachy, Adiagène SA).
Ricerca di Lawsonia intracellularis. La ricerca di Lawsonia
intracellularis è stata effettuata a partire da feci dell’ileo con
NestedPCR. Dopo l’estrazione del DNA genomico (kit QIAmp
DNA Stool Mini Kit ,Qiagen), è stata effettuata l’amplificazione
del DNA in 2 step, seguita dalla rivelazione del prodotto di
amplificazione (amplicone 319 bp) con elettroforesi su gel di
agarosio.
Analisi statistica. Obiettivo dell’analisi statistica è verificare
il ruolo di alcuni fattori di rischio (infezione da Salmonella
spp. e Lawsonia intracellularis) nel determinare la qualità
(classificazione SEUROP) delle carcasse di ogni partita. Le
variabili valutate sono: dimensione della partita, esiti ricerca
di Lawsonia intracellularis e Salmonella spp e qualità delle
carcasse espressa come proporzione di capi della partita inclusi
in ciascuno dei sei livelli (s,e,u,r,o,p) della classificazione. A ogni
partita sono stati abbinati 2 indici: SEU e QUAL. L’indice SEU
(range 0.06-1.00) è costruito dalla somma delle proporzioni dei
capi appartenenti alle categorie s, e ed u; l’indice QUAL è invece
ottenuto, dopo aver assegnato a ogni livello di qualità uno score
decrescente (s=6, p=1), come media ponderata utilizzando
come pesi i valori della distribuzione delle proporzioni di soggetti
inclusi in ogni categoria. SEU e QUAL sono fortemente correlati
(β=0.48, P=0.000). La diffusione dei due microrganismi è stata
valutata in termini di presenza o assenza di almeno un capo
positivo nella partita. Per descrivere le variabili utilizzate e
per verificare in modo esplorativo le loro relazioni sono stati
prodotti boxplot e diagrammi di dispersione. Le relazioni tra
le variabili dipendenti (SEU e QUAL) e quelle indipendenti
sono state studiate attraverso modelli di regressione lineare.
Le operazioni di verifica, manipolazione e di elaborazione
286
statistica per la produzione di grafici o per la costruzione dei
modelli sono state effettuate con il software statistico dedicato
STATA 11.1.
Esame istopatologico. Sono stati sottoposti ad esame
istologico ileo e colon di 74 suini positivi all’isolamento di
Salmonella spp e/o Brachyspira spp e/o Lawsonia intracellularis.
I campioni sono stati fissati in formalina, processati e inclusi in
paraffina. Le sezioni (4±2 μm), sottoposte alla colorazione con
ematossilina, sono state esaminate al microscopio ottico.
Ricerca di Salmonella spp, Brachyspira spp e Lawsonia
intracellularis. L’84,4%(73,1- 92.2, IC 95%) delle 31 partite
esaminate per Salmonella spp è risultato positivo (almeno
un capo positivo). Sono stati isolati 10 sierotipi diversi tra cui,
con maggiore frequenza, Salmonella Afula (isolato 17 volte)
e Salmonella Eingedi (17), spesso determinanti coinfezione
nello stesso animale (15 casi). E’ stato identificato il sierotipo
Salmonella Typhimurium in una sola azienda (2 capi). Per
quanto riguarda Brachyspira spp, l’esito positivo dell’isolamento
non è stato confermato dalla PCR, pertanto poiché dal solo
fenotipo della colonia non è possibile l’identificazione univoca
di tale microorganismo, si è deciso di non considerarlo nel
prosieguo dell’analisi statistica. Infine, il 26,6%(16,3-39,1,
IC 95%) delle 64 partite sottoposte ad analisi sono risultate
positive per Lawsonia intracellularis. Come in Jacobson et al.
(1) è stata rilevata la compresenza di più patogeni nella stessa
partita.
Analisi statisitica. Sono stati prodotti modelli univariati e
multivariati di regressione lineare usando alternativamente
come variabile dipendente gli indici SEU e QUAL e come
covariante la numerosità di partita e il grado di infezione da
Salmonella spp/Lawsonia intracellularis.
Valutazione dell’associazione con l’indice di qualità delle
carcasse SEU. La dimensione della partita nel modello
univariato risulta avere un β pari a -0.0003 (P=0.294) con una
varianza spiegata dal modello inferiore al 2%. Nel caso della
potenziale associazione con la presenza e grado di infezione
da Salmonella spp .(N=31), il β era pari a 0.006 (P=0.574) e la
varianza all’1.1%. Per Lawsonia intracellularis (N=64), il β era
pari a 0.014 (P=0.481) e la varianza all’0.8%.
Valutazione dell’associazione con l’indice di qualità delle
carcasse QUAL. La dimensione della partita nel modello
univariato risultava avere un β pari a -0.0005 (P=0.318)
con una varianza spiegata dal modello inferiore al 2%. Nel
caso della potenziale associazione con la presenza e grado
di infezione da Salmonella spp. (N=31), il β era pari a 0.01
(P=0.645) e la varianza all’0.7%. Per Lawsonia intracellularis
(N=64), il β era pari a 0.037 (P=0.349)e la varianza all’1.4%.
Per entrambi gli indici i modelli multivariati non identificano
alcun effetto statisticamente significativo.
Esame istopatologico. Tutti i campioni analizzati presentano
lesioni infiammatorie aspecifiche con diverso grado di gravità
prevalentemente a livello dell’ileo. Un solo capo presenta
lesioni tipicamente imputabili a Lawsonia intracellularis
(iperplasia delle cripte con marcata proliferazione di cellule
epiteliali immature, assenza di goblet cells e presenza di cellule
infiammatorie e materiale di desquamazione all’interno). La
presenza di un solo soggetto con lesioni tipiche potrebbe far
ipotizzare che l’infezione da Lawsonia intracellularis, rilevata
dalla PCR, abbia determinato prevalentemente forme di
moderata gravità o comunque in fase iniziale, difficilmente
riscontrabili dalla valutazione istologica.
Pur non avendo evidenziato una relazione tra infezione da
Salmonella spp e Lawsonia intracellularis e la qualità della
carcassa, la nostra indagine ha confermato la diffusione di
questi patogeni sul territorio. Sarebbe quindi auspicabile
procedere ad ulteriori approfondimenti, coinvolgendo un
numero maggiore di aziende, per quantificare gli effetti
di queste patologie sull’allevamento del suino pesante
piemontese. Si potrebbero così individuare soluzioni efficaci
per diminuire i danni arrecati all’allevatore da questi patogeni
e, allo stesso tempo, per promuovere la sicurezza e la qualità
delle produzioni per il consumatore.
BIBLIOGRAFIA
1. Jacobson M, Hardaf Segerstad C, Gunnarsson A,
Fellstrom C, de Verdier Klingerberg K, Wallgren P, JensenWaern M. (2003). Diarrhoea in the growing pig- a comparison
of clinical, morphological and microbial findings between
animals from good and poor performance herds. Research in
Veterinary Science, 74: 163-169
2. Jacobson M, Fellström C, Jensen-Waern
M.(2010).
Porcine proliferative enteropathy: An important disease with
questions remaining to be solved. The Veterinary Journal
184:264-268.
3. Ladinig A, Sommerfeld-Stur I, Weissenbo H.(2009).
Comparative evaluation of diagnostic methods for Lawsonia
intracellularis infection in pigs, with emphasis on cases lacking
characteristic lesions.J. Comp. Path. 140:140-8.
287
ORDINANZA MINISTERIALE 18 DICEMBRE 2008: ATTIVITA’ DI SORVEGLIANZA DELLA
SEZIONE DI CUNEO DELL’IZS DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D’AOSTA
Grindatto A. 1, Pistone G.1, Rutigliano B.1, Lotti R.1, Caracciolo F.1, Fioravanti F.2, Leporati M.3,
Capra P.3, Gili M.2, Biolatti P.G.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta - Sezione di Cuneo
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta – Torino
3
Centro Regionale antidoping “A.Bertinaria” – Orbassano (TO)
Keywords OM 18th December 2008, animal poisoning, bait
SUMMARY
Poisoning of domestic and wild animals is a widespread public
health issue. As a matter of fact the presence of toxic substances
in the environment could result in accidental human ingestion
and environmental contamination. The Ordinanza Ministeriale
18th December 2008 charge the ASL and the IZS net with
official diagnosis of animal poisoning, with detection of toxic
molecules employed and with monitoring of the phenomenon
diffusion. Here follow the results of the surveillance activity of
the Sezione di Cuneo of the Istituto Zooprofilattico Sperimentale
del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta.
INTRODUZIONE
L’uccisione di animali mediante utilizzo di esche e bocconi
avvelenati è un fenomeno diffuso sia in ambito urbano che
extraurbano. Vengono colpiti non solo gli animali domestici
e sinantropi, ma anche le specie selvatiche tra cui quelle a
rischio di estinzione. La presenza di veleni e sostanze tossiche
sul territorio, inoltre, rappresenta un grave rischio anche per
l’uomo ed in particolare per i bambini (1), sia direttamente con
l’ingestione accidentale che indirettamente, nella misura in cui
queste molecole possono contaminare la catena alimentare o
diffondere nelle acque.
Per tutelare gli animali domestici e selvatici, l’uomo e l’ambiente
sono state pertanto redatte l’Ordinanza Ministeriale (OM) del
18 dicembre 2008 (2) e le successive modifiche (OM 19 marzo
2009 (3), OM 14 gennaio 2010 (4), OM 10 febbraio 2012(5))
che stabiliscono alcune norme per l’impiego delle molecole
utilizzate per contrastare gli animali nocivi e per la sorveglianza
dell’uso doloso di sostanze tossiche e veleni.
In particolare, il medico veterinario che sospetti l’avvelenamento
doloso di un animale domestico o selvatico è tenuto a
comunicare il fatto al sindaco e al servizio veterinario della
ASL territorialmente competente. Inoltre, in caso di decesso
dell’animale, l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di
competenza territoriale è tenuto ad effettuare la necroscopia e
le necessarie analisi tossicologiche il cui esito sarà comunicato
entro 30 giorni al medico veterinario autore della segnalazione,
all’ASL e all’autorità giudiziaria.
La rete degli Istituti Zooprofilattici ha infatti il compito di
confermare o escludere il sospetto avvelenamento, identificare
le molecole responsabili e raccogliere ed analizzare i dati
che consentano alle Province ed alle Regioni di redigere
e aggiornare annualmente le mappe epidemiologiche del
fenomeno.
La Struttura Semplice di Patologia e Benessere animale della
Sezione di Cuneo dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del
Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (IZSPLVA) è organizzata
per adempiere alle indicazioni di legge e offrire all’utenza, in
collaborazione con il Centro Regionale Antidoping (CAD),
specifici servizi diagnostici e di indagine tossicologica.
Vengono di seguito riportati i risultati ottenuti dalla sorveglianza
effettuata dal 1 gennaio 2009 al 31 agosto 2013.
MATERIALI E METODI
Gli animali deceduti in seguito a sospetto avvelenamento sono
stati sottoposti ad esame necroscopico e a tutte le indagini
collaterali necessarie ad effettuare una corretta diagnosi
differenziale (esami batteriologici, virologici, istologici). La
ricerca delle sostanze tossiche è stata effettuata su pool di
organi (fegato, rene) e sul contenuto gastrico o del gozzo
quando presente.
Sono inoltre state analizzate le esche raccolte nell’ambiente
su cui è stata direttamente effettuata la ricerca di sostanze
tossiche.
Sulle presunte esche e sui materiali derivanti dall’esame
autoptico vengono eseguiti due screening mediante tecniche
di cromatografia- spettrometria di massa:
- Determinazione mediante GC-MS Full Scan di
Metaldeide, Stricnina, Glicole monoetilenico, pesticidi
organoclorurati,
organofosforati,
carbammati,
piretroidi e relativi agenti sinergizzanti.
- Determinazione mediante LC-MS/MS con ionizzazione
ESI (ioni negativi) di α-cloralosio e di rodentici
anticoagulanti derivati della 4-idrossicumarina e
dell’indandione.
Ove necessaria viene applicata alle matrici da analizzare la
metodica QuEChERS di estrazione/purificazione.
Il grafico in figura 1 illustra la tipologia di campioni analizzati
presso i laboratori della Sezione di Cuneo dell’IZSPLVA e
del dell’U.O. Tossicologia e Ricerca anabolizzanti, con la
collaborazione della S.S. Ricerca Residui. In particolare,
sono stati sottoposti ad analisi 75 animali deceduti in seguito
a sospetto avvelenamento e 14 esche. La specie animale
maggiormente coinvolta risulta essere il cane (48,32%), seguita
dal gatto (21,35%) e dal piccione (10,11%). L’interessamento
degli animali selvatici sembrerebbe marginale, ma il fenomeno
potrebbe essere sottovalutato considerato il minor controllo
attuabile su queste specie.
Il 62,92% (56) dei campioni analizzati è risultato positivo per
almeno una sostanza tossica, mentre sul 30,34% (27) non è
stato possibile individuare alcuna molecola. Per il 6,74% dei casi
non è stato ritenuto opportuno condurre prove tossicologiche
perché l’esame necroscopico e le indagini collaterali hanno
permesso di collegare la morte dell’animale ad altre cause.
In 34 dei 56 campioni positivi è stata isolata una sola sostanza
tossica. Nei restanti casi sono state individuate negli organi
di un solo animale più molecole, anche appartenenti a classi
differenti fino ad un massimo di 4 diverse molecole individuate
nel caso di 2 cani deceduti in seguito ad avvelenamento.
288
L’utilizzo di cocktail di molecole tossiche conferma la natura
dolosa degli avvelenamenti e allo stesso tempo configura un
rischio maggiore per la popolazione umana nella misura in cui
la compresenza di più molecole tossiche potrebbe determinare
una sintomatologia più e più grave difficile da interpretare per
il medico.
Le sostanze tossiche più utilizzate (figura 2) sono risultati
essere i rodentici anticoagulanti di prima,seconda e terza
generazione (71,26%), seguiti dai rodenticidi non anticoagulanti
(a-cloralosio, 16,09%) e dalla metaldeide (9,19%). Marginale
l’utilizzo di organofosforici ed organoclorurati, tra i quali è da
segnalare l’utilizzo (2 casi) dell’Endosulfan molecola messa
al bando in Europa già dal 2005 (6) e a livello mondiale nel
2011 (Convenzione di Stoccolma sugli inquinanti organici
persistenti) in ragione della sua tossicità acuta, della sua
capacità di bioaccumularsi e della sua pericolosità per il
sistema endocrino (7).
I dati raccolti nell’ambito della sorveglianza disposta dall’OM
del 18 dicembre 2008 rivelano la diffusione del fenomeno
degli avvelenamenti a carico degli animali domestici e non sul
territorio della provincia di Cuneo.
In seguito alla rilevazione di molecole tossiche, la pronta
denuncia alle autorità giudiziarie e sanitarie competenti ha
efficacemente contribuito all’organizzazione di un adeguato
sistema di prevenzione. Risulta tuttavia opportuno continuare
ed eventualmente implementare l’attività di sorveglianza per
meglio caratterizzare il rischio connesso alla presenza di veleni
e sostanze tossiche nell’ambiente, al fine di tutelare la salute
degli animali e dell’uomo.
FIGURA 1: Tipo di campione
CANE
GATTO
ESCA
COLOMBO
SELVATICI
ASINO
FIGURA 2: Sostanze tossiche utilizzate
BIBLIOGRAFIA
1. Watt B.E., Proudfoot A.T., Bradberry S.M., Vale J.A. (2005).
Anticoagulant rodenticides. Toxicol Rev ; 24(4): 259-269
2. OM 18 dicembre 2008
3. OM 19 marzo 2009
4. OM 14 gennaio 2010
5. OM 10 febbraio 2012
6. Decisione della Commissione Europea 2005/864
7. Mrema E.J., Rubino F.M., Brambilla G., Moretto
A., Tsatsakis A.M., Colosso C. (2013). Persistent
organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.
Toxicology 307: 74-88
289
Rodenti ci di non
anti coagul anti
Rodenti ci di
anti coagul anti
Or ganof osf or i ci
Metal dei de
Or ganocl or ur ati
VALIDAZIONE DEL PROCESSO PRODUTTIVO DI UN SALAME ITALIANO TRADIZIONALE.
CONTROLLO DI SALMONELLA
Grisenti M. S., Frustoli M. A., Passera E., Dondi S., Barbuti S.
SSICA - Stazione Sperimentale per l’Industria delle Conserve Alimentari – Azienda Speciale CCIAA – Parma
Key words: Salmonella, Italian salami, Process validation
Abstract
A validation study was performed on the manufacturing process
of Italian salami, produced with and without starter cultures, in
order to assess its efficiency in inactivating Salmonella. Sausage dough was divided in two batches; only the first batch was
inoculated with a starter culture. Of the each batch was subsequently divided into three parts: one inoculated with a mix of
Salmonella and the other two non-inoculated and used as control. Of the latter one was ripened at SSICA and one at a plant.
At fixed times, microbiological and physico-chemical analyses
were performed. On the inoculated salami, Salmonella were
evaluated by direct counting on selective media. No growth was
observed for the pathogen investigated and in addition, after 60
days’ ripening, 3.2 Log cfu/g and 2.6 Log cfu/g reductions were
observed in salami with or without starter respectively. These reductions, associated with a constant control of fresh meat, might
give sufficient guarantees of safety in the finished product.
Introduzione
I prodotti carnei fermentati sono generalmente considerati prodotti a basso rischio, ma la sopravvivenza di microrganismi patogeni non può essere esclusa. Alcuni casi eclatanti registrati
negli ultimi anni continuano a porre l’accento sul possibile collegamento tra salami tradizionali ed insorgenza di tossinfezioni
(3). In particolare grande attenzione è stata rivolta alla possibile
sopravvivenza di Salmonella in salami stagionati (2).
Il “Gentile” è un salame tradizionale italiano ottenuto da un’antica ricetta con l’impasto di carni suine fresche, condite con sale,
aromi naturali e conservanti (E 252-E 250). Il salame, del peso
fresco di circa 1-1,5 kg, viene sottoposto ad asciugatura e stagionatura a 12-15°C per un minimo di 30 giorni. Alla fine della
stagionatura (con un calo peso minimo del 30%) si ottiene un
prodotto irregolarmente affusolato, con diametro di 6-7 cm. In
linea con le esigenze di sicurezza e qualità igienica, con i livelli
di riduzione standard per i patogeni pubblicati dalle agenzie internazionali e i limiti previsti nei Regolamenti EU 2073/2005 e
852/2005, lo scopo di questo lavoro è stato quello di caratterizzare e validare il processo produttivo di salami tradizionali, prodotti con e senza l’impiego di starter, per verificarne l’efficacia
a inattivare microrganismi patogeni quali Salmonella mediante
“Microbial Challenge Testing” di processo.
Materiali e Metodi
Lo studio è stato condotto in collaborazione con un’azienda del
settore, su salami tipo Gentile. L’impasto è stato preparato secondo la ricetta tradizionale (magro suino 72%, grasso suino
25%, sale 3,4%, zucchero 0,10%, pepe 0,05%, aglio 0,015% e
potassio nitrato120 ppm) ed è stato suddiviso in due aliquote,
una (60 Kg) utilizzata tal quale, e l’altra (60 Kg) addizionata con
uno starter tecnologico (Staphylococcus xylosus e Lactobacillus
plantarum). Un terzo di entrambe le aliquote è stato insaccato
presso l’azienda (controlli aziendali AZ), gli impasti rimasti sono
stati inviati refrigerati alla SSICA e, nella stessa giornata di lavo-
razione, ulteriormente suddivisi in due aliquote da 20 kg ciascuna. Una parte è stata insaccata tal quale (controllo SSICA), ed
i restanti 20 Kg sono stati inoculati (105 ufc/g) con una miscela
composta da tre ceppi di Salmonella: S. Manhattan rif. 180073 e
S. enterica subsp. enterica rif. 49769 (collezione IZSLER di Parma) e S. Typhimurium ATCC14028. I salami appartenenti alle
diverse aliquote sono stati sottoposti ad asciugamento, stufatura e stagionatura presso la SSICA così come presso l’AZ utilizzando gli stessi parametri tecnologici. In totale per ogni tipologia
di salame (con e senza starter) sono stati ricavati 40 salami di
controllo e 22 salami contaminati con la miscela di Salmonella.
Per ogni tipologia di salame, sono stati prelevati ai tempi prestabiliti di 0, 4, 11, 20, 40, e 64 giorni di stagionatura quattro salami
di controllo (2 SSICA e 2 AZ) che sono stati sottoposti ad analisi chimico-fisiche e microbiologiche. Ad ogni tempo sono stati
inoltre prelevati 3 salami inoculati per il conteggio di Salmonella
e di batteri lattici. Sui controlli sono state eseguite le seguenti
analisi microbiologiche: Carica microbica aerobi, Batteri lattici,
Stafilococchi coagulasi negativi SCN, Stafilococchi coagulasi
positivi SCP, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Salmonella.
Sugli stessi campioni si sono eseguite misure di pH e di attività
dell’acqua (aw); sui salami in corso di stagionatura è stato rilevato il calo peso.
L’evoluzione dei parametri chimico-fisici, ha dimostrato una
buona sovrapponibilità delle produzioni ottenute nei due differenti ambienti di lavorazione (SSICA e AZ). Il valore di pH misurato negli impasti è risultato mediamente di 5,9 ed ha raggiunto
un valore minimo di 5,2 dopo 5 giorni nei salami prodotti con
starter e dopo 10 giorni in quelli senza starter, per poi risalire
progressivamente nel corso della maturazione fino ad assestarsi su valori compresi tra 5,5 (SSICA) e 5,6 (AZ). La diminuzione dell’aw nei salami di controllo SSICA è risultata, nei primi
20 giorni di osservazione, in linea con i valori registrati per la
produzione AZ, scadenza alla quale è stato registrato un valore
di 0,93 rispetto allo 0,96 dell’impasto iniziale. I dati relativi alle
scadenze successive mostrano una disidratazione leggermente
maggiore per i salami stagionati in SSICA che hanno raggiunto,
al quarantesimo giorno, valori di 0,88 rispetto allo 0,90 osservato in AZ e, al sessantesimo, valori di 0,83 rispetto allo 0,85 della
produzione AZ. Il calo peso % registrato per i salami AZ e SSICA ha avuto un andamento analogo nel corso di tutto il periodo
di osservazione. A 10 giorni dall’inizio della lavorazione è stato
registrato un calo del 22%. A venti giorni il calo era mediamente
del 27% fino a raggiungere il 35% al trentesimo giorno e il 38%
al quarantesimo che rappresenta il tempo ottimale di commercializzazione. Le determinazioni eseguite a 50 e 60 giorni hanno
riguardato esclusivamente salami SSICA, per i quali la stagionatura è stata prolungata di 20 giorni con un calo peso finale
del 43%. L’andamento dei principali gruppi microbici (media di 4
determinazioni ± dev. st.) registrato nel corso della stagionatura
dei salami prodotti con e senza l’aggiunta di colture starter è
290
riportato rispettivamente nelle Tabelle 1 e 2.
Produzione con starter - I salami, analizzati al momento
dell’insacco, presentavano una CMA di 6,40 Log ufc/g costituita
da batteri lattici e SCN, rappresentativi della coltura starter che
è stata addizionata all’impasto. Gli enterobatteri erano presenti
ad un livello medio di circa 3 Log ufc/g. Salmonella spp. è risultata assente. L’evoluzione dei batteri lattici nel corso della stagionatura ha fatto registrare un aumento progressivo nei primi
4 giorni, in coincidenza con il raggiungimento del minimo di pH,
scadenza alla quale hanno raggiunto una concentrazione pari
a 8,8 Log ufc/g. Il livello è rimasto pressoché invariato durante tutte le fasi successive della stagionatura. Gli SCN si sono
mantenuti, nel corso di tutto il periodo di maturazione, sui livelli
di circa 6 Log ufc/g inizialmente riscontrati. Gli enterococchi ad
ogni scadenza sono risultati presenti ad un livello di circa 2 Log
ufc/g. Gli enterobatteri hanno subito invece una diminuzione
progressiva, fino a raggiungere, a partire dal ventesimo giorno,
livelli inferiori al limite analitico.
Tab.1 Analisi microbiologiche eseguite sui salami con starter.
Valori espressi come Log ufc/g.
Giorni di
Analisi microbiologiche
stagionatura
Batteri lattici
SCN
Enterobatteri
0
6,27 ± 0,08
6,27 ± 0,06
3,02 ± 0,06
4
8,96 ± 0,11
6,11 ± 0,16
1,82 ± 0,24
11
8,61 ± 0,22
5,90 ± 0,17
1,22 ± 0,45
20
8,55 ± 0,42
5,87 ± 0,39
0,70 ± 0,00
40
9,08 ± 0,15
5,20 ± 0,59
0,70 ± 0,00
64
8,07 ± 0,16
5,47 ± 1,03
0,70 ± 0,00
Salmonella in salame gentile prodotto con e senza starter
L’inoculo iniziale di Salmonella è risultato di 5,21 ± 0,07 Log
ufc/g nell’impasto con starter e di 5,18 ± 0,09 Log ufc/g in quello
senza starter. In entrambe le produzioni, durante i 60 giorni di
osservazione non si è registrato alcun accrescimento del patogeno. La concentrazione di Salmonella è progressivamente
diminuita facendo registrare al ventesimo giorno, una riduzione
di circa 1 Log nella produzione con starter, ed una riduzione di
0,82 in quella senza starter. La discesa è stata, per entrambe
le linee di produzione, progressiva e lineare nel corso di tutto il
processo produttivo. Al quarantesimo giorno, in corrispondenza
di un calo peso del 37,5%, le riduzioni decimali osservate sono
state, in entrambe le tipologie di salame, pari ad 1,5 Log ufc/g.
Al termine della stagionatura (sessantesimo giorno), in corrispondenza di un calo peso del 43%, sono stati registrati valori
medi per Salmonella di 1,97 ± 0,15 Log ufc/g nei salami con
starter e di 2,59 ± 0,45 Log ufc/g nei salami senza starter, corrispondenti rispettivamente a 3,2 e 2,6 riduzioni decimali a prova
del fatto che, come affermato anche da altri autori (1), l’utilizzo
di colture starter fornisce un maggior livello di sicurezza rispetto
ai prodotti carnei soggetti a fermentazione naturale. In entrambe le produzioni i batteri lattici, pur partendo da concentrazioni
differenti (circa 6 Log ufc/g e circa 4 Log ufc/g) hanno raggiunto
il livello di circa 8,5 Log ufc/g entro i primi 5 giorni di osservazione, a dimostrazione dell’instaurarsi di un corretto processo
di fermentazione in entrambe le linee considerate, livello che si
è mantenuto fino al termine della stagionatura, sia nei salami a
fermentazione naturale, che guidata.
Fig. 1 Andamento di Salmonella in salami prodotti senza (A) e
con (B) starter.
Produzione senza starter - Le analisi eseguite sull’impasto
hanno evidenziato un livello di CMA di circa 5 Log ufc/g prevalentemente costituita da batteri lattici seguiti da SCN ed enterobatteri. Salmonella spp. è risultata assente in 25 g in tutti i
campioni. Nei primi 4 giorni di stagionatura, la CMA ha raggiunto livelli di 8,5 Log ufc/g che ha mantenuto nel corso di tutto
il periodo di maturazione. La principale componente della flora
microbica, a partire dal quarto giorno, era rappresentata dai
batteri lattici che si sono sviluppati fino a valori di 8,37 Log ufc/g
e sono rimasti a tali livelli fino alla fine della stagionatura. Gli
SCN sono progressivamente aumentati fino a raggiungere al
ventesimo giorno 6 Log ufc/g. Gli enterobatteri hanno subito una
diminuzione progressiva nel corso della stagionatura, fino ad arrivare, al termine della stessa, a livelli prossimi al limite analitico.
Tab. 2 Analisi microbiologiche eseguite sui salami senza starter. Valori espressi come Log ufc/g.
Giorni di
stagionatura
Batteri lattici
SCN
Enterobatteri
0
4,30 ± 0,61
3,91 ± 0,43
3,45 ± 0,09
4
8,37 ± 0,44
4,92 ± 0,37
2,79 ±1,41
11
8,51 ± 0,06
5,74 ± 0,42
2,49 ±1,75
20
8,17 ± 0,22
5,88 ± 0,60
1,37 ±1,34
40
8,56 ± 0,40
5,64 ± 0,38
0,70 ± 0,00
64
8,06 ± 0,26
6,04 ± 0,52
0,94 ± 0,48
291
Conclusioni
Il presente lavoro fornisce dati scientifici riguardo l’evoluzione
di Salmonella in salame tipo “Gentile” a fermentazione guidata
e naturale. In entrambe le linee considerate non è stato registrato alcun accrescimento del patogeno ma una progressiva
inattivazione. Anche se il numero di riduzioni decimali ottenute
alla fine del processo produttivo commerciale, indicato mediamente intorno al 40° giorno, non supera 1,5 Log ufc/g, tale dato
potrebbe essere sufficiente a garantire la produzione considerando che la contaminazione naturale della materia prima generalmente non supera le 10 ufc/g. Pertanto, in accordo con i
risultati ottenuti nel presente studio, è stato dimostrato che durante la maturazione di salami tipo “Gentile” le fasi di fermentazione e di stagionatura inducono una significativa inattivazione
di Salmonella. Tali risultati sono stati raggiunti in entrambe le
produzioni sia con che senza starter.
Bibliografia
1. Berry E. D., Liewen M. B., Mandigo W., Hutkins W.,
1990, Inhibition of Listeria monocytogenes by bacteriocin-producing Pediococcus during the manufacture of
fermented semidry sausage, J. Food Protect., 53, 194 – 197.
2. Mataragas M., Skandamis P.N., Drosinos E.H., 2008.
Risk profiles of pork and poultry meat and risk ratings
of various pathogen/product combinations, Int. J. Food
Microbiol., 126, 1 – 12.
3. Scavia G., Ciaravino G., Luzzi I., Lenglet A., Ricci A.,
Barco L., Pavan A., Zaffanella F., Dionisi A. M., 2013,
www.eurosurveillance.org, Euro Surveill., 18.
Ringraziamenti Indagine realizzata nell’ambito del programma
scientifico di CIRAL (Consorzio Italiano per la Ricerca sulla sicurezza e qualità Alimentare) al quale la Stazione Sperimentale
per l’Industria delle Conserve Alimentari aderisce.
STUDIO PRELIMINARE PER L’UTILIZZO DELL’IMMUBLOT COME METODO DI
CONFERMA PER LA RICERCA DI ALLERGENI
Guglielmetti C., Mazza M., Buonincontro G., Fragassi S., Vencia W., Acutis P.L., Decastelli L.
Keywords: allergeni, β-lattoglobulina, western blot
SUMMARY (max 1000 caratteri spazi inclusi)
Food allergy is an adverse health effect arising from a specific
immune response that occurs reproducibly on exposure to a
given food (NIAID). Currently the detection of allergens is
performed by screening methods (ELISA or PCR). In this
work we developed a western blot (WB) protocol to detect
β-lactoglobulin in food, in order to confirm positive samples.
For the development of the WB, we worked on extraction of
β-lactoglobulin and identification of optimal concentrations of
antibodies and solutions. Fresh milk from different species
(cow, sheep, goat, donkey) was analyzed. For the comparison
between species have been set up a parallel SDS-PAGE
and a Native-PAGE. As expected, and as already reported in
literature, the various species have different electrophoretic
pattern.
To check the sensitivity of the primary antibody of bovine milk,
starting from 10 µg of total protein were loaded. The antibody
used in WB was sensitive, recognizing 1 ng of total protein
loaded.
INTRODUZIONE
L’allergia rappresenta una reazione avversa dell’organismo
ad alcuni alimenti che determina l’attivazione del sistema
immunitario. La reazione avversa può manifestarsi anche in
risposta all’esposizione a tracce di proteine allergeniche (1).
Uno studio condotto dal National Institutes of Allergy and
Infectious Diseases (NIAID) ha definito che negli Stati Uniti le
allergie alimentari colpiscono l’1-2% della popolazione. Il numero
di casi di allergia alimentare varia in funzione dell’età, dell’area
geografica considerata, dal tipo di dieta e da altri numerosi
fattori che rendono difficile una stima certa della prevalenza
delle allergie alimentari (2,3). Le allergie sono più diffuse tra i
bambini, anche se spesso tali patologie si risolvono con l’età
adulta. A livello europeo le percentuali sono sovrapponibili a
quelle riscontrate negli Stati Uniti (4). Al fine di prevenire severe
reazioni allergiche nei soggetti sensibilizzati, il legislatore
comunitario ha emanato una normativa sull’etichettatura dei
prodotti alimentari, recepita a livello nazionale, che richiede
di indicare il dettaglio dei singoli costituenti e di specificare la
presenza di allergeni, come riportato nell’allegato alla direttiva
stessa (Direttiva 2003/89/CE, D. Lgs 114/2006). Inoltre
nell’allegato II (UE) del Reg. 1169/2011, che sarà applicato a
partire dal 14 dicembre 2014, sono indicate le 14 sostanze o
prodotti che provocano allergie o intolleranze.
I principali alimenti che contengono proteine allergeniche sono:
latte, uova, arachidi, crostacei, pesce, soia, frutta a guscio e
cereali contenenti glutine (grano, segale, orzo, avena, farro,
kamut o i loro ceppi ibridati e prodotti derivati (1). Il latte è un
alimento che determina numerose reazioni avverse soprattutto
in età pediatrica.
Attualmente la ricerca degli allergeni negli alimenti viene
condotta con metodica ELISA ricercando direttamente una
frazione proteica o indirettamente tramite la rilevazione del DNA
292
codificante la proteina allergenica (PCR). Inoltre, non esistono
dei metodi di secondo livello consolidati per la conferma dei
campioni positivi in prima istanza.
L’obiettivo di questo studio è stato quello di mettere a punto un
protocollo di Western Blot (WB) che confermasse la presenza
di latte (β-lattoglobulina) in alimenti risultati positivi ai test di
screening (metodo ELISA).
MATERIALI E METODI
Nella prima fase di messa a punto del Western Blot (WB)
l’estrazione da latte in polvere (controllo positivo) e da farina
(controllo negativo) è stata effettuata utilizzando i reagenti
del kit ELISA (RidaScreen Fast ß-Lactoglobulin) secondo le
istruzioni riportate dal produttore.
Gli estratti sono stati quindi diluiti in Laemmli buffer a pH
differenti, al fine di individuare quello più idoneo per il campione
in esame. Si è proceduto quindi con l’elettroforesi denaturante
(SDS-PAGE) su gel di poliacrilamide al 12% e successivo
blottaggio su membrana in PVDF. Per la saturazione è stata
utilizzata una soluzione di TBS pH7,4 + BSA 1% + Tween20
0,03%. L’anticorpo primario (rabbit anti-bovine β-lactoglobulin.
Bethyl Laboratories) è stato testato da 1:20000 a 1:50000,
overnight a 4°C. Per i lavaggi è stata utilizzata una soluzione
di TBS pH7,4 + Tween20 0,05%. Sono stati testati diversi
anticorpi secondari anti-rabbit coniugati con AP, incubati 1h a
temperatura ambiente. Le immagini sono state poi acquisite su
lastra fotografica
Nella seconda fase si è passati a lavorare su latte fresco
(bovino, ovino, caprino, asinino) l’estrazione è stata condotta
come segue (5):
• Centrifugazione 13000 rpm 1h 4°C
• Rimozione della frazione superiore (contenente grassi
e caseina)
• Quantificazione con metodo Bradford
Per il confronto tra le specie sono state allestite parallelamente
una SDS-PAGE ed una Native-PAGE. Prima del caricamento
in SDS-PAGE10 µg di campione sono stati equilibrati in 10
mM Tris-HCl, 5% SDS, pH 7.6, glicerolo e blu di bromofenolo,
senza riscaldare per conservare la struttura. Per la NATIVEPAGE si è proceduto nello stesso modo ma senza SDS nella
soluzione di equilibrazione e nel tampone Tris-Glicina per la
corsa elettroforetica.
Per verificare la sensibilità dell’anticorpo primario sono state
caricate su un gel di acrilamide al 14% diluizioni scalari in base
10 di latte bovino, partendo da 10 µg di proteine totali.
SDS-PAGE e WB sono state condotte come riportato sopra.
RISULTATI
Nella fase di messa a punto del WB sono state individuate le
concentrazioni d’uso degli anticorpi (1:50000 per l’Ab primario,
1:5000 per il secondario), tempi di incubazione delle diverse
fasi e le soluzioni più adatte per lavaggi e saturazione.
I campioni di latte fresco provenienti dalle diverse specie
293
confrontati in SDS-PAGE e Native-PAGE mostrano pattern
elettroforetici distinguibili. (Figura 1)
Il segnale è visibile fino al lane n°5 (1:10000), corrispondente
quindi ad 1 nanogrammo di proteine totali caricate. (Figura 2)
Figura 1: WB di confronto dopo SDS-PAGE (A) e Native-Page
(B) su estratti da latte fresco di diverse specie: bovino (1),
ovino (2), caprino (3), asinino (4). Per tutti i campioni sono stati
caricati 10 µg di proteine totali. L’Ab primario riconosce tutte le
specie seppur con diversa sensibilità. I pattern elettroforetici
permettono di identificare la specie di provenienza del latte.
Figura 2: WB su diluzioni scalari in base 10 di estratto di
latte fresco bovino, partendo da 10 µg di proteine totali (1).
L’Ab primario riconosce la beta-lattoglobulina fino al lane 5,
corrispondente ad 1 ng di proteine totali.
BIBLIOGRAFIA
1. Scott H. Sicherer, Hugh A. Sampson.Food allergy.
Original Research Article 2010. Food Allergy.J Allergy
ClinImmun, Volume 125, Issue 2, Supplement 2,
February 2010, pp S116-S125
2. Scott H. Sicherer. Epidemiology of food allergy, 2011. J
Allergy ClinImmun, Volume 127, n° 3, pages 594-602.
3. NIAID-Sponsored Expert Panel. Guidelines for the
Diagnosis and Management of Food Allergy in the
United States: Report of the NIAID-Sponsored Expert
Panel. 2010. J Allergy Clin Immun, Volume 126, Issue
6, Supplement, December 2010, pp S1-S58.
4. Roberto J. Rona, Thomas Keil, Colin Summers, David
Gislason, LaurianZuidmeer, Eva Sodergren, Sigurveig
T. Sigurdardottir, Titia Lindner, Klaus Goldhahn, Jorgen
Dahlstrom, Doreen McBride, Charlotte Madsen. The
prevalence of food allergy: A meta-analysis Original
Research ArticleJ Allergy ClinImmun, Volume 120,
Issue 3, September 2007, Pages 638-646.
5. W L Chen, M T Hwang, C Y Liau, J C Ho, K C Hong, S J T
Mao.Beta-lactoglobulin is a thermal marker in processed
milk as studied by electrophoresis and circular dichroic
spectra. Journal of Dairy Science 06/2005; 88(5):161830.
6. MirjanaPesic , MiroljubBarac , MiroslavVrvic , Nikola
Ristic , OgnjenMacej , SladjanaStanojevic. Qualitative
and quantitative analysis of bovine milk adulteration
in caprineand ovine milks using native-PAGE. Food
Chemistry 125 (2011) 1443–1449
DISCUSSIONE
Nel WB l’utilizzo dei reagenti del kit ELISA (RidaScreen
Fast ß-Lactoglobulin) si è rivelato poco adatto in quanto
probabilmente interferisce e le bande visualizzate risultano
diffuse.
Nella NATIVE-PAGE il bovino presenta due bande quasi
sovrapposte intorno a 18-20 kDa, probabilmente si tratta delle
due isoforme A e B della ß-lattoglobulina.
In SDS-PAGE, nel bovino e nell’ovino sono visibili sia la forma
dimerica (~35 kDa) sia la monomerica (~15 kDa).
Le varie specie, come previsto e come già riportato in letteratura
per bovino e capra (6) hanno pattern elettroforetico differente,
permettendo di distinguerle mediante WB a differenza di quanto
accade in ELISA.
L’anticorpo utilizzato in WB si è dimostrato sensibile, pertanto
perfezionando il protocollo di estrazione su matrici quali biscotti
o farine, sarà possibile validare il protocollo ed utilizzare la
metodica per confermare i campioni positivi con il metodo
ELISA.
294
INDAGINE PRELIMINARE SULLA CONTAMINAZIONE DA RADIONUCLIDI BETA
EMITTENTI (90Sr) NEI PRODOTTI DI ORIGINE ANIMALE
Iammarino M., Dell’Oro D., Bortone N., Mangiacotti M., Chiaravalle A.E.
Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico Veterinario
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata - Foggia
Key words: 90Sr, radionuclides, beta emitters
SUMMARY
Sr is a pure β-emitter, produced in nuclear fission processes
and it is one of the most hazardous pollutants since its long
physical and biological half-life (28.8 years). The accidental
ingestion of contaminated food leads to a rapid absorption of
the radioisotope that is deposited in bones where it is retained.
90
Sr beta particle emission can cause severe damage to
bone and bone marrow, so it is very important to control the
radiocontamination level in the environment and in foods. Two
radiochemical procedures by liquid scintillation counting (LSC)
for the monitoring of 90Sr in products of animal origin (milk,
meats, seafood, cheeses, wheat and derived products) after
achieving of 90Y secular equilibrium condition, were validated.
In order to assess the reliability of the analytical procedures
for routine analyses of 90Sr, 152 samples of milk, dairy
products, meats and seafood, of different origin, were analysed
demonstrating a 90Sr contamination very lower than legal limits.
90
INTRODUZIONE
Lo Stronzio-90 (90Sr) è un prodotto di fissione dell’Uranio-235. È
un pericoloso radionuclide in quanto caratterizzato da un tempo
di dimezzamento di 28.5 anni. In questo intervallo di tempo è
in grado di emettere particelle beta, con un’energia massima di
546 keV decedendo in Yttrio 90 (90Y), anch’esso beta emettitore
(energia massima 2284 keV) con tempo di dimezzamento di
64.1 ore [3]. Nel momento in cui viene raggiunto l’equilibrio
secolare tra 90Sr e 90Y la concentrazione di attività dello stronzio
può essere valutata misurando quella dell’ittrio, corrispondente
a quella dell’isotopo progenitore. Lo 90Sr costituisce un rischio
serio per la sicurezza alimentare in quanto, possedendo una
buona similarità con alcuni importanti elementi biologici come
potassio e calcio, può essere facilmente assimilato dall’uomo
attraverso l’ingestione di diversi prodotti agroalimentari. Una
volta assorbito, questo radionuclide può depositarsi nel tessuto
osseo [4]. La Legislazione Europea [1] prevede l’esecuzione
di un elevato numero di controlli su diverse tipologie di matrice
(latte e prodotti lattiero-caseari, prodotti per l’infanzia, ecc.) e
per ognuna di queste matrici sono previsti dei limiti massimi
per la radiocontaminazione da 90Sr. Negli ultimi anni diversi
metodi per la determinazione di 90Sr in campioni alimentari
sono stati proposti [2]; tuttavia, questi metodi possono risentire
di varie problematiche analitiche quali la scarsa sensibilità e/o
la presenza di interferenze spettrali; inoltre, non sono mai state
definite e sviluppate le necessarie procedure di validazione. In
questo lavoro viene presentata l’attività svolta negli ultimi anni
presso il Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della
Radioattività nel settore Zootecnico-Veterinario. Due metodi
radiochimici per la determinazione di 90Sr nei più importanti
prodotti alimentari di origine animale, ovvero latte, prodotti
carnei, ittici e lattiero-caseari, ed in altre matrici controllo
particolarmente significative quali acqua, cereali e derivati,
sono stati sviluppati, validati ed accreditati. La tecnica analitica
impiegata è stata la scintillazione liquida (LSC); tale tecnica
consente di determinare le concentrazioni di attività di 90Sr dopo
opportuno trattamento del campione (differenziato per matrici
liquide e solide) e raggiungimento dell’equilibrio secolare 90Sr
/ 90Y. L’attendibilità di queste metodiche analitiche è stata
verificata mediante procedure di validazione implementate
seguendo un protocollo sviluppato in-house che consente
di determinare le più importanti performances analitiche in
accordo con gli attuali riferimenti legislativi.
MATERIALI E METODI
Matrici liquide. Il latte viene trattato con una particolare
resina cationica (Dowex), in grado di trattenere lo 90Sr a pH
8.5. Dopo separazione del surnatante e lavaggi ripetuti della
resina con acqua distillata, la stessa viene posta in una
colonna cromatografica e lo 90Sr eventualmente presente
viene eluito mediante lento gocciolamento di HNO3 3M e
acqua distillata. L’eluato viene portato a secco su piastra
riscaldante ed il residuo viene lasciato a temperatura ambiente
per due settimane, tempo necessario per il raggiungimento
dell’equilibrio secolare 90Sr / 90Y. Raggiunto l’equilibrio, il residuo
viene disciolto e portato a volume (200 mL) con HCl 0.1M; il pH
viene corretto a 1.0 e si procede con la separazione dell’90Y.
Tale passaggio viene ottenuto mediante complessazione con
HDEHP (acido bis(2-etilesil)fosforico) ovvero aggiungendo
200 mL di una soluzione di HDEHP al 5% in toluene ed
agitando vigorosamente e trattenendo la fase organica che
viene quindi lavata con HCl 0.1M. L’estrazione finale dell’90Y
dalla soluzione si ottiene mediante separazione liquido-liquido
con due aliquote da 150 mL di HNO3 3 M. L’90Y estratto nella
fase acida viene precipitato come ossalato aggiungendo acido
ossalico all’8%, correggendo il pH a 2.5 mediante aggiunta
di NH4OH al 15% e riscaldando la soluzione fino ad ottenere
un cospicuo precipitato bianco ed una soluzione limpida. Il
precipitato viene filtrato, disciolto in una miscela HNO3 / H2O2,
portato a secco totale, quindi ridisciolto con HCl ed essiccato
nuovamente. Il residuo finale viene ripreso con 8 mL di acido
cloridrico 0.1 N, trasferito in vial di scinitillazione dove viene
aggiunto il cocktail di scintillazione (Ultima Gold AB, Perkin
Elmer). La lettura LSC viene effettuata mediante scintillatore
liquido ad ultra basso fondo (Wallac 1220 Quantuls – Perkin
Elmer) impostato con un tempo di conteggio di 1000 minuti.
Per verificare l’affidabilità del metodo allo scopo preposto sono
state eseguite prove di validazione. Tre sorgenti di Stronzio-90
di attività pari a 1 Bq sono state trattate con la stessa procedura
dei campioni per valutare l’efficienza di conteggio. Quindi sono
state effettuate prove di ripetibilità intermedia su sei campioni
fortificati a due livelli di concentrazione di attività pari a 0.5 e
1.0 Bq L-1 (due operatori diversi, identica procedura ed identico
materiale di prova). La selettività del metodo è stata verificata
mediante misure ripetute su un campione di latte fortificato con
una sorgente di stronzio-90 alla concentrazione di attività pari a
1.0 Bq L-1. Sulla base della forma dello spettro β, dei conteggi
totali e della legge di decadimento del radionuclide stesso
295
si è confermata la sola presenza di ittrio-90. L’accuratezza
del metodo è stata ulteriormente verificata analizzando un
materiale di riferimento certificato (latte in polvere, IAEA-152)
contaminato da stronzio-90 in seguito all’incidente nucleare di
Chernobyl.
Matrici solide. Il campione viene incenerito in muffola. Le ceneri
vengono disciolte in una miscela HNO3 8M / HF al 50%. Viene
effettuata una lisciviazione della miscela a 300°C, quindi una
filtrazione e l’aggiunta di acido ossalico anidro e sodio acetato.
L’aggiunta di acido ossalico, e la successiva correzione del
pH a 4.5 mediante aggiunta di NH4OH al 30%, consente di
precipitare lo stronzio presente nel campione come ossalato
e separarlo dalla maggior parte degli altri metalli. Il precipitato
viene quindi disciolto con una miscela H2O2 / HNO3 8M e la
soluzione viene portata a secco totale. Il residuo viene disciolto
in HCl 0.5 M e si aggiungono altri 4 volumi di H2O. Il 210Pb ed
il 210Bi rappresentano degli importanti interferenti radiometrici
e, pertanto, è necessaria la loro rimozione mediante aggiunta
di 1 mL dei rispettivi standard 10000 ppm e circa 50 mg di
sodio solfuro. Il precipitato formatosi viene rimosso mediante
filtrazione con carta bibula, il pH del filtrato viene corretto ad
1.0 in quanto solo a questo valore di pH è possibile rimuovere
l’90Y già presente mediante complessazione con HDEHP.
La complessazione si ottiene mediante doppia aggiunta di
una soluzione di HDEHP al 20% in toluene, agitazione ed
eliminazione della fase organica. La fase acida viene portata a
volume (200 mL) con HCl 0.1M e posta a temperatura ambiente
fino al raggiungimento dell’equilibrio secolare 90Sr / 90Y (min.
15 gg). Una volta raggiunto l’equilibrio secolare, si procede
con la separazione dell’90Y e la determinazione radiochimica
così come descritto per le matrici liquide. La validazione del
metodo è stata implementata effettuando misure ripetute su
un campione di muscolo bovino fortificato. Considerando la
forma dello spettro β ed i conteggi totali è stata verificata la
selettività del metodo, mentre, effettuando il conteggio di tre
sorgenti di attività pari a 1.5, 95.48 e 494,40 Bq è stata valutata
la linearità strumentale. L’accuratezza è stata verificata
elaborando i dati ottenuti dalle analisi di campioni fortificati a
due livelli di concentrazione di attività pari a 0,5 e 1.0 Bq kg-1;
infine, operando in condizioni di major changes, è stata testata
la robustezza del metodo, ovvero analizzando diverse tipologie
di muscolo (bovino e suino), prodotti ittici (pangasio, tonno e
cozze), formaggi (a lunga e media stagionatura, mozzarella e
ricotta), grano, pane e pasta, fortificati ad una concentrazione
di attività pari a 0.5 Bq kg-1 e verificando, mediante ANOVA test,
l’omogeneità dei dati ottenuti per tutte le tipologie di matrice.
Anche per le matrici solide l’accuratezza del metodo è stata
ulteriormente verificata analizzando un materiale di riferimento
certificato (coriandolo, IAEA-156) contaminato da stronzio-90
in seguito all’incidente nucleare di Chernobyl.
buona discriminazione delle sorgenti di emissione. La tecnica
LSC fornisce, inoltre, efficienze di conteggio delle sorgenti
comprese tra l’80% ed il 90% per i beta emettitori, tali valori
risultano più elevati rispetto alle tecniche tradizionali. In tabella
1 sono riassunti i principali parametri di validazione ottenuti,
suddivisi per matrici liquide e solide. I metodi sono stati utilizzati
nell’ambito dei controlli ufficiali conducendo un monitoraggio su
152 campioni di diversa specie e tipologia di cui: 93 campioni
di latte, 21 campioni di formaggio, 36 campioni di carne e 2
prodotti ittici. I risultati ottenuti sono riportati in tabella 2. Le
concentrazioni di 90Sr rilevate sono tutte ben al di sotto dei
limiti di legge stabiliti in caso di incidente nucleare. La quantità
di elementi radioattivi rilevati negli alimenti di origine animale
dipendono strettamente dal loro metabolismo nell’organismo
ed in particolare dal rapporto Sr/Ca.
Nei campioni di latte le concentrazioni di 90Sr sono al di sotto
di 1 Bq L-1. Solo un campione di latte ovino presenta una
concentrazione di 1,10 ± 0,41 Bq L-1 ed in generale i campioni
di latte di origine ovina mostrano un livello di contaminazione
leggermente superiore a quelli caprini e vaccini. Nei prodotti
lattiero caseari esaminati é stata sempre riscontrata la presenza
di 90Sr a concentrazioni di attivitá superiori al Detection Limit
(< 0,003 Bq kg-1). Due campioni di formaggi pecorini ed
un campione di formaggio caprino hanno fatto registrare
concentrazioni di attivitá > 1 Bq kg-1 (1,29 ± 0,41 Bq kg-1; 1,74 ±
0,55 Bq kg-1; 1,14 ± 0,34 Bq kg-1).
I livelli di contaminazione riscontrati nei campioni di muscolo
e di prodotti ittici risultano piú bassi e confrontabili tra loro (<
¸0,5 Bq kg-1). In conclusione i valori ottenuti risultano di due
ordini di grandezza piú bassi dei limiti di legge stabiliti nei casi
di emergenza radioattiva e pur non destando preoccupazioni
di carattere sanitario confermano l’importanza dei controlli
sulla radiocontaminazione, soprattutto nelle matrici in cui tale
radionuclide tende ad accumularsi.
BIBLIOGRAFIA
1.European Commission, 1989. Regulation (EURATOM)
No. 2218/1989. 18 July 1989. Official Journal of the
European Union. L211: 1–3.
2.Heilgest M, 1999. Use of extraction chromatography, ion
chromatography and liquid scintillation spectrometry for
rapid determination of strontium-89 and strontium-90 in
food in cases of increased release of radionuclides. Journal
of radioanalytical and nuclear chemistry, 245(2): 249-254.
3.Stamoulis KC, Ioannides KG, Karamanis DT, Patiris
DC, 2007. Rapid screening of 90Sr activity in water and
milk samples using Cherenkov radiation. Journal of
environmental radioactivity, 93:144-156.
4.Torres JM, Tent J, Llaurado M, Rauret G, 2002. A rapid
method for 90Sr determination in the presence of 137Cs
in environmental samples. Journal of environmental
radioactivity, 59:113-125.
Tabella 1 – Principali parametri di validazione
Matrici liquide
Livello di additivazione
Matrici solide
Livello di additivazione
0.5 Bq L-1
1.0 Bq L-1
0.5 Bq L-1
1.0 Bq L-1
Concentrazione
di attivitá media
(n=6) ± SD
0.58 ±
0.07
0.99 ±
0.13
0.46 ± 0.06
0.89 ±
0.13
CV%
12 %
13%
14%
15%
Recupero medio
116 %
99%
92%
89%
Parametro
Efficienza di
conteggio
Robustezza
(campo di
applicazione)
0,87
0,89
Latte, acqua
Carni, prodotti lattiero
caseari, prodotti ittici,
grano e derivati
Tabella 2 – Risultati dell’indagine preliminare
Rispetto ai metodi ufficiali, quelli sviluppati per la determinazione
dello stronzio-90 nelle più importanti matrici agro-alimentari,
mediante scintillazione liquida, risultano meno laboriosi
e più efficaci. Questo è possibile grazie ad una specifica
serie di precipitazioni e purificazioni che garantiscono una
buona separazione radiochimica dello 90Sr da altri isotopi ed
interferenti. Per poter confermare la presenza del radioisotopo
con i metodi tradizionali è necessario effettuare misure
ripetute, a distanza di giorni, per verificare il decadimento
del segnale. Al contrario, il metodo in scintillazione liquida
consente di registrare spettri sia di particelle alfa che beta con
296
Matrice
Latte
Prodotti
lattiero
caseari
Muscolo
Prodotti
ittici
Tipologia
N.
campioni
Caprino
Ovino
Bovino
Caprino
Ovino
37
41
15
9
5
90
Sr media
(Bq L-1)
(Bq kg-1)
0.16
0.28
0.04
0.56
0.99
90
Sr range
(Bq L-1)
(Bq kg-1)
< 0.003 - 0.36
0.03 – 1.10
< 0.003 – 0.09
0.23 - 1.14
0.40 – 1.74
Bovino
7
0.08
0.02 - 0.22
Caprino
Ovino
Bovino
Tonno
Gamberetti
10
16
10
1
1
0.08
0.13
0.07
0.03
0.04
<0.008 - 0.16
<0.003 - 0.43
<0.003 - 0.17
-
297
Valutazione della presenza di Ocratossina A lungo la filiera produttiva
della liquirizia (Glycyrrhiza glabra)
Imbimbo S., Arace O., Castellano V., Soprano V., Esposito M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, via Salute, 2 - 80055 Portici
Keywords: ochratoxin, licorice, immunoaffinity
SUMMARY
Liquorice of Calabria DOP is produced from the extract of the
Glycyrrhiza glabra roots. For the quality and food safety a control
of chain production is of great importance, especially in relation to
the possibility of contamination by fungal strains. In fact, fresh roots
have a high moisture content that facilitates the development of
fungal flora, particularly Aspergillus and Penicillium, producers of
mycotoxins including ochratoxin. On the basis of the evidence of
nephrotoxicity and carcinogenicity (IARC, 1993; EFSA, 2006) the
EU Regulation 105/2010 has set maximum levels for Ochatoxin A
in those products which contribute significantly to the exposure of
the human population, including liquorice. In this study, samples
of licorice collected at various stages of the production chain,
were analysed for the OTA content. The results helped to identify
some critical points during the production process which, properly
controlled, could help to bring down the mycotoxin contamination.
INTRODUZIONE
La liquirizia riveste una importanza commerciale notevole per il
nostro paese, in particolare per la Calabria dove è concentrata
la quasi totalità della produzione e della lavorazione nazionale
della “Liquirizia di Calabria DOP” proveniente dalla Glycirrhiza
glabra, pianta erbacea perenne appartenente alla famiglia delle
Leguminose. La liquirizia è un integratore alimentare usato come
ingrediente in molti infusi per le sue proprietà farmaceutiche, due
delle più importante di queste sono la sua azione espettorante e
la capacità di incrementare la pressione sanguigna. Ai fini della
qualità e della sicurezza alimentare il controllo dei processi di
lavorazione assume grande rilievo, soprattutto in relazione alla
possibilità di contaminazione da ceppi fungini. Infatti, la radice
di liquirizia, alla raccolta, ha un elevato contenuto in umidità che
favorisce il rapido sviluppo di una flora fungina, con la comparsa
di miceli dei generi Aspergillus e Penicillium, produttori di
micotossine, in particolare dell’Ocratossina A (OTA), metabolita
secondario dei generi Penicillium verrucosum e Aspergillus
ochraceus, ma anche di A. carbonarius e A. niger(1). L’OTA è
formata da una frazione cumarinica legata ad una molecola di
L-β-fenilalanina tramite un legame. Le evidenze di nefrotossicità
e carcinogenicità (IARC, 1993) hanno portato l’EFSA(1) a stabilire
una dose settimanale tollerabile (TWI) di OTA pari a 120 ng/kg di
peso corporeo e la Commissione . Sulla base di questo valore il
Regolamento UE 105/2010(2) ha fissato dei tenori massimi per
l’OTA in quei prodotti che contribuiscono in maniera significativa
all’esposizione della popolazione umana in generale, tra questi
le spezie e la liquirizia. Per quest’ultima i limiti massimi sono
stati fissati rispettivamente in 20 µg/kg per la radice di liquirizia,
ingrediente per infusioni a base di erbe e in 80 µg/kg per l’estratto
di liquirizia, usato nei prodotti alimentari, soprattutto nelle bevande
e nella confetteria.
Non sono contemplati dalla normativa i prodotti di confetteria
malgrado alcuni lavori abbiano dimostrato la possibilità di una
loro contaminazione a livelli anche abbastanza elevati(3,4,5). D’altro
canto sono sempre numerose le allerte che la Comunità Europea
ha emesso dal 2010 ad oggi mediante il Rasff- Rapid Alert System
for Food and Feed (Sistema Rapido di Allerta di comunicazione
dei rischi sanitari per alimenti e mangimi) (6) per la presenza di
Ocratossina A in alimenti tra cui i prodotti derivati dalla liquirizia,
In questo lavoro è stata determinata la presenza di Ocratossina A
in campioni di liquirizia prelevati in vari stadi della filiera produttiva,
dalla materia prima al prodotto finito in commercio, allo scopo di
valutare il grado di contaminazione e quindi di valutare eventuali
punti critici durante il processo di lavorazione che, adeguatamente
controllati, potrebbero consentire di abbattere fortemente i livelli
di contaminazione da micotossine.
MATERIALI E METODI
L’indagine è stata effettuata su 29 campioni, di cui 13 forniti
direttamente da un’azienda produttrice di liquirizia, e 16 reperiti
sul mercato presso rivendite al dettaglio:
- n. 5 campioni di radici di liquirizia fresca provenienti dalla raccolta
in campo e che non avevano subito ancora alcun processo di
trattamento;
- n. 3 campioni di pasta nera densa semilavorata, intermedio di
lavorazione ottenuto da varie fasi di lavorazione che prevedono
lavaggio, sfibramento, macinazione e pressatura delle radici
fresche, e successiva chiarificazione e concentrazione
dell’estratto di liquirizia
- n. 7 campioni di radici di liquirizia provenienti solo dal processo
di lavaggio per eliminare i residui di terra ed essiccamento e
pronte per essere consumate tal quali;
- n. 1 campione di preparato per liquori a base di liquirizia;
- n. 1 campione di liquore a base di liquirizia;
- n. 12 campioni di caramelle alla liquirizia (spezzatine ecc.).
I campioni sono stati analizzati mediante analisi in HPLC-FLD
previa estrazione mediante PBS e purificazione su colonne di
immunoaffinità.
Reagenti e materiali di riferimento
Acetonitrile grado HPLC, Metanolo grado HPLC, Acido Acetico
Glaciale (SIGMA-ALDRICH)
Acqua ultrapura: ottenuta mediante impianto Milli-Q Plus Millipore
PBS: tampone fosfato ottenuto utilizzando bicarbonato di sodio
anidro, sodio idrogeno fosfato anidro, potassio diidrogeno fosfato,
cloruro di sodio e cloruro di potassio
TWEEN 20
Soluzione di materiale di riferimento di OTA a 10 mg/Kg in aceto
nitrile (STANDARD BIOPURE – ORSELL)
Soluzione di lavoro a 1 mg/Kg è preparata in acetonitrile e va
conservata a -18°C
Apparecchiature
Colonne di immunoaffinità per Ocratossina A (OCRAPEP della
R-BIOPHARM)
Colonna per HPLC: Colonna Synergi Polar-Rp 80 Å 250x 4.6
mm (PHENOMENEX) con relativa precolonna C18
Sistema HPLC AGILENT TECHNOLOGIES costituito da pompa,
comparto termostatato colonna, iniettore automatico, rivelatore
FLD
Procedimento
Pesare 10 g di campione omogeneizzato, porli in una bottiglia di
vetro da 250 ml e aggiungere 100 ml di una soluzione acquosa
298
all’1% di bicarbonato di sodio. Omogeneizzare per 2 minuti ad
alta velocità con omogeneizzatore Ultra Turrax. Centrifugare
l’estratto a 4000 rpm per 10 minuti. Diluire 5 ml di estratto, in
una provetta di vetro da 20 ml, con 10 ml di PBS. Far passare
il filtrato diluito (equivalente a 0.5 g di campione) attraverso le
colonnine di immunoaffinità ad un flusso di circa 2 ml per minuto
(è preferibile lasciar passare il filtrato sulle colonnine per gravità).
La colonna di immunoaffinità contiene una sospensione in gel di
anticorpi monoclonali legati covalentemente a un supporto solido.
L’anticorpo è specifico per l’Ocratossina A. L’ OTA presente nel
campione è trattenuta dall’anticorpo contenuto nella sospensione
in gel. La colonna viene quindi lavata con 20 ml di una soluzione
di TWEEN 20 al 10% in PBS ad un flusso di circa 2 ml per
minuto, per eliminare ogni materiale non legato. L’OT A legata
viene rilasciata dall’anticorpo a seguito dell’eluizione con 1,5 ml
di una soluzione di Metanolo e Acido Acetico Glaciale 98:2 v/v
ad un flusso di circa 1 goccia al secondo dopo aver effettuato
ma manovra di back-flushing. Successivamente si aggiunge 1,5
ml di acqua Ultra pura MilliQ. Raccogliere l’eluato in un cilindro
graduato della capacità di 10 ml per verificare che il volume
finale dell’eluato sia di 3 ml. 100 µl dell’eluato finale vengono
poi iniettati in una colonna Synergi Polar-Rp 80 Å 250×4.6 mm
(Phenomenex) munita di precolonna C18 e termostata a 40°C,
con un programma di eluizione in isocratica con fase mobile
costituita da Acqua/Acetonitrile/Acido Acetico Glaciale (53/46/1,
v/v/v). La rivelazione è condotta in fluorescenza alle lunghezze
d’onda di eccitazione λeccitazione = 333 nm e di emissione λemissione
= 460 nm. La determinazione quantitativa dell’OTA è effettuata
mediante la tecnica della standardizzazione esterna, allestendo
la retta di taratura mediante soluzioni di materiali di riferimento
a concentrazioni crescenti. Il LOQ (Limite di Quantificazione)
è stato calcolato fortificando un campione di radici di liquirizia
esente da contaminazione (bianco) al livello di 2.0 µg/kg,
aggiungendo 20 µl del materiale di riferimento a 1 mg/kg a 10 g di
campione. Il LOD (Limite di Rilevabilità), invece è risultato essere
di 0,5 µg/kg. La specificità è stata valutata verificando l’assenza
di interferenti nel cromatogramma ai valori dei tempi di ritenzione
del picco di Ocratossina A. La linearità del metodo è stata
verificata nell’intervallo 0.3125 µg/kg-40 µg/kg corrispondenti a
concentrazioni su matrice comprese tra 2 e 256 µg/kg. Il valore
di R2 è risultato superiore a 0.999. L’accuratezza del metodo è
stata valutata mediante analisi di campioni fortificati a 2 µg/kg e
20 µg/kg, ottenendo un recupero medio tra 92 e 93%, in tutti i
casi le percentuali di recupero ottenute rientravano l’intervallo di
70-110%.
I risultati delle determinazioni di Ocratossina A sono stati valutati
alla luce dei limiti massimi stabiliti dalla normativa comunitaria.
Per quanto riguarda la materia prima, costituita dalle radici fresche,
soltanto due campioni su cinque hanno mostrato la presenza di
OTA; in uno il livello determinato, pari a 20,9 µg/kg, era superiore
al tenore massimo consentito, anche se calcolando l’incertezza
di misura associata al risultato, il valore diventava conforme.
Nell’altro campione, la concentrazione misurata era di 8.7 µg/kg .
Un dato molto interessante, invece, è stato quello riguardante la
contaminazione presente nelle radici secche al naturale: i campioni
di radici prelevate e fornite direttamente dalla fabbrica, non
presentavano nessuna contaminazione; mentre le radici reperite
sul mercato presentavano una diffusa presenza di Ocratossina
A, sebbene a valori inferiori al limite massimo tollerabile. In tutti
i campioni di pasta di liquirizia semilavorata l’Ocratossina A è
risultata inferiore al LOQ (Limite di Quantificazione).
Molto variabili infine i livelli di contaminazione da OTA nei prodotti
di confetteria: infatti, sui 12 campioni di caramelle analizzati,
2 campioni hanno mostrato livelli molto alti di OTA pari a 126 e
147 µg/kg e 2 con valori < LOQ mentre in 8 campioni il livello
riscontrato variava da 2.2 a 24.3 µg/kg.
Nella tabella 1 si riportano, di tutti i campioni analizzati, provenienza,
matrice, contenuto in Ocratossina A espressi in µg/kg.
TABELLA 1: Concentrazioni di Ocratossina A in µg/kg nei
campioni analizzati
PROVENIENZA
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Fabbrica
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Mercato
Fabbrica
Fabbrica
MATRICE
Radici fresche
Radici fresche
Radici fresche
Radici fresche
Radici fresche
Radici secche
Radici secche
Radici secche
Radici secche
Radici secche
Radici secche
Radici secche
Pasta semilavorata
Pasta semilavorata
Pasta semilavorata
Preparato per liquori
Liquore
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
Caramelle
OTA
8.67
< LOQ
< LOD
< LOQ
20.9
< LOD
11.7
8.2
6.55
< LOD
< LOD
< LOD
< LOD
< LOD
< LOD
18
< LOQ
147
7
4.56
8.6
21.7
< LOD
5.56
2.38
24.34
126.52
< LOQ
2.18
L’esame dei dati ottenuti dall’analisi di tutti i campioni conferma
che la contaminazione da Ocratossina A nella liquirizia avvenga
già a livello della raccolta delle radici fresche e che tracce più
o meno forti di micotossina si ritrovano anche nei prodotti finiti.
Infatti sia le radici essiccate consumate tal quali che i vari prodotti
di confetteria mostrano concentrazioni variabili di ocratossina, in
alcuni casi molto vicini al limite massimo definito per l’estratto.
BIBLIOGRAFIA
1) Esteban A., Abarca, M.L., Bragulat, M.R., Cabañes, F.J.,
2006. Effect of water activity on ochtratoxin A production by
Aspergillus niger aggregate species. International Journal of
Food Microbiology 108, 188-195
2) Opinion of the scientific panel on contaminants in the food
chain on a request from the Commission related to ochratoxin A
in food. The EFSA Journal (2006) 365; 1-56
3) Regolamento (CE) N. 105/2010 della Commissione del 5
febbraio 2010 recante modifica del regolamento (CE) 1881/2006
che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti
alimentari G.U. L 35 del 06/02/2010
4) Ariño A., Herrera M., Estopañan G., Juan T. (2007) High levels
of ochratoxin A in licorice and derived products. International
Journal of Food Microbiology 114; 366–369
5) Bresch, H., Urbanek, M., Nusser, M. (2000) Ochratoxin A in
food containing liquorice. Nahrung 44, 276–278.
6) Herrera M., Herrera A., Ariño A. (2009) Estimation of dietary
intake of ochratoxin A from liquorice confectionery. Food and
Chemical Toxicology 47; 2002–2006
7) https://webgate.ec.europa.eu/rasff-window/portal/ RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed)
299
Mycobacterium bovis NELL’UOMO NELL’ITALIA NORD OCCIDENTALE:
CONFRONTO TRA I CEPPI NELL’INDAGINE EPIDEMIOLOGICA
Irico L.¹, Ferraro G.¹, D’Errico V.¹, Mondo A.², Turchi A.², Goria M.¹, Zoppi S.¹, Chiavacci L.¹, Dondo A.¹
¹ Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta
²Clinica delle Malattie Infettive, Università degli Studi di Torino, Ospedale Amedeo di Savoia
Key words: M.bovis, Tubercolosi, Zoonosi.
ABSTRACT
Mycobacterium bovis is the mainly agent of bovine
tuberculosis, an infection disease with zoonotic potential.
Human transmission is prevalent due to the consumption of
infected unpasteurised milk and other dairy products or to
the direct contact with infected animals, mainly in countries
in which there is lack of control policies. Isolation for the
diagnosis is usually completed by molecular characterization
of strains. The aim of this paper was to compare 34 human
strains of M.bovis collected from 2001 to 2011 by evaluating
genotypic affinities with those isolated in livestock. Affinity
was found in 12 out of 25 total VNTR profiles of 14 different
Spoligotyping. Four of these were ascertained cases of
zoonotic transmission. It results that M. bovis is a potential
problem in humans and a complete epidemiological
investigation with a cooperation between Veterinary and
hospital Services is important with attention direct to the
professionals that are frequently in contact with livestock.
INTRODUZIONE
La tubercolosi bovina è una malattia infettiva d’interesse
mondiale a carattere diffusivo causata da Mycobacterium
bovis e caratterizzata prevalentemente da forme respiratorie
a evoluzione cronica e progressiva. M. bovis ha un ampio
spettro d’ospite e può essere causa di malattia nei mammiferi
(domestici e selvatici) tra cui l’uomo. L’agente causale fa
parte del gruppo Mycobacterium tuberculosis complex, che
include tra gli altri anche M. tuberculosis, principale agente
causale della tubercolosi umana e M. microti, tipico dei
roditori e diffuso nei selvatici.
Le frequenti movimentazioni del bestiame ne facilitano la
diffusione (4). Tra gli animali la principale forma di contagio è
rappresentata dall’inalazione di aerosol contenente l’agente
patogeno; i polmoni e i rispettivi linfonodi sono quindi gli organi
prevalentemente colpiti dalle lesioni. Occasionalmente il
micobatterio può sfruttare altre vie di contagio, per esempio
quella digerente (in questo caso è colpito il tratto gastrointestinale) o la forma congenita. L’infezione può diffondere
anche per via sistemica, colpendo altri distretti.
La trasmissione all’uomo di M. bovis avviene
prevalentemente per via alimentare (attraverso il consumo
di latte non pastorizzato) o per contatto diretto con gli animali
infetti, soprattutto nei paesi in via di sviluppo, dove non
sono sistematicamente applicate misure di controllo nelle
popolazioni animali sensibili (4).
Da molti decenni nei Paesi dell’Unione Europea sono stati
adottati piani di profilassi che, ad oggi, fanno capo alla
normativa comunitaria (Direttiva 64/432/CEE, in Italia recepita
dal D. Lgs 196/99 e successive modifiche). Ciononostante
lo stato sanitario a livello europeo è disomogeneo, in molti
Paesi persistono esigue percentuali di allevamenti infetti.
In tali circostanze il rischio zoonosico è circoscritto per lo
più alle categorie professionali impiegate nel settore, e in
particolare a veterinari buiatri, allevatori, macellatori, addetti
e tecnici degli allevamenti (6).
La difficoltà nell’eradicazione della malattia è dovuta, in parte,
al lungo periodo d’incubazione e in parte al decorso, per lo più
lento e cronico, entrambi fattori che non sempre permettono
un’identificazione clinica e diagnostica immediata. Inoltre,
va detto che l’infezione nell’uomo causata da M. bovis non
è di per sé distinguibile, né clinicamente, né dal punto di
vista patologico, da un’infezione da M. tuberculosis (4).
Per questi motivi, risulta di fondamentale importanza la
collaborazione tra i Servizi Veterinari (SV) ed i Servizi di
Igiene e Sanità Pubblica (SISP) delle Aziende Sanitarie
Locali, al fine di scambiare reciprocamente informazioni
utili a completare l’indagine epidemiologica in corso di un
focolaio di Tubercolosi bovina o in seguito a identificazione
di M. tuberculosis complex nell’uomo.
L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria
e Valle d’Aosta (IZSPLV) ha implementato, sin dal 2002 un
DataBase (DB) in ambiente Microsoft Access (2000), con
lo scopo di gestire i focolai di tubercolosi bovina integrando
anche le informazioni ottenute dalle indagini molecolari che
ordinariamente affiancano l’isolamento di M. bovis negli
animali e in taluni casi anche nell’uomo (genotipizzazione
dei ceppi isolati mediante identificazione dello Spoligotyping
del locus DR, VNTR-ETR,QUBs MIRU). In questo lavoro
sono riportati i risultati delle caratterizzazioni molecolari dei
ceppi di M. bovis isolati nell’uomo in Piemonte dal 2001 al
2011 e sono state valutate le affinità genotipiche con i ceppi
bovini isolati nelle tre regioni di competenza IZSPLV nello
stesso periodo e disponibili nel DB.
MATERIALI E METODI
I ceppi erano stati isolati nel periodo dal 2001 al 2011
presso diverse Aziende Ospedaliere del Piemonte e riferiti
all’Ospedale Amedeo di Savoia. La caratterizzazione
molecolare dei ceppi M. bovis, è stata effettuata con la
determinazione dello spoligotipo del locus DR e con l’analisi
dei VNTR-ETR (A, B, C, D, E); per i ceppi di origine umana
la tipizzazione è stata eseguita anche con l’analisi di QUBs
(11a, 11b, 26, 1895, 15, 3232) e MIRU 26 (5). I risultati
delle analisi molecolari effettuate presso l’IZSPLV su 34
ceppi umani di M. bovis sono stati quindi informatizzati e
successivamente estratti dal DB, per essere elaborati
con Excel (Microsoft Office 2003) e messi a confronto con
quelli bovini isolati dal 2001 al 2011 già presenti nel DB che
raccoglie i dati riguardanti gli isolamenti effettuati nel corso
delle procedure di eradicazione.
L’età media dei pazienti è di 55,6 anni (+/-22,3 ds), con un
caso in un paziente di 3 anni (età minima) e 5 casi in pazienti
300
di 83 anni (età massima). Sei di questi pazienti (età compresa
tra 24 e 36 anni) provenivano da Paesi extraeuropei, in
particolare da zone ad elevato rischio di Tubercolosi.
Nella Tabella 1 sono riportati i 13 Spoligotipi riscontrati ed
i 25 diversi profili ottenuti dell’analisi dei VNTR associati al
numero di pazienti in cui sono stati rispettivamente rilevati.
Nell’ultima riga in Tabella 1 il codice alfanumerico dello
Spoligotyping, secondo la codifica internazione della banca
dati internazionale collocato sul portale online www.mbovis.
org, non è riportato perché tale ceppo non risulta ancora
codificato. Le caratterizzazioni in Spoligotipo e VNTR dei
ceppi umani sono state confrontate con quelle dei ceppi
bovini a disposizione nel DB; nello specifico vi è il numero
delle diverse aziende in cui è stato isolato il ceppo umano su
uno o più capi.
.
La Tabella 2 riporta, a latere del profilo dei ceppi isolati
nell’uomo, il numero di ceppi bovini e il numero di pazienti
con provenienza da aree considerate a rischio infezione di
M.bovis in cui è stato riscontrato il medesimo profilo
Tabella 2
Tabella 1
SPOLIGO
SB0120
VNTR
diversi
VNTR
OMOLOGHI
con ceppi
bovini
VNTR
riscontrati
SOLO
NELL’UOMO
Provenienza
da aree a
rischio
SB0120
11
8
3
1
SB0125
1
0
1
1
SB0134
1
1
0
0
SB0140
2
0
2
1
SB0340
1
0
1
1
SB0841
1
1
0
0
SB0866
1
0
1
0
SB0867
1
0
1
0
SB0930
1
0
1
1
SB1142
1
0
1
1
SB1169
1
0
1
0
SB1542
1
0
1
0
SB1584
1
1
0
0
5,26,27
1
-
-
-
VNTR
N° PAZIENTI
AZIENDE in cui è stato
riscontrato il ceppo
25613
1
0
35533
1
8
44523
2
0
44534
1
8
45533
5
61
52533
1
1
54533
1
21
54534
4
83
54535
1
2
PAZIENTE
QUB 3232
QUB 11a
QUB 11b
QUB 15
QUB 26
QUB1895
MIRU 26
55513
1
0
1
6
11
3
2
5
4
5
2
7
11
3
3
5
4
5
55534
1
9
SB0125
54433
1
0
SB0134
54534
2
28
46533
1
0
75633
1
0
SB0340
15333
1
0
SB0841
45533
1
5
SB0866
52444
1
0
SB0867
55332
1
0
SB0930
44433
1
0
SB1142
64432
1
0
SB1169
55523
1
0
SB1542
54534
1
0
SB1584
45533
1
2
5,26,27
45523
1
-
SB0140
Spoligo
tipo
Lo studio più approfondito sui marker genetici, quali QUBs
e MIRU, consente di approfondire la differenziazione
evidenziando meglio differenze tra ceppi, apparentemente
omologhi (stessi Spoligotipo e VNTR). Un esempio è riportato
in Tabella 3: per lo stesso profilo (Spoligotipo e VNTR), in
questo caso un ceppo SB0120-44523 presenta differenze
all’analisi molecolare più approfondita.
Tabella 3 – ceppi isolati in due pazienti con stesso profilo
SB0120 – 45523 ma con QUBs e MIRU differenti
Il riscontro di pazienti in cui è stato isolato M. bovis, è
comunque indicativo di un problema presente, seppur
marginale. Inoltre la diagnosi di M. bovis verosimilmente
è sottostimata, considerando che non sempre gli
approfondimenti diagnostici effettuati nei presidi ospedalieri,
identificano M. tb complex a livello di specie. Il Database
sviluppato è d’indubbia utilità nel confronto dei ceppi di
natura umana e bovina al fine di stabilire relazioni di tipo
epidemiologico e facilitare la comprensione dell’origine
dell’infezione sia nell’uomo sia nelle aziende.
In Regione Piemonte sono stati 4 i casi accertati di contagio
diretto allevatore-bovino. In questi casi, le indagini genetiche
di approfondimento hanno permesso di riscontrare una
perfetta omologia tra il ceppo isolato nei pazienti, ed il ceppo
isolato nei capi all’interno dell’azienda di cui loro stessi erano
proprietari (3).
Tali episodi confermano l’importanza di mantenere una
fonte di comunicazione e di collaborazione continua tra i
Servizi Veterinari ed i SISP, al fine di effettuare un’indagine
epidemiologica completa e sistematica, sia in campo,
sia attraverso l’utilizzo delle banche dati informatizzate
301
(ARVET e Banca Dati Nazionale) e del Database in continuo
aggiornamento. L’informatizzazione dei risultati diagnostici
e degli approfondimenti genetici effettuati sui ceppi isolati
costituiscono un’importante aspetto integrativo delle
indagini epidemiologiche effettuate dai Servizi Veterinari e
dall’Osservatorio Epidemiologico Regionale.
L’integrazione, inoltre, con la caratterizzazione molecolare,
permette di individuare le eventuali correlazioni riscontrate
tra i profili dei ceppi umani e bovini, evidenziando così la
trasmissione interspecifica. Le ulteriori indagini dei marker
specifici quali QUBs e MIRU, applicabili sia nei casi di
infezione uomo-bovino che tra gli animali, potrebbero
risultare importanti a scopo epidemiologico, nell’indagine,
per esempio, sull’origine e la diffusione dei ceppi stessi.
Queste azioni si dimostrano un consistente sostegno
per migliorare le azioni della Sanità Pubblica sia per la
prevenzione della malattia, sia per il raggiungimento
dell’obiettivo dell’eradicazione della tubercolosi dagli
allevamenti bovini in Piemonte.
BIBLIOGRAFIA
(1) Chiavacci L., Barbaro A. (2009) Osservatorio
epidemiologico regionale: organizzazione e valutazione
dei dati finalizzate alla riprogrammazione degli interventi.
Medicina Veterinaria Preventiva, N. 30 (Numero monografico
sulla Tubercolosi); pag 18-26.
(2) Giuliani A., Talone T. et al. L’impegno dell’Unione Europea
nell’eradicazione della tubercolosi bovina.
(3) Goria M., Garrone A. et al. (2009). La tubercolosi da M.
bovis nell’uomo: il risvolto zoonosico della malattia e i riscontri
raccolti in Piemonte. Medicina Veterinaria Preventiva, numero
30 (Numero monografico sulla Tubercolosi); pag. 50-58.
(4) Michel A.L., Muller B., Van Helden P.D. (2010).
Mycobacterium bovis at the animal-human interface: A
problem or not? Veterinary Microbiology 140, 371-381.
(5) Roring S. et al. 2002 - Development of variable numbers of
tandem typing of Mycobacterium bovis :comparison of results
with those obtained by using existing exact tandem repeats
and spoligotyping . J. Clin. Microbiol. 40(6), 2126-2133
(6) Torres-Gonzales P., Soberanis- Ramos O. et al. (2013).
Prevalence of latent and active Tuberculosis among dairy
farm workers exposes to cattle infected by Mycobacterium
bovis. PLOS Neglected Tropical Diseases, Vol 7 (4).
PROGETTO PILOTA DI SORVEGLIANZA SULLA MORTALITA’ DEGLI ALVEARI:
RISULTATI PRELIMINARI IN PIEMONTE
Irico L., D’Errico V., Caruso C., Vitale N., Radaelli M.C., Romano A., Mogliotti P., Masoero L., Goria M.,
Chiavacci L., Dondo A., Possidente R.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino;
Key words: Varroasis, Colony mortality, Piedmont
ABSTRACT
Beekeeping in Italy is a practice of ancient tradition, as the
advantageous climatic conditions and the productivity of local
breed Apis mellifera ligustica have made this activity popular.
Nevertheless, environmental and human factors such as
pollution, habitat destruction and frequent use of pesticide
could threaten honeybee survival. In order to monitoring
honeybee pathologies as varroasis and mortality of apiaries a
pilot surveillance study was carried out by the French Agency
for Food, Environmental and Occupational Health Safety,
in Europe. This work shows data on Piedmont monitoring.
Varroasis is present in 12 of 15 sampled apiary, with a variable
mean prevalence among colonies (from <2% to >5%). Colony
losses were higher after winter (13 of total colonies dead).
Further studies, would be useful to define the total diffusion of
honeybee pathologies in Piedmont and to evaluate mortality
in relation of this parasite and other environmental causes of
colonies depopulation.
INTRODUZIONE
L’Apicoltura è una pratica diffusa a livello mondiale, di
fondamentale importanza per la produzione del miele e dei suoi
derivati per il ruolo che le api hanno nell’impollinazione delle
piante, sia spontanee che coltivate. L’Italia vanta una vasta
tradizione apistica, derivante sia dalle favorevoli condizioni
climatiche che dall’elevata attitudine produttiva della specie
nativa (Apis mellifera ligustica).
Nonostante ciò, la mortalità degli apiari negli ultimi tempi
tende ad essere in aumento (1), con il rischio di ripercuotersi
negativamente sugli ecosistemi; tra le cause più comuni vi
sono i principi attivi utilizzati in agricoltura, soprattutto nelle
aree ad intensa attività agricola (con concentrazioni ambientali
elevate nel periodo primaverile - estivo) e le diverse patologie
che colpiscono le colonie stesse (problema rilevabile per lo più
in tarda estate ed al termine dell’inverno successivo).
Nel 2012, la French Agency for Food, Environmental and
Occupational Health Safety (ANSES) ha stilato un progetto
pilota con l’intento di armonizzare procedure di sorveglianza
attiva per consentire stime affidabili delle perdite di colonie
nei paesi europei. Nello specifico, gli obiettivi del progetto
consistono nell’individuare il tasso di mortalità stagionale negli
apiari campionati e la prevalenza delle principali patologie
delle api. In particolare, è stato chiesto di valutare il tasso
d’infestazione da Varroa destructor, valutare la prevalenza
clinica stagionale delle principali malattie delle api, tra cui
peste americana (Paenibacillus larvae), peste europea
(Melissococcus plutonius), nosemiasi (Nosema apis e Nosema
ceranae), valutare il tasso di infezioni delle tre virosi principali
(virus della paralisi acuta - ABPV, virus della paralisi cronica
- CBPV, virus delle ali deformi - DWV), nonché la ricerca di
eventuali parassiti esotici (Aethina tumida - SHB, Tropilelaps
spp.). In questo lavoro sono presentati i primi risultati ottenuti
302
attraverso un campionamento effettuato in apiari della Regione
Piemonte, in seguito ad una selezione, secondo indicazioni
dell’Unione Europea, che ha portato a valutare sia il grado
d’infestazione di varroasi, che la mortalità stagionale delle
colonie.
MATERIALI E METODI
Sono stati campionati un numero di 15 apiari, opportunamente
identificati, su un totale di 5000 apiari presenti sull’intero territorio
piemontese (4). Durante la prima visita autunnale sono state
selezionate per ogni apiario, un numero variabile di colonie
da ispezionare, in modo da poter ottenere una prevalenza
del 20%. Le colonie selezionate sono state esaminate per
l’intera durata del progetto che prevede complessivamente tre
momenti diversi di campionamento: il primo campionamento è
stato effettuato tra il 15 ottobre e il 15 novembre; il secondo,
coincidente con la ripresa dell’attività dell’apiario, è stato
effettuato nella primavera del 2013; l’ultimo campionamento
corrispondeva al pieno periodo produttivo ed è stato pertanto
effettuato entro il 15 luglio.
Per la rilevazione e registrazione dei dati, sono state utilizzate
le schede predisposte dal Centro di Referenza Europeo,
che hanno permesso la raccolta di informazioni riguardanti
l’apicoltore, la georeferenziazione e la gestione dell’apiario
(migrazione stagionale, acquisti, spostamenti, stato sanitario,
trattamenti). Durante la prima visita, in tutti gli apiari è stato
effettuato un campionamento sistematico di 300 api per ogni
colonia individuata, al fine di identificare l’infestazione da Varroa
spp. Le api sono state prelevate e raccolte in contenitori idonei
(barattoli di plastica di 200 ml o buste ermetiche) ed inviate
alla S.S. Diagnostica Generale dell’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta (IZSPLV).
Il conteggio delle varroe è stato effettuato manualmente, previo
distacco delle stesse mediante lavaggio con soluzione alcoolica.
Gli esiti sono stati inseriti nel Sistema Informativo di Gestione
Laboratori dell’IZS e successivamente elaborati mediante
file Excel (Microsoft Office 2003). Ulteriori prelievi sono stati
effettuati, in tutti e tre gli accessi solo in caso di sospetto clinico
di malattie diverse da Varroasi ed esaminati mediante ricerca di
DNA con RRT PCR. Nel secondo e nel terzo campionamento
è stato inoltre valutato, in base alle indicazioni del protocollo,
il tasso di mortalità invernale (colonie selezionate morte tra il
primo e il secondo ingresso) e stagionale (colonie selezionate
morte tra il secondo e il terzo ingresso) degli apiari.
La maggior parte degli apicoltori coinvolti nel piano ha un’età
compresa tra i 45 ed i 65 anni (circa l’80%). Il 13% ha più di 65
anni mentre uno solo ha l’età compresa tra i 39 ed i 45 anni. Circa
il 43% è un allevatore professionista a tempo pieno, uno solo
degli intervistati pratica l’apicoltura part-time, mentre il restante
50% è costituito per lo più da hobbisti. L’attività migratoria è
praticata nel 13% dei casi e gli spostamenti avvengono sul
303
territorio regionale o in regioni limitrofe. La specie più allevata
è A. mellifera ligustica (72%), seguita da A. mellifera carnica
(14%), A. mellifera mellifera (7%) e da ibridi (7%); in un caso
mancano informazioni al riguardo. Tutti gli intervistati praticano
l’apicoltura per la produzione del miele.
Per ognuno dei 15 apiari selezionati sono state casualmente
campionate da 2 (valore minimo) a 14 colonie (valore
massimo); la media e la mediana dei campionamenti sono
state rispettivamente 8,9 (± 3,6) e 10 colonie per apiario.
Ricerca di Varroasi. Durante la visita invernale sono state
campionate 38228 api (in media 285.3 capi per colonia). Nella
Tabella 1 sono riportati i campioni sistematici (SYS) effettuati
negli apiari piemontesi, compreso il numero di colonie per
apiario infestate; gli apiari infestati da Varroa destructor sono 12;
di cui 11 (73,3%) con almeno la metà delle colonie campionate
infestate. In tre apiari non è stata rilevata infestazione. Si può
dire in questo caso che l’apiario è considerato negativo.
Tabella1 – Infestazione di Varroa spp. nelle diverse colonie.
APIARIO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
COLONIE CAMPIONATE
10
14
10
12
11
10
10
5
2
8
11
12
6
2
11
TOTALE COLONIE INFESTATE
0
0
8
5
11
10
5
5
2
4
11
10
5
0
10
trattamento immediato) al fine di non perdere la colonia.
Dai risultati nel grafico è quindi importante valutare la
prevalenza del parassita soprattutto al fine di salvaguardare
la sopravvivenza dell’apiario che, in taluni casi, rischia di
essere compromessa.
In solo due apiari sono state riscontrate altre patologie.
In particolare, mediante metodiche biomolecolari è stata
rilevata la presenza di DWV (apiari numero 9 e numero
11), e in un solo caso coinfezione ABPV e CBPV (apiario
numero 11). Il reale impatto che tali agenti eziologici hanno
sulla mortalità della colonia è ancora oggetto di discussione;
tuttavia, possono essere causa di gravi danni soprattutto in
contemporanea presenza di Varroa destructor (2, 5). A causa
del limitato numero di campioni rimane comunque difficile
stabilire un’associazione tra il parassita e la presenza di
agenti virali.
Mortalità degli apiari. Nei campioni selezionati i dati
riguardanti la mortalità sono riassunti in Tabella 2; 7
apiari hanno subito perdite di colonie tra il primo ingresso
(autunno 2012) ed il secondo (primavera 2013), con un
tasso di mortalità invernale variabile tra l’8,3% ed il 50% (in
quest’ultimo caso le colonie iniziali erano soltanto due ed
una media di 1,8 colonie perse per apiario.
Grafico 1 – Prevalenza media nelle singole colonie, per
apiario.
INFESTAZIONE 2-5%
INFESTAZIONE >5%
12
10
8
COLONIE
6
INFESTATE
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
APIARIO
Dai dati emerge che la presenza di varroe nelle colonie
infestate è eterogenea con un range di infestazione che
varia dallo 0.17% fino al 7.90%, con un’infestazione
talvolta superiore alla soglia critica del 5%. Secondo gli
aggiornamenti forniti dall’Unità Operativa Apicoltura (IZSLT)
(6), la determinazione della percentuale di varroasi aiuta
a definire la tempestività del trattamento (<2% attento
monitoraggio, 2 – 5% trattamento in tempi ristretti, >5%
BIBLIOGRAFIA
(1) Commissione Europea (2010). Comunicazione della
Commissione al Parlamento Europeo e al Consiglio relativa
alla salute delle api. Bruxelles.
(2) Contessi A. (2009). Le Api. Biologia, allevamento, prodotti.
Edagricole.
(3) Formato G. (2009). Aggiornamenti sui fenomeni di
spopolamento e morte degli alveari in Italia. Argomenti, numero
4 (Dicembre).
(4) French Agency for Food, Environmental and Occupational
Health Safety (2012). Protocollo per il progetto pilota UE
finalizzato alla sorveglianza della mortalità nelle colonie di api
mellifere.
(5) Genersch E. (2010). Honey bee pathology: current threats
to honey bees and beekeeping. Appl. Microbiol. Biotechnol
87:87-97.
(6) Guido G. (2011-2013). Varroa destructor, monitoraggio
dell’infestazione e soglie d’intervento. L’apicoltura moderna in
pillole. Atti del congresso. Istituto Zooprofilattico Sperimentale
delle Regioni Lazio e Toscana. Pag. 3-5.
(7) Porrini C., Sabatini A.G., et al. (2008). Le segnalazioni degli
spopolamenti e delle mortalità degli alveari in Italia: resoconto
2008. L’osservatorio, anno 11 numero 6 (Dicembre).
(8) Van Engelsdorp D., Hayes J. Jr., et al (2008). A Survey of
Honey Bee Colony Losses in the U.S.,, Fall 2007 to Spring
2008.
Tabella2 – mortalità negli apiari.
Il Grafico 1 che segue mostra le colonie infestate in relazione
alla prevalenza media di Varroa destructor all’interno di ognuna
di esse.
INFESTAZIONE <2%
APIARIO
COLONIE
1° VISITA
COLONIE
2° VISITA
COLONIE
3° VISITA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
10
14
10
12
11
10
10
5
2
8
11
12
6
2
11
10
14
10
10
9
8
10
5
1
8
10
11
6
2
7
10
14
10
10
9
8
10
5
1
8
9
11
6
2
7
TASSO
TASSO
MORTALITA'
MORTALITA'
STAGIONALE
INVERNALE %
%
0
0
0
16,7
18,2
20
0
0
50
0
9,09
8,3
0
0
36,4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
0
0
0
0
Le colonie che non hanno superato l’inverno sono state in totale
13 e presentavano alla prima visita un’infestazione variabile
di varroasi (da <2% a >5%). In un solo apiario l’infestazione
era decisamente elevata (due colonie con >18%) e questo
potrebbe dimostrare un effettivo e grave indebolimento delle
api stesse. Due delle colonie perse erano invece negative alla
ricerca dell’acaro al primo ingresso. La mortalità stagionale,
valutata osservando le perdite tra secondo e terzo ingresso
(estate 2013) evidenzia una situazione favorevole, infatti, è
stata persa una sola colonia nell’apiario numero 11.
In base ai primi dati ottenuti, risulta che il protocollo di
campionamento è stato utile a dimostrare la presenza di
varroasi nel territorio, con una prevalenza media variabile tra le
colonie. Vista la diffusione dell’apicoltura e il numero elevato di
apiari presenti nella nostra Regione, un’indagine approfondita,
aumentando il campione in esame, potrebbe essere utile a fornire
maggiori informazioni riguardo sia la diffusione della malattia,
sia un’eventuale correlazione tra quest’ultima e la mortalità
degli apiari, fenomeno, tra l’altro, in aumento, considerando le
più svariate cause di spopolamento degli alveari, tra le quali,
oltre le patologie, vi sono anche l’inquinamento agricolo da
fitofarmaci, errori di gestione, cambiamenti climatici.
304
305
INDAGINI NEUROPATOLOGICHE IN CETACEI SPIAGGIATI LUNGO LE COSTE LIGURI
(2007-2012)
Iulini B.1, Giorda F.1, Pautasso A.1, Pintore M.D.1, Tittarelli C.1, Romano A.1, Goria M.1, Serracca L.1, Grattarola C.1,
Dondo A.1, Di Guardo G.2, Mignone W.1, Casalone C.1
2
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna, 148 – 10154 Torino
Dipartimento di Scienze Biomediche Comparate - Università degli studi di Teramo, Viale Crucioli 122 - 64100 Teramo
Key words: spiaggiamento, lesioni neuropatologiche, cetacei
SUMMARY
Aquatic mammals could act as reservoirs for potentially
zoonotic and emerging infectious pathogens.
This report summarizes the neuropathological findings detected
in cetaceans stranded along the Ligurian Sea coast in the period
2007-2012. Post mortem examinations were performed on 40
cetaceans. Histological, immunohistochemical, biomolecular
and microbiological investigations were conducted on the
central nervous system (CNS) sampled from 24 well preserved
carcasses.
Analysis showed inflammatory lesions in 12 cases; 1 sample
was unsuitable for analysis due to autolysis and no histological
lesions were found in the remaining cetaceans. Investigations
for the presence of pathological prion protein (PrPSc) were
negative in all cases.
This report testifies that the CNS sampling should be performed
routinely during the necropsy since it can provide relevant
scientific data on cetacean health and conservation status.
INTRODUZIONE
Lo spiaggiamento dei cetacei è un evento noto in tutto il mondo.
Approfondirne le cause di morte consente di ottenere importanti
informazioni sullo stato di conservazione e di salute di questi
animali, in quanto permette di accedere ad una preziosa
fonte di dati scientifici e biologici. Le cause responsabili degli
spiaggiamenti di delfini e balene, sia singoli sia di massa,
sono multiple, tra le più importanti si annoverano: biotossine
algali, incidenti con natanti, intrappolamenti nelle reti da pesca,
esposizione a contaminanti ambientali, emaciazione e malattie
infettive.
I mammiferi marini possono fungere da reservoirs di agenti
patogeni responsabili di zoonosi e di infezioni emergenti
in grado potenzialmente sia di causare epidemie letali tra le
popolazioni di cetacei sia di costituire un problema di sanità
pubblica, rappresentando una minaccia alla salute dell’uomo
(4).
Nei periodi compresi tra il 1990 e il 1992 e tra il 2006 e il 2008 nel
Mar Mediterraneo sono avvenuti due imponenti spiaggiamenti
di massa di stenelle (Stenella coeruleoalba) causati da due
ceppi di Dolphin Morbillivirus (DMV) altamente correlati tra loro
(1, 3).
Questi virus sono riconosciuti essere degli agenti infettivi di
rilevante importanza e preoccupazione per le popolazioni di
cetacei.
La letteratura riporta inoltre casi di coinfezione con Toxoplasma
gondi, un patogeno che dopo essere stato considerato a lungo
soltanto un oppurtunista per i mammiferi marini, viene oggi
annoverato anche come agente di infezione primaria (2).
Lo scopo del presente lavoro consiste nel descrivere le lesioni
neuropatologiche osservate negli esemplari spiaggiati lungo le
coste del mar Ligure dall’anno 2007 all’anno 2012.
MATERIALI E METODI
Durante il periodo 2007-2012 si sono spiaggiati lungo le coste
della regione Liguria 40 mammiferi marini in totale, come
mostrato in tabella 1.
Trentotto di questi esemplari erano delfini e più precisamente,
33 stenelle (Stenella coeruleoalba), 4 tursiopi (Tursiops
truncatus), 2 balenottere comuni (Balenottera physalis) ed
un soggetto di cui non è stato possibile identificare la specie
poiché in stato di mummificazione.
Tabella 1 – Mammiferi marini spiaggiati in Liguria (20072012)
SPECIE
N
Stenella
33
Tursiope
4
Balenottera comune
2
Cetaceo non identificato
1
TOT
40
ID
Meningite
linfocitica
Vasculite
linfocitica
x
x
3
Grafico 1- Risultati delle analisi istologiche
N° animali
14
Manicotti
perivascolari
Noduli
gliali /
gliosi
Necrosi
neuronale /
neuronofagia
x
x
x
x
x
4
x
x
x
x
5
x
x
x
x
6
x
x
x
7
x
x
9
x
x
10
x
x
x
11
x
x
x
12
x
x
x
x
x
BIBLIOGRAFIA
1. Di Guardo G., Marruchella G., Agrimi U., Kennedy S. (2005)
Morbillivirus infections in aquatic mammals: A brief overview.
Journal of Veterinary Medicine A (Physiology, Pathology and
Clinical Medicine) 52, 88-93.
2. Di Guardo G, Di Francesco CE, Eleni C, Cocumelli C, Scholl
F, Casalone C, Peletto S, Mignone W, Tittarelli C, Di Nocera F,
Leonardi L, Fernández A, Marcer F, Mazzariol S. Morbillivirus
infection in cetaceans stranded along the Italian coastline:
pathological, immunohistochemical and biomolecular findings.
Res Vet Sci. 2013 Feb;94(1):132-7.
3. Raga J.-A., Banyard A., Domingo M., Corteyn M., Van
Bressem M.-F., Fernández M., Aznar F.-J., Barrett T. (2008) Dolphin morbillivirus epizootic resurgence, Mediterranean Sea.
Emerging Infectious Diseases 14, 471-473.
4. Van Bressem MF, Raga JA, Di Guardo G, Jepson PD, Duignan
PJ, Siebert U, Barrett T, Santos MC, Moreno IB, Siciliano S,
Aguilar A, Van Waerebeek K. Emerging infectious diseases
in cetaceans worldwide and the possible role of environmental
stressors. Dis Aquat Organ. 2009 Sep 23;86(2):143-57.
Review.
4
2
0
Assenza di lesioni
x
x
8
N° animali
Lesioni infiammatorie
Cisti
toxoplasmiche
x
x
10
6
Malacia con
gitter cells
xx con
neutrofili
12
8
Edema
x
2
I risultati del presente lavoro (grafico 1) mostrano che 12
soggetti presentavano all’esame neuropatologico lesioni
infiammatorie localizzate o diffuse (dettagliate in Tabella 2); in
11 soggetti non è stata rinvenuta alcuna lesione istologica ed
un soggetto è risultato non idoneo per marcata autolisi.
neuropatologiche, ha messo in evidenza la presenza di lesioni
istologiche aspecifiche in molti encefali esaminati, anche in
assenza di positività per Morbillivirus e Toxoplasma gondi.
I risultati di questo lavoro dimostrano che il campionamento
del sistema nervoso centrale (SNC) dovrebbe essere un
fatto imprescindibile durante la conduzione di un esame
necroscopico, in quanto in grado di fornire rilevanti informazioni
scientifiche sullo stato di salute e di conservazione di questi
animali.
Per comprendere integralmente le ragioni di questi spiaggiamenti
ulteriori indagini sarebbero necessarie, soprattutto nei casi
in cui non è stato possibile risalire alla causa di morte con le
metodiche utilizzate.
I mammiferi marini sono considerati delle specie sentinella
sia per l’ecosistema sia per la salute pubblica, condividendo
con l’uomo lo stesso ambiente e pertanto risulta fondamentale
monitorare il loro stato di salute
Tabella 2 – Risultati degli encefali con lesioni istologiche
1
Presso la sezione di Imperia dell’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta è stato
condotto un esame necroscopico completo su 25 cetacei; 24 di
questi soggetti si presentavano in buono stato di conservazione
ed è stato pertanto possibile prelevarne l’encefalo per
effettuare indagini istologiche (HE), immunoistochimiche (IHC)
biomolecolari e microbiologiche.
Inoltre è stato eseguito l’esame immunoistochimico per la
ricerca della proteina prionica patologica (PrPSc) su tutti i casi.
306
Le lesioni infiammatorie erano rappresentate da meningite,
vasculite, manicotti perivascolari caratterizzati da cellule
mononucleate e gliosi. In 4 casi si sono evidenziate aree
malaciche con presenza di gitter cells, ed un soggetto di questi
presentava anche numerosi neutrofili. Nove esemplari sono
risultati positivi al test della PCR per la presenza di Toxoplasma
gondi, 6 di questi mostravano lesioni neuropatologiche
aspecifiche e 2 soggetti presentavano cisti parassitarie;
l’esame immunoistochimico per Toxoplasma gondi condotto su
questi ultimi ha confermato le positività ottenute.
Due animali con lesioni neuropatologiche sono risultati positivi
all’IHC e al RTPCR per Morbillivirus. In 1 di questi 2 soggetti è
stata inoltre osservata una coinfezione con Toxoplasma gondi.
L’esame batteriologico non ha permesso di isolare alcun
batterio, Brucella spp. incluso. L’esame immunoistochimico per
la presenza della PrPsc è risultato negativo in tutti i campioni.
Il presente studio, focalizzato sulla descrizione delle lesioni
Autolisi
307
CARATTERIZZAZIONE PROTEOMICA DI BRUCELLA SUIS PER L’IDENTIFICAZIONE
DI TARGET ANTIGENICI PROTEICI DA IMPIEGARE AD USO DIAGNOSTICO
Krasteva I. 1, Travaglini D. 1, Smith D.G.E. 2, Inglis N. 2, Tittarelli M. 1 & Sacchini F. 1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise “G. Caporale”, via Campo Boario 64100, Teramo
2
Moredun Research Institute, Pentlands Science Park, Penicuik, Mid Lothian, UK
immunogenicità è già stata descritta in letteratura per altre
Brucelle diverse da B. suis (1, 4, 6)
Ulteriori studi sono ora necessari per valutare l’utilizzo delle
proteine target identificate, come antigeni ricombinanti per lo
sviluppo di nuovi test diagnostici per la diagnosi di B. suis.
Tabella 1. Localizzazione cellulare delle proteine identificate
secondo il software PSORTb Version 3.00.
Key words: Brucella suis; proteomic; mass spectrometry
SUMMARY
Porcine brucellosis is a disease caused by Brucella suis affecting
domestic and feral pigs but it can also induce pathology in humans.
Currently available serological tests are based on Brucella S-LPS
but cross-reaction with S-LPS of Y. enterocolitica O:9 results in
false positive serological reaction. As a consequence, results
interpretation, based on serology only, may be very challenging
and research of new candidate diagnostic antigens, distinct from
LPS, is necessary. In order to identify non cross-reacting protein
antigens, we characterized the enriched cell envelop fraction
of B. suis bv. 1 and 3 and of Y. enterocolitica O:9 using SDSPAGE analysis combined with LC-ESI-MS/MS. 103 proteins for
B. suis bv.1, 114 proteins for B. suis bv. 3 and 82 proteins for
Y. enterocolitica O:9 were identified. Among them, 3 proteins
(Omp25, Omp28, GroES) were selected as candidate targets
specific for Brucella, since they are common to 2 B. suis and not
to Y. enterocolitica.
INTRODUZIONE
La Brucellosi suina è una zoonosi causata dalla Brucella suis
biovar 1, 2 e 3, tra le quali le biovarianti 1 e 3 sono particolarmente
patogene per l’uomo (2, 9). Sebbene la lotta alla Brucellosi
sia da anni una delle priorità veterinarie nazionali, il quadro
epidemiologico di Brucella suis è piuttosto incompleto, non solo
nel territorio italiano ma nell’intera Unione Europea, anche a
causa dell’assenza di piani di sorveglianza. Inoltre, le metodiche
indirette per la diagnosi sierologica di brucellosi, normalmente
impiegate nella specie bovina e ovi-caprina (Siero agglutinazione
rapida, Fissazione del Complemento ed ELISA), presentano
notevoli problematiche quando applicate alla specie suina. Ad
oggi, nessuno dei test sierologici convenzionali, suggeriti dall’OIE,
si è dimostrato completamente affidabile per l’individuazione dei
singoli soggetti positivi. Pertanto, tali test sono efficaci quando
utilizzati nello screening di massa per l’identificazione degli
allevamenti infetti mentre presentano problemi di specificità
quando impiegati per l’identificazione del singolo capo positivo.
Tale limite è dovuto principalmente al fatto che metodi indiretti
impiegati per la diagnosi di B. suis si basano sulla determinazione
di anticorpi diretti contro componenti della membrana esterna,
tra i quali l’antigene lipopolisaccaridico (LPS) rappresenta la
componente quali-quantitativa più importante (3). Tuttavia, tale
componente è sostanzialmente simile a quella presente in vari
batteri Gram negativi, primi fra tutti Yersinia enterocolitica O:9,
ampiamente diffusa negli allevamenti suini e causa di cross
reattività sierologiche e pertanto di falsi positivi (7, 9). Da qui la
necessità di indirizzare ricerche verso l’identificazione di antigeni
più specifici. Possibili alternative all’s-LPS sono rappresentate
dalle proteine della membrana più esterna (OMP) e dalle
proteine citoplasmatiche. In tale contesto si colloca il presente
studio il cui obiettivo è stato quello di caratterizzare una frazione
arricchita di proteine di membrana e citoplasmatiche di B. suis
e Y. enterocolitica al fine di identificare target antigenici proteici
(non cross-reattivi) da impiegare ad uso diagnostico.
MATERIALI E METODI
Lo studio è stato condotto su 2 ceppi di Brucella suis – B. suis
bv. 1 (NCTC 10316, ceppo 1330), B. suis bv. 3 (NCTC 10511,
ceppo 686) e un ceppo di Y. enterocolitica O:9 (NCTC 11174). La
frazione arricchita di proteine di membrana e citoplasmatiche,
purificate in seguito ad applicazione del metodo descritto da
Connolly et al. (5), sono state separate mediante SDS-PAGE e
successivamente sottoposte ad analisi mediante spettrometria
di massa (LC-ESI-MS/MS).
I dati grezzi ottenuti dall’analisi spettrometrica di massa sono
stati caricati sulla piattaforma informatica MASCOT e mediante
l’algoritmo di ricerca della piattaforma è stata eseguita un’analisi
crociata con il database contenente le sequenze genomiche
note di B. suis e Y. enterocolotica. I dati MS/MS sono stati
interpretati e presentati secondo linee guida pubblicate (10).
Per valutare e confrontare la localizzazione cellulare delle
proteine identificate per i due ceppi di B. suis e per il ceppo di Y.
enterocolitica è stato utilizzato il software PSORTb version 3.0.
Inoltre, le proteine individuate sono state analizzate mediante
il software Basic Local Alignment Search Tool (NCBI BLASTP,
versione 2.2.27), al fine di verificare eventuali omologie delle
sequenze proteiche identificate tra i 2 ceppi di B. suis e tra le B.
suis e la Y. enterocolitica.
Le analisi delle proteine di membrana condotte mediante LCESI-MS/MS hanno permesso di identificare 103 proteine per
B. suis 1330 biovar 1, 114 proteine di B. suis 686 biovar 3 e 82
proteine di Y. enterocolitica O:9. Lo studio della localizzazione
cellulare delle proteine identificate mediante software PSORTb
ha evidenziato una distribuzione molto simile per le due B. suis
mentre la maggiore differenza con Y. enterocolitica si osserva
per “Uknown proteins” e “Outer membrane proteins” (Tab.1).
Per tutti i ceppi analizzati circa il 50% delle proteine identificate
sono state classificate come citosoliche (Tab.1).
Di tutte le proteine identificate, 56 sono risultate comuni ai 2
ceppi di B. suis mentre un totale di 39 proteine sono risultate
comuni ai due ceppi di B. suis e a Y. enterocolitica. In particolare
36 proteine sono presenti in B. suis 1330 e 25 in B. suis 686,
mentre 22 proteine di Y. enterocolitica O:9 sono rinvenibili in
entrambi i ceppi di B. suis. Delle proteine identificate, 13 sono
descritte in letteratura come immunogene e tra queste, 10 sono
risultate immunogene per B. suis 686 bv. 3; 10 sono risultate
immunogene per B. suis 1330 bv. 1 (Tab.2). Sette proteine
sono comuni alle 2 Brucelle e 4 di queste sono comuni anche
a Y. enterocolitica. Le 3 proteine comuni alle 2 Brucelle e non
a Y. enterocolitica sono: omp25 gene product, omp28 gene
product and groES gene product. In un precedente studio è
stato dimostrato che Omp28 gene product (Tab. 2, ID prot.
2), anche nota come Bp 26, è una proteina presente in B.
melitensis, B. ovis, B. suis e B. canis ma non in Y. enterocolitica
(8). Per quanto riguarda le altre 2 proteine, la omp25 (Tab. 2,
ID prot. 1) e la chaperonin groES (Tab. 2, ID prot. 3), la loro
308
Protein
localisation
Unknown % (n.
of proteins)
Periplasmic % (n.
of proteins)
B.suis
1330
bv.1
19%
(20)
9%(9)
B.suis
686
bv.3
17%
(19)
10%
(11)
Y.enterocolitica
6% (5)
6% (5)
Outer membrane
% (n. of proteins)
11%
(11)
11%
(13)
27% (22)
Cytoplasmic
membrane % (n.
of proteins)
6% (6)
5% (6)
13% (11)
1% (1)
1% (1)
no
54%
(56)
56%
(64)
48% (39)
Extracellular %
(n. of proteins)
Cytoplasmic %
(n. of proteins)
BIBLIOGRAFIA
1. Al Dahouk S, Nöckler K, Scholz HC, Tomaso H,
Bogumil R, Neubauer H, 2006. Immunoproteomic
characterization of Brucella abortus 1119-3 preparations
used for the serodiagnosis of Brucella infections. J
Immunol Methods;309(1-2):34-47.
2. Billard E, Dornand J, Gross A, 2007. Interaction of Brucella
suis and Brucella abortus rough strains with human
dendritic cells. Infect and Immun:75(12):5916–5923.
3. Cardoso PG, Macedo GC, Azevedo V, Oliveira SC, 2006.
Brucella spp non canonical LPS: structure, biosynthesis,
and interaction with host immune system. Microb Cell
Fact;5:13.
4. Cloeckaert A, Vizcaíno N, Paquet JY, Bowden RA,
Elzer PH, 2002. Major outer membrane proteins
of Brucella spp.: past, present and future. Vet
Microbiol;90(1-4):229-47.
5. Connolly JP, Comerci D, Alefantis TG, Walz A, Quan M,
Chafin R, Grewal P, Mujer CV, Ugalde RA, DelVecchio
VG, 2006. Proteomic analysis of Brucella abortus
cell envelope and identification of immunogenic
candidate
proteins
for
vaccine
development.
Proteomics;6(13):3767-80.
6. Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor
C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N, 2009.
Analysis of the occurrence and distribution of the
Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six
classical Brucella species. Vet Microbiol;137(1-2):74-82.
7. Nielsen K, Smith P, Yu W, Nicoletti P, Jungersen G, Stack
J, Godfroid J, 2006. Serological discrimination by indirect
enzyme immunoassay between the antibody response
to Brucella spp. and Yersinia enterocolitica O:9 in cattle
and pigs. Vet Immunol and Immunopathol;109:69-78.
8. Rossetti OL, Arese AI, Boschiroli ML, Cravero SL, 1996.
Cloning of Brucella abortus gene and characterization
of expressed 26-kilodalton periplasmic protein: potential
use for diagnosis. J Clin Microbiol; 34(1):165–169.
9. Scientific Opinion of the Panel on Animal Health and
Welfare (AHAW) on a request from the Commission
on porcine brucellosis (Brucella suis), 2009. EFSA
Journal;1144:1-112.
10. Taylor GK, Goodlett DR, 2005. Rules governing protein
identification by mass spectrometry. Rapid Commun
Mass Spectrom;19(23):3420.
Tabella 2. Proteine con proprietà immunogene identificate per i due ceppi di B. suis 1330 bv. 1 e 686 bv. 3 con i risultati
delle analisi BLAST per valutare le cross-reattività con Y. enterocolitica.
ID
prot.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Accession n.
Protein identification
B. suis
686 bv.3
B. suis
1330 bv.1
EEY32365
NP_697715
outer-membrane immunogenic protein
omp25 gene product
√
√
EEY33103
NP_698471
EEY30875
|NP_699397
NP_698249
EEY33617
EEY33510
NP_697653.1|
EEY33241
NP_698612
EEY31096
NP_699613
NP_697090
EEY32546
EEY30874
NP_699396
periplasmic immunogenic protein
omp28 gene product
chaperonin
groES gene product
rplL gene product
surface antigen
hsp70-like protein
omp2b gene product
outer membrane protein 31b
omp31-1 gene product
outer-membrane immunogenic protein
omp31-2 gene product
hypothetical protein
immunogenic membrane protein yajC
chaperonin
groEL gene product
DNA-directed RNA polymerase subunit
alpha
rpoA gene product
√
√
np
√
√
np
√
√
np
√
√
√
√
√
np
np
√
√
√
√
np
EEY32855
NP_698213
309
√
√
√
Yersinia enterocolitica
Aminoacid
Accession n.
Coverage %
np
np
np
np
np
np
ADZ41620
ADZ41941
ADZ43440
ADZ42802
ADZ43507
ADZ41474
ADZ41594
22
34
37
23
19
67
87
ADZ40874
96
ADZ44110
99
RILIEVI ANATOMOPATOLOGICI IN CASO DI AVVELENAMENTO DOLOSO NELLE
PROVINCE DI FIRENZE, PRATO E PISTOIA
Lombardo A.1, Ambrogi C.2, Corrias F. 1, Ragona G.1, Fico R.3, Brajon G.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Sezione di Firenze
2
Corpo Forestale dello Stato – UTB di Lucca
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Centro di Referenza Nazionale per la Medicina
Forense Veterinaria
1
Key words: poisoning, necropsy, pathological lesions
SUMMARY
From January 2010 to December 2012, 117 carcasses from
Florence, Prato and Pistoia were necropsied and found positive at
toxicological tests (zinc phosphide, anticoagulants, metaldehyde,
organophosphate, organochlorine and carbamates pesticides,
strychnine). The aim of this study was to trace back the lesions linked
to the most common baits detected. The observed pathological
lesions were non pathognomonic; however, the authors concluded
that: 1) pulmonary and gastrointestinal hemorrhages seem to be
consistent with poisoning; 2) hemorrhagic gastroenteritis may
differentiate zinc phosphide and anticoagulant poisonings; 3)
pulmonary edema was not observed in anticoagulant poisoning; 4)
spleen congestion is rare in pesticides poisoning; 5) the presence
of the bait in the stomach allows an easier diagnosis; 6) a standard
classification of the lesions is essential to collect data leading to
the right toxicological diagnostic pathway.
laboratorio, indicando gli organi colpiti e il tipo di lesione riscontrata.
Qualora ritenuti opportuni, sono stati svolti esami batteriologici,
virologici ed istopatologici volti ad escludere la presenza di altre
patologie concomitanti. In base all’anamnesi riferita e alle lesioni
riscontrate è stato effettuato il prelievo delle matrici idonee e in
quantità sufficiente per la ricerca del veleno con le metodiche in
uso presso i nostri laboratori (2). Le lesioni anatomopatologiche
osservate sono state classificate attraverso un glossario che
comprende ulteriori descrizioni del quadro anatomo-patologico
(tabella 1).
Tabella 1 – Classificazione delle lesioni anatomo-patologiche
osservate in 117 casi (2010-2012)
Classificazione
della lesione
Congestione viscerale
INTRODUZIONE
L’uso di esche e bocconi avvelenati è un fenomeno piuttosto
comune in Italia. In Toscana, dal 2004 al 2009 sono stati segnalati
2683 casi di sospetto avvelenamento e/o di esche avvelenate con
1527 conferme (56,9%) (2). l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale
è dal 2001 l’Ente preposto allo svolgimento degli accertamenti di
laboratorio (3,4,5). La diagnosi di avvelenamento presenta alcune
difficoltà per il numero elevato di veleni reperibili sul mercato
che hanno diverse azioni sul bersaglio. Una corretta valutazione
anamnestica, clinica e anatomopatologica rappresenta dunque
il presupposto per orientare in maniera efficace le successive
analisi chimico-tossicologiche di conferma. Tuttavia, i sintomi
clinici e le lesioni anatomo-patologiche causate dai diversi veleni,
spesso usati in associazione, ostacolano il percorso diagnostico.
Inoltre, la natura di alcune molecole e il loro comportamento
tossicocinetico (rapido metabolismo, azione lenta, emesi che fa
smarrire l’eventuale esca ingerita ecc.) complicano ulteriormente il
percorso diagnostico. Infine, i dati presenti in letteratura riguardanti
le lesioni anatomopatologiche nei casi di avvelenamento acuto
sono spesso frammentari e aspecifici (1,7). Scopo del presente
lavoro è definire una metodologia di classificazione delle lesioni
anatomopatologiche negli animali avvelenati e utilizzarle per
la diagnosi differenziale tra i vari tipi di veleni da confermare
attraverso le analisi chimico-tossicologiche.
MATERIALI E METODI
Sono stati inclusi nello studio 117 animali deceduti nelle
provincie di Firenze, Prato e Pistoia (51 cani, 49 gatti, 2 volpi, 3
piccioni, 10 storni, 1 cinghiale, 1 istrice) con diagnosi accertata
di avvelenamento, nel periodo compreso tra Gennaio 2010 e
Dicembre 2012. Le carcasse sono pervenute ai nostri laboratori
corredate di scheda anamnestica e di segnalamento, ai sensi
della normativa vigente (3,4,5). Le carcasse sono state sottoposte
a necroscopia diagnostica secondo le procedure in uso presso il
Cianosi delle mucose
apparenti
Petecchie e soffusioni
sottocutanee
Emoperitoneo,
emopericardio,
emotorace
Emorragie
dell’apparato
respiratorio
Edema polmonare
Gastro-enterite
emorragica
Lesioni pancreatiche
Lesioni renali
Lesioni epatiche
Lesioni spleniche
Ulteriore descrizione del quadro
antomo-patologico
RISULTATI
Tutti gli animali pervenuti si presentavano in buone condizioni
generali e la morte è risultata un evento improvviso e non
ascrivibile a stati patologici pregressi. Ogni animale reclutato nello
studio è risultato positivo ad un solo tipo di veleno. In tabella 2
si osserva che le lesioni riscontrate sono sovrapponibili negli otto
tipi di veleni rilevati (fosfuro di zinco, metaldeide, anticoagulanti,
pesticidi organoclorurati, organofosforici e carbamati, stricnina).
Solo nel 40,2% dei casi, nel contenuto gastrico, era presente il
veleno macroscopicamente evidente (cfr. metaldeide di colore
bluastro o fosfuro di zinco in polvere nera).
Tabella 2 – Frequenza delle lesioni per tipologia di veleno
rilevato (numero casi e percentuale)
Tipologia
a
tossico
PZn
MET
AC
Numero casi
59
25
16
Congestione
viscerale
Cianosi
mucose
apparenti
Petecchie/
soffusioni
sottocutanee
Emoperitoneo/
emopericardio/
emotorace
Emorragie
all'apparato
respiratorio
Edema
polmonare
Gastro-enterite
emorragica
19
(32,2%)
5
(20,0%)
4
(25,0%)
5
(8,5%)
1
(4,0%)
0
12
(20,3%)
4
(16,0%)
39
(66,1%)
Lesioni
pancreatiche
Quadro congestizio sistemico
osservabile in tutti gli organi e visceri
Soffusioni e petecchie pleuriche,
emorragie polmonari parenchimali,
emorragie tracheo-bronchiali.
Pancreatite, congestione e petecchie.
Congestione renale, petecchie del
bacinetto, glomerulonefrite, nefrite
interstiziale, sclerosi e altre nefropatie
non indagate istologicamente.
Congestione, epatomegalia, steatosi,
focolai di necrosi, angiocolite.
Congestione splenica, splenomegalia,
infarti
Sangue ipocoagulabile
Svuotamento delle cavità cardiache e
dei grossi vasi, mancanza di coaguli,
eccessivo sanguinamento da tagli
autoptici
Anomalie del contenuto
gastrico e intestinale
Presenza di esche ancora riconoscibili,
granulazioni di colore, aspetto o odore
caratteristico nel contenuto gastrico,
dell’ingluvie o intestinale.
OC
OF
CA
STR
TOT
5
5
4
3
117
3
(60,0%)
4
(80,0%)
3
(75,0%)
1
(33,3%)
39
(33,3%)
1
(20,0%)
1
(20,0%)
1
(25,0%)
0
9
(7,7%)
1
(6,3%)
1
(20,0%)
0
0
0
18
(15,4%)
5
(20,0%)
7
(43,8%)
1
(20,0%)
0
0
1
(33,3%)
53
(45,3%)
59
(100%)
15
(60,0%)
16
(100%)
4
(80,0%)
0
1
(25,0%)
1
(33,3%)
96
(82,1%)
12
(20,3%)
59
(100%)
1
(4,0%)
15
(60,0%)
39
(66,1%)
3
(60,0%)
1
(25,0%)
2
(50,0%)
2
(66,7%)
15
(12,8%)
88
(75,2%)
2
(40,0%)
2
(40,0%)
2
(50,0%)
1
(33,3%)
60
(51,3%)
1
(6,3%)
4
(25,0%)
2
(40,0%)
2
(40,0%)
1
(20,0%)
1
(20,0%)
3
(75,0%)
3
(75,0%)
2
(8,0%)
1
(6,3%)
0
0
0
0
13
(11,1%)
0
2
(12,5%)
0
0
0
0
15
(12,8%)
10
(40,0%)
1
(6,3%)
3
(60,0%)
2
(40,0%)
3
(75,0%)
0
47
(40,2%)
3
(18,8%)
1
(20,0%)
4
(80,0%)
13
(52,0%)
1
(6,3%)
Lesioni
epatiche
31
(52,5%)
10
(16,9%)
13
(52,0%)
4
(16,0%)
Lesioni
spleniche
10
(16,9%)
Lesioni renali
-
Le frequenze osservate per associazione tra tipo di veleno rilevato
nelle matrici analizzate e classificazione della lesione anatomopatologica sono state confrontate per identificare, dove possibile,
un panel di lesioni caratterizzante ogni tipo di veleno.
310
Sangue
13
ipocoagulabile (22,2%)
Anomalie
contenuto
gastrico
28
(45,7%)
0
0
0
0
0
51
(43,6%)
24
(20,5%)
PZn=fosfuro di zinco; MET=metaldeide; AC=anticoagulanti;
OC=pesticidi organoclorurati; OF=pesticidi organofosforici; CA=
pesticidi carbamati; STR=stricnina.
a
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Il limitato numero di osservazioni non consente una valutazione
statistica dei risultati.
Infatti, dall’indagine effettuata è possibile evidenziare alcune
lesioni differenziali che saranno verificate su una casistica più
ampia. Fra le lesioni tipiche riscontrate le emorragie dell’apparato
respiratorio (96%) e le gastroenteriti emorragiche (88%) sono
quelle maggiormente rappresentate. In assenza di queste lesioni
una diagnosi di avvelenamento si può ritenere poco probabile.
Le emorragie dell’apparato respiratorio sono state osservate nel
100% dei casi di avvelenamento sia da fosfuro di zinco che da
anticoagulanti. L’ipocoagulabilità del sangue è presente soltanto
in queste due tipologie di avvelenamento, sebbene alcuni Autori
la associno anche alla stricnina (1); quest’ultimo aspetto non è
valutabile a causa della ristretta casistica osservata per questo
veleno. L’azione emorragica del fosfuro di zinco è probabilmente
dovuta all’attività endotelio-tossica delle fosfine che si liberano
con l’acidità gastrica. Infatti, la gastroenterite emorragica è
presente in tutti i casi di avvelenamento da fosfuro di zinco, ma
solo nel 18,8% di quelli da anticoagulanti; questa lesione potrebbe
essere considerata un possibile parametro differenziale tra i due
veleni. Altri caratteri differenziali, riportati in letteratura come tipici
dell’avvelenamento da anticoagulanti (emorragie nelle cavità
sierose, nel sottocute e della compagine muscolo-tendinea)
(1,2) sembrano essere meno discriminanti. L’edema polmonare,
ampiamente documentato in letteratura (1,2,6,7), non è mai stato
riscontrato nei 16 casi di avvelenamento da anticoagulanti ed
è poco frequente nei 25 casi di avvelenamento da metaldeide
(4,0%). Si conferma quanto riportato in letteratura riguardo agli
avvelenamenti da pesticidi, laddove i quadri anatomopatologici
sono simili tra loro, ad eccezione di una maggior frequenza di
petecchie e soffiusioni sottocutanee in corso di avvelenamento da
organoclorurati. Le lesioni spleniche non sono mai state osservate
in corso di avvelenamento da pesticidi e stricnina come pure la
congestione splenica che è descritta in corso di avvelenamento
da organoclorurati (1); occorre pertanto un campionamento più
ampio per poter meglio indagare quest’associazione e stabilirne
il valore diagnostico. Com’è noto, un elemento differenziale
molto utile è la presenza di parti di esca nel materiale gastrico
o nell’intestino: tale reperto permette la visualizzazione diretta
del veleno e orienta facilmente le successive analisi. In accordo
con altri autori (7), il reperto di esche ancora riconoscibili o di
altre colorazioni anomale del materiale gastrico è stato registrato
nel 40% dei casi, è influenzato dalla fisiopatologia dell’animale
avvelenato (emesi o peristalsi accentuate) e dalle caratteristiche
di alcune sostanze ad azione ritardata, come gli anticoagulanti.
In conclusione, l’esame anatomopatologico in caso di sospetto
avvelenamento acuto rappresenta un utile strumento per la
diagnosi differenziale di morte e per orientare le successive
analisi chimico tossicologiche. Le osservazioni preliminari di
questo lavoro consentono al momento di formulare le seguenti
conclusioni: 1) in assenza di emorragie dell’apparato respiratorio
e gastroenterite emorragica la diagnosi di avvelenamento è
poco probabile; 2) la gastroenterite emorragica rappresenta un
parametro differenziale tra avvelenamento da fosfuro di zinco
ed anticoagulanti; 3) l’edema polmonare non è stato accertato
in caso di avvelenamento da anticoagulanti; 4) la presenza
di lesioni spleniche non è comune in corso di avvelenamento
da pesticidi; 5) il reperto di esche nello stomaco facilita la
diagnosi differenziale; 6) è necessario adottare un sistema di
classificazione omogeneo delle lesioni anatomopatologiche al
fine di raccogliere più dati utilizzabili per il percorso diagnostico
chimico tossicologico.
BIBLIOGRAFIA
1.AA.VV. (2010). Manuale operativo per la gestione veternaria
di casi di sospetto avvelenamento di animali selvaitici e
domenstici. A cura del centro di referenza nazionale per la
medicina forense veterinaria, IZSLT.
2.Corrias F. (2009). L’avvelenamento doloso degli animali.
Regione Toscana: Dalla salute degli animali, alimenti sicuri
per i cittadini. Attività del sistema veterinario regionale.
pag.60-62.
3.Legge 39/2001 della Regione Toscana, in materia di uso e
detenzione di esche e bocconi avvelenati.
4.ORDINANZA 18 dicembre 2008. Norme sul divieto di utilizzo
e di detenzione di esche o di bocconi avvelenati.
5.ORDINANZA 10 gennaio 2012. Norme sul divieto di utilizzo e
di detenzione di esche o di bocconi avvelenati.
6.Mengozzi G. e Soldani G. (2010). Tossicologia veterinaria.
Idelson-Gnocchi.
7.Zoppi S., Bergagna S., Rossi F. et al. (2009). L’esame
necroscopico come screening per la diagnosi di
avvelenamento acuto negli animali: correlazioni tra quadri
anatomopatologici e determinazioni tossicologiche. Atti
convegno SiDiLV, pag. 45-46.
311
A SURVEY FOR YESSOTOXIN IN SHELLFISH FARMED AND MARKETED IN THE
SARDINIA REGION IN 2013
Lorenzoni G., Arras I., Sanna G., Mudadu A., Muzzigoni C., Tedde G., Santucciu C., Nicolussi P., Marongiu E., Virgilio S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Via Duca degli Abruzzi, 8 – 07100 Sassari
Key words: shellfish, yessotoxin, Sardinia
SUMMARY
In this paper we report the results of Yessotoxin (YTX) survey
carried out by mouse bioassays (MBA) (1), on 638 samples of
bivalve molluscs farmed and marketed in Sardinia region from
January to August 2013. A number of 5 samples were found
positive for mouse tests, however, only 3 were confirmed by
liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS/MS) by
National Laboratory Reference (NLR) for marine biotoxins of
Cesenatico.
Positivity for Yessotoxin in bivalve molluscs was noticed for the
first time in Sardinia in April 2013.
INTRODUCTION
Lipophilic marine biotoxins can be accumulated, under specific
conditions, in different molluscan shellfish presenting a health
risk to humans if shellfish contaminated are consumed. To protect
public health, monitoring programmes for marine biotoxins have
been established in many countries for detecting the presence of
these compounds in shellfish tissues.
The lipophilic toxin group includes the classic diarrheic shellfish
poisoning toxins (DSP): okadaic acid (OA) and dinophysistoxins
(DTXs); as well as pectenotoxins (PTXs), yessotoxins (YTXs)
and azaspiracids (AZAs) (1).
Yessotoxin (YTX) and their analogues are a group of structurally
related polyether toxins produced by the dinoflagellates
Protoceratium reticulatum, Lingulodinium polyedrum, and
Gonyaulax spinifera. The bivalve molluscs, can accumulate
high quantities of YTX due to their filtering feeding nature. Low
concentrations of cells are enough to produce the accumulation
of high quantities of toxin in shellfish. YTX has been associated
with diarrhoetic shellfish poisoning (DSP) because it was
simultaneously extracted with DSP toxins (11). Recent evidences
suggest that YTX, unlike okadaic acid and dinophysistoxin, does
not cause diarrhoea or inhibition of protein phosphatases, hence,
it should be excluded from the DSP toxin group. No human cases
of intoxication have been reported to date, thus, symptoms
of intoxication produced by YTX in humans are unknown.
Toxicological studies carried out in rodents showed that YTX is
highly toxic if injected intraperitoneally to mouse (5).
Following injection of lethal doses of YTX in mice observed
symptoms were: restless, dyspnea, jumping, shivering and
cramps. Electron microscopy studies revealed that the toxin
produces damage in the cardiac muscle, as well as in the liver
and pancreas. YTX is not lethal to mice after oral administration.
Neither diarrhoea nor digestive organ damage have been
observed (3). YTX was first isolated in 1986 in Mutsu Bay, Japan
(4) from the digestive gland of Patinopecten yessoensis, a scallop
that gave its name to the toxin. YTX was identified in Mytilus
galloprovincialis from the Adriatic Sea in Italy (2) and often, along
the Adriatic coast, farming areas are closed in certain periods
of the year due to the presence of YTX beyond the limits. The
Regulation (EC) No 853/2004 established the maximum levels
of some marine biotoxins in molluscs for human consumption
(7). Actually the official method accepted to detect YTX is still the
mouse bioassay (MBA) (8).
Recently the Commission Regulation (EU) No 15/2011 of
10 January 2011 amended the previous Regulation (EC) No
2074/2005 as regards recognised testing methods for detecting
marine biotoxins in live bivalve molluscs and established that
a liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS/MS)
method will be applied as the reference method. However, to
allow Member States to adapt their methods to the chemical
method, the biological methods should continue to be used for a
limited period of time (until 31 December 2014) (9).
Commission Regulation (EU) No 786/2013 of 16th of August
2013 amending Annex III to Regulation (EC) No 853/2004 of
the European Parliament and of the Council as regards the
permitted limits of yessotoxins in live bivalve molluscs. The limit
for yessotoxins was increased from 1 milligram to 3,75 milligrams
of yessotoxin equivalent per kilogram (10).
The objectives of our paper was to report the activities
contemplated in the Regional Plans in Sardinia (6) to verify the
respect of biotoxicological requirements for the YTX indicated
in the Reg. CE n 853/04, in a representative bivalve mollusc
sample collected in breeding areas and retailed in Sardinia.
MATERIALS AND METHODS
A plan of sanitary control of production and marketing of
molluscs, and of periodic monitoring of shellfish farming areas
is in force in Sardinia Region. All activities are coordinated
by the Prevention Department of the Region of Sardinia and
implemented by Veterinary Services of Aziende Sanitarie Locali
(ASLs), Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna (IZS)
and Department of botany and plant ecology at the University
of Sassari. The Regional Plan, for regarding the monitoring,
provides a) the control of potentially toxic algae eventually present
in breeding waters, b) detection and quantification of toxin in
bivalve molluscs live in breeding, c) sampling almost every 15
days both water and molluscs. Frequency change according to
periodic risks evaluation related to the presence of harmful algal
species and toxin levels observed in shellfish. Samples, weight 4
kg, were made up of several ‘elementary samples’, coming from
every single point of the monitoring station. In particular, in case
of breeding areas that use complete water column, sampling
was performed at 3 depth levels (bottom, middle and 50 cm from
the surface) while, in case of long line rows, samples were taken
from several points.
Samples from monitoring stations were properly identified,
refrigerated delivered to the Laboratory and analyzed within 24
hours of collection. For potentially toxic algae monitoring, samples
have been collected by a special net equipped with a binder
goblet drawn from the bottom to the surface to be representative
of the water column and to provide information about presence of
toxigenic species and population trends. Regarding the sanitary
control, the main objective of the Regional Plan is verification of
compliance with microbiological and chemical requirements both
in production and marketing (6).
A total amount of 638 bivalve mollusc samples was analysed for
the lipophilic toxins presence by using the MBA (AESAN EU – RL
MB Lipophilic toxins Version 5 June 2009) (1) from January to
August 2013.
312
Briefly, the lipid extracts preparation from molluscs for MBA:
the homogenate (100 g) of mussels was mixed with 300 ml of
acetone in Ultra-Turrax, filtered on filter paper and re-extracted
with 200 ml of acetone. The acetone supernatants were mixed
then evaporated, yielding a residue. The residue, recovered
with 30 ml of dichloromethane and 60 ml of methanol (60%
v/v) was subjected to partition by the separating funnel; the
methanol phase was stored and the dichloromethane phase
was re-extracted twice with 60 ml of methanol (60% v/v). For
both extracts, solvent is evaporated and the resultant residue
suspended in aqueous solution of 1% Tween 60. One ml of
each extract was injected intraperitoneally into albino mice swiss
strain weighing between 19 g and 21 g for the dichloromethane
extract (investigation of OA-toxins group, PTX group and AZA
group); the death of 2 out of 3 injected mice, within a 24 hours
observation period, constitutes a positive result. In the case of
the methanolic extract (investigation of YTX group), the death
of 2 out of 3 injected mice, within a 6 hours observation period,
constitutes a positive result for the presence of YTXs (1).
RESULTS AND CONCLUSIONS
Table 1 shows the number of mollusc samples analyzed for
Lipophilic biotoxins from January to August 2013, relating to
each ASL, number of samples analyzed in Monitoring and
Sanitary Control, their positivity for YTX, number of negative
samples and the percentage of positivity.
Table 1 – Lipophilic biotoxins biotoxicological determination in
bivalve molluscs by MBA collected by ASLs of Sardinia from
January to August 2013 (Monitoring and Sanitary Control)
A.S.L.s
n.
n.
n.San. n.
n.
N°
tot.
Monit. Contr
YTX pos. neg.
samp. samp. samp. samp.
samp.
1 Sassari
2 Olbia
3 Nuoro
4 Lanusei
5 Oristano
6 Sanluri
7.Carbonia
8 Cagliari
Total
samples
% pos./tot.
4
191
7
55
110
8
21
242
638
0
175
0
45
98
0
6
205
529
4
16
7
10
12
8
15
37
109
0
3
0
0
0
0
1
1
5
4
188
7
55
110
8
20
241
633
0.8%
-
-
-
-
Table 2 shows for each YTX positive sample, sample type,
identification number, origin, date of sampling, time of death of
mice and YTX concentration in mg/kg edible part analyzed by
method LC-MS/MS.
Table 2 – Positive results of YTX in bivalve molluscs analysed
by MBA and LC-MS/MS analysis
Type of
samples and
identification
number
Mussels
32378
Mussels
32517
Mussels
34069
Mussels
36814
Mussels
38826
Origin and
sampling
date
Olbia
03/04/2013
Carbonia
03/04/2013
Olbia
08/04/2013
Cagliari
17/04/2013
Olbia
22/04/2013
Mouse test
and time of
death (limit
6 hours)
Mg of YTX/
kg e.p. (limit
1 mg/kg)
‹ 6 hours
1,53
‹ 6 hours
1,37
‹ 6 hours
1,03
‹ 6 hours
0,97
‹ 6 hours
0,77
We analyzed 638 bivalve mollusc samples, 5 of them were
positive for mouse test, they were sent to the National
Reference Laboratory for marine biotoxins for confirmation with
LC-MS/MS method. As showed in Table 2, only 3 of the positive
samples at mouse tests have exceeded the limit of 1 mg / kg
of edible portion.
The Regulation (EC) 15/2011 indicates the LC-MS/MS method
as reference method for the detection of marine Lipophilic
biotoxins.
Positivity for Yessotoxin in bivalve molluscs was noticed for the
first time in Sardinia in April 2013.
European Food Safety Authority (EFSA) adopted an Opinion
of the Scientific Panel on Contaminants in the Food chain on
a request from the European Commission on marine biotoxins
in shellfish for yessotoxin group. According to that Opinion, in
a serie of acute toxicity studies following oral administration of
yessotoxins, no lethality and no clinical signs of toxicity were
observed. In addition, EFSA concluded that shellfish should not
contain more than 3,75 milligrams of yessotoxin equivalent for
kilogram.
That level is above the current limit indicated in the Regulation
(EC) No 853/2004. The Commission Regulation (EU) No
786/2013 of 16th of August 2013 is in force from 6th of September
2013. consequently, according with the current legislation,
today, the samples analyzed in April 2013 would be negatives
and were compliant with this low.
REFERENCES
1. EU Harmonised Standar Operating Procedure for
detection of Lipophilic toxins by Mouse Bioassay –
Communitty Reference Laboratory on marine biotoxins
Version 5, June 2009.
2.Ciminiello P., Dell’Aversano C., Fattorusso E., Forino
M., Tartaglione L., Boschetti L., Rubini S., Cangini M.,
Pigozzi S., Poletti R. 2010. Complex toxin profile of
Mytilus galloprovincialis from the Adriatic Sea revealed
by LC–MS. Toxicon 55, 280–288.
3. Dominguez H.J., Paz B., Daranas A.H., Norte M.,
Franco J.M., Fernandez J.J. 2010.Dinoflagellate
polyether in the yessotoxin, pectenotoxin and okadaic
acid toxin groups: Characterization, analysis and human
health implications. Toxicon 56,191–217.
4. Murata M., Masanori K., Lee J.S., Yasumoto T. 1987.
Isolation and structure of Yessotoxin, a novel polyether
compound implicated in diarrhetic shellfish poisoning.
Tetrahedron Lett. 28, 5869–5872
5. Paz B., Daranas A.H., Norte M., Riobo P., Franco J.M.,
Fernandez J.J. 2008. Yessotoxins, a group of marine
polyether toxins: an overview. Mar. Drugs 6, 73–102.
6. Piano regionale per la vigilanza ed il controllo
sanitario della produzione e commercializzazione dei
molluschi bivalvi vivi e per il monitoraggio periodico delle
zone di produzione e di stabulazione di molluschi bivalvi
vivi, Anno 2011, (Regione Autonoma della Sardegna Direzione generale della Sanità- Prot. del 18/02/2011 nr.
0004212/Det/111)
7. Regulation 853/2004/EC
8. Regulation 2074/2005/EC
9. Regulation 15/2011/EU.
10 Regulation (EU) No 786/2013 of 16 August 2013
11. Visciano P., Schirone M., Tofolo R., Berti M., Luciani
M. Ferri N., Suzzi G. 2013 Detection of yessotoxin by
three different methods in Mytilis galloprovincialis of
Adriatic Sea, Italy. Chemosphere 90, 1077-1082.
313
INDAGINE SIEROLOGICA SU FEBBRE Q NELL’UOMO IN CATEGORIE A RISCHIO
Lucchese L.(1), Raoult D.(3), Marangon S.(1), Mion M.(1), Giurisato I.(1), Barberio A.(4), Lonardi U.(2), Natale A.(1)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro, (PD);
2
Studio Lonardi, Medicina del Lavoro, Padova;
3
Faculté de Médecine, Unité des Rickettsies, WHO Collaborative Center for Rickettsial Reference and Research, Marseille,
France;
4
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Vicenza.
1
Key words: Q fever, serology, human
ABSTRACT
Due to the increasing number of confirmed Q fever human
cases in EU, the EFSA has focused the attention on the
risk assessment related to human infection. Even if the
human infection can occur following several situations that
involve proximity between humans and animals, Q fever
mainly remain an occupationally linked disease (2). During
an IZSVe course on Q fever in 2011, a serological and
epidemiological survey was performed on 74 volunteers,
veterinarians and laboratory biologists. Four veterinarians
resulted positive and one of them was classified as recent
infection. All of them had been exposed to risk factors. Two
subjects reported chronic health problems or fever, but for
none of them the Coxiella burnetii infection was taken into
account during the differential diagnosis.
INTRODUZIONE
Nell’aprile 2011 l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle
Venezie (IZSVe), in collaborazione con la Società Italiana
di Buiatria, ha organizzato un corso di formazione per 80
biologi e veterinari riguardante gli aspetti zoonosici e
zootecnici della Febbre Q. In tale occasione, è stata data
la possibilità ai partecipanti di verificare il proprio stato
immunologico effettuando un prelievo di sangue gratuito
per la determinazione degli anticorpi verso C. burnetii
(Cb). Ai volontari che hanno aderito all’iniziativa è stato
anche chiesto di compilare un questionario per la raccolta
di dati anamnestici ed epidemiologici che consentisse una
valutazione degli esiti in relazione ai principali fattori di
rischio legati alla Febbre Q nell’uomo.
MATERIALI E METODI
Prelievi e analisi:
Tramite l’attività di prelievo sono stati raccolti 74 campioni
di sangue, prontamente sierati e aliquotati per le successive
analisi sierologiche. Presso l’IZSVe è stato effettuato sui
campioni il test di Fissazione del Complemento (FdC), già in
uso presso l’Istituto per la diagnosi di Febbre Q nelle specie
animali. Un’aliquota di siero è stata inviata a Marsiglia,
presso la Faculté de Médecine, Unité des Rickettsies, WHO
Collaborative Center for Rickettsial Reference and Research,
dove i campioni sono stati analizzati con test di screening in
ELISA (Ig totali) e confermati mediante immunofluorescenza
(IFAT) specifica per IgG, IgM ed IgA dirette verso la fase I
e II dell’antigene. I campioni positivi alla diluizione 1:50 in
ELISA sono stati classificati come campioni a reattività non
significativa, mentre quelli positivi alla diluizione ≥1:100 sono
stati successivamente testati con l’IFAT. La metodica IFAT in
uso presso l’Istituto di Marsiglia consente la classificazione
dei soggetti in fase acuta e cronica, nella maggior parte dei
casi anche sulla base di un singolo prelievo (1, 3).
Questionario epidemiologico:
Il questionario fornito agli aderenti all’iniziativa è stato
redatto seguendo le indicazioni sui fattori di rischi legati
a Febbre Q pubblicate dall’EFSA (2). In particolare le
informazioni raccolte (tab. 1) hanno riguardato, oltre ai dati
anagrafici, la frequenza e le modalità di contatto con animali
e materiali a rischio, con vettori, la tipologia e l’ambiente di
lavoro, l’anamnesi di forme cliniche riconducibili a Febbre Q
nell’uomo. Il questionario è stato redatto tenendo conto che i
partecipanti erano veterinari e biologi e rappresentavano già
di per sé categorie professionali a rischio.
Rispetto al totale di 74 sieri testati, 25 sono risultati reattivi
alla prova ELISA alla diluizione 1:50, titolo considerato non
significativo dal punto di vista epidemiologico. Di questi,
quattro (campioni 21, 27, 33, 36) sono stati confermati
all’IFAT in fase I e II e due (27, 33) sono risultati positivi
anche all’FdC (tab. 2). I campioni 21, 27 e 36 sono stati
classificati come infezioni pregresse, mentre il n. 33 come
infezione recente.
Il questionario ha consentito di ottenere le seguenti
informazioni sui quattro soggetti positivi:
• Soggetto 21: uomo, 53 anni, veterinario del SSN,
residente nella regione Veneto. Proprietario di cani,
lavora in allevamenti di bovini e cavalli, in ambienti
polverosi. Mai stato morso da zecche, ma ha avuto
contatti con cani infestati. Consumo saltuario di prodotti
crudi a rischio. A volte a contatto con materiali a rischio
anche legati a parti/aborti nelle specie domestiche e
di allevamento (ruminanti, suini). Segnala di essere
stato interessato da polmoniti atipiche e di soffrire di
problemi cronici tra quelli indicati nel questionario (non
specificato).
• Soggetto 27: uomo, 49 anni, veterinario libero
professionista, abita in area rurale nella regione Veneto.
Possiede cani e gatti e lavora a contatto con bovini, ovini
e suini. Riporta di aver subito morsi da zecche e di avere
contatti con ovini infestati. Entra spesso in contatto con
materiali a rischio, spesso legati a parti/aborti in specie
quali bovini, ovi-caprini e suini. Consumo saltuario di
prodotti crudi a rischio. Non segnala di aver avuto forme
cliniche riconducibili a infezione da Cb.
professionista, vive in area urbana del Veneto. Possiede
gatti ed entra spesso in contatto con animali domestici,
a volte con animali da allevamento e selvatici. Non
riporta morsi da zecche, ma entra spesso in contatto
con camosci e caprioli infestati. Lavora sia sul campo
sia in laboratorio, a volte in ambienti polverosi e a
contatto con materiali a rischio, anche legati a parti/
314
aborti di bovini, ovi-caprini, cani, gatti. Riporta di essere
stato interessato da sindromi febbrili atipiche e di avere
avuto un contatto recente con un gregge caprino infetto
da Cb.
professionista, vive in area urbana in Friuli-Venezia
Giulia. Possiede un cane e un coniglio e alleva volatili da
cortile (polli, anatre, oche). Per lavoro entra in contatto
cani, gatti, bovini, suini, caprini. Riporta di essere stato
morso da zecche in Friuli Venezia Giulia diversi anni
prima; contatto con cani infestati. Consumo saltuario
di prodotti crudi a rischio. Lavora spesso in ambienti
polverosi, a contatto con materiali a rischio spesso
legati a parti/aborti di bovini o ovi-caprini. Non segnala
di aver avuto forme cliniche riconducibili a infezione da
Cb.
Nessuno dei soggetti positivi era mai stato sottoposto ad
accertamenti diagnostici che comprendessero Cb.
Per quanto riguarda le analisi sierologiche, la FdC si è
dimostrata essere una metodica specifica: pur individuando
meno sieropositivi rispetto all’IFAT, ha mostrato concordanza
nell’identificare i due soggetti con titoli più elevati.
I quattro soggetti positivi esercitano la professione veterinaria
in condizioni che facilitano il contatto con fattori di rischio.
I ruminanti, in particolare gli ovi-caprini, sono riconosciuti
essere il serbatoio principale della Febbre Q e la principale
fonte d’infezione per l’uomo (2). Dato che l’infezione può
essere mediata da vettori (zecche) ma più frequentemente
avviene per inalazione di aerosol, il contatto con ruminanti
rappresenta una condizione di rischio soprattutto durante i
parti dei soggetti infetti, che possono emettere nell’ambiente
grandi quantità di Cb tramite secrezioni vaginali e invogli
fetali. Sulla contaminazione ambientale influisce inoltre,
soprattutto per gli ovini, l’eliminazione del batterio attraverso
le feci. La possibilità d’infezione tramite consumo di latte
crudo è ancora in fase di discussione (2), ma l’eliminazione
di Cb nel latte è stata ampiamente dimostrata, così come
esiste la possibilità di contaminazione fecale delle carni.
E’ da sottolineare che nessuno dei soggetti positivi
ha manifestato sintomi di gravità tale da richiedere
ospedalizzazione, né indagini approfondite. Per tale motivo,
pur essendo esposti al rischio d’infezione e avendo in due
casi contratto patologie potenzialmente riconducibili a
Febbre Q, non sono stati eseguiti test diagnostici per Cb.
BIBLIOGRAFIA
1. Dupont HT, Thition X, Raoult D (1994) Q fever serology:
cutoff determination for microimmumofluorescence.
Clinical and Vaccine Immunology. 1 (2):189-196.
2. EFSA (2010) Scientific Opinion on Q fever. EFSA
Journal; 8 (5):1595.
3. Raoult D, Parola P (2007) Rickettsial Diseases. Chap. 21
“Clinical aspects, diagnosis and treatment of Q Fever”.
291-301.
Tab. 1 – Informazioni raccolte tramite il questionario
epidemiologico
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Età
Sesso
Luogo di residenza
Professione
Modalità/frequenza di contatto con animali
domestici/d’allevamento/selvatici
Pratica di attività sportive con animali/caccia
Anamnesi di morsi da zecche
Contatto con animali infestati da zecche
Consumo di alimenti crudi (carne, latte) o
prodotti a base di latte crudo
Ambiente di lavoro (all’aperto, polveroso,
laboratorio)
Frequenza
di
contatto
con
materiali
potenzialmente a rischio (paglia, fieno, lana
grezza, pelli, deiezioni animali, latte crudo, carni
crude)
Frequenza di contatto con secrezioni vaginali,
invogli fetali a seguito di parti/aborti con
indicazione delle specie
Anamnesi di sindromi febbrili, polmoniti, epatiti,
endocarditi atipiche con o senza accertamenti
per C. burnetii
Problemi epatici, cardiaci, intestinali, articolari
cronici o di affaticamento cronico
Anamnesi di aborto spontaneo
Accertamenti diagnostici specifici per la ricerca
di C. burnetii
Tab. 2 – Esiti dei campioni di siero risultati positivi alla prova IFAT
CAMPIONE
21
IgG
1:200
IFAT FASE II
IgM
neg
IgA
neg
IgG
1:100
IFAT FASE I
IgM
neg
IgA
neg
FdC
neg
27
1:800
neg
1:50
1:400
neg
1:25
1:10
33
36
1:800
1:400
1:400
neg
1:00
neg
1:400
1:200
1:200
neg
1:50
neg
1:80
neg
315
SVILUPPO DI UNA ELETTROFORESI SU GEL IN GRADIENTE DENATURANTE (DGGE)
PER L’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE DI MYCOPLASMI
Macaluso G., Puleio R., Ciprì V., Tamburello A., Loria G.R.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Palermo
Key words: 16S rDNA, DGGE, Mycoplasma
SUMMARY
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) is based on
the prevention of migration of DNA fragments following strand
separation caused by chemical denaturants.
The objective of this study was to develop and validate a
new diagnostic test based on PCR of the 16S rRNA gene
with Mycoplasma-specific primers and separation of the PCR
product according to primary sequence using DGGE.
The development of a PCR DGGE offers advantages of a rapid
identification of many Mycoplasma species for which no specific
PCR is yet available, enables the differentiation of different
mycoplasma species of veterinary significance and represents
a significant improvement from conventional culture and
serological tests in term of specificity and time consumption.
INTRODUZIONE
I micoplasmi appartengono alla classe Mollicutes e sono
tra i più piccoli microrganismi a vita libera in grado di
autoreplicazione. I micoplasmi sono batteri altamente esigenti,
difficili da coltivare e a crescita lenta. Molte specie sono agenti
patogeni di importanza veterinaria che causano infezioni
respiratorie, mastiti, congiuntiviti, artriti, e occasionalmente
aborto. L’identificazione dei micoplasmi come agenti eziologici
della malattia è spesso ostacolata dalla mancanza di test
diagnostici rapidi e dalla similarità delle patologie cliniche che
essi causano.
Recentemente, la PCR è stata introdotta quale metodo di
routine per la diagnosi di laboratorio di alcuni micoplasmi
veterinari.
La differenziazione dei micoplasmi mediante PCR basata
sull’impiego di primers specifici, è stata limitata in quanto vi è
una bassa variazione interspecifica nel 16S DNA ribosomiale
(rDNA). Ad oggi, non esiste un singolo test generico che
permetta l’identificazione dei micoplasmi a livello di specie.
La Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) può
teoricamente identificare mutazioni di singole basi del DNA (1).
La DGGE si basa sull’elettroforesi di frammenti di DNA (regioni
del gene 16S) precedentemente amplificati mediante PCR, su
un gel di poliacrilammide contenente un gradiente crescente
di sostanze denaturanti (urea e formammide). La separazione
dei frammenti è basata sulla ridotta mobilità elettroforetica che
hanno le molecole di DNA parzialmente denaturate rispetto
al DNA a doppia elica. Migrando lungo il gel, i frammenti di
dsDNA incontrano condizioni denaturanti sempre maggiori,
fino a che esse non causano l’apertura del doppio filamento.
La transizione da doppio filamento a filamenti parzialmente
denaturati avviene in un range molto stretto; questo determina
l’arresto della molecola sul gel in corrispondenza del suo
specifico dominio di melting. Sequenze differenti hanno domini
di melting differenti ed arresteranno la loro corsa in posizioni
diverse sul gel. In questo modo è possibile separare frammenti
di identica lunghezza, che differiscono per la sequenza di basi.
Scopo di questo studio è stato quello di sviluppare una
PCR DGGE per rilevare e differenziare diversi micoplasmi
di importanza veterinaria utilizzando primers micoplasmaspecifici e valutare la sua specificità e la sensibilità rispetto ai
test convenzionali e la sua eventuale applicabilità nelle infezioni
miste.
MATERIALI E METODI
Estrazione del DNA e 16S PCR
Sono stati selezionati 5 campioni positivi all’esame colturale e
alla PCR classica per M. agalactiae, M. bovis, M. gallinaceum,
M. gallinarum, M mycoides scelti tra i ceppi in collezione
presso il laboratorio e 4 ceppi di riferimento richiesti presso il
Public Health England Colture Collection, M. synoviae NCTC
10124, M. meleagridis NTCT 10153, M. iowae NCTC 10185,
M. gallisepticum NCTC 10115
Il DNA di micoplasma è stato estratto da un’aliquota di 1 ml di
colture in fase stazionaria utilizzando il PrepMan Ultra Sample
Preparation Reagent kit secondo le istruzioni d’uso (Applied
Biosystems). Il DNA dei tamponi e tessuti è stato estratto
utilizzando il Genelute genomic DNA kit secondo le istruzioni
d’uso (Sigma).
Il DNA estratto è stato quindi sottoposto a dosaggio
spettrofotometrico (NanoDrop2000c Thermoscientific) per
valutarne la concentrazione e la purezza tramite il rapporto
OD260/OD280.
L’amplificazione della regione V3 del gene 16S RNA è stata
eseguita secondo il metodo di Muyzer et al. (1993) (3) con
piccole modifiche utilizzando il primer batterico universale
GC341F(5CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG) e il primer
mollicutes-specifico R543 (5-ACCTATGTATTACCGCG).
Per la reazione di PCR, 1 µl di lisato è stato aggiunto come
templato ad una mix di reazione di 49 µl realizzata impiegando
l’AmpliTaqGoldDNA Polymerase secondo le istruzioni d’uso
(Applied Biosystem) .
Un termociclatore a gradiente termico (CFX96 ™, Biorad) è
stato utilizzato per testare un range di temperature di annealing
per assicurarne la specificità. Per tutti gli esperimenti è stata
settata una temperatura di annealing di 56 ° C.
Le condizioni termiche sono state le seguenti: denaturazione
a 94 °C per 5 min, seguita da 30 cicli di95 °C per 1 min, 56 °C
per 45 s and 72 °C per 1 min, e uno step di estensione finale
di 72 °C per 10 min. (2) L’esito della PCR è stato controllato
mediante elettroforesi su gel d’agarosio al 2% seguita dalla
visualizzazione al transilluminatore mediante colorazione con
GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain
L’elettroforesi è stata eseguita a 100 V ad una temperatura
di 58 ° C per 18 h. I gel sono stati poi colorati con SBYR
Gold (Cambridge BioScience) in TAE 1X per 30 min a 37
° C, decolorati in acqua distillata e visualizzati mediante
transilluminatore a raggi UV.
I membri appartenenti alla specie Mycoplasma, potrebbero
essere amplificati utilizzando il primer Mycoplasma-specifico
R543 e il primer universale GC341. Tutte le specie di
Mycoplasma analizzate hanno prodotto un amplicone di circa
340 bp (Figura 1).
Figura 1: Elettroforesi dei prodotti di PCR
L’analisi DGGE ha consentito la rilevazione e la differenziazione
delle specie di Mycoplasma da ospiti differenti. Per alcune
di queste specie di Mycoplasma non è disponibile alcun
test diagnostico basato sul DNA e molte sono stati finora
identificabili solo attraverso lunghe colture o test sierologici.
La metodica DGGE consente significativi miglioramenti rispetto
a metodiche biomolecolari che richiedono l’impiego di primers
Mycoplasma-specifici, inoltre permettono di identificare
infezioni miste, che sarebbero difficili da rilevare con i metodi
convenzionali. In conclusione, la DGGE permette la rapida
rilevazione e differenziazione delle specie di Mycoplasma e
può essere utilizzata per diagnosticare infezioni direttamente
da tessuti o da isolati colturali. E ‘in grado di rilevare colture
miste o anche nuove specie di Mollicutes ed è adatta per un
uso routinario nei laboratori diagnostici.
BIBLIOGRAFIA
1. Garcia, M., M. W. Jackwood, M. Head, S. Levisohn, and S. H.
Kleven. 1996. Use of species-specific oligonucleotide probes to
detect Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae, and M. iowae
PCR amplification products. J. Vet. Diagn. Investig. 8:56–63.
2. McAuliffe L., Ellis R.J., Lawes J.R., Ayling R.D. and
Nicholas R.A.J.. 2005. 16S rDNA PCR and denaturing
gradient gel electrophoresis; a single generic test for detecting
and differentiating Mycoplasma species. Journal of Medical
Microbiology , 54, 731–739
Sebbene sono state trovate alcune bande non specifiche a
55 ° C, l’aumento della temperatura di annealing a 56 ° C ha
assicurato che i primers amplificassero solo DNA di mollicutes.
Questi prodotti sono stati sottoposti a DGGE in gruppi in base
all’ ospite animale. Nella maggior parte dei casi si è visualizzata
una sola banda, dovuta alla mancata variazione interspecifica
nella sequenza amplificata. La presenza di più bande può
essere motivata dalla presenza di più di un operone 16S rDNA
e dalle differenze di sequenza tra le copie. La migrazione delle
bande mediante gel è funzione del comportamento di melting
degli ampliconi nel gradiente chimico utilizzato (Figura 2).
3. Muyzer, G., de Waal, E. C. & Uitterlinden, A. G. (1993).
Profiling of complex microbial populations by denaturing
gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain
reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ
Microbiol 59, 695–700.
Figura 2: DGGE delle specie di Mycoplasmi saggiati
DGGE
La DGGE è stata eseguita utilizzando il DCode™ Universal
Mutation System (Biorad). I campioni (20 ul) sono stati caricati
su un gel 10% di poliacrilamide / bis (30: 1) con gradiente di
denaturazione 30-60% [dove 100% è 7 M urea e 40% (v / v)
formammide deionizzata] in buffer TAE 1X (Severn Biotech).
316
317
GENETIC ASSESSMENT THROUGHOUT MT-DNA SEQUENCING FROM
WILD POPULATIONS OF SICILIAN ROCK PARTRIDGE AS PRELIMINARY STEP
FOR SPECIES CONSERVATION
Macaluso G.1,; Puleio R.1 ; Manno C.1; Reale S.1; Lo Valvo M.2; Vitale F.1; Loria G.R.1
1) Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia , Palermo 2) Dipartimento di Biologia Ambientale e Biodiversità,
Università egli Studi di Palermo
Key words: Alectoris graeca, mtDNA control-region, Sicily
SUMMARY
Mediterranean rock partridge (Alectoris graeca) populations
are declining throughout their range due to habitat changes
and overhunting. Massive restocking with captive-reared birds
belonging exotic similar species, may lead to risk of genetic
pollution.
The aim of this work was to develop and validate an effective
molecular assay based on mitochondrial DNA (mtDNA)
sequencing to assess the genetic differentiation and the
possible presence of hybrids in clinical specimens of Alectoris
populations collected in Sicily.
In the study, sequence analysis of 450 nucleotides from
the mtDNA, has resulted as a sensitive method for typing
recognized organic samples (fecal samples, feathers, muscles)
collected in the wild and related to Sicilian rock partridges in
order to investigate phylogeography and current population
genetic structure in the region.
The final aim of the study is to know and improve the distribution
of autochthonous couples and delete genetic pollution
constituted by hybrids.
(A. chukar, A. greca graeca). Tale fatto ha rappresentato un serio
rischio di generare individui ibridi, derivati dall’accoppiamento
con i soggetti locali, con conseguente inquinamento genetico
della biodiversità autoctona. L’Alectoris chukar (Coturnice
asiatica) è la specie più frequentemente identificata nel genoma
di coturnici ibridi in Italia (1).
Nell’ambito di un progetto di conservazione finanziato dalla
Commissione Europea (“Urgent actions for the conservation
of the “Alectoris greca whitakeri” - Codice progetto: LIFE09
NAT/IT/000099”), volto a migliorare le condizioni ambientali
necessarie alla conservazione della coturnice di Sicilia si è
indagato sullo stato di salute genetica della specie endemica
tramite metodi di laboratorio specifici. A tal scopo è stata
messa a punto una metodica di Biologia Molecolare al fine di
caratterizzare i geni della sequenza della regione controllo del
DNA mitocondriale polimorfico (mtDNA-CR) (2,3). I risultati delle
analisi avevano lo scopo di caratterizzare i soggetti che vivono
nelle aree identificate dal progetto (la ZPS di Castellammare
del Golfo, TP) per selezionare soggetti con profilo genetico
wild-type.
INTRODUZIONE
La Coturnice siciliana (Alectoris graeca whitakeri, Schiebel,
1934) è una delle specie selvatiche siciliane a maggior rischio
estinzione e per tal motivo inserita nell’allegato I di tutela della
Direttiva Europea 2009/147/CE, ritenuta quindi specie ad
alta “priorita’” per quanto riguarda interventi di conservazione
(Figura 1)
MATERIALI E METODI
Le attività hanno previsto una costante e periodica attività di
campo dal 12 settembre 2011 al 12 maggio 2012: in totale sono
stati eseguiti oltre 20 sopralluoghi nell’area protetta (M. Inici,
M. Cofano, M. Sparagio e Capo San Vito), con l’obiettivo di
raccogliere campioni clinici utili alla valutazione della purezza
genetica dei soggetti ancora presenti in queste montagne
ormai considerate areali relitti della specie.
I campioni clinici raccolti, per le problematiche severe sulla
cattura e/o campionamento riguardanti le specie protette,
sono stati costituiti principalmente da campioni di feci
(n° 252) e piume (n°44). In alcuni casi è stato possibile
recuperare carcasse fresche o congelate e quindi tessuto
muscolare proveniente da soggetti recuperati nell’ambiente
dalle guardie forestali e/o cacciatori. Per campioni diversi
da quella che è la specie autoctona, da impiegare come
controllo, si è provveduto a richiedere campioni ad altri Istituti
Zooprofilattici, tra cui ringraziamo l’Università di Palermo e
l’IZS delle Venezie. La regione considerata per lo screening
è stata il D-loop (mitochondrial control-region, mtDNA CR),
una sequenza genica mitocondriale di circa 1155bp che,
nonostante sia altamente conservata per struttura, dimensioni
ed organizzazione, mostra una notevole variabilità interspecie
che la rendono altamente polimorfica.
Le procedure di sequenziamento per l’identificazione genetica
di specie, sono derivate da metodiche pubblicate in precedenza
(1,2) integrate ed ottimizzate per lo scopo del progetto.
Le prove di amplificazione hanno dimostrato che i migliori
risultati per lo scopo previsto dal progetto (e con le matrici
Figura 1: Esemplare di coturnice sicula
La drammatica diminuzione del numero di soggetti presenti in
Sicilia è probabilmente legata alla progressiva urbanizzazione
di aree endemiche ed all’agricoltura intensiva che lasciano
sempre meno spazio alle condizioni naturali necessarie alla
sopravvivenza e nidificazione della coturnice. Negli ultimi
anni inoltre, a scopo venatorio, sono state effettuate ripetute
immissioni di specie del medesimo genere dell’Alectoris graeca
318
biologiche disponibili), si ottengono utilizzando una reazione
di amplificazione seminested PCR del gene D-Loop del DNA
mitocondriale (1) che aumenta l’efficienza di amplificazione
della sequenza dell’mtDNA CR, con un miglioramento della
sensibilità e specificità delle analisi. I primers impiegati sono
PHDL5’ AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3’ H1321
5 ’ TAGYAAGGTTAGGACTRAGTCTT – 3’ SEMD467
5’ - CCTCGGTCAGGCACATCC - 3’ SEMD621
5’
AACCTGTGAAGAAGCCCCAGA – 3’,
Le prove di amplificazione sono state eseguite mediante una
first PCR, utilizzando l’AmpliTaqGoldDNA Polymerase (Applied
Biosystem con la coppia di primers (PHDL/H1321) secondo il
seguente profilo termico: 3 min a 94°C seguiti da 30 cicli di 1
min a 94°C, 2 min a 55°C, 1 min a 72°C e infine 7 min a 72°C.
Una ramp del 50% è stata inserita tra l’annealing e l’estention
ad ogni ciclo di amplificazione.
I prodotti della first PCR sono stati riamplificati mediante
una semi nested PCR (snPCR) usando le coppie di primers
PHDL-SEMD621 che amplificano la regione CRI di 621bp e
SEMD467-H1321 che amplificano la regione CRII di 689bp. Si
è utilizzato lo stesso profilo termico della first PCR, tranne che
per la temperatura di annealing pari a 60°C.
Per verificare l’avvenuta amplificazione del DNA è stata
condotta l’elettroforesi su gel d’agarosio dei prodotti
ottenuti. I prodotti di PCR sono stati purificati e sottoposti
ad una reazione di sequenza, mediante l’impiego di un
sequenziatore ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems®) impiegando il metodo BigDye adoperando come
5
’
innesco uno dei primer di sequenza SEQD83
TATATTTATATGCCCCATATATATG-3’
SEQD484
5’-GGATGTGCCTGACCGAGG-3’
SEQD604
5’-GGGGCTTCTTCACAGGTT-3’
SEQD1120
5’-AATAGTATTTGTTTGTGGGG-3’
(Barbanera F. e Guerrini M., 2009). Le sequenze in formato
FASTA così ottenute, sono state allineate alle sequenze
depositate in GenBank, utilizzando il software BLAST (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
per l’interrogazione del
database.
Dalle prove di estrazione mediante appositi kit, che
utilizzano colonnine di affinità specifiche e valutazione
della concentrazione del DNA si è osservato che le matrici
biologiche più idonee allo scopo del progetto sono campioni
di piume. Circa il 60% dei campioni fecali, come prevedibile,
ha mostrato un grado di contaminazione e degradazione,
limitando marcatamente l’estrazione di quantità sufficienti di
DNA.
Una buona percentuale (quasi il 60%) dei campioni hanno
dato un esito positivo alla snPCR D-Loop: 30/44 campioni di
piume, mentre i risultati sulle feci ha identificato come positivi
n° 141/252 campioni di feci (per oltre l’80% rappresentate da
campioni freschi). Il 100 % dei campioni di tessuto muscolare
esaminato ha dato esito positivo per A.graeca whitakeri.
Si riportano nella Tabella 1 gli esiti delle analisi effettuate
complessivamente, aggiornate al Maggio 2012
Matrice
Tot
campioni
PCR D-loop
POSITIVI
PCR D-loop
NEGATIVI
Feci
252
141
111
Piume
44
30
14
Tessuto
Muscolare
14
14
0
310
185/310
125/310
TOTALE
Tabella 1: Esiti delle analisi PCR D-Loop
Le sequenze dei campioni positivi alla PCR-D-loop (183/310),
analizzate attraverso il programma BLAST non hanno evidenziato
la presenza di linee genetiche esotiche, rilevando un maggiore
livello di sovrapposizione con la sequenza Alectoris graeca
(isolate Italy, Sicily) mitochondrial D-loop DNA (emb AJ222731.1).
Le indagini genetiche sinora svolte su questo limitato, ma pur
sempre significativo campione di popolazione di coturnice
di Sicilia, hanno confermato la presenza della sottospecie
endemica in assenza di eventuali inquinamenti genetici sospettati
a causa dell’introduzione negli anni passati di taxa non autoctoni.
L’applicazione seguente allo studio della variabilità di sequenza
è utile per la definizione delle specie e del grado di ibridizzazione
tra quelle native e di nuova immissione. E’ importante sottolineare
che, rispetto a quanto pubblicato ad oggi, il metodo ha dovuto
subire delle modifiche con un miglioramento delle sensibilità e
specificità. Inoltre l’applicazione del test su campioni che non
necessitano la cattura e/o traumi alle specie oggetto di indagine,
rappresenta un strumento utile per future applicazioni su altre
popolazioni relitte di particolare importanza ecologica e nella
difesa delle biodiversità.
BIBLIOGRAFIA
1. Filippo Barbanera, Monica Guerrini, Aleem A. Khan, Panicos
Panayides, Pantelis Hadjigerou, Christos Sokos, Sundev
Gombobaatar, Sarah Samadi, Bakht Y. Khan, Sergio Tofanelli,
Giorgio Paoli, Fernando Dini, 2009 - Human-mediated
introgression of exotic chukar (Alectoris chukar, Galliformes)
genes from East Asia into native Mediterranean partridges. Biol
Invasions 11:333–348;.
2. Randi E., Lucchini V., 1998 - Organization and Evolution
of the Mitochondrial DNA Control Region in the Avian Genus
Alectoris. Journal of Molecular Evolution, 47, 449-462
3. Randi, E., Tabarroni, C., Rimondi, S., Lucchini, V., Sfougaris,
A., 2003 - Phylogeography of the Rock Partridge (Alectoris
graeca). Molecular Ecology 12, 2201-2214;
Studio prodotto con il contributo della Commissione Europea:
“Urgent actions for the conservation of the “Alectoris greca
whitakeri” - Codice progetto: LIFE09 NAT/IT/000099”
319
PIANO DI SELEZIONE GENETICA PER LA RESISTENZA ALLE ENCEFALOPATIE
SPONGIFORMI TRASMISSIBILI DEGLI OVINI NELLA REGIONE SICILIA:
EFFICACE STRUMENTO DI CONTROLLO.
Figura 2 – Istogramma rappresentante il numero campionario analizzato e suddiviso per genotipi.
Macrì D. 1, Bivona M. 1, Buttitta O. 1, Galante A.1, Randazzo V.1, Calderone S.1, Vitale F.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia
Key words: scrapie, genotyping, Plan selection.
SUMMARY
Scrapie is an infectious disease of sheep and goats belonging to the group of transmissible spongiform encephalopathies (TSE). In order to limit the spread of scrapie, the European Union has adopted measures based on programs to
select populations genetically resistant to TSE. In Italy the
preparation of specific dialing plans is delegated to the regional level, in accordance with the scheme of the national
selection of DM 17/12/2004. The objective of this work is to
show, through Rt-PCR, the genotype distribution of scrapie
in 2013, and consider the numerical variation of the analyzed
samples after the entry into force of the new Regulation.
INTRODUZIONE
La scrapie è una malattia infettiva degli ovi-caprini appartenente al gruppo delle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE), anche note come malattie da prioni.
Il lungo periodo d’incubazione, comune a tutte le TSE, che
spesso corrisponde o supera la vita commerciale degli ovini e l’assenza di un test diagnostico ante-mortem, rendono
inefficaci gli interventi di controllo e gestione tradizionalmente adottati nei confronti degli agenti di malattie infettive.
L’Unione Europea ha adottato misure di controllo della scrapie negli ovini, con l’emissione del Regolamento 999/2001/
CE, che reca disposizioni per l’ eradicazione di alcune TSE.
L’introduzione del Piano di selezione genetica, in Italia, ha luogo con l’emissione del Decreto Ministeriale del
17/12/2004. La predisposizione di specifici piani di selezione
viene demandata a livello regionale in conformità allo schema di selezione nazionale, del D.M. sopracitato.
Le autorità regionali competenti devono quindi, nel redigere
il piano, attenersi ai requisiti minimi previsti nello schema del
piano nazionale.
L’adesione è obbligatoria dal 2005 solo per i greggi ad elevato merito genetico. Nella Regione Sicilia il Decreto Assessoriale (D.A. 3/2013) emanato il 4 gennaio 2013, prevede
l’obbligatorietà al piano, oltre che per gli allevamenti suddetti
nel piano nazionale, anche degli allevamenti commerciali
con capi di numero superiore ai 200. Obiettivo del presente
lavoro è evidenziare, tramite RT-PCR, la distribuzione genotipica di scrapie nel 2013 e valutare la variazione numerica
dei campioni analizzati, successivamente all’entrata in vigore della sopracitata normativa.
MATERIALI E METODI
Nel primo semestre 2013, come contemplato nel Decreto Assessoriale (D.A. n 0003/2013) sono stati saggiati un numero
campionario di 2000 ovini di sesso maschile provenienti dal
territorio siciliano. Per l’indagine molecolare RT-PCR sono
stati analizzati campioni ematici, previa estrazione del DNA
genomico con l’impiego del Kit “Illustra blood genomicPrep “
(GE Healthcare) seguendo il protocollo della ditta fornitrice.
La reazione di PCR prevede l’impiego di primers localizzati nell’intorno della mutazione in esame, oltre a due sonde
fluorescenti, uno per l’allele wild-type e l’altra specifica per
l’allele mutato. L’analisi della fluorescenza, per lettura in
tempo reale, permette di discriminare i tre possibili genotipi
(soggetto omozigote normale, soggetto eterozigote, soggetto omozigote mutato).
RISULTATI E DISCUSSIONI
In Figura 1 sono mostrati il numero di campioni ovini analizzati, tramite approccio molecolare, da Gennaio 2012 a
Giugno 2013. Come è possibile notare, i dati ottenuti nel I
semestre 2013, incrementano notevolmente rispetto al numero campionario, pervenuto in laboratorio, nell’anno 2012.
Figura 1 – campioni analizzati nel I e II semestre 2012 e nel
I semestre 2013.
In Figura 2 sono mostrati i genotipi, rilevati tramite approccio
molecolare, nella popolazione ovina oggetto di studio (2000
campioni). Come è possibile osservare il genotipo ARR/ARQ,
considerato un genotipo di scarsa suscettibilità alla scrapie, ha
mostrato un numero campionario più elevato rispetto ad altri
genotipi. I dati ottenuti nel I semestre 2013 evidenziano come il
40% dei campioni analizzati presentino genotipi suscettibili alla
patologia neurodegenerativa (figura 3).
Figura 3 – Grafico a torta rappresentante le % di genotipi suscettibili e resistenti alla scrapie.
Tale studio ha dimostrato un incremento notevole del numero di
campioni genotipizzati nell’anno 2013, rispetto il 2012, successivamente all’entrata in vigore del “Piano di selezione genetica
del Regione Sicilia”. Inoltre si è rilevata, tramite approccio molecolare, la distribuzione genotipica della scrapie nel territorio
siciliano, e come siano presenti genotipi considerati di suscettibilità alla patologia. L’alta percentuale di genotipi suscettibili
(40%) sottolinea l’importanza e l’utilità del Piano di selezione
genetica, come efficace strumento di controllo ed eradicazione
della patologia neurodegeneratica, scrapie.
BIBLIOGRAFIA
Reg. CE n. 999 22.05.01: “Eradicazione delle encefalopatie
spongiformi trasmissibili negli ovini e caprini e le regole per il
commercio di ovini e caprini e di embrioni vivi”;
Decreto Ministeriale del 17.12.2004: “Piano nazionale di selezione genetica per la resistenza alle encefalopatie spongiformi
negli ovini”;
L’incremento numerico, riscontrato nel 2013 rispetto l’anno
2012, è attribuibile all’entrata in vigore del Decreto Assessoriale n. 3 del 4 Gennaio 2013, il quale rende obbligatorio
il Piano di selezione genetica per la resistenza alle encefalopatie spongiformi in tutti gli allevamenti aventi un patrimonio zootecnico superiore ai 200 capi e in tutti gli allevamenti
iscritti al libro genealogico o ad elevato merito genetico. Si
riscontra, infatti, nel solo I semestre del 2013 un incremento
del 20,35% popolazione ovina genotipizzata, rispetto l’intero
anno 2012.
320
Decreto Assessoriale n. 3 del 04.01.2013:” Piano di selezione
genetica per la resistenza alle encefalopatie spongiformi trasmissibili degli ovini, controllo animali con identificazione controllata”.
321
VALIDAZIONE DI UN METODO DI PROVA IN REAL TIME PCR: DETERMINAZIONE DEI
POLIMORFISMI A SINGOLO NUCLEOTIDE (SNPS) NEI CODONI 136, 154 E 171,
MARCATORI DELLA SUSCETTIBILITÀ ALLA SCRAPIE NELLA SPECIE OVINA
Macrì D. 1, Bivona M. 1, Buttitta O. 1, Lo Verde V.1, Acutis P.2, Chetta M.1, Muzzupappa C.3, Reale S.1, Vitale F.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, ”A. Mirri”
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta,
3
Real Gene S.R.L.
1
2
Keywords: Prion, Scrapie, RT-PCR.
SUMMARY
Prion diseases are transmissible spongiform encephalopathies
in humans and animals, including scrapie in sheep. The infectious agent is generally recognised as a misfolded isoform of
the host encoded prion protein.
Although scrapie is an infectious disease, susceptibility/resistance in sheep is influenced by polymorphism of the Prp gene,
which encodes the PrPc. Following EU decision 2003/100/EC
Member States may implement breeding programmes to increase genetic resistance to scrapie in sheep populations.The
objective of this study was to validate a test method in Real
Time PCR, in order to identify single nucleotide polymorphisms
in codons 136, 154 and 171, and then to evaluate the susceptibility to SCRAPIE, in the sheep population.
INTRODUZIONE
La principale differenza della proteina prionica wild-type (PrP)
con quella della scrapie, è di natura conformazionale, in quanto
la proteina prionica “cellulare” PrPC, pur possedendo la stessa struttura primaria di quella “patologica” PrPSc, ne differisce
per struttura secondaria e terziaria. Infatti, nella PrPC la configurazione spaziale delle catene polipeptidiche è ad “α-eliche”,
mentre modificazioni post-traslazionali, nonché l’acquisizione
di una strutture a “foglietti-β”, conferiscono patogenicità alla
proteina prionica. (figura 1).
(Fig. 1) Conversione post-traslazionale della PrP “normale” o
“cellulare” (PrPC), con prevalente struttura a “alfa-eliche”, in
PrP “patologica” (PrPSc), con prevalente struttura a “fogliettibeta”.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).
ne di diversi aminoacidi. In particolare, il codone 136 del gene
PrP può codificare rispettivamente per Alanina (A) o per Valina (V); il codone 154 per Arginina (R) o Istidina (H); mentre il
codone 171 per Arginina (R), Glutamina (Q) o Istidina (H) (3).
Il genotipo VRQ/VRQ è associato alla massima suscettibilità
per lo scrapie, mentre il genotipo ARR/ARR è associato alla
maggiore resistenza. Tutto ciò ha portato la Commissione Europea ad emanare una direttiva (2003/100/EC) volta ad incentivare gli Stati membri ad attuare piani di selezione genetica,
negli allevamenti di ovini, basati sul test di genotipizzazione del
gene PrP, al fine di aumentare la frequenza dell’ allele di resistenza ARR. L’obiettivo di tale studio è stato quello di validare
un metodo di prova in Real Time PCR, al fine di identificare i
polimorfismi a singolo nucleotide nei codoni 136, 154 e 171, e
valutare quindi, la suscettibilità alle Encefalopatia Spongiforme
Trasmissibile, nella popolazione ovina.
MATERIALI E METODI
Il kit diagnostico “Scrapie Genotype Plus”, della ditta Real
Gene, è impiegato per il saggio in Real Time PCR. Il protocollo
di amplificazione per la determinazione degli alleli è stato ottimizzato e standardizzato, al fine di lavorare, alle medesime
condizioni, i codoni oggetto di studio (4).
Il protocollo di Real Time PCR utilizzato è riportato in tabella 1,
permettendo di definire il risultato dell’analisi al 35° ciclo, dopo
circa un’ora di corsa dello strumento. Al protocollo previsto dal
kit, infatti, è stato aggiunto un ulteriore ciclo iniziale di 2 minuti
a 50 °C, al fine di favorire l’inattivazione termica dei frammenti
nucleotidici contenenti uracile, possibilmente presenti, lasciando inalterato il modello di DNA bersaglio.
Tabella 1 – protocollo di Real Time PCR utilizzato
Da tutti gli studi finora effettuati è emerso che la Scrapie è una
malattia infettiva, ma la sua manifestazione negli ovicaprini è
controllata da fattori genetici. In particolare, la sua incidenza
nella pecora è essenzialmente legata alle mutazioni dei codoni
in posizione 136, 154, 171, che si traducono nella codificazio-
produttrice. Per la validazione del metodo di prova sono stati
valutati i seguenti indici di prestazione: sensibilità, specificità,
accuratezza e concordanza (Kappa), secondo la “Procedure
per la validazione dei metodi interni in accordo con i requisiti
prescritti dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025 p.ti 5.4.3. –
5.4.4. – 5.4.5..
La discriminazione allelica è stata eseguita analizzando contemporaneamente con ogni codone due sonde oligonucleotidiche specifiche per ciascun polimorfismo (SNP). Ogni sonda
è marcata al terminale 5’ con fluoroforo specifico (VIC o FAM),
mentre al 3’ con un gruppo MGB (Minor Groove Binder) che
funge da quencher. Le differenze di degradazione delle sonde
durante l’amplificazione, dovute alla diversa complementarietà delle sonde, può essere letta in fluorescenza determinando
quale sostituzione aminoacidica è presente. Combinando i risultati ottenuti per ogni codone si arriva a determinare il genotipo del campione in esame. Per la verifica degli indici di validazione sono stati analizzati 40 campioni di sangue in EDTA; le
prove sono state condotte in doppio, variando l’operatore per
tutte le fasi previste. Inoltre i saggi sono stati eseguiti su due
diversi termociclatori Real Time PCR. Gli stessi campioni sono
stati inviati alla Struttura Semplice Genetica e Immunobiochimica, del Centro di Referenza per le Encefalopatie Animali
(CEA) dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta. I campioni inviati sono stati processati
con il metodo del pirosequenziamento.
RISULTATI E DISCUSSIONI
Il kit utilizzato ha permesso di analizzare, all’interno della stessa corsa di RT-PCR più polimorfismi. L’utilizzo di un protocollo di amplificazione comune a tutti i codoni contribuisce alla
semplificazione del flusso di lavoro in laboratorio. I dati di concordanza intra e inter laboratorio unitamente agli indici di validazione, ottenuti con la partecipazione ai Ring Test nazionali,
organizzati dall’Istituto Superiore Sanità di Roma, confermano
l’elevato grado di attendibilità e di robustezza della metodica.
In tabella 2 è possibile osservare gli indici di validazione ottenuti con diverse metodiche diagnostiche e come questi risultino
sovrapponibili.
I risultati ottenuti negli anni di impiego del kit hanno mostrato un
trend positivo dei risultati attesi (figura 2).
Tabella 2 - Recupero dei dati relativi agli indici di validazione
Sensibilità: 100%
Specificità: 100%
STEP
FASE
TEMPO
Temp.
N° CICLI
Accuratezza: 100%
1
UNG Glicosilase
2’
50°C
1
Concordanza (Kappa): 1.00 (95% IC:0.98-1.00)
2
Denaturazione
iniziale
10’
95°C
1
3
Denaturazione
15’’
95°C
4
Polimerizzazione
1’
60°C
40
La preparazione dei campioni ematici e l’allestimento del saggio sono stati effettuati secondo le indicazioni della ditta produttrice. L’estrazione del DNA dei campioni è stato effettuato con
il kit “Illustra blood genomicPrep mini spin kit” prodotto dalla
ditta GE Healthcare, secondo le modalità indicate dalla ditta
322
323
Figura 2 – Andamento dei risultati attesi negli anni d’impiego
del Kit.
Tale lavoro ha consentito di validare un metodo di prova in RTPCR al fine di identificare i polimorfismi a singolo nucleotide
nei codoni 136, 154 e 171, e valutare quindi, la suscettibilità
alle Encefalopatia Spongiforme Trasmissibile, nella popolazione ovina.
BIBLIOGRAFIA
1. Agrimi U, Conte M, Morelli L, Di Bari MA, Di Guardo G,
Ligios C, Antonucci G, Aufiero GM, Pozzato N, Mutinelli F,
Nonno R, Vaccari G. Animal transmissible spongiform encephalopathies and genetics. Vet Res Commun 27(Suppl
1):31-8, 2003;
2. Di Guardo G, Marcato PS. Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili. In: Marcato PS “Patologia Sistematica Veterinaria”, Bologna, Edagricole-Il Sole 24 Ore, 1302-11, 2002;
3. Belt, P. B., Muileman, I. H., Schreuder, B. E., Bos-de
Ruijter, J., Gielkens, A. L. & Smits, M. A. (1995). Identification of five allelic variants of the sheep PrP gene and their
association with natural scrapie. J Gen Virol 76, 509–517.
4. Westaway D, Zuliani V, Copper CM, Da Costa M, Neuman S, Jenny AL, Detwiler L, Prusiner SB. Homozygosity
for prion protein alleles encoding glutamine-171 renders
sheep susceptible to natural scrapie. Genes Dev 8(8):
959-69, 1994
SENSIBILITA’ AGLI ANTIMICROBICI DI BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE
IN ITALIA DAL 2005 AL 2013
Magistrali C.F.1, Cucco L. 1, Scoccia E. 1, Tartaglia M. 1, Luppi A. 2, Bonilauri P. 2 , Biasi G. 2, Merialdi G. 2, Maresca C. 1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria Marche- Perugia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lombardia e Emilia Romagna
1
2
Key words: B. hyodysenteriae, sensibilità, antimicrobici
Abstract
A broth microdilution method was used to determine the
antimicrobial susceptibility of 206 Brachyspira hyodysenteriae
isolated from Italian pig herds between 2005 and 2013. The
antimicrobials tested were tiamulin, lyncomycin and tylosin,
and the MIC values were interpreted using epidemiological
and clinical cut-off. The vast majority of the isolates (91% to
tiamulin, 98% to lyncomycin and 99%, to tylosin) showed MIC
values above the epidemiological cut off, indicating a previous
exposure to antimicrobials. Moreover, most isolates (98%) were
resistant to tylosin, about half (56%) to lyncomycin and roughly
a third (34%) to tiamulin. Furthermore, a significant increase of
resistant isolates was seen for both lyncomycin and tiamulin
from 2008 to 2013. A non-negligible proportion of isolates
(56%) showed multiple resistances to all the tested antibiotics,
and a significant increase of this percentage was observed in
2011 and 2013 compared to 2008.
Introduzione
Brachyspira hyodysenteriae, un spirocheta anaerobia, è
l’agente eziologico della Dissenteria emorragica del suino
(SD). Questa malattia enterica, endemica negli allevamenti
italiani, si manifesta prevalentemente nelle fasi di magronaggio
ed ingrasso ed è caratterizzata da una diarrea mucoemorragica con esiti gravi ed impatto economico rilevante.
Tradizionalmente, il controllo della SD si è basato sull’impiego di
antimicrobici, e in particolare di tilosina, tiamulina, lincomicina,
carbadox e dimetridazolo. Questi ultimi due, sulla base di
norme comunitarie, non sono oggi più utilizzabili. Inoltre, nel
corso degli ultimi anni è stata segnalata la comparsa di ceppi a
ridotta sensibilità nei confronti degli antibiotici (1; 2). Anche in
Italia questo fenomeno è stato descritto da tempo (3). La ridotta
sensibilità ai trattamenti antibatterici ha creato difficoltà nella
gestione dei focolai di dissenteria suina, tanto che questa può
essere considerata una malattia emergente.
Scopo di questo lavoro è stato confrontare la sensibilità di B.
hyodysenteriae nei confronti di tilosina, tiamulina e lincomicina.
Gli isolati provenivano da casi di dissenteria suina verificatesi
in allevamenti italiani dal 2005 al 2013.
Materiali e metodi
Isolati: sono stati valutati 206 isolati di B. hyodysenteriae
provenienti da focolai di dissenteria suina in Italia dal 2005
al 2013. Gli isolati sono stati mantenuti in Microbank (Prolab
Diagnostic, Richmond hill, Canada) a -80°C fino al momento
dell’analisi. In seguito, i ceppi sono stati seminati in Agar
sangue al 5% sangue di montone, e incubati in anaerobiosi a
42°C per 3-5 giorni. Dopo l’incubazione, la purezza del ceppo è
stata verificata mediante microscopia ottica.
Metodo di diluizione in brodo: il metodo è stato effettuato sulla
base di quanto già descritto da Rohde (4). In breve, ciascun
isolato è stato seminato su Anaerobe Fastidious Agar (LAB-M
Ltd, UK) in anaerobiosi a 42°C per 72 ore. Dopo un controllo di
purezza in microscopia, il ceppo è stato sospeso in BHI, ad una
concentrazione di 108 ufc/ml circa. 300 l della sospensione
sono stati quindi aggiunti a 30 mL di BHI+ calf fetal serum
(BioWhittaker, Walkersville, MD, USA) , fino ad ottenere una
concentrazione di 106 ufc/ml circa. 0,5 ml di questa sospensione
sono stati seminati in ciascun pozzetto di piastra VetMIC Brachy
(SVA, Uppsala, Sweden) e incubati in anaerobiosi a 37°C per
4 giorni con agitazione continua. Un ceppo di Brachyspira
hyodysenteriae (ATCC 27164, B78) è stato impiegato come
controllo. Le concentrazioni testate sono state le seguenti:
tiamulina: 0,063 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml,
1 mg/ml; 2 mg/ml; 4 mg/ml; 8 mg/ml; Lincomicina: 0,5 mg/ml,
1 mg/ml; 2 mg/ml; 4 mg/ml; 8 mg/ml; 16 mg/ml; 32 mg/ml; 64
mg/ml; Tilosina: 2 mg/ml; 4 mg/ml; 8 mg/ml; 16 mg/ml; 32 mg/
ml; 64 mg/ml; 128mg/ml. La lettura è avvenuta tramite visore
ottico; la minima concentrazione inibente (MIC) è stata definita
sulla base della diluizione di antimicrobico più bassa in grado di
inibire la crescita batterica.
Interpretazione dei risultati: I breakpoint clinici per
l’interpretazione dei dati di MIC per B. hyodysenteriae sono
stati proposti da Ronne e Szancer nel 1990 (5): sulla base
di questi, è possibile suddividere gli stipiti in tre categorie:
resistente, intermedio e sensibile (R;I;S). : tiamulina (S: ≤1mg/
ml, I: >1-≤4mg/ml; R:>4mg/ml), tilosina (S: ≤1mg/ml; I: >1≤4mg/ml; R:>4mg/ml) e lincomicina (S: ≤ 4mg/ml, I: >4-≤32mg/
ml; R>32) mg/ml.
Sono stati infine classificati ceppi multiresistenti quelli che si
presentavano non sensibili (resistenti od intermedi) a tutti e tre
gli antimicrobici.
I cut-off epidemiologici per l’interpretazione dei dati di MIC
sono stati calcolati sulla base di quanto proposto da Pringle
(6), come segue: lincomicina: >1mg/ml; tiamulina: >0,25; mg/
ml; tilosina: >16mg/ml.
Elaborazione statistica: la valutazione dell’andamento di ceppi
isolati negli anni (dal 2008 al 2013) è stata effettuata con
il χ2 for trend prendendo come riferimento sempre il 2008 e
considerando significativo un p-value≤0,05. Per evidenziare la
forza dell’associazione sono stati calcolati gli Odds Ratio (OR)
con i relativi intervalli di confidenza al 95% (IC95%).
I risultati ottenuti per ciascuna molecola sono indicati in tabella
1. Osservando le distribuzioni delle MIC dei diversi antibiotici
è evidente come la maggior parte degli isolati si collochi al
di sopra dei cut-off epidemiologici indicati da Pringle (6). In
dettaglio, si collocano al di sopra di questo valore il 91% degli
isolati per quanto riguarda la tiamulina, il 98% per tilosina
e il 99% per lincomicina. Questo indica una precedente
esposizione all’antimicrobico dell’isolato o la presenza di
reazioni crociate con altri antimicrobici utilizzati in campo. Per
quanto riguarda gli esiti di tiamulina, lincomicina e tilosina, sulla
324
base dei breakpoint clinici (4) è possibile discriminare gli isolati
in tre distinte popolazioni, sensibili, resistenti ed intermedi.
Sulla base di questa classificazione, 202/206 isolati, pari al
98%, sono risultati resistenti alla tilosina, 70/206, pari al 34%
alla tiamulina, e 114/204, pari al 56% alla lincomicina.
Analizzando i risultati in base all’anno di isolamento, e
suddividendo gli isolati in sensibili e non sensibili (resistenti ed
intermedi), è possibile osservare per tiamulina un trend tra gli
anni significativo (p-value=0,0328),evidenziando un aumento
di campioni non sensibili negli anni 2011 (OR=8,4), 2012
(OR=4,65) e 2013 (OR=4,44) rispetto al 2008. Un andamento
analogo è stato osservato per lincomicina, per i ceppi resistenti
(p-value=0,0276), pur non evidenziando nessun anno
statisticamente significativo. La stessa elaborazione non è
stata possibile per tilosina, per la mancanza di stipiti sensibili
per tre anni consecutivi.
Infine, 110/205 ceppi, corrispondenti al 54% degli isolati, sono
risultati multiresistenti; l’andamento negli anni (grafico 1),
valutato attraverso il χ2 for trend (p-value=0,0039), è risultato in
aumento: in particolare, risulta una differenza statisticamente
significativa per il 2011 (OR=8,4) e il 2013 (OR=4,32) rispetto
al 2008 (tabella 2).
I livelli di sensibilità rilevati attraverso gli stipiti conferiti
passivamente ai laboratori possono non descrivere in modo
accurato la situazione di campo: infatti, questi campioni derivano
generalmente da casi di particolare gravità o non rispondenti
ai trattamenti. Nonostante questo, i dati confermano quanto
rilevato in altri paesi europei, vale a dire un progressivo calo
della sensibilità di B.hyodysenteriae nei confronti degli antibiotici
tradizionalmente impiegati nel controllo della dissenteria suina.
In questa situazione, l’impiego prudente degli antibiotici, dove
ancora utilizzabili, appare non procrastinabile, mentre appare
urgente individuare a strategie alternative per il controllo di
questa patologia.
Bibliografia
1 Karlsson M, Aspán A, Landén A, Franklin A. (2004) Further
characterization of porcine Brachyspira hyodysenteriae isolates
with decreased susceptibility to tiamulin. J Med Microbiol.
53:281-5
2 Hidalgo Á, Carvajal A, Vester B, Pringle M, Naharro G, Rubio
P. (2011). Trends towards lower antimicrobial susceptibility and
characterization of acquired resistance among clinical isolates
of Brachyspira hyodysenteriae in Spain. Antimicrob Agents
Chemother. 55:3330-7.
3 Bonilauri P., Merialdi G., Calzolari M., Luppi A., Dottori M.
(2004) “Incremento del riscontro di ceppi multiresistenti di B.
hyodysenteriae in allevamenti suini del nord Italia”. Atti della
Società Italiana di patologia e allevamento del suino, XX Meeting
Annuale, Salsomaggiore Terme. 181-186
4 Rohde J., Kessler M., Baums C.G., Amtsberg G. (2004)
“Comparison of methods for antimicrobial susceptibility
testing and MIC values for pleuromutilin drugs for Brachyspira
hyodysenteriae isolated in Germany”. Vet. Microbiol. 102, 25-32.
5 Ronne H., Szancer J. (1990) “In vitro susceptibility of Danish field
isolates of Treponema hyodysenteriae to chemiotherapeutics”.
In: Proceedings of the International Pig Veterinary Society
Congress, Lausanne, Switzerland, 126.
6 Pringle M, Landén A, Unnerstad HE, Molander B, Bengtsson
B (2012) Antimicrobial susceptibility of porcine Brachyspira
hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli isolated in Sweden
between 1990 and 2010. Acta Vet Scand.;54:54.
Tabella 1: valori di Minima concentrazione inibente (MIC) suddivisi per antibiotici. E’ indicato il numero di ceppi testati che presentava
quel determinato valore, espresso in mg/ml. Sono sottolineate le concentrazioni effettivamente testate per ciascuna molecola.
Tiamulina
Lincomicina
Tilosina
0,031
0,063
11
0,125
8
0,25
18
0,5
24
2
1
30
5
2
32
2
2
4
13
11
1
8
70
21
1
16
32
64
128
26
0
24
1
114
4
197
Grafico 1: andamento dei ceppi multiresistenti nel periodo considerato
Tabella 2: OR di stipiti multiresistenti isolati negli anni 2008-2013
ANNO
2008
2009
2010
2011
2012
2013
OR
1
7,5
7,5
8,4
3,94
4,32
IC 95%
0,24-9,26
0,67-84,10
1,23-57,15
0,94-16,43
1-18,60
325
P-VALUE
0,6602
0,0543
0,0091
0,0422
0,0320
Totale
206
205
206
CLOSTRIDIUM DIFFICILE NELLA FILIERA DEL VITELLO A CARNE BIANCA
Magistrali C.F.1, Cucco L. 1, Felici A. 1, Dettori A. 1, Filippini G. 1, Broccatelli S. 1, Bano L.2, Pezzotti G. 1
1
2
Istituto Zooprofilatico Sperimentale Umbria Marche- Perugia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Treviso
Key words: vitello, Clostridium difficile, prevalenza
Abstract
Aim of this work is described prevalence and risk factors
of C.difficile infection in veal calves in Italy. The animals,
introduced into six herds belonging to two companies at 25
days of age, were sampled three times: at 0-16, 90-120 days
and at 150 days after introduction. At every sampling moment,
faecal samples were taken and the presence of diarrhoea was
recorded. Cecal contents and carcasses sponges were taken
at slaughter. C. difficile was isolated at least once from 87 out of
420 calves (20.7%). The overall prevalence at the first sampling
was 20,24%: in company A 29. 58% and 7.78% in company
B. A correlation with age and shedding was found: the OR
ranged from 2.79 for 36-45 days to 4.57 for 13-28 days. No
cecal contents or carcass sponges were positive at slaughter,
excluding a prevalence of infection higher than 3,5%. Finally,
the presence of diarrhoea at first sampling was significantly
associated with the infection (OR 3.26).
Introduzione
Clostridium difficile è responsabile della CDI, Clostridium
difficile infection, associata nell’uomo ad una serie di
manifestazioni cliniche differenti e considerata la causa
principale di diarrea nel mondo occidentale (1). La CDI è
tradizionalmente considerata come una malattia nosocomiale,
che si manifesta tipicamente in soggetti anziani, ospedalizzati e
che hanno subito un trattamento antibiotico. Tuttavia, nel corso
degli ultimi 10 anni, si è assistito ad un aumento di segnalazioni
di casi senza esposizione ai fattori di rischio, in pazienti della
comunità: la malattia così contraddistinta è stata denominata
community acquired-Clostridium difficile disease (CA-CDI) (2).
Contemporaneamente sono emersi alcuni ribotipi ipervirulenti,
quali lo 027 e il 078 (3). E’ stata quindi formulata l’ipotesi che
la CA-CDI riconosca un reservoir negli animali domestici,
supportata dalla diffusa presenza del ribotipo 078 in alcune
specie, quali il suino e il bovino (4).
Scopo di questo lavoro è stato studiare la prevalenza di
C. difficile in allevamenti italiani di vitello a carne bianca,
dall’introduzione in azienda fino al macello. Sono state inoltre
valutate l’età e la presenza di diarrea come fattori di rischio per
l’infezione.
Materiali e metodi
Allevamenti: il lavoro è stato condotto in sei allevamenti afferenti
a due aziende distinte: l’azienda A ha ospitato in media 6700
vitelli nel periodo del lavoro, mentre l’azienda B 3800. I vitelli,
di provenienza multipla, venivano introdotti ad un’età media di
25 giorni circa, e stabulati prima individualmente in gabbiette
e poi, a circa 2 mesi di età, in piccoli gruppi di 4-7 animali.
L’alimentazione differiva nelle due aziende: in entrambi si
utilizzavano sostituti del latte, ma nell’azienda A si utilizzavano
mais granella e mais ceroso, mentre nell’azienda B insilato di
mais e paglia. In tutte e due le aziende, gli animali venivano
abbattuti a 180-190 giorni di età in due macelli di grosse
dimensioni.
Campionamento: il lavoro è stato condotto da febbraio 2012 a
ottobre 2012. Complessivamente, sono stati prelevati 420 vitelli,
di cui 240 dall’azienda A e 180 dalla B. I vitelli, contrassegnati
individualmente, sono stati sottoposti a tre campionamenti
di feci individuali: a 0-16, 90-120 e 150 giorni circa dopo
l’introduzione in azienda.
Contemporaneamente, era registrata l’eventuale presenza di
diarrea. Infine è stato eseguito un campionamento al macello,
stratificato sulla base dell’allevamento di origine degli animali,
calcolando una prevalenza attesa del 3,5% L.C. 95% e una
precisione del 3%. Al macello sono stati prelevati il contenuto
ciecale e un tampone carcassa utilizzando spugnette preumidificate e campionando collo, punta del petto, linea alba e
inguine, sulla base sella procedura ISO 17604:2003.
Coltura: 1g di feci o di contenuto ciecale è stato coltivato
seguendo il protocollo di Arroyo (5) modificato: in breve, i
campioni erano seminati in TCCFB, cycloserine-cefoxitin
frucose broth, addizionato con lo 0,1% di taurocolato di sodio,
e incubati a 37% in anaerobiosi (5%H2-5%CO2-90%N2) per
7-10 giorni. Dopo l’incubazione, 2mL di ciascun brodo era
trattato con 2mL di etanolo al 96% e mantenuto a temperatura
ambiente per un’ora, quindi centrifugato a 3800 x g per 10
minuti, e il pellet seminato su ASEC, agar sangue addizionato
con il 5% di sangue equino e 0,1% di esculina. Le piastre
venivano quindi incubate a 37°C per 24-48 hrs in anaerobiosi.
In seguito, le colonie sospette, individuate sulla base della
morfologia, del caratteristico odore e dal colore nero al trans
illuminatore, venivano isolate su Agar sangue addizionato con
il 5% di sangue ovino e quindi confermate come C. difficile
dopo colorazione di Gram, test biochimico (Rapid ID32 A,
Biomerieux) e infine PCR diretta al gene housekeeping tpi (6).
Analisi statistica
E’ stata effettuata un’analisi descrittiva dei dati distribuendo
le variabili nel tempo e nelle due aziende.Al primo prelievo
è stata calcolata la prevalenza, con un livello di confidenza
del 95% (L.C. 95%), e relativi intervalli (I.C. 95%) sul totale
dei campioni e distintamente per l’azienda A e l’azienda
B.Tramite l’analisi univariata è stata valutata la differenza
tra le prevalenze delle due aziende.Inoltre è stata valutata
l’associazione tra la presenza di C. difficile e i fattori di rischio
(età dei vitelli, categorizzate in classi e diarrea), attraverso il
calcolo degli Odds Ratio (OR) e i relativi intervalli di confidenza
al 95% (IC95%), considerando significativo un p-value ≤0,05.
C. difficile è stato isolato almeno una volta da 87 /420 animali
inclusi nello studio, corrispondenti al 20,7%. La prevalenza
di C. difficile al primo prelievo complessivamente è stata del
20,24% (I.C. 95%: 16,79%-24,07%). Distinguendo i dati nelle
due filiere, si osserva come la prevalenza di C. difficile al primo
prelievo nell’azienda A si riveli del 29,58% (I.C. 95%: 24,36%35,25%), mentre nella B si è attestata al 7,78% (I.C. 95%:
326
4,81%-11,93%). Questa difformità registrata non deve stupire,
infatti i dati di prevalenza di C. difficile nei vitelli riportati in
letteratura sono molto variabili tra il 7 e il 60%. Molteplici fattori
sono stati chiamati in causa per spiegare questa variabilità, tra
cui i differenti sistemi di produzione, i momenti di prelievo e
metodi per evidenziare l’infezione (6,7). Nel nostro caso, sia i
momenti di prelievo che i metodi impiegati sono stati gli stessi
e quindi è possibile attribuire la difformità riscontrata ad un
effettiva diversa diffusione del batterio nelle due filiere.
Nel presente lavoro, la probabilità di eliminare C. difficile
con le feci al primo prelievo era quasi 5 volte più elevata per
i vitelli allevati nell’azienda A rispetto alla B (OR 4,98; limite
inferiore 95% 2,70; limite superiore 95%: 9,18). E’ possibile
che questa differenza di prevalenza sia legata ad una diversa
contaminazione iniziale degli animali, che provenivano in
entrambi i casi da fonti multiple. Un’altra ipotesi è che le
condizioni di allevamento in cui si trovavano i vitelli della
filiera A possano avere favorito l’infezione da C. difficile.
Numerosi fattori gestionali possono avere contribuito a questa
discrepanza, tra cui le pratiche igieniche, l’alimentazione, e
infine i diversi trattamenti antibiotici utilizzati nella filiera A e in
quella B, o negli allevamenti d’origine.
Nessun campione prelevato a 150 giorni o al macello (contenuto
ciecale o spugnetta da carcassa) ha invece fornito esito positivo.
Sulla base di questo lavoro, quindi, l’ipotesi di una trasmissione
foodborne dell’infezione non può essere confermata, anche se
permangono dei rischi ipotetici per il personale di stalla.
I dati relativi a ciascun momento del campionamento sono
indicati in tabella 1 e grafico 1. Uno dei tre vitelli che eliminavano
a 90-120 giorni, era positivo anche al prelievo precedente. La
maggior parte dei vitelli è risultata positiva al primo prelievo,
in prossimità della introduzione in azienda. Questo andamento
può essere legato alla presenza di diversi fattori: è possibile
che le caratteristiche delle aziende in esame, in particolare la
presenza di pavimento grigliato o il cambiamento della dieta,
rispetto a quelle di provenienza, abbiano favorito il ridursi
progressivo della prevalenza.
E’ anche possibile ipotizzare una maggiore sensibilità
all’infezione in animali giovani, già osservata in altre specie (8,9).
Valutando il momento in cui è stato effettuato il primo prelievo,
è stato infatti possibile stabilire un’associazione indirettamente
proporzionale tra l’età degli animali e l’eliminazione di C.difficile
(tabella 2). E’ quindi possibile confermare l’età come fattore di
rischio per l’infezione nel vitello, come già rilevato da altri autori
(6,7,10).
Infine, nel corso del presente lavoro, la presenza di diarrea al
primo campionamento si è rivelata significantemente associata
alla escrezione di C. difficile nelle feci (Tabella 2). Il ruolo di C.
difficile come agente di diarrea nel vitello è oggetto di dibattito in
letteratura (6,7,11); è possibile d’altra parte che l’associazione
da noi osservata sia da attribuirsi a ragioni diverse ad un suo
ruolo eziologico; è ipotizzabile, ad esempio, che l’escrezione di
questo batterio aumenti durante un episodio diarroico.
In conclusione, nel corso di questo lavoro l’infezione di C. difficile
nella filiera del vitello a carne bianca è apparsa localizzata nelle
prime fasi dopo il ristallo, e associata alla giovane età e alla
presenza di diarrea.
Bibliografia
1. Bauer M. P. Kuijper E. J. Van Dissel J. T. European Society
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID):
treatment guidance document for Clostridium difficile infection
(CDI) Clinical Microbiology and Infection. 2009;15(12): 1067–
1079.
2. Keessen EC, Gaastra W, Lipman LJ. Clostridium difficile
infection in humans and animals, differences and similarities.
Vet Microbiol. 2011 Dec 15;153(3-4):205-17. doi: 10.1016/j.
vetmic.2011.03.020. Epub 2011 Mar 26.
3. Jones AM, Kuijper EJ, Wilcox MH. Clostridium difficile: a
European perspective. J Infect. 2013 Feb;66(2):115-28.
4. Bauer MP, Notermans DW, van Benthem BH, Brazier JS,
Wilcox MH, Rupnik M, Monnet DL, van Dissel JT, Kuijper EJ;
ECDIS Study Group. Clostridium difficile infection in Europe:
a hospital-based survey. Lancet. 2011 Jan 1;377(9759):63-73.
5. International Standard Organization (ISO) ISO 17604:2003,
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Carcass
sampling for microbiological analysis.
6. Arroyo LG, Rousseau J, Willey BM, Low DE, Staempfli H,
McGeer A, Weese JS.Use of a selective enrichment broth to
recover Clostridium difficile from stool swabs stored under
different conditions. J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):5341-3.
7 Lemee, L. et al. Multiplex PCR targeting tpi (triose phosphate
isomerase), tcdA (toxin A), and tcdB (toxin B) genes for
toxigenic culture of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 2004:
42, 5710-5714.
8. Zidaric V, Pardon B, Dos Vultos T, Deprez P, Brouwer MS,
Roberts AP, Henriques AO, Rupnik M. Different antibiotic
resistance and sporulation properties within multiclonal
Clostridium difficile PCR ribotypes 078, 126, and 033 in a single
calf farm. Appl Environ Microbiol. 2012 Dec;78(24):8515-22
9. Rodriguez-Palacios A, Koohmaraie M, LeJeune JT.
Prevalence, enumeration, and antimicrobial agent resistance
of Clostridium difficile in cattle at harvest in the United States..
J Food Prot. 2011 Oct;74(10):1618-24.
10. Zidaric V, Zemljic M, Janezic S, Kocuvan A, Rupnik M. High
diversity of Clostridium difficile genotypes isolated from a single
poultry farm producing replacement laying hens.Anaerobe.
2008 Dec;14(6):325-7.
11. Costa MC, Stämpfli HR, Arroyo LG, Pearl DL, Weese JS.
Epidemiology of Clostridium difficile on a veal farm: prevalence,
molecular characterization and tetracycline resistance. Vet
Microbiol. 2011 Sep 28;152(3-4):379-84.
12. Hammitt MC, Bueschel DM, Keel MK, Glock RD, Cuneo P,
DeYoung DW, Reggiardo C, Trinh HT, Songer JG. A possible
role for Clostridium difficile in the etiology of calf enteritis.Vet
Microbiol. 2008 Mar18;127(3-4):343-52.
Tabella 1: risultati suddivisi per filiera di appartenenza e momento di prelievo.
Filiera A+B
Giorni
0-16
90-120
150
Totale
Campionati
420
416
313
1159
pos
85
3
0
88
Filiera A
% pos
20,23
0,72
0
7,59
Campionati
240
238
169
647
327
pos
71
2
0
73
Filiera B
% pos
29,58
0,84
0
11,28
Campionati
180
178
144
502
pos
14
1
0
15
% pos
7,77
0,56
0
2,98
CARATTERIZZAZIONE DI ISOLATI DI CLOSTRIDIUM DIFFICILE NELLA FILIERA
DEL VITELLO A CARNE BIANCA
Tabella 2. fattori di rischio valutati e relativi OR.
Diarrea
Età al prelievo
Fattori di rischio
OR
Limite inferiore 95%
Limite superiore 95%
P-value
46-90 giorni
1
-
-
-
13-28 giorni
4,57
1,98
10,53
0,000
29-35 giorni
4,16
1,79
9,69
0,001
36-45 giorni
2,79
1,17
6,67
0,021
Assenza
1
-
-
-
Presenza
3,26
1,97
5,40
0,000
Figura 1: numero di prelievi per momento di prelievo, suddivisi in base all’esito
Magistrali C.F.1, Cucco L. 1, Maresca C. 1, Tartaglia M. 1, Filippini G. 1, Broccatelli S. 1, Bano L.2, Drigo I. 2, Pezzotti G. 1
1
2
Istituto Zooprofilatico Sperimentale Umbria Marche- Perugia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Treviso
Key words: vitello, Clostridium difficile, prevalenza
Abstract
Aim of this work is to describe ribotypes, virulence determinants
and antibiotic sensitivity of C. difficile isolates from veal calves
in Italy. The work has been carried out on 80 isolates from
six herds, belonging to two large companies in Northern Italy.
Isolates were typed for ribotype, virulence determinants and
finally for antibiotic sensitivity using a E-test method. 76/80
isolates belong to 4 ribotypes only, and 54% of them to 078.
Genes codifying for the major toxins were found: in particular,
Tox B was very common, with 91% of the isolates positive
for this virulent factor. The profile shown by the 078 isolates
(43/43) was ToxA/ToxB/binary toxin/ 39 bp deletion of tcdC.
These isolates were resistant to 5/6 tested antimicrobials and,
more generally, an association between resistance and ribotype
was shown. These findings support the hypothesis that calves,
among other animal species, could act as a reservoir for hyper
virulent strains of C. difficile.
Introduzione
Clostridium difficile è un batterio gram positivo, sporigeno ed
anaerobio oggi considerato come una delle cause più frequenti
di infezioni nosocomiali (1). Tradizionalmente, la popolazione
a rischio è costituita da soggetti anziani, ospedalizzati e che
avevano subito un trattamento antibiotico. Tuttavia, nel corso
degli ultimi 10 anni, si è assistito ad un aumento di segnalazioni
di casi senza esposizione ai fattori di rischio, in pazienti della
comunità, correlata alla comparsa di alcuni ribotipi ipervirulenti,
quali lo 027 e il 078 (2). Il ribotipo 078 è considerato dominante
in alcune specie di animali domestici, quali il suino e il bovino
(3): di conseguenza, è stato ipotizzato un ruolo da reservoir
di queste specie. In un altro lavoro, abbiamo riportato la
prevalenza di C. difficile in allevamenti della filiera del vitello
a carne bianca in Italia: le informazioni relative al ribotipo,
tossinotipo e antibiotico resistenza in questa categoria
produttiva sono tuttavia ancora lacunose.
Scopo di questo lavoro è stato caratterizzare isolati di C. difficile
in allevamenti italiani di vitello a carne bianca, valutandone
l’appartenenza ai diversi ribotipi, la presenza di geni codificanti
per le principali tossine ed infine la sensibilità agli antimicrobici.
Materiali e metodi
Isolati: nel corso del presente lavoro, sono stati esaminati
79 stipiti di C. difficile, da altrettanti vitelli. Questi isolati
corrispondevano a quelli ottenuti in un precedente lavoro
sulla prevalenza di C. difficile nella filiera del vitello a carne
bianca. Il lavoro, condotto da febbraio 2012 a ottobre 2012,
ha interessato sei allevamenti afferenti a due filiere: la filiera A
ha ospitato in media 6700 vitelli nel periodo del lavoro, mentre
la filiera B 3800. In entrambe le filiere, nel periodo del lavoro
sono stati utilizzati antibiotici per metafilassi o terapia in tutti gli
animali sottoposti a prelievo. Sono stati utilizzati aminoglicosidi,
beta lattamici, chinoloni, florfenicolo, lincosamidi , macrolidi,
328
polimixine, sulfamidici e tetraciciline, in percentuali variabili. In
particolare, tutti gli animali hanno ricevuto un trattamento con
sulfamidici e tetracicline, mentre l’impiego di beta lattamici e
delle polimixine era diffuso nella filiera A, quello dei chinoloni e
dei macrolidi nella filiera B. 1 g di feci o di contenuto ciecale è
stato coltivato seguendo il protocollo di Arroyo (4), modificato;
per informazioni dettagliate relative all’isolamento dei ceppi si
rimanda al lavoro indicato.
PCR-ribotipizzazione. La ribotipizzazione è stata eseguita
come descritto da Bidet et al. (5). Tale metodica ha previsto
l’amplificazione dello spazio intergenico tra l’rDNA 16S e 23S
attraverso l’utilizzo di specifici primers e la separazione dei vari
frammenti in gel di agarosio.
Rilevazione dei geni codificanti le tossine. la presenza dei geni
tcdA e tcdB è stata evidenziata mediante il metodo descritto da
Lemee et al. (6) mentre per la rilevazione dei geni codificanti la
tossina binari è stato adottato il protocollo proposto da Stubbs
et al. (7)
Analisi del gene regolatore tcdC. Per la rilevazione delle
eventuali delezioni a carico del gene tcdC è stato utilizzato il
protocollo descritto da Antikainen et al. (8)
Sensibilità agli antimicrobici: 82 isolati sono stati sottoposti
a test per la valutazione della sensibilità ad Ampicillina,
Clindamicina, Cloramfenicolo, Enrofloxacin, Eritromicina e
Tetraciclina, utilizzando il metodo E-test (Biomerieux), su
piastre di Agar Brucella (Becton Dickinson) addizionato con
sangue lisato di cavallo al 5%. Le piastre sono state incubate
in condizioni di anaerobiosi (H2-CO2-N2, 5,5 e 90%) per 48
ore, e successivamente lette ad occhio nudo. Bacteroides
fragilis (ATCC 25285) è stato usato come controllo di qualità,
verificando che i risultati si collocassero negli intervalli indicati
dalle norme M11-A6 (9). I breakpoint per l’interpretazione dei
risultati sono stati derivati dallo stesso documento o, quando
non presenti, derivati da pubblicazioni (10). Sono stati giudicali
come multi resistenti gli stipiti che presentavano resistenza a 3
o più antimicrobici.
I dati relativi alla distribuzione dei diversi ribotipi all’interno delle
due filiere sono indicati in tabella 2. Sono stati rilevati 8 ribotipi
differenti, dei quali 5 erano presenti in entrambe le filiere. Per
quanto riguarda la diffusione dei ribotipi, questa è apparsa
simile, ad eccezione del ribotipo 033, isolato da cinque soggetti
nella filiera B, e solo una volta nella filiera A.
76/80 isolati appartengono a soli quattro ribotipi, 078, 012, 126
e 033. In particolare, si è osservata una prevalenza del ribotipo
078, isolato nel 54% dei casi: il ribotipo 078 è riconosciuto come
ribotipo dominante in molte specie animali, tra cui il bovino. I
ribotipi 078, 012 e 126 sono inoltre compresi nell’elenco dei
ribotipi più comunemente isolati negli ospedali europei, sulla
base di un recente lavoro (3). In particolare, il ribotipo 078 è
considerato emergente in Europa, ed è stato isolato da circa
329
un terzo dei casi di CDI nell’uomo (3). Per quanto riguarda la
distribuzione dei geni codificanti per le principali tossine, questa
è indicata in tabella 3: 73/80 stipiti, e tutti quelli appartenenti
ai ribotipi 078, 012 e 126, sono risultati positivi per ToxB, che
rappresenta il principale marker di patogenicità. L’analisi per la
ricerca della delezione 39 bp di tcdC, che conferisce maggiore
patogenicità, legata ad un aumento della produzione di tossine,
ha rivelato la sua presenza in 62 isolati . Quest’ultima era
prevalente dei ribotipi 078 (43/43), 033 (6/6) e 126 (11/11),
mentre i ceppi appartenenti al ribotipo 012, TV43 e TV42 non
presentavano delezioni del gene regolatore tcdC. Il Per quanto
riguarda la sensibilità agli antimicrobici, le MIC90 registrate per
clindamicina, eritromicina e tetraciclina si collocavano a valori
>256 mg/ml, quello di ampicillina a 4 mg/ml, cloramfenicolo a 8
mg/ml e infine enrofloxacin a >32 mg/ml. Analizzando i dati sulla
base dei breakpoint riportati in letteratura, il 27% degli stipiti è
risultato sensibile ad ampicillina, il 6% a clindamicina, il 95% a
cloramfenicolo, il 5% ad eritromicina e il 2% a tetraciclina. La
distribuzione delle sensibilità sembra essere correlata al ribotipo:
infatti, il profilo di resistenze più comune registrato per 078 è
stato:
clindamicina/cloramfenicolo/enrofloxacin/eritromicina/
tetraciclina. La quasi totalità degli isolati appartenenti al
ribotipo 012 (14/15) è risultata resistente ad ampicillina, mentre
gli unici sei isolati sensibili alla eritromicina appartenevano al
ribotipo 033. La presenza di antibiotico resistenza nei ceppi
di C. difficile isolati dal vitello è stata segnalata da diversi
autori e sembra essere correlata con l’impiego di antimicrobici
in allevamento. Negli allevamenti oggetto di studio, il diffuso
utilizzo di antimicrobici può avere determinato un vantaggio
selettivo per gli stipiti resistenti.
Concludendo, nel presente lavoro si è descritta la presenza di
ceppi dotati di numerosi determinanti di virulenza e resistenti
agli antimicrobici nella filiera del vitello a carne bianca in
Italia. Sulla base di questi dati è quindi possibile sospettare
un possibile ruolo del vitello a carne bianca come reservoir di
ceppi ipervirulenti.
Bibliografia
1. Keessen EC, Gaastra W, Lipman LJ. Clostridium difficile
infection in humans and animals, differences and similarities.
Vet Microbiol. 2011 Dec 15;153(3-4):205-17. doi: 10.1016/j.
vetmic.2011.03.020. Epub 2011 Mar 26.
2. Jones AM, Kuijper EJ, Wilcox MH. Clostridium difficile: a
European perspective. J Infect. 2013 Feb;66(2):115-28.
3. Bauer MP, Notermans DW, van Benthem BH, Brazier JS,
Wilcox MH, Rupnik M, Monnet DL, van Dissel JT, Kuijper EJ;
ECDIS Study Group. Clostridium difficile infection in Europe: a
hospital-based survey. Lancet. 2011;377(9759):63-73.
4. Arroyo LG, Rousseau J, Willey BM, Low DE, Staempfli H,
McGeer A, Weese JS.Use of a selective enrichment broth to
recover Clostridium difficile from stool swabs stored under
different conditions. J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):5341-3.
5. Bidet, P., Barbut, F., Lalande, V., Burghoffer, B. & Petit, J. C.
Development of a new PCR-ribotyping method for Clostridium
difficile based on ribosomal RNA gene sequencing. FEMS
Microbiol. Lett. 1999; 175, 261-266.
6.Lemee, L. et al. Multiplex PCR targeting tpi (triose phosphate
isomerase), tcdA (toxin A), and tcdB (toxin B) genes for
toxigenic culture of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 2004:
42, 5710-5714.
7. Stubbs, S. et al. Production of actin-specific ADPribosyltransferase (binary toxin) by strains of Clostridium
difficile. FEMS Microbiol. Lett.2000; 186, 307-312.
8. Antikainen, J. et al. Detection of virulence genes of Clostridium
difficile by multiplex PCR. APMIS 2009; 117, 607-613.
9. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods
for antimicrobial susceptibility testiting of anaerobic bacteria;
approved standard-Sixth edition M11-A6 6th ed. Wayne, PA:
CLSI; 2004.
10. Peláez T, Alcalá L, Blanco JL, Alvarez-Pérez S, Marín M,
Martín-López A, Catalán P, Reigadas E, García ME, Bouza E.
(2013) Characterization of swine isolates of Clostridium difficile
in Spain: A potential source of epidemic multidrug resistant
strains? Anaerobe: 45-9.
Tabella 1. distribuzione dei diversi ribotipi, suddivisi per filiera.
Ribotipo
RT-078
Filiera A
Filiera B
Totale
N
%
N.
%
N.
%
37
56,0%
6
42,9%
43
53,8%
RT-012
14
21,2%
1
7,1%
15
18 8%
RT-126
11
16,7%
1
7,1%
12
15,0%
RT-033
1
1,5%
5
35,7%
6
7,5%
TV40
1
1,5%
-
-
1
1,2%
TV41
1
1,5%
-
-
1
1,2%
TV42
-
-
1
7,1%
1
1,2%
TV43
1
1,5%
-
-
1
1,2%
Totale
66
100%
14
100%
80
100,0%
Tabella 2: distribuzione dei geni codificanti per le principali
tossine, distinte per ribotipo
330
Ribotipo
Totale
Tox A
Tox B
CDT
RT-078
43
43
43
43
RT-012
15
15
15
3
RT-126
12
-
12
12
RT-033
6
6
-
6
TV40
1
-
-
-
TV41
1
1
1
1
TV42
1
1
1
-
TV43
1
1
1
-
Total
80
66
73
65
SORVEGLIANZA EPIDEMIOLOGICA DEI MICRORGANISMI PATOGENI
DI INTERESSE ALIMENTARE
Malanga M. 1, Bertasi B.1, Pavoni E.1, Losio M. N.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (IZSLER), Via Bianchi, 9 – 25124 Brescia
Centro di Referenza Nazionale per i Rischi Emergenti in Sicurezza Alimentare
1
Key words: food-borne pathogens, vegetables, PCR
SUMMARY
The main goal of this work was to standardize common
procedures of pathogens isolation and detection in raw and
ready to eat (RTE) vegetables, and to activate a dynamic
system able to collect the informations regarding the
characteristics of isolated strains. These informations are an
important tool to track the microorganisms in food and to
compare food strains with human strains, isolated in case
of human disease. The work is focused not only on bacterial
strains, but also on viral strains, widely recognized as one of
the most important causes of human gastroenteritis.
INTRODUZIONE
L’analisi del rischio è ampiamente riconosciuta come la
principale metodologia alla base della messa a punto
di standard di sicurezza alimentare. Ciò è ovviamente
condizionato da una corretta valutazione del rischio che
tenga conto dei pericoli riconosciuti a livello di tutte le fasi
della catena alimentare.
I metodi colturali utilizzati in ambito microbiologico non
sono infatti caratterizzati da un livello di sensibilità tale da
poter consentire di stabilire livelli di attenzione; di contro,
va sottolineato come i metodi molecolari in uso, a causa di
un’elevata variabilità e di una scarsità di metodiche validate,
producano frequentemente risultati poco confrontabili e
quindi inutilizzabili in ambito di analisi del rischio.
Tali problematiche, seppure vere per tutti i patogeni di natura
batterica, sono ancora più accentuate per i virus, data la
completa assenza di metodi di riferimento (eccezion fatta per
la ISO-TS 15216/2 (1)) e la loro scarsa capacità di replicare
in colture cellulari.
Una corretta valutazione epidemiologica della circolazione
dei patogeni non può prescindere da una caratterizzazione
degli stessi che si limiti alle tradizionali valutazioni di
ordine biochimico e morfologico; attualmente, esistono altri
approcci, che consentono una più fine caratterizzazione su
base molecolare. Tali metodi, tuttavia, producono risultati
non sempre confrontabili con quelli prodotti da altri metodi
simili e con quelli relativi ad informazioni di ordine fenotipico.
Pertanto, è rilevante poter disporre di un sistema in grado di
organizzare tutte le informazioni connesse ad ogni singolo
ceppo e di stabilire, sulla base della tecnica molecolare
impiegata, le percentuali di similitudine tra i diversi ceppi.
Quest’ ultimo approccio, che si basa sul confronto dei dati
di ribotipizzazione automatica (2) e di Pulsed Field Gel
Electrophoresis (PFGE) (3 ) permette di ideare un nuovo
sistema dinamico in grado di fornire utili e dettagliate
informazioni sulla tipizzazione dei ceppi. In questo contesto
sono stati presi in considerazione i prodotti vegetali di I e di
IV gamma che, a causa della loro facile deperibilità e della
potenziale presenza di microrganismi patogeni, potrebbero
rappresentare un rischio per il consumatore.
La vita commerciale dei prodotti di IV gamma dipende dalle
caratteristiche organolettiche dei diversi vegetali, ma anche
dal sistema di produzione, dalla loro conservazione e dalla
gestione del prodotto da parte del consumatore. Una shelflife media per le insalate è dell’ordine di una settimana. In
generale, la microbiologia e la fisiologia di questi prodotti
portano ad escludere tentativi di prolungamento della
shelf-life oltre i limiti accettabili, al fine di evitare fenomeni
di deperimento o di sviluppo dei patogeni oltre i limiti
consentiti. Scopo di questo studio è stato quello di verificare
la presenza dei principali patogeni alimentari (Salmonella
spp., L. monocytogenes, E.coli O157:H7, Campylobacter
jejuni, coli e lari, Y. Enterocolitica, Norovirus, Enterovirus,
virus dell’epatite A-HAV) in prodotti vegetali di I e IV gamma
disponibili sul mercato italiano, al fine di valutare il rischio
sanitario associato al loro consumo.
MATERIALI E METODI
Nel periodo tra gennaio 2010 e febbraio 2012 è stato
eseguito un piano di monitoraggio sulle matrici vegetali,
svolgendo analisi per i principali patogeni batterici. Le
analisi sono state eseguite presso L’istituto Zooprofilattico
Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna
(IZSLER) di Brescia, laboratorio di Microbiologia e Virologia
degli Alimenti. In totale, sono stati analizzati 399 campioni di
cui 193 di I gamma e 206 di IV gamma. Di questi, 399 sono
stati analizzati per la presenza di virus enterici e parassiti,
mentre 354 per i microrganismi batterici.
Le analisi virali sono state eseguite secondo metodiche
biomolecolari e, per quanto riguarda i batteri, sono state
svolte in parallelo anche quelle di microbiologia tradizionale
(in accordo alle norme ISO in vigore).
Su 399 campioni analizzati per contaminazioni virali,
12 campioni sono risultati positivi per HAV (3%), 9 per
Enterovirus (2,3%), 1 per Calicivirus (0,3%), 6 per Rotavirus
(1,5%), e 2 per HEV (0,5%). Inoltre, 2 campioni sono risultati
positivi in PCR per Toxoplasma gondii (0,5%) ed 1 per
Cryptosporidum parvum (0,3%) (Tabella 1).
Il campione positivo in PCR Real time per Listeria
monocytogenes, non è stato confermato in coltura.
Viceversa, Y. Enterocolitica, negativa tramite PCR real
time, è stata rilevata in 10 campioni con i metodi culturali
tradizionali (Tabella 2).
331
Tabella 1 - risultati analisi virologiche e batteriologiche
mediante PCR e PCR Real time (*)
POSITIVI IN
PCR
NEGATIVI
IN PCR
ANALIZZATI
12 (3%)
387
399
HAV
Enterovirus
9 (2,3%)
390
399
Calicivirus
1 (0,3%)
398
399
Norov GI – GII*
0
399
399
Rotavirus
6 (1,5%)
333
399
HEV
2 (0,5%)
397
399
Toxoplasma gondii
2 (0,5%)
397
399
C. parvum
1 (0,3%)
398
399
Y. Enterocolitica*
0
354
354
L.Monocytogenes*
1 (0,3%)
353
354
Salmonella spp*
0
354
354
Campylobacter*
0
354
354
E.Coli O157:H7*
0
354
354
Tabella 2 – risultati delle analisi batteriologiche eseguite
mediante metodi ISO
POSITIVI
NEGATIVI
ANALIZZATI
Y. Enterocolitica
(ISO 10273:2003)
10 (3,7%)
261
271
Y. Intermedia
(ISO 10273:2003)
1 (0,4%)
270
271
L. Monocytogenes
(ISO 11290 parte
1:2004)
0
271
271
0
271
271
0
271
271
0
221
221
Salmonella spp
(ISO 6579: 2002)
Campylobacter
termotolleranti
(ISO 10272
1:2006)
E. Coli O157:H7
(ISO 16654)
Uno degli obiettivi del lavoro è stato quello di verificare l’applicabilità,
nello screening di campioni alimentari di origine vegetale, di metodi
biomolecolari. Il disegno sperimentale ha avuto come obiettivo
l’osservazione del processo produttivo dei prodotti vegetali RTE
(IV gamma), eseguendo le analisi microbiologiche sia sui lotti di I
gamma che sui lotti trasformati in IV gamma.
Le analisi eseguite con metodi molecolari hanno dimostrato una
maggiore contaminazione nei prodotti di I gamma (23 campioni)
di cui 9 solo per HAV, 6 per Enterovirus, 3 per Rotavirus, 2 di HEV,
2 di Toxoplasma Gondii e 1 di L. monocytogenes. Per quel che
riguarda la IV gamma sono stati ritrovati 11 campioni positivi ,
3 in HAV, 3 in Enterovirus, 3 in Rotavirus, 1 in Calicivirus e 1 in
C.Parvum (Tabella 3).
Questo dato risulta in linea con le aspettative, dal momento che
le matrici di I gamma sono vendute senza fasi di processamento
dopo la raccolta (4). Al contrario, la positività degli 11 campioni
di IV gamma ha indotto a considerare che nei sistemi di
individuazione e gestione del rischio da parte delle aziende
produttrici (HACCP-Hazard Analysis and Critical Control Point),
vi siano ancora carenze da correggere e superare, soprattutto
nella fase di lavaggio e mondatura.
Un obiettivo del lavoro è stato quello di verificare il grado di
contaminazione dei prodotti vegetali attraverso un cospicuo
campionamento: i lotti analizzati hanno evidenziato una qualità
igienico-sanitaria medio-alta degli stessi. Questo risultato deve
comunque essere interpretato anche in relazione alle aziende
coinvolte nello studio, che spesso si sono presentate come
leader del settore dei vegetali freschi. Altre aziende, seppur
di piccole-medie dimensioni, hanno dimostrato comunque
una qualità elevata dei loro prodotti. Non tutte le positività in
Real-Time PCR sono state confermate con i metodi colturali
tradizionali. In generale, i metodi molecolari sono caratterizzati
da una maggiore sensibilità. Tuttavia, poiché non danno
informazioni circa la vitalità dei microrganismi, necessitano di
conferma mediante metodi colturali tradizionali, che permettono
al contrario, di isolare il microrganismo vivo e vitale.
I dati ottenuti, saranno impiegati per l’attivazione dell’analisi
del rischio associate ad alimenti di origine vegetale. Inoltre,
l’attivazione di piani di controllo finalizzati, contribuisce a
definire meglio i livelli di esposizione ai maggiori contaminanti
microbiologici a cui la popolazione è esposta. Queste
informazioni saranno quindi utilizzate allo scopo di dare
sempre maggiori garanzie di “sicurezza alimentare” attraverso
l’attuazione di tutte le misure in grado di impedire o ridurre
il verificarsi di condizioni di esposizione a livelli di rischio
inaccettabili. Attualmente sono in corso, le analisi dei profili
di fingerprinting della ribotipizzazione e della PFGE, al fine di
implementare i dati di filogenesi ed i dendogrammi riferibili ai
campioni contaminati con i patogeni maggiormente ricorrenti.
BIBLIOGRAFIA
Tabella 3-distribuzione dei campioni positivi per tipologia
di matrice
HAV
Campioni
I Gamma
9
Campioni
IV Gamma
3
Enterovirus)
6
3
Calicivirus
0
1
Rotavirus
3
3
HEV
2
0
Toxoplasma gondii
2
0
L.Monocytogenes
1
0
C. parvum
0
1
j
332
1. ISO-TS 15216/2. Microbiology of food and animal feed
– Horizontal method for determination of hepatitis A
virus and norovirus in food using real time PCR. Part
2: method for qualitative detection.
2. Ryu C.S., Czajka J.W., Sakamoto M., Benno Y.
“Characterization of the Lactobacillus casei group
and the Lactobacillus acidophilus group by automated
ribotipyping”. Microbiol Immunol 45(4) 271-275 (2001).
3. One day (24 – 48 h) Standardized laboratory Protocol
for Molecular Subtyping of Escherichia Coli O157:H7,
Salmonella Sonnei, and Shighella flexnery by Pulsed
Field gel Electrophoresis (PFGE): NulseNet USA.
( h t t p : / / w w w. p u l s e n e t i n t e r n a t i o n a l . o r g /
SiteCollectionDocuments/pfge/5%201PNetStand E
Coli whith Sflexneri. pdf)
4. Warriner K, Ibrahim F, Dickinson M, Wright C and
Waites WM, 2003. Internalization of human pathogens
within growing salad vegetables. Biotechnol Genet
Eng Rev, 20, 117-134.
ZANZARE ESOTICHE (AEDES) NEI PORTI PUGLIESI:
RISULTATI PRELIMINARI DI UNO STUDIO PILOTA
Mancini G.1, Chiocco D.1, Galante D.1, Palmisano L.2, Raele D.1, Nardella La Porta C.1, Schino G.1, Cafiero M.A.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Entomologia Sanitaria, Via Manfredonia, 20 - 71121 Foggia
2
Ufficio di Sanità Marittima e Aerea di Bari, Unità di Taranto, Ufficio periferico del Ministero della Salute, Porto Mercantile 74123 Taranto
Key words: invasive mosquitoes, seaports, traffics
SUMMARY
People’s increased mobility and international trade play
important roles in the dissemination of vectors and their
pathogens. Taranto and Bari seaports (Italy, Apulia region)
were surveyed for mosquitoes. A questionnaire was used
to gather baseline informations on traffics (passenger and
commercial). A total of 570 mosquitoes were collected. All of
them were endemic and locally common, with a prevalence
of Culex pipiens and Aedes albopictus. Imported tyres and
ornamental plants from Asia were registered at these sites.
Mosquitoes surveillance at ports in Italy is an important
tool in our ability to deal swiftly with invasions of aedinae
mosquitoes.
INTRODUZIONE
Il fenomeno delle invasioni da parte di organismi
biologici alloctoni è in costante espansione, per via
della movimentazione globale di merci e persone e per i
cambiamenti climatici. Nel caso di zanzare esotiche del
genere Aedes (Ae.), esso può rappresentare un serio
problema sanitario per le popolazioni animali e l’uomo, con
ragguardevoli costi economici e sociali. Capaci di spostarsi
passivamente anche molto lontano dai paesi di origine,
attraverso il traffico di alcune merci (pneumatici e piante
ornamentali), numerose specie sono caratterizzate da
spiccata attività ematofaga, antropofilia e competenza nei
confronti di diversi virus zoonotici (Febbre Gialla, Dengue,
Chikungunya) originari di Paesi tropicali che però, in era
di globalizzazione, sempre più spesso sono segnalati in
territorio europeo, al pari dei loro vettori. Ne è un esempio
la zanzara asiatica Ae. albopictus ormai presente in alte
densità in molti Paesi, Italia inclusa, dove a partire dal
momento del suo primo ingresso (Porto di Genova) nel
1990 con l’importazione di pneumatici usati, in poco più di
un ventennio ha invaso la maggior parte delle città italiane.
In Emilia Romagna nel 2007, essa ha contribuito al primo
outbreak europeo di focolaio autoctono di una patologia
tropicale (Chikungunya) trasmessa da vettori, passando
da “fastidioso” insetto a pericoloso vettore di Arbovirus.
Nell’occasione, il rilevamento del virus in popolazioni locali
di Ae. albopictus (1) ha confermato il ruolo di questo culicide
come principale vettore della malattia. Altre specie del genere
Aedes, tuttavia, sono state occasionalmente registrate in
diversi paesi Europei: Ae. japonicus in Francia e Belgio,
Ae. atropalpus in Olanda e in Italia, Ae. aegypti in Olanda
e Portogallo, Ae. koreicus recentemente in Nord Italia (2).
Anche se, in alcuni di questi casi, gli interventi messi in atto
hanno permesso di eradicare i focolai, il rischio di importare
nuove popolazioni è alto, soprattutto in Italia, dove condizioni
geografiche, paesaggistiche, ambientali e climatiche di molte
regioni risultano particolarmente favorevoli a tali vettori. Il
territorio pugliese appare particolarmente vulnerabile per
la presenza di molte di queste caratteristiche (posizione,
clima, sviluppo costiero, ecc.) e di numerosi porti. Anche se,
attualmente, tra i culicidi del genere Aedes è registrata in
Puglia la sola specie Ae. albopictus, con importanti livelli di
infestazione in numerose città costiere (Cafiero, dati IZSPB),
temuto è l’ingresso di Ae. aegypti (3), già segnalata nei porti
pugliesi di Bari e Taranto, nel periodo successivo al primo
conflitto mondiale (4). Porti e aeroporti rappresentano la
principale via di entrata di vettori e patogeni esotici, come
evidenziato da diversi organismi scientifici anche in Italia,
che raccomandano azioni di sorveglianza e controllo sempre
più mirate (5). Sulla base di queste considerazioni è stato
intrapreso uno studio (2012-2013) epidemiologico sui
culicidi esotici in alcuni porti e aeroporti pugliesi, finalizzato
alla conoscenza dei principali fattori di rischio correlati
all’introduzione di zanzare Aedes e di cui si riportano i
risultati preliminari relativi alle sedi portuali.
MATERIALI E METODI
- Aree di studio - Bari Porto (BA) (latitudine 41°08’17’’
longitudine 16°50’40’’) situato a nord-ovest della omonima
città vecchia è uno scalo polivalente per navi commerciali
(cargo, portacointainers), passeggeri (traghetti e navi da
crociera) e in misura ridotta per pescherecci, navi militari,
rimorchiatori. E’ lo scalo commerciale meridionale più
importante nei rapporti con i mercati balcanici e del Medio
Oriente.
Taranto Porto (TA) (latitudine 40°27’N longitudine 17°12’E)
situato nell’omonimo golfo è un porto naturale che consta
di una rada grande (Mar Grande) e una interna minore
(Mar Piccolo), sede quest’ultima della Marina Militare. In
prossimità della rotta Suez-Gibilterra e in posizione strategica
rispetto alle rotte principali Oriente-Occidente, si estende
per 350.000 km2 ed è essenzialmente un porto mercantile
(commerciale, industriale, area Terminal Cointainer) con
parte delle banchine in concessione a Industrie Siderurgiche
ILVA S.p.A, Raffinerie ENI S.p.A., Cementificio Cementir. E’
tra i maggiori di Italia e Europa per traffico di merci gestito.
- Questionari - Redatti un questionario generale (Q.G.)
e uno di approfondimento (Q.A.). Il Q.G. si prefiggeva di
acquisire informazioni (organizzazione, struttura del traffico,
tratte, tipologie di merci importate e loro provenienza, ecc.)
utili ad avere un quadro conoscitivo delle predette realtà
portuali ed è stato sottoposto alle rispettive Autorità Portuali
e alla Dogana (Direzione Interregionale delle Dogane per la
Puglia, Molise e Basilicata - D.I.D.P.M.B). Il Q.A. intendeva
acquisire specifiche info (tipo di trasporto e imballaggio,
quantità importate, certificazioni, ecc.) sull’importazione di
merci epidemiologicamente rilevanti ai fini dell’introduzione
di culicidi esotici, quali “pneumatici” e “piante ornamentali” ed
è stato sottoposto al D.I.D.P.M.B. e, limitatamente alla merce
“piante ornamentali”, anche a Osservatorio Fitosanitario
333
Regionale (O.F.R.).
- Monitoraggio entomologico - Sopralluoghi con Veterinari
PIF, tecnici dell’USMAF e membri della Capitaneria di Porto:
- Culicidi adulti: selezionato 1 sito in ciascun porto per
il posizionamento di 2 trappole (1 BG-Sentinel® e 1 CDC
Miniature light-trap) per un totale di 4 trappole, attive da
luglio a ottobre 2012/2013 per 5 giorni consecutivi (lun.ven.) a settimana. Le raccolte, suddivise in base a luogo,
data, tipologia di trappola, erano trasportate in contenitori
refrigerati (+4oC) presso l’ IZSPB di Foggia. L’identificazione
è avvenuta in base alle chiavi morfologiche di Severini F. et
al. (6). Gli esemplari identificati sono stati conservati a -80°C
per la ricerca di patogeni tramite PCR.
- Stadi preimaginali: individuati 2 siti nel porto di Bari
(approdo navi merci/containers) e 1 sito a Taranto (approdo
navi merci) per posizionamento di 15 ovitrappole/sito,
recuperate settimanalmente da Luglio ad Agosto (2012), per
un totale di 120 bicchieri/BA e 60bicchieri/TA.
L’analisi dei questionari ha consentito di ottenere le seguenti
informazioni: Bari Porto Rotte: Mediterraneo (cargo,
portacointainers, traghetti, crociera, militari, pescherecci),
Atlantico-europee (cargo, crociera, militari, pescherecci),
extraeuropee con Asia, Africa, America (cargo, crociera,
militari). Traffico passeggeri (2010,2011); poco meno di 2
milioni (soprattutto da/verso l’opposta sponda Adriatica)
di cui un quarto croceristi; traffico merci (2010,2011):
circa 5 milioni di tonnellate, per metà merci rinfuse solide
(cereali quasi per la metà) e per metà merci in cointainers.
Pneumatici (2012): nuovi (119.600 pezzi) da Turchia, Cina e
Serbia che giungono con navi containers/cargo sfusi e/o con
imballaggi in plastica. Piante, incluse le ornamentali (2012):
giungono in casse di legno in cointainers (318 t.) da Asia
(Cina, Taiwan) e Albania; quasi tutte sono destinate a vivai
pugliesi.
Taranto Porto - Rotte:Mediterraneo (cargo, portacointainers,
poche
altre
varie),
Atlantico-europee
(cargo
e
portacointainers, poche altre varie), extraeuropee con Asia,
Africa, America (cargo e portacointainers, militari). Traffico
passeggeri (2012): poco rilevante (5 navi da crociera, 500
crocieristi in totale). Traffico merci: circa 35/40/35 milioni di
tonnellate per gli anni 2010/2011/2012 rispettivamente, di
cui 20% in contenitori. Trattasi per lo più di merci rinfuse per
siderurgia, raffinerie, cementifici. Pneumatici (2012):nuovi
(2.161t.) da Asia (Cina, India, Tailandia, Taiwan, Corea,
Arabia, Giappone, Israele) che giungono sfusi e/o con
imballaggi in plastica. Piante (449t.), incluse le ornamentali
da Asia (Cina, Tailandia, Taiwan); parte è destinata a vivai
pugliesi. Ai fini dello sdoganamento, i controlli sulle merci
riguardano esclusivamente la regolarità della fornitura e,
limitatamente alle piante, la ricerca di fitopatogeni.
Catture entomologiche - risultati relativi ad anno 2012:
Catturati in totale 570 culicidi adulti di cui 235 nel porto
di Bari e 335 nel porto di Taranto. Gli esemplari catturati
sono risultati appartenenti a 4 generi diversi tra cui Aedes
(40/570) (BA 13/40; TA 27/40), Culex (517/570) (BA 214/517;
TA 303/517), Culiseta (4/570) (BA 4/4; TA 0/4), Ochlerotatus
(1/570) (BA 0/1; TA 1/1) e a 4 specie differenti rappresentate
da Aedes albopictus (40/570), Culiseta longiareolata (4/570),
Ochlerotatus caspius (1/570) e Culex pipiens “zanzara
comune” (488/570) (BA 195/488; TA 293/488). Per 8/570
esemplari è stato possibile definire solo la sottofamiglia
Culicinae e 29/570 Culex spp. Sono in corso analisi
molecolari per la ricerca di patogeni.
Ovitrappole: recuperate in totale 50 bacchette (20/50BA
e 30/50TA) di cui 18/50 positive (07/18BA e 11/18TA),
appartenenti a 3 differenti raccolte.
Studi epidemiologici hanno dimostrato che, in tutti i paesi
Europei, il primo ingresso di Ae. albopictus e di altre specie
di zanzare Aedes è avvenuto con l’importazione da Paesi
asiatici di pneumatici usati e piante ornamentali (Agavacaee,
Bromeliacaee) infestate. Le informazioni rilevate dalla
nostra indagine evidenziano che questa tipologia di merci
entra dall’Asia anche nei porti di Bari e Taranto. Manca,
inoltre, l’evidenza di controlli e disinfestazioni nei confronti
di questi insetti, sia prima dell’ imbarco che a destinazione
(Italia). Tali informazioni, indispensabili per valutare il
rischio di introduzione di vettori esotici in un territorio,
ci consentono di affermare che la Puglia è esposta a tale
evento. E la importazione di soli pneumatici nuovi e provvisti
di imballaggi in plastica, non elimina certo il rischio; non è
escluso, infatti, che la merce in attesa di essere imbarcata,
permanga all’aperto senza coperture protettive, con la
possibilità che femmine di Aedes possano ovodeporre
prima delle operazioni di imballaggio e imbarco e essere
così trasferite passivamente in nuovi territori. Tra i due
porti monitorati, quello di Taranto sembra più esposto a tale
rischio, sia per la maggiore quantità di prodotto importato,
sia per il numero superiore di Paesi asiatici da cui importa. Il
rischio di introduzione di questi vettori con navi passeggeri,
sembrerebbe ridotto nel Porto di Taranto, essenzialmente
commerciale; in quello di Bari, che movimenta passeggeri
e loro mezzi soprattutto verso/da i Paesi della opposta
sponda adriatica, potrebbe essere particolarmente facilitato
lo scambio di popolazioni di Ae. albopictus. Relativamente
al monitoraggio entomologico, come prevedibile, i risultati
hanno confermato la presenza, in entrambi i porti, di
zanzare esotiche Aedes, limitatamente però alla specie Ae.
albopictus (uova e adulti). Tale insetto, rilevato sia nella
città che nel porto di Bari alcuni anni fa (Romi e Otranto,
com. pers.), per la prima volta viene segnalato anche nel
porto di Taranto e si conferma capace di riprodursi anche in
habitats portuali. Il lavoro di trappollaggio è stato il frutto di
un ovvio compromesso tra le esigenze di ricerca e quelle più
strettamente pratiche e di gestione sicura dello strumentario,
giustificando, in parte, il ridotto numero di trappole utilizzate.
Nel monitoraggio con ovitrappole, difficoltà sono state
riscontrate nella fase di recupero. Molti barattoli, infatti,
risultavano spostati, dispersi e capovolti per la continua
movimentazione di mezzi legata alle molteplici attività
portuali, ma senza dubbio sono da ricercare altri elementi
di disturbo. La carenza di personale dedicato e in loco, che
quotidianamente accertasse il regolare posizionamento
delle ovitrappole, ci ha indotto ad interrompere questo tipo
di monitoraggio, pur nella consapevolezza che, lo stesso,
permetterebbe di diagnosticare precocemente l’eventuale
insediamento in area portuale di ulteriori specie di zanzare
Aedes. In considerazione del rischio sanitario correlato
all’introduzione di alcune merci, sarebbe importante
obbligare il paese esportatore ad effettuare e certificare
su questi prodotti, controlli e disinfestazioni nei confronti di
insetti vettori; in mancanza, tali operazioni dovrebbero essere
previste all’arrivo del carico nei porti. Tutto ciò, tuttavia,
presuppone in primo luogo la conoscenza e il mantenimento
di un livello alto di attenzione al problema da parte di
334
diverse Istituzioni e Ministeri che dovrebbero interagire con
il Ministero della Salute per l’individuazione e adozione delle
opportune strategie. È infatti necessaria la mobilitazione di
diverse competenze attuabile attraverso la collaborazione
interprofessionale (fitopatologi, entomologi, personale di
dogana, ecc.). Nella nostra esperienza, la collaborazione
tra Istituto Zooprofilattico e varie Istituzioni operanti in area
portuale ha favorito un costruttivo confronto e reso possibile
l’individuazione e applicazione di interventi migliorativi e
può essere considerata il punto di forza di questo progetto
pilota. Nel pianificare gli interventi di lotta al vettore, la
sorveglianza nei porti, così come negli aeroporti, appare un
anello imprescindibile nella catena dei controlli da attuare per
prevenire l’entrata e la diffusione di zanzare esotiche.
Fondi Ministero della Salute, Ricerca Corrente 2010.
Si ringraziano i Dott. Romi R. e Toma L. (Istituto Superiore di
Sanità, DMIPI) per i numerosi suggerimenti forniti nel corso
della ricerca.
BIBLIOGRAFIA
1 Dottori M. et. al., (2008). Primo focolaio europeo autoctono di
malattia tropicale trasmessa da vettori in Romagna. Praxis Vet.
Vol IXXX n 1/2008: 2-9.
2 Medlock J. et al., (2012). A review on the invasive mosquitoes
in Europe: ecology, public health risks and control options. Vector
borne & Zoonotic Diseases, 6: 435-447.
3 Toma L. et al., (2011). Aedes aegypti: risk of introduction in Italy
and strategy to detect the possible re-introduction. Veterinaria
Italiana. Collana di monografie. Monografia 23, 18-26.
4 La Face L., Raffaele G. (1928). Sulla presenza della Stegomyia
fasciata nell’Italia meridionale e nella Sicilia. Il Policlinico, sezione
pratica, XXXV, 43, 2095.
5 Romi R. et al., (2009). Linee guida per controllo di Culicidi
potenziali vettori di arbovirus in Italia. Rapp. ISTISAN 09/11,52 p.
6 Severini F. et al., (2009). Le zanzare italiane: generalità e
identificazione degli adulti (Diptera, Culicidae). Fragmenta
Entomologica, 41: 213-372.
335
BATTERI LATTICI CON ATTIVITA’ ANTIBATTERICA ISOLATI DA
FORMAGGI TRADIZIONALI SICILIANI
Mancuso I.1, Carrozzo A.1, Ducato B.1, Todaro M. 2, Miraglia V.1, Macaluso G.1, Fiorenza G.1, Scatassa M.L.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia “A. Mirri” - Palermo
2
Dipartimento Scienze Agrarie e Forestali – Università di Palermo
Key words: Sicilian cheeses, lactic acid bacteria, bacteriocins
SUMMARY
The study was conducted on typical Sicilian cheeses made
from raw cow milk (Caciocavallo Palermitano) and sheep
milk (Vastedda della valle del Belice PDO e Pecorino PDO).
Genotypic identification of the LAB isolates was carried out
by 16S/23S rRNA sequencing. a total of 400 bacteria strains
were isolated and genotypically identified as Lactobacillus
spp., Lactoccoccus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc
spp., Enterococcus spp. and Streptococcus spp. Evaluation of
bacteriocin-producing LAB was investigated in vitro using the
“spot on the lawn” method (2) aganist Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis and Escherichia
coli. Results showed a predominance of LAB showing inhibition
alone against Listeria monocytogenes.
INTRODUZIONE
La Sicilia vanta un ricco patrimonio di prodotti lattierocaseari tradizionali (DA 28 dicembre 1998 n. 4492) alcuni
dei quali certificati DOP, caratterizzati da processi produttivi
che prevedono l’utilizzo di latte crudo, caglio artigianale ed
attrezzature in legno. Le tecnologie e gli ambienti di lavorazione
contribuiscono alla selezione di una ricca e variegata microflora
lattica autoctona che oltre a svolgere un ruolo pro-caseario per
la produzione del formaggio esercita attività biocompetitiva nei
confronti di eventuali microrganismi patogeni presenti (4) con
favorevoli ricadute sulla sicurezza alimentare del prodotto
finito. L’attività biocompetitiva si esplica anche grazie alla
capacità di alcuni batteri lattici (LAB) di produrre batteriocine,
molecole proteiche dotate di attività inibitoria nei confronti di
microrganismi batterici, tra cui alcuni patogeni d’interesse
nell’ambito della sicurezza alimentare. Scopo del presente
lavoro è stato quello di isolare e genotipizzare LAB provenenti
dai processi produttivi di formaggi tradizionali e DOP siciliani
e ne è stata testata, in vitro, la capacità di inibire la crescita di
alcuni patogeni.
MATERIALI E METODI
Lo studio è stato condotto su due formaggi DOP ovini a latte
crudo, Pecorino Siciliano e Vastedda della valle del Belìce e su
un formaggio bovino a latte crudo e a pasta filata, il “Caciocavallo
Palermitano”. La ricerca della flora lattica è stata effettuata su
campioni prelevati da 42 forme di “Caciocavallo Palermitano”,
14 Vastedda della valle del Belìce, 23 pecorini siciliani e su 11
campioni prelevati dalla superficie dei tini in legno, sette dei
quali utilizzati per la produzione di “Caciocavallo Palermitano” e
4 per la Vastedda della valle del Belìce. Il campionamento della
superficie dei tini in legno è stato eseguito con un metodo “non
distruttivo” che prevedeva la “spazzolatura” della superficie e
la raccolta del materiale risultante mediante garze sterili. Sono
state utilizzate apposite “forme” in plastica preventivamente
disinfettate atte a delimitare un’area di cm 10x10 comprendente
sia il fondo che la parete del tino. La superficie del tino veniva
strofinata con uno spazzolino sterile preventivamente inumidito
con il terreno di trasporto (SSP + Tween 80) ed il materiale
“spazzolato” dalla superficie veniva raccolto con una garza
sterile immessa poi nel terreno di trasporto.
Per l’isolamento della microflora lattica è stata utilizzata la
metodica riportata dai Rapporti ISTISAN 08/36 (1). Per la
ricerca dei Lattobacilli veniva utilizzato MRS agar acidificato
(37°C in microaerofilia per 48h) e per i Lattococchi M17agar.
(aerobiosi 30°C per 72h, ricerca dei cocchi mesofili, e 44°C per
48h, cocchi termofili). I ceppi lattici isolati risultati Gram positivi,
catalasi e ossidasi negativi, sono stati crioconservati a -80°C
in MRS broth + glicerolo all’80% oppure, per la conservazione
a breve termine, mantenuti in piastre di MRS agar o in tubi con
brodo MRS a temperatura di refrigerazione (4°C) ed identificati
genotipicamente mediante PCR. L’amplificazione di una
porzione di circa 350-bp del 16S rRNA è stata realizzata
utilizzando i primer ITS For [5’-GTC GTA ACA AGG TAG CCG
TA -3’] e ITS Rev [5’-GCC AAG GCA TCC ACC -3’], disegnati
su regioni conservate del cistrone ribosomale eubatterico. Gli
ampliconi sono stati separati su gel d’agarosio al 1,5% (p/v),
contenente 1X Sybr Green in tampone Tris-Borato-EDTA 0,5X.
I prodotti di amplificazione risultati positivi sono stati sottoposti
a reazione di sequenza, mediante sequenziatore ABI PRISM
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®). Le sequenze
in formato FASTA così ottenute, sono state allineate alle
sequenze depositate in GenBank, utilizzando il software BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)per ’interrogazione del
database. La capacità biocompetitiva di 400 LAB nei confronti
dei principali patogeni alimentari è stata valutata in vitro
utilizzando la metodica “spot on the lawn” descritta da Lewus
(1991) (2, 3). I microrganismi utilizzati per la prova sono stati:
Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella enteritidis
ATCC 13076, E.coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus
ATCC 25923; 200 LAB sono stati testati contro un ceppo di
Staphylococcus aureus C.I.P. produttore enterotossina B. I
ceppi crioconservati a -80°C sono stati scongelati in frigorifero
a 4°C per 24h e rivitalizzati in 5 ml di MRS broth incubato
a 37°C per 72h in CO2. Dopo incubazione, 2 µl di ciascuna
brodocoltura sono stati seminati su piastre di TSA + 0.5% di
estratto di lievito ed incubate in anaerobiosi a 30°C per 24h; in
ciascuna piastra sono stati seminati più ceppi lattici da testare
fino ad un massimo di otto. Dopo 24h dalla semina dei LAB
sono state allestite le colture dei 4 microrganismi patogeni.
1 ml della diluizione corrispondente alla concentrazione di
105-106 ufc/ml di ciascun patogeno è stata trasferita in una
provetta contenente 9 ml di BHI +1 % di agar; circa 8 ml di
questa sospensione batterica sono stati distribuiti sulle piastre
precedentemente seminate con i ceppi lattici da testare,
quindi incubate a 30°C in anaerobiosi per 24h.
La comparsa di una zona chiarificata intorno al sito di inoculo
del batterio lattico (>3 mm) indicava l’inibizione della crescita
del patogeno testato da attribuire verosimilmente alla capacità
del LAB di produrre batteriocine (2). Dopo aver eliminato dal
data-set le specie con un numero di osservazioni inferiori a
336
5, i dati sono stati elaborati con l’analisi di varianza per dati
categorici (CATMOD software SAS vs 9.2) dove le variabili
dipendenti sono state la produzione di “batteriocina” (intesa
come presenza/assenza di alone inibitorio) e “la tipologia di
latte” (latte bovino/ovino) mentre la variabile indipendente era il
genotipo LAB rilevato.
Fra i 400 ceppi di LAB testati (tabella 1) i generi maggiormente
rappresentati sono stati Lactobacillus casei (78) Enterococcus
faecium (72) e Lactobacillus rhamnosus (41). In totale il
46,5% dei LAB ha mostrato capacità biocompetitiva, inibendo
la crescita di almeno uno dei microrganismi patogeni testati
(tabella 1). In tabella 2 sono riportati i risultati aggregati e distinti
in base alla provenienza dei LAB isolati: formaggi o superficie
dei tini in legno. Su 316 ceppi isolati da formaggio il 40%
mostrava attività antibatterica, percentuale che si presentava
superiore nei LAB isolati dalle superfici dei tini. In quest’ultimo
caso su 83 ceppi isolati complessivamente il 70% mostrava
attività biocompetitiva. Enteococcus faecium e Lactobacillus
rhamnosus si confermano per entrambe le tipologie di matrici
i generi LAB maggiormente rappresentativi; mentre Lb. casei
è stato isolato unicamente dalle matrici “lattiero-casearie”, mai
dai tini.
Tra i patogeni testati Listeria monocytogenes è stato quello
più sensibile all’attività antibatterica dei LAB, su 186 ceppi in
grado di produrre batteriocine: 150 erano attivi verso Listeria
monocytogenes, 15 nei confronti di Staph.aureus e 2 anche
nei confronti del ceppo di Staph.aureus enterotossigeno; 8 nei
confronti di Salmonella enteritidis infine nessun ceppo lattico
ha inibito la crescita di E.coli. 13 ceppi lattici (6 Lb. casei; 3
Ped.acidilactici; 2 Lc. rhamnosus; 1 Ped.lolii; 1 Leuconostoc
mesenteroides) hanno mostrato effetto inibente verso più di un
patogeno.
L’analisi statistica dei dati ha evidenziato relazioni significative
fra l’attività antibatterica (inibizione della crescita del patogeno)
ed il genotipo isolato (tabella 3), al contrario la specie di
provenienza del latte non ha influenzato significativamente la
capacità dei LAB di produrre batteriocine.
Tabella 3-attività antibatterica dei LAB identificati
Specie LAB
Tabella 1- attività antibatterica dei LAB isolati
Specie LAB
LAB
isolati
Filiera produttiva*
latte
a latte
bovino
ovino
61
17
40
32
attività
antibatterica
% attività antibatterica
(µ ± s.e.)
Lactobacillus brevis
84,61 ± 13,44
Enterococcus faecalis
81,81 ± 14,61
Lactobacillus plantarum
77,78 ± 16,15
Streptococcus thermophilus
66,67 ± 14
Lactobacillus rhamnosus
57,14 ± 6,92
Lactococcus lactis
53,33 ± 12,51
Pediococcus lolii
53,33 ± 12,51
Pediococcus acidilactici
50 ± 8,.85
Enterococcus faecium
48,28 ± 5,20
Lb. casei
Ec. faecium
78
72
Lb. rhamnosus
41
35
6
23
Lactobacillus casei
44,11 ± 4,.80
Pd.pentasaceus
Pd.acidilactici
39
30
23
22
16
8
10
15
Leuconostoc mesenteroides
42,86 ± 18,31
Streptococcus macedonicus
39,13 ± 10,10
Str macedonicus
23
19
4
9
Lactobacillus delbrueckii
37,5 ± 12,11
Pd. lolii
Lb. delbrueckii
Ec. faecalis
Lb. brevis
15
15
11
11
15
12
9
5
8
6
9
9
Pediococcus pentosaceus
23,80 ± 7,48
3
2
6
Enterococcus spp.
20 ± 21,68
Lactobacillus fermentum
16,67 ± 14
Str.thermophilus
12
6
6
8
Lactobacillus buchneri
0 ± 21,67
Lb. fermentum
Lc lactis
Lb plantarum
Lb buchneri
Ln mesenteroides
Ec. hirae
12
10
6
5
5
4
10
6
5
5
3
2
2
4
1
2
7
4
2
2
2
2
Enterococcus.spp.
3
2
1
1
Ln. lactis
Ec. durans
Lb. sakei
Lc.pseudomesenter.
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Str. gallolyticus
1
1
Str. vestibularis
1
1
Str. infantarius
1
TOTALE
400
32
36
1
1
BIBLIOGRAFIA
1. Aureli P, Fiore A, Scalfaro C, Franciosa G (2008) Metodi
microbiologici tradizionali e metodi molecolari per l’analisi degli
integratori alimentari a base di o con probiotici per uso umano.
Rapporti ISTISAN 08/36.
2. Fiore A, Vilmercati A, Anniballi
F, De Medici D (2011) Valutazione dell’attività antibatterica
delle batteriocine nei confronti di patogeni alimentari. Rapporti
ISTISAN 12/54
3. Lewus C.B, Montville T.J (1991) Detection of bacteriocins
produced by lactic acid bacteria. International Journal of
Microbiological methods13,145-150 4. Scatassa M.L, Di
Noto A.M, Cardamone C, Sciortino S, Todaro M, Caracappa
S (2009) Vastedda della valle del Belìce cheese: experimental
contamination with Salmonella and Listeria spp. Atti XVII
International Congresso FeME S P Rum: 298-299
Lavoro eseguito fondi del Min. Salute RF 2008
”Messa a punto di metodi di biocompetizione e di
decontaminazione
per aumentare la sicurezza degli alimenti e dei processi.”
1
286
114
186 (46,5%)
* formaggi + superfici tino legno
337
da
formaggi
alone
Lb. casei
Ec. faecium
Pd.pentasaceus
Lb. rhamnosus
Pd. acidilactici
Str. macedonicus
Lb. delbrueckii
Pd. lolii
Lb. fermentum
Ec. faecalis
Lb. brevis
Lb. plantarum
Lb buchneri
Ln. mesenteroides
Ec. hirae
Str. thermophilus
Lc. lactis
Ec. durans
Lb. sakei
Ln. lactis
Str. gallolyticus
Str. infantarius
Str. infantarius
Enterococcus. spp.
Ln. pseudomesenteroides
78
58
37
28
23
17
14
11
10
6
6
6
5
4
3
3
3
1
1
1
1
32
25
9
14
8
4
6
7
0
6
5
4
0
2
1
2
2
1
0
0
1
TOTALE
316
Specie LAB
da TINI formaggi
BOVINI
alone
alone
4
3
1
3
4
3
4
5
1
3
1
2
2
4
3
6
6
5
5
1
3
1
1
1
1
1
8
1
9
4
1
58
Tabella 2- specie di LAB isolati dalle diverse matrici e relativa attività antibatterica (alone)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Sezione Diagnostica di Pavia, Centro di
Referenza Nazionale per le Clamidiosi animali, Pavia
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, S.S. Laboratorio Specialistico Diagnostica
Molecolare Virologica e Ovocoltura,Torino
1
Key words: clamidie, PCR real-time, specie aviarie
1
1
40
(68%)
STUDIO RETROSPETTIVO SULLA PRESENZA DI CLAMIDIE ATIPICHE
IN CAMPIONI DI SPECIE AVIARIE
Manfredini A.1, Bellotti M.1, Labalestra I.1, Petasecca D.1, Mandola M.L.2, Rizzo F.2, Prati P.1,
Fabbi M.1, Magnino S.1, Vicari N.1
1
1
2
1
338
da TINI formaggi
OVINI
10
2
11
4
2
1
4
1
129
(40%)
1
1
25
18 (72%)
SUMMARY
Following a recent revision, the family of Chlamydiaceae
consists of the single genus Chlamydia, which currently
includes nine species. Nonetheless, in recent years, diagnostic
tests for the detection of chlamydiae infecting birds (pigeons,
poultry and wild birds) in Italy, France and Germany have led
to the detection of microorganisms that do not belong to any
known chlamydial species. Recently, two different real-time
PCRs specific for the novel chlamydiae infecting poultry (ACC)
and pigeons (ACP) have been developed. This communication
presents the results of a retrospective survey that aimed at
identifying novel chlamydial agents in Chlamydiaceae-positive
samples from birds submitted between 2009 and 2013 to the
National Reference Laboratory for Animal Chlamydioses. Out
of 36 samples, 8 (7 from pigeons and 1 from a magpie) tested
positive at the real-time PCR specific for the novel chlamydiae
infecting pigeons.
INTRODUZIONE
La famiglia delle Chlamydiaceae, secondo una recente
revisione tassonomica (1), si compone dell’unico genere
Chlamydia, che comprende attualmente nove specie. Si
tratta di microorganismi intracellulari obbligati con un ciclo
riproduttivo bifasico caratterizzato dall’alternanza di corpi
reticolari non infettanti (fase replicativa intracellulare) e corpi
elementari infettanti (fase extracellulare). Tuttavia, negli ultimi
anni le indagini diagnostiche per la ricerca di Chlamydia in
specie aviarie (piccioni, pollame e avifauna selvatica) eseguite
in Italia, Francia e Germania hanno prodotto una serie di
risultati non conclusivi, con rilevamento di un microorganismo
che sembra non appartenere a nessuna delle specie di
Chlamydia finora conosciute. Questa situazione, nota peraltro
già dal 2009 (2, 3, 4), ha trovato conferma anche in un recente
studio effettuato su 300 tamponi fecali di piccione dal quale
è emerso inaspettatamente che il 19,5% di tutti i campioni
positivi per Chlamydiaceae risultava infetto da organismi
non classificati (5). Per meglio comprendere l’identità e il
ruolo di questi nuovi microorganismi, sono stati condotti
studi molecolari che tramite l’analisi filogenetica del gene
codificante il 16S RNA ribosomale, del gene ompA e di quattro
loci genomici housekeeping (gatA, hflX, enoA e gidA) hanno
confermato che i nuovi microorganismi segregano in maniera
separata rispetto alle specie di clamidia conosciute (6, 7).
Questi dati sono stati confermati anche da un recente studio
condotto su 11 ceppi di clamidie isolate da piccione e da pollo.
L’analisi filogenetica descritta in precedenza, ha confermato la
segregazione in due differenti cladi. Inoltre, l’intero genoma di
due ceppi rappresentativi delle due cladi è stato interamente
sequenziato. L’analisi comparativa del genoma ha confermato
l’appartenenza di questi microorganismi al genere Chlamydia
e la loro posizione filogenetica separata rispetto alle altre
specie conosciute. Questi risultati hanno indotto gli autori a
proporre il riconoscimento di due nuove specie (dati inviati per
la pubblicazione). Sono state sviluppate, inoltre, due differenti
PCR real-time specifiche per le nuove clamidie infettanti il
pollame e i piccioni (6, 7).
Il presente lavoro riferisce i risultati di uno studio diagnostico
retrospettivo che si è avvalso delle due PCR real-time sopra
citate con la finalità di identificare i nuovi microorganismi nei
campioni pervenuti tra il 2009 e il 2013 al Centro di Referenza
Nazionale per le Clamidiosi animali, e già risultati positivi
per Chlamydiaceae ma negativi per le specie di Chlamydia
conosciute.
MATERIALI E METODI
I 36 DNA analizzati in questo studio sono stati estratti tra il
2009 e il 2013 da campioni appartenenti a differenti specie
aviarie sia d’affezione sia selvatiche. Le matrici erano visceri,
feci e tamponi. Gli estratti sono stati nuovamente amplificati
mediante PCR real-time Chlamydiaceae-specifica con target
23S (8) e PCR real-time C. psittaci-specifica con target ompA
(9), e analizzati con PCR-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) con target 16S (10).
Infine tutti i campioni confermati positivi sono stati analizzati
mediante le PCR real-time specifiche per le clamidie atipiche
individuate nei piccioni (atypical pigeon Chlamydiaceae, ACP)
e nel pollame (atypical chicken Chlamydiaceae, ACC) (6, 7).
Dei 36 DNA analizzati, solo 24 hanno dato esito positivo
alla PCR real-time Chlamydiaceae-specifica. La mancata
amplificazione dei restanti 12 campioni potrebbe essere
dovuta all’avvenuta degradazione del DNA.
Nessuna positività è stata ottenuta con la PCR real-time C.
psittaci-specifica. Inoltre, l’analisi mediante la PCR-RFLP non
ha permesso di rilevare C. psittaci, la clamidia generalmente
rilevata nelle specie aviarie.
Soltanto 8 dei 24 campioni risultati positivi alla PCR realtime Chlamydiaceae-specifica hanno dato esito positivo alla
PCR real-time ACP. Gli otto campioni appartenevano a sette
piccioni e a una gazza. Nessuno dei 24 campioni esaminati è
invece risultato positivo alla PCR real-time ACC.
Rimane ancora non risolta l’identità dei microorganismi
appartenenti alla famiglia delle Chlamydiaceae rilevati nei
campioni provenienti dalle altre specie aviarie (canarino,
cinciallegra, cornacchia grigia, gabbiano reale, germano reale,
piro-piro culbianco) (Tabella 1).
In conclusione, il riscontro di questi nuovi membri della famiglia
339
Chlamydiaceae solleva la questione della loro importanza
epidemiologica e possibile ruolo come agenti patogeni. In
futuro sarebbe opportuno estendere le indagini nei volatili
domestici e selvatici con il fine di isolare e meglio caratterizzare
questi nuovi microorganismi emergenti.
Tabella 1: riepilogo dei risultati ottenuti
#
ID
1 63635
2 66103
3 48558
4 205315
5 155757/1
6 97352/5
7 100776
8 127625
9 136027
10 14520/2
11 189538/1
12 214137/1
13 214137/2
14 214137/3
15 105952/1
16 105952/2
17 105952/3
18 110219/1
19 110219/2
20 110244/1
21 110244/2
22 198786/1
23 198786/2
24 225270
25 22151
26 43160
27 52496
28 305141
29 75363
30 75369
31 97203/1
32 97203/2
33 112019
34 196900
35 222823/1
36 222823/2
Anno
2009
2009
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2011
2011
2011
2011
2011
2011
2011
2011
2011
2011
2012
2012
2012
2012
2013
2013
2013
2013
2013
2013
2013
2013
PCR real- PCR realPCRPCR real- PCR realtime 23S time ompA RFLP 16S time ACP time ACC
+
+
Cornacchia grigia
+
+
Cornacchia grigia
+
+
+
Piccione
+
+
+
Gazza
+
+
+
Piccione
+
Cornacchia grigia
+
+
Cornacchia grigia
+
+
Piccione
+
+
Cornacchia grigia
Piccione
+
+
Canarino
+
+
Gazza
+
+
Gazza
+
+
Gazza
Piccione
Piccione
Piccione
Beccaccia
Beccaccia
+
+
Gabbiano reale
Gabbiano reale
+
+
Germano reale
+
+
Germano reale
Gabbiano reale
+
+
+
Piccione
+
+
+
Piccione
Piccione
Coturnice
+
+
+
Piccione
Piccione
+
+
+
Piccione
+
+
+
Piccione
+
+
Cinciallegra
+
+
Piro-piro culbianco
+
+
Germano reale
+
+
Germano reale
Specie
BIBLIOGRAFIA
1) Kuo C.C., Stephens R.S., Bavoil P.M. & Kaltenboeck B.
(2011). Genus Chlamydia Jones, Rake & Stearns 1945, 55.
In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second
Edition, Vol. 4, Krieg N.R., Staley J.T., Brown D.R., Hedlund
B.P., Paster B.J., Ward N.L., Ludwig W. & Whitman W.B.,
eds. Springer, Heidelberg, pp. 846–865.
2) Vicari N., Laroucau K., Vorimore F., Barbieri I., Sachse
K., Hotzel H., Fabbi M., Labalestra I., Magnino S. Analisi
molecolare di clamidie isolate da intestino e tamponi
cloacali di piccioni catturati nelle città di Milano e Ferrara.
XI Congresso Nazionale S.I.Di.L.V. Parma, 30 settembre
- 2 ottobre 2009
3) Laroucau, K., F. Vorimore, R. Aaziz, A. Berndt, E. Schubert,
and K. Sachse. 2009. Isolation of a new chlamydial agent
from infected domestic poultry coincided with cases of
atypical pneumonia among slaughterhouse workers in
France. Infect. Genet. Evol. 9:1240-1247.
4) Rizzo F., Vicari N., Ameri M., Renna G., Labalestra I.,
Robetto S., Orusa R., Mandola ML. Isolamento da
gazza di un nuovo microrganismo appartenente alla
famiglia delle Chlamydiaceae. XIII Congresso Nazionale
S.I.Di.L.V. Trani, 12-14 Ottobre 2011. P.56-57
5) Sachse K, Kuehlewind S, Ruettger A, Schubert E, Rohde
G. 2012. More than classical Chlamydia psittaci in urban
pigeons. Vet Microbiol. 15;157(3-4):476-80.
6) Zocevic A, Vorimore F, Marhold C, Horvatek D, Wang
D, Slavec B, Prentza Z, Stavianis G, Prukner-Radovcic
E, Dovc A, Siarkou VI, Laroucau K. 2012. Molecular
characterization of atypical Chlamydia and evidence
of their dissemination in different European and Asian
chicken flocks by specific real-time PCR. Environ
Microbiol. 2012 Aug;14(8):2212-22
7) Zocevic A, Vorimore F, Vicari N, Gasparini J, Jacquin L,
Sachse K, Magnino S, Laroucau K. A real-time PCR assay
for the detection of atypical strains of Chlamydiaceae
from pigeons. PLoS One. 2013;8(3):e58741
8) Ehricht R., Slickers P., Goellner S., Hotzel H., Sachse K.
2006. Optimized DNA microarray assay allows detection
and genotyping of single PCR-amplifiable target copies.
Mol Cell Probes 20, 60-63.
9) Ossewaarde J.M., Meijer A. 1999. Molecular evidence
for the existence of additional members of the order
Chlamydiales. Microbiology 145, 411-417.
10)Pantchev A, Sting R, Bauerfeind R, Tyczka J, Sachse K.
2010. Detection of all Chlamydophila and Chlamydia spp.
of veterinary interest using species-specific real-time
PCR assays. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2010
33(6):473-84.
EFFETTI DELLA RIMOZIONE DEL SIERO FETALE BOVINO
NELLA COLTIVAZIONE DI IBRIDOMI: UTILIZZO DI TERRENI SERUM-FREE
Manna L., Armillotta G., Di Febo T., Luciani M., Ciarelli A., Di Ventura M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise “G. Caporale”, Via Campo Boario – 64100 Teramo
Key words: monoclonal antibodies; serum-free media; foetal bovine serum
SUMMARY
Four murine hybridoma cell lines were adapted to multiply
under serum free (SF) conditions using DMEM medium
containing decreasing amount of foetal bovine serum (FBS).
Two SF media were tested: Nutridoma SP (Roche) (M1) and
Ex-Cell 610 HSF (Sigma) (M2). Cell multiplication, vitality
and antibody (Ab) production were evaluated against cell
cultivated in DMEM containing 10% FBS (M3).
Clone C4B showed the best percentage of viable cells,
proliferative capacity and Ab productivity in M3.
Clone 10C2G5 cultivated in M1 showed a better vitality than
those cultivated in M2; there were no significant differences
with cells cultivated in M3. Ab production in SF media was
comparable to that of cells cultivated in M3.
M2 was appropriate for cell multiplication of clone 6C5F4C7
but not for Ab production, better Ab productivity was obtained
with M1.
Clone 2D10G11 showed the best vitality in M3 but among SF
media M2 was the best. Ab productivity in M3 and M2 were
comparable.
INTRODUZIONE
La coltivazione di ibridomi secernenti anticorpi monoclonali
(MAbs) prevede l’utilizzo di terreni addizionati di siero
fetale bovino (FBS) che fornisce fattori indispensabili di
crescita e differenziamento cellulare (1). Tuttavia l’uso di
FBS è sempre più criticato per diverse ragioni, sia di natura
tecnica che etica. Tra i principali svantaggi dell’uso di FBS
vi sono la composizione non definita e variabile nei diversi
lotti in commercio, gli alti costi di produzione e la presenza
di un’elevata concentrazione proteica che interferisce nei
successivi processi di purificazione dei prodotti secreti
dalle cellule nel mezzo di coltura. Vi sono, inoltre, anche
motivazioni etiche (2) alla limitazione dell’uso di FBS per le
modalità di raccolta del sangue dai feti di vacche gravide
macellate per la produzione di carne.
Scopo del nostro studio è stato quello di valutare e comparare
gli effetti della coltivazione in terreno addizionato con FBS
rispetto alla coltivazione in terreni serum free sulla crescita e
sulla produzione di MAbs in differenti linee di ibridoma.
MATERIALI E METODI
Linee cellulari di ibridoma
Sono state utilizzate quattro linee cellulari di ibridoma,
che producono rispettivamente anticorpi specifici per: IgG
bovine (clone C4B), IgG suine (clone 10C2G5), Bluetongue
Virus (BTV) (clone 6C5F4C7), African Horse Sickness Virus
(AHSV) (clone 2D10G11). Tutte le linee di ibridoma sono
state ottenute dalla fusione tra cellule di mieloma SP2/0Ag14 e splenociti murini (3). Terreni di coltura e condizioni di
crescita cellulare
Ciascuna linea di ibridoma è stata coltivata in terreno
340
DMEM contenente 10% di FBS (Sigma), glutammina 2
mM, anfotericina-penicillina-streptomicina 100x (Sigma),
gentamicina 50 mg/ml (Sigma), nistatina 10000 UI/ml
(Sigma) (M3) per ottenere un lotto di surnatante colturale di
controllo.
Parallelamente i cloni sono stati adattati a concentrazioni
decrescenti di FBS (10%, 5%, 2,5%, 1%) (4) e quindi
alla crescita in sospensione utilizzando come supporto
di crescita flasks da 25-75-175-525 cm2. I cloni sono stati
coltivati per tutta la fase di adattamento in termostato a 37°C
in condizioni di umidità controllata (90%) e con il 5% di CO2.
Durante la fase di adattamento le cellule sono state
mantenute alla stessa concentrazione di siero per almeno
due passaggi cellulari. Al termine di questa fase gli
ibridomi sono stati coltivati in completa assenza di siero
nei due terreni serum free: Ex-cell HSF 610 (Sigma) (M1)
e Nutridoma SP (Roche) (M2). Ad ogni passaggio cellulare
sono stati determinati, tramite contacellule automatico
(Countess® Automated Cell Counter), il numero di cellule/ml
e la percentuale di vitalità cellulare. I cloni adattati al terreno
Ex-cell HSF 610 sono stati coltivati in termostato a 37°C in
condizioni di umidità controllata (90%) e con il 5% di CO2,
quelli adattati al terreno Nutridoma SP con una percentuale
di CO2 del 7,5%. Per quanto riguarda il terreno Ex-cell HSF
610, i passaggi cellulari sono stati effettuati mantenendo una
densità di cellule di 3-5 x 105 cellule/ml. Dopo il completo
adattamento le cellule sono state passate ogni 3-4 giorni
ad una densità di 2 x 105 cellule/ml. Per quanto riguarda il
terreno Nutridoma SP, i passaggi dei cloni adattati sono stati
effettuati mantenendo sempre una densità di cellule di 1-2 x
105 cellule/ml.
Alla fine della fase di coltura, è stato raccolto circa 1 litro di
surnatante per ciascuna tipologia di terreno e per ciascun
clone. Tutti i surnatanti, compreso quello di controllo, sono
stati centrifugati a 400 g per 10’ a + 4°C per due volte, filtrati
con filtri da 0.22 µm e purificati mediante cromatografia
di affinità con proteina A al fine di valutare la resa in IgG
ottenuta per ciascun terreno. I purificati ottenuti sono stati
titolati in ELISA indiretta utilizzando micropiastre attivate
con 10 µg/ml del relativo antigene in tampone carbonato
bicarbonato 0,05M, pH 9.6; le diluizioni sono state effettuate
per raddoppio a partire dalla concentrazione di 100 μg IgG/
ml fino alla concentrazione di 0.003 μg IgG/ml. Il grado di
purezza dei purificati è stato inoltre valutato in SDS-PAGE
dopo colorazione dei gel con Silver stain.
Il clone C4B ha mostrato la maggiore percentuale di vitalità
cellulare (95.5%), il maggior numero di cellule/ml (1.34 x 106)
e la maggiore resa in IgG in M3; tra i due terreni SF testati,
M1 ha determinato percentuali di vitalità e numero di cellule
maggiori rispetto al terreno M2 (vitalità 90.9%; 1.02 x 106
cellule/ml) (Grafico 1).
341
Grafico 1 – Clone C4B
La resa in IgG (mg/L di surnatante) dei 4 cloni coltivati nei 3
terreni è indicata in Tabella 1.
Tabella 1
Resa in IgG (mg/L surnatante)
Clone
La vitalità del clone 10C2G5 in M1 è risultata simile a quella
in M3 (78-79%), mentre con il terreno M2 è stata ottenuta una
vitalità inferiore (69%); per quanto riguarda il numero di cellule/
ml, M1 e M2 hanno mostrato valori simili (0.71-0.75 x 106),
mentre il numero più elevato è stato ottenuto con M3 (1.04 x
106) (Grafico 2). La resa in IgG è stata simile per i tre terreni.
Grafico 2 – Clone 10C2G5
Nutridoma SP Ex-Cell HSF 610 DMEM 10%FBS
(M1)
(M2)
(M3)
C4B
17
18
67
10C2G5
2
1
3
6C5F4C7
26
2
9
2D10G11
2
16
17
in uso, che possono aumentare il segnale di fondo nei test
immunoenzimatici.
In conclusione, l’utilizzo di terreni SF rappresenta una
valida alternativa per la produzione di MAbs caratterizzati
da un elevato grado di purezza che consente di eliminare le
interferenze aspecifiche nei test diagnostici e, non da ultimo,
comporterebbe una riduzione dell’utilizzo degli animali per la
produzione dell’ FBS.
BIBLIOGRAFIA
1.Eagle H., 1955. Nutrition needs of mammalian cells in tissue
culture. Science, 122: 501-504.
2.Even M.S., Sandusky C.B., Barnard N.D., 2006. Serumfree hybridoma culture: ethical, scientific and safety
considerations. Trends in Biotechnology, 24: 105-108.
3.Goding J.W., 1996. Monoclonal antibodies: principles and
practice. Third Edition. Academic Press Limited, London,
154-156.
4.Mariani E., Mariani A.R., Monaco M.C., Lalli E., Vitale M.,
Facchini A., 1991. Commercial serum-free media: hybridoma
growth and monoclonal antibody production. Journal of
Immunological Methods, 145 (1-2): 175-183.
I titoli in ELISA indiretta dei MAbs purificati sono indicati in
Tabella 2. Come titolo è stata scelta la concentrazione dei MAbs
che ha fornito il valore di assorbanza di circa 2.000 a 450 nm.
Tabella 2
Titolo in ELISA indiretta (μg IgG/ml)
Nutridoma SP Ex-Cell HSF 610 DMEM 10%FBS
(M1)
(M2)
(M3)
Per quanto riguarda i parametri di crescita cellulare del clone
6C5F4C7, i migliori risultati sono stati ottenuti con il terreno M2
(vitalità 85.3%; 1.17 x 106 cellule/ml) (Grafico 3), tuttavia la resa
in IgG è stata significativamente più elevata in M1.
Grafico 3 – Clone 6C5F4C7
C4B
6.25
6.25
1.56
10C2G5
100
0.39
1.56
6C5F4C7
0.19
0.19
1.56
2D10G11
6.25
50
50
I risultati ottenuti mostrano che tutti i cloni testati sono in grado
di crescere in assenza di FBS nei due terreni SF utilizzati. È
da sottolineare che parametri ottimali di crescita cellulare non
sempre portano ad una maggiore produzione di IgG, come nel
caso dei cloni 6C5F4C7 e 2D10G11 (Tabella 3).
Tabella 3
In ultimo, per il clone 2D10G11 il terreno di crescita ottimale
è risultato M3 (vitalità 87.1%; 0.82 x 106 cellule/ml); tra i due
terreni SF testati, il migliore è risultato M2 (vitalità 83.0%; 0.51
x 106 cellule/ml) (Grafico 4); M2 e M3 hanno fornito la maggiore
produttività in IgG.
Grafico 4 – Clone 2D10G11
N° cellule Resa mg/L
x 106 / ml surnatante
Clone
Terreno
Vitalità %
M1
75,6
0,69
2
2D10G11
M2
83
0,51
16
M3
87,1
0,82
17
M1
81,2
1,02
26
6C5F4C7
M2
85,3
1,17
2
M3
83,4
0,99
9
Pertanto sarà necessario individuare per ogni linea di ibridoma
il terreno SF che fornisca la maggiore resa anticorpale. L’analisi
in SDS-PAGE dei purificati dei MAbs ottenuti con terreni SF
evidenzia un maggiore grado di purezza rispetto a quelli
prodotti in terreni addizionati con FBS (dati non mostrati). Le
IgG presenti nel siero fetale bovino rimangono, infatti, come
contaminanti anche dopo la purificazione, determinando in
alcuni casi interazioni di legame aspecifiche con gli antigeni
342
343
IL VIRUS DELLA BLUETONGUE RIAPPARE IN SARDEGNA: CARATTERIZZAZIONE
MOLECOLARE E FILOGENESI DEI CEPPI COINVOLTI
1
1
Marcacci M., 1Marini V., 1Spedicato M., 1Carvelli A., 2Puggioni G., 1Lorusso A., 1Savini G.
Laboratorio di Referenza OIE per la Bluetongue, Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise ‘G. Caporale”,
Teramo; 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna “G. Pregreffi”, Sassari.
Keywords: Bluetongue virus, Sardinia, Phylogenetic Analysis
Introduzione
La febbre catarrale degli ovini, più comunemente conosciuta
come Bluetongue (BT), è una malattia infettiva, non contagiosa,
dei ruminanti caratterizzata da infiammazione, congestione,
edema a carico della regione della testa, emorragie ed ulcere
delle mucose (10). L’agente eziologico della malattia è il virus
Bluetongue (BTV) appartenente alla famiglia Reoviridae,
genere Orbivirus, del quale si conoscono 24 sierotipi con
patogenicità variabile (11). Sono stati recentemente identificati
due nuovi sierotipi, 25 e 26 (4, 9). BTV è trasmesso da insetti
vettori del genere Culicoides e la distribuzione della malattia
è limitata alle aree geografiche in cui esistono le condizioni
climatiche ed ambientali idonee al loro ciclo vitale (5). Il genoma
virale è costituito da 10 segmenti (da Seg-1 a Seg-10) di RNA
lineare a doppio filamento di circa 19.200 paia di basi che
codificano per 7 proteine strutturali e 4 proteine non strutturali
(11,13,16). La prima evidenza di circolazione virale in Europa
risale al 1998; da allora sono state registrate almeno 11 diverse
incursioni a carico dei sierotipi BTV-1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 e 16.
Per la sua caratteristica localizzazione al centro del bacino del
Mediterraneo, la regione Sardegna è storicamente una delle
principali vie di ingresso dei virus dal Nord-Africa in Europa e
rappresenta, di fatto, un caso unico in cui è stata dimostrata
la circolazione simultanea di diversi sierotipi BTV (BTV-1, 2,
4, 8 e 16). Nell’autunno 2012 in Sardegna sono stati registrati
nuovi focolai di BT. In poche settimane l’infezione si è diffusa
dalla parte orientale dell’isola a tutta la zona meridionale. A
Marzo 2013 risultavano infetti 488 greggi (14.826 pecore su
un totale di 135.000 capi, l’11% della popolazione suscettibile
presente nella zona) con sintomatologia clinica evidente e il
6.8% di questi (9.238 pecore) è morto a causa della malattia.
I sierotipi BTV-1 e BTV-4 sono risultati responsabili dei nuovi
focolai sia singolarmente che associati. La circolazione di BTV1 era stata dimostrata sia nel 2011 che nel 2012 attraverso
sieroconversione di 4 animali sentinella; al contrario, l’ultima
segnalazione per il sierotipo BTV-4 era stata effettuata nel 2010
mentre non era stata registrata alcuna circolazione virale negli
anni 2011 e 2012 a ridosso dei nuovi focolai.
Materiali e Metodi
665 campioni di sangue e 442 campioni di milza prelevati
da animali infetti o morti sono stati conferiti al Laboratorio
di Referenza OIE per BT presso l’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise “G. Caporale” di
Teramo. Tutti i campioni sono stati testati per la ricerca diretta
del virus BTV sia mediante il metodo classico di isolamento
virale (14) che mediante un saggio molecolare di Real-time
RT-PCR (qRT-PCR) (7). La sierotipizzazione è stata effettuata
sui campioni positivi per BTV mediante il kit TaqVet European
BTV Typing kit (LSI-Laboratoire Service International Lissieu,
France). Le curve di crescita dei due nuovi ceppi isolati BTV1 (BTV-1 SAD2012) e BTV-4 (BTV-4 SAD2012) sono state
confrontate con quelle dei ceppi dello stesso sierotipo isolati
in Sardegna negli anni precedenti (BTV-1 SAD2006 e BTV4 SAD2003) (8). L’analisi statistica e il relativo grafico sono
stati prodotti mediante il software Prism paackage (GraphPad
Software Inc., La Jolla, CA). Sono stati inoltre sequenziati il
segmento 5 (Seg-5, 1769 bp) e il segmento 10 (Seg-10, 822
bp) che codificano rispettivamente per la proteina NS1 e la
proteina NS3/3a. Il sequenziamento è stato effettuato dopo
estrazione dell’ RNA virale dei due ceppi BTV-1 SAD2012 e
BTV-4 SAD2012 direttamente dai campioni di campo (sangue
e milza) e amplificazione dei due geni (Seg-5 e Seg-10)
mediante utilizzo del kit One-Step RT-PCR (Qiagen) e primers
specifici (8). Le sequenze nucleotidiche così ottenute sono
state assemblate con il software DNAstar package (DNAStar
Inc., Madison, WI, USA) e confrontate con sequenze omologhe
depositate nel database di Genbank. L’analisi filogenetica
condotta con il metodo Maximum Composite Likelihood è stata
eseguita utilizzando il software MEGA version 4 (15). Tutti i dati
relativi alle vaccinazioni effettuate per BTV sono stati recuperati
dal Sistema Informativo Italiano per la Bluetongue, gestito dal
Laboratorio di Referenza OIE per BT e analizzati mediante
software Microsoft Office Excel. I dati sulle popolazioni di
ruminanti in Provincia di Cagliari e Carbonia-Iglesias sono stati
recuperati dalla Banca Dati Nazionale.
Risultati
Segni clinici caratteristici dell’infezione a carico del virus
Bluetongue (BTV) sono stati inizialmente descritti nella provincia
di Ogliastra, nella parte est della Sardegna. In poche settimane
l’infezione si è diffusa in tutta la zona meridionale dell’isola
coinvolgendo soprattutto la provincia di Cagliari e di CarboniaIglesias. Dei 655 campioni di sangue analizzati mediante test
Real-time RT-PCR, l’86% è risultato positivo per BTV-1, l’11%
per BTV-4 e il 3% per entrambi i sierotipi. Analogamente, dei
442 campioni di milza esaminati, l’86% è risultato positivo per
BTV-1, il 9% per BTV-4 e il 5% per entrambi i sierotipi. Nei
campioni in cui è stata riscontrata la presenza contemporanea
dei due sierotipi BTV-1 e BTV-4 non è stato possibile gli stipiti
virali singolarmente. Dal grafico relativo alla curva di crescita
dei 4 ceppi BTV (BTV-1 SAD2012, BTV-4 SAD2012, BTV1 SAD2006 e BTV-4 SAD2003) si evince che non ci sono
differenze significative di crescita su cellule CPT-Tert nei diversi
time points nelle ore successive l’infezione. Le sequenze
nucleotidiche del Seg-5 (KC896850, KC896851) e del Seg-10
(KC896852, KC896853) rispettivamente dei due ceppi BTV1 SAD2012 e BTV-4 SAD2012 mostrano una percentuale di
similarità del 99%. Dall’analisi filogenetica condotta sul Seg-5
si evidenzia che entrambi i ceppi, BTV-1 SAD2012 e BTV-4
SAD2012, si collocano all’interno dello stesso cluster, formando
un gruppo monofiletico con le sequenze omologhe dei ceppi
BTV-1 FRA2007/01 (JX861492, 99%), BTV-1 FRA2008/24
(JX861502, 99%), BTV-1 SAD2010 (KC896845, 99%), BTV-1
344
SAD2006 (KC896844, 99%) e con le sequenze omologhe dei
ceppi di BTV-1 e BTV-4 che hanno recentemente circolato in
Nord-Africa come il BTV-4 TUN2009 (KC896847, 99%), BTV4 TUN2007 (KC896846, 99%) BTV-1 ALG2007 (KC896848,
99%) e BTV-1 MOR2007 (KC896849, 99%). Tali sequenze
inoltre differiscono da quelle omologhe del Seg-5 dei ceppi
BTV-4 responsabili del focolaio registrato in Marocco nel
2004, in Spagna negli anni 2003-2005 e in Sardegna nel
2003. L’analisi filogenetica condotta utilizzando il Seg-10,
mostra che la sequenza nucleotidica dei nuovi ceppi isolati
in Sardegna segrega con le sequenze omologhe dei ceppi
BTV-1, 2 e 4 che hanno circolato nel bacino del Mediterraneo
a partire dal 2000 suggerendo un’apparente segregazione
regione-specifica almeno per questo segmento.
Discussione
Nel 2012 BTV è ricomparso in Sardegna provocando
9.238 morti e 14.826 casi clinici. BTV-1 e BTV-4 sono i
sierotipi responsabili dei nuovi focolai. BTV-1 è il sierotipo
maggiormente coinvolto la cui presenza è stata diagnosticata
in circa l’86% dei campioni testati. La Sardegna è stata
scenario di focolai di BTV sostenuti dai sierotipi BTV-2 (2000),
BTV-4 (2003), BTV-16 (2003), BTV-1 (2006 E 2010) e BTV8 (2009). Fatta eccezione per BTV-8, tutti i focolai BTV
sono esplosi nella parte meridionale dell’isola mostrando un
significativo legame con la circolazione degli stessi ceppi in
Nord-Africa. La ricorrenza di questi focolai invita a porre molte
domande, soprattutto riguardo la loro origine. E’ importante,
di fatto, riuscire a capire se si tratta degli stessi ceppi che
hanno circolato in precedenza sul territorio o se ci troviamo
di fronte all’introduzione di nuovi ceppi BTV. Il ceppo BTV1 SAD2012 è in grado di provocare negli ovini segni clinici
gravi, in maniera analoga ai ceppi BTV-1 responsabili dei
primi focolai sardi (2006 e 2010); presenta, inoltre, dopo
confronto delle sequenze nucleotidiche dei segmenti genici
Seg-5 e Seg-10 con le rispettive sequenze omologhe dei
ceppi BTV-1 SAD2006 e BTV-1 SAD2010, il 99% di similarità.
Se si considera, invece, la localizzazione geografica dei
primi casi clinici osservati nei tre diversi focolai provocati
dal sierotipo BTV-1 e segnalati sempre a sud dell’isola e la
segregazione all’interno dello stesso cluster filogenetico
delle sequenze Seg-5 e Seg-10 dei ceppi BTV-1 che hanno
circolato nel Sud-Europa e nel bacino del Mediterraneo,
non si può escludere che la sorgente di infezione per questi
ceppi sia nord-africana come già accaduto e confermato per
il ceppo BTV responsabile del focolaio del 2006 (3,6). Più
sorprendenti ed interessanti sono invece le conclusioni che si
possono trarre sull’origine del ceppo BTV-4 SAD2012. Sulla
base dell’allineamento delle sequenze nucleotidiche del Seg5, il ceppo BTV-4 SAD2012 si localizza all’interno dello stesso
cluster in cui si trovano anche il ceppo BTV-1 SAD2012 e altri
ceppi del sierotipo BTV-1 che hanno circolato recentemente
nel bacino del Mediterraneo; è possibile, quindi, avanzare
l’ipotesi che si tratti di un ceppo BTV-1/4 riassortante. Negli
anni passati, è già stata dimostrata la presenza di almeno
due gruppi separati e non correlati di ceppi BTV-1 e BTV-4
che hanno circolato nel Mediterraneo e nel sud dell’Europa:
il primo gruppo includeva, tra gli altri, ceppi BTV-1 GRE2001
e BTV-4 GRE1999-15 di chiara provenienza orientale; il
secondo, invece, comprendeva ceppi BTV-1 ALG2006 e BTV4 SPA2004 di origine occidentale (2,3,12). Questo studio
dimostra la presenza di un terzo, nuovo gruppo di ceppi
BTV-4 che condivide, per quanto concerne la sequenza del
Seg-5, un elevato grado di similarità con il ceppo BTV-1, la
cui presenza è stata recentemente riscontrata nel bacino del
Mediterraneo. Il nuovo ceppo riassortante BTV-1/4 differisce,
poi, chiaramente, sia dai ceppi omologhi, responsabili delle
incursioni fra gli anni 2003 e 2005 in Sardegna, Marocco
e Spagna, sia dal primo ceppo BTV-4 isolato in Grecia nel
1999. Dall’analisi filogenetica condotta utilizzando il Seg-10
emerge, inoltre, che i sierotipi BTV-2, BTV-4 e BTV-1, con
l’eccezione dei due ceppi BTV-1 2000 e BTV-4 1999 isolati
in Grecia, hanno questo segmento genico estremamente
conservato. Ciò conferma che i ceppi BTV-1 SAD2012 e BTV4 SAD2012 sono strettamente correlati con gli altri ceppi BTV1 e BTV-4 recentemente isolati in Algeria, Tunisia, Marocco,
Italia, Portogallo, Francia e Spagna e che pertanto possono
rappresentare un singolo lineage sulla base di informazioni
fornite da analisi effettuate su un singolo segmento genico.
Se si considera, infine, il fatto che il Seg-5 del sierotipo BTV-1
è stato trovato per la prima volta in un ceppo BTV-4 isolato
in Tunisia nel 2007, l’origine nord-africana del ceppo BTV4 SAD2012 potrebbe essere considerata conclusiva. Più
difficile, invece, sembra poter risalire all’origine del ceppo
riassortante. Potrebbe derivare, ad esempio, da una coinfezione dei sierotipi BTV-1 e BTV-4. Il riassortimento tra
ceppi vaccinali e è già stato dimostrato (1) e, di fatto, l’utilizzo
combinato di ceppi vaccinali vivi attenuati (MLVs) potrebbe
aver di gran lunga favorito questo tipo di fenomeno. In Tunisia
vaccini MLVs per i sierotipi BTV-1 e BTV-4 non sono stati
utilizzati in combinazione prima del 2010 mentre in Marocco
questi venivano impiegati già a partire dal 2005. La presenza
contemporanea dei due sierotipi, come è stato riscontrato
nel focolaio BT del 2012, potrebbe quindi aver dato origine al
nuovo ceppo riassortante BTV-1/4 con un potenziale fenotipo
alterato rispetto al ceppo parentale (8). Rispetto al ceppo BTV4 isolato nel 2003, il Seg-5 non fornisce alcun vantaggio nel
meccanismo replicativo al nuovo ceppo BTV-4 SAD2012 (8).
Il fatto che i due ceppi BTV-1 SAD2012 e BTV-4 SAD2012 non
si siano propagati in cellule di mammifero al primo tentativo
conferma l’ipotesi che si tratti di ceppi di campo ed esclude
una derivazione in toto da ceppi vaccinali dovuti all’utilizzo
in passato di vaccini vivi attenuati. In Italia il vaccino MLVs
(BTV-1) non è stato più utilizzato a partire dal 2010 ed è stato
sostituito da un vaccino inattivato che risulta più sicuro ma
che richiede costanti richiami. Dal 2008, in Italia la percentuali
di animali vaccinati si è drasticamente ridotta, soprattutto in
Sardegna. I nuovi focolai del 2012 sono probabilmente una
conseguenza della insufficiente strategia di prevenzione
adottata negli ultimi anni. BTV continua ancora a circolare in
Sardegna e in Nord-Africa con gravi ripercussioni economiche
per il settore. Sarebbe quindi auspicabile che le autorità
competenti rafforzassero il programma di monitoraggio e le
strategie di vaccinazione.
345
1. Batten, C. A., Maan, S., Shaw, A. E., Maan, N. S.,
and Mertens, P. P., 2008. A European field strain of
bluetongue virus derived from two parental vaccine
strains by genome segment reassortment. Virus Res.
137(1), 56-63.
2. Breard, E., Sailleau, C., Nomikou, K., Hamblin, C.,
Mertens, P. P., Mellor, P. S., El Harrak, M., and Zientara,
S., 2007. Molecular epidemiology of bluetongue
virus serotype 4 isolated in the Mediterranean Basin
between 1979 and 2004. Virus Res. 125(2), 191-197.
3. Cetre-Sossah, C., Madani, H., Sailleau, C., Nomikou,
K., Sadaoui, H., Zientara, S., Maan, S., Maan,
N., Mertens, P., and Albina, E., 2011. Molecular
epidemiology of bluetongue virus serotype 1 isolated
in 2006 from Algeria. Res. Vet. Sci. 91(3), 486-497.
4. Chaignat, V., Worwa, G., Scherrer, N., Hilbe, M.,
Ehrensperger, F., Batten, C., Cortyen, M., Hofmann,
M., and Thuer, B., 2009. Toggenburg Orbivirus, a new
bluetongue virus: initial detection, first observations in
field and experimental infection of goats and sheep.
Vet. Microbiol. 138(1-2), 11-19.
5. Conte, A., Giovannini, A., Savini, L., Goffredo, M.,
Calistri, P., and Meiswinkel, R., 2003. The effect of
climate on the presence of Culicoides imicola in Italy.
J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 50(3),
139-147.
6. de Diego, A. C., Sanchez-Cordon, P. J., and SanchezVizcaino, J. M., 2013. Bluetongue in Spain: From the
First Outbreak to 2012. Transbound Emerg Dis., in
press
7. Hofmann, M., Griot, C., Chaignat, V., Perler, L., and
B, T., 2008. Bluetongue disease reaches Switzerland.
Schweiz. Arch. Tierheilkd. 150, 49-56.
8. Lorusso A., Sghaier S, Carvelli A, Di Gennaro A,
Leone A, Marini V, Pelini S, Marcacci M, Rocchigiani
AM, Puggioni G & Savini G (2013). Bluetongue virus
serotypes 1 and 4 in Sardinia during Autumn 2012:
New Incursions or Re-infection with Old Strains?
Infection Genetics and Evolution, in press. doi:
10.1016/j.meegid.2013.06.028.
9. Maan, S., Maan, N. S., Nomikou, K., Veronesi, E.,
Bachanek-Bankowska, K., Belaganahalli, M. N.,
Attoui, H., and Mertens, P. P., 2011. Complete
genome characterisation of a novel 26th bluetongue
virus serotype from Kuwait. PLoS One 6(10), e26147.
346
10. Maclachlan, N. J., Drew, C. P., Darpel, K. E., and
Worwa, G., 2009. The pathology and pathogenesis
of bluetongue. J. Comp. Pathol. 141(1), 1-16.
11. Mertens, P., Ross-Smith N., Diprose J., Attoui H.,
2009. The structure of bluetongue virus core and
proteins. In: Bluetongue. 1st edition. P. Mellor,
M. Baylis and P. Mertens, eds. Academic Press,
London., 101-133.
12. Potgieter, A. C., Monaco, F., Mangana, O., Nomikou,
K., Yadin, H., and Savini, G., 2005. VP2-segment
sequence analysis of some isolates of bluetongue
virus recovered in the Mediterranean basin during the
1998-2003 outbreak. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet.
Public Health 52(9), 372-379.
13. Ratinier, M., Caporale, M., Golder, M., Franzoni, G.,
Allan, K., Nunes, S. F., Armezzani, A., Bayoumy,
A., Rixon, F., Shaw, A., and Palmarini, M., 2011.
Identification and characterization of a novel nonstructural protein of bluetongue virus. PLoS Pathog.
7(12), e1002477.
14. Savini, G., F. Monaco, P. Migliaccio, C. Casaccia,
S. Salucci, and Ventura, M. D., 2004. Virological
and serological responses in sheep following field
vaccination with bivalent live-modified vaccine
against bluetongue virus serotypes 2 and 9. Vet. Ital.
40, 631-634.
15. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., and Kumar, S., 2007.
MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
(MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24(8),
1596-1599.
16. Verwoerd, D., 1970. Failure to demonstrate in vitro
as opposed to in vivo transcription of the bluetongue
virus genome. Onderstepoort J. Vet. Res. 37, 225227.
MONITORAGGIO DELLE CROSS CONTAMINAZIONI DA PAT NEI LABORATORI CHE
ESEGUONO LE ANALISI UFFICIALI NEI MANGIMI
Marchis D.1), Amato G.1), Benedetto A.1), Brusa B.1), Abete M.C.1)
1)
Key words: cross contamination, PAT, mangimi
SUMMARY
Several potential sources of cross contamination by processed
animal proteins (PAP) exist within a laboratory environment.
Among them we have: manipulation of material (sample
collection, transportation, grinding...), use of contaminated
equipment (unclean milling devices, vials, spatula...) and
ambient contamination. Simple measures according to GLP
standards can drastically reduce this risk. As a result of efficient
counter measures, the risk for laboratory cross contamination
can be reduced but never eliminated. Ambient or environmental
air contamination still remain hard to eliminate and therefore
needs monitoring.
Il nostro laboratorio, quale Laboratorio Nazionale di
Riferimento delle proteine animali trasformate, ha poi
proseguito lo studio per ulteriori 5 mesi per valutare
le eventuali contaminazioni dopo la manipolazione e
analisi di campioni positivi.
Per questa seconda parte dello studio il laboratorio ha
effettuato un primo monitoraggio dopo un periodo di
tempo pari a 3 mesi, in cui sono state analizzate 32
farine di pesce, ed un secondo monitoraggio dopo la
preparazione del Proficiency Test (PT) annuale, per
il quale sono stati preparati e quindi manipolati 150
campioni positivi.
INTRODUZIONE
Nell’ambiente di lavoro dei laboratori che eseguono le analisi
ufficiali sui mangimi esistono differenti fonti di contaminazione
da proteine animali trasformate (PAT). Tra le possibili cause
di contaminazione possiamo trovare: la manipolazione dei
materiali (trasporto, stoccaggio, macinazione) l’uso di oggetti
e/o equipaggiamenti poco puliti (attrezzatura da laboratorio,
vetreria) e la contaminazione vera e propria. Come risulta
da alcuni studi statistici il rischio di cross contaminazione in
laboratorio può essere ridotto drasticamente, adottando dei
semplici accorgimenti e un monitoraggio mensile, ma mai
eliminato del tutto.
Lo studio è stato eseguito seguendo le linee guida fornite
dall’EURL-AP.
Nella tabella 1 sono riportati i risultati ottenuti dai 5 laboratori
della rete nazionale dopo un anno di studio. Come si può notare
sono stati trovati frammenti ossei in due dei cinque laboratori
che hanno partecipato allo studio, e più precisamente nella
zona della pesata e a livello della cappa.
Nel laboratorio 3, dove è stato rilevato un frammento osseo,
è stata riscontrata anche una fibra muscolare, entrambi nella
zona della pesata.
Nel laboratorio 1 si sono riscontrate due fibre muscolari,
entrambe nella zona della cappa.
Negli altri laboratori, invece, si sono evidenziate fibre tessili,
fibre vegetali e capelli, quindi non è stato rilevato nulla di
significativo ai fini delle analisi.
MATERIALI E METODI
Per effettuare il monitoraggio sono stati utilizzati:
- Vetrini ad orologio
- Pennelli
- Vetrini portaoggetto
- Vetrini coprioggetto
Innanzitutto sono stati individuati i punti del laboratorio
considerati a rischio o maggiormente esposti a contaminazione,
ovvero:
- punto 1: zona della pesata
- punto 2: zona della macinazione
- punto 3: zona della preparazione e lettura dei vetrini
- punto 4: cappa (zona dove avviene la fase di
estrazione dei mangimi)
A livello di questi “punti chiave” sono stati collocati i vetrini
ad orologio opportunamente identificati e lasciati lì per
un periodo pari a 30 giorni.
Il materiale che si è depostitato sul vetrino ad orologio
durante i 30 giorni è stato raccolto con un pennello
pulito, trasferito su un vetrino portaoggetto, coperto
da un vetrino coprioggetto, e osservato al microscopio
ottico (usando come mezzo di montaggio il glicerolo).
Alla prima parte dello studio hanno partecipato 5 laboratori
della rete nazionale che per 12 mesi hanno monitorato
il proprio ambiente di lavoro.
Tabella 1 – Risultati di 5 laboratori sullo studio delle cross
contaminazioni
Frammenti Fibre
Fibre
ossei
muscolari tessili
Capelli Fibre
vegetali
Lab 1
0
2
0
0
2
Lab 2
0
0
0
1
3
Lab 3
1
1
2
0
1
Lab 4
0
0
3
0
0
Lab 5
2
0
25
4
25
Nella tabella 2 sono riportati i risultati ottenuti dal monitoraggio
effettuato dall’NRL dopo l’analisi dei campioni positivi. Si può
notare che dopo il primo periodo di monitoraggio durante il
quale sono state analizzate in laboratorio 32 farine di pesce,
si sono riscontrate due fibre muscolari, una nella zona della
cappa e una nella zona della pesata.
Dopo la manipolazione dei 150 campioni positivi preparati per
il RT si sono riscontrate invece 6 fibre muscolari, tutte a livello
della cappa.
Si sono evidenziate, inoltre, fibre tessili, fibre vegetali e minerali,
in numero maggiore nella zona della pesata.
347
Tabella 2 – Risultati dell’NRL sullo studio delle cross
contaminazioni
Frammenti Fibre
Fibre Fibre
Minerali
ossei
muscolari tessili vegetali
0
2
12
19
5
Lettura
dopo 32
mpositivi
Lettura
0
dopo 150
positivi
6
32
28
13
Dai dati raccolti possiamo concludere che le zone più a rischio
di contaminazione risultino essere la zona della cappa, dove si
sono riscontrate la maggior parte di fibre muscolari, e la zone
della pesata.
La cappa risulta essere una zona particolarmente a rischio
poiché è dove avviene la fase di estrazione e di asciugatura del
sedimento; inoltre il ricircolo della cappa potrebbe contribuire al
trasporto di particelle volatili come le fibre muscolari.
Anche la zona della pesata è uno dei punti maggiormente
esposti a contaminazione perchè durante la pesata è facile
che il materiale polverulento vada ad “inquinare” l’ambiente di
lavoro circostante.
Il riscontro in un laboratorio solo di fibre muscolari e nessun
frammento osseo si può spiegare tenendo conto della volatilità
delle fibre muscolari, che quindi costituiscono un rischio
maggiore di contaminazione rispetto ai frammenti ossei.
Risulta perciò indispensabile un’accurata pulizia delle zone del
laboratorio considerate a rischio per ridurre al minimo il rischio
di cross contaminazioni.
E’ importante sottolineare, inoltre, che il non riscontro di
frammenti ossei e fibre muscolari non corrisponda ad una
contaminazione pari a zero, benchè indichi un ambiente di
lavoro dove la probabilità di contaminazione è molto bassa (ma
non nulla).
Durante lo studio sono emerse alcune criticità relative allo
studio stesso. Un passaggio critico per la valutazione delle
contaminazioni si è rivelato essere il trasferimento del materiale
sul vetrino effettuato con il pennello, poichè a questo livello
potrebbero rimanere intrappolati frammenti ossei e fibre
muscolari. Per studi futuri, in alternativa ai pennelli, potrebbero
essere usate delle cartine ottiche per ridurre al minimo la
perdita di particelle utili all’indagine.
I dati acquisiti risultano ancora insufficienti per una elaborazione
statistica a causa dei pochi laboratori della rete nazionale
che hanno aderito allo studio. Mancano inoltre alcune
informazioni importanti come il numero di campioni che transita
all’interno di ciascun laboratorio, poichè un numero elevato di
campioni all’interno del laboratorio aumenta la possibilità di
contaminazione.
Lo studio dovrebbe poi essere più mirato, si dovrebbe cioè
porre maggiore attenzione a quei laboratori che vengono a
contatto piu’ spesso con campioni positivi (es. analisi su farine
di pesce).
L’intenzione dell’NRL è quella di proseguire lo studio e, tenendo
conto di queste criticità, implementare il monitoraggio avendo
cura di acquisire dati sempre più precisi e mirati.
BIBLIOGRAFIA
1) Araujo Rennan G.O. et al, Food Chem., 101:397-400, 2007.
2) Jiang Y. Et al, Neurotoxology, 28:126-135, 2007.
3) La Pera L. et al, Chirotti Editori, pp. 257, 2005.
4) Reg. EC 767/2009
5) Zatta P. et al, Brain Research Bullettin, 62:15-28, 2003.
6) Reg. EC 152/2009
SORVEGLIANZA MORTALITA’ API 2012/2013: RISULTATI UMBRI
Maresca C. 1, Dettori A. 1, Scoccia E. 1, Valentini A.1, Ghittino C. 1, Macellari P. 2
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, Perugia
2
USL Umbria 1, Perugia
Key words: Umbria, sorveglianza, api
SUMMARY
The objectives of the UE pilot surveillance project are to
harmonize active surveillance procedures that will allow an
accurate estimation of colony losses within and throughout
participating European countries. An active surveillance based
on visits was carried out at specific period by trained bee
inspectors on a representative sample of apiaries.
Five apiaries were randomly selected in Umbria Region. During
the first visit one systematic sampling of 300 honeybee per
examined hive was collected, additional symptomatic samplings
in every hive with symptoms either on adult bees or on brood
during visits 1, 2 and 3 were collected. The varroa mites were
counted on the samples of internal honeybees, based on the
OIE diagnosis method. The average rate of varroa mites per
colony ranged from 1 to 28 varroa mites per 100 bees. The rate
of varroa average for all 5 apiaries was 5%. Only one apiary
has reported symptoms such as honeybees with deformed
wings and cannibalism on larvae/pupae.
INTRODUZIONE
L’ambiente naturale, le condizioni climatiche e geografiche
hanno da sempre favorito in Umbria l’attività apistica.
Il ruolo delle api per l’ambiente è fondamentale perché favorisce
la biodiversità ed è necessario nell’opera di impollinazione delle
colture (1).
Nell’ultimo decennio in cui si è assistito al fenomeno dello
spopolamento degli alveari che ha interessato numerosi paesi
europei in particolare dell’Europa occidentale (2, 6), la salute
delle api è stata oggetto di maggiore osservazione.
La moria delle api è un fenomeno che si è verificato già dal
2003 ed è stato definito in USA (7) come Colony Collapse
Disorder (CCD) per il quale pare siano coinvolti numerosi
fattori che possono agire sinergicamente come virus, batteri,
parassiti, l’impiego di fitofarmaci, la riduzione della biodiversità
(carenze nutrizionali) e variazioni climatiche.
In tutta Europa l’apicoltura è una attività ampiamente praticata,
nell’UE si contano circa 700.000 apicoltori, il 97% di questi sono
rappresentati da apicoltori non professionisti che detengono il
67% degli alveari dell’UE (3). L’Unione Europea ha messo a
punto un Piano di sorveglianza comunitario che ha coinvolto
17 Stati membri tra cui l’Italia con obiettivi specifici di valutare
il tasso di mortalità invernale e stagionale e la prevalenza
delle principali patologie delle api attraverso protocolli di
campionamento ed analisi standardizzati con la finalità di
ottenere dati comparabili tra i diversi Stati.
Lo scopo di questo lavoro è stato analizzare la situazione
degli apiari in Umbria, coinvolti nel piano di sorveglianza, ed
esaminare le criticità emerse.
MATERIALI E METODI
Il Progetto pilota di sorveglianza europeo prevedeva l’ispezione
di un numero stabilito di aziende apistiche per Regione
348
attraverso una estrazione random degli apiari e delle colonie
presenti. Per l’Umbria era prevista la visita e il campionamenti
di cinque apiari.
Per ciascun apiario da campionare era prevista una selezione
in maniera casuale delle colonie in base al numero totale di
colonie presenti per individuare una prevalenza del 20%.
La sorveglianza attiva sugli apiari implicava visite a scadenze
fisse: la prima visita doveva essere effettuata tra settembre e
ottobre 2012 prima del periodo invernale la seconda tra febbraiomarzo e aprile 2013 alla fine del periodo di svernamento e la
terza visita era da effettuarsi nel corso della stagione attiva nell’
estate 2013 (4).
Durante i sopralluoghi è stata compilata una scheda con i dati
relativi all’apicoltore, all’apiario visitato, all’attività svolta sulle
colonie nel 2012, all’ambiente circostante e la descrizione
dei sintomi clinici e disturbi presenti nelle colonie esaminate.
L’ispezione prevedeva inoltre l’annotazione delle condizioni
sanitarie delle colonie, eventuali malattie, trattamenti anti
varroa effettuati riferiti alla stagione 2012.
Le finalità del campionamento erano individuare il tasso di
infestazione delle api adulte da Varroa destructor e determinare
i livelli di infezione del Virus della paralisi acuta delle api (ABPV)
e del Virus delle ali deformi (DWV).
Le matrici da campionare erano costituite da 300 api vive per
la conta delle varroe e per le virosi e in caso di sospetto di
malattia era previsto un campionamento di api vive malate,
favo di covata, eventuali parassiti (coleotteri e acari diversi da
varroa) e se presenti un campione di api morte.
In laboratorio è stata effettuata la conta delle varroe ed espresso
il livello di infestazione come tasso medio di varroa su 100 api
per ogni colonia campionata.
Sono state 5 le aziende apistiche (figura 1) sottoposte da parte
dei Servizi Veterinari della Regione Umbria alla prima visita del
periodo invernale prevista dal Piano di sorveglianza. Tutti gli
apicoltori coinvolti nel progetto avevano un numero di apiari
uguale o superiore a 2, con un numero di colonie variabile da
40 a 120. Due degli apicoltori coinvolti svolgevano l’attività parttime e 3 come hobby. Tutti appartenevano ad una associazione
di apicoltori tranne uno per il quale non era stato specificato,
4 di loro non effettuavano nomadismo, 1 lo effettuava fuori
regione.
Il numero di colonie ispezionate è stato di 40 su un totale di 89
colonie distribuite nei 5 apiari sottoposti al controllo (tabella 1).
Per ogni colonia è stato raccolto un campione di 300 api. Tutti
gli apiari controllati avevano almeno due colonie infestate da
varroa. Il tasso medio di varroa per colonia registrato variava
da un minimo di 1 a un massimo di 28 varroe ogni 100 api. Il
tasso di varroa medio per le colonie di tutti gli apiari è stato circa
del 5% (figura 2), più elevato rispetto, per esempio, a quello
registrato nella Regione Lazio con un valore del 3,43% (5).
349
E’ risultato del 62,5% (25/40) il rapporto tra il numero di colonie
infestate da V. destructor durante la prima visita e il numero
totale di colonie monitorate per apiario.
Attraverso l’osservazione interna delle colonie, da un solo
apiario sono stati diagnosticati i seguenti sintomi: presenza di
varroa in fase foretica (n=6 su 10 colonie ispezionate), api con
ali deformate o atrofizzate (n=4 su 10), segni di cannibalismo
su larve o pupe (n=1 su 10). Gli stessi disturbi presenti al
momento della visita erano stati registrati per quell’apiario nel
corso della stagione 2012.
Nel corso della seconda e terza visita non sono state rilevate
anomalie nei 5 apiari sottoposti al controllo.
La difficoltà iniziale è stata quella di reperire la lista di tutti gli
apiari presenti nel territorio regionale a causa dell’incompleto
aggiornamento dei dati dell’anagrafe nazionale. L’anagrafe
apistica nazionale è stata istituita con il Decreto del 4 dicembre
2009 (disposizioni per l’anagrafe apistica nazionale GU n. 93
del 22-4-2010); le finalità dell’istituzione dell’anagrafe sono la
tutela della salute delle api, la valorizzazione del patrimonio
apistico, la tutela del consumatore e dei prodotti derivati dalle
api, la farmacosorveglianza. L’anagrafe apistica nazionale
attualmente non è però entrata a pieno regime, la bozza del
Manuale Operativo contenete le procedure di attuazione del
Decreto sull’anagrafe apistica non è stata ancora ultimata.
Per ottenere i nominativi degli apicoltori umbri ci si è avvalsi
perciò dell’anagrafe apistica regionale degli apicoltori.
La costituzione di una anagrafe apistica nazionale efficace
ed efficiente basata su dati standardizzati è quindi necessaria
non solo per conoscere il patrimonio apistico presente in un
territorio ma anche per poter adottare gli adempimenti previsti
dal Regolamento di polizia veterinaria (DPR 320/54) che
disciplina la lotta alle malattie delle api.
VALUTAZIONE DELL’EFFICIENZA DEL KIT BOVIGAM®2
Tabella 1: distribuzione per azienda degli apiari, colonie
totali e campionate
Apiari
totali
Colonie
totali
Colonie
apiario
campione
Colonie
ispezionate
Azienda 1
3
100
15
10
Azienda 2
2
40
17
10
Azienda 3
3
120
45
8
Azienda 4
4
51
6
6
Azienda 5
2
45
6
6
Azienda
Figura 2: distribuzione percentuale negli apiari controllati
del tasso medio di varroa per 100 api e valore medio
BIBLIOGRAFIA
Figura 1: georeferenziazione degli apiari controllati in Umbria
1. Aspetti igienico-sanitari in apicoltura, (2010). Quaderni
di zooprofilassi numero 5, terza edizione.
2. OPERA Research Centre Bee health in Europe –
Facts and figures, (2013) Compendium of the latest
information on bee health in Europe.
3. COMMISSIONE EUROPEA, Bruxelles, 6.12.2010
Comunicazione della commissione europea al
Parlamento europeo e al consiglio relativa alla salute
delle api.
4. European Union Reference Laboratory for honeybee
health. (2011) Guidelines for a pilot surveillance
project on honeybee colony losses.
5. Giovanni Formato (2013) Il piano di sorveglianza
del Ministero della Salute. Risultati nella Regione
Lazio http://www.izslt.it/apicoltura/progetto-pilota-disorveglianza-sulla-salute-delle-api/
6. EFSA report: Hendrikx P., Chauzat M.P., Debin M.,
Neuman P., Fries I., Ritter W., Brown M., Mutinelli F.,
Le Conte Y., Gregorc A. (2009). Bee Mortality and Bee
Surveillance in Europe CFP/EFSA/AMU/2008/02.
7. Hayes, J. (2007) Colony collapse disorder - Research
update. American Bee Journal, 147, 1023 1025.
350
Marineo S.1, Mossi P.2, Crucitti D.1, Vargetto D.1, Giarratana R.1 and Caracappa S.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia- Dipartimento Sanità Animale Interprovinciale
2
Prionics AG, Switzerland
Keywords: Mycobacterium bovis, Bovigam, Interferon gamma assay
ABSTRACT
Bovine Tuberculosis (Tb) is a respiratory disease caused
by the bacterium Mycobacterium bovis. It is a major infectious disease spread worldwide in domestic animals and in
certain wildlife populations. Symptoms may include physical weakness, anorexia, emaciation, enlargement of lymph
nodes. Tuberculosis is an important zoonosis and presents a
serious health risk to humans. The bacterium can be spread
from animals to humans through aerosols or through the
consumption of unpasteurized milk or dairy products from
infected cows.
In this work the results obtained with the new version of Bovigam 1 are compared with those obtained with the new version Bovigam 2.
La tubercolosi bovina causata da Mycobacterium bovis è
una malattia cronica infettiva con distribuzione mondiale e
rappresenta un’importante barriera per il commercio degli
animali con significative perdite economiche. La tubercolosi
è inoltre una malattia zoonosica quindi rappresenta un grave
rischio anche per l’uomo.
Il test cutaneo (intradermoreazione) che si basa sull’ipersensibilità di tipo ritardato è la metodica più comunemente utilizzata per identificare la tubercolosi nei bovini [1]. L’interpretazione è basata sull’osservazione dell’ispessimento cutaneo
sia in assenza che in presenza di segni clinici. Altre prove
diagnostiche utilizzate per la conferma della tubercolosi ci
sono il test IFN-γ, l’osservazione degli animali in sede di macellazione e l’isolamento colturale (Ordinanza Ministeriale
14 Novembre 2006).
Il test IFN-γ si basa sul principio secondo il quale i linfociti
Th1 presenti nei campioni di sangue intero sensibilizzati con
l’antigene (proteina purificata tubercolina derivata PPD) producono l’IFN-γ al contrario dei linfociti mai venuti in contatto
con Mycobacterium. Il test è in grado di dimostrare quindi
la reattività immunitaria cellulo-mediata (CMI). La quantità
di IFN-γ prodotto dai linfociti stimolati è quantizzabile attraverso un test ELISA eseguibile o immediatamente dopo la
sensibilizzazione o in un secondo momento venendo così
incontro alle esigenze e alle priorità del laboratorio.
Fig. 1 Principio del test BOVIGAM. Nella prima fase il sangue intero in vitro viene incubato per 24h per indurre la produzione di IFN-γ, nella seconda la produzione di IFN-γ viene
rilevata mediante un test ELISA a sandwich.
Il test BOVIGAM® IFN-γ viene utilizzato in molti paesi [2,3]
nei programmi di controllo della tubercolosi bovina [4]. Il saggio del l’IFN-γ offre una maggiore sensibilità e la possibilità
di una rapida ripetizione del test. Inoltre, utilizzando il saggio
IFN-γ non è richiesta una seconda visita del veterinario in
azienda e il tipo di tecnica utilizzata rende l›interpretazione
del risultato meno soggettiva
Al test BOVIGAM®1 sono state apportate delle modifiche
tra cui l’utilizzo di una serie di peptidi stimolanti che offrono un’elevata flessibilità nell’applicazione del test che hanno
portato al BOVIGAM®2. Nella nuova versione, inoltre, i tempi
di esecuzione del test sono stati accorciati e la procedura
semplificata in quanto durante l›esecuzione del test ELISA
non è necessario aggiungere il cromogeno (piochè già presente con l›enzima substrato) e una delle fasi di lavaggio è
stata eliminata. Lo scopo di questo lavoro è quello di valutare l’efficienza della nuova versione del kit BOVIGAM® al fine
di potere effettuare analisi diagnostiche che possano essere
affidabili e tempestive.
Presso i laboratori diagnostici dell›Istituto Zooprofilattico
Sperimentale della Sicilia sono stati analizzati 53 sieri provenienti da tre allevamenti di cui due con capi positivi al
test cutaneo. Alcuni dei capi positivi, durante l’esame post
mortem hanno mostrato lesioni riferibili alla tubercolosi ed
è stato inoltre possibile l’isolamento con la successiva spoligotipizzazione che ha confermato la presenza dello spoligotipo SB0120, il più diffuso tra i bovini siciliani [5]. Il terzo
allevamento non ha mai manifestato positività all’intradermoreazione.
Tutti i sieri sono stati saggiati sia con il kit BOVIGAM®1 che
con il kit BOVIGAM®2 seguendo in entrambi i casi i protocolli
forniti dalla casa produttrice.
Il confronto tra i risultati ottenuti con le due versioni è schematizzato nella tab 1.
351
BOVIGAM®1
BOVIGAM®2
+
+ 15
0
3
35
Tab 1 Riepilogo dei risultati positivi e negativi ottenuti con le
due metodiche a confronto.
Dei 53 sieri analizzati 15 sono risultati positivi con entrambi i kit
utilizzati e 35 sono risultati negativi con entrambe le metodiche
utilizzate. Nessuno dei sieri è risultato positivo con il kit BOVIGAM®1 e negativo con la nuova versione, ma 3 sieri identificati
come negativi con la vecchia versione del kit si sono rivelati positivi con la nuova versione dimostrando la maggiore sensibilità
del kit BOVIGAM®2.
La nuova versione del kit BOVIGAM® ha quindi dimostrato una
maggiore sensibilità e una maggiore semplicità del protocollo
di utilizzo.
Test sempre più sensibili possono essere validi alleati nella
strategia attualmente utilizzata per l’eradicazione di questa patologia.
1. Monaghan M.L., M.L. Doherty, J.D. Collins, J.F. Kazda,
P.J. Quinn (1994) The tuberculin test Veterinary Microbiology, Volume 40, Issues 1–2, May 1994, Pages 111–124
2. Acevedo P., Romero B., Vicente J., Caracappa S.,
Galluzzo P., Marineo S., Vicari D., Torina A., Casal C., de la
Fuente J., Gortazar C. (2013) Tuberculosis epidemiology
in islands: insularity, hosts and trade. PLoS One. 2013 Jul
29;8(7):e71074
3. de la Rua-Domenech R., Goodchild A.T., Vordermeier
H.M., Hewinson R.G., Christiansen K.H., Clifton-Hadley
R.S. (2006) Ante mortem diagnosis of tuberculosis in
cattle: a review of the tuberculin tests, gamma-interferon
assay and other ancillary diagnostic techniques. Res Vet
Sci. 2006 Oct;81(2):190-210
4. Vordermeier M., Whelan A., Ewer K., Goodchild T., Clifton- Hadley R., Williams J., Hewinson R.G. (2006) The
BOVIGAM® assay as ancillary test to the Tuberculin skin
test. Government Veterinary Journal; 16(1):72-80
5. Schiller I., Vordermeier H.M., Waters W.R., Whelan A.O.,
Gormley E., Buddle B.M., Palmer M., Thacker T., McNair
J., Welsh M., Hewinson R.G., Oesch B. (2010) Bovine
tuberculosis: Effect of the tuberculin skin test on in vitro
interferon gamma responses Veterinary Immunology and
Immunopathology, 136:1-11
NESTED- PCR PER LA DIAGNOSI DI TOXOPLASMA GONDII
Marino A.M.F., Alfonzetti T., Puglisi M.L., Aparo A., Vitale F., Reale S.
Centro di Referenza Nazionale per la Toxoplasmosi - Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Catania
Keywords: Toxoplasma gondii, Nested-PCR, Gene B1
ABSTRACT
Authors describe the Nested-PCR method for Toxoplasma
gondii diagnosis of biological samples and foodstuffs
derived from susceptible animal species, with reference to
the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals OIE ed. 2008 “Toxoplasmosis”, Section 2.9.10. B
1.c. The method includes a step of extraction of DNA and
subsequent amplification by Nested-PCR (1). The amplified
genomic region is a part of the gene B1 Locus AF179871.
Before the extraction step, the sample is digested and
pretreated according to a procedure variable in relation to the
matrix in question. The method was validated by calculating
the sensitivity, specificity and accuracy, and using dilutions
of the positive control purchased from the ATCC, cells grown
on Human Fetal Foreskin. The drafting of a protocol for rapid
and reliable diagnosis from edible and biological matrices
is explained by the need to ensure, through the laboratory,
surveillance towards a neglected zoonoses.
INTRODUZIONE
La Toxoplasmosi appartiene al gruppo delle zoonosi neglette.
L’EFSA ha ribadito, nei report sulle zoonosi degli ultimi anni,
la necessità di approfondire la conoscenza sui livelli di
prevalenza in ambito zootecnico e sui livelli di infestazione
da cisti parassitarie delle carni degli animali macellati. La
disponibilità di un metodo diagnostico rapido e validato
costituisce un presupposto fondamentale per approfondire
lo studio sulla malattia.
MATERIALI E METODI
I campioni biologici ed alimentari possono essere
rappresentati da tessuti o da sangue intero di specie animali
recettive.
Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA è stata condotta seguendo le modalità
previste dalle istruzioni del Kit dell’Invitrogen PureLink™
Genomic DNA che fa uso di colonnine di affinità. Tali istruzioni
prevedono, prima della fase di estrazione, di operare una
fase di preparazione del campione, nel corso della quale
vengono digeriti i tessuti così da facilitarne le successive
fasi d’analisi.
La durata della digestione varia da poche ore a tutta la notte,
secondo la consistenza del campione. Nel caso in cui la
matrice in esame sia rappresentata da tessuto muscolare o
da organi (fegato, cuore, ecc.), per aumentare la probabilità
di evidenziare i bradizoiti nelle cisti è opportuno processare
una quantità di campione che sia più rappresentativa
possibile e sottoporla a digestione per una notte. A seguito
della fase di pretrattamento le matrici da esaminare vengono
ridotte in forma di omogenato.
Successivamente il campione è digerito con 200 µl di
tampone di lisi contenente sali cautropici e la proteinasi K,
utile per eliminare le contaminazione derivate dalla presenza
352
di proteine inquinanti, e incubato a 55°C fino a completa lisi
e dissoluzione della sua parte corpuscolata. La miscela è in
seguito caricata nella colonnina di affinità e fatta passare, per
centrifugazione, attraverso la colonnina di silice a cui si lega
il DNA. Il DNA bloccato sul filtro viene lavato per due volte
con gli opportuni tamponi di lavaggio e centrifugato fino ad
asciugatura. Viene quindi eluito con il tampone di eluizione
e recuperato per centrifugazione. La presenza del DNA così
estratto dal campione è verificata tramite elettroforesi su
gel di agarosio all’1% e successiva lettura della corsa su
gel mediante acquisitore di immagini. La concentrazione è
valutata attraverso il confronto con bande di peso molecolare
noto contenute nel marcatore λHind III, cioè DNA del fago λ
digerito con Hind III.
Amplificazione Nested – PCR
La scelta della regione di amplificazione si è basata sul
lavoro di Burg et al (1989) (3) a cui fa riferimento il anche
il Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals – O.I.E.- ed. 2008, “Toxoplasmosis” Cap. 2.9.10. B
1.c.
La metodica Nested-PCR prevede due successive
amplificazioni di una regione del gene B1 LOCUS AF179871.
Il target scelto è stato individuato nella sequenza ripetitiva
B1, che è presente nel genoma di T. gondii in 35 copie
aumentando così la sensibilità e la specificità della PCR (4)
(5).
La prima amplificazione “first” è condotta con i primers P1
(Toxo Burg First Forward) e P4 (Toxo Burg Nested Reverse)
per dare un amplificato di 194bp, e la seconda amplificazione
“nested” con i primers P2 (Toxo Burg Nested Forward) e P3
(Toxo Burg Nested Reverse) ottenendo un frammento di 97
bp (Tabb. 1 e 2).
Tabella 1 – Sequenza parziale gene B1
661cttcaagcagcgtattgtcgagtagatcagaaaggaactg
catccgttcatgagtataagaaaaaaatgtgggaatgaaagag
acgctaatgtgtttgcataggttgcagtcactgacgagctccc
ctctgctggcgaaaagtgaaattctgagtatctgtgcaacttt
ggtgtattcgcagattggtcgcctgcaatcgatagttgacacg
aacgctttaaagaacaggagaagaag 900
Il programma di amplificazione per la PCR First prevede una
fase di denaturazione a 94°C per 5 minuti. Successivamente
i campioni sono sottoposti a 35 cicli di amplificazione così
costituiti: denaturazione 95°C per 50 secondi, annealing 53°C
per 50 secondi e polimerizzazione 72°C per 60 secondi, e la
polimerizzazione finale a 72°C per 4 min.
Il programma di amplificazione per la PCR_Nested prevede
una fase di denaturazione a 95°C per 3 minuti.
353
Tabella 2 – Sequenza primers utilizzati per la Nested - PCR
saggiare 50 campioni a valore noto, realmente positivi, ottenuti
dal ceppo di riferimento certificato ATCC50838 e campioni
realmente negativi. Inoltre è stato valutato il limite di rivelabilità
(LOD) del metodo che è identificato come la più alta diluizione
alla quale tutti i replicati hanno dato esito positivo alla PCR. Il
LOD corrispondente alla concentrazione di analita più bassa
in riscontro della quale tutti i replicati (100%) sottoposti a
Nested-PCR danno esito positivo. Per calcolare il LOD è stata
effettuata l’estrazione del campione positivo noto (contenente
l’analita in esame) e quindi sono state eseguite opportune
diluizioni scalari in base 10 del genoma estratto. Per la prova è
stato predisposto anche un controllo negativo.
Primers First PCR: frammento di 194 bp
Toxo Burg First Forward
5’-ggaactgcatccgttcatgag
da 694 a 714 P1
Toxo Burg First Reverse
5’- gaccacgaacgctttaaaga
da 887 a 868
P4
(3’- ctggtgcttgcgaaatttct ) Sequenza complementare Burg
Primers Nested PCR: frammento di 97 bp
Toxo Burg Nested Forward
5’- tgcataggttgcagtcactg
da 757 a 776 P2
Toxo Burg Nested Reverse
5’- ggtgtattcgcagattggtcgcc da 853 a 831 P3
(3’- ccacataagcgtctaaccagcgg) Sequenza complementare
Burg
I campioni vengono quindi sottoposti a 30 cicli di amplificazione
così costituiti: denaturazione 95°C per 45 secondi, annealing
58°C per 30 secondi e polimerizzazione 72°C per 60 secondi, e
la polimerizzazione finale a 72°C per 5 min.
La rilevazione dei prodotti della PCR è ottenuta mediante la
corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2%. Foto 1.
Foto 1 – Elettroforesi su gel di agarosio del prodotto di
amplificazione di 97bp ottenuto mediante Nested- PCR.
97bp
p
Validazione del metodo
Per la validazione del metodo si è fatto riferimento al
calcolo della sensibilità, specificità ed accuratezza. Questi
valori descrivono la capacità del metodo nell’individuare
correttamente, rispettivamente, un campione positivo ed un
campione negativo. Per calcolare tali parametri si è stabilito di
Gli autori hanno ottimizzato e validato una tecnica di biologia
molecolare, basata sulla PCR qualitativa, applicabile a diverse
matrici sia biologiche che alimentari. Il lavoro ha prodotto dati
sull’applicazione del metodo Nested-PCR su campioni veri
positivi e veri negativi. Ogni prova è stata ripetuta tre volte, da
tre operatori, per confermare e validare i risultati elaborati da
ogni campione. E’ stato raggiunto l’obiettivo di ottimizzare la
classica PCR qualitativa, mirata all’amplificazione del gene B1,
modificata dall’introduzione di una PCR Nested come indicato
nel Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals – O.I.E.- ed. 2008. Dall’osservanza del protocollo di
validazione, si è riscontrato un valore di sensibilità, specificità
e accuratezza del 100% ed un LOD pari a 0,001pg/µl. Il limite
di rilevabilità calcolato, corrisponde a 10-4 pg/µl, riconducibile
ad una sensibilità del 70%, partendo da uno standard di 10pg/
µl fino ad una diluizioni 10-5. L’attività svolta ha prodotto uno
strumento analitico a servizio della sanità pubblica e veterinaria
che sempre maggiori attenzioni dovranno riservare alla
Toxoplasmosi nel nostro Paese.
BIBLIOGRAFIA
1) Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals – O.I.E.- ed. 2008, “Toxoplasmosis” Cap. 2.9.10. B 1.c.
2) J.G. Montoya, O. Liesenfeld, (2004) “Toxoplasmosis” Lancet
vol.363: 1965-76.
3)J. L. Burg, C. M. Grover, P. Pouletty and J. C. Boothroyd
(1989) “Direct and sensitive detection of apathogenic protozoan,
Toxoplasma gondii, by polymerase chain reaction”. Journal of
Clinical Microbiol., 27 (8): 1787.
4) J.T. Ellis, (1998) “Polymerase chain reaction approches for
the detection of Neospora caninum and Toxoplasma gondii”
International Journal for Parasitology 28 (1998) 1053- 1060.
5) Benjamin Edvinsson, et al. (2004) “DNA extraction and PCR
assays for detection of Toxoplasma gondii” APMIS 112:342- 8,
Cdc toxoplasmosis.
354
L’IMPORTANZA DI UN CAMPIONAMENTO STATISTICAMENTE SIGNIFICATIVO PER
L’IDENTIFICAZIONE DELLA SPECIE BATTERICA DA UTILIZZARE NELL’ALLESTIMENTO
DI UN VACCINO STABULOGENO PER LA PROFILASSI DI MASTITI OVINE E CAPRINE
Marogna G., Barbato A., Fiori A., Carboni G.A., Schianchi G.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna “G. Pegreffi”.
Keywords: prevalenza, incidenza, intervallo di confidenza.
Summary
Milk sampling representativity is an essential prerequisite for
proper microorganism identification and isolation in flock specific
bacterial vaccine production. The possibility of performing
a representative sampling comes from an evaluation of the
alleged prevalence of the disease. Nonetheless, etiological
diagnosis of small ruminant mastitis is particularly difficult,
due to the absence of pathognomonic signs and to the large
number of bacterial species responsible of mammary infections
often simultaneously present in the flock. For this reason a
standardized method of milk sampling is required in order to
allow the production of effective flock specific bacterial vaccine
against small ruminant mastitis.
Introduzione
Le mastopatie infettive batteriche sono il principale problema
sanitario nell’allevamento degli ovini e dei caprini da latte.
Queste patologie si contrastano con terapie antibiotiche e con
profilassi vaccinali e sanitarie. Il recente indirizzo dato dalle
autorità sanitarie mondiali è quello di abbattere drasticamente
il ricorso all’utilizzo degli antibiotici e di incrementare l’uso dei
vaccini. I vaccini stabulogeni prodotti dall’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale della Sardegna assolvono pienamente a questo
compito. La profilassi vaccinale delle mastopatie degli ovini
e dei caprini viene garantita allestendo stabulogeni a partire
da diverse specie batteriche regolarmente isolate da latte e
correttamente inviate alle Produzioni dai laboratori di Diagnostica
dell’Istituto. Per garantire il successo della vaccinazione
con stabulogeno è fondamentale che a monte, cioè prima
dell’allestimento del vaccino, venga correttamente individuato
il principale agente patogeno responsabile di mastite. Questo
è un punto di criticità fondamentale. Esiste la possibilità che
un campionamento di latte poco rappresentativo possa portare
all’identificazione e alla scelta di un microrganismo sbagliato.
Le conseguenze di questi campionamenti possono inficiare
l’immunizzazione verso il patogeno più importante e contribuire
alla sua diffusione. Paradossalmente questi avvenimenti
contribuiscono ad amplificare anche le argomentazioni dei
detrattori all’uso dei vaccini stabulogeni, che trovano nella
presunta assenza di efficacia di alcune profilassi, giustificazione
alle loro tesi. Ricordiamo che gli IZS sono autorizzati in
esclusiva alla produzione dei vaccini stabulogeni con D.M. n.
287 del 17 marzo del 1994 e che questo prevede testualmente
“ … la richiesta di preparazione (del vaccino) deve essere
compilata dal veterinario d’intesa con il laboratorista dell’Istituto
Zooprofilattico Sperimentale che ha emesso la diagnosi
di laboratorio …”. In questa suddivisione dei compiti, è il
veterinario di campo che, dopo aver visitato i greggi, stabilisce
la prevalenza presunta della malattia e, verificata la numerosità
del campione, stabilisce il numero congruo e significativo di
prelievi da inviare al laboratorio di Diagnostica. La Diagnostica
processa i campioni e consegna il ceppo alla Produzione, ma
non può intervenire sul campionamento. Deve essere chiaro
che ogni campionamento deve tener conto della consistenza
del gregge o della numerosità degli animali con sintomatologia
clinica o comunque di un gruppo di animali con specifiche
caratteristiche. I capi prelevati infatti, devono essere sempre
proporzionali e significativi al campione da analizzare, in caso
contrario il rischio di formulare diagnosi discutibili è molto alto, a
maggior ragione quando si tratta di mastiti dei piccoli ruminanti,
patologie per le quali non esistono segni patognomonici e che
possono essere provocate da un numero elevato di specie
batteriche spesso contemporaneamente presenti nel gregge.
Nelle nostre ricerche abbiamo eseguito dei campionamenti
che prevedevano prelievi di latte di tutti i capi in produzione
presenti in greggi con ricorrenti problemi di mastite e i risultati
ai batteriologici hanno confermato quanta eterogeneità possa
esserci nella popolazione batterica isolata. All’interno di ogni
singolo gregge infatti, abbiamo isolato ed identificato germi
molto diversi sia come specie che potere patogeno. Inoltre,
anche all’interno di una stessa specie batterica abbiamo
verificato come spesso si registri una elevata eterogeneità
come: sierotipo, pulsotipo o risposta all’antibiogramma.
Conseguenza intuitiva è che un campionamento troppo limitato
ci avrebbe privato del quadro di insieme rendendoci difficile se
non impossibile l’individuazione del patogeno più importante
e l’allestimento di un vaccino efficace. Alla luce della nostra
esperienza (siamo l’IZS leader in Italia nella produzione degli
stabulogeni per la profilassi delle mastopatie batteriche degli
ovini e dei caprini) abbiamo verificato come i migliori risultati
vaccinali si ottengano solo quando si instaura una armonica
collaborazione fra tutte le componenti tecniche: veterinario
clinico e prelevatore, veterinario laboratorista responsabile di
Diagnostica e veterinario responsabile della Produzione; è per
questo motivo che sentiamo l’esigenza di promuovere metodi
univoci e condivisi di campionamento che possano consentire
l’allestimento di stabulogeni sempre più efficaci.
Materiali e Metodi
Prelievi di latte su tutto l’effettivo in lattazione dei greggi
problema ed esame clinico sistematico. Semina latte su terreni
colturali diversi, prima identificazione biochimica degli isolati
e conferma con apposite PCR-RFLP per gli Staphylococcus
e PCR per Streptococcus e Enterococcus. Antibiogrammi.
Analisi dei risultati, stima dell’eterogeneità delle specie e
dei ceppi isolati e confronto con le tabelle che consentono il
campionamento significativo del gregge.
Risultati
I risultati principali ottenuti negli allevamenti ovini e caprini
esaminati, nonché il dettaglio dei materiali e metodi su indicati
possono essere desunti dai due lavori pubblicati: Marogna G.,
Rolesu S., Lollai S., Tola S., Leori S.G. - Clinical findings in
sheep farms affected by recurrent bacterial mastitis. – Small
Ruminant Research – 88 (2010) 119-125. e Marogna G., Pilo
C., Vidili A., Tola S., Schianchi G., Leori S.G. - Comparison of
clinical findings, microbiological results, and farming parameters
355
in goat herds affected by recurrent infectious mastitis - Small
Ruminant Research - 102 (2012) 74-83.
Discussione
Il metodo corretto per eseguire il campionamento dal quale
individuare il batterio da utilizzare per l’allestimento di un
vaccino stabulogeno non può prescindere dalla stima della
frequenza della mastite in una popolazione, considerandone
l’incidenza e la prevalenza. E’ quindi fondamentale per una
corretta diagnosi il ruolo del veterinario di campo che questa
stima deve obbligatoriamente eseguire prima di effettuare il
campionamento. L’intervallo di confidenza fornisce informazioni
riguardo alla precisione dei valori ottenuti attraverso lo studio
del campione. Ad esempio, un intervallo di confidenza del
95% comprende un intervallo di valori che tiene conto della
variabilità del campione, in modo tale che si può confidare,
con un margine di certezza ragionevole (appunto il 95%) , che
quell’intervallo contenga il valore vero dell’intera popolazione
che non si ha modo di esaminare.
L’intervallo di confidenza rappresenta un parametro di
fondamentale importanza soprattutto negli studi epidemiologici
in cui la variabilità del campione (molto spesso dovuta al fatto che
il campione è piccolo) può rendere aleatoria l’interpretazione dei
risultati. Non possiamo prescindere da questo postulato quando
si vuole allestire un vaccino stabulogeno che possa avere la
giusta efficacia, questo molto prima di affrontare argomenti
riguardanti: immunologia, potere patogeno, adiuvanti, tecnica e
sito di inoculo, calendario delle vaccinazioni ecc.
Per questi motivi riteniamo auspicabile che nella pratica
di campo, prima di eseguire i prelievi di latte mastitico, ci si
avvalga di apposite tabelle di riferimento che consentono il
corretto campionamento.
Tabella 1. Numerosità del campione (Confidenza al 95% e 99%).
Numerosità
della
popolazione
30
60
100
300
500
1000
5000
10000
Prevalenza presunta della malattia
(Rapporto ammalati / totale della popolazione)
0.05
0.10
0.25
0.01
29
57
95
189
224
258
289
294
30
59
99
235
300
367
438
448
23
37
44
53
55
57
58
58
27
47
59
77
82
86
89
89
18
23
25
27
28
28
28
28
A sinistra numerosità del campione per ottenere confidenza del 95%
A destra numerosità del campione per ottenere confidenza del 99%
356
23
31
35
41
42
43
44
44
8
10
10
10
10
10
10
10
0.50
12
14
15
16
16
16
16
16
4
4
4
4
4
4
4
4
6
6
7
7
7
7
7
7
EDEMA MALIGNO IN BUFALE (BUBALUS BUBALIS) AL POST-PARTUM
Martucciello A.1, Marianelli C.2, Grassi C.3, Armas F.2, Alfano D.1, Guarino A.4, De Carlo E.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Sezione Diagnostica di Salerno-Centro di Referenza Nazionale sull’igiene
e le tecnologie dell’allevamento e delle produzioni bufaline, Salerno; 2Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Sanità
Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare, Roma; 3Veterinario Libero Professionista, 4Istituto Zooprofilattico Sperimentale del
Mezzogiorno, Direzione, Portici.
1
Key words: buffalo (Bubalus bubalis), Clostridium septicum, edema maligno
Abstract
In this report we describe four rare cases of postparturient
malignant edema with vulvovaginitis and myositis in water
buffaloes (Bubalus bubalis) by Clostridium septicum. Four
buffaloes showed swelling of perineal and perivulvar areas,
fever and agalactia after calving. Two of them dead within 24 h
from calving. Large Gram-positive rods, some with sub terminal
spores, were isolated from exudate samples taken from the
vulva. C. septicum was identificated as the etiological agent by
culture examination and nucleotide sequence analysis of the
16S-23S rDNA spacer region. All animals were primiparous.
We think that Clostridium infection might be related to trauma
during the birth process. It represents the first report in this
species.
Introduzione
Clostridi sono bacilli Gram-positivi, anaerobi, molto diffusi
che causano gravi patologie e morte in uomini ed animali. C.
septicum penetra attraverso lesioni di continuo della cute e
delle mucose e si sviluppa in ambiente anaerobio causando
mionecrosi (edema maligno, gangrena) e determinando
rapidamente la morte. Questo microrganismo è stato descritto
come causa di edema maligno in bovini (6,10), pecore e suini (4)
ed altre specie, e di “braxy”- una grave abomasite caratterizzata
da infiammazione suppurativa, edema ed enfisema - in vitelli
ed agnelli (1).
Nei ruminanti, la via d’ingresso del C. septicum è costituita
da ferite, determinate ad esempio in seguito ad incidenti,
perforazione della mucosa delle prime vie digerenti, lacerazioni
della mucosa che possono verificarsi durante il parto, ferite
per interventi chirurgici (asportazione delle corna, castrazione,
amputazione della coda, ecc), perforazioni dell’ago in occasione
della somministrazione parenterale di farmaci quando le
norme igieniche non vengono rispettate. La contaminazione
può avvenire direttamente dall’ambiente o attraverso le feci.
Quindi, la mucosa lesionata potrebbe consentire l’accesso del
C. septicum ai tessuti interni, mentre le emorragie dei tessuti
profondi creano le condizioni anaerobie utili alla proliferazione
dei microrganismi. C. septicum è un batterio mobile, ciò gli
consente di diffondere rapidamente lungo i piani fasciali dei
muscoli con progressivo danneggiamento dei tessuti muscolari
e connettivi circostanti e turbe del movimento con risentimento
generale. Quindi il decorso della malattia è acuto/peracuto, con
segni clinici evidenti entro le 24 h, ed esito letale in 1-5 giorni
dall’istaurarsi della lesione. C. septicum produce alfa tossina, la
più importante tossina di questo microrganismo, che ha azione
necrotizzante ed emolitica con conseguente aumento della
permeabilità capillare. L’alfa tossina causa rapida mionecrosi,
emorragia interstiziale, ed edema quando inoculato nel topo
(5) e collasso micro vascolare (3). C. septicum, inoltre, produce
una beta tossina (con attività citolitica), una gamma tossina
e una delta tossina (con attività ialuronidasica ed emolitica
rispettivamente), una neuraminidasi ed una emoagglutinina,
una chitinasi, una lipasi, ed una sialidasi (9); le quali, seppur
non letali, contribuiscono alla patogenensi del C. septicum
facilitando l’invasione tissutale e la mionecrosi, e riducendo il
flusso sanguigno microvascolare.
Questo studio descrive 4 casi di edema maligno postpartum
causati da C. septicum in bufali (Bubalus bubalis) e rappresenta
la prima segnalazione in questa specie.
Materiali e metodi
Nel mese di gennaio 2013 in un’ azienda bufalina di 1000
capi locata in provincia di Salerno, quattro bufale primipare
presentavano, all’esame clinico eseguito a 12 ore dal parto,
febbre ed agalassia. La vulva si mostrava massicciamente
gonfia, tesa, calda e dolente alla palpazione, indicando la
presenza di gas ed edema. Dopo 24 ore dal parto l’edema si
era esteso al sottocutaneo circostante e ai muscoli scheletrici
di una sola gamba con conseguente trascinamento dell’arto
interessato. Due soggetti sono morti dopo 24 ore dal parto. I
due soggetti sopravvissuti sono stati trattati a 24 h postpartum
con lavaggio e curettage con acqua ossigenata miscelata a
betadine della zona interessata, e con somministrazione IM di
ketoprofene al 10% (3mg/Kg) die per 3 giorni e sulfadiazinatrimethoprim (1 ml/10 Kg) die per 10 giorni. Successivamente al
trattamento gli animali presentavano buone condizioni generali,
necrosi dei tessuti superficiali nelle zone interessate all’edema,
con perdita abbondante di tessuto seguita da cicatrizzazione
per seconda intenzione. L’area interessata dalla necrosi aveva
raggiunto i 30 cm2 di diametro. Prima del trattamento i due
soggetti sono stati sottoposti a prelievo sterile di campioni
di essudato e di tessuto dall’area edematosa di vulva e
coscia. I campioni sono stati trasportati presso il laboratorio a
temperatura refrigerata nel più breve tempo possibile. Quindi,
sono stati sottoposti ad esame batteriologico e molecolare.
I campioni sono stati seminati su agar sangue al 5% e su
MacConkey agar ed incubati a 37°C for 48-72 h, sia in aerobiosi
che anaerobiosi. Le colonie sono state identificate con tecnica
biochimica (Vitek 2 Biomereux) e con indagine biomolecolare.
Si è proceduto all’estrazione del DNA con QIAamp DNA Mini
Kit (Qiagen) seguendo il protocollo allegato ed il DNA estratto
è stato sottoposto a saggio PCR. Una coppia di primer (Fw
5’-CGG CTG GAT CAC CTC CTT TC-3’ e Rev 5’-ATC ACG
TCC TTC ATC GGC TC-3’) è stata disegnata per amplificare
speficatamente la regione conservata del rDNA 16S-23S del
Clostridium di 460 bp. La sequenza del C. septicum disponibile
in banca data (accession n° AB040716, http://www.ncbi.
nlm.nih.gov) è stata utilizzata come sequenza di riferimento.
Il saggio di amplificazione è stato eseguito in un volume
totale di 25 microlitri utilizzando la GoTaq Green Master Mix
(Promega Corporation, Madison, WI) e seguendo le istruzioni
del produttore. Il profilo di amplificazione era il seguente: 2 min
a 94 ° C, seguita da 30 cicli di 30 secondi a 94 ° C, 30 sec a 58
357
° C e 30 secondi a 72 ° C. Dopo l’amplificazione, i prodotti della
reazione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di
agarosio 2%, colorati con gel rosso Nucleic Acid Stain (Biotium
Inc., Hayward, CA) e fotografati.
Le colonie cresciute in condizioni di anaerobiosi si presentavano
emolitiche. Bacilli Gram-positivi tipici del genere Clostridium (7)
sono stati visualizzati al microscopio (7). La presenza di colonie
di C. septicum è stata confermata dall’analisi biochimica e
molecolare (Figura 1). Nessun altro clostridio era stato isolato,
né altri germi con valenza patogena.
Figura 1. Sequenza nucleotidica della regione spaziatrice
del rDNA 16S-23S dell’isolato
E’ stato dimostrato che la sequenza della regione spaziatrice
del rDNA 16S-23S può essere usata per identificare e
differenziare i clostridi patogeni (C. chauvoei, C. septicum, C.
novyi e C. sordellii) (8). Tale regione infatti varia nelle diverse
specie soprattutto per la sua lunghezza, dovuta alla presenza
di sequenze di inserzione, rappresentate principalmente dai
geni tRNA. Nel C. septicum essa si differenzia soprattutto per
la presenza di una inserzione di 71 bp. L’analisi della sequenza
nucleotidica della regione spaziatrice del nostro isolato ha
evidenziato la presenza della sequenza di inserzione di 71 bp,
come sopra in Figura. L’interrogazione della banca dati per la
ricerca di somiglianze mediante l’algoritmo Blast (http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) ha confermato l’isolato come C.
septicum con una identità del 100%.
Il ceppo di C. septicum è stato successivamente sottoposto ad
antibiogramma al fine di verificare la sensibilità agli antibiotici
in uso secondo la tecnica di diffusione di Kirby-Bauer in agar
Muller Hinton (7).
L’isolato presentava sensibilità ad ampicillina, penicillina,
cefalessina,
eritromicina,
flumequina,
lincomicina
in
associazione con spectinomicina, marbofloxacina, rifampicina,
ed sensibilità intermedia ad amoxicillina, acido nalidixico,
apramicina, kanamicina, lincomicina, norfloxacina, spiramicina.
In contrasto, dimostrava resistenza a cefalochina, colistina,
gentamicina, neomicina, ossitetraciclina, tetraciclina, tilosina,
sulfametossazolo in associazione con trimetoprim. I risultati
erano simili a quelli presenti in letteratura (2). Anche questi dati
confermano l’eccellente attività in vitro della penicillina, che
risulta essere l’antibiotico di prima scelta, mentre cefalessina e
rifampicina possono essere usati come seconda scelta.
Una rapida diagnosi ed una terapia aggressiva con alte dosi
dell’ appropriato antibiotico sono fondamentali nella gestione
di un infezione da C. septicum e possono determinare la
guarigione e sopravvivenza dei soggetti malati.
Pertanto, nella prevenzione dell’edema maligno è molto
importante evitare l’introduzione dei germi attraverso ferite,
quindi è bene porre molta cura nei casi in cui si creano soluzioni
di continuo di cute e mucose. Buona pratica potrebbe essere
quella di utilizzare lettiera di buona qualità evitandola comunque
nella zona post-partum ed in infermeria, sostituendola con altri
tipi di lettiera ad esempio con materassini, da gestire secondo
severe norme igieniche. Bisogna tener presente, inoltre, che
i Clostridi sono maggiormente presenti in terreni alluvionali,
scarsamente drenati e paludosi (4) e quindi l’incidenza della
malattia è maggiore nei periodi di piogge intense.
In conclusione, questo studio riporta quattro casi di edema
maligno post-parto. Il quadro clinico, così come i risultati
microbiologici e molecolari, confermano la diagnosi di infezione
da C. septicum. La terapia con antibiotici, praticata ai due
soggetti sopravvissuti, ha evitato complicanze batteriche
secondarie, mentre risolutiva è stata la resezione chirurgica
del tessuto necrotico che ha creato un ambiente aerobio
sfavorevole allo sviluppo dei batteri anaerobi.
Bibliografia
1.Eustis S.L., Bergeland M.E., 1981. Suppurative abomasitis
associated with Clostridium septicum infection. Journal of the
American veterinary medical Association 178 (7), 732-734.
2.Gabay E.L., Rolfe R.D., Finegold S.M., 1981. Susceptibility
of Clostridium septicum to 23 antimicrobial agents.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 20 (6), 852-853.
3.Hickey M.H., Kwan R.Y.Q., Awad M.M., Kennedy C.L.,
Young L.F., Hall P., Cordner L.M., Lyras D., Emmins J.J.,
Rood J.I., 2008. Molecular and cellular basis of microvascular
perfusion deficits induced by Clostridium perfrigens and
Clostridium septicum. PLoS Pathogens 4, e1000045.
4.Hungerford, T.G. (Ed.), 1990. Disease of Livestock.
McGraw-Hill Book Company, Australia, pp. 35-710.
5.Kennedy C.L., Krejany E.O:, Young L.F., O’Connor J.R.,
Awad M.M., Boyd R.L., Emmins J.J., Lyras D., Rood J.I.,
2005 The α-toxin of Clostridium septicum is essential for
virulence. Molecular Microbiology 57 (5), 1357-1366.
6.Odani J.S., Blanchard P.C., Adaska J.M., Moeller R.B.,
Uzal F.A., 2009. Malignant edema in postpartum dairy cattle.
Journal Veterinary Diagnostic Investigation 21, 920-924.
7.Quinn P.J., Carter M.E., Markey B., Carter G.R., 1994.
Clinical Veterinary Microbiology. Ed. Mosby-Year Book
Europe Limited, London, pp. 95-208.
8. Sasaki Y., Yamamoto K., Kojima A., Norimatsu M., Tamura
Y., 2000. Rapid identification and differentiation of pathogenic
clostridia in gas gangrene by polymerase chain reaction
based on the 16S-23S rDNA spacer region. Research in
Veterinary Science 69 (3), 289-294.
9.Tweten R.K., 2001. Clostridium perfrigens beta toxin and
Clostridium septicum alpha toxin: their mechanism and
possible role in pathogenesis. Veterinary Micorbiology 82,
1-9.
10.Wayt L.K., 1951. Parturient malignant edema in a cow.
Journal of the American veterinary medical Association 119,
353-354.
358
INTERVENTO MIRATO DI EDUCAZIONE SANITARIA IN UN’AREA A RISCHIO
PER RECRUDESCENZA DELLA TUBERCOLOSI BOVINA
Masala S.1, Ponti N.1, Marongiu E.1, Pintore A.1, Canu M.1, Lucariello S.1, Rolesu S.12, Coccollone A.12
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, via Duca degli Abruzzi 8, 07100 Sassari
2
Centro di Sorveglianza Epidemiologica, via XX Settembre 9, 09125 Cagliari
Key words: health education, Mycobacterium bovis,
SUMMARY
The work explains the methods and tools notes prepared by
researchers at the Institute Zooprofilattico of Sardinia in a health
education intervention implemented in a risk area for the presence of Mycobacterium bovis.
The analysis of the questionnaires - compiled by the target population - has provided the necessary information for the definition of educational messages inserted in the brochures, directed
to children, adults and hunters.
INTRODUZIONE
Il primo passo per la messa in atto di un progetto educativo è
quello di individuare i bisogni della popolazione a cui il progetto
è rivolto. L’individuazione dei bisogni può avvenire attraverso
diversi percorsi e nel nostro lavoro sono stati individuati
attraverso interviste ai ragazzi in età scolare e alle loro famiglie.
Nel 2011 l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna
ha effettuato un’indagine che ha preso in considerazione,
fra gli altri aspetti, la percezione da parte della popolazione
dei rischi legati all’alimentazione. Il campione proveniva da
una sub-regione della Sardegna settentrionale, il Goceano,
in cui negli anni 2007-2008 si è manifestata un’importante
epidemia di Tubercolosi bovina. Attraverso l’indagine si è potuto
valutare se il risalto che questa patologia ha avuto sui mezzi di
comunicazione di massa avesse in qualche modo modificato
la percezione del rischio della popolazione di quest’area,
rendendola consapevole dell’esistenza del pericolo legato alla
presenza del Mycobacterium bovis. Il campione intervistato
ha invece dimostrato di ignorare le problematiche connesse
a importanti patologie certamente poco frequenti ma presenti
nel territorio quali la tubercolosi, appunto, la trichinellosi e
l’echinococcosi. (1).
MATERIALI E METODI
I risultati dell’indagine sulla percezione del rischio hanno portato
il gruppo di lavoro a mettere in atto un programma di educazione sanitaria mirato alla diffusione dei risultati dell’indagine stessa e a colmare alcune lacune relative non solo alla gestione ma
all’esistenza stessa del pericolo.
Per questo motivo si è deciso di elaborare tre diversi opuscoli informativi rivolti, rispettivamente, ai bambini, agli adulti e ai
cacciatori.
Nel primo opuscolo sono stati trattati temi generali di igiene; visto che il contagio della tubercolosi dai bovini all’uomo avviene
o per contatto diretto con animali infetti o col consumo di latte
crudo da essi derivato, non ci è sembrato utile fornire ai bambini
indicazioni più precise relativamente a questa patologia.
Per lo stesso motivo, anche nell’opuscolo rivolto alla popolazione adulta, non si è parlato solo o in maniera particolarmente
approfondita di tubercolosi. Relativamente a quest’ultima si è
spiegato in modo semplice e sintetico di cosa si tratta, qual è
l’agente causale, quali gli ospiti e le principali vie di infezione.
Sono stati poi illustrati gli aspetti salienti dell’indagine. Nello
specifico si è deciso di focalizzare l’attenzione sulla scarsa co-
noscenza dei processi produttivi di quegli alimenti che gli intervistati hanno dichiarato di consumare abitualmente, quali l’utilizzo
di latte crudo piuttosto che pastorizzato per la produzione dei
formaggi tipici. Sono state inserite poi delle considerazione in
cui si mette in evidenza che esistono dei pericoli, quali l’echinococcosi e la trichinelllosi, che gli intervistati hanno dimostrato di
ignorare completamente.
Il Mycobacterium bovis è stato isolato anche nei linfonodi di
alcuni cinghiali abbattuti nel territorio già infetto per i bovini. Si è
dunque ritenuto necessario dare ai cacciatori delle informazioni
più precise rispetto a quelle fornite al resto della popolazione.
È stato, anzitutto, spiegato qual è il possibile ruolo del cinghiale nella trasmissione della patologia. Sono state, poi, illustrate,
anche attraverso delle immagini, la localizzazione, la forma, e le
dimensioni tipiche delle lesioni tubercolari. Qualora tali lesioni
siano evidenziate, è stato ribadito che dovrà essere cura del
cacciatore contattare il veterinario ufficiale. Infine sono state
riportate le principali pratiche igieniche da seguire, sempre, durante l’eviscerazione dei cinghiali. Nello specifico è stato raccomandato di: usare guanti protettivi; eseguire un’accurata pulizia
e disinfezione dei coltelli e di tutti gli altri utensili utilizzati; fare
attenzione alla presenza di eventuali tagli o ferite che potrebbero essere esposte al contatto diretto con la carcassa; lavare
accuratamente mani e braccia dopo la manipolazione delle carcasse; non fumare durante le operazioni di eviscerazione; usare
sempre idonei contenitori per la raccolta di sangue e visceri.
L’obiettivo di una politica di sanità pubblica dovrebbe essere
quello di promuovere il benessere sanitario individuale e collettivo garantendo a tutta la popolazione un accesso equo alle
prestazioni, ai servizi e alle informazioni (2). Ma quali sono le
informazioni di cui la popolazione ha bisogno? Spesso la scelta
degli argomenti da trattare nelle campagne di formazione/informazione è legata all’incidenza, o al rischio di incidenza, di una
patologia sulla popolazione o su una classe di cittadini verso
i quali la campagna stessa sarà diretta. Il nostro lavoro si è
basato prima su un’indagine sulla percezione del rischio e poi
su una campagna di informazione nei confronti di un pericolo
presente nel territorio ma non percepito come tale dalla popolazione locale.
BIBLIOGRAFIA
1. Coccollone A., Marongiu A., Masala S., Fiori E., Canu
M., Ponti N., Rolesu S. (2011) Indagine conoscitiva su
abitudini alimentari e percezione del rischio nella popolazione del Goceano (sub-regione della Sardegna).
Risultati preliminari. VI Workshop Nazionale di Epidemiologia Veterinaria, L’epidemiologia veterinaria nel
contesto di “one world, one Health”, pag. 73 – 74
2. Domenighetti G. (2000) Per una politica di sanità
pubblica centrata sui bisogni della popolazione e non
su quelli dei servizi. Punto Omega n.2/3, Provincia
autonoma di Trento
359
IDENTIFICAZIONE MEDIANTE TECNICHE DI PROTEOMICA DI UNA PROTEINA
PLASMATICA QUALE POSSIBILE MARKER DI TRATTAMENTO ILLECITO
NEI VITELLI DA CARNE
Mazza M., Guglielmetti C., Pagano M., Nodari S., Carrella S., Sciuto S., Pezzolato M., Richelmi G.B., Baioni E.,
Acutis P.L., Bozzetta E.
Keywords: dexamethasone, anabolic treatments, paraoxonase.
ABSTRACT: Corticosteroids are illegally used in several
countries as growth promoters in veal calves and beef
cattle. Testing for abuse is based on direct detection of
illicit compounds or metabolites, or indirect detection
that identifies changes in biological pathways. This study
describes a comparative proteomic approach, through twodimensional electrophoresis (2DE), to identify plasma protein
markers indicative of dexamethasone administrations to
veal calves. Twenty male Friesian veal calves were treated
experimentally with dexamethasone both for anabolic and
therapeutic purpose. Plasma samples were collected from
each animal before and after treatment and then analyzed
by 2DE. The comparison of the maps obtained from animals
showed the disappearance of two spots identified as serum
paraoxonase/arylesterase 1 precursor (PON1). Statistical
analysis confirmed the specificity of this marker in detecting
possible illegal treatment with corticosteroids.
INTRODUZIONE: La Legislazione Comunitaria vieta
i trattamenti delle specie di interesse zootecnico con
sostanze ad effetto anabolizzante, pertanto in ognuno dei
Paesi facenti parte dell’UE viene programmato annualmente
un Piano Nazionale Residui. I controlli da parte delle
Autorità Sanitarie sono effettuati sia a livello di stalla e sia
al macello, ma in entrambi i casi i riscontri di positività sono
improbabili dal momento che coloro che usano abitualmente
farmaci vietati hanno acquisito negli anni capacità sempre
maggiori nell’effettuare cocktail di principi attivi ad effetto
anabolizzante a bassi dosaggi e di difficile riscontro alle
analisi ufficiali. Dagli studi effettuati si sono riscontrati
effetti genotossici e carcinogenici, pubertà anticipata,
danni al sistema immunitario, alterazioni dell’embriogenesi.
Considerati i rischi elevati per la salute pubblica, l’attenzione
è stata focalizzata sulla necessità di ricercare metodi in
grado di rilevare i trattamenti con sostanze anabolizzanti
in maniera sensibile. Nonostante i progressi della chimica
analitica, la sensibilità degli strumenti dedicati al ritrovamento
di tali molecole non è riuscita a stare al passo con cocktail
sempre più sofisticati. Per tale motivo si stanno studiando
nuove tecniche che possano sopperire ai limiti delle
metodiche di indagine applicate in routine. In questo ambito
le tecniche basate sul rilievo di marker biologici di queste
sostanze, come la proteomica e la metabolomica, offrono
delle promettenti prospettive. In questo lavoro sono riportati
i risultati di uno studio di proteomica al fine di ricercare nel
plasma di vitelli trattati sperimentalmente con corticosteroidi
marker proteici indicativi di trattamento illecito.
MATERIALI E METODI: Lo studio è stato condotto su 20
vitelli di razza Frisona stabulati all’età di 15-35 giorni. Al
sesto mese di età gli animali sono stati divisi casualmente in
due gruppi e trattati sperimentalmente con desametasone:
10 animali per venti giorni consecutivi (0,4 mg/giorno per os)
a scopo anabolizzante (gruppo 1); 10 animali per tre giorni
consecutivi (2-4 mg/Kg per i.m.) cercando di simulare un
trattamento terapeutico (gruppo 2). Campioni di plasma sono
stati poi ottenuti da ciascun animale a tempi diversi (T1-T6,
animali gruppo 1; T1-T4, animali gruppo 2) e conservati a 80 °C fino al momento delle analisi. I campioni ai tempi T1
e T4-T6 corrispondono ai prelievi eseguiti rispettivamente
prima e dopo i trattamenti).
Preparazione del campione: Prima della fase di
preparazione, il contenuto proteico dei singoli campioni
di plasma è stato determinatoquantificazione mediante
“metodo Bradford” (Quick Start™ Bradford 1x Dye Reagent;
Bio-Rad Laboratories). Un contenuto di , e sono stati
utilizzat 360 µg/ml di proteine totali per campione è stato
utilizzatodper l’e analisi bidimensionale. I campioni sono
stati poi incubati a temperatura ambiente, per tutta la notte,
in una soluzione tampone contenente: urea 7M, tiourea 2M,
CHAPS 4%, DTT 50mM, EDTA 250mM e 0,1% di blu di
bromofenolo. Prima di procedere al caricamento sulla strip
per l’isoelettrofocalizzazione (IEF), i campioni sono stati
centrifugati a 12 000 rpm per 5 minute, al fine di allontanare
eventuali sostanze interferenti. Tutti i campioni selezionati
sono stati analizzati in triplicato.
Separazione delle proteine in prima dimensione mediante
IEF: Prima di sottoporre il campione all’IEF, le IPG strip sono
state reidratate per tutta la notte in un tampone contenente:
urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2% DTT 10mM, 0,3% di
anfoline a pH3-10, 0,3% di anfoline a pH 5-8, 0,3% di anfoline
a pH 4-6 e 0,1% di una soluzione di blu di bromofenolo. Per
queste analisi sono state utilizzate delle IPG di lunghezza
pari a 18 cm e con un intervallo di pH non lineare compreso
tra 3 e 10 (pH3-10NL). 150 µl di campione sono stati caricati
sulla IPG strip mediante il sistema di caricamento con “cup
loading”.
Separazione delle proteine in seconda dimensione mediante
SDS-PAGE: Dopo l’IEF, le IPG strip sono state poste sulla
sommità dei gel di acrilammide con una concentrazione a
gradiente compresa tra l’8% ed il 16%. I gel assemblati con
le IPG strip sono stati inseriti nella camera per elettroforesi
termostatata e la separazione è stata condotta applicando
un valore di voltaggio proporzionale alle dimensioni e al
numero dei gel.
Fissaggio e colorazione dei gel: Terminata la corsa
elettroforetica i gel sono stati fissati peo un’ora in una
soluzione contenente 40% di metanolo e 10% di acido
acetico. A questa fase è seguita la colorazione dei gel con
colorazione con Blue Silver (1).
Acquisizione delle immagini: Dopo una fase di decolorazione,
le immagini dei gel sono stati acquisite mediante l’utilizzo di
360
un analizzatore e successivamente analizzate con il software
“BioNumerics® 2D Gel Types” (Applied Maths). Attraverso
questo tipo di analisi è stato condotto un confronto delle
mappe proteiche ottenute dai campioni di plasma degli
animali prima e dopo i trattamenti con desametasone per
evidenziarne eventuali differenze in termini qualitativi e
quantitativi.
Analisi di spettrometria di massa: Gli spot di interesse sono
stati prelevati direttamente dal gel dopo colorazione con Blue
Silver. Dopo una fase di decolorazione, sono stati digeriti con
tripsina ed i peptidi ottenuti sono stati analizzati mediante
LC-MS/MS e identificati successivamente mediante software
MASCOT® (Matrix Science UK).
Western Blotting: Per confermare il risultato dell’identificazione
effettuata mediante LC-MS/MS, è stato selezionato
un campione di plasma al T1 ed al T6 prelevato da un
animalo del gruppo 1. Dopo l’elettroforesi bidimensionalE,
le proteine sono state trasferite su membrana di PVDF.
L’immunorivelazione è stata condotta utilizzando un anticorpo
policlonale anti-PON1 e successivamente un secondario
anti-rabbit coniugato con fosfatasi alcalina. L’immagine è
stata acquisita successivamente su lastra fotografica.
Analisi statistica: Al fine di valutare la probabilità di associare
la variazione di espressione dell’enzima
paraoxonaei
(PON1) agli animali del gruppo 1, è stato utilizzato il test
esatto di Fisher, con un valore significativo di P<0-0,5.
Figura 2: Analisi 2DE rappresentativa dei campioni di plasma
ottenuti dagli animali del gruppo 2, prima (T1) e dopo (T4) il
trattamento con desametasone.
Figura 3. Analisi 2DE seguita da western blot di un campione
di plasma ottenuto da un animale del gruppo 1 prima (T1) e
dopo (T6) il trattamento con desametasone.
RISULTATI E CONCLUSIONI: Il confronto delle mappe
ottenute dai campioni di plasma ha evidenziato nell’ultimo
prelievo (T6) dei campioni trattati con desametasone a
scopo anabolizzante (gruppo 1), la scomparsa di una coppia
di spot proteici caratterizzati da un peso molecolare di circa
43 kDa ed un punto isoelettrico (p.I.) di 4.8, (figura 1)
Figura 1: Analisi 2DE rappresentativa dei campioni di
plasma ottenuti dagli animali del gruppo1, prima (T1) e dopo
(T6) il trattamento con desametasone.
Dall’analisi dei campioni prelevati dagli animali trattati a solo
scopo terapico (gruppo 2), tala coppia di spot è risultata
presente, seppur con un leggero indebolimento dell’isoforma
caratterizzata da un p.I. più acido (figura 2, spot indicato
dalla freccia). Le analisi di spettrometria di massa condotte
sulla coppia di spot proteici hanno permesso di identificarli
in due isoforme dell’enzima paraoxonasi/arilesterasi sierica
(PON1). Le analisi di immunoblotting, condotte su un
campione di plasma bovino prelevato al T1 ed al T6 (gruppo
1) utilizzando l’anticorpo policlonale anti-paraoxonasi1,
hanno confermato l’identificazione ottenuta mediante LCMS/MS, mostrando reattività anticorpale al T1 e assenza di
reattività al T6 (figura 3)
Dal test esatto di Fisher è emersa inoltre una differenza
statisticamente significativa nell’espressione dell’enzima
PON1 tra i due gruppi di animali (N=20; p< 0.001).
PON1, enzima sintetizzato dal fegato e rilasciato nel
sangue, riveste un ruolo importante nel metabolismo
dei lipidi (2). Studi in vitro hanno inoltre rivelato una forte
inibizione della sua attività da parte del desametasone
(3). Sebbene saranno necessari ulteriori studi per validare
questo risultatoL l’assenza di variazione di questa proteina,
nel gruppo degli animali trattati con desametasone a solo
scopo terapeutico, suggerisce una buona specificità di tale
marker nell’identificare un possibile trattamento illegale con
corticosteroidi nei vitelli già a livello di stalla.
BIBLIOGRAFIA
1.Candiano G., Bruschi M., Musante L., Santucci L.,
Ghiggeri G.M., Carnemolla B., Orecchia P., Zardi L., Righetti
P.G. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250
staining for proteome analysis. Electrophoresis, 2004, 25 (9)
:1327-33
2.Aviram M., Rosenblat M., Bisgaier C. Paraoxonase inhibits
high density lipoprotein oxidation and preserves its functions.
A possible peroxidative role for paraoxonase. J. Clin. Invest.,
1998, 101:1581-90
3.Arslan M., Gencer N., Arslan O., Ozensoy Guler O. In vitro
efficacy of some cattle drugs on bovine serum paraoxonase
1 (PON1) activity. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 2012, 27:72
361
DINAMICA DI COMPORTAMENTO DI SALMONELLA SPP. NELLA SALSICCIA SUINA
SARDA STAGIONATA MEDIANTE MICROBIAL CHALLENGE TEST DI PROCESSO :
Nota 1 - Studio preliminare di definizione standard di prodotto e di processo
FIG 2 Andamento dei valori di aw rilevati nel corso della
stagionatura sulla salsiccia Controllo IZS, Salsiccia Controllo
Azienda, Salsiccia Indagine Preliminare
Mele P.1, Marongiu E.1, Piras G.1, Delogu A.1, Noli A.C.1, Coppa G.2 , Virgilio S.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna , Dipartimento igiene degli Alimenti - Sassari
2
Veterinario aziendale libero professionista
1
Key words: , Salsiccia, Standard di prodotto e di processo, Microbial Challenge Test
SUMMARY
In order to evaluate the growth and survival of Salmonella
spp. strains in experimentally inoculated traditional sardinian
pork fermented sausages, a Microbial Challenge Test for
Salmonella spp. For this purpose a preliminary study was
carried out to define standards of Sardinian ripened pork
sausage and his manufacturing process.
INTRODUZIONE
Il Microbial Challenge Test (MCT) consente di stabilire
se un prodotto alimentare è intrinsecamente resistente
allo sviluppo di microrganismi potenzialmente patogeni e
come, all’ottenimento di questo risultato concorrano, se
correttamente attuate, le diverse fasi del processo produttivo.
Fondamentale, in via preliminare, risulta inoltre la conoscenza
di standard di prodotto e di processo acquisibili attraverso
lo studio di differenti produzioni del prodotto in esame. La
presente nota costituisce il parziale resoconto dell’indagine,
ancora in corso di completamento, relativa alla definizione
di tali standard sulla Salsiccia suina sarda stagionata e
preliminare alla attuazione di MCT di processo con ceppi di
Salmonella spp.
MATERIALI E METODI
Nell’ambito degli insaccati prodotti in Sardegna, la Salsiccia
suina sarda stagionata (prodotto agroalimentare tradizionale,
D.M. del 18/07/2000) è sicuramente quello più diffuso.
Per la descrizione dettagliata del prodotto e del processo
produttivo, attualmente in corso di pubblicazione, si rimanda
alla consultazione di www.arsalimentaria.it.(1).
Attraverso sopralluoghi in aziende ubicate nelle aree
a maggiore vocazione produttiva, è stato effettuato il
rilevamento di dati concernenti le caratteristiche del prodotto
e dei relativi processi produttivi. A tale scopo sono state
inizialmente individuate quattro aziende produttrici, per
ciascuna delle quali sono stati analizzati tre lotti produttivi,
mentre per il successivo allestimento del MCT, ci si è avvalsi
della collaborazione e consulenza di una di esse. Sono state
preparate contestualmente tre tipologie di salsicce:
Controllo azienda (non contaminato)
-
-
Controllo IZS (non contaminato)
-
Controllo SS (contaminato con una miscela di ceppi
di Salmonella spp.)
Su ogni lotto sono state monitorate la dinamica della
componente microbica e le caratteristiche chimico-fisiche a
partire dalla fase di preparazione dell’impasto fino al termine
della fase di stagionatura.
Il piano di campionamento ha previsto per ciascuna fase
del processo produttivo l’esecuzione in triplo dei prelievi
dell’impasto al tempo zero e alle 24 ore, della salsiccia al 5°
giorno (pH minimo) e al 7° giorno della fase di asciugatura,
e a 14, 21, 29, 35 giorni di stagionatura. Sono stati effettuati i
seguenti accertamenti di laboratorio:
– Carica microbica aerobia (Plate Count Agar 30°C/72
h); Salmonella in 25 g (ISO 6579:2002); Salmonella ufc/g
(XLD Agar 37°C/24ore); Batteri lattici (ISO 15214:2008);
Enterobacteriaceae
(ISO
21528-2:2004);
Stafilocchi/
Micrococchi (Mannitol Salt Agar, 30°C/72 ore); Enterococchi
(Slanetz Bartley agar 42°C/48 ore)
Stafilococchi coagulasi positivi (ISO 6888-2:2004)
Analisi chimico-fisiche
- aW è stata misurata a temperatura ambiente mediante
l’utilizzo dell’apparecchio Hygrolab 2 (Rotonic ag) e del
Software “Igro Software Quick”
-pH è
stato misurato per infissione (pHmetro Eutech
Instruments PH700 e Elettrodo Double pore F Hamilton).
Su ogni salsiccia sono state, inoltre, eseguite le seguenti
determinazioni:
- % Calo peso
- % di sale e % di umidità relativa (determinati tramite
Spettroscopia NIT (FoodScan™ Lab. FOSS Electric A/S
Denmark)
FIG 3 Andamento dei valori di % Umidità relativa rilevati nel
corso della stagionatura sulla salsiccia Controllo IZS, Salsiccia
Controllo Azienda, Salsiccia Indagine Preliminare
FIG. 6 Andamento dello sviluppo della flora lattica e della
Salmonella spp. nella Salsiccia Indagine Preliminare
FIG 4 Andamento dei valori di % Sale rilevati nel corso della
stagionatura sulla salsiccia Controllo IZS, Salsiccia Controllo
L’indagine ha consentito di individuare tre varianti della
Salsiccia suina sarda stagionata: classica, affumicata e con
aceto o vino. È stata focalizzata l’attenzione sulla Salsiccia
suina classica, di maggiore consumo e diffusione, rimandando
la possibilità di estendere l’indagine sulle altre varianti ad un
successivo studio.
Le Figure 1, 2, 3, 4 e 5 riportano le rappresentazioni
grafiche relative rispettivamente all’andamento del pH, aw, %
Umidità Relativa, % Sale, % Calo peso ed evidenziano una
chiara sovrapponibilità dell’andamento di questi parametri,
determinati sui prodotti sperimentali, con quello derivante
dall’indagine preliminare.
FIG 1 Andamento dei valori di pH rilevati nel corso della
stagionatura sulla Salsiccia Controllo IZS, Salsiccia Controllo
362
Considerazioni analoghe possono essere desunte da quanto
rappresentato nelle figure 6, 7 e 8 i cui grafici riportano
l’andamento, nel corso della maturazione del prodotto, della
componente microbica della salsiccia suina sarda stagionata
eseguita sui prodotti delle quattro aziende produttrici (Indagine
preliminare), della salsiccia “controllo Azienda” e della salsiccia
“controllo IZS”.
Prodotti carnei fermentati analoghi descritti da altri autori
riportano andamenti microbici simili (2, 3).
Le differenze di andamento microbico, dovute all’eterogeneità
delle specie coinvolte, rientrano nella variabilità attribuibile a
ciascun processo di maturazione, particolarmente quando,
come in questo caso, non vengono impiegate colture starter e
l’eventuale presenza di ceppi autoctoni rende ancora più forte
la relazione tra prodotto e area di produzione.
La presente sperimentazione costituisce un primo passo nella
definizione delle caratteristiche di qualità e sicurezza della
Salsiccia suina sarda stagionata e di validazione del processo
produttivo.
FIG. 7 Andamento dello sviluppo della flora lattica e della
Salmonella spp. nella Salsiccia Controllo Azienda
FIG 5 Andamento dei valori di % Calo Peso rilevati nel corso
della stagionatura sulla salsiccia Controllo IZS, Salsiccia
Controllo Azienda, Salsiccia Indagine Preliminare
FIG. 8 - Andamento dello sviluppo della flora lattica e della
Salmonella spp. nella Salsiccia Controllo IZS
363
Resta da approfondire il ruolo e la temporalità delle azioni
sinergiche della sua complessa componente microbica in
relazione a fenomeni di biocompetizione e in termini di produzione
di sostanze ad azione antibatterica mirata verso i patogeni. Il
lavoro di individuazione, selezione e caratterizzazione di questa
flora microbica ad azione protettiva potrà essere di supporto
per una corretta gestione delle produzioni, in quanto avrebbe
una rilevante valenza nel limitare la possibilità di sviluppo di
flora patogena indesiderata nel prodotto in particolare in quei
casi, non rari, in cui per rispondere a esigenze produttive e
commerciali, si assiste a un’immissione anticipata del prodotto
nei circuiti commerciali, rispetto al tempo minimo di 21 giorni di
maturazione previsto dal processo produttivo.
Sarebbe infatti auspicabile poter disporre di starter microbici
costituiti da flora lattica autoctona ad azione protettiva e nel
contempo capace di preservare le caratteristiche organolettiche
tipiche che fanno della Salsiccia suina sarda stagionata
l’insaccato “principe” dei prodotti della salumeria sarda.
DINAMICA DI COMPORTAMENTO DI SALMONELLA SPP. NELLA SALSICCIA SUINA
SARDA STAGIONATA MEDIANTE MICROBIAL CHALLENGE TEST DI PROCESSO
Nota 2 – Fase sperimentale
BIBLIOGRAFIA
1. www.arsalimentaria.it
2. Daga E., Mannu L., Porcu S., Comunian R., Paba A. and
Scintu M.F. (2007) Ital. J. Food Sci. 3: 297.
3. Talon R., Leroy S., Lebert I., Meat Science (2007), 77, 55
Mele P.1, Marongiu E.1, Piras G.1, Porqueddu G. 1, Terrosu G.1, Coppa G.2, Virgilio S.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna , Dipartimento igiene degli Alimenti - Sassari
2
Veterinario aziendale libero professionista
Key words: Salmonella spp, Microbial Challenge Test, Salsiccia
Indagine realizzata nell’ambito del programma scientifico di
CIRAL (Consorzio per la ricerca sulla sicurezza e qualità
alimentare) al quale l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della
Sardegna aderisce.
SUMMARY
In order to evaluate the growth and survival of Salmonella spp.
strains in experimentally inoculated traditional sardinian pork
fermented sausages, a Microbial Challenge Test for Salmonella
spp. were performed. The study show that the productive process
and the intrinsic characteristics of the product contribute to
decrease of Salmonella spp. from 1,6 Log cfu/g to 2,6 Log cfu/g.
INTRODUZIONE
I prodotti carnei fermentati sono considerati generalmente
alimenti a basso rischio microbiologico. Di recente si sono tuttavia
verificati alcuni casi di tossinfezione da Salmonella spp. a seguito
del consumo di salami stagionati. (1, 2) L’obiettivo di questo
lavoro è stato quello di ottenere dati relativi alla dinamica del
comportamento di Salmonella spp. durante il processo produttivo
della Salsiccia suina sarda stagionata fino al termine della fase
di stagionatura. E’ stato, a tale scopo, allestito un Microbial
Challenge Test di processo utilizzando miscele di differenti ceppi
di Salmonella spp., per verificare, nel corso della stagionatura,
l’entità dell’abbattimento della concentrazione del microrganismo
in relazione anche al ruolo svolto dalla componente microbica
propria della matrice e alle caratteristiche chimico-fisiche.
MATERIALI E METODI
Per la realizzazione del Microbial Challenge Test di processo è
stata selezionata una azienda produttrice che, per caratteristiche
di conduzione e per motivi logistici, risultava essere la più
idonea all’attuazione della fase sperimentale e le cui produzioni
di salsicce, preliminarmente monitorate, hanno confermato
la corrispondenza con standard di prodotto e processo
precedentemente stabiliti (6).
La preparazione e standardizzazione della sospensione
batterica da utilizzare come inoculo nella sperimentazione è
stata effettuata seguendo le indicazioni dei principali protocolli a
valenza comunitaria e internazionale (1,5). Sulla base di queste
linee guida sono stati utilizzati un ceppo di riferimento e due ceppi
di campo. Più precisamente, sono stati rispettivamente impiegati
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 e Salmonella Manhattan
IZSLER 180073/09 e Salmonella Enterica IZSLER 49769/10
isolati nel corso di episodi tossinfettivi dovuti a ingestione di
alimenti carnei fermentati naturalmente contaminati (2). Il
disegno sperimentale ha previsto la divisione dell’impasto, già
addizionato di tutti gli ingredienti, in tre aliquote: l’aliquota 1, che
è stata insaccata tal quale presso l’azienda produttrice (Controllo
Azienda); l’aliquota 2, inviata presso i nostri laboratori, è stata
insaccata tal quale (Controllo IZS); l’aliquota 3, sempre presso
le nostre strutture in condizioni di sicurezza, è stata inoculata
con la sospensione di salmonelle ed insaccata (Controllo SS).
Le salsicce insaccate sono state stagionate secondo lo schema
tempo/temperatura/UR% previsto (6). Il piano di campionamento
adottato è risultato abbastanza articolato, per la temporalità, per
il numero dei prelievi e per le diverse indagini microbiologiche,
364
chimico-fisiche e composizionali stabilite. Esso prevedeva
prelievi dell’impasto al tempo zero e alle 24 ore, della salsiccia al
5° giorno (pH minimo) e al 7° giorno della fase di asciugatura, e a
14, 21, 29, 35 giorni della fase di stagionatura. Sulle tre tipologie
di controllo, campionate in triplo, sono stati effettuati i seguenti
accertamenti di laboratorio:
– Carica microbica aerobia (Plate Count Agar 30°C/72 h);
Salmonella in 25 g (ISO 6579:2002); Salmonella ufc/g (XLD Agar
37°C/24ore); Batteri lattici (ISO 15214:2008); Enterobacteriaceae
(ISO 21528-2:2004); Stafilocchi/Micrococchi (Mannitol Salt Agar,
30°C/72 ore); Enterococchi (Slanetz Bartley agar 42°C/48 ore)
Stafilococchi coagulasi positivi (ISO 6888-2:2004)
Analisi chimico-fisiche
- aW è stata misurata a temperatura ambiente mediante l’utilizzo
dell’apparecchio Hygrolab 2 (Rotonic ag) e del Software “Igro
Software Quick”
-pH è stato misurato per infissione (pHmetro Eutech Instruments
PH700 e Elettrodo Double pore F Hamilton).
Su ogni salsiccia sono state, inoltre, eseguite le seguenti
determinazioni:
- % Calo peso
- % di sale e % di umidità relativa (determinati tramite Spettroscopia
NIT (FoodScan™ Lab. FOSS Electric A/S Denmark)
La dinamica di evoluzione della componente microbica, dei dati
chimico fisici e composizionali, rilevati sui campioni sperimentali,
sono risultati in linea con gli standard di prodotto e di processo
precedentemente definiti (6). Inoltre l’andamento, nel corso della
maturazione del prodotto, della componente microbica della
salsiccia (controllo Azienda) e della salsiccia (controllo IZS),
sostanzialmente ricalcava gli andamenti riscontrati in prodotti
carnei fermentati simili già descritti da altri autori, come indicato
nelle figure 1 e 2 (8).
FIG 1 Andamento dello sviluppo microbico nella salsiccia
(Controllo Azienda)
365
FIG. 2 Andamento dello sviluppo microbico nella salsiccia
(Controllo IZS)
FIG. 4 - Andamento del contenuto di Salmonella spp. nella
Salsiccia Controllo SS. Il modello log-lineare determinato dai dati
sperimentali risulta essere: Log (ufc/gr)=6,621-0,075 x Tempo
(giorni) [p(t student)=1,1x10-5]
PERFORMANCE DI CAMPO DEL NUOVO TEST RAPIDO TSE
“Prionics® - Check PrioSTRIP SR”
Meloni D., Varello V., Loprevite D., Cavarretta M.C., Manzardo E., Nocilla L., Longo D., Bozzetta E.
CEA, Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino
Key words: scrapie, test rapidi, performance.
Emerge, anche in questo caso, come le categorie dei batteri che
giocano un ruolo determinante nella fermentazione della salsiccia
e per le quali sono stati riscontrati in tutte le fasi del processo
produttivo valori di cariche progressivamente in aumento,
siano i batteri lattici e i Micrococchi catalasi positivi. I primi,
come è noto, determinano l’acidificazione iniziale dell’impasto
e, mediante l’attività proteolitica, caratterizzano il sapore del
prodotto finito, mentre i cocchi catalasi positivi, con l’azione
parzialmente neutralizzante del pH nelle fasi più inoltrate della
maturazione, conferiscono stabilità del colore, prevengono la
rancidità e consentono il rilascio di sostanze aromatiche. Inoltre,
il valore finale dell’acidità delle salsicce (compreso tra 5,5 e
5,7) e le caratteristiche organolettiche finali possono essere
state influenzate parzialmente anche dagli enterococchi fecali,
riscontrati in forma discontinua su entrambi i controlli, mediante la
produzione di ammoniaca e altre ammine (4).
La Figura 3 riporta i risultati relativi al Microbial Challenge Test
di processo nei confronti di Salmonella spp. oggetto di questo
studio. La rappresentazione grafica in essa contenuta mostra
l’andamento di questo batterio e dei batteri lattici in tutte le fasi del
processo. Appare chiaro come l’attivo metabolismo di quest’ultimi,
numericamente aumentati a partire dal 5° e 7° giorno del processo
produttivo, corrispondente al termine della fase di asciugatura,
determini il calo del pH, che, unitamente al calo dell’aw e
dell’umidità, favorisce l’inizio del progressivo e irreversibile
decremento di Salmonella spp. Il livello delle cariche microbiche
di Salmonella spp., infatti, si riduce da un valore massimo iniziale
di 5x107 ufc/g al valore di 1x105 ufc/g al 21° giorno, periodo in cui
il prodotto inizia a essere immesso nel mercato, per raggiungere il
valore minimo di 9x103 ufc/g al 35° giorno.
FIG. 3 - Andamento dello sviluppo della flora lattica e di Salmonella
spp. nella Salsiccia Controllo SS
La Figura 4 mostra la linearità di tale decremento.
L’esame dei dati acquisiti nel corso di questa sperimentazione
e dell’indagine preliminare, sembrerebbe avvalorare l’ipotesi che
nel corso del processo di maturazione della Salsiccia suina sarda
stagionata l’eventuale presenza di naturale contaminazione da
Salmonella spp., che non sia superiore a cariche di 10 1,5 ufc/g,
potrebbe essere azzerata grazie alle caratteristiche intrinseche
del prodotto e alla tecnologia stessa del processo produttivo. La
riduzione logaritmica osservata, calcolata dalla differenza del Log
iniziale e del Log al momento in cui il prodotto viene immesso
in commercio, è risultata rispettivamente di 1,6 Log e 2,6 Log
per il prodotto a 21 giorni e a 35 di maturazione. Questi risultati
sembrano trovare conferma in letteratura (3).
BIBLIOGRAFIA
1 AFSSA – Technical Guidance Document on shelf-life studies for
Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods
2. Carra E., et al. in “Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Manhattan in humans: a collection of strains makes the difference”,
International symposium Salmonella and Salmonelosis, Giugno 2010
Saint-Malo (Francia)
3. Ellajosyula, K.R., Doores, S., Mills, E.W., Wilson,
R.A.,Anantheswaran, R.e. and Knabel, S.J. (1998) Destruction of
Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella typhimurium in lebanon
bologna by interaction of fermentation pH, heating temperature and
time. Journal ofFood Protection 61, 152-157
4. Fadda S., Sanz Y., Vignolo G., Aristoy M.C. ,Oliver G., Tldra F.
Appl.Environ.Microbioll., 65,578(1999)
5. Guidance Document on Listeria monocytogenes shelf-life studies
for ready-to-eat foods, under Regulation (EC) No 2073/2005 of 15
November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs
5. Luzzi I., Galetta P., Massari M., Rizzo C., Dionisi A. M., Filetici E.,
Cawthorne A., Tozzi A., Argentieri M., Bilei S., Busani L., Gnesivo C.,
Pendenza A., Piccoli A., Napoli P., Loffredo L.,. Trinito M.O, Santarelli
E., Ciofi M. L. Atti, Euro Surveill., 12, E11 (2007)
6. Mele P., Marongiu E., Piras G., Delogu A., Noli A.C.,Coppa G.
, Virgilio S.1Dinamica di comportamento di salmonella spp. Nella
salsiccia suina sarda stagionata mediante microbial challenge test
di processo : Nota 1 - Studio preliminare di definizione standard di
prodotto e di processo
7. Pontello M., Sodano L., Nastasi A., Mammina C., Astuti M.,
Domenichini M., Belluzzi G., Soccini E., Silvestri M. G., Gatti M.,
Gerosa E., Montagna A., (1998) “A community-based outbreak of
Salmonella enterica serotype Typhimurium associated with salami
consumption in Northern Italy” Epidemiol. Infect., 120, 209
8. Talon R., Leroy S., Lebert I., (2007) Meat Science , 77, 55
Gli Autori ringraziano i Colleghi del Dipartimento di Igiene degli Alimenti per la collaborazione e l’azienda “La Genuina s.r.l. “
Ploaghe (Sassari) per la consulenza tecnologica e il supporto logistico fornito nel corso della sperimentazione.
Indagine realizzata nell’ambito del programma scientifico di CIRAL (Consorzio per la ricerca sulla sicurezza e qualità alimentare)
al quale l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna aderisce.
366
Abstract
Annex X to Regulation (EC) No 999/2001 sets out a list of
rapid tests approved for the monitoring of TSEs in bovine,
ovine and caprine animals. In 2012, EFSA recommended that
the test “Prionics® - Check PrioSTRIP SR” (visual reading
protocol) could be considered suitable for approval as rapid
test for detection of TSE in small ruminants’ Central Nervous
System. The aim of this study was to check the performances
of the “Prionics® - Check PrioSTRIP SR” using the “Idexx
HerdCheck BSE-SCRAPIE Antigen Kit as reference test.
Introduzione
La scrapie è una Encefalopatia Spongiforme Trasmissibile
(EST), che colpisce ovini e caprini. é caratterizzata
dall’accumulo nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) di
un’isoforma anomala della proteina prionica naturale (PrPc)
denominata PrPres (1).
La sorveglianza attiva nei confronti della scrapie è stata
introdotta in Italia nel 2002 (2). Parte integrante del
programma di sorveglianza è rappresentata da una procedura
di screening standardizzata. Per assicurarne l’uniformità di
applicazione sono stati validati a livello comunitario negli
anni diversi test diagnostici rapidi, valutandone le prestazioni
in termini di accuratezza e sensibilità analitica sui piccoli
ruminanti.
Nel Maggio 2012 l’EFSA ha pubblicato un’Opinione sulla
valutazione di nuovi test rapidi da utilizzare per il monitoraggio
delle TSE in Europa (3); l’unico test che ha superato la
valutazione e soddisfatto i requisiti previsti per la rilevazione
di TSE nel SNC di piccoli ruminanti è stato il ““Prionics® Check PrioSTRIP SR” (protocollo di lettura visiva). L’elenco
dei test rapidi per la sorveglianza delle TSE è stato modificato
di conseguenza (4-5).
I compiti istituzionali del CEA (Centro di Referenza Nazionale
per lo studio e le ricerche sulle encefalopatie animali e
neuropatologie comparate) prevedono tra l’altro attività quali
l’impostazione e la realizzazione di studi di validazione dei
test diagnostici; la valutazione delle prestazioni dei test rapidi
approvati dall’EU.
Scopo del lavoro è valutare la performance del test “Prionics®
- Check PrioSTRIP SR” - (protocollo di lettura visiva),
utilizzando come test di riferimento l’”Idexx HerdCheck BSESCRAPIE Antigen Kit”
• diluizioni seriali 1:50, 1:100 e 1:200 del pool scrapie
positivo.
Il pool positivo è stato omogeneizzato con i buffer specifici,
come da protocolli ufficiali dei due test, successivamente
sono state allestite le diluizioni seriali.
Sono stati utilizzati i test rapidi:
• Prionics® - Check PrioSTRIP SR - protocollo di
lettura visiva
• Idexx HerdCheck BSE-SCRAPIE Antigen Kit
Per garantire la comparazione dei risultati e ridurre le
potenziali variabili, sia il campione positivo indiluito che le
relative diluizioni sono stati analizzati in doppia replica nella
medesima seduta di lavoro. Inoltre, i due test rapidi sono
stati eseguiti nel corso della stessa giornata e dagli stessi
operatori.
Risultati
Tabella 1. Esiti di ciascun test
negativi
negativi
autolitici
positivi
iniziali
reattivi
IDEXX®
HerdCheck
BSE-Scrapie
Antigen Kit
128/128
128/128
4/4
0
Prionics®
- Check
PrioSTRIP
SR
128/128
128/128
1/4
0
Figura 1. lettura IDEXX® HerdCheck BSE-Scrapie
Antigen Kit
Materiali e metodi
Sono stati analizzati:
• 256 campioni negativi di tronco encefalico ovicaprino
testati in routine nell’ambito della sorveglianza attiva
della scrapie, il 50% dei quali presentava condizioni
di autolisi;
• un pool di campioni confermato positivo per scrapie
classica proveniente da un focolaio italiano a forte
segnale;
367
Figura 2. Prionics® - Check PrioSTRIP SR - lettura
visiva
Bibliografia
1. Prusiner SB: Science 1991, 252 (5012): 1515-22.
2. European Commission: In Off. J. Eur. Communities Vol.
147. Edited by: European Commission. Official Journal of
European Communities; 2001: 1-40.
3. Scientific Opinion on the evaluation on the TSE rapid test
submitted in the framework of the Commission Call for
expression of interest 2007/S204-2473391. EFSA J. 2012;
10(5): 2660.
4. Reg. UE n° 1064/2012 della Commissione del 13 novembre
2012. GU UE L314/13 del 14/11/2012.
5. Reg. UE n° 630/2012 della Commissione del 28 giugno
2013. GU UE L179/60 del 29/06/2013.
Conclusioni
Non sono stati riscontrati problemi di specificità; diversamente,
pur tenendo conto della piccola numerosità dei campioni positivi
esaminati, emerge un’evidente differenza relativamente alla
sensibilità analitica tra il test in esame e quello di riferimento:
soltanto il campione non diluito è risultato positivo con il test
“Prionics® - Check PrioSTRIP SR”; mentre l’IDEXX HerdCheck
BSE-scrapie ha dato risultati positivi fino alla massima
diluizione utilizzata (1:200). Si evidenzia inoltre l’obiettiva
difficoltà pratica ed il negativo impatto sul layout del laboratorio
operante in routine riferibile alla necessità cogente di procedere
all’interpretazione visiva e contemporanea da parte di due
lettori al fine di poter validare il risultato diagnostico delle prove.
Considerando che l’obiettivo del CEA è quello di continuare
a promuovere l’utilizzo dei migliori test rapidi disponibili sul
mercato, è evidente come non possa essere ipotizzato un
cambiamento del test rapido IDEXX HerdCheck BSE-scrapie
Antigen EIA ® in uso attualmente sul territorio italiano a favore
del test oggetto di valutazione.
368
LO SCREENING CON METODICHE IMMUNOCHIMICHE PER LA RICERCA DI
TRATTAMENTO ILLECITO CON CORTICOSTEROIDI: UNA STATEGIA AFFIDABILE?
Meloni D., Olivo F., Meistro S., Nocilla L., Manzardo E., Pitardi D., Pezzolato M., Bozzetta E.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Centro di referenza nazionale per le
Indagini Biologiche sugli Anabolizzanti animali, Torino
Key words: urina, cortisonici, validazione
ABSTRACT
In the EU the use of glucocorticoids in livestock is indicated
for therapeutic purpose only. At present, to monitor illegal use
in live animals, urine is the recommended matrix. According to
EU criteria, this matrix is mostly screened by immunoenzymatic
methods. Here, the Authors evaluated the performance of a
multiresidue screening ELISA kit applied by official laboratories
in the detection of glucocorticoids in bovine urine.
INTRODUZIONE
I glucocorticoidi sono un gruppo di ormoni steroidei che
comprende sia molecole naturali che sintetiche; cortisolo e
cortisone rappresentano le più importanti molecole endogene,
sono sintetizzate dalla corteccia surrenale e coinvolte nei processi
di risposta allo stress, nelle infiammazioni e nel bilanciamento
idroelettrico (1).
I derivati sintetici come desametasone e prednisolone, invece,
sono molto utilizzati in terapia veterinaria per le loro proprietà
antinfiammatorie e immunosoppressive e per i loro effetti sul
metabolismo (1).
Benché l’applicazione di queste molecole sia prevalentemente
per scopi clinici e strettamente regolamentato in Unione Europea
(2), i controlli ufficiali condotti in diversi Paesi Membri hanno
mostrato la presenza di residui di tali farmaci in preparazioni
illegali, nei mangimi, nei siti di inoculo, nelle urine e negli organi
soprattutto di bovini da carne (4).
I glucocorticoidi, infatti se somministrati a dosi molto inferiori a
quelle impiegate in terapia, pur non potendo essere considerati
veri “steroidi anabolizzanti”, possono causare un miglioramento
delle caratteristiche generali delle carcasse e un significativo
incremento di alcuni gruppi muscolari oltre che prolungare
l’azione di alcuni promotori di crescita (5).
La ricerca di queste molecole rimane quindi un aspetto importante
al fine di tutelare il benessere animale, rivelare alcune pratiche
illecite e proteggere il consumatore.
Dal 2012 i glucocorticoidi nel Piano Nazionale Residui (PNR)
appartengono al gruppo B2f, tale documento prevede la loro
ricerca in animali vivi nelle matrice “urina”, oltre ai controlli
da effettuare al macello sul fegato (6), In particolare l’iter
diagnostico prevede il rilevamento dei campioni sospetti non
conformi mediante metodiche immunochimiche di screening
e l’identificazione di queste con tecniche spettrometriche di
conferma (LC-MS/MS o GC-MS/MS).
Caratteristiche di un metodo di screening sono rapidità (analisi
e preparativa), bassi costi, affidabilità in termini di sensibilità e
specificità, rilevazione multiresiduo, possibilità di automazione
ed elevata produttività. Al fine di poter utilizzare un test di
screening in routine, unico requisito previsto dalla Decisione
657/2002 è che la % di falsi negativi al livello di interesse sia ≤
5%, mentre non viene data alcuna indicazione in proposito dei
falsi positivi; anche se una percentuale > 10% vanificherebbe
molti dei vantaggi di uno screening (7).
Altro aspetto da considerare è la necessità di rilevare allo
screening un numero sempre maggiore di residui, caratteristica
comporta spesso la riduzione della specificità del kit e un
aumento dei falsi non conformi. Questo fenomeno è dovuto
principalmente alla differente cross-reattività dell’anticorpo per
le molecole ricercate e al fatto che generalmente la validazione
viene fatta sulla molecola a cross-reattività più bassa e per
la quale vengono soddisfatti i criteri previsti dalla Decisione
Europea.
Il presente lavoro si propone di valutare le performance di un
metodo immuno-enzimatico per la ricerca dei glucocorticoidi di
sintesi nelle urine bovine, attualmente utilizzato per lo screening
nella Regione Piemonte ed in particolare le cause dell’alta
percentuale di campioni “sospetti non conformi” non identificati
come tali in LC-MS, per determinare efficienza ed efficacia della
tecnica quale strategia di controllo.
MATERIALI E METODI
METODICA DI SCREENING – Si è impiegato un ELISA
competitivo indiretto (Tecna, Trieste), in base ai valori di crossreattività il test può essere impiegato per la determinazione di
cinque corticosteroidi sintetici (desametasone, prednisolone,
flumetasone, betametasone, triamcinolone).
Il limite di rilevazione del kit in urina è dichiarato essere pari
a 0.5 mg/Kg, anche se non viene specificato l’analita a cui fa
riferimento (probabilmente desametasone).
Il kit è fornito di tutti i reagenti necessari, tra i quali una serie di
standard da utilizzare per la curva di calibrazione e corrispondenti
ad una concentrazione in matrice da 0.25 a 12.5mg/Kg. Nel
caso delle urine la preparazione del campione comprende una
filtrazione e una diluizione.
DATI DI VALIDAZIONE - Nelle prove di validazione è stata
verificata la specificità e l’errore beta, oltre alla robustezza e
ad altri parametri previsti in fase di pianificazione. Le molecole
considerate sono state due, il betametasone e il prednisolone,
che risultano a cross-reattività intermedia e bassa rispettivamente
70% e 20%.
Sono stati analizzati 3 differenti gruppi di campioni: 20 urine
negative e altrettante positivizzate con le due molecole. Per la
prima non è stato possibile adottare un livello di fortificazione
minore del livello di interesse (2 mg/Kg) mentre per la seconda
si è dovuto adottare un livello di fortificazione maggiore (6 mg/
Kg). Ad entrambi i livelli e per entrambe le molecole è stata
verificata l’assenza di falsi negativi, ma ai fini della applicabilità
della metodica solo tre delle cinque molecole rilevabili secondo
il produttore del kit sono state inserite nel campo di applicazione
del metodo.
I valori di CV % ottenuti dagli stessi dati per la verifica dell’errore
beta sono risultati minori del 10% tanto per i campioni negativi
che per quelli fortificati, inoltre anche il valore medio della risposta
dei negativi è risultato molto alto (B/B0 medio = 90%) che
presuppone una buona specificità nei confronti dei componenti
della matrice e quindi una bassa variabilità da campione a
campione.
369
CARATTERISTICHE DEL METODO DI CONFERMA - Le analisi
di conferma sono state effettuate mediante metodica LC-MS/
MS, il metodo è un multi-residuo che prevede una quantitativa su
curva in matrice costruita con aree relative Ax/AIS. Lo standard
interno impiegato è triamcinolone-d6 e gli analiti ricercati
sono: desametasone, flumetasone, prednisone, prednisolone
e 6α-metilprednisolone. La preparativa impiega 2 ml di urina e
prevede una fase di deconiugazione e una di estrazione con
solvente.
APPLICAZIONE IN ROUTINE - Nella valutazione delle
performance di un metodo oltre alla validazione può nel caso di
uno screening qualitativo, essere utile il confronto con un altro
metodo validato che utilizzi tecniche strumentali. E’ proprio da
questa valutazione fatta durante l’applicazione in routine che è
stata rilevata una percentuale di falsi positivi maggiore di quella
ritenuta accettabile secondo la Linea Guida del gruppo IIZZSS
(<10%).
Il criterio impiegato nella valutazione dei positivi in routine si
basa sull’utilizzo di un campione di urina positivizzato (POS) a
2 mg/Kg con betametasone e sulla base della sua risposta B/B0
(POS) andare a discriminare tra negativi o conformi nel caso B/
B0(x)<B/B0(POS) e sospetti positivi B/B0(x)≥B/B0 (POS).
PROVE DI VERIFICA - Sono state effettuate delle prove analoghe
a quelle condotte in validazione; stessi analiti considerati e stessi
livelli di fortificazione, utilizzando però urine differenti provenienti
da animali di controllo stabulati.
Le prove hanno previsto l’utilizzo di 20 urine di animali non
trattati, che sono state analizzate come tali (bianchi) e dopo
positivizzazione con betametasone e prednisolone.
Oltre ai campioni positivizzati sono stati considerati anche
campioni caratterizzati in LC-MS e provenienti da animali
sperimentali trattati con desametasone.
RISULTATI
Dalle analisi dei bianchi è emersa una elevata risposta in termini
di B/B0 (medio = 69%) oltre ad un’elevata dispersione (CV% =
24%), valori che possono indicare una scarsa specificità del kit
nei confronti delle interferenze da matrice.
La stessa variabilità è stata riscontrata nell’analisi dei campioni
positivizzati; betametasone (B/B0= 51%, CV% =17) e
prednisolone (B/B0= 54%, CV% =19).
Dai dati ottenuti, inoltre, è stato costruito un grafico della
distribuzione di frequenze (Fig. 1) dove risulta evidente la
sovrapposizione delle diverse popolazioni (positivi e negativi).
Questa mancanza di specificità, non necessariamente imputabile
alle caratteristiche del kit, non ha permesso di verificare la
capacità di rilevazione (CC b) al livello d’interesse utilizzato in
validazione, per entrambe le molecole considerate.
Al fine di simulare le condizioni di routine, è stato stabilito
come cut-off di seduta il valore più alto dei 20 positivizzati
con betametasone e sulla base di questo sono stati calcolati;
percentuale di falsi positivi, di falsi negativi, specificità e selettività.
La stessa valutazione è stata fatta considerando valori di cut
-off differenti; valore medio e valore più basso dei campioni
positivizzati con betametasone. I dati ottenuti sono presentati
nelle Tabelle 1. Nel caso del valore di cut-off più basso si
sono evidenziati il 7% di falsi negativi e il 40% di falsi positivi,
aumentando il valore di cut-off, come prevedibile, si è assistito ad
un aumento dei falsi negativi e una diminuzione dei falsi positivi.
Per quanto riguarda la valutazione dei campioni da animali trattati
non sono emersi falsi negativi e sono risultati positivi i campioni
con l’analita a concentrazioni comprese tra 1 mg/Kg e 2mg/Kg.
Al fine di confermare l’elevato valore medio emerso dall’analisi
dei campioni negativi, è stato inoltre valutato il contributo,
all’incremento del segnale netto dovuto ai soli analiti, questi sono
comunque risultati molto modesti e compresi tra 30-50%.
Tabelle 1a e 1b Parametri di performance ottenuti nello studio
1a)
1b)
Figura 1. Distribuzione di frequenza (asse X) dei valori B/B0
(asse Y) frequenze campioni negativi e positivizzati
CONCLUSIONI
I risultati dello studio indicano come il test e la sua attuale
applicazione non risponde alle prestazioni attese per un metodo
di screening efficacie, e in particolare si prefigura indispensabile
una fase di pretrattamento del campione, al fine di ottenere una
maggiore purificazione dello stesso e quindi una riduzione dei
falsi positivi. Obiettivo ottenibile con un’estrazione liquido/liquido
e/o una purificazione su colonnine SPE che tra l’altro potrebbe
permettere un abbassamento del livello d’interesse. La procedura
di diluizione impiegata è infatti uno dei metodi per ridurre l’effetto
matrice ma può portare a perdite in sensibilità o nella capacità di
distinguere concentrazioni vicine.
Per quanto riguarda la scelta del cut-off in routine, derivante dalla
risposta (B/B0) di un campione positivizzato con betametasone
a 2 mg/Kg, si evidenzia la sovrapposizione di questo livello
d’interesse con la capacità di rilevazione (CCβ) obbligatoria per i
metodi di screening rivolti verso i glucocorticoidi, da indicazioni del
CRL (8) infatti un metodo di screening dovrebbe essere sviluppato
su una concentrazione quanto più possibile inferiore a questa.
Nella valutazione complessiva del sistema diagnostico vanno
considerati anche i limiti del metodo di conferma che oltre a
comprendere un numero ridotto di molecole endogene, presenta
dei limiti di determinazione (LOD) molto vicini a quelli dello
screening, determinando un possibile incremento di falsi positivi.
1.Nozaki, O. (2001). Review, Steroid analysis for medical
diagnosis. Journal of Chromatography A, 935; 267-278.
2.European Commission. 2010. Commission Regulation
(EC) 37/2010, of 22 December 2010 on pharmacologically
active substances and their classification regarding
maximum residue limits in food stuffs of animal origin. Off.
J. Eur. Comm., L15; 1-72.
3.Courtheyn, D., Le Bizec, B., Brambilla, G., De Brabander,
H.F., Cobbaert, E., Van de Wiele, M., Vercammen, J., De
Wasch K. (2002). Recent developments in the use and
abuse of growth promoters. Analytica Chimica Acta, 473;
71-82.
4.Cannizzo, F.T., Capra, P., Divari, S., Ciccotelli, V., Biolatti,
B., Vincenti, M. (2011). Effects of low-dose dexamethasone
and prednisolone long term administration in beef calf:
Chemical and morphological investigation. Analytica
Chimica Acta, 700; 95-104.
5.Italian Residue Control Plan (2013).The plan was drawn
up according the Council Directive 96/23/EC. http://
pti.regione.sicilia.it/portal/page/portal/PIR_PORTALE/
PIR_LaStrutturaRegionale/PIR_AssessoratoSalute/PIR_
AreeTematiche/PIR_PianoNazionaleResidui/PNR%20
2013.pdf
6.Commission Decision 2002/657/EC. Implementing
Council Directive 96/23/EC concerning the performance of
analytical methods and the interpretation of results. Off. J.
Eur. Commun. 12 August 2002.
7.Linea Guida per la validazione intra-laboratorio di Metodi di
prova di Screening in accordo con la Decisione 2002/657/
CE Rev.1 -14/02/2008 Gruppo di Lavoro Settori Chimici
II.ZZ.SS
8.Guidelines for the validation of Screening Methods
(Initial Validation and Transfer) Community Reference
Laboratories Residues (CRLs) 20/01/2010
370
371
GENOTIPIZZAZIONE DI STIPITI DI SALMONELLA TYPHIMURIUM E SALMONELLA
ENTERICA 4,[5],12:i:- IN CINQUE EPISODI DI TOSSINFEZIONE ALIMENTARE
Merla C.1a, Andreoli G.1a, Carra E.1b, Corpus F.1b, Morganti M.1c, D’incau M.1d, Dalla Valle C.2, Marone P.2,
Colmegna S.1e, Fabbi M.1a
1d
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Sezione di: 1a Pavia, 1b Modena, 1c Parma,
Brescia, 1e Milano - Centro di referenza nazionale per i rischi emergenti in sicurezza alimentare2Fondazione IRCCS Policlinico
San Matteo di Pavia Struttura complessa di Microbiologia Virologia
Key words: Salmonella Typhimurium, Monophasic, salami
SUMMARY
Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST) and its Monophasic variant (STM) have emerged worldwide in the recent years
representing the prevalent cause of gastroenteritis. The aim of
this study was to characterize 16 ST and 18 STM strains collected from patients involved in five outbreaks occurred in November 2010 in the Northern Italy and from salami produced in the
province of Pavia from September 2010 to December 2012. The
strains were characterized by serotyping and performing PFGE
and MLVA techniques.
We found that all ST share the same PFGE and MLVA profile,
demonstrating the correlation between the salami and the 5 outbreaks. The STM strains were discriminate into 4 PFGE profiles
and into 7 MLVA profiles but only one MLVA profile was found
also in human strains.
INTRODUZIONE
Salmonella enterica è uno dei patogeni più frequentemente
isolati in caso di infezioni trasmesse da alimenti sia sporadiche
che epidemiche. La specie S. enterica comprende 6 subspecie
e più di 2500 sierotipi, determinati dall’antigene somatico (O) e
dall’antigene flagellare (H).
Il più comune serbatoio di Salmonella è il tratto intestinale di
alcuni animali e il batterio può essere isolato da diversi alimenti
di origine animale o vegetale che direttamente o indirettamente
abbiano subito una contaminazione. La contaminazione spesso
avviene quando i microrganismi sono introdotti in aree per la
preparazione degli alimenti e trovano le condizioni ideali per
mantenersi e moltiplicarsi.
In Europa S. Typhimurium rappresenta uno dei serovars più
frequentemente associati a tossinfezioni.
Sebbene l’incidenza delle salmonellosi umane sia rimasta
stabile negli ultimi anni, la presenza di nuovi stipiti di Salmonella
enterica rappresenta un problema per la salute pubblica (1). A
partire dagli anni ’90 si è assistito ad un aumento degli isolamenti
di S. Typhimurium (sierotipo 4,[5],12:i:1,2) ed alla comparsa della
sua Variante Monofasica (sierotipo 4,[5],12:i:-). Attualmente i due
sierotipi sono i più frequentemente isolati in casi di salmonellosi
umana (2).
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare ceppi
di S. Typhimurium isolati in 4 focolai di tossinfezione verificatisi
a Novembre 2010 nell’Oltrepo’ pavese (comune di Varzi) e in un
focolaio nella provincia di Milano in cui gli alimenti contaminati
e consumati dai pazienti erano insaccati stagionati (salami).
L’obiettivo conseguente è stato quello di monitorare nel tempo i
ceppi dei sierotipi S. Typhimurium e Variante Monofasica isolati
da insaccati e di caratterizzarne gli stipiti. L’attenzione è stata
rivolta soprattutto al controllo dei prodotti di 3 salumifici coinvolti
negli episodi di tossinfezione per verificare una eventuale
correlazione dei ceppi dei salami con i ceppi isolati da feci di
pazienti coinvolti nelle tossinfezioni.
MATERIALI E METODI
Per il presente lavoro sono stati analizzati da Novembre 2010 a
Dicembre 2012 234 campioni di salami a diverso stadio di stagionatura provenienti da produttori della provincia di Pavia e 11
carcasse suine. I campioni sono stati sottoposti ad analisi microbiologica per la ricerca di Salmonella spp. secondo il metodo ISO
6579:2002/Cor1:2004 (3).
I 54 ceppi di Salmonella isolati sono stati sierotipizzati per gli
antigeni O, H di fase 1 e H di fase 2 e i ceppi appartenenti ai sierotipi S. Typhimurium e Var. Monofasica sono stati caratterizzati.
Per verificare la diversità genetica 34 stipiti appartenenti ai due
sierotipi (25 isolati da salami, 7 da feci umane e 2 da tamponi
di carcasse suine), sono stati sottoposti a genotipizzazione
mediante il metodo Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
con l’enzima di restrizione Xba-I secondo il protocollo adottato da
PulseNet (6) e il metodo Multi-Locus Variable-Number TandemRepeat Analysis (MLVA) basato sull’analisi di 5 loci genici:
STTR9-STTR5-STTR6-STTR10pl-STTR3 secondo il protocollo
già descritto precedentemente (7). I pulsotipi sono stati analizzati
mediante software Bionumerics versione 6.6.
I 4 ceppi di ST isolati da pazienti mostrano lo stesso profilo in
PFGE e in MLVA di 12 ceppi isolati da salami di 3 produttori
(produttore n.1, 2, 3). E’ stato possibile osservare che tutti i salami contaminati da ST sono stati prodotti tra il 21 Settembre e
il 5 Ottobre 2010 e plausibilmente questi possono essere identificati come causa delle tossinfezioni verificatesi nel Novembre
2010 nell’Oltrepo’ Pavese e nella provincia di Milano. La contaminazione ha avuto origine probabilmente dal macello A e
ceppi con lo stesso profilo PFGE e MLVA sono stati riscontrati
nei salami dei produttori n.1, 2 e 3 afferenti a questo macello. Il
produttore n.3 ha lavorato nello stesso giorno anche le carni del
macello B determinando una contaminazione crociata, in seguito ad una disinfezione inappropriata in sede di lavorazione.
Per il cluster familiare segnalato nella provincia di Milano è
stata dimostrata la correlazione tra sintomatologia enterica ed
il consumo di un salame prodotto il 21 settembre dal produttore n.3, acquistato dalla famiglia in gita nell’Oltrepo’ e risultato
contaminato da un ceppo di S. Typhimurium con identico profilo
PFGE e MLVA (indicato nella ultima riga della tabella).
Tabella 2 – Distribuzione dei ceppi e provenienze Salmonella Typhimurium Variante Monofasica (STM)
Dai 34 stipiti selezionati, i 7 ceppi di origine umana sono risultati
essere 4 S. Typhimurium (ST) e 3 Var. Monofasica (STM), dagli
altri 27 sono stati individuati 12 ST e 15 STM. I profili PFGE e
MLVA sono indicati in tabella 1 per ST e in tabella 2 per STM.
Tabella 1 – Distribuzione dei ceppi e provenienze Salmonella Typhimurium (ST)
372
Per quanto riguarda i ceppi identificati come S. Typhimurium
Var. Monofasica si possono osservare 4 gruppi in PFGE e 7
gruppi in MLVA.
Il gruppo più numeroso comprende 9 ceppi aventi lo stesso
profilo PFGE e MLVA, 7 isolati da salami e 2 da tamponi su carcasse. I ceppi di questo gruppo sono attribuibili ai produttori n.2
e 6 e al macello A e si riferiscono al periodo compreso tra Aprile
e Novembre 2012. L’ipotesi che facciamo è che la Monofasica
abbia nel 2012 sostituito la ST nei prodotti di uno dei produttori
(n.2) già coinvolti nei precedenti focolai di tossinfezione. Questo profilo non corrisponde a nessuno dei ceppi di origine umana ma rimane il dubbio circa una sua potenziale patogenicità.
Il motivo della mancata segnalazione di tossinfezione ai servizi
sanitari potrebbe essere la minore patogenicità del profilo in
questione oppure una minore presenza quantitativa di Salmonella nei salami.
Un altro consistente gruppo è composto da 4 ceppi, 3 di origine
umana ed uno isolato da salame, che condividono lo stesso
profilo PFGE e MLVA. In questo caso non è stato però possibile
correlare l’episodio di tossinfezione all’alimento contaminato.
E’ comunque interessante notare che uno stipite con lo stesso
profilo e quindi con potenziale potere patogeno è stato ritrovato
in un salame prodotto oltre un anno dopo.
I rimanenti 5 ceppi mostrano ciascuno un profilo MLVA differente e tra questi 3 sono stati isolati da salami le cui carni provengono dai macelli B, C e D.
I risultati ottenuti da questa indagine confermano quanto già
osservato in altri studi dai quali emerge la predominanza di S.
Typhimurium e l’aumento degli isolamenti della sua Variante
Monofasica in Italia e in Europa. I due sierotipi risultano spesso
multiresistenti (4,5).
La PFGE è risultata utile nella caratterizzazione dei ceppi, evidenziando 5 gruppi, 4 associabili alle popolazioni presenti nel
2012 in 4 differenti macelli, ed uno responsabile dei casi di tossinfezione del Novembre 2010.
La metodica MLVA ha confermato per ST i risultati della PFGE
e ha evidenziato per STM una maggiore diversità genetica permettendo di correlare un ceppo da alimento ai 3 ceppi umani
che non era stato possibile collegare a nessuna fonte di infezione nel 2010.
Nel presente lavoro è stato inoltre possibile isolare ceppi di
S. Typhimurium in salami stagionati a 120 giorni e ceppi appartenenti alla Variante Monofasica in salami stagionati a 60
giorni. In analogia con il piano di sorveglianza sulla prevalenza
di Salmonella spp. in insaccati crudi di produzione regionale,
attualmente in corso, i nostri risultati indicano che l’ insaccato
è spesso veicolo di Salmonella spp. ed anche il consumo del
prodotto stagionato può rappresentare comunque un rischio
per il consumatore.
La tecnica MLVA insieme ai metodi già utilizzati come la PFGE
risulta uno strumento utile per comparare accuratamente e rapidamente ceppi isolati in caso di tossinfezioni alimentari e per
condurre studi epidemiologici al fine di ridurre l’incidenza delle
infezioni umane.
BIBLIOGRAFIA
1. The European Union Summary Report on Trends and
Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne
Outbreaks in 2011, 2013. European Food Safety Authority,
European Centre for Disease Prevention and Control
European Food Safety Authority (EFSA), European Centre
for Disease Prevention and Control (ECDC).
2. www.simi.iss.it/Enternet/Dati2_s.asp
3. ISO 6579:2002/Cor1:2004.
4. Kirchner M, Guerra B, Granier SA, Lucarelli C, Porrero MC,
Jakubczak A, Threlfall EJ, Mevius DJ, 2010. Multiresistant
Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Europe: a new
pandemic strain? Euro Surveillaince, (22):19580
5. Hauser E., Tietze E., Helmuth R., Junker E., Blank K.,
Prager R., Rabsch W., Appel B., Fruth A. and Malorny B.,
2010. Pork Contaminated with Salmonella enterica Serovar
4,[5],12:i:−, an Emerging Health Risk for Humans. Appl.
Environ. Microbiol. vol. 76 no.14:4601-4610. 6.http://www.
pulsenetinternational.org/SiteCollectionDocuments/pfge/
7. Lindstedt B.A., Vardund T., Aas L., Kapperud G., 2004.
Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeats Analysis
of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurim
using PCR multiplex and multicolor capillary electrophoresis.
Journal of Microbiological Methods, 59, 163-172.
373
Miceli I. 1, Vitale N.1, Marro S.2 , Monnier M.1, Zoppi S.1, Dondo A.1, Caruso C.1, Masoero L.1, Goria M.1, Faccenda M.3
1.Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna 148 -10154 Torino
2.Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università degli Studi di Torino, Via Leonardo da Vinci 44 - 10095 Grugliasco (TO)
3.Veterinario libero professionista
Key words: PRRS, RT-Nested PCR, saliva
SUMMARY
The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) is
one of the most economically significant disease affecting pigs
worldwide. Due to the devastating impact of PRRSV on swine
production, a rapid, convenient, sensitive and reliable diagnostic
method is required to monitor the disease.
The selection of oral fluid as diagnostic specimen is likely to be
a promising alternative to serum. The aim of this study was to
evaluate oral fluid reliability in detection and diagnosis of PRRSV
infection, by comparing it to one of most common specimen,
as serum is. Both specimen types were analysed by mean of
RT-nested PCR. Preliminary data reveal that diagnostic power
of individual oral fluid and serum seems to be not significantly
different. Nevertheless further studies are needed to clearly
assess oral fluid potential performance as efficient, cost-effective
diagnostic approach to PRRSV surveillance in swine herds.
indaginosa, considerando anche che l ‘RNA è facilmente
degradabile, da enzimi ubiquitari quali le RNAsi (8). Nel caso
della matrice saliva utilizzata come campione per la ricerca di
agenti eziologici, è pertanto necessario garantire adeguate
condizioni di conservazione dell’RNA, dal momento del prelievo,
fino all’arrivo in laboratorio.
Obiettivo principale dello studio è valutare le potenzialità di
campioni individuali di liquido salivare per rilevare la presenza
di genoma virale di PRRSV, rispetto a campioni di siero dei
medesimi soggetti, rapportandoli all’andamento della risposta
anticorpale. A tal fine diverse condizioni di conservazione/
trasporto e diverse strategie di estrazione sono state considerate
per la saliva, anche in combinazione con l’impiego di dispositivi
specifici per acidi nucleici (FTA Cards) e kit commerciali ad hoc
per la saliva, al fine definire un protocollo ottimale per preservare
l’integrità dell’RNA genomico del virus.
INTRODUZIONE
La sindrome riproduttiva-respiratoria del suino (PRRS) è una
malattia infettiva contagiosa, ad eziologia virale, causata da
un virus ad RNA monofilamento, genere Arterivirus, famiglia
Arterivirdae. La malattia è caratterizzata da un quadro clinico
polimorfo, manifestandosi sia in forma acuta, (in grado di
determinare mortalità considerevoli), che in forma cronica, con
impatti significativi sulla produttività dell’allevamento.
La suinicoltura in Piemonte, con un patrimonio di circa 11,5%
dei capi presenti sul territorio nazionale, ha un ruolo preminente
nell’economia del settore zootecnico. I dati disponibili sul
territorio nazionale confermano l’ampia diffusione dell’infezione,
indirettamente confermata dal frequente ricorso alla profilassi
vaccinale. L’isolamento del PRRSV può essere effettuato a partire
da diverse matrici biologiche, tra cui polmone, plasma, siero e
cellule del sangue fino a 5 settimane post infezione (3,5). A causa
dell’elevata contagiosità, il virus tende a diffondersi facilmente
nell’ambiente attraverso le secrezioni nasali, le feci, l’urina, lo
sperma, la placenta e i prodotti dell’aborto. Il controllo della PRRS
in allevamento è un percorso complesso che si deve avvalere di
diverse misure ed interventi oltre che strategie di management
aziendale e che, a causa dell’elevato numero di campioni
diagnostici necessari, risulta spesso oneroso. La scelta del fluido
orale quale matrice diagnostica sembra oggi rappresentare una
promettente alternativa al siero, più frequentemente utilizzato
per la diagnosi di laboratorio (2). Il campione di saliva potrebbe
essere considerato come un approccio non invasivo ed
economico per la diagnosi, monitoraggio e sorveglianza di una
vasta gamma di infezioni, causate da RNA-virus in veterinaria,
come in medicina umana ad esempio per HIV e Epatite A (1,4).
Tuttavia la saliva, per la funzione digestiva e protettiva (nei
confronti di agenti esterni), espletata attraverso l’azione di diversi
enzimi (proteasi e ribonucleasi), non rappresenta un ambiente
favorevole alla sopravvivenza di molti microrganismi. Inoltre
l’estrazione di RNA risulta essere una procedura laboratoristica
MATERIALI E METODI
Campionamento: Lo studio è stato condotto su un campione di
35 suini di 12 settimane di età, provenienti da un allevamento
per magronaggio-ingrasso situato in provincia di Cuneo. Gli
animali sono stati selezionati per la presenza dell’infezione,
considerando che la circolazione virale nell’allevamento è
comprovata da recente anamnesi patologica di infezione da
PRRSV, supportata da evidenze virologiche e relativi problemi
clinici in fase di accrescimento. Inoltre i soggetti campionati
provenivano da 2 siti in cui i suini svezzati viremici mantengono
la viremia. La numerosità campionaria è stata definita per
consentire di ottenere un limite inferiore dell’IC95% pari a 75%,
per una sensibilità diagnostica attesa pari a 95%, con un errore
di ±5%. Il protocollo sperimentale prevedeva il prelievo di siero e
saliva sui 35 capi ogni 2 settimane per un periodo di osservazione
complessivo di 10 settimane (6 prelievi successivi in totale).
Esame sierologico: Il siero è stato ottenuto per centrifugazione
da sangue intero; la ricerca degli anticorpi verso PRRSV è stata
effettuata mediante metodo ELISA utilizzando un kit commerciale
(IDEXX PRRS X3® virus antibody test kit, Idexx Laboratories).
Determinazione del virus PRRS mediante PCR: L’ estrazione
di RNA genomico da siero è stata fatta con kit commerciale
(E.Z.N.A. Viral RNA Kit, Omega Bio-tek), seguendo le istruzioni
del produttore. Preliminarmente, per il campione saliva sono
state condotte alcune valutazioni per definire le migliori
condizioni di conservazione/trasporto. Sono stati applicati due
diversi metodi di raccolta che prevedevano come supporto
per la conservazione degli acidi nucleici, rispettivamente,
l’utilizzo di uno stabilizzatore commerciale (RNAlater, Qiagen)
da aggiungere al momento del prelievo al fine di ridurre il più
possibile la degradazione dell’RNA, e le FTA Cards (Whataman,
GE Healthcare Life Sciences). Diversi kit commerciali sono stati
impiegati per le diverse condizioni di prelievo. I campioni di RNA
sono stati amplificati mediante tecnica RT-nested PCR secondo
Persia et al., modificata da Monnier et al. (6,7).
374
La sensibilità della matrice saliva è stata calcolata considerando
il numero di capi positivi alla PCR sul totale dei capi esaminati
per ogni prelievo. Tutte le elaborazioni statistiche sono state
realizzate con il software SAS® v9.2. I dati ottenuti da siero e
saliva sono stati esaminati con l’analisi della varianza per misure
ripetute, utilizzando il tempo come misura ripetuta, le densità
ottiche S/P dell’ELISA come variabile dipendente e la PCR saliva
(positivo/negativo) come variabile indipendente.
Sono stati eseguiti in totale 618 esami, 206 PCR su siero, 206
PCR su saliva e 206 sierologici in ELISA.
Il metodo che ha fornito, in via preliminare, i migliori risultati
per il campionamento e l’estrazione dell’RNA genomico nella
saliva si è dimostrato essere quello che prevedeva l’utilizzo
dello stabilizzatore RNAlater in associazione al kit di estrazione
Rneasy micro kit (Qiagen). Questo kit permette l’estrazione di
RNA presente in basse concentrazioni grazie all’utilizzo di un
RNA carrier che si lega all’RNA per la presenza della coda polyA.
In tabella 1 sono riportate le prestazioni delle matrici siero e
saliva analizzate in PCR per i 35 suini esaminati. Se siero e
saliva vengono valutati in parallelo come test indipendenti per la
determinazione della presenza del genoma virale la capacità di
rilevare l’infezione nell’animale aumenta, perché come mostra il
grafico 1 la finestra diagnostica della saliva è più lunga del siero.
Le medie delle DOS/P dei capi positivi alla saliva è 2.09(IC95%:
1.93-2.24), mentre quelle dei capi negativi è 2.10 (IC95%: 2.002.20). L’analisi della varianza sottolinea che non c’è differenza
statisticamente significativa tra le due medie (test F 1.67, p=0.14).
Questi risultati suggeriscono che la matrice saliva può essere
utilizzata per monitorare l’infezione da PRRS, ma risulta comunque
necessaria una ulteriore ottimizzazione e standardizzazione
della metodica, agendo sulle fasi iniziali del protocollo analitico.
L’affidabilità diagnostica aumenta se viene valutato in parallelo
l’esito ottenuto dalla matrice siero. La matrice saliva inoltre si
dimostra utile con l’impiego delle corde nei box come dispositivo
di prelievo multiplo, che diventa così rappresentativo di un intero
box di suini, offrendo un’ alternativa economica e vantaggiosa al
siero per monitorare la circolazione virale all’interno di un gruppo.
Tabella 1: Sensibilità della PCR per le matrici siero e saliva.
MATRICI
SALIVA
SIERO
PARALLELO
CAPI POSITIVI
14/35
24/35
27/35
SENSIBILITA’
40.0%
68.6%
77.1%
IC95%
23.9-57.9
50.7-83.1
59.9-89.6
Grafico 1: percentuale di capi positivi della matrice siero e
saliva per prelievo.
saliva
80%
siero
70%
60%
% capi positivi
Diagnosi di laboratorio di prrs: Valutazione delle performance
analitiche della matrice saliva nei Suini in fase di magronaggio
50%
40%
30%
20%
10%
0%
22-nov-12
07-dic-12
19-dic-12
03-gen-13
prelievo
17-gen-13
31-gen-13
Grafico 2: Medie delle densità ottiche S/P per prelievo suddivisi
per capi positivi e negativi alla matrice saliva alla PCR.
negativi
Saliva
positivi
3.3
3
2.7
2.4
% capi positivi
2.1
1.8
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0
22-nov-12
07-dic-12
19-dic-12
03-gen-13
17-gen-13
31-gen-13
prelievo
BIBLIOGRAFIA
1. Amado LA, Villar LM, de Paula VS, Gaspar AM.
Comparison between serum and saliva for the
detection of hepatitis A virus RNA. J Virol Methods.
2008 Mar;148(1-2):74-80.
2. Chittick WA, Stensland WR, Prickett JR, Strait
EL, Harmon K, Yoon KJ, Wang C, Zimmerman JJ.
Comparison of RNA extraction and real-time reverse
transcription polymerase chain reaction methods for
the detection of Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus in porcine oral fluid specimens. J Vet
Diagn Invest. 2011 Mar;23(2):248-53.
3. Christopher-Hennings J, Holler LD, Benfield DA,
Nelson EA. Detection and duration of porcine
reproductive and respiratory syndrome virus in
semen, serum, peripheral blood mononuclear cells,
and tissues from Yorkshire, Hampshire, and Landrace
boars. J Vet Diagn Invest. 2001 Mar;13(2):133-42.
4. Holm-Hansen C, Nyombi B, Nyindo M. Saliva-based
HIV testing among secondary school students in
Tanzania using the OraQuick rapid HIV1/2 antibody
assay. Ann N Y Acad Sci. 2007 Mar;1098:461-6.
5. Hu SP, Zhang Z, Liu YG, Tian ZJ, Wu DL, Cai XH, He
XJ. Pathogenicity and distribution of highly pathogenic
porcine reproductive and respiratory syndrome virus
in pigs. Transbound Emerg Dis. 2013 Aug;60(4):3519.
6. Monnier M., Kobal F., Ghia C.A., Buonincontro G.,
Goria M. “Sindrome riproduttiva e respiratoria del
suino: osservazioni preliminary per la ricerca del
virus ceppo europeo nel siero mediante RT-Nested
PCR” VII Congresso Nazionale SIDILV- Torino, 26-28
Ottobre 2005.
7. Persia D., Pacciarini M.L., Cordioli P. e Sala G. 2001.
Evaluation of Three RT-PCR assays for the detection o
veteporcine and respiratory syndrome virus (PRRSV)
in diagnostic samples. Atti “X International symposium
of rinary laboratory diagnosticians and OIE seminar
on biotecnology. Salsomaggiore.
8. Prickett J, Simer R, Christopher-Hennings J, Yoon
KJ, Evans RB, Zimmerman JJ. Detection of Porcine
reproductive and respiratory syndrome virus infection
in porcine oral fluid samples: a longitudinal study
under experimental conditions. J VET Diagn Invest
2008 20: 156.
375
DISEGNO E VALUTAZIONE DI UN METODO IN REAL-TIME PCR PER LA RICERCA DEI
GENI CODIFICANTI LE VEROCITOTOSSINE DI TIPO 1 E 2
Michelacci V., Tozzoli R., Grande L., Maugliani A., Caprioli A., Morabito S.
Laboratorio Europeo e Nazionale di Riferimento per Escherichia coli, Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza
Alimentare, Istituto Superiore di Sanità, Roma, Italia
Keywords: Escherichia coli, Verocytotoxin, Real Time PCR
ABSTRACT
Verocytotoxin(VT)-producing Escherichia coli (VTEC) are
foodborne pathogens causing severe disease. Recently an
international standard dedicated to the detection of these
pathogens in food has been published, ISO/TS 13136:2012
consisting in a Real Time PCR-based method. The first step of
the method involves the screening of food enrichment cultures
for the presence of the main virulence genes of VTEC, namely
VT-coding genes (vtx1 and vtx2). As the primers and probes
indicated in the method for vtx detection are subjected to
patents, we have deployed and evaluated new reagents. These
reagents will be later on validated according to ISO16140:2003
in order to assess their equivalence to be used by the
laboratories involved in the official control of foodstuffs without
facing any patent issues.
INTRODUZIONE
Escherichia coli produttore di Verocitotossina (VTEC) è un
patogeno zoonotico a trasmissione alimentare in grado di
causare patologie gravi nell’uomo, quali la colite emorragica e
la sindrome emolitico uremica. Nel 2012 è stato pubblicato uno
standard internazionale per la ricerca dei VTEC negli alimenti, la
ISO/TS 13136:2012, dal titolo: ”Microbiology of food and animal
feed -- Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens -- Horizontal
method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia
coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103
and O145 serogroups” (2). Tale metodo si basa sullo screening
mediante Real Time PCR di colture di arricchimento di alimenti,
finalizzato alla identificazione della presenza dei principali geni di
virulenza dei VTEC, ovvero i geni vtx codificanti le verocitotossine
(VT). I campioni positivi vengono quindi saggiati per la presenza
del gene eae codificante il fattore di adesione intimina, e i geni
associati ai sierogruppi maggiormente coinvolti nelle infezioni
umane gravi (O157, O111, O26, O103, and O145). Dai campioni
positivi per i geni vtx viene tentato l’isolamento del ceppo VTEC.
Gli oligonucleotidi e le sonde relative al saggio di Real Time
PCR per l’identificazione dei geni vtx indicate nella ISO/TS
13136:2012 sono coperte da brevetto, e per il loro utilizzo è,
in linea di principio, necessaria la negoziazione di licenze.
Reagenti alternativi possono essere utilizzati per tale scopo,
in seguito alla dimostrazione della loro equivalenza con quelli
indicati nella ISO/TS 13136:2012. Pertanto, in qualità di
Laboratorio Nazionale ed Europeo di Riferimento, abbiamo
disegnato dei nuovi oligonucleotidi e sonde per l’identificazione
dei geni vtx e ne abbiamo valutato l’efficienza al fine di disegnare
uno studio di validazione in accordo alla ISO 16140:2003. La
disponibilità di reattivi per la ricerca dei geni vtx non coperti
da brevetto completerebbe l’offerta diagnostica, a fianco dei
numerosi kit commerciali, assicurando la copertura analitica
per tutti i laboratori coinvolti nel controllo degli alimenti e la
tutela della salute.
viene ottenuta mediante l’utilizzo di sonde specifiche per i due
diversi geni, marcate con fluorofori differenti, in maniera tale da
poter essere utilizzate contemporaneamente. L’allineamento
delle sequenze dei geni vtx1 e vtx2 è riportato nella figura 1,
insieme alla posizione dei primers e dei probes.
Figura 1. Allineamento relativo alle porzioni delle sequenze
dei geni vtx1 e vtx2 presenti nelle banche dati dell’NCBI su
cui sono stati sviluppati gli oligonucleotidi e le sonde. La loro
posizione è riportata schematicamente.
MATERIALI E METODI
Ceppi batterici
I ceppi EDL933 e 031 sono stati utilizzati nelle reazioni di
amplificazione dei geni vtx1 e vtx2. In particolare il ceppo EDL933
è considerato il ceppo prototipo per i geni di sottotipo vtx1a,
mentre il ceppo 031 è considerato il ceppo di riferimento per i geni
vtx2c (5). Il ceppo di Escherichia coli K12 DH5a è stato utilizzato
per l’amplificazione dei plasmidi pGEM-T Easy contenenti le
sequenze nucleotidiche di interesse relative ai geni vtx.
Analisi di sequenza
Sequenze relative ai geni vtx1 e vtx2 disponibili nelle banche dati
genomiche dell’NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sono state
comparate mediante il software ClustalW.
Real Time PCR
Gli oligonucleotidi utilizzati in questo studio come primers e probe
per le reazioni di Real Time PCR sono stati disegnati sulle sequenze
di riferimento presenti in banca dati M19473 (sottotipo vtx1a) e
L11079 (sottotipo vtx2c). I primers sviluppati ed utilizzati sono:
stxAllFwd1
(CGDCTKATTRTTGARCRAAATAATTTATATGT)
e
stxAllRev1
(CCRCTRWRCKMCATYAAMKCCAGATA)
mentre le sonde Taqman sono Stx1ProbeEURL_1(5’
6FAMACCAGACAATGTAACCGCTGTTGT-3’
BHQ1)
e
Stx2ProbeEURL_1
(5’
ROXCGTTGTCATGGAAACCGTTGTCAC-BHQ2). Per le reazioni di
Real Time PCR è stato utilizzato un termociclatore Rotorgene
Corbet con il seguente profilo termico : 95°C 15 minuti, 45 cicli
95°C 15 secondi e 60°C un minuto.
Preparazione di materiali di riferimento ad hoc
Frammenti di 366 bp e 587 bp sono stati ottenuti mediante PCR
convenzionale con primers specifici per i geni vtx1 (stxAllFwd1/
stx1R) (3) e vtx2 (LP43/LP44) (1) rispettivamente sui DNA
estratti dai ceppi EDL933 per amplificare i geni di sottotipo
vtx1a e 031 per amplificare i geni vtx2c. Tali prodotti sono
stati clonati nel vettore plasmidico pGEM-T Easy. In seguito
alla loro purificazione, i due plasmidi sono stati quantizzati ed
opportunamente diluiti per costruire delle rette di calibrazione.
Disegno di oligonucleotidi e di sonde per l’identificazione dei
geni vtx1 e vtx2
Per il disegno dei nuovi reattivi, è stata utilizzata la stessa
strategia alla base dello sviluppo dei reattivi riportati nella
ISO/TS 13136, descritti da Perelle et al (2). Il disegno di
oligonucleotidi degenerati, in grado di riconoscere i geni
codificanti sia le verocitotossine di tipo 1 (VT1) che di tipo 2
(VT2), è stato condotto sulla base di un allineamento delle
sequenze relative alle subunità A (Figura 1) dei geni codificanti
le tossine VT1 (sottotipi vtx1a, vtx1c e vtx1d) e VT2 (sottotipi
vtx2a, vtx2b, vtx2c). La discriminazione dei geni vtx1 e vtx2
376
B) sequenza target vtx2
Costruzione delle rette di calibrazione con i materiali di
riferimento e determinazione delle performances.
I plasmidi di riferimento contenenti i frammenti vtx1 e vtx2 sono
stati diluiti in maniera scalare e soggetti ad amplificazione in
cinque repliche alle seguenti concentrazioni: 1 copia/reazione,
10 copie/reazione, 100 copie/reazione, 1000 copie/reazione e
10000 copie/reazione.
Un controllo negativo NTC (no template control) è stato incluso
in ogni esperimento.
Le curve di amplificazione sono state analizzate con il software
che gestisce il termociclatore e che consente la costruzione di
rette di calibrazione in cui il ciclo soglia (threshold cycle, CT)
ottenuto in ciascuna reazione di amplificazione, che rappresenta
un indice preciso della quantità di DNA inizialmente presente
nella reazione, viene messo in relazione con le concentrazioni
di DNA dei campioni utilizzati come standard. Il grafico che
ne deriva presenta sull’asse delle ascisse il logaritmo della
concentrazione delle diluizioni mentre sull’asse delle ordinate
il CT. Dall’analisi del grafico è possibile ricavare determinati
parametri, relativi all’efficienza della reazione di Real Time
PCR, quali la pendenza M, l’efficienza ed il coefficiente di
correlazione R2. Le curve di calibrazione ottenute sono di
seguito riportate (Fig. 2)
Figura 2. Curve di calibrazione ottenute per la sequenza target
(A) vtx1 R2= 0,95863; M= -3,38039; Efficienza= 0,97617 e (B)
vtx2 R2= 0,97357; M= -3,18327; Efficienza= 1,0613
Il coefficiente di correlazione (R2) è una misura di quanto i dati
sperimentali seguono la linea di regressione ed il suo valore
massimo è pari a 0,999. Nel caso della sequenza target vtx1 è
stato ottenuto un valore pari a 0,95863 mentre per la sequenza
target vtx2 un valore più alto e maggiormente vicino all’atteso
(0,97357). Un altro parametro importante è la pendenza M
(slope) della retta di regressione, che per ottenere risultati
accurati e riproducibili deve essere più vicina possibile al 100%
(identificato dal valore -3.32) ed entrambe le reazioni per le due
sequenze target mostrano valori compatibili (Fig. 2). In ultimo
abbiamo valutato l’efficienza della reazione di amplificazione,
determinata dall’equazione E=10(-1/slope)-1. L’efficienza ottimale
della PCR dovrebbe essere compresa nell’intervallo 90–100%,
corrispondente all’intervallo −3.6 ≥ slope (M) ≥ −3.3. I nostri
risultati mostrano che mentre per l’amplificazione dei geni vtx1 il
valore di M era compreso nell’intervallo, l’amplificazione dei geni
vtx2 ha restituito un valore di M pari a 3,18. Quest’ultimo risultato
richiede che la reazione per l’amplificazione dei geni vtx2 debba
essere ottimizzata al fine di portarne l’efficienza ai valori ottimali
per l’esecuzione della validazione secondo la ISO 16140:2003.
BIBLIOGRAFIA
1. Cebula TA, Payne WL, Feng P. Simultaneous identification
of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their
Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation
assay–multiplex PCR. J Clin Microbiol 1995;33:248-50
2. ISO/TS 13136:2012. Microbiology of food and animal
feed -- Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens -Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157,
O111, O26, O103 and O145 serogroups
3. Paton AW, Paton JC. Multiplex PCR for direct detection of
Shiga toxigenic Escherichia coli strains producing the novel
subtilase cytotoxin. J Clin Microbiol. 2005 Jun;43(6):2944-7.
4. Perelle, S., Dilasser, F., Grout, J., Fach, P. Detection by 5’
nuclease PCR of Shiga-toxin producing Escherichia coli
O26, O55, O91, O103, O111, O113, O145 and O157:H7,
associated with the world’s most frequent clinical cases.
Mol. Cell Probes 2004, 18, pp. 185-192
5. Scheutz F, Teel LD, Beutin L, Piérard D, Buvens G, Karch
H, Mellmann A, Caprioli A, Tozzoli R, Morabito S, Strockbine
NA, Melton-Celsa AR, Sanchez M, Persson S, O’Brien AD.
Multicenter evaluation of a sequence-based protocol for
subtyping Shiga toxins and standardizing Stx nomenclature.
J Clin Microbiol. 2012 Sep;50(9):2951-63.
A) sequenza target vtx1
377
ari
ri:
le
m),
io
co
he
ub
to
he
nt
nd
nd
G:
MOLECULAR AND MELISSOPALYNOLOGICAL ANALYSIS TO CHARACTERIZE HONEYS
PRODUCED WITHIN THE MAJELLA NATURAL PROTECTED AREAS (CENTRAL ITALY)
Milito M.1, Cersini A.1, Ciaschetti G.2, Giacomelli A.1, Di Santo M.2, Andrisano T.2, Puccica S.1, Antognetti V.1, Pietropaoli M.1,
Pizzariello M.1, Marchesi U.1, Formato G.1, Amaddeo D. 1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle regioni Lazio e Toscana, Rome, Italy;
2
Ente Parco Nazionale della Majella, Sulmona, Italy
Keywords: Melissopalynological analysis, molecular analysis, Majella Natural Park
ABSTRACT
In 2010 and 2011 the Majella Natural Protected Area
realized, under the coordination of the Istituto Zooprofilattico
Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, a study to
characterize by molecular and melissopalynological analysis
the honey produced within the Park.
INTRODUZIONE
Nel periodo 2010 – 2011, il Parco Nazionale della Majella,
in collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale
delle Regioni Lazio e Toscana, ha realizzato uno studio per
caratterizzare dal punto di vista botanico i prodotti apistici della
stessa area naturale attraverso: a) analisi sul polline per la
creazione di una palinoteca e di una gene bank di riferimento
con i pollini delle specie botaniche nettarifere e pollinifere
caratteristiche del parco; b) riconoscimento, tramite analisi
sia molecolari che melissopalinologiche, delle famiglie e dei
generi botanici dei pollini che caratterizzano il campione; c)
indagine sulle potenzialità delle analisi molecolari nel futuro
riconoscimento delle specie, subspecie e varietà per la
caratterizzazione dal punto di vista botanico e geografico il
miele del Parco Nazionale della Majella.
MATERIALI E METODI
Materiali
Sono stati esaminati i mieli e i pollini prodotti da 11 diverse
postazioni del Parco (Cansano Le Piscine, Cansano Mandrie
Chiare, Pettorano sul Gizio, Caramanico, S. Eufemia a Majella,
Pescocostanzo, Roccamorice, Palena, Fara San Martino, Lama
dei Peligni, Sulmona). All’interno di queste sono stati prelevati:
a) 117 campioni di polline fresco per altrettante analisi
palinologiche; b) 58 campioni di mieli in favo per 58 analisi
melissopalinologiche al microscopio ottico e 522 analisi in PCR
End point;
c) 21 campioni di mieli in barattolo, per 21 analisi organolettiche,
21 analisi di umidità, 21 analisi melissopalinologiche al
microscopio ottico, 630 analisi in PCR End point e 140 analisi
in Real Time PCR.
Per riconoscere l’origine botanica de miele si effettuano prima
una analisi sensoriale e melissopalinologica (ed eventualmente
quella della ricerca di alcune sostanze peculiari): confrontando
così le caratteristiche organolettiche del miele con il suo spettro
pollinico osservato al microscopio ottico. In una fase analitica
successiva si passa alla tipizzazione biomolecolare in PCR solo
di quei pollini la cui morfologia abbia dimostrato l’appartenenza
a specie botaniche tipiche o esclusive dell’areale di origine del
miele.
Il flusso di lavoro ha previsto: a) il campionamento dei fiori delle
specie botaniche nettariferee pollinifere, nelle 11 postazioni
interessate; b) la creazione di una palinoteca di riferimento
per la memorizzazione microscopica della morfologia pollinica
di tali specie c) la creazione di una gene bank di riferimento
per la memorizzazione del DNA pollinico di ciascuna specie e
subspecie tipica d) le analisi melissopalinologica e molecolare
sui campioni di miele.
Analisi sul polline: allestimento palinoteca
Il personale del Parco Nazionale della Majella ha campionato
ed identificato le specie botaniche in fioritura di interesse
apistico presenti in ciascuna delle 11 postazioni inviandone i
fiori ai laboratori dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio
e Toscana. Dagli stami di ogni fiore sono stati estratti due
campioni di polline con l’aiuto di ago e specillo. Un campione
è stato posizionato su vetrino, miscelato con una goccia di
acqua distillata, asciugato e montato con vetrino coprioggetto
mediante gelatina glicerinata per lo studio della morfologia
pollinica al microscopio ottico. Ciascun vetrino così preparato
è stato catalogato con l’esatto nome del genere, della specie
ed eventualmente della subspecie In questo modo è stato
possibile realizzare la palinoteca necessaria per lo studio
e la memorizzazione, sia a livello morfologico che a livello
genetico, delle molte forme polliniche presenti in ciascuna
delle 11 postazioni studiate e rinvenibili anche nei mieli. .
L’altro campione è stato inviato al reparto di Biotecnologie per
l’estrazione del DNA e la caratterizzazione molecolare della
specie/subspecie.
Analisi melissopoalinologiche
Da ogni campione di miele in barattolo e in favo sono stati
prelevati 10 grammi di prodotto e miscelati accuratamente con
20 ml di acqua distillata. Il campione è stato centrifugato a 2500
rpm per 10 minuti, ed il pellet recuperato è stato nuovamente
centrifugato per 5 minuti. Il sedimento è stato quindi posto ad
asciugare ad una temperatura inferiore ai 40°C su un vetrino
portaoggetto . sul quale è stato poi applicato un coprioggetto
impiegando gelatina glicerinata. A questo punto è stata
effettuata l’osservazione al microscopio ottico con obiettivo
100 X, contando fino a 500 pollini su cinque linee orizzontali,
in modo da arrivare ad estrapolare le “classi di frequenza” per
ogni tipo pollinico presente.
Identificazione microscopica dei tipi pollinici
Il riconoscimento delle forme polliniche è stato eseguito
mediante lo studio della loro morfologia ed attraverso il
confronto con i vetrini di riferimento della palinoteca del Parco
Si è posta particolare attenzione alle forme caratteristiche del
luogo associate con quelle comuni dello spettro polllinico di
base.
378
Analisi biomolecolari
Estrazione DNA pollinico: il DNA pollinico è stato estratto
dalle diverse tipologie di campioni di miele mediante l’Invisorb
Spin Food® kit II (Invitek GmBH, Berlin, Germany).
Controllo qualità e quantità del DNA estratto:
la
qualità e la quantità del DNA estratto è stata verificata sia
spettrofotometricamente che in Real Time PCR specifiche per
l’actina e l’RNA transfer leucina (tRNA-Leu) (1). Le master mix
sono state effettuate con TaqManTM PCR Core Reagent kit (A.
Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA).
Specifica identificazione dei Taxon in End point PCR:
sui 21 campioni di miele in barattolo sono stati testati anche
ulteriori protocolli molecolari basati sull’amplificazione e
sequenziamento di specifici tag del cloroplaqsto: trnL, LoopP6
ed rbcl (2, 3 e 4). Quest’ultima strategia ha permesso di
evidenziare solo le famiglie a cui appartengono i pollini senza
arrivare a livello di genere essendo gli stessi tag cloroplastici
estremamente conservati tra i generi di una stessa. Tutti
i DNA estratti positivi per l’actina e il tRNA-Leu sono stati
successivamente testati per la ricerca dei seguenti generi:
Eucalyptus(1)-96bp), Hedysarum (primer home-made, 259bp),
Hedera (primer home-made,102bp), Lavandula (1)-74bp),
Onobrychis (primer home-made, 218bp), Satureja (primer
home-made, 76bp), Taraxacum (primer home-made,351bp),
Trifolium (1)-191bp), Robinia (1)-107bp). Le master mix per
le PCR End point per i generi elencati sono sate ottenute
con l’AmpliTaq GoldTM DNA Polymerase, A. Biosystems,
Branchburg, New Jersey USA).
Analisi sui mieli in barattolo e sui mieli in favo. Attualmente
sono state eseguite sia le analisi microscopiche che
biomolecolari sui 21 mieli in barattolo ed i 58 mieli in favo del
Parco. Entrambe le tecniche hanno dimostrato la presenza di
tre famiglie e generi: Fabaceae (generi Trifolium, Onobrychis,
Hedysarum), Lamiaceae (genere Lavandula), Araliaceae
(genere Hedera). Inoltre con le analisi biomolecolari è stata
evidenziata anche la presenza di pollini appartenenti alle
famiglie: Asteraceae (genere Taraxacum), Myrtaceae (genere
Eucalyptus). Con le analisi melissopalinologiche effettuate
presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana a
tutt’oggi è possibile rilevare una serie di famiglie e di generi che
vengono riportati nella seguente tabella.
Tabella n.1 Specie botaniche che potrebbero essere tipizzate
per la caratterizzazione botanica e geografica dei mieli del
Parco Nazionale della Majella
Famiglia
riconosciuta
al
microscopio
Genere
riconosciuto
al
microscopio
Specie presente nel
Parco Nazionale
della Majella
Fabaceae
Onobrychis
vicifolia, alba
Fabaceae
Trifolium
repens, resupinatum,
fragiferum, pratense,
angustifolium,
campestre,
montanum,
ochroleucum
Fabaceae
Melilotus
altissimus, indicus,
officinalis, sulcatus
Fabaceae
Vicia
cracca,
onobrychioides,
sepium, tenuifolia,
villosa, irsuta,
hybrida, lutea, sativa
Rosaceae
Malus
sylvestris
Liliaceae
Lilium
bulbiferum subsp.
croceum
Asteraceae
Centaurea
tenoreana
(endemica), ambigua
Lamiaceae
Thymus
serpillum
Lamiaceae
Calamintha
nepeta
Lamiaceae
Saturejia
montana
Campanulaceae
Campanula
fragilis
Gentianaceae
Gentiana
lutea
Per ogni famiglia e genere vengono mostrate le specie botaniche
tipiche o endemiche delle postazioni esaminate nel Parco che
potrebbero quindi essere candidate ad un’ulteriore tipizzazione
a livello biomolecolare arrivando fino al livello di specie o di
sub specie. La caratterizzazione molecolare sembrerebbe
infatti molto utile per il conseguimento di un marchio qualità
dell’alimento miele (es. Denominazione di Origine Protetta dei
mieli del Parco)
BIBLIOGRAFIA
1.I. Laube, H. Hird, P. Brodmann, S. Ullmann, M. Schöne-Michling, J. Chisholm, H. Broll (2010) Development of primer and probe
sets for the detection of plant species in honey. Food Chemistry. 118: 979-986;
2.P. Taberlet, L. Gielly, G. Pautou, J. Bouvet (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast
DNA. Plant Molecular Biology. 17: 1105-1109;
3. P. Taberlet, E. Coissac, F. Pompanon, L. Gielly, C. Miquel, A. Valentini, T. Vermat, G. Corthier, C. Brochmann, E. Willerslev
(2007) Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding. Nucleic Acids Research. 35:3-10;
4.A. Ortola-Vidal, H. Schnerr, M. Rojmyr, F. Lysholm, A. Knight (2007) Quantitative identification of planta genera in food products
using PCR and Pyrosequencing® technology. Food Control. 18: 921-927;
5.G. Pirone, G. Fiaschetti (2010) Il Parco Nazionale della Majella: aspetti della flora e della vegetazione. Atti 53° Convegno
nazionale AAIG: 137-154;
6. Ministero delle politiche agricole Alimentari e Forestali – CRA
Istituto Sperimentale per la zoologia Agraria-Sezione di Apicoltura, Roma (2007) I Mieli Regionali Italiani;
7.G. Ricciardelli D’Albore, F. Intoppa (2000). Fiori e Api. Calderini Edagricola.
379
RISULTATI DI UN TEST RFLP SU CEPPI VACCINALI DI CANINE
DISTEMPER VIRUS IN ITALIA
gene H del ceppo vaccinale del Vanguard 7 del sito di clivaggio
per l’enzima PsiI. L’analisi delle sequenze nucleotidiche
ha inoltre mostrato che il ceppo vaccinale Vanguard 7 ha
un maggiore correlazione con i ceppi wild-type del gruppo
America-2, rispetto al ceppo Snyder Hill dichiarato dal
produttore o agli altri ceppi vaccinali oggetto di studio. Tutti gli
altri ceppi vaccinali risultano correlati al gruppo America-1.
Mira F., Purpari G., Gucciardi F., Di Bella S., Guercio A.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Via G. Marinuzzi, 3 – 90129 Palermo
Key words: Canine Distemper Virus, PCR-RFLP, sequence analysis
SUMMARY
Canine Distemper (CD) is a highly contagious and multisystemic
viral disease of domestic and wild carnivores. A published
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) test, based
on the presence of a PsiI cleavage site on hemagglutinin (H)
gene, allows a rapid differentiation of all currently used vaccine
strains by virulent field strains. The present study describes the
results of this test carried out on different CD vaccines available
in Italy in 2010. RFLP has also revealed that the CD strain
present in the Vanguard (Pfizer Animal Health) vaccine reacts
as a wild-type strain. Moreover, genetic analysis of H gene
sequence has showed that Vanguard vaccine strain does not
cluster in the group of vaccine strains (America-1), as expected
based on the product description provided by the manufacturer,
but it is more closely related to wild-type strains of the America-2
group. However, this protocol shows significant advantages to
identify CD wild-type strains.
INTRODUZIONE
Il Cimurro è una malattia infettiva contagiosa che colpisce
carnivori domestici e selvatici. Questa malattia è causata
dal Canine Distemper Virus (CDV), un virus appartenente al
genere Morbillivirus, della famiglia Paramyxoviridae. Da molti
anni vengono impiegati vaccini vivi attenuati per il controllo
della malattia, allestiti con i ceppi Onderstepoort, SnyderHill, Rockborn, Lederle e Convac. Studi filogenetici effettuati
su questi ceppi vaccinali hanno messo in evidenza la loro
appartenenza al lineage America-1 ed il raggruppamento di
questi in un cluster distinto rispetto ai ceppi wild-type isolati
appartenenti allo stesso lineage (2, 4). Nel corso di accertamenti
di laboratorio eseguiti su animali recentemente vaccinati, il
ceppo virale presente nel vaccino potrebbe interferire con la
RT-PCR, portando a risultati diagnostici controversi. Analisi
molecolari effettuate su casi clinici di cani recentemente
vaccinati non hanno messo in relazione l’agente causale con
alcuno dei ceppi vaccinali di uso corrente (4, 5), tuttavia casi
di animali vaccinati in cui era possibile evidenziare il ceppo
vaccinale per un breve periodo di tempo sono stati descritti
(3). Al fine di escludere tali dati fuorvianti vari Autori hanno
ritenuto opportuno valutare la possibilità di realizzare dei saggi
biomolecolari in grado di discriminare i ceppi vaccinali da quelli
di campo. Un test di RT-PCR associato ad una RFLP è stato
messo a punto per la differenziazione tra virus wild-type e ceppi
vaccinali (1). Il test è stato sviluppato sull’evidenza nucleotidica
della presenza di un sito di clivaggio per l’enzima PsiI nel gene
dell’emoagglutinina (H) caratteristico dei ceppi vaccinali di CDV
e quindi in grado di differenziare questi dai ceppi di campo.
Gli Autori del presente lavoro, durante l’esame di vaccini vivi
attenuati per il CDV disponibili in commercio sul territorio
nazionale, hanno messo in evidenza che il ceppo vaccinale
presente nel vaccino Vanguard (Pfizer Animal Health, USA), con
questo protocollo diagnostico, mostrava un profilo di restrizione
uguale ai ceppi wild-type, contrariamente a quanto atteso per il
ceppo vaccinale dichiarato. Questo studio riporta, quindi, l’esito
dell’indagine effettuata su vaccini vivi attenuati verso il Cimurro
commercializzati in Italia ed il risultato controverso mostrato dal
ceppo vaccinale presente in uno di questi prodotti.
MATERIALI E METODI
Per il presente studio è stata testata una dose di cinque differenti
vaccini per CDV in commercio in Italia nel 2010 (Tabella 1). I
vaccini sono stati conservati alla temperatura raccomandata
e sono stati ricostituiti secondo le indicazioni del produttore.
L’RNA virale è stato estratto utilizzando il kit QIAamp® Viral RNA
Mini Kit (QIAGEN) ed è stato conservato alla temperatura di
-80°C. Come controllo positivo è stato utilizzato un ceppo CDV
Bussell di riferimento, clone del ceppo vaccinale Onderstepoort
adattato alla crescita nella linea cellulare VERO Orwell (African
green monkey kidney). Sono state quindi ottimizzate una RTPCR One Step (QIAGEN, OneStep RT-PCR Kit) ed una PCRRFLP utilizzando l’enzima PsiI, secondo il protocollo suggerito
da Demeter Z. et al. (1). I prodotti di amplificazione ottenuti
dai ceppi vaccinali attraverso uno specifico set di primers (1),
sono stati purificati utilizzando il kit illustraÔ GFX PCR DNA,
Gel Band Purification (GE Healthcare) e sono stati sottoposti
a sequenziamento dalla ditta BMR Genomics, Padova. Le
sequenze nucleotidiche del gene dell’emoagglutinina (H)
ottenute sono state allineate con quelle di altri ceppi CDV
disponibili in GenBank.
Tabella 1 – Vaccini oggetto di studio
Ceppo
Vaccinale
Lotto
Canigen Ceppi+L
(Virbac Srl)
Non dichiarato
2SB9
Duramune® Puppy DP+C
(Fort Dodge)
Ondestepoort
370AY9001
Eurican Tetra
(Merial Tetra Spa)
Non dichiarato
L361281
Nobivac Ceppi
(Intervet Italia Srl)
Ondestepoort
A227B01
Snyder-Hill
L94377
Vaccino
Vanguard 7
(Pfizer Animal Health)
Figura 1 - RFLP del vaccino Vanguard 7 e del Ceppo CDV
Bussell
CONCLUSIONI
Nel presente studio è stato applicato un metodo di
PCRRFLP in grado di differenziare i ceppi vaccinali dai ceppi wildtype di cui si conosce la sequenza. Il metodo applicato ai ceppi
vaccinali in commercio in Italia ha mostrato come il ceppo
di CDV presente nel vaccino Vanguard produce un profilo di
restrizione equiparabile ad un ceppo wild-type. Questo risultato
era già stato segnalato in lotti differenti dello stesso vaccino
distribuito in Ungheria (2). L’analisi di sequenza del gene H
evidenzia come questo ceppo vaccinale sia maggiormente
correlato a ceppi wild-type rispetto al ceppo dichiarato Snyder
Hill o agli altri ceppi vaccinali in commercio, appartenenti al
lineage America-1. Tale osservazione è stata riportata anche
da altri gruppi di ricerca (2, 5, 6). Il presente lavoro è la prima
segnalazione in Italia della presenza nel vaccino Vanguard in
commercio in Italia di un ceppo differente da quello dichiarato e
conferma la maggiore correlazione di questo ceppo vaccinale
al gruppo America-2, come già evidenziato in Nord America ed
in Ungheria. Pertanto, in caso di animali vaccinati con questo
vaccino, non è possibile discriminare mediante tale protocollo
di RT-PCR e RFLP la presenza di genoma virale appartenente
al ceppo wild-type da quello di origine vaccinale. Per ovviare
a questo limite è possibile ricorrere al sequenziamento degli
amplificati ottenuti e alla loro comparazione con sequenze
note di CDV disponibili in GenBank, considerato che anche
le sequenze del ceppo utilizzato nel vaccino Vanguard sono
depositate, con i seguenti numeri di accesso: EF095750 (H
gene), EU072198 (F gene), EU072199 (M gene), EU072200
(N gene) e EU072201 (P gene). Risulta inoltre utile, ai fini
diagnostici, conoscere la storia vaccinale del soggetto al
momento dell’esecuzione dei tests di biologia molecolare.
Sebbene la tecnica RFLP proposta da Demeter et al. (1),
presenti dei limiti, la stessa mostra significativi vantaggi rispetto
ad altri metodi diagnostici e risulta utile quale prova di screening
per evidenziare ed identificare i ceppi wild-type di CDV circolati
nel territorio.
BIBLIOGRAFIA
1. Demeter Z., Lakatos B., Palade E.A., Kozma T., Forga´ch
P., Rusva M. (2007). Genetic diversity of Hungarian canine
distemper virus strains. Vet. Microbiol. 122: 258–269.
2. Demeter Z., Palade E.A., Hornyák A., Rusvai M. (2010).
Controversial results of the genetic analysis of a canine
distemper vaccine strain. Vet Microbiol. 142(3-4) :420-6.
3. Greene C.E., Appel M.J. (2006). Canine distemper. In:
Greene, C.E. (Ed.), Infectious Diseases of the Dog and
Cat. 3rd ed. Saunders-Elsevier, pp.25–41.
4. Martella V., Elia G., Lucente M.S., Decaro N., Lorusso E.,
Ba´nyai K., Blixenkrone-Møller M., Lan N.T., Yamaguchi
R., Cirone F., Carmichael L.E., Buonavoglia C. (2007).
Genotyping canine distemper virus (CDV) by a hemi-nested
multiplex PCR provides a rapid approach for investigation
of CDV outbreaks. Vet. Microbiol. 122: 32–42.
5. Pardo D.R., Johnson G.C., Kleiboeker S.B. (2005).
Phylogenetic Characterization of canine distemper viruses
detected in naturally infected dogs in North America. J.
Clin. Microbiol. 43: 5009–5017.
6. Radtanakatikanon A., Keawcharoen J., Charoenvisal
N.T., Poovorawan Y., Prompetchara E., Yamaguchi R.,
Techangamsuwan S. (2013). Genotypic lineages and
restriction fragment length polymorphism of canine
distemper virus isolates in Thailand. Vet Microbiol. 166(12): 76-83.
RISULTATI
L’RT-PCR One Step ha mostrato per tutti i campioni in esame
il prodotto di amplificazione di 1110 bp atteso. L’RFLP ha
evidenziato un prodotto di digestione costituito da due differenti
bande di 816 bp e di 294 bp per il controllo positivo e per tutti
i ceppi vaccinali, eccetto che per il vaccino Vanguard 7, che
è rimasto non digerito (1110 bp) (Figura 1). Questo risultato è
determinato dalla mancanza nella sequenza nucleotidica del
380
381
PRIMO CASO DI FEBBRE CATARRALE MALIGNA IN UN CERVO PUDU (PUDU PUDA)
OSPITATO IN UN GIARDINO ZOOLOGICO
Modesto P.1, Biolatti C.1, Grattarola C.1, Varello K.1, Iulini B.1, Mandola M.L.1, Dondo A.1, Goria M.1, Rocca F.2, Acutis P.L.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna 148, 10154 Torino;
2
Parco Faunistico “La Torbiera”, Via Borgoticino 19, 28010 Agrate Conturbia (NO)
Keywords: CpHV-2, febbre catarrale maligna, Pudu puda
ABSTRACT
A male, six years old, pudu (Pudu puda) from a zoological
garden was submitted for postmortem examination
after sudden death. At necroscopy, non-suppurative
bronchopneumonia and degeneration of the liver were
observed. Hemorrhagic lesions of the thymus, pericardium
and spleen were found.
Microscopically, multifocal perivascular and periglomerular
mononuclear cell accumulations were observed in the
kidneys and in the portal triads of the liver. Lungs and
spleen showed perivascular mononuclear cells infiltrates.
Histological examination of the brain revealed meningitis,
vasculitis and perivascular cuffs of mononuclear
inflammatory cells.
A real-time PCR was run in order to amplify a region of
DNA polymerase gene of malignant catarrhal fever (MCF)
viruses. Tissue samples showed PCR products that were
sequenced and analyzed. The sequences showed a 99%
homology with a portion of Caprine herpesvirus 2 DNA
polymerase gene.
This is the first report of MCF in a captive pudu.
INTRODUZIONE
I cervi pudu (Pudu puda) sono nativi delle foreste umide
del Cile e dell’Argentina (11). Appartengono al genere
Odocoilineae e sono considerati una specie vulnerabile
dall’International Union for Conservation of Nature (IUNC).
Sono conosciuti come i cervi più piccoli del mondo, poiché
il loro peso corporeo può variare da 5,8 a 12 kg (11).
In Europa i cervi pudu sono ospitati in alcuni giardini
zoologici. All’interno delle 26 istituzioni europee che
aderiscono all’International Species Information System
(ISIS) se ne contano attualmente 83 esemplari.
In letteratura non sono presenti molte informazioni sulle
malattie infettive che possono colpire questa specie. I lavori
più recenti riguardano un caso di setticemia provocata
da Arcanobacterium pyogenes conseguente a prolasso
uterino (9) e l’identificazione postmortem di un pestivirus
strettamente correlato al BVDV tipo 1B (8).
La febbre catarrale maligna (FCM) è una sindrome
linfoproliferativa dei ruminanti causata da un complesso di
virus appartenenti alla subfamiglia Gammaherpesvirinae,
genere Macavirus. All’interno del gruppo, sei virus sono
chiaramente associati a manifestazioni cliniche: ovine
herpesvirus-2 (OvHV-2), alcelaphine hervpesvirus-1
(AlHV-1), caprine herpesvirus-2 (CpHV-2), ibex malignant
catarrhal virus (MCFV-ibex), alcelaphine herpes virus2-like virus e un virus di origine sconosciuta in grado di
causare tale patologia nel cervo dalla coda bianca (MCFVWTD) (2).
Nel 2001 il CpHV-2 è stato isolato in capre asintomatiche
(5) e, negli anni successivi, è stato riconosciuto come
causa di malattia in animali selvatici (cervi dalla coda
bianca, alci e caprioli), sika e bufali d’acqua (1, 3, 4, 6, 10).
Scopo della comunicazione è descrivere il primo caso di
FCM provocata da CpHV-2 in un cervo pudu.
MATERIALI E METODI
Un cervo pudu maschio, di sei anni, proveniente da un
giardino zoologico piemontese, è stato inviato all’Istituto
d’Aosta per accertamenti diagnostici in seguito a morte
improvvisa.
L’animale è stato sottoposto a necroscopia completa e
come da protocollo necroscopico sono stati prelevati
encefalo, polmone, cuore, milza, lingua, linfonodi, fegato,
intestino e rene; inoltre si è provveduto al prelievo di
porzioni di organi che mostravano lesioni macroscopiche.
Tutti i tessuti sono stati conservati sia in formalina al 10%
sia in congelatore a
-80°C.
Per l’esecuzione dell’esame istologico, le porzioni di
encefalo e di organo fissate sono state incluse in paraffina,
tagliate in sezioni di 4±2μm di spessore e sottoposte alla
colorazione Ematossilina-Eosina.
Sono stati eseguiti test per la ricerca di Salmonella spp,
Listeria spp, Clostridium spp (mediante esami colturali),
Rickettsia spp, Coxiella burnetii, Borrelia burgdorferi s.1,
Leptospira spp, BVD, Border Disease, IBR, Blue Tongue,
Aujeszky, Tick-Borne Encephalitis, WNV, Epizootic
Hemorrhagic Disease e FCM (mediante PCR). Un esame
tossicologico (GC-MS) è stato eseguito su fegato e rene.
Il DNA usato per le metodiche molecolari, è stato estratto
dai campioni di organo mediante il kit Pure LinkTM Genomic
DNA Mini Kit (Invitrogen).
Per la diagnosi di FCM, è stata condotta una Real Time
PCR mediante utilizzo di FastStart Universal SYBR Green
Master (Roche) in un volume di reazione pari a 25 µl,
utilizzando primer in grado di amplificare una regione del
gene della DNA polimerasi dei seguenti virus: OvHV-2,
AlHV-1, CpHV-2, MCFV-ibex e MCFV-WTD (2). I prodotti
della PCR sono stati sequenziati e analizzati tramite ABI
3130 Genetic Analyzer. Le sequenze sono state comparate
con quelle disponibili in GenBank, mediante l’utilizzo del
programma BLAST.
Sono stati, inoltre, prelevati campioni di sangue intero,
tamponi nasali e buccali da due capre ospitate nel giardino
382
zoologico di origine del cervo pudu. Tutti i campioni
sono stati trattati, analizzati e conservati seguendo il
procedimento descritto in precedenza.
All’esame esterno il cervo pudu si presentava in buono
stato di nutrizione e non erano evidenti lesioni cutanee.
La necroscopia ha rivelato emorragie timiche, petecchie
ed ecchimosi a livello cardiaco e splenico e degenerazione
epatica e renale. Era inoltre evidente una broncopolmonite
non purulenta bilaterale che interessava i lobi diaframmatici
e intermedi.
Istologicamente, l’encefalo presentava, in tutte le aree
osservate, meningite, vasculite e manicotti perivascolari
caratterizzati dalla presenza di cellule mononucleate. Si
apprezzavano noduli gliali con proliferazione di rod cells
e neuronofagia. Il polmone presentava diffusa dilatazione
dei capillari alveolari e vasali conseguente a congestione;
si osservava inoltre moderato infiltrato mononucleato nelle
zone peribronchiali e peribronchiolari. Lo stesso tipo di
infiltrato era visibile in foci multipli a livello periarteriolare
splenico e della triade portale epatica. Era presente
moderata splenite granulomatosa, mentre i linfonodi
presentavano marcata proliferazione linfoblastica a livello
parafollicolare e dei seni midollari, associata a emorragie
focali. In corticale renale era evidente un massivo infiltrato
a prevalente localizzazione periglomerulare e perivasale
riferibile a nefrite interstiziale non suppurativa.
I test eseguiti per la ricerca di Salmonella spp, Listeria spp,
Clostridium spp, Rickettsia spp, Coxiella burnetii, Borrelia
burgdorferi s.l, Leptospira spp, BVD, Border Disease,
WNV, IBR, Blue Tongue, Aujeszky, Tick-Borne Encephalitis
ed Epizootic Hemorrhagic Disease sono risultati negativi.
La PCR condotta per la diagnosi di FCM ha dato risultato
positivo nei seguenti organi: polmone, rene, milza,
encefalo, lingua e intestino tenue. Le sequenze ottenute
dai prodotti PCR hanno mostrato un’omologia del 99% con
una porzione del gene della DNA polimerasi del CpHV-2
(AF283477).
La PCR condotta sul DNA, estratto dal sangue e dai tamponi
nasali e buccali prelevati dalle due capre appartenenti al
giardino zoologico dove era ospitato il cervo pudu, non ha
prodotto amplificati riconducibili al CpHV-2.
Secondo gli autori, questo è il primo caso di FCM, causata
da CpHV-2, descritto in un cervo pudu.
Tale agente patogeno sembra essere endemico nelle capre
ed è stato associato a FCM in diverse specie di cervidi (1, 3,
5, 6, 10). Nei casi riportati in precedenza, la sintomatologia
clinica risultava evidente: anoressia, dimagrimento
progressivo, febbre, lesioni cutanee, dispnea, diarrea,
alterazioni neurologiche, sanguinamento nasale, vaginale
e rettale (1, 3, 4, 6). Nel caso qui descritto, l’animale non
ha mostrato sintomi clinici.
Le lesioni macroscopiche e istologiche riscontrate nei
principali organi interni rispecchiano quanto riportato in
letteratura (1, 3, 4, 6, 10).
Tale variabilità nella presentazione clinica è tipica dei virus
che causano FCM. Essi, infatti tendono ad adattarsi molto
bene ad una singola specie di ruminanti, che ne diventa
portatrice asintomatica. Nel momento in cui infettano
un ospite appartenente a una specie diversa, si può
manifestare un quadro iperacuto, cronico o subclinico (1).
Il CpHV-2 è stato causa di morte in 5 sika (Cervus nippon)
ospitati in due zoo degli USA (1, 4). In entrambi gli episodi,
l’origine dell’infezione è stata ricondotta alla convivenza di
questi animali con capre sane portatrici del virus, alloggiate
in enclosure adiacenti.
In questo caso non è stato possibile rilevare il CpHV2 dalle capre ospitate nello stesso giardino zoologico di
provenienza del cervo pudu e, quindi, individuare l’origine
del virus. Secondo quanto riportato dal proprietario,
occasionalmente, greggi di capre in transumanza si fermano,
per alcuni giorni, nei pascoli adiacenti alla struttura; pascoli
che vengono anche destinati alla produzione di fieno da
utilizzare nello zoo. Non è possibile escludere che l’origine
del virus sia da ricercare in tali animali. Infatti, sebbene la
trasmissione classica della FCM avvenga tramite contatto
diretto con soggetti portatori o in seguito alla loro presenza
nelle immediate vicinanze, alcuni autori ritengono sia
possibile la diffusione dell’agente patogeno attraverso
lunghe distanze, fino a 5 km. Gli stessi ipotizzano che i
principali fattori coinvolti siano la formazione di un aerosol,
il vento, la temperatura, l’umidità e la presenza di vettori
meccanici (7). Risulta, quindi, molto importante mantenere
una separazione, all’interno dei giardini zoologici tra le
capre, eventuali portatrici asintomatiche del virus, e tutti i
ruminanti selvatici che possono essere suscettibili. Inoltre,
le norme di biosicurezza dovrebbero garantire il maggiore
isolamento possibile degli animali ospitati da tutto ciò che
può essere un vettore indiretto di malattia.
Il soggetto deceduto condivideva l’enclosure con un altro
conspecifico, che non ha mai mostrato sintomi e risulta
essere tutt’ora in buona salute. Si è scelto di non eseguire
approfondimenti diagnostici su di esso, vista l’estrema
sensibilità che i cervi pudu dimostrano verso le manovre
di contenimento. Il fatto che il secondo animale non abbia
sviluppato FCM, conferma che nelle specie suscettibili,
ma non portatrici, il virus non si trasmette da soggetto a
soggetto (3).
In conclusione, il percorso di diagnosi differenziale, in
caso di morte di ruminanti esotici deve comprendere
CpHV-2,anche se non vi sono indicazioni cliniche di
FCM manifesta. Alla luce dei risultati ottenuti risulta
importante approfondire la ricerca della causa mortis
in questa categoria di animali, considerato che, spesso,
appartengono a specie minacciate di estinzione e il
valore genetico dei singoli soggetti risulta essere molto
importante.
Infine, è necessario che i responsabili della gestione sanitaria
dei giardini zoologici pongano attenzione crescente alla
prevenzione delle malattie infettive. La separazione delle
specie suscettibili da quelle eventualmente portatrici di
agenti patogeni e le più avanzate tecniche di biosicurezza
devono essere sempre correttamente implementate in tutti
gli zoo.
383
BIBLIOGRAFIA
1. Crawford T.-B., Li H., Rosenburg S.-R., Norhausen R.W., Garner M.-M. (2002) Mural folliculitis and alopecia
caused by infection with goat-associated malignant
catarrhal fever virus in two sika deer. Journal of the
American Veterinary Medical Association 221, 843-847.
2. Cunha C.-W., Otto L., Taus N.-S., Knowles D.-P., Li
H. (2009) Development of a multiplex real-time PCR
for detection and differentiation of malignant catarrhal
fever viruses in clinical samples. Journal of Clinical
Microbiology 47, 2586-2589.
3. Dettwiler M., Stahel A., Krüger S., Gerspach C., Braun U.,
Engels M., Hilbe M. (2011) A possible case of caprineassociated malignant catarrhal fever in a domestic
water buffalo (Bubalus bubalis) in Switzerland. BMC
Veterinary Research 7, 78.
4. Keel M.-K-, Patterson J.-G., Noon T.H, Bradley G.-A.,
Collins J.-K. (2003) Caprine herpesvirus-2 in association
with naturally occurring malignant catarrhal fever in
captive sika deer (Cervus nippon). Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation 15, 179-183.
5. Li H., Keller J., Knowles D.-P., Crawford T.-B. (2001)
Recognition of another member of the malignant catarrhal
fever virus group: an endemic gammaherpesvirus in
domestic goats. Journal of General Virology 82: 227232.
6. Li H., Wunschmann A., Keller J., Hall G., Crawford T.B. (2003) Caprine herpesvirus-2-associated malignant
catarrhal fever in a white tailed deer (Odocoileus
virginianus).
Journal
of
Veterinary
Diagnostic
Investigation 15, 46-49.
7. Li H., Karney G., O’Toole D., Crawford T.-B. (2008) Long
distance spread of malignant catarrhal fever virus from
feedlot lambs to ranch bison. The Canadian Veterinary
Journal 49, 183-185.
8. Pizarro-Lucero J., Celedon M.-O., Navarro C., Ortega
R., Gonzalez D. (2005) Indentification of a pestivirus
isolated from a free-ranging pudu (Pudu puda) in Chile.
The Veterinary Record 157, 292-294.
9. Twomey D.-F., Boon J.-D., Sayers G., Schock A. (2010)
Arcanobacter pyogenes septicemia in a southern pudu
(Pudu puda) following uterine prolapse. Journal of Zoo
and Wildlife Medicine 41, 158-160.
10. Vikøren T., Li H., Lillehaug A., Jonassen M.-C.,
Bockerman I., Handeland K. (2006) Malignant catarrhal
fever in free-ranging cervids associated with OvHV2 and CpHV-2 DNA. Journal of Wildlife Diseases 42,
797–807.
11. Weber M., Gonzalez S. Latin America deer diversity
and conservation: a review of status and distribution
(2003) Ecoscience 10, 443-454.
INDAGINE CONOSCITIVA SULLA DIFFUSIONE DI ALCUNI AGENTI ZOONOTICI
ALIMENTARI NEI CINGHIALI DELLA SARDEGNA CENTRO-ORIENTALE
Mulas M., Goddi L., Carusillo F., Lisai A., Bassu M., Sanna S., Fancello C., Pirino T., Cabras P.A., Bandino E.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna – Dipartimento Territoriale di Nuoro
Key words: wild boar, Yersinia enterocolitica, Salmonella sp
Abstract
Over three subsequent game season (2008-2011) wild boar fecal samples were collected in Nuoro area, in order to estimate
the presence of common pathogens such as Yersinia sp (246
samples), Salmonella (137 samples) and Escherichia coli O157
(72 samples) and tested by cultural methods. The main aim of
the present study was to evaluate the diffusion rate of some foodborne pathogens in wild boars from the area under investigation.
The detection rate of Yersinia enterocolitica, Salmonella sp and
Escherichia coli O157, was 27.64%, 0.72% and 0% respectively.
Introduzione
La condivisione di habitat naturali fra diverse specie selvatiche,
animali allevati e talvolta le stesse popolazioni umane, si presta alla diffusione di diverse patologie infettive fra le varie specie
presenti in un determinato territorio. Tra le patologie, oltre alla
Peste Suina Africana endemica in alcune aree della Sardegna,
la trichinellosi, presente dal 2005 in suini bradi di un territorio circoscritto della Provincia di Nuoro, l’echinococcosi-idatidosi ampiamente diffusa negli animali domestici e anche nella popolazione umana, rivestono particolare importanza alcune zoonosi di
natura batterica quali la Salmonella sp., la Yersinia enterocolitica
e E. coli O157. I casi di salmonellosi, principale responsabile di
tossinfezioni alimentari fino a qualche anno fa, hanno subito una
diminuzione del 5,4% tra il 2010 e il 2011 (fino al 38% se comparati con quelli del 2007), questo significativo trend negativo
è principalmente dovuto al successo dell’applicazione dei piani
di controllo sugli allevamenti avicoli (1). Il cinghiale può essere considerato un buon indicatore della presenza di Salmonella
nell’ambiente, considerata l’ampia distribuzione nel territorio e
la sua attitudine alimentare (2). Al genere Yersinia appartengono undici specie, tre delle quali sono patogene per l’uomo e gli
animali: Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis. Nei
paesi industrializzati, la maggior parte delle infezioni sono sostenute da Y. enterocolitica. (3). La Yersiniosi rappresenta la quarta causa di tossinfezione alimentare nell’uomo, e viene isolata
principalmente da carni suine (EFSA journal 2013). Gli E. coli
enteroemorragici in particolare E. coli O157, sono batteri produttori della Shiga- Toxina e causano diarrea, colite emorragica
e Sindrome Emolitico Uremica (4). Tale patogeno appartiene al
gruppo degli E. coli verocitotossici (VTEC) che rappresentano la
terza causa di tossinfezioni alimentari in Europa (1).
L’obiettivo del presente lavoro è di valutare il grado di diffusione
di alcune zoonosi emergenti (yersiniosi, E. coli verocitotossici,
salmonellosi) nei cinghiali della provincia di Nuoro e il loro eventuale ruolo di reservoir.
territorio interessato dalla nostra indagine. Almeno una persona
per compagnia di caccia, istruita in precedenza, in assenza del
veterinario provvedeva al prelievo dei campioni. I campioni con
la relativa scheda di accompagnamento, debitamente compilata
con l’indicazione in particolare della compagnia, della località di
abbattimento e dei dati relativi al cinghiale cacciato (età, sesso,
eventuale numero di feti ed i campioni prelevati), venivano riposti
in borse frigo per essere recapitati all’’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna.
Sono stati sottoposti ad esame colturale per la ricerca di Salmonella sp. n. 137 campioni di feci utilizzando la metodica ISO
6579: 2002: Amendment 1:2007-Annex D: Detection of Salmonella sp in animal faeces and in enviromental samples from the
primary production stage.
Per la ricerca di Yersinia enterocolitica sono stati esaminati n.
246 campioni di feci con metodo colturale utilizzando il seguente
protocollo:
- Pesare ca.10 gr. di feci in busta per stomacher e aggiungere 90
ml di brodo di arricchimento per Yersinia (Yersinia PSB Broth –
Biolife). Omogenare con lo stomacher per alcuni minuti;.
- Dispensare 10 ml di omogenato in provetta con tappo aerato e
mantenere in frigorifero per 5-7 giorni. Quindi inoculare 0.1 ml di
brodocoltura in una piastra di Agar CIN (Yersinia Selective Agar
Base - Oxoid); incubare a 30 ± 2°C in aerobiosi per 24 ore (più
24 ore supplementari, se necessario).
Le colonie rosse con alone sono da considerarsi sospette. Le
piastre negative vengono reincubate per altre 24 ore. L’identificazione delle colonie sospette viene eseguita con prove biochimiche e biomolecolari.
Per la ricerca di Escherichia coli O157 sono stati saggiati all’esame batteriologico n. 72 campioni di feci utilizzando la metodica
ISO 16654: 2001: Microbiology of food and animal feeding stuffs
– Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157.
Risultati
Dall’analisi delle schede di accompagnamento dei campioni è
stato possibile suddividere gli animali cacciati per classe d’età
(grafico 1) e per sesso (grafico 2).
Grafico 1
Materiali e metodi
Nel corso di tre campagne venatorie consecutive (2008-2011)
sono stati raccolti campioni di feci da cinghiali cacciati o trovati
morti in provincia di Nuoro e recapitati all’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna. Nelle giornate antecedenti la
data di apertura della caccia sono state organizzate delle riunioni con i responsabili delle compagnie di caccia operanti sul
384
385
Grafico 2
Nell’insieme delle tre annate sono risultati positivi all’esame
colturale per la ricerca di Salmonella sp., n. 10 campioni su
137 esaminati (0.72%).
Sono risultati positivi all’esame colturale per la ricerca di Yersinia enterocolitica n. 34 campioni di feci prelevati nell’ annata
2008-2009, n. 16 nell’annata 2009-2010 e n. 42 nell’annata
2010-2011, per un totale di 68 campioni positivi (27,64 %).
I campioni di feci dei cinghiali sono risultati tutti negativi alla
ricerca di Escherichia coli O157.
Conclusioni
La maggior parte dei patogeni responsabili di tossinfezioni alimentari ha origine zoonotica e costituisce un importante problema di sanità pubblica.
La positività per Salmonella spp., sebbene sporadica (0.72%),
riscontrata nei campioni di cinghiale conferma la possibilità che
questa specie possa rappresentare un reservoir di questo patogeno in un territorio dove sono presenti interazioni tra animali
domestici e selvatici.
La diffusione di Y. enterocolitica fra gli animali riveste una notevole importanza nella catena epidemiologica delle malattie
umane, infatti i ceppi patogeni per l’ uomo, isolati sia da suini
che da pazienti umani, sono strettamente correlati da un punto
di vista geografico e risultano indistinguibili non solo con i normali metodi sierologici, biochimici e di tipizzazione fagica, ma
anche con analisi di biologia molecolare (5) L’uomo si infetta
consumando carni poco cotte, soprattutto di suino, che rappresenta il principale serbatoio animale del batterio, bevendo latte
crudo e acqua, venendo a contatto con gli animali portatori.
Dalla nostra indagine risulta che il 27,64 % dei campioni sono
positivi alla ricerca di Yersinia enterocolitica confermando l’importanza epidemiologica che il cinghiale può assumere nella
diffusione di questo microrganismo. Le modalità di eviscerazione non sempre corrette da parte dei cacciatori e i locali utilizzati
per la lavorazione delle carcasse, spesso garage o scantinati,
possono favorire la contaminazione dell’ambiente esterno e
delle carni stesse. Il cinghiale, insieme al maiale, può quindi
essere considerato un “serbatoio” di Yersinia enterocolitica nel
territorio e dovrebbe essere tenuto in considerazione nell’eventualità di un programma combinato di sorveglianza e controllo
delle zoonosi.
I cinghiali monitorati nella nostra indagine per il momento pare
non abbiano un ruolo di reservoir per l’ E. coli O157.
Le indagini riportate in questo lavoro rappresentano parte di un
progetto di ricerca corrente finanziato dal Ministero della salute
(RC IZSSA 05/07
Bibliografia
1. EFSA jurnal 2013. 11(4):3129) Scientifc report of EFSA
and ECDC: The European union summary report on trends and
sources of zoonoses, zoonotic agents and food born outbreaks
in 2011.
2. Chiari M., Zanoni M., Tagliabue S., Lavazza A., Alborali L.G. 2013. Salmonella serotypes in wild boars (Sus scrofa)
hunted in Northern Italy. ACTA Veterinary Scandinavica, 55:42
3. Barbieri Silvia, Bonardi Silvia. 2007. The role of pigs in the
epidemiology of Yersinia enterocolitica foodborne infection.
Ann. Fac. Medic. Vet. di Parma (Vol. XXVII, 2007) pag. 43 pag. 60.
4. Chekabab S.M., Paquine-Veillette J., Tozois C.M et Harel
J. 2013. The ecological habitat and transmission of Escherichia
coli O157:H7. FEMS Microbiology Letters vol. 340 29-01
5. Allegra A. M. 1 , Fezia G. 2 , Fontana E. 2 , Roceri M. 1 ,
Sommariva M. 2 , Tinelli F. 2003. Indagine sulla presenza di
Yersinia enterocolitica in suini macellati. Progresso veterinario
- 15 marzo 2003 - anno LVIII - N. 3
386
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI SALMONELLE ISOLATE IN ALIMENTI E
MANGIMI: INDAGINI PRELIMINARI
Napoli C., Cardamone C., Costa A., Piraino C., Vitale M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia “A. Mirri” Via G. Marinuzzi, 3 – 90129 Palermo
Key words: Salmonella, Food safety, RFLP.
SUMMARY
Salmonella spp are the main bacteria involved in food borne
diseases world wide. European surveillance plans are active
to control infection in human beings and livestock.To discriminate among isolates of Salmonella characterized by classical
methods a preliminary assay by RFLP has been performed.
Our samples was five isolates from food preparations and four
isolates from feed. A DNA fragment has been amplified in the
region of the small ribosomal RNA locus with conserved primers. The amplified fragment was subsequently restricted with
frequent cutter restriction enzymes to evaluate the possibility
of discriminating among different isolates. Only one enzyme
showed different restriction patterns among the isolates.
INTRODUZIONE
Le infezioni da Salmonella rappresentano la principale causa
di malattia di origine alimentare e un importante problema
di sanità pubblica, sia per l’elevata morbosità sia per il peso
economico che esse comportano (6). Per controllare le
infezioni trasmesse da alimenti, l’Unione Europea è intervenuta
adottando un approccio integrato alla sicurezza alimentare che
interessa l’intera filiera, dall’azienda agricola alla tavola. L’UE,
considerando prioritario il rischio di Salmonella, ha istituito
dal 2003 misure di controllo ad ampio spettro per le zoonosi
(3),ed in particolare, sono stati attuati programmi potenziati di
controllo di Salmonella nel pollame con il regolamento 2160
/2003 e s. m., in tutti gli Stati membri dell’UE (4).
Per ridurre il rischio di diffusione e trasmissione negli animali,
l’UE ha inoltre emesso il regolamento CE n° 183 /2005
riguardante l’igiene dei mangimi. In Italia ed in Europa, i
sierotipi di Salmonella enterica considerati maggiormente
pericolosi per la salute pubblica, sono S. enteritidis, S.
typhymurium e la variante monofasica di S.typhimurium (S:4,
[5],12:i:-) (2). Esistono Salmonelle specie specifiche come
S. gallinarum e S. pullorum presenti negli avicoli o ancora S.
dublin, S. cholerae suis, S. abortus equi, riscontrabili in altri
animali, che non hanno valenza patologica. Le salmonelle non
adattate all’ospite di contro, come S. typhimurium, la variante
monofasica, S. enteritidis, S. heidelberg, S. anatum, S.
infantis, S. hadar, S. virchow, etc. sono in grado di colonizzare
l’intestino di varie specie, contaminare l’ambiente, alimenti,
mangimi e di provocare nell’uomo forme morbose di gravità
variabile. La loro pericolosità, comunque, dipende molto dalla
carica microbica presente nelle varie matrici alimentari e non.
Inoltre non tutti i sierotipi sono virulenti per l’uomo e, nell’ambito dello stesso sierotipo, esistono differenze.
Le indagini basate sulla tipizzazione fagica e metodiche molecolari, hanno evidenziato come la patogenicità nei batteri sia
strettamente correlata sia al corredo genetico cromosomale,
ma che a elementi extra-cromosomali, come plasmidi ed isole
di patogenicità, che possono essere scambiati attraverso trasferimento genico orizzontale. Si è evidenziato, come alcuni
ceppi di Salmonella possiedono determinati geni pericolosi
per la salute, mentre altri ceppi
ne sono privi pur appartenendo sierologicamente allo stesso
sierotipo, ad esempio alla stessa S. typhimurium.
Questi geni responsabili della patogenicità delle Salmonelle,
sono presenti in plasmidi ( Salmonella Virulence PlasmidsSVPs) o nel cromosoma batterico, raggruppati in zone definite
isole di patogenicità (Salmonella Pathogenicity Islands)
(1).La presenza di plasmidi responsabili della virulenza
è stata ampiamente dimostrata in sierotipi di S. enteritidis,
typhimurium, dublin, cholerae-suis, infantis, panama,
heidelberg isolati da organi di animali infetti o dal sangue di
pazienti, mentre analoghi sierotipi provenienti da feci, alimenti
o ambiente, avevano solo alcune parti degli stessi plasmidi.
E’ convinzione di vari autori che le Salmonelle si sono evolute
in tempi relativamente recenti e abbiano potuto acquisire
larghi frammenti di DNA, da altri batteri per trasmissione
genetica orizzontale, acquisendo in alcuni casi nuovi caratteri
patogenici .
Obiettivo del lavoro, è la subtipizzazione dei ceppi di
Salmonelle isolate in alimenti e mangimi attraverso metodiche
molecolari di caratterizzazione più discriminanti, al fine di
effettuare uno studio delle stesse per la determinazione di
profili genetici di virulenza dei ceppi isolati.
MATERIALI E METODI
Nel periodo che va dal gennaio 2012 a giugno 2013, sono stati
esaminati presso i laboratori dell’area microbiologia alimenti
dell’istituto zooprofilattico, di Palermo, un numero totale di 717
campioni di matrici alimentari di origine animale e di mangimi
per la ricerca di Salmonella. Del totale dei campioni esaminati,
sono risultati positivi 5 campioni di alimenti di origine animale e
3 campioni di mangimi. L’esame colturale e l’identificazione di
Salmonella spp., è stato effettuato seguendo il protocollo ISO
6579, utilizzando terreni selettivi xylose–lysinedesoxycholate
XLD e Green Brilliant agar BGA. Le colonie sospette, sono state
identificate mediante test biochimici (API 20 E ). I ceppi sono
stati sierotipizzati con il metodo di agglutinazione secondo lo
schema di Kauffmann-White (5) attraverso la caratterizzazione
degli antigeni somatici (O) e flagellari(H). Sono stati utilizzati
antisieri della Statens Serum Institut Biogenetic, Difco (USA)
e Biorad. Quindi per la differenziazione di subspecie, sono
state eseguite le prove biochimiche in macrometodo.
Analisi Molecolari: E’ stata messa a punto una PCR con
target genico all’interno del locus per l’RNA ribosomale nella
zona del 16 S con I seguenti primers:
5′-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3′
U forward
U reverse 5′-ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC-3′
L’amplificato è stato poi saggiato con diversi enzimi di
restrizione, per valutare se i pattern di digestione distinguevano
i vari isolati. Sono stati usati i seguenti enzimi di restriziopne
Alu I, Mse I, Rsa I e Hinf I.
387
RISULTATI
Durante il periodo sopracitato, dei 717 campioni esaminati,
sono risultati positivi 5 campioni di origine alimentare, e 3 di
mangimi. Le Salmonelle isolate, come si può evincere dai dati
riportati in tabella 1, appartengono a diversi sierotipi. Inoltre, in
uno dei mangimi, sono stati isolati due sierotipi diversi di Salmonelle. I sierotipi isolati negli alimenti, sono riconducibili tutti
a specie non specifiche, adattabili a vari tipi di ospiti, e quindi
potenzialmente pericolose anche per l’uomo. Queste specie di
Salmonelle, circolano liberamente fra vari tipi di ospiti secondo
il seguente schema:
Animale →Uomo→ Ambiente
Come evidenziato in Tabella 1, tra i campioni a matrice
alimentare, risultati positivi , si è riscontrata S.typhimurium in
kebab di pollo e tacchino surgelato, S.enteritidis in quaglie,
S.infantis nelle uova, S. derby in “stigghiole”( preparato tipico
siciliano con le budella di agnello) e S. thompson in carne
panata di pollo.
Nei mangimi sono stati isolate S. cubana, S. mbandaka,
Salmonella gruppo E4 (non sierotipiz.) e S. montevideo tutte
riscontrate in mangimi di provenienza Argentina.
Tabella 1 : isolati di Salmonella e relative fonti
Salmonella
Ceppo
Matrice
Tipologia osa
Provenienza /
produzione
S. enteritidis
N°1
Kebab di pollo
Kebab di
tacchino
Friggitoria
Kobierno (Polonia)
ditta distributrice
Italiana
S. infantis
N°2
Uova
Azienda
avicola
Marsala (TP) Italy
S. typhimurium
N°3
Quaglie
Discount
Azienda produttrice
preparazioni carne
anche avicole
Italy
S.derby
N°4
Stigghiole
Distribuzione
all’ingrosso
Azienda produttrice
preparazioni carne
anche avicole
Canicattì (AG) Italy
S.thompson
N°5
Carne di pollo
panata
Self Service
Azienda produttrice
preparazioni carne
anche avicole (Teramo) Italy
S.cubana
N°6
Farina di soia
Mangimificio
Bunge Argentina
S.mbandaka
N° 7
Farina di soia
Mangimificio
Bunge Argentina
Salmonella
gruppo E4
(non sierotipiz.
N° 8
Farina di soia
Mangimificio
Bunge Argentina
S.montevideo
N°9
Farina di soia
Mangimificio
Bunge Argentina
Analisi Molecolari:
Figura 1: RFLP analisi sull’amplificato del 16S di Salmonella
Le Salmonelle studiate in questo lavoro, soprattutto quelle
isolate dai mangimi di provenienza estera, portano ad alcune
considerazioni di ordine epidemiologico, dal momento che
non può escludersi la possibilità del passaggio di elementi
di virulenza inter ed intra specie. Tale situazione, soprattutto
a fronte di un risanamento non efficace, potrebbe portare alla
comparsa, per fenomeni di adattamento, e/o trasmissione di
geni legati al potere patogeno, di un numero ancor più vasto
ed eterogeneo di eventuali ed ulteriori ceppi patogeni di
Samonella nel nostro territorio.
BIBLIOGRAFIA
1) de Parry CM, van der Poll T, Wiersinga WJ.:Hostpathogen interaction in invasive Salmonellosis. PLoS Pathog. 2012;8(10):
2) Dionisi A.M., Feliciti E., Ocwzarek S., Arena S., Bene-
Figura 1: Alu I mostra lo stesso pattern in tutti i 9 isolati : con
Hinf I si possono fare distinguere i seguenti gruppi per pattern
di restrizione:
1 (S. enteritidis) , 2 (S.infantis) e 3 (S.typhimurium )
4 (S. derby, 5 S. thompson, e 8 Salmonella gruppo E4
6 (S.cubana)e 7 (S. mbandaka)
Nella linea 9 si evidenzia un pattern specifico per
S.montevideo.
CONCLUSIONI
Le varie specie di Salmonella, oggetto di studio, sono state
isolate tutte da matrici alimentari di origine aviare tranne che
per S. derby isolata da “stigghiole”( preparato tipico siciliano
con le budella di agnello). Queste “stigghiole” comunque, provenivano da un’ azienda dove si producono anche preparati
di carne avicola. Come è noto, la carne di pollame, le uova e
altri prodotti avicoli sono stati ripetutamente riconosciuti come
la sorgente più frequente della salmonellosi umana di origine
alimentare in tutto il mondo.
Con l’analisi molecolare sono stati studiati i pattern di nove
ceppi di Salmonella indicate in tabella con i numeri da 1 a 9.
L’analisi dei pattern di RFLP con enzimi di restrizione che digerivano all’interno dell’amplificato, ha mostrato che solo con
HinfI si ottenevano pattern di restrizione differenti per alcune
salmonelle (fig. 1). Così come si evince dalla figura che riporta
i pattern di restrizione degli enzimi Alu I e Hinf I. Con Hinf I, si
hanno gruppi di pattern comuni a 2 o più isolati di salmonelle
ed un pattern unico per S. montevideo . Il pattern di restrizione di Hinf I, evidenzia una variabilità maggiore soprattutto a
livello delle Salmonelle isolate dai mangimi, che potrebbero
indicare una maggiore variabilità in questo tipo di salmonella
di provenienza ambientale a livello del locus del DNA ribosomale. Questo dato, considerato però il ristretto numero di isolati, deve sicuramente essere implementato con altre indagini
su un numero maggiore di ceppi al fine di potere valutare se
le differenze sono significative. Verranno effettuate ulteriori indagini su altri loci genetici, caratterizzazioni di eventuali
plasmidi presenti, che insieme alla caratterizzazione fagica
in comparazione con ceppi di riferimento saranno utili per indagini di tipo epidemiologico molecolare. Tale studio, sarà utilizzato per evidenziare caratteristiche genetiche di virulenza
fra isolati di provenienza geografica o di matrice diversa.
Con l’apertura delle frontiere commerciali con l’estero,
la circolazione delle Salmonelle aumenta e nuove specie
possono circolare sul nostro territorio.
388
389
dettiI., Lucarelli C., Luzzi I., Scavia G., Minelli F., Ciaravino G., Marziano M.L., Caprioli A., e i Laboratori rete Enternet Italia(2011). Notiziario dell’Istituto Superiore di Sanità,
24 (1). ENTER-NET: sorveglianza delle infezioni trasmesse da alimenti e acqua. Rapporto dell’attività 2007-2009.
3). Direttiva 2003/99/CE del 17 novembre 2003 sulle misure di sorveglianza delle zoonosi e degli agenti zoonotici.
G.U.C.E. 12.12.03, L. 325, 31-37.
4) Regolamento (CE) 2160 /2003 sul controllo della salmonella e di altri agenti zoonotici specifici presenti negli
alimenti. G.U.C.E. 12.12.03, L. 325/1
5) Popoff M. Y., Le Minor L. (2007). Schema di KauffmannWhite. Antigenic formulas of the Salmonella serovars.
WHO. 9thEdition.
6) The European Union Summary Report on Trends and
Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents and in foodBorne Outbreacks in 2010 EFSA Journal2012;10(3):2597
INFEZIONE DA BOVINE PAPILLOMAVIRUS: DIAGNOSI MOLECOLARE E
CARATTERIZZAZIONE DEGLI STIPITI IN CAMPIONI CUTANEI
Nappi R., Ferraro G., Miceli I., Meistro S., Callipo M.R., Crescio I., Varello K., Goria M.
Key words: BPV, Papilloma, PCR
SUMMARY
Bovine papillomaviruses (BPVs )are DNA oncogenic viruses
responsible for cattle papillomas and play a major role in the
pathogenesis of equine sarcoid. Our aim is to investigate by
PCR the presence of BPVs in 52 biopsy samples, collected
between 2011-2012 and previously confirmed histologically
as papillomas. We carried out 2 different PCR targeted to
recognize Subgroup A (BPV-1, BPV-2, BPV-5) and Subgroup
B viruses (BPV-3, BPV-4, BPV-6). BPV DNA was found in 64%
of biopsy specimens, including a donkey sample. All positive
samples were found by using BPV subgroup A-specific primer
sets. BPV subgroup B-specific DNA was not detected in any
of the samples. Preliminary results suggest a wide-spread
occurrence of BPV subgroup A. Subgroup A includes the most
pathogenic BPV viruses for cattle and infect other species. This
seems to be confirmed by the positive result obtained in the
donkey.
INTRODUZIONE
Bovine papilloma virus (BPVs) sono un gruppo di virus a
DNA diffusi in tutto il mondo appartenenti alla famiglia dei
Papillomaviridae. I BPVs infettano comunemente il bovino,
tuttavia in particolari condizioni l’infezione può essere
trasmessa agli equidi (2). Sei BPV sottotipi (BPV 1-6) sono stati
caratterizzati e associati a diversi tipi di lesioni istopatologiche.
Questi differenti sei genotipi sono stati classificati in tre gruppi:
- Xi-papillomavirus che include i BPV-3, BPV-4 e BPV-6 che
infettano i cheratinociti causando dei papillomi squamosi
epiteliali.
- Delta-papillomavirus che include i BPV-1 e BPV-2 associati
a fibropapillomi che coinvolgono sia l’epitelio che il derma
sottostante. Entrambi i genotipi presentano una specificità
d’infezione in quanto BPV-1 presenta un tropismo per le
aree paragenitali, quali pene , capezzoli e mammella, mentre
BPV-2 infetta la pelle. In particolari condizioni immunologiche
dell’ospite, entrambi i genotipi (in particolare BPV2), possono
infettare il tratto alimentare e la vescica urinaria ed esitare in
neoplasie maligne. Infine questi genotipi sono stati associati al
sarcoide equino in cavalli e asini (3).
- Epsilon-papillomavirus che ha come unico membro il BPV5 che presenta un genoma simile a quello degli altri due
gruppi. Il BPV-5 è responsabile della formazione di lesioni a
livello dei capezzoli e mammelle e può causare dei papillomi o
fibropapillomi.
Sulla base dell’attività biologica e sulle similarità genotipiche
i BPVs possono anche essere suddivisi in due sottogruppi:
sottogruppo A (BPV-1, BPV-2, BPV-5) e sottogruppo B (BPV-3,
BPV-4, BPV-6) come riportato da Jarrett et al, 1984 (4).
I bovini infetti di solito guariscono nell’arco di due anni e le lesioni
regrediscono nell’arco di 14 mesi, tuttavia occasionalmente le
lesioni possono evolvere in forme maligne. La malattia da BPV è
di notevole importanza per l’impatto economico nell’allevamento
colpito, a seguito della perdita della produzione lattea quando
l’infezione colpisce mammella e capezzolo.
l’analisi di sequenza, al fine della caratterizzazione e
classificazione dei BPVs nei rispettivi gruppi di appartenenza.
Questi studi permetteranno di chiarire i meccanismi d’infezione
ed eventuali differenti gradi di virulenza di ciascun sottotipo
virale, oltre a evidenziare la circolazione di possibili sottotipi di
BPVs non ancora classificati.
Figura 1: PCR sottogruppo A (BPV-1, BPV-2, BPV-5) e PCR
sottogruppo B (BPV-3, BPV-4, BPV-6)
In Italia l’incidenza dell’infezione da BPV non è stata
ben documentata. Scopo del presente lavoro è affinare il
protocollo diagnostico di laboratorio per BPV, affiancando
all’esame istologico, l’utilizzo di metodi biomolecolari per la
caratterizzazione di BPV a livello di sottogruppo A e B.
MATERIALI E METODI
Sono stati analizzati 52 campioni (51 bovini e un asino) presenti
in archivio presso i laboratori dell’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale di Torino e provenienti da allevamenti del
Piemonte, fissati in formalina al 10% e inclusi in paraffina,
raccolti tra il 2011-2012, precedentemente confermati all’esame
istologico come papillomi. Di questi per 5 casi è stato possibile
analizzare anche il tessuto fresco precedentemente stoccato
a -20°C.
Sono state messe a punto due tipi di PCR, una per il sottogruppo
A (BPV-1, BPV-2, BPV-5) e sottogruppo B (BPV-3, BPV-4, BPV6). I metodi si basano rispettivamente sul rilievo delle regioni
conservate del gene L1, per ciascuna delle quali sono state
disegnate una coppia di primers e definito un profilo termico di
amplificazione (5). L’estrazione dai tessuti fissati e paraffinati e
da tessuti freschi è stata eseguita utilizzando kit del commercio
(rispettivamente Qiagen e GE Healthcare).
DNA specifico di BPV è stato rilevato in circa 64% dei campioni
inclusi in paraffina esaminati e in tutti campioni di tessuto. La
banda positiva di DNA (circa 443bp) è stata rilevata solo con
la PCR sottogruppo A , specifica per i sottotipi BPV-1, BPV-2,
BPV-5. Invece nessun campione analizzato è risultato positivo
alla PCR sottogruppo B, specifica per BPV-3, BPV-4, BPV-6
(Figura 1).
L’unico campione prelevato da asino è risultato positivo
alla PCR sottogruppo A, evidenziando il salto di specie per i
sottotipi virali BPV 1 e BPV 2. La negatività dei campioni inclusi
in paraffina potrebbe essere riconducibile alla degradazione
del DNA a seguito dei processi di fissazione, inclusione e dello
stato di conservazione del campione. Tale ipotesi è supportata
dal confronto delle PCR dei medesimi campioni analizzati sia
da tessuto sia da blocchetti in paraffina, nei quali si evidenzia
un segnale decisamente più debole per i campioni inclusi in
paraffina (figura 2). Inoltre, un unico campione è risultato
positivo all’analisi PCR da fresco e negativo da blocchetto in
paraffina.
L’utilizzo combinato dei due metodi PCR permette di
diagnosticare un’elevata percentuale di casi di infezione da
BPV. Dai risultati tre tipi di BPVs sono stati evidenziati nel
campione di studio. Tra questi BPV 1 e BPV 2 sono considerati
tra i papilloma virus a elevato grado di virulenza, inoltre sono
comunemente associati al tumore urinario della vescica. Infine
questi genotipi sono stati riconosciuti come tra i più importanti
fattori eziologici per lo sviluppo del sarcoide equino (1).
Ulteriori studi sono comunque necessari sia per aumentare il
campione di studio sia per la conferma dei positivi attraverso
390
Figura 2: PCR Sottogruppo A: In alto l’intensità di segnale
ottenuta da tessuto fresco;in basso l’intensità di segnale dei
medesimi campioni da blocchetti in paraffina
1
2
3
4
5
CR+ CR-
5
CR+ CR-
BPV
Sottogruppo A
fresco
1
21 3
4
BPV
Sottogruppo A
paraffina
391
BIBLIOGRAFIA
1.Bogaert L, Martens A, Van Poucke M, Ducatelle R, De
Cock H, Dewulf J, De Baere C, Peelman L, Gasthuys F,
2008. High prevalence of bovine papillomaviral DNA in
the normal skin of equine sarcoid-affected and healthy
horses.Vet Microbiol. 25;129(1-2):58-68.
2. Campo MS, 2006. Bovine papillomavirus: old system,
new lessons? Papillomavirus research from natural
history to vaccines and beyond. Caister Academic
Press, Norfolk: 373-383.
3.Chambers G, Ellsmore VA, O’Brien PM, Reid SW, Love
S, Campo MS, Nasir L., 2003. Association of bovine
papillomavirus with the equine sarcoid. Virus Res.; 96
(1-2):141-145.
4.Jarrett WF, Campo MS, O’Neil BW, Laird HM, Coggins
LW., 1984. A novel bovine papillomavirus (BPV-6)
causing true epithelial papillomas of the mammary
gland skin: a member of a proposed new BPV
subgroup. Virology. 30;136(2):255-264.
5.Maeda Y, Shibahara T, Wada Y, Kadota K, Kanno
T, Uchida I, Hatama S., 2007. An outbreak of teat
papillomatosis in cattle caused by bovine papilloma
virus (BPV) type 6 and unclassified BPVs. Vet
Microbiol. 15;121(3-4):242-248.
TSE A CUNEO: UNA STORIA LUNGA 12 ANNI
Nardella M.C.1, Marrone L.1, Marongiu L.1, Grindatto A.1, Careddu M.E.1, Biolatti P.G.1, Pistone G.1
1
Figura 1: numero di campioni BSE processati per anno. I
diversi colori rappresentano la variazione dell’età diagnostica
degli animali sottoposti a sorveglianza attiva.
Personale stabilizzato nel 2008
Circa il 30% del personale precario impiegato tra il 2001 ed il
2008 è stato stabilizzato nella sezione di Cuneo continuando,
fino al 2013, ad occuparsi della ricerca delle TSE nei bovini e
negli ovicaprini.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta - Sezione di Cuneo
Tabella 5: Personale stabilizzato
Keywords: TSE, BSE, active surveillance
SUMMARY
Rapid Test laboratories active surveillance started in 2001.
From 2001 to June 2013, 356.000 samples were analysed
by the TSE Laboratory in Cuneo of Istitute Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (IZSPLV).
In these years four different diagnostic rapid tests were used.
The large amount of analyses resulted in the employment of
various professional figures. The increase of both diagnostic
facilities and human resources resulted in an improvement of
the visibility and of the territorial importance of Cuneo Istitute
and of the whole IZSPLV.
INTRODUZIONE
A più di 20 anni dall’esplosione, prima negli animali e poi
nell’uomo, dell’emergenza BSE in Europa, il numero dei casi
diagnosticati nella specie bovina si è progressivamente ridotto.
Fondamentale per questo obiettivo è stata la coralità della
risposta a livello di UE con il bando delle farine di origine animale
dall’alimentazione dei ruminanti in produzione zootecnica, con
l’individuazione ed esclusione dal consumo dei Materiali a
Rischio Specifico, con lo sviluppo di un sistema di tracciabilità
a livello europeo e soprattutto con l’armonizzazione del sistema
di controllo. A tale fine è risultato fondamentale il contributo
della rete degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali che, a partire
dal 2001, sono stati protagonisti dell’applicazione del sistema
di sorveglianza attiva nel cui ambito sono stati analizzati più
di 7 milioni di campioni su tutto il territorio nazionale. I dati
epidemiologici scaturiti dall’attività diagnostica hanno condotto
alla Decisione 2013/76 (1) che ha ridimensionato l’attività di
sorveglianza. In seguito a questa decisione il Laboratorio BSE
della Sezione di Cuneo dell’IZSPLV ha cessato la propria
attività. Scopo di questo lavoro è analizzare l’attività del
laboratorio BSE nel periodo dal 2001 a giugno 2013.
MATERIALI E METODI
Campioni
Dal febbraio 2001 a giugno 2013 nel laboratorio della sezione di
Cuneo dell’IZSPLV sono stati analizzati circa 356.000 campioni
per la ricerca di encefalopatia spongiforme trasmissibile. Nella
seguente tabella è riportato il numero di campioni esaminati per
anno e per specie.
Tabella 1: Campioni esaminati nel periodo 2001-2013
ANNO
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
GIU- 2013
TOTALE
Test utilizzati
N. CAMP BSE
14407
28097
27420
38220
30632
31447
28634
30683
30982
33908
27769
18962
10213
351374
N. CAMP SCRAPIE
n.e.
71
158
177
292
814
1068
591
262
0
28
518
203
4182
Nell’ambito dell’attività di sorveglianza sono stati utilizzati
diversi test diagnostici, riportati nella tabella sottostante.
CATEGORIA
Tabella 2: Test utilizzati
TIPO DI TEST
DITTA
PRODUTTRICE
ANNI UTILIZZO
WESTERN BLOT
PRIONICS
DA 02/2001 A 09/2004
ELISA
BIORAD
DA 10/2004 A 09/2008
IMMUNOCROMATOGRAFICO
PRIONICS
DA 10/2008 A 02/2011
ELISA
IDEXX
DA 03/2001 A 06/2013
SCRAPIE
Per quanto riguarda la SCRAPIE il picco di esami effettuati
si è registrato nel 2007 come è illustrato in Figura 2. Gli ovini
e i caprini con età maggiore di 18 mesi o con due incisivi
permanenti già spuntati vengono tuttora sottoposti a esame
presso il Centro di Referenza per le Encefalopatie Spongiformi
Trasmissibili di Torino.
Figura 2: numero di campioni Scrapie processati per anno.
VETERINARIO
4
TECNICO DI LABOR.
21
AMMINISTRATIVO/
OPERATORE TECNICO
8
392
4
2
21
6
AMMINISTRATIVO/
OPERATORE TECNICO
8
2
L’attività di sorveglianza attiva e la raccolta di dati epidemiologici
hanno portato un incremento delle risorse umane e strumentali
con conseguente aumento del valore economico della sezione
di Cuneo.
Inoltre, l’efficacia nell’azione di sorveglianza per le TSE non
solo ha contribuito alla protezione dei consumatori, ma ha
anche portato all’aumento della visibilità e del prestigio della
sezione e dell’ente sul territorio.
2. Regolamento CE 999/2001 e s.m ed i.
Durante il periodo di sorveglianza attiva (2001/2013) sono
stati accertati un caso di bovino affetto da BSE nel 2005 e un
caso di BASE (Bovine Amyloid Spongiform Encephalopathy),
forma atipica caratterizzata dalla deposizione di amiloide (3)
nel 2007. Sono stati inoltre diagnosticati 2 casi di Scrapie tra
gli ovicaprini nel 2008 e nel 2009.
3. Casalone C, Zanusso G, Acutis P, Ferrari S, Capucci L,
Tagliavini F, Monaco S, Caramelli M. (2004). Identification of
a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy:
molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2;101(9):3065-70
Tabella 4: Casi positivi accertati presso la sezione di Cuneo
BSE
L’analisi dei 351.374 campioni suddivisi per anni evidenzia
un picco degli esami effettuati per BSE nel 2004 ed un
progressivo calo negli anni successivi come si può
evidenziare nella Figura 1.
Tale calo è imputabile alla variazione, stabilita dal
Regolamento (CE) N. 999/2001 e successive modifiche
(2), dell’età degli animali sottoposti al test: dai 24 mesi
previsti nel 2001 si è progressivamente stabilito di testare,
per gli animali regolarmente macellati, soltanto gli animali
di età maggiore ai 30 mesi (2005), ai 48 mesi (2009)
fino ai 72 mesi (2011) allo scopo di diminuire i costi della
sorveglianza attiva.
Anche per quanto riguarda gli animali morti in stalla/
macellati d’urgenza nel 2009 l’età diagnostica è stata
innalzata da 24 a 48 mesi.
VETERINARIO
TECNICO DI LABOR.
1. Decisione 2013/ 76 UE
Tabella 3: Personale impiegato
NUMERO PERSONALE A TEMPO
DETERM.
NUMERO
STABILIZZATI
BIBLIOGRAFIA
Turnover Personale dal 2001 al 2008
Negli anni 2001-2008 è stato molto rilevante l’apporto di risorse
umane impegnate per l’emergenza BSE, tale da determinare
un aumento di circa il 30% di personale nella sezione di Cuneo,
La tipologia ed il numero di risorse umane impiegate nei 7 anni
è la seguente:
CATEGORIA
NUMERO
DATA
ETA’
(anni)
RAZZA
SEX
TEST
2005
12
piemontese
F
ELISABIORAD
Macellato
/
2007
14
piemontese
F
ELISABIORAD
Morto in
stalla
BASE
2008
3
meticcio
F
ELISABIORAD
Morto in
stalla
Focolaio
2009
6
biellese
F
WBPRIONICS
Morto in
stalla
Focolaio
BOVINI
OVINI
MOT.
NOTE
PRELIEVO
393
ESCHERICHIA COLI VTEC IN LATTE CRUDO OVI-CAPRINO PRODOTTO NEL
PROMONTORIO DEL GARGANO (PUGLIA)
Nobili G.1, Zippone V.1, Basanisi M.G.1, Normanno G.2, Nardella M.C.1, La Salandra G.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Via Manfredonia, 20 – 71121 Foggia
Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze agrarie, degli alimenti e dell’ambiente, Via Napoli 25 – 71122 Foggia
1
2
Key words: E. coli, VTEC, Real-time PCR
ABSTRACT
E. coli VTEC causes serious human illnesses, such as
hemorrhagic colitis (HC) and hemolytic uremic syndrome
(HUS). A number of studies have also reported outbreaks of
HC and HUS associated with consumption of milk and dairy
products. The aim of this work was to determine the presence
of virulence genes and verocytotoxin-producing Escherichia
coli (VTEC) strains in sheep and goat’s raw milk. In the period
between November 2011 and December 2012 were collected
and analyzed 43 samples from 37 farms in local farms (Gargano
- Foggia). The preliminary results of this study showed a
prevalence of 4.6% of samples contaminated with pathogenic
E. coli clones. Specifically, of 43 samples of sheep and goat’s
raw milk, 51.2% (22/43) were positive to at least one of virulence
genes (vtx1, vtx2, eae) and genes coding for serogroups
investigated, with microbiological confirmation in only 9.0% of
the samples screened positive (2/22). No VTEC strains were
isolated.
INTRODUZIONE
All’inizio degli anni ‘80 sono stati identificati ceppi di E. coli in
grado di elaborare una potente tossina simile a quella prodotta
da Shigella dysenteriae di tipo 1, capace di indurre effetto
citopatico su monostrati di cellule VERO; questi cloni sono stati
denominati E. coli verocitotossici (VTEC) o E. coli produttori di
tossine Shiga-like (STEC) (6).
L’infezione da VTEC costituisce un rilevante problema di
sanità pubblica perché può causare, oltre a forme di diarrea
non specifica, alcune patologie estremamente gravi: colite
emorragica e sindrome emolitico-uremico (SEU), colpendo
soprattutto bambini e anziani, anche come eventi epidemici.
La SEU si manifesta nel 5-10% dei casi come evoluzione della
colite emorragica.
La patogenicità dei ceppi VTEC è dovuta, non solo alla
produzione delle due citotossine, VT1 e VT2, codificate dai
geni batteriofagici stx1 e stx2, ma anche al prodotto proteico
del gene cromosomiale eae, che codifica per una proteina di
membrana, detta intimina (2, 8).
Il maggiore “reservoir” di VTEC è rappresentato dai ruminanti,
non solo bovini ma anche ovi-caprini, come confermato dai
numerosi dati riportati in letteratura, costituendo così la principale
fonte di infezione per l’uomo, per contatto diretto con l’animale
o per ingestione di carne o latte non trattati termicamente (7, 4).
In Italia le informazioni relative alle popolazioni di ruminanti
diverse dal bovino sono frammentarie per quanto riguarda la
presenza di cloni patogeni di E. coli e di VTEC non-O157 in
particolare.
La Puglia vanta un patrimonio ovino e caprino di 369.087 capi
distribuiti in 5869 allevamenti, di cui il 41% del patrimonio
(151.070 capi e 2.255 allevamenti) nella sola provincia di Foggia
(fonte OEV-IZS PB).
Il presente studio ha l’obiettivo di aggiornare le conoscenze
epidemiologiche riguardanti la presenza di varianti patogene
di E. coli, in particolare VTEC, in latte crudo ovi-caprino,
prodotto nel promontorio del Gargano (provincia di Foggia) e
approfondire la valutazione dei fattori di rischio.
MATERIALI E METODI
Nel periodo compreso tra Novembre 2011 e Dicembre 2012
sono stati analizzati 43 campioni di latte crudo di massa ovicaprino provenienti da 37 allevamenti presenti nel territorio del
Gargano (Foggia).
Per l’analisi dei campioni è stata utilizzata la metodica ISO-CEN
Technical Specification 13136:2011 (5).
I DNA estratti sono stati sottoposti a screening mediante Real
time PCR per il rilievo dei markers genetici di virulenza (eae,
stx1 e stx2), utilizzando come controllo positivo il ceppo E. coli
ATCC 43895 e come controllo negativo il ceppo E. coli ATCC
25922.
Sui campioni positivi per i geni indagati si è proceduto
all’identificazione dei sierogruppi O157, O111, O26, O145,
O103, O104, mediante Real time PCR, usando tecnologia
TaqMan per la ricerca dei sierogruppi citati.
Come previsto dal protocollo utilizzato (ISO/TS 13136:2011),
allo screening è seguita una fase di isolamento colturale e
successiva conferma degli isolati mediante Real-time PCR.
Relativamente al sierogruppo O104, è stato utilizzato il metodo
proposto dal UE RL per E. coli in Real-Time PCR qualitativa,
basato sulla ricerca dei geni wzx O104 e fliC H4, che codificano
rispettivamente per l’antigene somatico O e per l’antigene
flagellare H4 (3).
I campioni risultati positivi sono stati confermati con metodo
microbiologico (5). Come controlli positivi sono stati utilizzati i
ceppi forniti dall’EU RL VTEC, mentre come controllo negativo
è stato utilizzato il ceppo E. coli ATCC 25922.
Le infezioni a veicolo alimentare causate dai ceppi VTEC
rappresentano un importante capitolo della sicurezza
microbiologica degli alimenti in quanto possono provocare
malattie gravi.
Sebbene E. coli O157 sia ritenuto la causa predominante di
SEU a livello mondiale, il sierogruppo O26 sta emergendo come
il più comune ceppo non-O157 in grado di indurre patologie
nell’uomo, in Europa e negli Stati Uniti. In particolare nell’ambito
delle patologie causate da VTEC, le infezioni da E. coli O26 sono
sempre più frequentemente diagnosticate in Europa e in Italia (1).
I risultati preliminari di questo studio hanno evidenziato, che dei
43 campioni di latte di massa di origine ovi-caprino, il 51.2%
(22/43) è risultato positivo ad almeno uno dei geni di virulenza
(vtx1, vtx2, eae) e ai geni codificanti per i sierogruppi indagati;
tuttavia la conferma microbiologica si è avuta solo nel 9% dei
campioni positivi allo screening (2/22) e nel 4.6% dei campioni
analizzati (2/43).
394
Come mostrato in figura 1, dei 22 campioni positivi ai geni di
virulenza, 6 (6/22 27.3%) hanno mostrato positività ai tre geni
ricercati, 3 (3/22 13.6%) ai geni codificanti per entrambe le
verocitotossine (vtx1, vtx2), 5 (5/22 22.7%) ai geni vtx1 ed eae,
4 (4/22 18.2%) solo al gene vtx1, 1 (1/22 4.5%) solo al gene
vtx2; infine, 3 campioni (3/22 13.6%) sono risultati positivi solo
al gene eae.
L’analisi dei sierogruppi in Real time PCR ha mostrato che dei 22
campioni positivi 6 veicolano i geni codificanti per il sierogruppo
O157 (6/22, 27.3%), 4 per il sierogruppo O26 (4/22, 18%), 11
per il sierogruppo O103 (11/22, 50%) e 1 per il sierogruppo
O104 (1/22, 4.5%) (Figura 2). Nel caso del campione positivo
per il gene associato al sierogruppo O104, la negatività per il
gene fliC H4 e la contemporanea presenza del gene eae fanno
escludere che la positività sia dovuta alla presenza di un ceppo
di VTEC O104 simile a quello associato all’episodio epidemico
tedesco del 2011.
Figura 1. Campioni di latte crudo ovi-caprino risultati positivi
allo screening RT PCR per i geni vtx1, vtx2, eae.
6
4
2
0
Figura 2. Sierogruppi identificati mediante RT PCR dai
campioni di latte crudo ovi-caprino
Tabella 1. Caratterizzazione degli isolati mediante RT PCR
Screening
Campione
19 latte
ovino
23 latte
ovino
Conferma
(Isolamento + RT PCR)
Geni di
virulenza
(RT PCR)
Sierogruppi
(RT PCR)
Geni di
virulenza
(RT PCR)
Sierogruppi
(RT PCR)
vtx1, eae
O157, O26
eae
O26
vtx1, eae
O157, O103
eae
O1O3
I campioni confermati microbiologicamente evidenziano
la presenza di cloni di E. coli O26 e cloni di E. coli O103
entrambi positivi al gene eae (Tab.1); nonostante negli stessi
campioni fosse stata rilevata, con lo screening in Real time
PCR, Ia presenza dei geni vtx1 e del gene codificante per il
sierogruppo O157, non vi è stata alcuna conferma colturale a
questo reperto.
Pertanto, ai fini del controllo microbiologico degli alimenti e
per ottenere un numero maggiore di dati utile per l’analisi del
rischio, potrebbe essere necessario implementare tecniche
microbiologiche con più elevati livelli di sensibilità, in grado
di consentire l’isolamento dei patogeni anche in presenza di
basse cariche contaminanti.
Concludendo, dalla nostra indagine è emersa una notevole
diffusione di geni di virulenza nei campioni di latte crudo
presi in esame; tuttavia, il reale rischio alimentare risulta
difficile da stabilire poiché l’isolamento dei cloni dai campioni
positivi allo screening molecolare appare difficoltoso con i
protocolli disponibili. Ulteriori studi si rendono necessari per
meglio definire la prevalenza di ceppi VTEC e di altri agenti
di tossinfezione alimentare in latte ovi-caprino ed il loro
potenziale impatto sulla salute pubblica, anche alla luce dei
recenti casi di SEU registrati in Puglia.
BIBLIOGRAFIA
1.Bielaszewska M, Mellmann A, Bletz S, Zhang W, Köck
R, Kossow A, Prager R, Fruth A, Orth-Höller D, Marejková
M, Morabito S, Caprioli A, Piérard D, Smith G, Jenkins C,
Curová K, Karch H., 2013. Enterohemorrhagic Escherichia
coli O26:H11/H-: a new virulent clone emerges in Europe.
2.Caprioli A, Morabito S., Brugère H., Oswald E. 2005.
Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on
virulence and modes of transmission. Vet Res. 36(3):289311.
3.EU RL per E. Coli “Detection and identification of
Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O104:H4
in food by Real Time PCR” Method food 04 Rev 1
10/07/2013.
4.Horcajo P, Domínguez-Bernal G, De La Fuente R, RuizSanta-Quiteria JA, Orden JA. 2010. Association of vt1c
with verotoxin-producing Escherichia coli from goats and
sheep. J Vet Diagn Invest. 22(2):332-4.
5.ISO-CEN Technical Specification “Horizontal method
for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli
(STEC) belonging to O157, O111, O26, O103 and O145
serogroups - Qualitative Method” (ISO-TS13136:2011).
6.O’Brien A D, Lively TA, Chen ME, Rothman S.W., Formal
S.B.1983. Escherichia coli O157:H7 strains associated
with haemorrhagic colitis in the United States produce a
Shigella dysenteriae 1 (Shiga) like cytotoxin. Lancet.1(8326
Pt 1):702
7.Orden JA, Horcajo P, de la Fuente R, Ruiz-Santa-Quiteria
JA, Domínguez-Bernal G, Carrión J. 2011. Subtilase
cytotoxin-coding genes in verotoxin-producing Escherichia
coli strains from sheep and goats differ from those from
cattle. Appl Environ Microbiol. 77(23):8259-64.
8.Pradel N, Bertin Y, Martin C, Livrelli V. 2008. Molecular
analysis of shiga toxin-producing Escherichia coli strains
isolated from hemolytic-uremic syndrome patients
and dairy samples in France. Appl Environ Microbiol.
74(7):2118-28.
Lavoro svolto con i fondi RC del Ministero della Salute - IZSPB
09/10 RC.
395
DINAMICA DI COMPORTAMENTO DI SALMONELLA SPP. NELLA SALSICCIA
STAGIONATA UMBRA MEDIANTE MICROBIAL CHALLENGE TEST
Ortenzi R., Valiani A., Scuota S., Roila R., Haouet M.N., Pezzotti G.
IZSUM - Istituto Zooprofilatico Sperimentale Umbria e Marche
Key words: Salmonella, salsiccia stagionata, Challenge Test.
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the behaviour of
Salmonella during the curing process of the typical Umbria
seasoned sausage. A bacterial suspension of Salmonella
(104 cfu/g) was used to contaminate the meat paste during
production. The sausages, undergoing the normal process of
drying and seasoning, were periodically sampled to assess
the number of Salmonella, as well as other parameters
such as the number of lactic acid bacteria, mesophilic
aerobic bacteria, Enterobacteriaceae, coagulase-negative
Staphylococci, coagulase-positive Staphylococci, faecal
Streptococci, aw, pH, salt concentration, relative humidity
and weight loss. At the end of the seasoning period it was
observed that the production process of the typical Umbria
sausage may lead to a 2-Log Salmonella reduction.
INTRODUZIONE Nell’ambito della sicurezza alimentare l’igiene dei prodotti
commercializzati deve essere garantita attraverso misure
di prevenzione che permettano di mantenere sotto controllo
tutte le fasi del processo di trasformazione e distribuzione
degli alimenti (10). All’analisi del processo produttivo deve
seguire la dimostrazione scientifica in grado di documentare
oggettivamente la capacità del processo produttivo stesso
di poter eliminare o ridurre ad un livello accettabile i pericoli
microbiologici. Tra questi Salmonella spp. rappresenta una
delle cause più comuni di tossinfezione alimentare nell’uomo.
E’ stato stimato che il 28% dei casi di salmonellosi umani in
Europa è attribuibile al suino (2), sia in termini di zoonosi
diretta che indiretta, attraverso cioè il consumo di carne. Tra
i vari prodotti che derivano dalla trasformazione della carne
di suino, i prodotti insaccati, come riportato in diversi paesi
europei (3, 4, 6, 7), rappresentano una delle maggiori fonti
d’infezione da Salmonella. In tali prodotti, pronti al consumo,
il processo di trasformazione, in termini di temperatura, pH
e aw, rappresenta l’unico ostacolo allo sviluppo di batteri
patogeni (9).
Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la
dinamica di comportamento di Salmonella spp. durante il
processo di stagionatura della salsiccia stagionata umbra
mediante l’allestimento di uno specifico Microbial Challenge
Test.
MATERIALI E METODI
La sperimentazione ha previsto una fase preliminare durante
la quale è stata effettuata una valutazione del processo
produttivo utilizzato per la produzione della salsiccia
stagionata in diverse aziende del territorio umbro, allo scopo
di individuare il produttore il cui processo fosse più prossimo
a quello da considerare tipico. Sulla base delle caratteristiche
del processo produttivo individuato nell’azienda prescelta
è stato definito il protocollo sperimentale da sviluppare nel
corso del Microbial Challenge Test.
L’impasto, prodotto secondo la ricetta dell’azienda
produttrice, già addizionato di tutti gli ingredienti, è stato
suddiviso in tre aliquote di 5 Kg ciascuna:
- una è stata insaccata tal quale presso l’azienda ed è stata
sottoposta a stagionatura nell’azienda stessa (controllo AZ);
- una è stata insaccata tal quale presso l’azienda ma è
stata stagionata presso le celle di stagionatura dell’IZSUM
(controllo IZSUM);
- una è stata inviata all’IZSUM, dove è stata inoculata con
una sospensione di Salmonella, insaccata e stagionata nelle
celle di stagionatura dell’IZSUM (SS).
Il protocollo di contaminazione delle salsicce con Salmonella
ha previsto l’utilizzo di 3 ceppi di cui uno di riferimento
(Salmonella Typhimurium ATCC 14028) e due ceppi di
campo isolati da matrici alimentari simili a quella oggetto
della contaminazione sperimentale (Salmonella Manhattan
IZSLER 180073/09 e Salmonella enterica subsp. enterica
IZSLER 49769/10). L’impasto è stato contaminato in
ambiente controllato con una sospensione batterica che
conteneva un numero di Salmonella pari a circa 104 ufc/g.
Le salsicce sono state quindi sottoposte a stagionatura
secondo lo schema tempo/temperatura/UR% indicato
dall’azienda produttrice.
Subito dopo l’insacco (tempo 0) sono stati prelevati 3
campioni controllo IZSUM e 3 campioni SS per effettuare
le determinazioni previste. Successivamente sono stati
prelevati 3 campioni per ciascuna tipologia di prodotto a
scadenze prefissate (4, 7, 12, 18, 25 e 34 giorni).
Sui suddetti campioni appartenenti alle categorie controllo
AZ e controllo IZSUM sono state eseguite le seguenti
indagini: numerazione Carica Mesofila Aerobia eseguita
secondo il metodo validato AFNOR BIO 12/15 – 09/05
(TEMPO®
BioMérieux);
numerazione
Enterobatteri
eseguita secondo il metodo validato AFNOR BIO 12/21 –
12/06 (TEMPO® BioMérieux); numerazione batteri lattici
eseguita secondo la norma ISO 15214:1998; numerazione
Micrococchi/ Stafilococchi coagulasi negativi eseguita
mediante semina su terreno Baird Parker (Biolife) incubato
a 37°C ± 1°C per 21 h ± 3 e successiva conta e conferma
delle colonie con i metodi microbiologici classici (colorazione
di Gram, test della catalasi, test dell’ossidasi); numerazione
Stafilococchi coagulasi positivi eseguita secondo il metodo
validato AFNOR BIO 12/28 – 04/10 (TEMPO® BioMérieux);
numerazione Streptococchi fecali eseguita mediante semina
su terreno Slanetz-Bartley (Biokar) incubato a 37°C ± 1°C
per 48 h ± 3 h e successiva conta delle colonie tipiche;
ricerca di Salmonella spp., per verificare che non ci fosse
una contaminazione naturale del prodotto, eseguita secondo
il metodo validato AFNOR BIO 12/16-09/05; valutazione del
pH mediante pHmetro ad infissione (Crison pH25, Crison
Instrument, S.A., Barcelona, Spain); valutazione dell’acqua
libera (aw) mediante igrometro (AquaLab, Decagon Devices,
Inc); valutazione del cloruro di sodio secondo il metodo
396
Volhard; determinazione dell’umidità relativa eseguita
secondo il metodo Baldini et al. (1996); calcolo del calo peso
espresso in percentuale.
Sui campioni contaminati sperimentalmente con Salmonella
(SS) sono state effettuate le seguenti indagini: numerazione
Salmonella spp. eseguita mediante semina su terreno di
coltura selettivo/differenziale (cromogenico per Salmonella
- Biorad), incubato in aerobiosi a 37°C ± 1°C per 24-48 h
e successiva conta delle colonie tipiche; determinazione di
pH, aw e calo peso secondo le modalità descritte sopra.
L’analisi dei campioni di controllo IZSUM e AZ non ha
evidenziato la presenza di una contaminazione accidentale
da Salmonella spp. I risultati delle indagini chimico-fisiche
relative all’andamento di pH, aw, % di sale, % di umidità
relativa e % di calo peso hanno mostrato una sostanziale
sovrapponibilità degli andamenti dei suddetti parametri per i tre
tipi di prodotto (IZSUM, AZ e SS). I dati relativi all’andamento
di pH mostrano un rapido decremento nelle prime fasi della
stagionatura, passando da un valore di 6,20 a 5,36 per la
salsiccia controllo IZSUM, 5,13 per la salsiccia controllo AZ
e 5,20 per quella SS, cui fa seguito, in tutte le tipologie di
prodotto, un lieve innalzamento nelle fasi successive. L’aw è
scesa durante tutto il periodo di osservazione raggiungendo
il valore di 0,81 per la salsiccia AZ, 0,89 per la salsiccia
IZSUM e 0,91 per quella SS. Contestualmente si è assistito
anche al decremento della percentuale di umidità relativa.
L’andamento della percentuale di sale ha invece subito un
graduale aumento passando dal 2,55% a circa il 5,00%.
Le indagini microbiologiche effettuate sulle salsicce
controllo IZSUM e AZ hanno evidenziato quanto segue.
La popolazione dei batteri lattici, che costituisce la
microflora dominante negli insaccati, ha presentato già
al tempo 0 una concentrazione elevata (105 ufc/g) che è
aumentata rapidamente nei primi giorni di stagionatura
fino a raggiungere un valore di plateau pari a 108 ufc/g in
entrambe le tipologie di prodotto. Per quanto riguarda le altre
popolazioni batteriche indagate, è stata osservata un’elevata
concentrazione di Micrococchi/Stafilococchi coagulasi
negativi (circa 107 ufc/g per controllo IZSUM e circa 105 ufc/g
per controllo AZ) che, nonostante abbiano degli andamenti
non completamente sovrapponibili per il controllo IZSUM
e il controllo AZ, mantengono tali concentrazioni per tutto
il periodo di osservazione contribuendo probabilmente,
insieme agli Streptococchi fecali (circa 102 ufc/g in entrambi
i controlli), a definire il valore di pH finale e a conferire le
caratteristiche organolettiche tipiche del prodotto stesso
(1). Inoltre è stata osservata la presenza di Stafilococchi
coagulasi positivi che, se pur a basse concentrazioni (non
hanno mai superato 102 ufc/g), sono risultati presenti per
tutto il corso della sperimentazione.
Nella Figura 1 è rappresentato il comportamento di
Salmonella durante il processo di stagionatura della salsiccia
SS. Si osserva un graduale e lineare abbattimento della
popolazione che è stato di 2,4 logaritmi durante il periodo
di osservazione (34 giorni). In realtà la nostra osservazione
si è protratta oltre il tempo reale di stagionatura del prodotto
considerato che, come detto in precedenza, è di circa 20
giorni. Perciò durante l’effettivo periodo di stagionatura
l’abbattimento di Salmonella può essere stimato intorno a
1,73 logaritmi, come si evince dalla rappresentazione grafica.
Figura 1. Comportamento di Salmonella rilevata nel
corso della stagionatura sulle salsicce SS (contaminate
sperimentalmente): retta di regressione lineare
5
4,17
4
y = -0,0754x + 4,1288
2
R = 0,9299
4,21
3,55
Log ufc/g
3
2,89
2,51
2,26
2
1,78
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tempo (giorni)
È da tempo noto come i prodotti a base di carne debbano
la propria stabilità alla fermentazione e alla riduzione di
acqua libera durante la stagionatura (8). Dall’osservazione
degli andamenti dei parametri chimico-fisici (pH e aw) appare
verosimile come questi possano aver influito sul decremento
della concentrazione di Salmonella spp., creando un vero
e proprio ostacolo allo sviluppo della suddetta popolazione,
come riferito anche da altri autori (1, 5, 9). È da considerare,
inoltre, che i valori di aw raggiunti dai prodotti stagionati
nelle celle dell’IZSUM (controllo IZSUM e salsiccia SS) sono
risultati maggiori rispetto a quelli del prodotto stagionato in
azienda (controllo AZ). Considerando l’influenza del valore
di aw sull’inibizione dello sviluppo batterico, si potrebbe
presupporre che, nelle condizioni aziendali, l’abbattimento
del valore di contaminazione da Salmonella spp. possa
essere persino superiore a quello registrato nella presente
sperimentazione. Il rapido sviluppo della flora lattica ha
indubbiamente contribuito all’abbassamento dei valori di
pH, oltre che a creare un fenomeno di biocompetizione che,
assieme agli altri fattori già descritti, non ha permesso lo
sviluppo di Salmonella.
Al termine del periodo di stagionatura reale del prodotto si
è osservato che il processo di produzione della salsiccia
stagionata umbra è in grado di contrastare lo sviluppo di
Salmonella spp., producendo un abbattimento stimato
della carica iniziale pari a 1,73 logaritmi. L’eventuale
contaminazione accidentale della materia prima con il
patogeno considerato a concentrazioni superiori alla
riduzione logaritmica osservata, potrebbe rappresentare
un rischio per il consumatore. Ciò nonostante, una
contaminazione “naturale” del prodotto a tali livelli risulta
altamente improbabile.
BIBLIOGRAFIA
1. Cibotti S., Scuota S., Bazzucchi V., Bonanno S., Tommasino
M., Valiani A., Morgante A.R., Sebastiani C., Cenci T. (2008)
“Sopravvivenza di Listeria monocytogenes e Salmonella
Typhimurium in salame perugino addizionato di LAB
produttori di batteriocine e contaminato sperimentalmente”
http://spvet.it/arretrati/numero-46/001.html
2. EFSA SCIENTIFIC REPORT OF EFSA AND ECDC The
European Union Summary Report on Trends and Sources
of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks
in 2010 EFSA Journal 2012;10(3):2597.
3. Emberland K.E., Nygard K., Heier B.T., Aavitsland P.,
Lassen J., Stavnes T.L., Gondrosen B. (2006). Outbreak of
Salmonella Kedougou in Norway associated with salami,
April–June 2006. Euro Surveill. 11 E060706 060703.
397
4. Gossner CM., van Cauteren D., Le Hello S., Weill FX.,
Terrien E., Tessier S., Janin C., Brisabois A., Dusch
V., Vaillant V., Jourdan-da Silva N. (2012). Nationwide
outbreak of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i:infection associated with consumption of dried pork
sausage, France, November to December 2011. Euro
Surveill. 2012;17(5):pii=20071.
5. Grisenti M.S., Frustoli M.A., Garofali D., Cigarini M.,
Barbuti S. (2009) “Behaviour of Listeria monocytogenes
during shelf-life of sliced italian salami” SSICA.
6. Kuhn KG., Torpdahl M., Frank C., Sigsgaard K., Ethelberg
S. (2011) An outbreak of Salmonella Typhimurium traced
back to salami, Denmark, April to June 2010. EuroSurveill.
2011;16(19):pii=19863.
7. Luzzi I., Galetta P., Massari M., Rizzo C., Dionisi A.M.,
Filetici E., Cawthorne A., Tozzi A., Argentieri M., Bilei S.,
Busani L., Gnesivo C., Pendenza A., Piccoli A., Napoli,P.,
Loffredo L., Trinito M.O., Santarelli E., Ciofi degli Atti M.L.
(2007). An Easter outbreak of Salmonella Typhimurium DT
104A associated with traditional pork salami in Italy. Euro
Surveill. 12, E11–E12.
8. Pin C., Sutherland JP., Baranyi J. (1999) Validating
predictive models of food spoilage organisms, J Appl
Microbiol 87: 491-499.
9. Pin C., Avendaño-Perez G., Cosciani-Cunico E., Gómez
N., Gounadakic A., Nychas G. J., Skandamis P., Barker G.
(2011) Modelling Salmonella concentration throughout the
pork supply chain by considering growth and survival in
fluctuating conditions of temperature, pH and aw. Int. Jour.
of Food Microbiol. 145 (2011) S96–S102.
10. REGOLAMENTO
(CE)
n.
2073/2005
DELLA
COMMISSIONE del 15 novembre 2005 sui criteri
microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.
Lavoro eseguito nell’ambito delle attività del consorzio CIRAL
(Consorzio Italiano per la sulla Qualità e la Sicurezza degli
Alimenti) Società consortile A.R.L.
398
INTOSSICAZIONE DA METOLCARB IN CAPRETTE TIBETANE
(CAPRA HIRCUS DOMESTICA) E LAMA (LAMA GLAMA) DI UNO ZOO PARCO
*Palazzo L., *Quaranta V., ^Brigante B., *Nesta S., ^^ Vignola M., **Haouet M.N., *Muscarella M.
*Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata;
**Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’ Umbria e delle Marche;
^Servizio Veterinario Azienda Sanitaria Potenza;
^^Biologo libero professionista – Potenza.
Key words: caprette tibetane, Metolcarb, intossicazione.
SUMMARY
Cases of intoxications by Metolcarb in tibetan goats and lamas
belonging to a Southern Italy Zoo are described. The mortality
of these animals occurred in the winter period 2012-2013. Poisoned animals were adult and most of them were male. In
all cases the ante-mortem symptoms was mainly characterized
by progressive weight loss and neurological signs. Post
mortem examinations showed pancreas and lung edema and
hyperemia of the meninges. The analytical method used to
detect the presence of Metolcarb in the animal gastric contents
was based on an easy extraction followed by SPE purification
and gas-cromatography combined with mass spectrometer
detection.
tossicità di questo composto si esplica attraverso il blocco
dell’attività dell’enzima acetilcolinesterasi che catalizza
l’idrolisi dell’acetilcolina, mediatore delle sinapsi colinergiche
periferiche e centrali.
La sintomatologia deriva da una iperstimolazione delle
sinapsi colinergiche con effetti muscarinici, nicotinici e
centrali (eccitazione seguita da astenia, atassia, convulsioni,
depressione dei centri respiratori e circolatori)(4).
In questo lavoro viene descritto un episodio di intossicazione
da Metolcarb che ha interessato caprette tibetane e lama di
uno Zoo Parco situato nel territorio del Parco Nazionale dell’
Appennino Lucano – Val D’Agri – Lagonegrese nel Sud della
Regione Basilicata.
INTRODUZIONE
La capretta tibetana(Capra hircus domestica), questo è il nome
più comune con il quale è conosciuta in Italia, sembra abbia
origini nell’Africa occidentale e per tale motivo sarebbe più
corretto parlare di capra nana D’africa. E’ presente anche in
Africa, negli USA e nei paesi del nord Europa dove è invece
conosciuta con il nome comune di capra nana nigeriana. Non è
considerata un animale da reddito ma un animale ornamentale
e da affezione, infatti anche in Italia viene ospitata a scopo
di attrazione nei giardini zoologici, parchi naturali e strutture
per agriturismo. È un animale gregario per cui ha necessità
di vivere in gruppo. E’ un animale vivace, simpatico e molto
resistente ragion per cui raramente si ammala; è dotato di
grande agilità e adattabilità alle diverse condizioni ambientali
e climatiche. Dal punto di vista alimentare è piuttosto frugale,
ama foglie, germogli e cortecce.
E’ dotata di una struttura morfologica sovrapponibile alla capra
domestica ma di dimensioni più piccole: altezza al garrese
da 20-30 cm a 50 – 60 cm , il peso si aggira sui 20-30 Kg,
la femmina è più piccola del maschio; il mantello uniforme o
pezzato può presentarsi di colore bianco, nero, marrone o
grigio-argento; corna corte e sottili.
Anche il lama (Lama glama) per la sua docilità e curiosità si
presta ad essere ospitato in parchi e zoo. Si nutre anch’esso
di arbusti, foglie e germogli e come la capretta tibetana è un
animale molto robusto e raramente si ammala.
Il Metolcarb è un pesticida appartenente alla categoria
dei carbammati. E’ stato classificato dalla World Health
Organization come pesticida di classe II con DL50 = 300 mg/kg
di peso corporeo per mammiferi e altri vertebrati (2)(3).
Il Metolcarb non rientra nell’elenco dei pesticidi consentiti
in Europa (Reg. 396/2005/CE e s.m.), ma il suo utilizzo in
agricoltura come insetticida è altamente comune in Cina ed è
stato rivelato in numerosi campioni di frutta e vegetali (1).
Il rischio tossicologico è legato all’introduzione di tale molecola
per via orale attraverso acqua di abbeverata o alimento. La
MATERIALI E METODI
Nello Zoo Parco sopra citato erano ospitati 28 caprette tibetane
e 16 lama oltre a una voliera con un’ara, qualche emù, stagni
con tartarughe d’acqua e qualche anatra. Nel periodo settembre
2012 - febbraio 2013 si sono verificati numerosi decessi
che hanno interessato n. 22 caprette tibetane (18 maschi e
4 femmine) e n. 8 lama (6 maschi e 2 femmine). I maschi e
le femmine di capretta tibetana vivevano insieme così come
i lama. I recinti erano distanti circa 30 m e separati da locali
adibiti a ricevere visite guidate. I maschi di capretta tibetana
erano tutti castrati mentre i maschi di lama non erano castrati.
L’alimentazione era costituita da fieno misto, fiocchi di cereali e
leguminose e mangime complementare per ovicaprini.
Presso la Sezione Diagnostica provinciale di Potenza
dell’IZS della Puglia e della Basilicata sono state recapitate
complessivamente n.15 carcasse (n.11 di caprette tibetane
e n.4 di lama) di animali adulti, le caprette avevano un’età
compresa tra i 7 e i 15 anni, tutti di sesso maschile tranne una
femmina di 7 anni; i lama, tutti di sesso maschile, avevano
un’età compresa tra 2 e 22 anni.
All’anamnesi si riferiva che gli animali interessati avevano
presentato in alcuni casi morte improvvisa, in altri la
sintomatologia era caratterizzata da dimagrimento, cachessia
e sintomi nervosi con incoordinazione motoria, incapacità alla
stazione quadrupedale e a volte opistotono.
All’esame autoptico si presentava un quadro anatomopatologico
piuttosto omogeneo per tutte le carcasse: si evidenziava uno
stato generale di congestione e iperemia raramente emorragie,
degli organi interni e particolarmente del polmone, del peritoneo
e del pancreas; le lesioni a carico dell’intestino tenue erano
riconducibili ad enterite muco catarrale, presenza di materiale
fluido al suo interno, iperemia della mucosa ed interessamento
dei linfonodi tributari. Inoltre erano presenti iperemia delle
meningi ed edema polmonare con materiale schiumoso nella
trachea. Il quadro anatomopatologico induceva al sospetto di
una intossicazione tuttavia, al fine di escludere il coinvolgimento
399
di agenti etiologici di natura infettiva, dagli organi prelevati in
sede autoptica (fegato, rene, milza, polmone ed encefalo) si
procedeva all’esame colturale secondo i metodi diagnostici
utilizzati di routine presso il laboratorio.
Si procedeva all’invio dei campioni presso altri laboratori per
indagini di tipo chimico-tossicologico che hanno previsto l’utilizzo
di una metodica basata sulla gas-cromatografia accoppiata alla
spettrometria di massa (GC/MS) con analizzatore a trappola
ionica.
Preparazione del campione: A 10 g di campione sono aggiunti
40 mL di diclorometano. Si agita mediante vortex per 1 ora.
Si aggiunge 1g di sodio solfato e si procede alla filtrazione.
Successivamente si porta a secco e si riprende il residuo secco
con 5 mL di etere di petrolio e si passa alla fase di purificazione
mediante Colonnine SPE Florisil. L’eluato viene portato a
secco mediante flusso di azoto e ripreso con 5 mL di acetone.
L’estratto viene trasferito in vial ed è pronto per l’analisi GC/MS
Condizioni strumentali: E stato adoperato un Gas cromatografo
Varian mod. CP3900 combinato ad uno spettrometro di massa
Varian mod. 2100T con analizzatore a trappola ionica. E’ stata
utilizzata una colonna Rtx - 5MS ( 30m x 0.25 mm, 0.25µm).
L’elio alla pressione di 12 psi è stato adoperato come carrier
gas. E’ stata utilizzata una temperatura del forno a gradiente,
un volume di iniezione pari a 1µL, un flusso make up + carrier
di 30 mL/min e un mass range compreso tra 45-650 u.m.a. Il
tempo complessivo della corsa cromatografica è stato di 40
minuti.
Le indagini di tipo batteriologico eseguite sugli organi degli
animali deceduti hanno sempre dato esito negativo ad eccezione
di un solo caso di positività per Listeria monocytogenes in una
capretta tibetana.
Le indagini chimico-tossicologiche per la ricerca di Fosfuri,
Arseniuri, Pesticidi, Rodenticidi anticoagulanti, Metaldeide e
Stricnina hanno rilevato la presenza di Metolcarb nel contenuto
gastrico di n.11 delle n.14 carcasse esaminate (78,6%).
Nella Figura n. 1 è riportato il cromatogramma di un campione
di contenuto gastrico di capretta tibetana risultato positivo
al Metolcarb. La Figura n. 2 riporta lo spettro di massa dello
stesso campione analizzato.
La sintomatologia e le condizioni ambientali e alimentari comuni
a tutti gli animali deceduti unitamente all’uniformità del quadro
anatomopatologico e dei risultati delle indagini di laboratorio
inducono a ritenere che l’intossicazione da Metolcarb abbia
interessato tutti gli animali, 22 di 28 caprette tibetane (78,5%) e
8 di 16 lama (50%), deceduti nello Zoo Parco.
Considerato che il rischio tossicologico è rappresentato
dall’introduzione della molecola tossica per via digerente e
vista la moderata tossicità di Metolcarb che ha una DL50 = 300
mg/kg di peso corporeo per i mammiferi, sebbene in letteratura
non siano riportati casi di intossicazione da Metolcarb per le
caprette tibetane e per i lama (2), si deduce che la quantità
ingerita dagli animali venuti a morte sia stata piuttosto elevata.
Sia che l’ingestione sia avvenuta con alimenti, sia attraverso
esche avvelenate, ancora una volta è dimostrato l’uso
indiscriminato e pericoloso di sostanze tossiche a cui si
aggiunge nel caso di Metolcarb l’utilizzo e l’introduzione illegale
poiché tale molecola non è più consentita in Europa.
Fig.1:cromatogramma di un campione di contenuto gastrico
positivo per Metolcarb
GLI AVVELENAMENTI ACUTI NEGLI ANIMALI:
I VANTAGGI DELL’APPLICAZIONE DELLE LINEE GUIDA IN PIEMONTE
Perosino M., Grattarola C., Abete M.C., Dondo A., Giorgi I., Zoppi S.
Key words: malicious poisoning, pet, baits
Fig.2: spettro di massa di un campione di contenuto gastrico
positivo per Metolcarb
BIBLIOGRAFIA
1. Sun J. (2010).Development of enzyme linked
immunoassay for the simultaneous detection
of carbaryl and metolcarb in different
agricultural products. Analitica Chimica
Acta. 666:76-82.
2. W.H.Lu, Jieli, Pesticide Knowledge and
technique
hands,
publishing
company,
Beijing, PRC, 2000
3. Berny P, Caloni F, Croubels S, et al.: 2010,
Animal poisoning in Europe. Part 2: Companion
animals. Vet J 183:255–259.
Tossicologia
4. C.
Beretta.
Veterinaria.
Ed.
Grasso
(1984)
400
SUMMARY
The most important action to tackle malicious poisoning is
the comprehension of the size and the characteristics of the
phenomenon at the local level and the main purpose of the
application of these guidelines is to discriminate between accidental and deliberate poisoning in private or public areas.
Collecting and analyzing the information contained in the
schedules accompanying the samples sent for suspected poisonings, it was drawn an outline of what happens in our territory: it is more common to see cases of poisoning in urban
environment rather than in agricultural or in woodland setting,
thus affecting mainly dogs and cats. It was also observed that
the number of reports per year is almost constant and it counts
for approximately 100-150 cases/ year.
Moreover, it’s important to carefully evaluate the data obtained
in order to avoid creating alarm among the population and the
delivery of any kind of material or carcasses at the diagnostic
laboratories.
INTRODUZIONE
L’aumentata sensibilità generale verso i casi di avvelenamento
è legata alla nuova e moderna concezione del rapporto etico
tra uomo e animale ed è stata tradotta in un’Ordinanza Ministeriale nel lontano dicembre 2008. Nel testo di questa norma,
l’Istituto Zooprofilattico ha il compito di confermare o escludere
il sospetto di avvelenamento, identificare le molecole responsabili ed eseguire studi opportuni che consentono alle Province ed alle Regioni di redigere annualmente le mappe epidemiologiche del fenomeno e procedere all’attuazione di misure
contenitive.
La mancata uniformità di informazioni sui singoli episodi, tuttavia, raramente conduce ad una reale concretizzazione di
queste azioni.
Il 16 novembre 2011 il Ministero della Salute ha trasmesso
ufficialmente sia le linee guida per migliorare l’applicazione
dell’Ordinanza 18 dicembre 2008, con lo scopo principale di
uniformare i comportamenti da adottare nel caso di episodi di
avvelenamento, sia la modulistica da compilare per l’inoltro dei
campioni all’IZS di competenza.
Il documento, redatto dalla Direzione Generale della Sanità
Animale in forma di nota esplicativa, è stato realizzato in collaborazione con il Centro di Referenza nazionale per la Medicina Forense Veterinaria e rappresenta un riferimento normativo chiaro ed efficace se compiutamente applicato dalle parti
coinvolte.
Il primo e cruciale passo per contrastare il fenomeno degli avvelenamenti dolosi è, di fatto, comprendere l’entità e le caratteristiche del fenomeno a livello locale e lo scopo principale
dell’applicazione delle linee guida emanate rientra nell’ottica di
contrastare queste pratiche illecite in aree pubbliche e private.
L’obiettivo del presente lavoro è stato quello di raccogliere ed
analizzare le informazioni contenute nelle schede di accompagnamento dei campioni inviati all’IZS di Torino per sospetto
avvelenamento e tracciare un profilo di quanto accade a livel-
lo di territorio piemontese al fine di ottenere un quadro della situazione in previsione della futura conversione in legge
dell’Ordinanza Martini e porre le basi per la gestione di questi
episodi.
MATERIALI E METODI
Nel periodo compreso tra il 1° gennaio 2012 e il 30 giugno
2013, sono state prese in considerazione le richieste di esami
per sospetto avvelenamento, sia di animali morti sia di esche.
Per ogni caso sospetto sono stati recuperati i dati relativi a data
e luogo di prelievo, zona di ritrovamento (urbana, agricola, privata, boschiva) e specie animale coinvolta.
Sono stati presi in considerazione 112 casi di avvelenamento
nel 2012 e 51 nei primi sei mesi del 2013 per un totale di 163
casi (70 esche, 51 cani, 30 gatti e 12 altre specie animali). Questi dati confermano un trend costante dopo un iniziale significativo incremento registrato proprio a partire dal 2008, anno
di emanazione dell’Ordinanza Martini (3). Tale valore si attesta
intorno ai 100-150 campioni annui.
Tabella 1 – Confronto per zona di ritrovamento.
2012
N
P
Totale
POS (%)
urbana
26
18
44
40,9
privata
15
10
25
40,0
non definita
12
6
18
33,3
agricola
10
6
16
37,5
boschiva
7
2
9
22,2
Totale
70
42
112
37,5
N
P
Totale
POS (%)
urbana
18
9
27
33,3
privata
4
6
10
60,0
boschiva
4
0
4
0,0
agricola
3
3
6
50,0
non definita
1
3
4
75,0
Totale
30
21
51
41,2
2013
Analizzando i dati riportati in Tabella 1, in entrambi i periodi
considerati, si osserva che le zone principalmente interessate
dal fenomeno sono quella urbana e l’ambito privato. Da una
preliminare lettura critica del dato, è possibile desumere che
lo scenario e le conseguenti azioni che si prospettano devono
essere ricalibrate rispetto a quanto riportato dalla norma.
Il maggior coinvolgimento di animali domestici, nella fattispecie
cani e gatti (Tabella 2), fa supporre che gli episodi registrati
401
siano legati principalmente alle problematiche tipiche dell’ambiente urbano (liti fra condomini, comportamenti scorretti dei
detentori di animali in ambienti pubblici, problema delle deiezioni, rumori molesti, violazione di domicilio) e le sostanze prevalentemente utilizzate sono riconducibili a tossici di più facile
reperimento (topicidi anticoagulanti e lumachicidi) come già osservato in lavori precedenti (1,2).
Per contro, il mancato conferimento di animali selvatici non può
essere valutato in alcun modo, in quanto potrebbe avere il duplice significato sia di scarsa sensibilizzazione al controllo delle
aree boschive e tutela della fauna selvatica sia di minore rilevanza di tali aree per quanto riguarda gli avvelenamenti.
Un altro aspetto che emerge, ancora oggetto di approfondimento e valutazione, è il riscontro di esche in tutte le aree di
indagine. Le linee guida hanno introdotto la registrazione della
descrizione morfologica dell’esca e questo è da considerarsi
un aspetto importante oltre che, a nostro parere, un punto cruciale per la valutazione indiretta dell’intento criminoso di chi ha
confezionato l’esca. In via preliminare si è osservato, tra la casistica del 2012 e quella del 2013, un apparente aumento della
cura con cui questi bocconi vengono preparati. E’ stato rilevato,
infatti, che chi allestisce esche tende a nascondere con cura
la sostanza tossica o inserendola all’interno del boccone (rodenticidi, lumachicidi, vetro, graffette, farmaci in compresse) o
cospargendola sotto forma di soluzione sullo stesso materiale
alimentare (carne, ossa, insaccati, granaglie).
velenamento. Sulla base dei dati ottenuti (Tabella 3), chi ha
dichiarato il sospetto DOLO ha effettivamente la percezione
della gravità dell’episodio, dimostrato dalla percentuale di positività maggiore rispetto alle altre due categorie (rispettivamente
89,7-97,7% verso 0-33,3%).
Il fatto che molte volte venga indicata la voce “NON SAPREI”
(oltre il 50%), tuttavia, potrebbe essere interpretato come sia
estremamente facile che uno strumento così importante possa
divenire oggetto di abuso, se non viene portata avanti un’efficace e corretta campagna di sensibilizzazione della popolazione.
Il rischio, infatti, è che si arrivi ad un aumento indiscriminato di
campioni inutili e all’emergenza di generare falsi allarmismi tra
la popolazione.
In conclusione possiamo affermare che, anche se si tratta di
dati preliminari che necessitano ulteriori approfondimenti, sicuramente pongono le basi per una conoscenza più puntuale
delle singole realtà territoriali.
Tabella 3 – Confronto per sospetto 2012
Tabella 2 – Confronto per specie animale
2012
2012
N
Non Saprei
62
Doloso
1
Non definito
6
Accidentale
1
Totale
70
2013
Non Saprei
P
Totale
POS (%)
62
0,0
39
40
97,5
3
9
33,3
1
0,0
42
112
37,5
N
P
Totale
POS (%)
25
0
25
0,0
N
P
Totale
POS (%)
esca
30
16
46
34,8
cane
17
16
33
48,5
Doloso
2
17
19
89,7
gatto
17
6
23
26,1
Non definito
1
3
4
75,0
2
2
100,0
Accidentale
2
1
3
33,3
0
2
0,0
Totale
30
21
51
41,2
piccioni
capra
2
lupo
1
1
0,0
ovino
1
1
0,0
pappagallo
1
1
0,0
1
100,0
1
0,0
1
1
100,0
70
42
112
37,5
N
P
Totale
POS (%)
esca
16
8
24
33,3
cane
9
9
18
50,0
gatto
5
2
7
28,6
bovino
0
1
1
100,0
piccione
0
1
1
100,0
Totale
30
21
51
41,2
pollo
1
tartaruga
1
volpe
Totale
2013
BIBLIOGRAFIA
La valutazione del giudizio che viene riportato sulla scheda
anamnestica circa la possibile natura dell’intossicazione (DOLOSO, ACCIDENTALE, NON SAPREI) può, a nostro avviso,
rappresentare un utile strumento per valutare indirettamente
l’attenzione e la sensibilizzazione al problema da parte di chi
conferisce il campione nei confronti del caso di sospetto av-
1. Zoppi S., Bergagna S., Rossi F., Grattarola C.,
Abete M.C., Capra P., Dondo A., 2009. L’esame necroscopico come screening per la diagnosi di avvelenamento acuto negli animali: correlazioni tra quadri
anatomo-patologici e determinazioni tossicologiche.
Parma 30/09-2/10/2009. Atti XI Congresso Nazionale
S.I.Di.L.V. pag. 45-46.
2. Zoppi S., Varello K., Pezzolato M., D’Errico V., Meloni D., Abete M.C., Dondo A., Bozzetta E. Anatomical
and histopathological features related to anticoagulant poisoning in companion animals. J Vet Pharmacol Ther. 2012 Oct;35 Suppl 3:1-182: 101-102.
3. Zoppi S., Brizio P., Capra P., Leporati M., Giorgi
I., Grattarola C., Dondo A., Abete M.C. Application of
the Italian legislation against animal poisonings: state
of art in North West Italy J Vet Pharmacol Ther. 2012
Oct;35 Suppl 3:1-182: 102.
RINGRAZIAMENTI
La ricerca è stata parzialmente finanziata dal Ministero della
Salute, Dipartimento della Sanità Pubblica Veterinaria, della Sicurezza Alimentare e degli Organi Collegiali per la Tutela della
Salute, nell’ambito del progetto di ricerca corrente anno 2010
- IZS PLV 22/10 RC
402
PRESENZA DI PROTOTHECA SPP. NEGLI ALLEVAMENTI BUFALINI
DELLA PROVINCIA DI CASERTA.
DATI PRELIMINARI
Pesce A. 1, Garofalo F. 1, Coppa P. 1, Salzano C. 1, Cioffi B. 1, Mosca E. 1, Guarino A. 2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno; Sezione Diagnostica di Caserta
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno; Sede Centrale Portici
1
Key words: Mastitis, milk, Prototheca spp.
Abstract
Bovine mastitis by Prototheca spp. is an increasing global
phenomenon. Particularly, Prototheca species associated to
bovine mastitis are P. zopfii genotype 2 and P. blaschkeae. Aim
of this study was to evaluate occurrence of Prototheca spp. in
buffalo milk of Caserta area.
Bulk milk samples were collected from 83 buffalo farms.
Samples were cultured in Prototheca Isolation Medium agar to
investigate on the presence of Prototheca spp. Fat, protein and
lactose concentration in milk was determinated by MilkoScan
FT instrument.
4 Prototheca spp. strains were isolated: 3 P. wickerhamii and
1 P. zopfii. Positive samples showed low percentage of fat
composition, suggesting a correlation between presence of P.
spp. and fat levels.
Many studies report the isolation of P. spp in dairy herds in Italy,
but there are few reports in buffalo milk. Even if our data are
preliminary, they give us a first information about distribution of
Prototheca spp. in Caserta buffalo farms.
Introduzione
La Prototheca è un’alga unicellulare, aerobica, incolore, simile
ai lieviti. Il genere Prototheca include 6 specie: stagnora, ulmea,
wickerhamii, zopfii, blaschkeae e cutis (10); P. moriformis,
non è stata attualmente riconosciuta come settima specie, a
causa sia della sua somiglianza biochimica e genetica con P.
zopfii che della sua eterogeneità intraspecifica. Inoltre, sulla
base delle sue caratteristiche biochimiche e sierologiche,
nonché delle sequenze 18S-rDNA, la specie P. zopfii è stata
differenziata in due genotipi: genotipo 1 e genotipo 2 (9). Alcune
specie di Prototheca possono causare malattie infettive negli
uomini e negli animali. In particolare la Protothecosi umana è
associata principalmente a P. wickerhamii, seguita da P. zopfii,
P. blaschkeae e P. cutis (6,10). La Protothecosi animale, invece
è associata essenzialmente a P. zopfii genotipo 2, quale agente
di mastite bovina, inoltre sono stati descritti rari casi di mastite
bovina dovuti a P. blaschkeae (7).
Gli animali affetti da infezione mammaria da Prototheca
inizialmente non evidenziano particolari segni clinici ad
eccezione di una diminuzione della produzione di latte ed in
alcuni casi, di un lieve aumento delle cellule somatiche (8).
Solo con il progredire dell’infezione si possono manifestare
dei segni clinici come aspetto acquoso del latte, aumento di
consistenza del parenchima e atrofia del quarto interessato,
conclamandosi come patologia cronico-evolutiva e causando
alle aziende notevoli danni economici (1).
Gli studi effettuati sull’isolamento, identificazione e distribuzione
di Prototheca spp. in Italia, hanno evidenziato una notevole
diffusione dell’infezione nell’allevamento bovino da latte (3). In
particolare, è stata riscontrata una percentuale di positività per
Prototheca zopfii del 15.43% negli allevamenti bovini del nord
Italia (4). Scarse, invece sono le conoscenze sulla diffusione di
Prototheca negli allevamenti bufalini.
Scopo del nostro lavoro è quello di dare un’ indicazione della
diffusione di Prototheca negli allevamenti bufalini della provincia
di Caserta, analizzando campioni di latte di massa.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto esaminando 83 campioni di latte di
massa di bufala provenienti da 83 allevamenti della provincia
di Caserta.
I campioni di latte sono stati prelevati da tank di raccolta,
trasportati in laboratorio a 4 °C e seminati, per la ricerca di
Prototheca spp, su una piastra di PIM agar (Prototheca Isolation
Medium). Dopo incubazione a 37°C per 72 ore in condizioni di
aerobiosi, le colonie tipiche osservate sono state identificate
utilizzando lo strumento Vitek 2 (BioMerieux).
I ceppi di Prototheca spp. isolati sono stati inviati al Consiglio
Nazionale delle Ricerche di Lodi per la conferma della specie
e la genotipizzazione della P. zopfii, effettuati mediante metodo
biomolecolare descritto da Cremonesi et al. 2012 (5).
Inoltre i campioni di latte sono stati analizzati per il contenuto in
grasso, proteine e lattosio mediante lo strumento MilkoScan FT+
(FOSS), spettrofotometro ad alta prestazione FTIR (Foourier
Transform InfraRed) ed è stata calcolata la resa mediante la
formula di Addeo.
Risultati
Prototheca spp. è stata evidenziata in 4 campioni, pari al 4.8%
dei campioni di latte analizzati; in particolare 3 campioni di latte
sono risultati positivi a Prototheca wickerhamii ed un campione
di latte è risultato positivo a Prototheca zopfii. Il contenuto in
grasso, proteine, lattosio e la resa dei campioni positivi sono
rappresentati in tabella 1.
Tabella1
specie
Grasso
g/100
Proteine
g/100g
Lattosio
g/100g
Resa
(%)
1
P. wickerhamii
7.85
4.71
4.64
25.26
2
P. zopfii
7.90
4.66
4.91
25.15
3
P. wickerhamii
7.43
4.27
4.99
23.20
4
P. wickerhamii
7.79
4.16
4.85
23.26
n°
Discussione e Conclusioni
Bueno et al 2006 (2) descrivono che nel latte, di bovini con
mastite subclinica dovuta a Prototheca, si riscontra una
diminuzione della resa del latte e del contenuto in grasso e
lattosio.
Nel nostro studio i campioni di latte bufalino, che presentano
403
un’infezione da Prototheca spp., mostrano un basso contenuto
di grasso, al di sotto degli 8.5 g/100g (media del contenuto di
grasso degli stessi allevamenti negli anni precedenti), e valori
normali di lattosio e resa del latte.
Nei campioni 3 e 4 il valore della resa è stato influenzato dal
tenore ridotto in proteine. Nelle aziende in cui di routine è
effettuato un monitoraggio delle performance quali-quantitative
del latte la diminuzione del contenuto di grasso potrebbe essere
comunque utilizzata come indicatore per il campionamento dei
capi da analizzare per la ricerca di Prototheca.
Sebbene siano preliminari, i nostri dati danno una prima
indicazione sulla diffusione di Prototheca spp. negli allevamenti
bufalini da latte della provincia di Caserta. Più del 4% del latte
mostra la presenza di Prototheca spp.; di questi solo 1 campione
è risultato positivo a P. zopfii, ritenuto responsabile della
mastite bovina. Nonostante la positività del latte di massa alla
Prototheca potrebbe farci ipotizzare che vi sia nella mandria un
grosso numero di animali eliminatori di tale alga, non sono stati
riscontrati casi di animali con evidenti segni clinici di mastite. Gli
animali di tale allevamento saranno monitorati singolarmente
al fine di evidenziare quanti e quali sono gli eliminatori e se, a
distanza di tempo i soggetti monitorati manifesteranno segni
clinici di mastite.
In base ai nostri risultati, la diffusione di Prototheca sembra
essere limitata ad una zona circoscritta della provincia di
Caserta (Figura1); in particolare trattasi di un’area adiacente
sia al fiume Volturno che ad un canale di raccolta delle acque
(Regi Lagni). Pertanto, sospettando che questi possano essere
una fonte di contaminazione, riteniamo opportuno effettuare
ulteriori studi su tali acque.
Figura1 - Distribuzione sul territorio delle aziende campionate.
- Aziende sieronegative
- Aziende sieropositive
Bibliografia
1) Arrigoni N., Belletti G.L., Cammi G., Garbarino C., Ricchi
M. 2010. Mastite bovina da Prototheca. Large Animal Review.
16:39-43
2) Bueno V.F., De Mesquita A.J., Neves R.B., De Souza
M.A., Ribeiro A.R. Nicolau E.S. De Oliviera A.N. 2006.
Epidemiological and clinical aspect of the first out break of
bovine mastitis caused by Prototheca zopfii in Goias State,
brazil. Mycopathologia. 161:145-145.
3) Buzzini P., Turchetti B., Facelli R., Baudino R., Cavarero
F., Mattalia L., Mosso P. e Martini A. 2004. First large-scale
isolation of Prototheca zopfii from milk produced by dairy
herds in Italy. Mycopathologia 148:427-430.
4) Cammi G., Arrigoni N., Belletti GL., Garilli F., Ricchi M.,
Vicari n., Tamba M., Galletti G. 2008. Indagine sulla presenza
di prototheca spp. in allevamenti di bovine da latte del Nord
Italia. Atti X Congresso Nazionale SIDiLV, Alghero 2008:120121
5) Cremonesi P., Pozzi F., Ricchi M., Castiglioni B., Luini M.,
Chessa S. 2012. Technical note: identification of Prototheca
species from bovine milk by PCR- single strand conformation
polymorphism. J. Dairy Sci. 95:6963-6968.
6) Lass-Florl, C. and Mayr, A. 2007. Human protothecosis.
Clin Microbiol Rev. 20:230–242.
7) Marques, S., Silva, E., Kraft, C., Carvalheira, J., Videira,
A.,Huss, V.A. and Thompson, G. 2008. Bovine mastitis
associated with Prototheca blaschkeae. J Clin Microbiol.
46:1941–1945.
8) Mc Donald JS., Richard JL., Cheville J.1984. Naturaland
experimental bovine intramammary infections with Prototheca
zopfii. Am J Vet Res 45:592-595.
9) Roesler U, Moller A, Hensel A, Baumann D, Truyen U.
2006. Diversity within the current algal species Prototheca
zopfii: A proposal for two Prototheca zofii genotypes and
description of a novel species, Prototheca blaschkeae spp.
nov. Int J Syst Evol Microbiol, 56: 1419-1425.
10) Satoh, K., Ooe K, Nagayama H, Makimura K. 2010.
Prototheca cutis sp. nov., a newly discovered pathogen of
protothecosis isolated from inflamed human skin. Int J Syst
Evol Microbiol. 60:1236-1240.
404
SIEROPREVALENZA DI COXIELLA BURNETII IN AZIENDE CON TIPOLOGIA DI
ALLEVAMENTO MISTO BUFALO E BOVINO DELLA PROVINCIA DI CASERTA.
DATI PRELIMINARI
Pesce A. 1, Napoletano M. 1, Coppa P. 1, Grimaldi P. 1, De Santo A. 1, Tamburro A. 1, Bove V. 1, Guarino A. 2
1
2
Key words: Serum, antibodies, Coxiella burnetii.
Abstract
Q fever is a zoonosis caused by a gram negative intracellular
bacterium, Coxiella burnetii. It is often subclinical disease
in animals, however it can lead to abortion and reproductive
disorders.
The aim of this study is to estimate C. burnetii seroprevalence
in farms with co presence of bovines and buffaloes in Caserta
area.
A total of 607 serum samples (370 buffaloes and 237 bovines)
were collected from 17 farms and were tested for Q fever
antibodies using indirect ELISA kit.
Our study shows that 64,7% of analyzed farms is seropositive for
Coxiella burnetii. Moreover, we observe 18,56% seropositivity
in bovines and 5,68% seropositivity in buffaloes.
Our data give a first indication on seroprevalence of Coxiella
burnetii in Caserta area, although further investigation should
be performed to understand the real presence of the pathogen
in tested farms.
Introduzione
La Febbre Q è una zoonosi causata da un batterio Gramnegativo parassita intracellulare obbligato: Coxiella Burnetii
(6). Molti animali, come ad esempio, roditori, cani, gatti,
uccelli, rettili, anfibi, pesci, e molte zecche possono fungere da
serbatoio dell’infezione, ma la più comune fonte di infezione
per gli uomini è rappresentata dagli animali da fattoria quali
vacche, capre, pecore e naturalmente bufali (2,4,9,10).
La trasmissione avviene tramite il morso di zecche, per via
inalatoria, tramite ingestione di invogli fetali e fluidi placentari
in occasione del parto o dell’aborto, attraverso le feci, le urine
o alimenti contaminati.
L’infezione da C. burnetii è associata a rischio abortivo
soprattutto in ovi-caprini così come nel bufalo (Bubalus bubalis),
nelle vacche il rischio d’aborto è più contenuto ma l’infezione
può essere causa di mastite o malattie riproduttive.
La febbre Q è una malattia subdola, infatti, all’interno di un
allevamento, molti individui possono essere asintomatici per
lunghi periodi, contribuendo così alla diffusione della patologia.
In pratica, non esistono segni d’allarme nella mandria e gli unici
sintomi apprezzabili sono le patologie riproduttive: l’aborto
tardivo, il parto prematuro, la mortalità neonatale, la prole
disvitale, talvolta si riscontrano sintomi similinfluenzali con
mialgie e febbre (3,6).
In Italia meridionale la presenza di C. burnetii in allevamenti
bovini e ovicaprini è risultata essere dell’11,6% e 21,5%,
rispettivamente (8).
Limitate sono le conoscenze sulla diffusione di Coxiella burnetii
negli allevamenti della provincia di Caserta, in particolare in
quelli in cui convivono bufali e bovini.
Scopo del nostro lavoro è quello di dare un’ indicazione della
sieroprevalenza di Coxiella burnetii in tali allevamenti.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto esaminando 607 campioni di siero,
di cui 370 bufali e 237 bovini, provenienti da 17 allevamenti
della provincia di Caserta (Figura 1).
Sono stati selezionati allevamenti con presenza sia di bufali
che di bovini, destinati alla produzione di latte In particolare, la
scelta delle aziende ha privilegiato quelle in cui il rapporto tra il
numero dei capi tra le due specie fosse bilanciato.
Il campionamento è stato effettuato in modo che le aziende
testate fossero localizzate sia nelle zone montuose che nelle
zone più pianeggianti della provincia di Caserta.
I campioni di siero sono stati prelevati da ottobre 2012 a luglio
2013 e conservati a -20°C fino al momento dell’esecuzione
dell’analisi.
Per la ricerca degli anticorpi anti Coxiella burnetii (Febbre Q) nei
sieri, è’ stato utilizzato il kit ELISA ID Screen® Q fever indirect
multi–species (IDVet). In breve, il siero è stato diluito1:10 e si è
proceduto al test Elisa come indicato nel manuale di istruzioni
del kit.
Sono stati considerati positivi i sieri con S/P ≥50%, e negativi
quelli con S/P ≤ 40%.
Risultati
Dei 17 allevamenti analizzati, 11 allevamenti sono risultati
sieropositivi (con almeno un capo sieropositivo), e 6 allevamenti
non presentavano capi con presenza di anticorpi anti-Coxiella.
Inoltre in tabella 1 sono rappresentati la sieroprevalenza nei
capi bovini e nei capi bufalini analizzati.
Tabella 1
specie
Numero campioni
positivi
negativi
Bufali
370
5.68%
94.32%
Bovini
237
18.56%
81.44%
Totale
607
10.71%
89.29%
Discussione e Conclusioni
I nostri risultati mostrano che il 64,7% degli allevamenti
analizzati presentano almeno un capo sieropositivo a C.
burnetii. Inoltre, si osserva una sieroprevalenza di C. burnetii
maggiore nel bovino (18,56%) che nel bufalo (5,68%). Ciò
rispecchia anche quanto descritto in bibliografia riguardo la
maggiore percentuale di positività di Coxiella burnetii su feti
abortivi bovini rispetto a quelli bufalini (5).
Capuano et al. hanno osservato una associazione diretta tra
405
tipologia di allevamento e sieropositività a Coxiella burnetii,
considerando più a rischio i capi stabulati in stalle durante
l’inverno e lasciati all’aperto in primavera (1).
Gli allevamenti da noi testati presentano bufali che vivono in
paddock esterni per tutto l’anno, mentre i bovini sono stabulati
in stalle chiuse durante l’inverno e lasciati in spazi esterni in
primavera. Ciò potrebbe essere una delle cause della maggiore
sieroprevalenza di Coxiella burnetii nei bovini rispetto ai bufali.
Le zecche sono considerate il principale serbatoio di Coxiella
burnetii responsabili della diffusione dell’infezione negli
animali selvatici e per la trasmissione ad animali domestici
(7). Nella nostra ricerca abbiamo osservato che i bufali da noi
campionati, diversamente dai bovini, non erano parassitati da
zecche, probabilmente per il maggiore spessore della cute. Ciò
potrebbe essere un ulteriore motivo di minore sieroprevalenza
nel bufalo.
Il nostro lavoro sarà prossimamente rivolto anche alle aziende
che hanno solo capi bufalini in modo da valutare quanto la
presenza dei capi bovini possa influenzare la percentuale di
sieropositività nel bufalo.
Inoltre, al fine di valutare l’effettiva presenza di Coxiella
burnetii negli allevamenti testati, questi saranno monitorati per
evidenziare casi di aborti e saranno effettuati test di PCR per la
ricerca di Coxiella burnetii su campioni di latte a vari intervalli di
tempo e sui feti in caso di aborto.
Figura1 -Distribuzione sul territorio delle aziende campionate.
- Aziende sieronegative
- Aziende sieropositive
Bibliografia
1) Capuano F,. Landolfi M. C,. Monetti D. M. 2001. Influence
of three types of farm management on the seroprevalence
of Q fever as assessed by an indirect immunofluorescence
assay. The Veterinary record 149: 669-671.
2) Dunbar, M.R., Cunningham, M.W., Roof, J.C., 1998.
Seroprevalence of selected disease agents from freeranging black bears in Florida. Journal of Wildlife Disease
34: 612–619.
3) Kazar J. 2005. Coxiella burnetii infection. Ann NY Acad
Sci. 1063:105-114
4) Komiya, T., Sadamasu, K., Kang, M.I., Tsuboshima, S.,
Fukushi, H., Hirai, K., 2003. Seroprevalence of Coxiella
burnetii infections among cats in different living environments.
The Journal of Veterinary Medical Science 65:1047–1048.
5) Lucibelli M.G., Auriemma C., Borriello G., Alfano F., Gallo
A., De Carlo E., Galiero G. 2011. Indagine sulla presenza
di Coxiella burnetii in feti bovini e bufalini nella Regione
Campania. XIII Congresso nazionale S.I.Di.L.V. 255-256
6) Maurin M. & Raoult D. 1999. Q fever. Clin Microbiol Rev.
12, 518-553.
7) Norlander, L., 2000. Q fever epidemiology and
pathogenesis. Microbes Infect. 2: 417–424.
8) Parisi A., Fraccalvieri R., Cafiero M., Miccolupo A., Padalino
I., Montagna C., Capuano F., Sottili R. 2006. Diagnosis of
Coxiella burnetii-related abortion in Italian domestic ruminants
using single-tube nested PCR. Vet Microbiol, 118: 101-106.
9) Parker, N.R., Barralet, J.H., Bell, A.M., 2006. Q-fever.
Lancet 367, 679–688.
10) Webster, J.P., Lloyd, G., Macdonald, D.W., 1995. Q
fever (Coxiella burnetii) reservoir in wild brown rat (Rattus
norvegicus) populations in the UK. Parasitology 110:31–35.
406
BUFALO E BOVINO: ANTIBIOTICORESISTENZE A CONFRONTO
Pesce A. 1, Garofalo F. 1, Coppa P.1, Salzano C. 1, Cioffi B. 1, Guarino A. 2
1
2
keywords: Antibiotic-resistance, bovine, buffalo.
Abstact
The emergence, propagation and maintenance of strains of
antimicrobial resistant pathogenic bacteria have become a
worldwide health concern in human and veterinary medicine.
The aim of this study is to compare difference of antibiotic
resistance among circulating strains in bovine and buffalo and to
assist the veterinarian to improve the effectiveness of antibiotic
therapy.
We evaluated sensitivity of Staphylococcus aureus, Escherichia
coli and Streptococcus spp, isolated from mastitis milk, to five
antibiotics.
Staphylococci isolated from buffalo have good sensitivity for
all antibiotics. E.coli, regardless of their origin, have a low
sensitivity. Streptococci have a good level of sensitivity only for
amoxicillin/clavulanic acid (88% in buffalo and 78% in bovine).
The sensitivity for cephalexin and ciprofloxacin is good only in
bacteria isolated from buffalo.
Our results show a lower occurrence of the antibiotic-resistance
in buffalo species due to a number of causes analyzed below.
Introduzione
L’insorgenza delle resistenze agli antibiotici continua ad essere
un rilevante problema medico in crescita in tutto il mondo (4).
La ricerca di possibili agenti patogeni causa di infezione
mammaria, eseguita con l’esame batteriologico su campioni di
latte è il metodo diagnostico di ausilio primario a disposizione
del veterinario aziendale. Solitamente l’obiettivo è di definire
l’eziologia, contagiosa o ambientale, e stabilire di conseguenza
i piani di prevenzione e gestione delle terapie (2).
L’importanza dell’indagine microbiologica nella diagnosi e nella
terapia delle malattie ad eziologia batterica è legata soprattutto
alla possibilità, dopo l’isolamento e l’identificazione del
microrganismo, di valutare la sua sensibilità ai chemioterapici
per poter intervenire tempestivamente con una terapia mirata;
questo, infatti, dovrebbe essere l’interesse primario del
veterinario per evitare l’instaurarsi di fenomeni di resistenza
dovuti ad un’errata somministrazione farmacologica. Il
raggiungimento di questo scopo presuppone una stretta
collaborazione tra il veterinario clinico e il microbiologo; per
impostare una corretta terapia antibiotica, è infatti necessario
conoscere non solo l’anamnesi, le infezioni pregresse e gli
eventuali trattamenti farmacologici a cui è stato sottoposto
l’animale, ma anche l’esatto comportamento che l’agente
eziologico mostra nei confronti dei diversi antibiotici.
L’uso prudente degli antibiotici in veterinaria è un tema al centro
delle politiche sanitarie internazionali. Il Ministero della Salute ha
avviato un progetto che prevede un sistema di comunicazione
volontaria del medicinale veterinario somministrato e punta ad
una riduzione dell’utilizzo di antibiotici del 20% nei prossimi cinque
anni. L’Agenzia Europea per i Medicinali (EMA) ha pubblicato il
rapporto “Trends in the sales of Veterinary antimicrobial agents
in nine European countries (2005-2009)”. E’ il risultato di quattro
anni di monitoraggio dell’uso di antibiotici effettuato in nove
Paesi Europei su richiesta della Commissione Europea, dal
quale si evince che tetracicline, penicilline e sulfamidici sono le
tre principali classi di antibiotici maggiormente venduti.
Considerando che in bibliografia (3) è spesso riportata una
diversa resistenza dei ceppi batterici isolati nei diversi Paesi
e nelle diverse specie animali, scopo di questa indagine è
confrontare l’eventuale grado di differenza di resistenza agli
antibiotici tra i ceppi circolanti nella specie bovina e bufalina.
Inoltre, il lavoro si propone di fornire un aiuto concreto al
veterinario, fornendo i dati effettivi di antibiotico resistenza dei
ceppi batterici più frequentemente isolati nella specie bufalina e
bovina della provincia di Caserta, per migliorare l’efficacia della
terapia antibiotica.
Materiali e Metodi
Lo studio è stato condotto analizzando 550 campioni di latte
mastitico della provincia di Caserta, in particolare sono stati
testati i campioni di 330 bovini e 220 di bufali pervenuti all’IZSM
Sez. di Caserta da gennaio 2010 a giugno 2013.
Le colonie da noi isolate sono state identificate utilizzando lo
strumento Vitek 2® (Biomerieux).
Si è stabilito di considerare per lo studio i tre microrganismi più
frequentemente isolati: Staphylococcus aureus, Escherichia coli
e Streptococcus spp.(Grafico 1).
Grafico 1
microrganismi isolati
staphyilococcus aureus
20,88%
e.coli
10,70%
streptococcus spp
aeromonas spp
pseudomonas spp
bacillus spp
serratia spp
altro
22,66%
4,88%
4,44%
2,22%
1,78%
32,44%
Successivamente per ognuno dei ceppi dei tre microrganismi
selezionati è stato eseguito l’antibiogramma con il metodo
Kirby Bauer. Gli aloni di inibizione sono stati misurati secondo
le norme CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).
Sulla base del rapporto EMA, per l’analisi dei dati, sono stati
scelti quali rappresentanti delle rispettive classi, i seguenti
antibiotici: amoxicillina/acido clavulanico (AMC)(classe
penicilline), sulfametoxazolo/trimethoprim (SXT) (classe
sulfamidici) e tetraciclina (TE) (classe tetracicline). Inoltre
abbiamo considerato anche due delle più recenti classi di
antibiotici: cefalosporine e fluorochinolonici, analizzando
rispettivamente cefalessina (CL) e ciprofloxacina (CIP).
I risultati sono stati definiti come sensibilità (S), sensibilità
intermedia (I) e resistenza (R).
Nelle tabelle i risultati I ed R sono stati accorpati per facilità di
lettura.
407
60%
50%
bufalo
40%
bovino
30%
20%
10%
0% (PA), 23-25 Ottobre 2013
XV Congresso Nazionale S.I.Di.L.V. - Monreale
S
I/R
S
I/R
S
I/R
S
I/R
AMC
Nel nostro lavoro 225 campioni di latte mastitico sono risultati
positivi per la ricerca di microrganismi patogeni, di cui 123
campioni di latte bovino e 102 campioni di latte di bufala.
In particolare gli Stafilococchi sono stati isolati per il 53% nel
bufalo e il 47% nel bovino; l’E.coli per il 33% nel bufalo e 67%
nel bovino; gli Streptococchi per il 43% nel bufalo e 57% nel
bovino.
La tabella 1 mostra i dati percentuali di sensibilità e resistenza
agli antibiotici selezionati, dei batteri isolati nei bufali e nei
bovini.
Streptococcus
spp
In particolare gli Stafilococchi sono stati isolati per il 53% nel
bufalo e il 47%
nel bovino;
per il bufalo
33% nelbovino
bufalo ebufalo
67%
bovino
bufalo l’E.coli
bovino
AMC
S
67%
91%
13%
25%
78%
88%
bovino.
La
tabella
1
mostra
i
dati
percentuali
di
sensibilità
I-R gli33%
9% sono 88%
75%per il22%
In particolare
Stafilococchi
stati isolati
53% nel12%e
resistenza
antibiotici
selezionati,
bufalo
e il 47% agli
nel bovino;
l’E.coli
per il 33%dei
nel batteri
bufalo eisolati
67% nei
SXT
Se nei bovini.
59%
88%
37%
50%
31%
62%
bufali
Tabella 1
bovino.
I-R
41% Staphylococcus
12%
63%
50%
69%
38%
Streptococcus
E. coli
La tabella 1 mostra aureus
i dati percentuali di sensibilitàsppe
TE
S agli 41%
3%
resistenza
antibiotici
selezionati,
dei 25%
batteri
bovino 84%
bufalo 25%
bovino
bufalo isolati
bovino nei24%
bufalo
AMCe nei bovini.
S
67%
91%
13%
25%
78%
88%
bufali
I-R I-R 59% 33% 16% 9% 75%88% 75%
97%
76%
75%
22%
12%
Tabella
SXT
S
59%
88% 1
37%
50%
31%
62%
CL
Staphylococcus
61%
41% 91% 12%
S I-R
E.63%
coli 25%
6%
56%
72%
50%Streptococcus
69%
38%
CL
I/R
CIP
100%
1
90%
70%
50%
bufalo
40%
bovino
30%
20%
10%
0%
S
I/R
S
I/R
S
SXT
I/R
S
I/R
TE
Grafico 4
S
CL
I/R
Key words: Ring test, PSA, diagnosi
CIP
Grafico 4
Streptococcus spp
100%
90%
80%
Streptococcus spp
70%
60%
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
50%
bufalo
40%
bovino
30%
20%
10%
0%
Grafico 2
90%
80%
Staphylococcus aureus
70%
60%
100% 50%
90% 40%
bufalo
bovino
80% 30%
70% 20%
60% 10%
50% 0%
40%
S
30%
I/R
S
AMC
20%
I/R
S
SXT
I/R
S
TE
I/R
S
CL
I/R
bufalo
bovino
CIP
10%
0%
S
I/R
AMC
100%
90%
80%
70%
100% 60%
90% 50%
80% 40%
S
I/R
SXT
S
I/R
Grafico
3
S
I/R
TE
CL
Escherichia coli
S
I/R
CIP
S
I/R
AMC
S
I/R
SXT
S
I/R
TE
S
I/R
CL
S
I/R
CIP
bufalo
bovino
Il nostro intento è quello di rafforzare la collaborazione con
allevatori
e veterinari aziendali al fine di divulgare un utilizzo
Bibliografia
Bibliografia
prudente
e adeguato
degliC.,
antimicrobici
modoA.,daBinkin
ridurre
1. Busani
L.,Graziani
Franco A., DiinEgidio
N., ilBattisti
1. Busani
L.,Graziani
A., Di Egidio
A., Binkin
N.,
Battisti A.
A.
2004.
Survey of C.,
theFranco
knowledge,
attitudes
andall’uomo.
practice
of 2004.
ItalianSurvey
rischio
di
trasmissione
delle
antibiotico-resistenze
of theand
knowledge,
attitudes
and practiceconcerning
of Italian beef
anduse
dairy
veterinarians
beef
dairy cattle
veterinarians
the
of cattle
antibiotics.
concerning
the use of antibiotics. Vet Rec.; 155:733-738.
Vet
Rec.; 155:733-738.
Bibliografia
Bertocchi
L., C.,
Vismara
F.,A.,Hathaway
T.,Scalvenzi
Fusi F.,
2. 2.
Bertocchi
L., Vismara
F., Hathaway
Fusi F.,
A.,Scalvenzi
Bolzoni G.,A.,
Zanardi
1. Busani
L.,Graziani
Franco
DiT.,
Egidio
A.,
Binkin
N.,
Battisti
Bolzoni
G.,G.Zanardi
G., Varisco
G. 2012.
Evoluzione
dell’eziologia
A. 2004.
Survey
of2012.
the knowledge,
attitudes
and
practice
Italian
G., Varisco
Evoluzione
dell’eziologia
della
mastiteofbovina
nel Nord Italia
mastite
bovina
nel
NordReview.
Italia dal
al 2011.
Large Animal
beef della
and2005
dairy
veterinarians
concerning
the use
of antibiotics.
dal
al cattle
2011.
Large
Animal
18. 2005
Review.
18.
Vet Rec.;
155:733-738.
3.3.
Hendriksen
RS,
Mevius
DJ,
Schroeter
A,
Teale
C,
Meunier
D, Butaye
P, Franco
Hendriksen
RS, Mevius
DJ, Schroeter
A, Teale
C, Meunier
2. Bertocchi
L., Vismara
F., Hathaway
T., Fusi
F., Scalvenzi
A., D,
A,
Utinane
A,
Amado
A,
Moreno
M,
Greko
C,
Stärk
K,
Berghold
C,
Myllyniemi
Butaye
P,
Franco
A,
Utinane
A,
Amado
A,
Moreno
M,
Greko
C,
Stärk
Bolzoni G., Zanardi G., Varisco G. 2012. Evoluzione dell’eziologia
AL,
Wasyl
D,C, Sunde
M, Aarestrup
FM.
.al2008.
of
Berghold
Myllyniemi
AL, Wasyl
D, Sunde
M,Prevalence
Aarestrup
FM.antimicrobial
.
della K,
mastite
bovina
nel Nord
Italia
dal 2005
2011.
Large
Animal
2008.
of antimicrobial
resistance
among
bacterial
resistance
among bacterial
pathogens
isolated from
cattle
in different European
Review.
18.Prevalence
pathogens
isolated
from
cattle
in different
European
countries:20023. Hendriksen
RS, Mevius
Teale
C, Meunier
D,
countries:2002-2004.
ActaDJ,
VetSchroeter
Scand.
50A,(1):28.
2004.
Acta
Scand.
50
Butaye
P, Franco
Utinane
A, (1):28.
Amado
A, Moreno
M, Greko
Stärk
4. Wright
G. Vet
D,A,2013
“ Antibiotic
resistance:
what more
do weC,know
and what more
4. WrightMyllyniemi
G. D, 2013
“ Antibiotic
resistance:
what more
do. we know
K, Berghold
AL,
Wasyl D, Sunde
M, Aarestrup
FM.
we can C,
do” BMC Biology.
11:51.
what more
we can do” BMC
Biology.
11:51.bacterial
2008.and
Prevalence
of antimicrobial
resistance
among
pathogens isolated from cattle in different European countries:20022004. Acta Vet Scand. 50 (1):28.
408
4. Wright G. D, 2013 “ Antibiotic resistance: what more do we know
and what more we can do” BMC Biology. 11:51.
Grafico 3
Escherichia coli
bufalo
bovino
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, via Gaetano Salvemini, 1 – Perugia
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, via F.lli Kennedy – Nuoro
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, via dell’Acquedotto Romano – Elmas (Cagliari)
4
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, via Vienna 2 – Sassari
5
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, via Atene – Oristano
1
60%
Dalla valutazione dei grafici emerge un diverso comportamento
dei ceppi di E. coli che risultano resistenti a tutte le classi di
antibiotici testati tranne che alla CIP. Probabilmente tale resistenza
è dovuta alla pratica, diffusa nei paesi europei, di prescrivere e
Gli stafilococchi isolati dal bufalo presentano per tutti gli somministrare antibiotici per la terapia di malattie enteriche e
antibiotici analizzati una buona sensibilità (>80%) mentre quelli respiratorie (1).
tutte Nella
le classi
di antibiotici
testati ottenuti
tranne si
cheevidenzia
alla CIP.una minor
valutazione
dei risultati
isolati
dainon
bovini
hanno
sensibilità
che, in
ogni
caso,
caso,
supera
mai una
il 67%
ad eccezione
della
CIP
con non
un
insorgenza tale
delresistenza
fenomenoè dovuta
dell’antibiotico-resistenza
nella
Probabilmente
alla pratica, diffusa
insorgenza
del
fenomeno
dell’antibiotico-resistenza
nella specie
supera
mai
67%
ad eccezione
CIP con
valore
delil72%.
Gli valore
stafilococchi
isolati
dal bufalo della
presentano
peruntutti
gli del
specieeuropei,
bufalina di
probabilmente
alle seguenti
ipotesi:
nei paesi
prescrivere edovuta
somministrare
antibiotici
bufalina
probabilmente
dovuta
alle
seguenti ipotesi:
Gli E.coli,
indipendentemente
dalla loro provenienza,
hanno
72%.
antibiotici
analizzati
una buona sensibilità
(>80%) mentre
 terapia
negli allevamenti
vi eèrespiratorie
la consuetudine
per la
di malattie bufalini
enteriche
(1). di non usare
una
bassa
sensibilità,
minoreuna
delsensibilità
50%
tutti

negli
allevamenti
bufalini
vi
è
la
consuetudine
di non
usare
nuove
quelli
isolati
dai
bovini hanno
che, gliin antibiotici
ogni
Gli
E.coli,
indipendentemente
dalla
loro per
provenienza,
hanno
nuove
classi
di
antibiotici
e
utilizzare,
in generale,
meno
Nella valutazione dei risultati ottenuti si evidenzia
una
minor
analizzati
ad eccezione
dalla
CIP 50%
(> 94%)
nei
ceppi
isolati
caso,
non supera
mai il 67%
ad del
eccezione
della
CIP
con
un ininsorgenza
classi
didel
antibiotici
e utilizzare,
in generale,
menosubcliniche
chemioterapici
una
bassa
sensibilità,
minore
per
tutti
gli
antibiotici
chemioterapici
vista
ladell’antibiotico-resistenza
prevalenza
di mastiti
fenomeno
nella
entrambe
le specie.
valore
del 72%.
vista
la prevalenza
di mastiti
subcliniche
rispetto
alla specie bovina.
rispetto
alla
specie
bovina.
specie
bufalina
probabilmente
dovuta
alle seguenti
ipotesi:
analizzati
ad eccezione dalla CIP (> 94%) nei ceppi isolati in
streptococchi
hanno un dalla
buonloro
livello
di sensibilità
solo per  negli
Gli Gli
E.coli,
indipendentemente
provenienza,
hanno

l’allevamento
intensivo
specie
bufalina
è abbastanza
l’allevamento
intensivo
della
specie
bufalina
è abbastanza
allevamenti bufalini
vi èdella
la
consuetudine
di non
usare
entrambe
le
specie.
(88%
nel bufalo
e 78%
bovino),
mentre
la sensibilità nuove
unaAMC
bassa
sensibilità,
minore
delnel
50%
per tutti
gli antibiotici
recente,
per
cuiininfuturo
futuro
potremmoattenderci
attenderci
uno
sviluppo delle
classi
dicui
antibiotici
epotremmo
utilizzare,
in
generale,
meno
recente,
per
uno
sviluppo
Gli
streptococchi
hanno
un
buon
livello
di
sensibilità
solo
per
per SXT
TE non èdalla
soddisfacente.
per inCL e chemioterapici
analizzati
ad eeccezione
CIP (> 94%)Laneisensibilità
ceppi isolati
delle antibiotico-resistenze
come
è verificato
nei bovini.
vista la come
prevalenza
disi mastiti
subcliniche
si
è
verificato
nei
bovini.
AMC
(88%
bufalo
e 78%
bovino),
mentre
la sensibilità rispetto
CIP
è buona
(72%) solo
nei nel
batteri
isolati dal
bufalo.
entrambe
le nel
specie.
Presumibilmente
minore
insorgenza
antibioticoalla specie bovina.
Presumibilmente
lalaminore
insorgenza
delledelle
Gli In
streptococchi
hanno
un buon
livelloLa
disensibilità
sensibilità
solomaggiore
pere CIP
generale
possiamo
quindi
osservare
una
per
SXT
e TE non
è soddisfacente.
per
CL
 l’allevamento
intensivo
dellabufalina
specie bufalina
abbastanza
resistenze nella
specie
è dovutaè ad
una serie di
nella specie
bufalina
è dovuta ad attenderci
una serie di
concause che non ci
(88%
nelagli
bufalo
e 78%
nel iisolati
bovino),
mentre
la bufalo
sensibilità
sensibilità
antibiotici
per
batteridal
isolati
nel
rispetto recente,
èAMC
buona
(72%)
solo
nei
batteri
bufalo.
per cui
in futuro
uno sviluppo una
concause
che
non potremmo
ci consentono di individuarne
per
TE
non
soddisfacente.
sensibilità
per sensibilità
CL e
consentono
di individuarne
una
aSXT
quellie isolati
nelèbovino
2 La
- 3una
- 4).maggiore
delle
come
si prevalente.
è verificato nei bovini.
In
generale
possiamo
quindi(Grafici
osservare
prevalente.
CIP è buona (72%) solo nei batteri isolati dal bufalo.
nostro intento
intento
èquello
quello
di rafforzare
la antibioticocollaborazione
Presumibilmente
la èminore
insorgenza
delle
IlIl nostro
di rafforzare
la collaborazione
con con
agli
antibiotici per i batteri isolati
nel bufalo
rispetto a quelli
In generale possiamo quindi
osservare
una maggiore
Grafico
2
allevatori
e
veterinari
aziendali
al
fine
di
divulgare
un
utilizzo
resistenze
nella
specie
bufalina
è
dovuta
ad
una
serie
di
allevatori
e
veterinari
aziendali
al
fine
di
divulgare
un
utilizzo
isolati
nel bovino
(Graficiper
2 -i batteri
3 - 4). isolati nel bufalo rispetto
sensibilità
agli antibiotici
concause
cheeeadeguato
non
ci consentono
di individuarne
prudente
adeguato
degli
antimicrobici
in modo
da ridurre
il
prudente
degli
antimicrobici
in modo
da una
ridurre
il
Staphylococcus aureus
a quelli isolati nel bovino (Grafici 2 - 3 - 4).
prevalente.
rischio
di
trasmissione
delle
all’uomo.
rischio
di
trasmissione
delle
all’uomo.
Grafico 2
100%
Petrini S., 2Bandino E., 3Liciardi M., 4Oggiano A., 5Ruiu A., 1Iscaro C., 1Giammarioli M., 1Feliziani F., 1De Mia G.M.
80%
aureus
spp
S
41%
84%
25%
25%
3%
24%
20%
bovino59% bufalo
75%bovino
97%bufalo28%
76%
I-R I-R 39%
9% 16% bovino
94%75%bufalo
75%
44%
10%
AMCCL
S
67% 61%
91% 91% 13% 6% 25% 25% 78% 56% 88% 72%
S
0%
Dalla
valutazione
deiI/R grafici
emerge
un diverso
I-R I-R
33% 39%
9% 9% 88% 94% 75% 75% 22% 44% 12% 28%
S
I/R
S
I/R
S
S
I/R
S
I/R
CIP
S
72%
100%
93%
100%
48%
72%
SXT CIP
S
59% 72%
88% 100% 37% 93% 50% 100% 31% 48% 62% 72%
S
comportamento dei ceppi di E. coli che risultano resistenti a
AMC
SXT
TE
CL
CIP
I-R
41% 28%
12%
52% 38% 28%
28%
I-R I-R 28%
0% 0% 63%
7% 7% 50%
0%0% 69%52%
tutte le classi di antibiotici testati tranne che alla CIP.
TE
S
41%
84%
25%
25%
3%
24%
I-R
59%
16%
75%
75%
97%
76%
Probabilmente tale resistenza è dovuta alla pratica, diffusa
dal bufalo
presentano
tutti gli
CL Gli stafilococchi
S
61% isolati91%
6%
25%
56% per 72%
paesi europei,dei
di prescrivere
e somministrare
antibiotici
Dallanei valutazione
grafici emerge
un diverso
I-R
39%
9% buona
94% sensibilità
75%
44%
28%
antibiotici
analizzati
una
(>80%)
mentre
per la terapia
di ceppi
malattie
enteriche
respiratorie
(1).
CIP
S
72%
100%
93%
100%
48%
72%
comportamento
dei
di E.
coli chee risultano
resistenti
a
quelliI-Risolati dai
una sensibilità
in ogni
28% bovini0%hanno 7%
0%
52%che, 28%
Nella valutazione dei risultati ottenuti si evidenzia una minor
TE
Nazionale S.I.Di.L.V. - Monreale (PA), 23-25 Ottobre 2013
CIRCUITO INTERLABORATORIO PER LA DIAGNOSI DI
PESTE SUINA AFRICANA IN SARDEGNA
Grafico 3
Escherichia coli
Tabella 1
E. coli
TE
Grafico 3
AMC
Staphylococcus
aureus
SXT
S
beef and dairy cattle veterinarians concerning the use of antibiotics.
Vet Rec.; 155:733-738.
2. Bertocchi L., Vismara F., Hathaway T., Fusi F., Scalvenzi A.,
Bolzoni G., Zanardi G., Varisco G. 2012. Evoluzione dell’eziologia
della mastite bovina nel Nord Italia dal 2005 al 2011. Large Animal
Review. 18.
XV Congresso
3. Hendriksen RS, Mevius DJ, Schroeter A, Teale C, Meunier D,
Butaye P, Franco A, Utinane A, Amado A, Moreno M, Greko C, Stärk
K, Berghold C, Myllyniemi AL, Wasyl D, Sunde M, Aarestrup FM. .
2008. Prevalence of antimicrobial resistance among bacterial
pathogens isolated from cattle in different European countries:20022004. Acta Vet Scand. 50 (1):28.
4. Wright G. D, 2013 “ Antibiotic resistance: what more do we know
and what more we can do” BMC Biology. 11:51.
SUMMARY
An interlaboratory Ring Trials to evaluate the laboratories involved
in African Swine Fever (ASF) diagnosis was organized. Three
panels of different samples were sent to four laboratories for
ELISA test, Fluorescent Antibody Test (FAT) and PCR/Real time
PCR reactions. The results evidenced that all the participating
laboratories showed a high proportion of concordant results
together with a good harmonisation of procedures.
INTRODUZIONE
La peste suina africana (PSA) è una malattia infettiva del suino
domestico e selvatico il cui agente eziologico appartiene alla
famiglia Asfarviridae genere Asfivirus. La PSA è presente in
Africa, in Italia (Sardegna), nella regione del Caucaso e nella
Federazione Russa (4). Ad oggi, la diagnosi di PSA viene
effettuata su campioni di siero, sangue e organi in accordo alle
procedure raccomandate dall’organizzazione mondiale per la
sanità animale (8). Tra queste, la prova di immunofluorescenza
allestita su sezioni criostatiche (FAT) ha lo scopo di evidenziare
l’antigene virale (3). La prova di emoadsorbimento virale (HAD)
è basata sul legame che si stabilisce tra gli eritrociti di suino
e la superficie dei monociti o dei macrofagi infetti e consente
l’isolamento del virus (7); le prove di PCR e Real time PCR
hanno lo scopo di rilevare il genoma virale e consentono anche
di evidenziare gli stipiti di PSA non emoadsorbenti, inclusi quelli
ad alta e bassa virulenza (1-2,5-6); infine, le prove sierologiche
sono impiegate per rilevare gli anticorpi. Di ampia diffusione sono
le metodiche immunoenzimatiche (ELISA), mentre le conferme
sierologiche vengono eseguite con prove di immunoperossidasi
o immunoblotting (8). L’armonizzazione e la standardizzazione
delle prove di laboratorio sono essenziali per una corretta
diagnosi di PSA, e sono appannaggio dei laboratori nazionali
di referenza. In quest’ambito, il Centro di Referenza Nazionale
per lo studio delle malattie da Pestivirus e Asfivirus (CEREP),
ha avuto come obiettivo quello di organizzare nel 2012 un ring
test (RT) per la diagnosi della PSA. In questo studio, ne vengono
riportati i risultati ottenuti dai singoli laboratori.
Il primo è stato allestito con 20 sieri raccolti da differenti animali
sperimentalmente infettati con il virus della PSA e collezionati a
diversi giorni post-infezione. Il secondo è stato preparato con 12
sezioni criostatiche allestite da differenti organi (linfonodi sottomandibolari, tonsille palatine, milza) e il terzo è stato costituito
da 15 omogenati d’organo, preparati da differenti campioni clinici
(linfonodi sotto-mandibolari, tonsille palatine, rene, milza). I
pannelli sono stati completati con l’aggiunta di controlli positivi
e negativi e successivamente congelati a -20°C fino al loro invio
ai laboratori partecipanti al RT. La valutazione della stabilità degli
stessi è stata effettuata saggiando i campioni rispettivamente
dopo 24 ore, a 15 e 35 giorni post-congelamento. I campioni
sono stati poi inviati ai laboratori in ghiaccio secco, per mezzo
di un corriere, nel rispetto delle norme UN 1845 e UN 2900 e in
accordo con i regolamenti dell’associazione del trasporto aereo
(IATA 2009 e ADR 2009). Il periodo di trasporto è stato di 4 giorni.
I risultati ottenuti sono riassunti nelle Tabelle 1 e 2.
MATERIALI E METODI
Sono stati preparati diversi campioni sperimentali dedicati alla
diagnosi di PSA con le seguenti metodiche: ELISA, FAT, PCR/
Real time PCR. I campioni sono stati inviati a tutti i laboratori
nello stesso giorno ed a ciascuno è stato richiesto di utilizzare
le procedure correntemente in uso nella routine diagnostica.
Quattro laboratori identificati da L1 a L4 appartenenti all’Istituto
Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, sono stati invitati
a prendere parte al RT. Tutti i laboratori hanno partecipato con
le metodiche sopramenzionate, ad eccezione del laboratorio L4
che ha eseguito solo le prove ELISA e PCR/Real time PCR. Tre
pannelli di campioni sono stati preparati per la diagnosi di PSA.
409
Tabella 1 – Risultati ottenuti dal CEREP sui campioni
del RT.
FAT2
PCR3,4 /Real time PCR5
ELISA1
ID
ID
ID
Esito
Esito
Esito
siero
sezione
organo
1
+
1
+
1
+ (Ct 24,79)
2
2
2
3
+
3
+
3
+ (Ct 23,02)
4
4
+
4
+ (Ct 22,94)
5
+
5
5
+ (Ct 24,58)
6
+
6
+
6
7
+
7
+
7
+ (Ct 23,95)
8
8
8
+ (Ct 26,59)
9
+
9
+
9
+ (Ct 21,73)
10
10
10
+ (Ct 26,28)
11
11
11
+ (Ct 28,99)
12
12
+
12
+ (Ct 27,30)
13
+
13
+ (Ct 24,52)
14
14
+ (Ct 21,36)
15
+
15
16
17
18
+
19
20
+
1
ELISA,Ingezim Ingenasa, ES;
2
FAT, prova di immunofluorescenza su sezioni criostatiche;
3
PCR, OIE-PCR (Augero et al., 2003);
4
UPL-PCR (Fernandez et al., 2012);
5
Real time PCR, OIE Real time PCR (King et al., 2003);
Ct, cicli soglia
generale questo test, mal si presta alle esigenze di un circuito
interlaboratorio, tanto è vero che questa prova è stata esclusa
anche dal corrispondente circuito internazionale.
Come valutazione generale, la capacità diagnostica di ciascun
laboratorio è da ritenersi soddisfacente ed i risultati forniti, nel
loro insieme, sono stati conformi all’atteso, soprattutto perché
sono stati correttamente individuati tutti i campioni positivi. La
sensibilità diagnostica del sistema è pertanto da considerarsi
buona. Sporadici errori di interpretazione legati a risultati
falsi positivi, sono da valutare nell’ambito delle criticità sopra
esposte e non si ritengono rilevanti. I test biomolecolari hanno
evidenziato le performances migliori e tutti i laboratori hanno
fornito risultati conformi all’atteso. Ne risulta che queste prove
sono condotte secondo standard adeguati e collaudati.
Tabella 2 – Percentuali di corretta identificazione dei
campioni positivi e negativi da parte dei laboratori
partecipanti al RT ottenute con le metodiche ELISA, FAT
e PCR/Real time PCR.
Laboratori
Prova
ELISA1
FAT2
PCR3,4/Real
time PCR5
2
Campioni
L1
L2
L3
L4
Totali
100
95
95
95
Positivi
100
90
90
90
negativi
100
100
100
100
Totali
91,7
100
83,3
N.A.
Positivi
100
100
100
N.A.
negativi
80
100
60
N.A.
Totali
100
100
100
100
Positivi
100
100
100
100
negativi
100
100
100
100
1
ELISA, Ingezim Ingenasa, ES;
FAT, prova di immunofluorescenza su sezioni criostatiche;
3
PCR, OIE-PCR (Augero et al., 2003);
4
UPL-PCR (Fernandez et al., 2012);
5
Real time PCR, OIE Real time PCR (King et al., 2003);
N.A., non applicabile.
Di fronte ad una emergenza come quella che si sta verificando
in Sardegna per la PSA, è essenziale fornire una risposta
adeguata in termini di efficienza ed efficacia che deve basarsi
su specifiche e collaudate procedure fondate sulle buone
pratiche di laboratorio. Questo processo include anche
l’implementazione di attività di verifica delle performances
previste dal sistema qualità per individuare eventuali criticità
e mettere in atto le conseguenti azioni correttive. In questa
ottica è da giudicare assolutamente positiva la risposta fornita
dai laboratori che hanno aderito al RT con professionalità
e spirito di collaborazione. In termini generali, la risposta
diagnostica fornita è stata conforme all’atteso e gli operatori
hanno dimostrato di eseguire correttamente le prove sia
dirette che indirette per la diagnosi di PSA. Evidentemente
l’esperienza acquisita nel corso degli anni ha consolidato un
corretto approccio alla problematica oggetto di RT. Analizzando
singolarmente le prove, è da ritenersi soddisfacente la
capacità diagnostica dimostrata attraverso la prova ELISA.
In effetti 3 laboratori non hanno individuato correttamente
il siero numero 6 che era stato inserito nel pannello come
“indicatore soglia” e pertanto diluito artificialmente fino al limite
della rilevabilità. Nella valutazione di questo siero non era
pertanto in gioco la capacità diagnostica del laboratorio quanto
invece la sensibilità analitica del test in uso. Da sottolineare
che L1, ha correttamente valutato il siero attraverso il test di
immunoblotting che è impiegato come prova di conferma di
PSA, mentre l’ ELISA rimane un test di screening applicabile su
larga scala per il monitoraggio di popolazioni esposte al rischio
di infezione. L’’immunofluorescenza ha messo in luce alcune
criticità, peraltro insite nella prova stessa, in primo luogo per il
fatto di non possedere dei criteri oggettivi di interpretazione. In
BIBLIOGRAFIA
1.Aguero M., Fernandez J., Romero L., Sanchez C.,
Arias M., Sanchez-Vizcaino J.M. (2003). Higly sensitive PCR
assay for the routine diagnosis of African swine fever virus
clinical samples. J Clin Microbiol 41(9), 4431-4434.
2. Aguero M., Fernandez J., Romero L., Zamora M.J.,
Sanchez C., Belak S., Arias M., Sanchez-Vizcaino JM. (2004).
A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR
assay for the simultaneous and differential diagnosis of African
swine fever and Classical swine fever. Vet Res, 35, 1-13.
3. Bool P.H., Ordas A., Sanchez Botija C. (1969) El
diagnostic della peste porcina Africana por immunofluorescencia.
Bull OIE, 72, 819-839.
4. Costard S., Mur L., Lubroth J., Sanchez-Vizcaino
J.M., Pfeiffer D.U. (2013). Epidemiology of African Swine fever
virus. J Virol Met 173, 191-197
5. Fernandez-Pinero J., Gallardo C., Elizalde M.,
Rasmussen T.B., Stahl K., Loeffen W., Blome S., Batten C.,
Crooke H., Le Potier M.F., Uttenthal A., LeBlanc N., Albina E.,
Kowalczyk A., Markowska-Daniel I., Tignon m., De Mia G.M.,
Giammarioli M., Arias M., Hoffman B. (2010). Epizone ring
trial on ASF real time PCR. Annual Meeting of national African
Swine Fever Laboratories, 18 Maggio 2010, Polonia.
6. King D.P., Reid s.M., Hutchings G.H., Grierson S.S.,
Wilkinson P.J., Dixon L.K., Bastos A.D.S., Drew T.W. (2003).
Development of Taqman® PCR assay with internal amplification
control for the detection of African swine fever virus. J Virol
Methods 107, 53-61.
7. Malmquist W.A., Hay D. (1960). Haemadsorption and
cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine
bone marrow and buffy coat cultures. Am J Vet Res, 21, 104108.
8. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for
terrestrial Animals, Sixth Edition, 2008, Sez. 2.8.1, pp. 1-13.
410
CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI STIPITI DI CIRCOVIRUS SUINO TIPO 2 (PCV2)
ISOLATI NEL CENTRO ITALIA
Petrini S., Bazzucchi M., Casciari C., Pierini I., Feliziani F., Giammarioli M., De Mia G.M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, Via Gaetano Salvemini, 1 – 06126 Perugia
Key words: PCV2, suidi, analisi filogenetica
Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the main causative agent
of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS).
The aim of this study was to determine the genetic diversity
of PCV2 in Umbria and Marche regions, in central Italy.
Organ homogenates from both domestic pigs and wild boars
were inoculated on the PK 15 cell line and examined for the
presence of virus by fluorescent antibody (FA) test. Total DNA
was extracted from FA positive cultured cells and PCR was
conducted to amplify a fragment of the open reading frame 2
(ORF2) of PCV2 isolates. The analysis of PCV2 sequences
revealed that the viruses originated from domestic pig clustered
in the 2b genetic group, whereas the wild boar isolates were
allocated within the 2a genotype.
e amplificato mediante una PCR che amplifica un frammento
di 263 bp dell’ORF2 (5). L’amplificato di tre cloni indipendenti
per ogni campione analizzato è stato purificato, quantificato
e sequenziato in entrambe le direzioni mediante ABI PRISM
3130 DNA Sequencing System. Le sequenze ottenute sono
state analizzate con il pacchetto DNAstar. L’allineamento
multiplo con sequenze di riferimento ottenute dalla GenBank
e rappresentative dei genotipi 2a, 2b, 2c e di stipiti vaccinali, è
stato effettuato con ClustalX2 e le sequenze sono state editate
con BioEdit. L’albero filogenetico (Maximum Likelihood-ML) è
stato costruito mediante il software RDP3. L’analisi statistica è
stata effettuata su 10.000 replicati. L’albero è stato visualizzato
mediante FigTreev1.3.1.exe. L’analisi per verificare la presenza
di fenomeni di ricombinazione è stata effettuata con i software
RDP e Simplot.
INTRODUZIONE
Il circovirus suino tipo 2 (PCV2) rappresenta un serio problema
per l’allevamento suino in tutto il mondo essendo responsabile
di una serie di sindromi associate a diverse manifestazioni
cliniche (1). Il virus ha un DNA circolare a singolo filamento che
contiene tre Open reading frames (ORF1, ORF2, ORF3). ORF2
rappresenta il marker di elezione per gli studi di filogenesi e di
epidemiologia molecolare (4). Diversi studi di genotipizzazione,
hanno evidenziato 2 distinti tipi di PCV2, un terzo è stato
identificato in campioni di origine danese (2).
Attualmente la classificazione di PCV2 raggruppa i diversi stipiti
in 3 genotipi: PCV2a, PCV2b e PCV2c (4). Il PCV2a è stato
inoltre suddiviso in 5 sub-genotipi (2A-2E) mentre il PCV2b è
stato suddiviso in tre sub-genotipi (1A-1C) (4). Numerosi studi
hanno dimostrato che il PCV2 è in continua evoluzione, in
seguito a mutazioni puntiformi e ricombinazione genica, che
conducono all’emergenza di nuove varianti virali (3). Scopo del
presente lavoro è stato quello di genotipizzare stipiti di PCV2
circolati nel centro Italia in suidi domestici e selvatici.
Dei 39 campioni analizzati 14 sono risultati positivi all’isolamento
ed utilizzati per il dataset di sequenze da analizzare (Tabella 1).
SUMMARY
Tabella 1 - Isolati di PCV2 utilizzati nello studio
MATERIALI E METODI
Campioni d’organo (linfonodi, milza, polmone, rene, intestino
tenue, ileo e tonsilla palatina), sono stati raccolti da 21 suini con
sintomatologia clinica riferibile a sindrome multisistemica postsvezzamento del suino (PMWS) e dermatite-nefrite del suino
(PDNS), durante gli esami necroscopici condotti nel periodo
2008-2011. Altri 18 campioni sono stati collezionati da cinghiali
cacciati in ATC umbre nella stagione venatoria 2011/2012. Tutti
i campioni sono stati utilizzati per allestire prove di isolamento
virale e di sequenziamento genico. Omogenati d’organo sono
stati seminati su colture cellulari della linea PK 15 esenti da
PCV2. A 4 giorni dalla semina, le colture sono state saggiate per
la presenza del virus mediante prove di immunofluorescenza
eseguita con un coniugato policlonale anti PCV2 del commercio.
Il DNA virale è stato estratto con il kit QIAamp DNA mini kit
Campione/anno
Sintomi
clinici
Regione
Origine
62297/2.2008
PMWS
Marche
suino
28375/2008
PMWS
Marche
suino
15287.S1/2008
PMWS
Umbria
suino
16287/2008
PMWS
Marche
suino
44502/LN/08
PMWS
Umbria
suino
44502/P/08
PMWS
Umbria
suino
53054/P/08
PDNS
Marche
suino
15287/S2/08
PMWS
Umbria
suino
20560/3/08
PMWS
Umbria
suino
40596/2010
PMWS
Marche
suino
22.GO-DIVA9.2012
nd
Umbria
cinghiale
23.GO-DIVA12.2012
nd
Umbria
cinghiale
39.GO-DIVA33.2011
nd
Umbria
cinghiale
42.GO-DIVA102.2012
nd
Umbria
cinghiale
I risultati dell’analisi filogenetica mostrano che è possibile
suddividere gli isolati collezionati in due gruppi genetici distinti
(Fig.1). Tutti gli isolati di origine suina clusterizzano nel genotipo
2b, mentre quelli provenienti da cinghiali clusterizzano nel
genotipo 2a.
411
BIBLIOGRAFIA
Figura 1 - Analisi filogenetica degli isolati PCV2 analizzati.
1. Petrini S., Paniccià M., Gavaudan S., Simone E.,
Sensi M., Filipponi G., Rigotti L., Fortunati M., Ferrari
M., De Mia G.M. (2011). Principali malattie associate
all’infezione da circovirus suino tipo 2 (PCV2). Large
Animal Review, 17:89-98.
2. Dupont K., Nielsen e.O., Baekbo P., Larsen l.E.
(2008). Genomic analysis of PCV2 isolates from
Danish archives and a current PMWS case-control
study supports a shift in genotypes with time. Vet
Microbiolog, 128:56-64.
3. Olvera A., Cortey M., Segales J. (2007). Molecolar
evolution of porcine circovirus type 2 genomes:
phylogeny and clonality. Virology 357:175-185.
Nessuno degli isolati analizzati appartiene invece al genotipo
2c. In particolare, gli isolati collezionati dai suini dal 2008 al
2011 si collocano all’interno del cluster PCV2b-1A1B con una
percentuale di identità intra-group del 94,4-100%. Gli isolati
collezionati da cinghiali si collocano invece nel cluster PCV2a1E con una percentuale di identità intra-group del 86,1-95,9%.
I risultati ottenuti suggerirebbero che in questa area geografica,
i contatti suino-cinghiale non siano frequenti e che, almeno
per quanto riguarda il PCV2, non ci sia stato un passaggio di
virus dal suino al cinghiale e viceversa. Per confermare quanto
sopra, sarà necessario estendere ulteriormente le indagini
ad un numero più elevato di campioni, anche per verificare la
presenza di varianti virali ed analizzare l’evoluzione molecolare
del virus. Infine, l’analisi di ricombinazione effettuata non
ha mostrato la presenza di eventi ricombinanti all’interno
del frammento dell’ORF2 analizzato. Sarebbe auspicabile
approfondire la caratterizzazione degli isolati mediante analisi
dell’intero ORF2 per evidenziare, con livelli di probabilità
maggiore, eventuali mutazioni, in special modo a carico delle
proteine strutturali maggioritarie del virus, per le implicazioni
che ciò potrebbe avere sulla risposta immunitaria dell’ospite.
4. Chunya Wei, Minze Zhang, Ye Chen, Jiexiong Xie,
Zhen Huang, Wanjun Zhu, Tingchuang Xu, Zhenpeng
Cao, Pei Zhou, Shuo Su, Guihong Zhang. Genetic
evolution and phylogenetic analysis of porcine
circovirus type 2 infections in southern China from
2011 to 2012. Infection, Genetics and Evolution, 17,
(2013) 87-92.
5. Huang C., J. Hung, G. Wu, M. Chien, Multiplex PCR
for rapid detection of pseudorabies virus porcine
parvovirus and porcine circovirus”. Veterinary
Microbiology, 101 (2004), 209-214.
CONSIDERAZIONI SULLA GESTIONE E PREVALENZA DELLE MALATTIE DENUNCIABILI
DELLE API IN ITALIA NEGLI ANNI 2006-2010
Pietropaoli M.1, Maroni Ponti A.2, Ruocco L.2 , Mutinelli F.3, Lavazza A.4, Bassi S.4, Sacchi C.4, Sala G.4,
Nassuato C.5, Scholl F. 1, Formato G.1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, UO di Apicoltura, Roma;
2
Ministero della Salute, DGSAF, Roma;
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Centro di referenza nazionale per l’apicoltura, Legnaro (PD);
4
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Brescia;
5
Regione Lombardia
1
Key words: Apis mellifera, malattie denunciabili, prevalenza, gestione, RPV
SUMMARY
In the framework of a research project funded by the Ministry
of Health (RC IZSLT 11/07), we focused on outbreaks and
management of notifiable honey bee diseases in Italy in order
to identify possible improvements of the current national
veterinary regulation.
INTRODUZIONE
Ai sensi del Regolamento di Polizia Veterinaria (RPVD.P.R 320/1954), tra le malattie denunciabili delle api sono
annoverate: acariosi, varroatosi (O.M 21 4 1983 e OM 17 2
1995), peste americana, peste europea, nosemiasi, aethinosi
e tropilaelapsosi.
Con il progetto di ricerca corrente 2007 del Ministero della
Salute “Studio epidemiologico sulle malattie denunciabili
delle api e valutazione del relativo quadro normativo” è stato
effettuato uno studio di epidemiosorveglianza per avere delle
indicazioni sulla diffusione delle malattie denunciabili delle api
e valutare quindi eventuali modifiche alla normativa sanitaria
vigente per migliorarne il controllo.
MATERIALI E METODI
Lo studio di epidemiosorveglianza su scala nazionale è stato
realizzato attraverso la distribuzione di questionari ad hoc
e la raccolta di tutte le segnalazioni ufficiali di focolai noti di
malattie denunciabili rilevate nel periodo 2006-2010 dagli
IIZZSS e dal Centro di Referenza Nazionale, che hanno fatto
capo al coordinamento del Ministero della Salute.
I questionari distribuiti agli apicoltori per verificare la loro
conoscenza sulle malattie erano composti da una sezione
anagrafica, una in cui descrivere la caratterizzazione
geografica dell’apiario ed una in cui indicare le malattie
rilevate in apiario dal 2006 al 2010.
I dati sui focolai di malattie denunciabili ottenuti dalle
segnalazioni ufficiali degli II.ZZ.SS. sono stati georeferenziati
per ottenere un quadro preciso della diffusione delle malattie
delle api.
Di seguito vengono elencate le diverse malattie delle api e le
considerazioni cui si è pervenuti in funzione della prevalenza
registrata. Grazie alla georeferenziazione dei focolai di
malattie denunciabili (Fig. 1-3) e all’analisi dei 74 questionari
raccolti dagli apicoltori (Tab.1) è stato possibile ottenere un
interessante quadro delle malattie denunciabili, fino ad allora
inedito.
412
Tabella 1. Questionari di epidemiosorveglianza raccolti
Regione
N. questionari compilati
Lazio
56
Toscana
6
Lombardia
4
Piemonte
3
Abbruzzo
3
Marche
2
Totale
74
Acariosi (Acarapis woodi) – è risultata essere una malattia
poco o nulla conosciuta dagli apicoltori. Anche se non viene
ricercata routinariamente dai laboratori II.ZZ.SS., si ritiene sia
scomparsa dal territorio nazionale grazie a trattamenti per il
contenimento della varroatosi.
Alla luce di quanto ad oggi noto su tale patologia è stato
considerato corretto l’attuale approccio gestionale previsto dal
RPV.
Varroatosi (Varroa destructor) – è stata confermata come
malattia endemica sul territorio nazionale fin dal 1983, come
anche confermato dal Centro di Referenza Nazionale per
l’Apicoltura. E’ stata segnalata nei questionari da tutti gli
apicoltori e risultava del tutto non gestita dai Servizi Veterinari
Pubblici.
Nell’ambito del progetto, quindi, con iniziativa del Ministero
della Salute ed il coinvolgimento delle Associazioni Nazionali
di Apicoltori e delle Regioni, è stata proposta una bozza di
O.M che superasse le precedenti (O.M. del 21 aprile 1983
e del 17 febbraio 1995), al fine di rendere tale patologia non
più denunciabile e quindi non più soggetta alle vigenti norme
di cui al Regolamento di Polizia Veterinaria al tempo stesso
sono state predisposte modalità operative per il controllo della
varroatosi meno restrittive, ponendo maggiore attenzione
all’esecuzione dei trattamenti antivarroa.
Peste europea – è una malattia batterica della covata causata
da Melissococcus plutonius classificabile come endemica (Fig.
1 e Tab. 2) e quindi si ritiene poco sostenibile l’approccio di
eradicazione a livello nazionale previsto dal Regolamento di
Polizia Veterinaria.
413
Figura 1. Georeferenziazione dei focolai ufficiali di peste
europea (casi clinici) in Lazio e Toscana (2006 – 2010)
americana (casi clinici) in Lazio e Toscana (2006 – 2010)
Tabella 2. Focolai ufficiali di peste europea suddivisi per
regione (2006-2011)
Regione
N. focolai
Lazio
34
Toscana
4
Lombardia
3
Puglia
1
Totale
42
americana (casi clinici) in Lombardia ed Emilia Romagna
(2006-2010)
Peste americana – è una malattia causata dal batterio sporigeno
Paenibacillus larvae ed anch’essa risulta endemica sul territorio
nazionale (Fig. 2-3 e Tab. 3). Considerato tale carattere
di endemicità, il Ministero della Salute, con Nota DGSAF
0007575-P-18/4/2012 Regolamento di polizia veterinaria - Art.
155 “Misure di controllo della peste americana” ha specificato
che la sola presenza di spore non definisce un “caso” di
malattia, e le misure di distruzione previste dall’art. 155 del
RPV si applicano, solo alle famiglie con sintomi clinici. Inoltre,
è stato previsto che trascorse 2 settimane dalla distruzione
delle famiglie colpite i Servizi veterinari debbano rientrare nelle
aziende per controllare le restanti famiglie e in assenza di nuovi
casi clinici chiudere i focolai.
Tabella 3. Focolai di peste americana suddivisi per regione
(2006-2011)
Aethiniosi e Tropilaelapsosi – Sono parassitosi esotiche e come
tali entrambe inserite nell’elenco delle malattie denunciabili.
A livello comunitario esiste una grande apprensione per
il rischio di possibile introduzione nell’UE di tali patologie,
soprattutto mediante l’importazione di api regine. A tal fine il
Ministero della Salute ha previsto, mediante la Nota prot. N.
19830 DGSA del 8/11/2010 che le api importate da paesi terzi
vengano controllate dagli II.ZZ.SS. territorialmente più vicine
agli aeroporti internazionali prima di giungere a destino.
L’indagine svolta con il presente studio è stata molto utile per
ottenere un quadro georeferenziato,sebbene non completo,
della diffusione delle malattie denunciabili delle api che fino al
2010 era nota solo in maniera frammentata.
Allo stesso modo, ha permesso di iniziare un percorso di
rivisitazione della normativa sanitaria in merito alla loro
gestione sul territorio.
Dal 2009 in poi, grazie sia a piani di monitoraggio implementati
a livello di singole Regioni (es. Lombardia, Piemonte, Friuli
Venezia Giulia) sia a progetti di monitoraggio più strutturati,
anche in termini di budget e di analisi di laboratorio a
calendario, si è riusciti ad ottenere nuovi dati sullo stato
sanitario delle api. E’ il caso ad esempio del progetto APENET
(2009-2011), del progetto BEENET (2012-2013), nonché del
più recente Progetto UE finalizzato alla sorveglianza della
mortalità nelle colonie di api (2012-2013) gestito dal Ministero
della Salute.
Risulta comunque interessante rilevare come lo studio
qui illustrato abbia consentito di integrare e di precorrere
informazioni sulla prevalenza endemica nel nostro territorio
di malattie denunciabili quali nosemiasi, peste americana e
peste europea, oltre alla varroatosi. Ma nel contempo emerge
come sia necessario monitorare con costanza la situazione
epidemiologica, per adeguare la normativa in modo continuo,
in funzione della costante evoluzione delle situazione
epidemiologica. ma anche tenuto conto della eventuale
comparsa di nuove emergenze.
Informazioni più approfondite sul reale livello di prevalenza
saranno disponibili con la completa attivazione dell’anagrafe
apistica nazionale che fornirà dati certi sulla dislocazione e sul
numero di apiari presenti a livello nazionale.
BIBLIOGRAFIA
1.Regolamento di polizia veterinaria (RPV). DPR n. 320
dell’8/2/1954 (G.U. n. 142 del 24 giugno 1954) e s.m.i.
Nosemiasi – E’ un’entità nosologica che può essere causata
da due diverse specie di microsporidi: Nosema apis e
Nosema ceranae, responsabili a loro volta di forme cliniche
completamente diverse tra loro. Considerata la diversa
patogenicità e prevalenza delle due forme morbose, il
Ministero della Salute, con Nota DGSA 0017114-P-1/10/2011
“Regolamento di polizia veterinaria - misure per nosemiasi” ha
definito che le misure previste dal RPV si applicano solo nei
casi di nosemiasi da Nosema apis clinicamente manifesta.
Tabella 4. Focolai di nosemiasi (N. ceranae) suddivisi per
regione (anno 2006-2011)ù
Regione
N. focolai
Regione
N. focolai
Toscana
92
Lazio
62
Lazio
52
Lombardia
48
Lombardia
3
Toscana
35
Emilia Romagna
2
Emilia Romagna
35
Puglia
2
Puglia
1
Campania
2
Totale
181
Totale
153
414
415
PRESENZA DI BORRELIA BURGDORFERI S.L., RICKETTSIA SPP. E
ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM IN PIEMONTE
Pintore M.D.1, Ceballos L.2, Iulini B.1, Pautasso A.1, Giorda F.1, Tomassone L.2, Bardelli M.3, Scala S.1,
Rizzo F.1, Mandola M.L.1, Peletto S.1, Mannelli A.2, Casalone C.1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle D’aosta, Torino Italia
2
Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Torino Italia
3
Asl VCO, Verbania, Italia
Tabella 1 - Prevalenza d’infezione in zecche in cerca di ospite, suddivisa per genere e comune del VCO, Piemonte, 2011.
*in 1 zecca è presente una co-infezione con A. phagocytophilum ; **in 1 una zecca è presente una co-infezione con B. lusitaniae.
Key words: survelliance, tick-borne-disease, zoonoses
SUMMARY
In Verbano-Cusio-Ossola province, northeastern Piedmont, Italy,
24 sites located at different altitudes were selected and ticks
were collected by dragging from April to September 2011-2012;
ticks from animals were also analyzed. A total of 3297 vectors
were identified as Ixodes ricinus. Ticks from bitten patients in
Piedmont region (n=94) were also collected; 86,9% were Ixodes
spp. and 3.1% Rhipicephalus spp. Preliminary results from
biomolecular tests targeting Borrelia burgdorferi s.l., Rickettsia
spp., Anaplasma spp. showed an infection prevalence of 14.35%,
5.91% and 2.11% respectively in questing ticks, and prevalence
of 4.5%, 16% and 3.4% respectively in ticks from humans.
Borrelia positive samples were sequenced and four genospecies
were found: B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana and B. lusitaniae.
Phylogenetic analysis based on the OspC gene Borrelia strains
might have the potential for human infection and for secondary
invasion.
inoltre le zecche da animali selvatici abbattuti durante la stagione
venatoria. Nel 2012 invece sono stati aggiunti altri 11 siti nei
comuni di Crodo, Beura-Cardezza e Cavandone, ma nessuna
zecca è stata raccolta da animali. Tutti i siti sono stati scelti in
base a precedenti segnalazioni di casi umani di Borreliosi di Lyme
nella provincia. Per quanto riguarda le zecche da uomo sono
state analizzate quelle pervenute da tutta la regione Piemonte
all’IZSPLV di Torino. Le zecche raccolte sono state identificate
e un campione è stato sottoposto ad indagini molecolari per la
ricerca dei patogeni. Per la ricerca di Borrelia burgdorferi sl si
è applicato un protocollo di PCR end point specifico per una
regione intragenica tra le sequenze codificanti le subunità 5S e
23S (3); per Rickettsia spp. una PCR end point specifica per il
gene gtlA (4); per Anaplasma spp. una PCR end point specifica
per il gene 16S rRNA (5); per la ricerca dell’RNA del Tick Borne
Encephalitis virus il saggio Real time PCR specifico per un tratto
della regione 3’ NC (6).
INTRODUZIONE
Le malattie trasmesse da zecche (MTZ) colpiscono l’uomo e gli
animali e molte sono zoonosi. Tali patologie possono evolvere in
modo asintomatico e senza conseguenze, oppure manifestarsi
con sintomatologia grave. Le MTZ sono in continua espansione
in diversi Paesi del mondo e la loro incidenza è aumentata nel
corso degli ultimi anni. Tale aumento è strettamente correlato
con la sopravvivenza e la diffusione dei vettori che dipendono
da diversi fattori climatici e ambientali. I vertebrati domestici e
selvatici rivestono un ruolo importante come ospiti di riserva,
diffusori naturali del vettore e dell’agente patogeno nel territorio;
l’uomo in genere è solo un ospite occasionale (Jongejan et al
2004). La pressione antropica e le migrazioni, comprese quelle di
uccelli selvatici possono inoltre favorire le importazioni di nuove
specie di zecche dai Paesi vicini (Beugnet et al. 2009). I principali
vettori responsabili della trasmissione delle MTZ in Italia sono
zecche dure appartenenti ai generi Ixodes, Dermacentor,
Hyalomma e Rhipicephalus. Nell’ambito di questo progetto è
stata studiata la presenza di 4 patogeni:
-virus dell’encefalite trasmessa da zecche -Tick Borne
Encephalitis (Flavivirus)
- Borrelia burgdorferi s.l. (agente della malattia di Lyme)
- Rickettsie del gruppo delle febbri bottonose
- Anaplasma phagocitophilum (agente dell’anaplasmosi
granulocitica)
a) 2011: Nella provincia di Verbano-Cusio-Ossola (VCO),
sono state raccolte complessivamente 1662 zecche in cerca
di ospite (1249 larve, 407 ninfe e 6 adulti) e 105 (solo adulti)
dagli animali selvatici, tutte appartenenti alla specie I. ricinus. Un
campione di 352 zecche, 327 dall’ambiente e 25 dagli animali,
sono state sottoposte ad indagini molecolari. In totale 50 zecche
(15.29%; 95% CI 11.39-19.19), tutte catturate nell’ambiente,
sono risultate positive per Rickettsia spp., B. burgdorferi s.l., A.
phagocytophilum con una prevalenza pari 5.91% (95%CI:2.98.91), 14.35% (95%CI:9.88.18.81) e 2.11% (95%CI:0.28-3.94)
rispettivamente (Tab.1).
I campioni positivi per B. afzelii e B. garinii (n = 16) sono stati
sottoposti a PCR per il sequenziamento del gene OspC e
sottoposti ad analisi filogenetica per identificare i gruppi invasivi
per l’uomo. La maggior parte dei ceppi di B. afzelii rilevati nel
nostro studio (10 su 11) formano un cluster nell’albero filogenetico
con sequenze identiche a quelle isolate dagli esseri umani. Tra
questi, 9 su 10 sono localizzati in gruppi invasivi, specificamente
nei gruppi A2 (n = 6), A5 (n = 1), A6 (n = 1) e A7 (n = 1). Allo stesso
modo, 4 su 5 campioni di B. garinii formano un unico clade con le
sequenze di riferimento del gene OspC di ceppi invasivi umani,
indicati come gruppi G5 (n = 2), G9 (n = 1) e G10 (n = 1).
b) 2012: Nel VCO, sono state raccolte dall’ambiente 1530 zecche
(1245 larve, 274 ninfe e 11 adulti) tutte appartenenti alla specie
I. ricinus. Le indagini molecolari sono tuttora in corso. Nessuna
zecca è stata prelevata dagli animali.
Complessivamente sono state analizzate negli anni 2011-2012
94 zecche da uomo (4 larve, 59 ninfe e 31 adulti). La maggior
parte delle zecche provenivano dalla provincia di VCO (71,5%),
seguita da Torino (18%), Vercelli (5,3%), Cuneo (3,2%), Novara e
Asti (1%). Tali zecche sono state identificate come Ixodes ricinus
(n=72; 77%), Ixodes spp (n=19; 20%), Ixodes hexagonus 1 (1%)
MATERIALI E METODI
In Piemonte, nella provincia Verbano-Cusio-Ossola (VCO),
sono state raccolte le zecche dall’ambiente tramite la tecnica
del dragging. La raccolta è stata svolta mensilmente da aprile a
settembre, negli anni 2011 e 2012. Nel 2011 sono stati selezionati
in totale 13 siti nel territorio dei comuni di Cannobio, CalascaCastiglione e Varzo. Nello stesso anno sono state raccolte
416
quanto riguarda i patogeni, si è registrata un’alta prevalenza di B.
burgdorferi s.l. (14.35%), in particolare B. lusitaniae e B. afzelii,
nei comuni di Varzo e Calasca- Castiglione.
Le zecche raccolte dall’uomo provenienti dal VCO hannoostrato
una maggior prevalenza d’infezione rispetto alle altre province. Il
patogeno più rappresentato era R.
e Rhipicephalus spp 2 (2%). In totale 24 sono risultate positive,
1 proveniente dalla provincia di Vercelli, 3 da quella di Torino, e
20 dal VCO (Tab. 2).
Dai risultati preliminari di questo studio è emersa un’abbondante
presenza di zecche infette in cerca di ospite nella provincia
di VCO, dove I. ricinus è stata l’unico vettore identificato. Per
Varzo
N° 90 zecche
Esaminate
Cannobio
N° 100 zecche
esaminate
Calasca-Castiglione
N° 137 zecche esaminate
VCO
327 zecche esaminate
N°
+
Prevalenza
(95%CI)
N°
+
Prevalenza
(95%CI
N°
zecche
+
Prevalenza
(95%CI)
N°
zecche
+
Prevalenza
(95%CI)
Zecche positive
B.burgdorferi s.l.
7
7.78%
(2.24- 13.31)
1
1.00%
(0.00-2.95)
26
18.98%
(12.41-25.54)
34
14.35% (9.8818.81)
Zecche positive
Rickettsia spp.
2
5.56%
(0.82-10.29)
7*
4.00%
(0.16-7.84)
5**
3.65%
(0.51-6.79)
14
5.91%
(2.9-8.91)
Zecche positive
A. phagocytophilum
0
−
3
3.00%
(0.00-6.34)
1
0.730%
(0.000-2.155)
4
2.11%
(0.28-3.94)
Tot zecche positive♠
9
5.88%
(0.00-13.79)
11
32
41.38%
(31- 51.73)
50
5.00%
(0.73-9.27)
15.29% (11.3919.19)
Tabella 2 - Prevalenza dei patogeni da zecche su uomo, divise per provincia del Piemonte.
*tutte le zecche presentano una co-nfezione con R. monacensis; **in 1 zecca è presente una co-infezione con B. lusitaniae.
Torino
N=17
Vercelli
N=5
VCO
N=67
N°
Zecche
+
Prevalenza
(95%CI
N°
Zecche
+
Prevalenza
(95%CI
N°
Zecche
+
R. monacensis
3
17.65%
(0.00-5.77)
0
−
6
R. conori
0
−
0
−
3*
R. helvetica
0
−
0
−
5
A. phagocytophilum
0
−
0
−
3**
B. lusitaniae
0
−
0
−
1
B. valaisiana
0
−
0
−
1
B. garinii
0
−
0
−
1
1
20.00%
(0.00-55.06)
0
−
20
29.85%
(18.89%, 40.81%)
B. afzelii
totale
0
3
−
−
1
Prevalenza (95%CI)
8.96%
(2.12%, 15.79%)
4.48%
(0.00%, 9.43%)
7.46%
(1.17%, 13.76%)
4.48%
(0.00%, 9.43%)
1.49%
(0.00%, 4.40%)
1.49%
(0.00%, 4.40%)
1.49%
(0.00%, 4.40%)
BIBLIOGRAFIA
1. Beugnet F and Mariè JL. Emerging arthropod-borne
diseases of companion animals in Europe Vet Paras 2009;
163: 298-305.
2. Jongejan F and Uilenberg G. The global importance of
ticks. Parasitology 2004; 129: S3-S14.
3. Kampen H, Rötzel DC, Kurtenbach K, Maier WA, Seitz
HM. Substantial rise in the prevalence of Lyme borreliosis
spirochetes in a region of western Germany over a 10-year
period. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(3):1576-8.
monacensis (8.96%), seguita dal R. helvetica (7.46%) e A.
phagocytophilum (4.48%). In nessuna zecca, da dragging
o da uomo è stato ritrovato il virus della TBE (Tab. 2). Il
presente progetto si è limitato allo studio solo di quattro MTZ,
su una parte territorio; sarebbe quindi auspicabile ampliare
l’indagine anche ad altri patogeni trasmessi da zecche che
possono causare malattie importanti nell’uomo coinvolgendo
un’area più ampia della Regione. Un monitoraggio a lungo
termine consentirebbe inoltre di valutare se la prevalenza di
un patogeno stia aumentando in una regione come risultato
di fattori climatici ed ecologici come dimostrato in altri Paesi
Europei (Kampen et al. 2004).
417
L. interrogans Serovar Bratislava:
primo isolamento in sardegna da un feto bovino
1
Ponti M. N. 1 Palmas B., 1 Noworol M., 1 Canu M.,
2
Fig. 1 Pattern di frammenti ottenuti ai VNTR-4 (linee 1, 2, 3)
VNRT-7 (linee 4, 5, 6) e VNTR-10 (linee 7, 8, 9), del genoma
feto bovino in doppio e del serovar Bratislava rispettivamente.
Picardeau M., 1 Carboni G.A., 1 Pedditzi A., 1 Pintore P., 1 Piredda I.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Dipartimento Sanità Animale,
Laboratorio Sieroimmunologia e Gestione Tecnica Piani eradicazione ruminanti, Sassari
2
Institut Pasteur of Paris, Unitè de Biologie des Spirochetès
1
Key Words: Leptospirosi, aborto, bovino
ABSTRACT
Cattle are considered the main maintenance host for L. borgpetersenii serovar Hardjo in many countries, but in Sardinia
the most frequent isolation is referred to L. interrogans serovar Pomona. In this paper we report the first isolation of L.
interrogans serovar Bratislava from a bovine fetus. In May
2011 a dairy herd of 120 heads presented some cases of
abortion in the last trimester of pregnancy

View - Società Italiana di Diagnostica di Laboratorio Veterinaria

Transcript

Documenti analoghi

Reparto di Biologia Molecolare

BC-5800 - Medical Systems

PROBIOTICI: UNA VISIONE MOLECOLARE

X Congresso Internazionale Leibniz

Relazioni - Metodo di Bella

Comunicato stampa

CHI HA DETTO CHE LA DISTORSIONE è AFFARE DI

intervista esclusiva - Labworld

doc cbm 01 - esami settore citogenetica e biologia molecolare

LE rEgOLE E La LIBErTà D`azIONE: cONgrESSO