Preview - Italus Hortus

Review n. 8 – Italus Hortus 15 (4), 2008: 1-9
Meccanismi e segnali della morte cellulare programmata nelle piante
Hilary J. Rogers*
School of Biosciences, Cardiff University, Main Building, Park Place, Cardiff CF10 3TL (UK)
Ricevuto: 26 giugno 2008; accettato: 30 giugno 2008
Mechanisms and signals of programmed cell death in plants
Abstract. Programmed cell death (PCD) is a complex process involving transcriptional, biochemical
and cellular changes and is in this distinguished from
sudden necrotic death. PCD is an integral part of
plant development: the death of specific groups of
cells is essential for the correct development of, for
example, the anther and the xylem. PCD is also the
final step in organ senescence, although the transition
between senescence and PCD has been difficult to
define precisely. Pathogen attack, through the hypersensitive response, clearly activates a programme
ending in the PCD of the cells surrounding the point of
pathogen entry. Another form of biotic interaction, the
self incompatibility response, also clearly activates a
regulated cell death programme. Abiotic stress can
also activate a form of PCD as long as the stress is
not too severe. Morphologically some types of plant
PCD resemble animal apoptosis including DNA
degradation and chromatin condensation, and the formation of apoptotic bodies. However in many cases
the cellular changes are more similar to autophagic
cell death. These include the formation of vesicles
which fuse with the vacuole, enlarging it, and ultimately lead to rupture of the tonoplast and release of
hydrolytic enzymes into the cytoplasm. One of the
problems in constructing a model for plant PCD has
been the absence of genes homologous to plant caspases, key enzymes in animal PCD. However caspase-like activities have been reported in numerous
PCD systems, and other proteases such as vacuolar
processing enzymes have been proposed as candidates for at least some of this caspase activity.
However it seems likely that additional proteases with
caspase activity remain to be discovered. Likewise
although there is evidence for the participation of
mitochondria in some plant PCD systems, through the
release of cytochrome c, this phenomenon is as yet
not confirmed in many examples of plant PCD and
whether the cytochrome c has a regulatory role is also
uncertain. Changes in intracellular calcium levels do
seem to be emerging as a widespread feature and
may be an important regulator of plant PCD, while the
role of reactive oxygen species remains as yet
unclear. A number of plant growth regulators partici*
[email protected]
pate in the regulation of plant PCD such as ethylene,
jasmonic acid and salicylic acid, but it has not been
possible to identify a single molecule that is a universal regulator for all forms of PCD. Thus, although a
complete model for plant PCD is elusive, we are
beginning to have enough data to start building models that can be tested experimentally.
Key words: autophagy, apoptosis, caspases,
hypersensitive response, plant growth regulators.
Introduzione
La morte cellulare delle piante viene attivata per
diverse funzioni. Durante lo sviluppo di parecchi
organi, la morte di alcune cellule specifiche permette
la formazione di strutture con ruoli importanti come lo
xilema o l’endosperma. In alcune piante la morte
cellulare é anche una componente dello sviluppo delle
foglie. In tutti questi casi si presuppone che i segnali
che portano alla morte della cellula siano coordinati a
livello dello sviluppo dell’organo ed é evidente che
sono programmati, quindi possiamo parlare di
Programmed Cell Death o PCD. Il concetto che la
PCD sia un elemento essenziale dello sviluppo delle
piante é ormai stato accettato da lungo tempo (Jones e
Dangl, 1996; Pennell e Lamb, 1997). Meno ovvia é la
programmazione della morte cellulare che si svolge
alla fine della vita di un organo nell’ultima fase della
senescenza. Peró studi giá noti da tempo sulle attivitá
biochimiche e citologiche e sull’espressione di geni
durante la senescenza (Smart, 1994) rivelano che
anche questo tipo di morte richiede l’attivazione di
nuovi geni e processi biochimici e cellulari. Questa
scoperta puó rendere difficile la definizione del limite
tra senescenza e PCD, ed é una definizione che é stata
molto discussa (Thomas et al., 2003; van Doorn e
Woltering, 2004). Un altro tipo ancora di morte
cellulare é quella attivata come metodo di difesa: la
risposta ipersensibile o Hypersensitive Response
(HR). Qui la PCD viene attivata soltanto nelle cellule
adiacenti al sito d’infezione e ha la funzione di
bloccare l’invasione del patogeno. Anche qui é chiaro
che si tratta di una morte programmata (Greenberg e
Yao, 2004), questa volta segnalata dalla presenza del
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Rogers
patogeno e da molecole prodotte dal patogeno durante
l’infezione. Meno chiaro é il programma della morte
in conseguenza di stress abiotici come l’esposizione a
sostanze tossiche, per esempio metalli pesanti, o un
forte cambiamento di temperatura. Peró anche qui ci
sono molti indizi che suggeriscono una morte
programmata, se il danno non é troppo rapido
(McCabe e Leaver, 2004). Nel campo animale si é
fatta una chiara distinzione tra morte programmata e
necrosi (Ellis et al., 1991). Infatti la PCD viene
definita come una morte che fa parte del ciclo di vita
normale dell’ organismo, viene provocata da segnali
fisiologici e comporta la trascrizione di nuovi geni.
Nelle piante, questa definizione sembrerebbe piú
complessa, ed é forse soltanto quando avremo una
conoscenza piú completa dei segnali che provocano la
PCD e i meccanismi che la regolano che potremo
usare il termine PCD in modo piú preciso.
PCD durante lo sviluppo
La PCD si manifesta durante lo sviluppo normale
della pianta sia a livello di singole cellule, o piccoli
gruppi di cellule, che nell’ultima fase della senescenza in tutte le cellule di un organo (Rogers, 2005). Uno
degli esempi classici di morte a livello cellulare é
nello sviluppo delle foglie del genere Monstera nelle
quali la morte di piccolissimi gruppi di cellule durante
lo sviluppo delle foglie si amplia di 10.000 volte per
formare buchi conspicui nella foglia adulta
(Gunawardena, 2008). Un altro esempio é durante la
formazione dei vasi xilematici. Qui, le cellule mesofilliche si differenziano in elementi tracheari mediante
una completa degradazione del contenuto cellulare.
La Zinnia é stata usata come modello per questo processo perché é possibile, con trattamenti di fitoormoni, transdifferenziare colture di cellule mesofilliche
direttamente in elementi tracheari senza divisione cellulare (Fukuda, 2000; Turner et al., 2007).
Nelle radici, le cellule che formano lo strato
esteriore della caliptra provengono dalla divisione del
meristema e vengono squamate continuatamente
mentre la radice cresce. Giá dallo sviluppo
dell’embrione, queste cellule (Giuliani et al., 2002)
sono destinate alla PCD.
Durante la fioritura e la riproduzione ci sono
svariati esempi di PCD (Rogers, 2006). Nelle piante
monoiche e dioiche, la formazione di fiori unisessuali
avviene con l’aborto degli organi dell’altro sesso
durante lo sviluppo (Wu e Cheung, 2000). La PCD
avviene anche nelle antere sia nel tappeto che nello
stomio e nell’endotecio (Rogers et al., 2005).
Nel seme la PCD ha un ruolo importante nella
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formazione dell’endosperma, che é stato
particolarmente ben studiato nei cereali. Qui, a
differenza di altre forme di PCD, le cellule morte
rimangono in situ riempite di amido e la
sincronizzazione tra produzione di amido e PCD deve
essere regolata accuratamente. La PCD in questo
tessuto avviene come un’onda che, partendo dalla
zona centrale/prossimale, viaggia verso il pedicello
(Young e Gallie, 2000). Un altro tessuto destinato alla
PCD é il sospensore (Lombardi et al., 2007a, 2007b)
dopo che la sua funzione per lo sviluppo
dell’embrione é finita. In tutti questi esempi la morte
delle cellule é chiaramente programmata ed é
necessaria per lo sviluppo normale della pianta.
La senescenza é forse un caso particolare di PCD
dato che sia nelle foglie che nei petali avviene
accompagnata, nella maggioranza delle specie,
dall’abscissione dell’organo. Inoltre, la PCD in molte
delle cellule puó perfino completarsi dopo
l’abscissione dalla pianta. Ció nonostante é una morte
programmata e, come vedremo sotto, ha molte
similaritá, sia morfologicamente che nei meccanismi
d’azione, con la PCD che avviene durante lo sviluppo
in risposta a stress, o con la PCD attivata da patogeni.
PCD come risposta a stress abiotici e ad interazioni biotiche
Forse l’esempio piú studiato di PCD vegetale é
quello che avviene durante la risposta ipersensibile.
Sono passati quasi cent’anni dalla prima descrizione
di questo tipo di difesa contro i patogeni (Mur et al.,
2008), ma i suoi meccanismi non sono ancora
completamente conosciuti. Questo tipo di morte
cellulare avviene in un numero limitato di cellule che
circondano il punto in cui il patogeno assale la pianta.
É chiaramente una morte programmata e puó essere
attivata da virus, funghi o batteri, o anche da molecole
elicitori rilasciate dal patogeno. Un forte indizio del
programma di PCD in questo caso é la scoperta di
mutanti di Arabidopsis come il l s d 1, in cui la PCD
attivata da patogeni si espande senza controllo. Un
altro tipo di PCD stimolato da fattori biotici é la morte
che avviene durante la risposta fra pistillo e polline
incompatibile nelle specie auto-incompatibili (SI).
L’inibizione della crescita del tubetto pollinico risulta
in seguito nella PCD del tubetto (Bosch e FranklinTong, 2008). Anche questa sembrerebbe una morte
programmata, attivata da molecole provenienti dal
pistillo, tramite meccanismi e segnali comuni ad altri
esempi di PCD vegetale ed animale (tab. 1).
Meno chiaro é il programma nella morte dovuta a
fattori abiotici. Questa puó essere suddivisa in morte
Morte cellulare programmata nelle piante
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Rogers
rapida di tipo necrotico (Reape et al., 2008) e morte
che invece sembra programmata. Per esempio la
morte attivata da un forte aumento di temperatura in
colture cellulari di Arabidopsis porta principalmente
alla PCD se inferiore a 55 oC e quasi esclusivamente
alla morte necrotica se la temperatura é al di sopra di
55 oC. Nel tipo di morte necrotica la cellula muore
rapidamente e non ci sono cambiamenti morfologici
associati alla PCD. Altri stimoli che inducono la PCD
sono i raggi UV-C, lo stress idrico, l’ozono e il
freddo, ma anche in questi stimoli c’é una soglia tra
PCD e necrosi.
Diverse morfologie di PCD nelle piante
Nel campo animale, una distinzione importante é
quella tra morte necrotica e morte programmata di cui
l’apoptosi rimane il tipo di morte cellulare animale
meglio definita. Si manifesta con caratteristiche
morfologiche che erano giá state definite da Kerr et
al. (1972), tra cui la diminuzione del volume della
cellula, la condensazione e frammentazione della
cromatina e la formazione di ‘corpi apoptotici’. Per
molto tempo, queste caratteristiche sono state cercate
nelle piante per capire se, a livello citologico e,
quindi, anche meccanicistico, la PCD vegetale potesse
essere simile a quella animale. Ed é vero che molti di
questi sintomi sono stati individuati in certi tipi di
PCD vegetale. Per esempio, la condensazione della
cromatina é stata constatata nella PCD che avviene
nelle cellule alla superfice della caliptra (Wang et al.,
1996), nell’ aborto degli organi sessuali nelle piante
monoiche (Wu e Cheung, 2000), nella degenerazione
delle due cellule sinergide (An e You, 2004) e delle
megaspore (Bell, 1996). É anche stata rilevata nella
PCD che avviene nella degenerazione del tappeto
dell’antera, sia nello sviluppo normale del polline, sia
nella degenerazione prematura nelle antere del mais
con sterilitá maschile citoplasmatica (Rogers, 2006).
É anche stata riferita nella senescenza dei petali giá
abscissi (Yamada et al., 2007). Perfino i corpi
apoptotici sono stati rilevati in alcune cellule vegetali,
per esempio nella formazione dell’aerenchima
(Gunawardena et al., 2001) e nelle cellule alla
superfice della caliptra (Wang et al., 1996).
Piú recentemente, la morte cellulare animale é
stata suddivisa in tre categorie: apoptosi (Tipo I),
morte cellulare autofagica (Tipo II) e necrosi (Tipo
III) (Lockshin e Zakeri, 2004). La morte cellulare
autofagica puó essere definita come il processo in cui
il materiale citoplasmatico viene degradato dalla cellula stessa. Nelle cellule animali questo avviene
mediante l’attivitá dei lisosomi, ma nelle piante sem4
brerebbe che questo ruolo sia svolto dal vacuolo (van
Doorn e Woltering, 2005). Questo tipo di morte cellulare si manifesta a livello morfologico con la formazione di vescicole contenenti proteine e, a volte, organelli: queste poi ingrandiscono e si uniscono al vacuolo centrale (fig. 1a) che dapprima si espande e poi si
rompe, rilasciando nel citoplasma enzimi idrolitici
che degradano organelli e macromolecole. La maggior parte della PCD vegetale ha le caratteristiche di
questa morte di Tipo II animale. La permeabilizzazione e la seguente rottura del tonoplasto é molto comune come fase finale della PCD vegetale (van Doorn e
Woltering, 2005), ed é stata rilevata per esempio sia
nello sviluppo degli elementi tracheari (Obara et al.,
2001) che nella formazione dell’aerenchima (Evans,
2003).
Altri due tipi di vescicole che potrebbero
partecipare in una PCD di tipo autofagico sono state
rilevate. Nelle cellule epidermali dell’Arabidopsis,
vescicole derivate dal reticolo endoplasmatico (ER)
contengono precursori di cistein-proteasi e sono state
chiamate PPV (Protease Precursor Vesicles)
(Hayashi et al., 2001) (fig 1b). Quando la pianta viene
sottoposta a stress, i PPV si uniscono dapprima tra di
loro e poi con il vacuolo, trasferendo le proteasi
dentro al vacuolo stesso. Queste attivano altre proteasi
giá nel vacuolo, e dopo la rottura del tonoplasto
partecipano alla degradazione del contenuto della
cellula. Un altro tipo di vescicola, anch’esso ritrovato
in cellule in fase di PCD, sono i ricinosomi (fig 1c),
cosí chiamati perché furono rilevati per la prima volta
nell’endosperma del Ricinus communis (Schmid et
a l., 1999). Anche queste vescicole racchiudono
cistein-proteasi, ma questo tipo di proteasi ha la
particolarità di avere la sequenza KDEL vicino al Ctermine della proteina, che dirige le proteine verso il
ER. Quindi si ritiene che, come i PPV, anche i
ricinosomi derivino dal ER. I ricinosomi peró sono
diversi dai PPV perché, invece di unirsi al vacuolo
durante la PCD, si rompono rilasciando proteasi
direttamente nel citoplasma e contribuendo cosí alla
degradazione delle proteine cellulari. Sembrerebbe
che la rottura della membrana che racchiude i
ricinisomi sia attivata dalla acidificazione del
citoplasma. Questa acidificazione avviene dopo la
rottura del tonoplasto che rilascia il contenuto del
vacuolo nel citoplasma. Il vacuolo ha normalmente un
pH inferiore a quello del citoplasma, quindi si
presuppone che i ricinosomi rilascino il loro
contenuto dopo la rottura del tonoplasto. Questo tipo
di vescicola é stata rilevata anche in altri tessuti in
fase di PCD, come nei petali senescenti di
Hemerocallis (Schmid et al., 1999).
Morte cellulare programmata nelle piante
A
B
C
Fig 1 - Formazione di tre tipi di vescicole durante la PCD.
A autofagosomi: (1) La formazione di autofagosomi viene indotta,
benché i segnali ancora non sono conosciuti e la derivazione della
loro membrana é anch’essa poco chiara. (2) L’autofagosoma si
unisce al vacuolo centrale e poi (3) rilascia il suo contenuto.
B: Protease Precursor Vescicles (PPV): (1) Queste vescicole
derivano la loro membrana dal ER e contengono proteasi. Quando
la cellula é sottoposta a stress, si uniscono tra loro (2) e poi si
uniscono al vacuolo (3). Nel vacuolo le proteasi vengono rilasciate
e attivano altre proteasi vacuolari (4). Quando il tonoplasto si
rompe le proteasi attivate vengono rilasciate nel citoplasma.
C: Ricinosomi: (1) I ricinosomi contengono proteasi e sono
derivati dall’ER, ma rimangono nel citoplasma fino alla rottura
del tonoplasto (2). Questo provoca l’acidificazione del
citoplasma, che distrugge la membrana dei ricinosomi (3)
rilasciando il loro contenuto di proteasi nel citoplasma.
Fig 1 - Formation of three types of vesicles during PCD.
A: Autophagosomes: (1) formation of autophagosomes is
induced, although the signals promoting their induction are not
known, and nor is the derivation of their membranes. (2) The
autophagosomes fuse with the vacuole and then (3) release their
contents. B: Protease Precursor Vescicles (PPV): (1) These
vesicles are derived from the ER and contain proteases. When the
cell is subjected to stress, they fuse with each other (2) and then
with the vacuole (3). Within the vacuole, the protease cargo is
released and activates vacuolar proteases (4). When the tonoplast
ruptures, the activated proteases are relseased into the cytoplasm.
C: Ricinosomes: (1) Ricinosomes contain proteases and are
derived from the ER but remain in the cytoplasm until after
rupture of the tonoplast (2). This results in acidification of the
cytoplasm causing rupture of the ricinosome membrane and
releasing the proteases directly into the cytoplasm.
Un altro indizio che collegherebbe molti tipi di
PCD vegetale con il meccanismo autofagico é
l’isolamento nell’Arabidopsis di omologhi dei geni
coinvolti con questo tipo di PCD. Nel lievito ci sono
almeno 16 geni che regolano la PCD autofagica
(Klionsky e Emr, 2000). Quando i geni omologhi
sono mutati nell’ Arabidopsis, i fenotipi presentano
difetti nella PCD legata alla HR, allo sviluppo, o alla
senescenza (Liu et al., 2005). Il ruolo di questi geni
nel lievito é quello di formare complessi che facilitino
la formazione di autofagosomi, vescicole circondate
da una doppia membrana, e si presuppone che i geni
omologhi nelle piante abbiano funzioni simili benché
ancora non del tutto confermate. Quindi sembrerebbe
che, almeno per il meccanismo autofagico, sia
probabile una forte omologia con il lievito e con le
cellule animali, anche se per il meccanismo di
apoptosi rimane piú difficile trovare le componenti
regolatrici.
Attivitá biochimiche durante la PCD vegetale
Degradazione del DNA
La degradazione del DNA é spesso stata usata
come sintomo di PCD o, partendo dal modello
animale, di apoptosi. In particolare, due techniche
sono molto diffuse: il DNA laddering e il TUNEL
(Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP
Nick End Labelling). Il DNA laddering a v v i e n e
quando la degradazione del DNA é effettuata da
DNasi che tagliano il DNA nell’intervallo fra gli
istoni. Questo crea frammenti in multipli di 200 basi
che si possono rilevare tramite elettroforesi. Si é
ritenuto che questo tipo di degradazione sia un
sintomo di una morte programmata perché avviene
piú lentamente, mentre se la morte é troppo veloce, il
DNA rimane quasi intatto. Peró in effetti, esaminando
i molti esempi di PCD vegetale, si é notato che il
laddering non é stato accertato universalmente. In
certi casi invece avviene una degradazione piú
uniforme, lasciando uno smear di DNA degradato
anziché laddering. Uno dei problemi maggiori, forse,
é che dopo la fase del laddering si presuppone che si
proceda ad una degradazione piú o meno completa
del DNA. Quindi scegliere il momento giusto in un
tessuto completo per vedere il laddering potrebbe
risultare difficile se ci sono cellule in varie fasi di
PCD. Un altro problema avviene durante l’estrazione
del DNA: se non si utilizzano sufficienti inibitori di
DNasi, altre DNasi potrebbero venire in contatto con
il DNA e aumentarne la degradazione prima che il
laddering sia rilevato (Domínguez et al., 2004). Il
TUNEL invece é basato sulla colorazione dei termini
5
Rogers
OH del DNA frammentato con marcatori fluorescenti
ed ha il grande vantaggio che puó essere utilizzato a
livello istologico. L’unico problema é che non
differenzia fra DNA in fase di laddering o in fase di
degradazione piú avanzata. Quindi queste tecniche,
benché possano risultare entrambe utili
nell’identificare tessuti e cellule che sono entrati in
fase di PCD, non si sono poi rivelate molto utili per
capire il meccanismo che porta alla PCD.
Ruolo delle proteasi
Nelle cellule animali si é rilevato un sistema complesso di cisteine proteasi specializzate per la PCD,
chiamate caspasi, che si attivano a vicenda. Questi
enzimi tagliano il substrato ad una asparagina, che si
trova in un gruppo di quattro amino acidi la cui
sequenza é specifica alla categoria delle caspasi.
Quindi, per esempio, la caspasi-3 richiede la sequenza
DEXD (ove X puó rappresentare qualsiasi aminoacido), e questa attivitá enzimatica puó essere inibita da
substrati del tipo Ac-DEVD-CHO. Benché tanto l’attivitá quanto gli effetti degli inibitori siano stati rilevati in molti esempi di PCD vegetale, nelle specie
(riso e Arabidopsis) di cui l’intera sequenza é ora
conosciuta non si sono trovati geni omologhi a quelli
animali per le caspasi (Bonneau et al., 2008). Questo
conflitto ha suscitato una ricerca per le proteine vegetali con attività simile alle caspasi. Inizialmente é
stato proposto un gruppo di proteine con sequenze
omologhe alle caspasi (metacaspasi), ma si é rilevato
che, benché le sequenze di queste proteine siano simili, non hanno un’attivitá enzimatica per i substrati
delle caspasi animali (Bonneau et al., 2008). Due tipi
di proteine che hanno questa attivitá enzimatica sono
finora stati rilevati: le VPE (Vacuolar Processing
Enzymes) e le saspasi. Le VPE sono codificate da una
famiglia di geni espressi in molti tessuti, tra i quali
foglie, semi, fiori e radici (Sanmartín et al., 2005), ed
hanno un’attivitá di tipo caspasi-1. La saspasi, che
peraltro é una serine proteasi, ha un’attivitá di tipo
caspasi-6. Peró di attivitá simili a caspasi ce ne sono
molte altre, contro substrati specifici per le caspasi-3,
-6 e -9. Queste attivitá sono state coinvolte per esempio nella PCD attivata da patogeni e UV-C, nella PCD
dell’endosperma, del tubetto pollinico e del sospensore, e nello sviluppo di buchi nelle foglie (Bonneau et
al., 2008, Borén et al., 2006) (tab. 1). Quindi sembrerebbe che le caspasi abbiano un ruolo anche importante nella PCD vegetale, benché ancora non sappiamo
con quale meccanismo né si siano individuati tutti gli
enzimi responsabili.
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Partecipazione del mitocondrio
Anche la partecipazione del mitocondrio nella
PCD vegetale non é del tutto chiara (Vianello et al.,
2007). Una chiave del meccanismo dell’apoptosi animale é la partecipazione dei mitocondri che funzionano a monte delle caspasi. Il rilascio del citocroma C
dal mitocondrio é facilitato dalla formazione di un
poro chiamato Permeability Transition Pore (PTP) ed
é inoltre regolato da una famiglia di proteine del gruppo Bcl-2. Una volta rilasciato nel citoplasma, il citocromo C attiva le caspasi. Quindi il rilascio del citocromo C nel citoplasma durante la PCD potrebbe
essere considerato come indizio che il mitocondrio é
coinvolto nel meccanismo, benché non é affatto chiaro che abbia un ruolo regolatore nelle piante. Il citocromo C é stato rilevato nel citoplasma di alcune cellule vegetali in fase di PCD, per esempio nella morte
del tubetto pollinico ed in quella del tappeto dell’antera, ed in colture di cellule trattate con elicitori del HR,
o con altri stress (Jones, 2000; Rogers, 2005; Vianello
et al., 2007) (tab. 1). Peró non é stato trovato nei petali senescenti della Petunia (Xu e Hanson, 2000).
Come per le caspasi, geni omologhi alla famiglia
di proteine del gruppo Bcl-2 mancano nei genomi
delle piante, peró due tipi di proteine che interagiscono con le Bcl-2 sono state individuate
n e l l ’Arabidopsis. Il Bax inhibitor protein BI-1 é una
proteina che inibisce l’attivitá del Bax, una proteina
della famiglia dei Bcl-2 che favorisce l’apoptosi, e un
gene omologo al BI-1 é stato isolato dall’Arabidopsis
e dal riso (Sanchez et al., 2000). Inoltre, recentemente
una famiglia di geni chiamati BAG (Bcl-2 associated
AthanoGenes) é stata individuata nell’Arabidopsis
(Doukhanina et al., 2006) usando tecniche bioinformatiche avanzate. Quindi non si puó escludere che,
usando questo tipo di approccio, non si trovino ancora
omologhi funzionali alle proteine del gruppo Bcl-2.
Calcio, ROS e NO
Tre tipi di molecole sono candidati per essere fattori importanti nella segnaletica intracellulare che attiva il meccanismo della PCD, e sono stati trovati in
svariati esempi di PCD vegetale. Si tratta del calcio,
delle specie di ossigeno reattivo o ROS (Reactive
Oxygen Species) e dell’ossido nitrico (NO). Questi tre
tipi di molecole non agiscono separatamente ma, probabilmente, sono importanti in un equilibrio che porta
la cellula a varcare la soglia della PCD.
Un cambiamento nella concentrazione del calcio é
un fattore che sembrerebbe importante in molte forme
di PCD nelle piante (Jones, 2000). É stato coinvolto
nella PCD di vari tipi di cellule tra cui quelle dell’aleurone, degli elementi tracheari, nella formazione
Morte cellulare programmata nelle piante
dell’arenchima, nel tubetto pollinico e nella senescenza sia delle foglie che dei petali (Rogers, 2005). Un
aumento nella concentrazione del calcio é legato ad
un aumento di ROS mitocondriali e quindi potrebbe
contribuire ad un meccanismo per la PCD che coinvolge mitocondri.
Le specie di ossigeno reattivo (ROS) sono rilasciate da vari compartimenti della cellula tra cui la parete
cellulare, il citoplasma, i mitocondri, i cloroplasti e i
perossisomi. Un aumento delle ROS mitocondriali fa
parte del meccanismo dell’apoptosi animale, in cui
favorisce la formazione del PTP ed il rilascio di citocromo C. Nelle piante, le ROS sono state coinvolte sia
nella PCD dovuta al HR (Mur, 2008) che nella senescenza delle foglie (Zentgraf e Hemleben, 2008), ma
non é certo che siano una componente essenziale di
tutte le forme di PCD vegetale. Per esempio van
Doorn e Woltering (2008) sostengono che ci sono
pochi dati che confermino un ruolo importante per le
ROS nella senescenza dei petali .
L’ossido nitrico é un altra molecola importante in
relazione ai ROS ed alla PCD. Da tempo si sa che é
coinvolto nella PCD animale, ma il suo ruolo nella
PCD vegetale é stato approfondito soltanto recentemente (Neill et al., 2003). Dati i differenti tipi di
PCD, non é stato stabilito un ruolo universale per il
NO, ma almeno in certi tipi di PCD una interazione
tra ROS e NO é importante per determinare se la cellula é destinata a entrare nella PCD (Delledonne et al.,
2001). In altri sistemi sembrerebbe che la PCD attivata dal NO sia mediata dal mitocondrio, dato che é
accompagnata dal rilascio di citocroma C ed é inibita
da inibitori della formazione del PTP.
Segnali extra-cellulari
Risulta chiaro, dalla morte di piccoli gruppi di
cellule e dalla funzione della PCD nello sviluppo
normale degli organi, che ci devono essere segnali
extra-cellulari che coordinano la morte cellulare.
Chiaramente i regolatori della crescita sono candidati
per questo ruolo e ci sono molti indizi che almeno
l’etilene, l’acido giberellico, l’acido jasmonico e l’acido
salicilico (SA) abbiano un ruolo in certi tipi di PCD.
L’etilene é il principale coordinatore della
senescenza dei petali in molte piante, e quindi della
PCD che ne risulta (Rogers, 2006), ed é anche
coinvolto nella senescenza fogliare benché il suo ruolo
qui sia probabilmente minore (Rogers, 2005). Questo
ormone é anche stato coinvolto nella PCD che avviene
durante lo sviluppo, per esempio nella formazione
dell’aerenchima (Drew et al., 1981), in cui traduce un
segnale causato dall’abbassamento del livello di
ossigeno, e nella formazione di buchi nelle foglie
(Gunawardena, 2008). Nel seme (Young e Gallie,
2000) l’etilene coordina la PCD nell’endosperma ed
un’onda di etilene precede la PCD. Peró nell’aleurone
é l’acido giberellico a coordinare la morte cellulare
dopo avere attivato l’idrolisi dei nutrienti conservati
nell’endosperma (Fath et al., 2000). L’etilene ha
anche un ruolo nella morte causata da stress abiotici e
da interazioni biotiche. Per esempio, nelle cellule di
pomodoro la PCD causata da trattamento con cadmio
é associata ad una segnalazione da parte dell’etilene
(Yakimova et al., 2006). Nella risposta di piante di
Arabidopsis al trattamento con ozono sono coinvolti
ROS, etilene e SA (Rao et al., 2002) e tutti e tre
partecipano a regolare la PCD. Queste tre molecole
regolatrici sono anche coinvolte nella segnalazione
della PCD causata dalla risposta ipersensibile e, nei
mutanti che sono difettosi nella risposta all’etilene,
spesso la PCD causata dalla HR é meno estesa
(Yakimova et al., 2005).
L’acido giasmonico (JA) é un altro ormone
vegetale che segnala la morte cellulare. Sembrerebbe
che l’equilibrio fra JA e SA sia importante per
regolare sia la senescenza fogliare che la PCD durante
la risposta ipersensibile (Miao e Zentgraf, 2007). Il
JA é anche stato coinvolto nella PCD dovuta a fattori
abiotici, per esempio nella risposta all’ozono (Rao et
al., 2002).
Quindi appare che in molti tipi di PCD vegetale
non ci sia un unico ormone che ne attiva e ne regola il
meccanismo, al contrario sembra che si tratti di un
equilibrio delicato tra molteplici segnali che attivano
gruppi di geni e proteine. Questi comunicano tra loro
tramite interazioni tra proteine ed attivazione di
fattori di trascrizione, spingendo la cellula verso la
morte o mantenendola in vita a seconda delle
esigenze del tessuto o dell’organismo.
Conclusioni
Una volta accettato il concetto che la morte
cellulare fa parte di un programma importante sia
nello sviluppo che nelle risposte all’ambiente, forse
era ingenuo cercare un unico modello per spiegarne il
meccanismo. Sembrerebbe invece che la PCD
vegetale somigli a quella animale nella sua
complessitá. La PCD animale, con il passare del
tempo, ha evidenziato un processo sempre piú
complicato e suddiviso in diverse forme, ed anche
quella vegetale si sta svelando come un processo con
molteplici aspetti.
Benché il modello puro dell’apoptosi animale
forse non sia ritrovato in nessuno degli esempi di
7
Rogers
PCD vegetale, ci sono certi tipi di PCD nelle piante
che quasi sicuramente coinvolgono molte delle stesse
componenti, ossia mitocondri, attivitá delle caspasi e
cambiamenti nella concentrazione del calcio (tab. 1).
Mentre la somiglianza delle caratteristiche
morfologiche ha suggerito un meccanismo simile,
l’assenza di geni omologhi alle caspasi nelle piante ha
creato un problema nella costruzione di un modello.
Tuttavia lo sviluppo di techniche bioinformatiche
potrá forse proporre proteine che abbiano la stessa
funzione, benché siano diverse nella loro sequenza.
Questo suggerirebbe che, invece di meccanismi
fondamentalmente diversi, ci sia stata solamente una
divergenza nei geni durante l’evoluzione che ostacola
la loro identificazione tramite i metodi classici basati
sull’omologia delle sequenze.
Il meccanismo autofagico invece, che
probabilmente é alla base di molte forme di PCD
vegetale, sembra piú conservato a livello delle
proteine. Qui il problema é l’assenza del lisosoma,
che invece verrebbe sostituito dal vacuolo. Benché la
conoscenza della PCD animale sia stato un ottimo
punto di partenza, forse é arrivato il momento di
lasciare questo modello e di continuare una ricerca
senza presupposti, per creare un modello nuovo e
probabilmente unico alla PCD vegetale.
Riassunto
Nelle piante, la morte cellulare programmata
(PCD) avviene sia nello sviluppo normale e nella
senescenza degli organi che nella risposta
all’ambiente ed ai patogeni. La PCD comporta la
trascrizione di nuovi geni e l’attivazione di processi
biochimici e cellulari, ed in questo si differenzia dalla
morte rapida o necrotica. A livello morfologico ci
sono somiglianze tra certi tipi di PCD vegetale e
l’apoptosi animale, tra cui la degradazione del DNA e
la condensazione della cromatina. Peró la PCD nelle
piante é forse piú frequentemente simile alla morte
autofagica. Uno dei conflitti tra i diversi modelli é
l’assenza di geni omologhi alle caspasi, che sono
importanti sia nel regolare che nell’effettuare la PCD
animale. Anche la partecipazione del mitocondrio
rimane da chiarire in molti tipi di PCD vegetale, ma
sembra che in quasi tutte le forme di PCD vegetale ci
sia un cambiamento dei livelli di calcio intracellulari.
A livello extra-cellulare ci sono svariati ormoni che
probabilmente regolano l’entrata della cellulla nella
fase di PCD, ma non c’é un unico regolatore
universale per tutte le forme di PCD. Quindi, benché
manchino ancora modelli completi della PCD
vegetale, incominciamo ad avere abbastanza dati per
8
sviluppare modelli che dovranno essere confermati
con ulteriori esperimenti.
Parole chiave: autofagia, apoptosi, caspasi, risposta
ipersensibile, regolatori di crescita.
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