Lezione 2 Assemblaggio del genoma

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Genomics Session
Lezione 2
Assemblaggio del genoma
Lezione 2
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Genome assembly software: Celera Whole-genome Assembler
Maschera sequenze ripetute
Identifica regioni
sovrapposte di almeno
40bp non mascherate
Crea i contigs
Ordina i contigs
Lezione 2
Genome assembly software: Arachne
Sviluppato da Serafim Batzoglou al MIT
(2002)
1. Identificazione di gruppi di reads sovrapposte
Selezione reads
(Phred scores)
Divisione delle reads in
k-meri (k=24)
Eliminazione
k-meri frequenti
Identificazione reads
che condividono k-meri
Allineamento reads
(programmazione dinamica)
Lezione 2
GCCGTCAGCTAGCTAT
GCCGTC
CCGTCA
CGTCAG
GTCAGC
TCAGCT
CAGCTA
AGCTAG
GCTAGC
CTAGCT
TAGCTA
AGCTAT
Lezione 2
GCCGTCAGCTAGCTAT
TCAGCTAGTATAAATC
GCCGTC
CCGTCA
CGTCAG
GTCAGC
TCAGCT
CAGCTA
AGCTAG
GCTAGC
CTAGCT
TAGCTA
AGCTAT
TCAGCT
CAGCTA
AGCTAG
GCTAGT
CTAGTA
TAGTAT
AGTATA
GTATAA
TATAAA
ATAAAT
TAAATC
Identifica k-meri condivisi
da due reads
GCCGTCAGCTAGCTAT
TCAGCTAGTATAAATC
Unisci i k-meri e sovrapponi
le reads
GCCGTCAGCTAGCTAT
TCAGCTAG-TATAAATC
Allinea le reads con
Smith-Waterman
1. Identificazione di gruppi di reads sovrapposte
Selezione reads
(Phred scores)
Divisione in
k-meri (k=24)
Eliminazione
k-meri frequenti
Identificazione reads
che condividono k-meri
Allineamento reads
(programmazione dinamica)
GCCGTCAGCTAGCTAT
GCCGTC
CCGTCA
CGTCAG
GTCAGC
TCAGCT
CAGCTA
AGCTAG
GCTAGC
CTAGCT
TAGCTA
AGCTAT
Identificazione e
correzione errori
Valutazione e selezione
degli allineamenti
Lezione 2
Identificazione e correzione di errori
Sostituire T con C
TAGATTACACAGATTACTGA
TAGATTACACAGATTATTGA
TAG-TTACACAGATTACTGA
Aggiungere A
TAG-TTACACAGATTATTGA
errori frequenti: Verosimilmente causati
da ripetizioni -> scissione
Lezione 2
2. Creazione dei contig di sequenza
Identificazione di plasmidi
con cloni di dimensioni simili
e sovrapposizioni ad entrambe
le estremità (paired pairs)
Fusione delle reads
sovrapposte
a formare i contigs
Determinazione della sequenza
consenso del contig
Lezione 2
3. Trattamento delle sequenze ripetute
Lezione 2
Identificazione di reads sovrapposte
ad altre reads che non sono
sovrapponibili fra di loro
Determinazione dei confini R
delle regioni ripetute
Lezione 2
Determinazione dei confini delle regioni ripetute
Overlap graph:
–
Nodi: reads r1…..rn
–
Archi: sovrapposizioni (ri, rj, shift, orientazione, punteggio)
Caso di due gruppi di due
regioni genomiche contenenti
la stessa ripetizione al centro
Lezione 2
Ripetizione
Contig unico
Overcollapsed Contig
Scopo: identificare i confini dell ripetizione
Lezione 2
Identificare e rimuovere le sovrapposizioni inferibili:
Se la read r sovrappone sulla destra con le reads r1 e r2, e
r1 sovrappone r2, allora (r, r2) può essere inferita da (r, r1) e
(r1, r2), ed è ridondante
Lezione 2
Si identificano 4 contigs unici e 1 contig ripetuto al centro
Lezione 2
Identificazione di reads sovrapposte
ad altre reads che non sono
sovrapponibili fra di loro
Determinazione dei confini R
delle regioni ripetute
A
R
D
C
R
B
Creazione dei contigs
di sequenza
Creazione dei contigs
ripetuti
Lezione 2
4. Creazione dei supercontigs e riempimento dei gaps
Riempimento dei gaps con
i contigs ripetuti
Identificazione di contigs
contenenti paired pairs
supercontig
(scaffold)
Lezione 2
Next generation
sequencing
Lezione 2
Next Generation Sequencing
DNA sequencing technologies
•
Sanger sequencing
•
“Next-Generation” sequencing
•
Lezione 2
•
Roche 454
•
ABI SOLiD
•
Illumina (Solexa)
“Next-Next (3rd) Generation” sequencing
•
VisiGen
•
Helicos
•
Oxford Nanopore
- Producono un'enorme mole di reads corte;
- I tempi di corsa sono molto brevi;
- Grosso risparmio economico;
- Possono essere applicate a DNA, RNA e altre varianti;
- Di recente sono state estese per la produzione di paired reads;
- L'analisi bioinformatica è lo step limitante di tutta la procedura: I dati sono prodotti
più velocemente e facilmente di quanto sia possibile analizzarli.
Lezione 2
[Zhou et al.,
Protein Cell 2010]
Lezione 2
[Kahvejian et al., Nature Biotech 2008]
Lezione 2
Adapted from John McPherson, OICR
Lezione 2
Piattaforme per Next Generation Sequencing
Lezione 2
Sequenziamento con terminatori reversibili
1) Estrazione del DNA
2) Frammentazione
3) Attacco degli adattatori
Lezione 2
4) Attacco ad un supporto solido
5) Amplificazione per PCR
Lezione 1
2
adattatore
sequenza del
frammento
adattatore
.
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A A A
G G
T T T T
C C C
T T
T T T T
T T T
C C
C C C C
G G G
T T
A A A A
A A A
G G
G G G G
A A A
A A
G G G G
.
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Cluster 1
Lezione 2
Cluster 2
Cluster 3
Primo ciclo di sequenziamento
.
.
Aggiunta di adattatori
liberi e basi marcate
.
A
C
T
G
A
A
.
.
.
Lezione 2
.
.
Lettura dell'emissione
.
A
C
T
G
A
Laser
A
.
.
.
Lezione 2
.
.
.
A
C
T
rimozione del terminatore
G
A
A
.
.
.
Lezione 2
Secondo ciclo di sequenziamento
.
.
Aggiunta di basi
marcate
.
A
C
T
G
A
A
.
.
.
Lezione 2
Secondo ciclo di sequenziamento
.
.
.
A
C
T
G
Laser
A
A
.
.
.
Lezione 2
Terzo ciclo di sequenziamento
.
.
.
A
C
T
Laser
G
A
A
.
.
.
Lezione 2
Quarto ciclo di sequenziamento
.
.
.
A
C
Laser
T
G
A
A
.
.
.
Lezione 2
Sequenziamento Illumina/Solexa Genome Analyzer
Reazioni di PCR amplificano i frammenti
formando gruppi di sequenze identiche
vicine sulla piastra
La piastra è densamente ricoperta da adattatori
[Mezker, Nature Rev. Genet. 2010]
Lezione 2
3'-O-azydomethyl
Lezione 2
Illumina Genome Analyzer Flow cell
- Divisa in 8 canali (lanes);
- Ogni canale può essere caricato con fino a
12 campioni diversi ientificati da diverse tag
(multiplexing);
- Input: 0.1–1.0 μg;
- 96-120 milioni di reads (clusters) per flow
cell, ogni cluster contenente ~1,000 copie
dello stesso templato.
lanes
Lezione 2
Illumina Genome Analyzer Flow cell
control
lane
tile
lanes
1
Lezione 2
2
3
4
5
lanes
6
7
8
sequence
clusters
tile
Lezione 2
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3
Ciclo 4
Ciclo 5
Ciclo 6
Lezione 2
Read
Length
Run
Time
(Giorni)
Output
(Gb)
1 X 35
bp
~2
10-12
2 X 50
bp
~5
25-30
2 X 75
bp
~7
18-37.5
2 X 100
bp
~9.5
54-60
2 X 150
bp
~14
85-95
Sequenziamento Roche/454
Emulsion-based clonal amplification (emPCR)
Frammenti di DNA sono amplificati per PCR in una goccia d'acqua in
olio. Nella goccia si trovano biglie ricoperte da primer, nucleotidi e
enzimi per la PCR.
Le biglie sono
caricata su una
piastra (PicoTiter
plate)
Lezione 2
La solforilasi converte il pirofosfato in ATP
L'ATP è idrolizzato dalla luciferasi emettendo luce
Lezione 2
Lezione 2
T
C
A
GG
TTTTTT
AA
Lezione 2
Flow Order
T
A
C
G
Lezione 2
Assemblaggio de novo di genomi da NGS
Gli algoritmi per assemblaggio di sequenze WGS non sono adatti per reads
corte:
- L'overlap graph (un nodo per read) diventa estremamente grosso e pesante da
calcolare;
- La piccola dimensione delle reads produce molte connessioni ambigue nel
grafo;
- Molti algoritmi richiedono un overlap minimo che è comparabile se non
superiore alla lunghezza di molte reads ottenute per NGS;
- Il grande numero di reads + overlap corti + alta frequenza di errori di sequenza
fanno si che l'approccio tradizionale overlap - layout – consensus diventi
inappropriato.
Lezione 2
Le reads corte fanno si che le piattaforme NGS non siano particolarmente adatte al
sequenziamento di nuovi genomi, sopratutto se di grandi dimensioni e ricchi di
sequenze ripetute. Ci sono però esempi in cui la strategia è stata vincente:
Sono stati sviluppati diversi
assemblatori per NGS:
• ABySS
• SHRAP
• ALLPATHS
• SSAKE
• Edena
• Velvet
• SHARCGS
[Zhou et al.,
Protein Cell 2010]
Lezione 2
Grafo di de Bruijn
L'approccio più comunemente usato per assemblatori de novo per NGS utilizza
i grafi di de Bruijn, che sono normalmente utilizzati per rappresentazione di
stringhe;
- Il loro utilizzo è stato introdotto da Pevzner (2001) per l'assemblatore per
WGS EULER;
Lezione 2
Grafo di de Bruijn
Per costruire un grafo di de Bruijn:
- tutte le reads sono divise in segmenti sovrapposti di lunghezza k (k-meri);
- ogni k-mero costituisce un nodo;
- un arco diretto esiste fra due nodi a e b se a (tolta la prima base) è
prefisso di b e b (tolta l'ultima base) è suffisso di a (ad es. a=acgtctgact e
b=cgtctgactg;
- l'assemblaggio si ottiene cercando un percorso euleriano nel grafo
(passando per ogni arco una sola volta).
Lezione 2
Grafo di de Bruijn
Vantaggi:
- Non c'è bisgno di allineare ogni coppia di reads;
- I percorsi Euleriani sono più semplici da trovare rispetto ai percorsi Hamiltoniani
(anche se ci possono essere diversi percorsi Euleriani in un grafo altrettanto buoni);
- Errori di sequenziamento e sequenze ripetute causano la formazione di
ramificazioni o cicli nel grafo, permettendone il riconoscimento;
- La scelta del valore di k è cruciale:
Lezione 2
k-meri corti
→ incrementa la connettività
→ aumenta le regioni ambigue
k-meri lunghi
→ incrementa la specificità
→ diminuisce la connettività
Grafo di de Bruijn
Spesso un percorso Euleriano non è possibile. Ad esempio il problema dei sette
ponti di Königsberg
[Schatz et al., 2010]
Lezione 2
Grafo di de Bruijn
Spesso un percorso Euleriano non è possibile. Si cerca allora il percorso che visiti
ogni arco almeno una volta (problema del postino cinese); archi attraversati più
volte sono indizio di ripetizioni;
Lezione 2
Graphi di de Bruijn
Lezione 2
Graphi di de Bruijn
Scomponendo le reads in kmeri è possibile che il
percorso scelto per la
costruzione del contig non sia
coerente con la sequenza
completa di un sottoinsieme
di reads.
Reads
[Pop, 2009]
Lezione 2
Grafo di de Bruijn
1. Sequenziamento
4. Rimozione degli errori
2. Construzione del
grafo di de Bruijn
3. Semplificazione
del grafo
[Flicek & Birney, 2009]
Lezione 2
Velvet (Zerbino, 2008)
- Ogni nodo rappresenta una serie
di k-meri overlappanti (k=5), in cui
l'ultimo k-mero corrisponde alla fine
di una read;
- k-meri adiacenti overlappano per
k-1 nucleotidi;
- La sequenza di ogni nodo è data
dall'ultimo nucleotide di ogni kmero;
Grafo di de Bruijn
- Archi uniscono nodi in cui l'ultimo
k-mero del nodo all'origine dell'arco
ha overlap con il primo k-mero del
nodo destinazione;
- Ogni nodo è associato ad un
"gemello" che rappresenta i
complementi dei k-meri.
Lezione 2
A
B
Semplificazione delle catene di nodi:
–
Lezione 2
Se il nodo A ha un solo arco uscente diretto al nodo B, e B ha
un solo arco entrante → A e B sono fusi
Rimozione degli errori:
Velvet rimuove potenziali errori basandosi su caratteristiche topologiche del
grafo:
1. rimozione delle punte (tips)
● Tip: catena di nodi disconnessa ad un'estremità
● Si usano due criteri:
● lunghezza (si rimuove la tip se < 2k bp)
● ci sono altre catene più lunghe originanti dal nodo di partenza della tip
2. rimozione delle bolle (bubbles)
● Bubble: due percorsi che iniziano e finiscono nello stesso nodo
● Sono causate da errori o SNPs
● Si rimuovono confrontando (allineando) le sequenze definite dai due
percorsi e unendole (se sufficientemente simili)
3. rimozione delle connessioni spurie
● connessioni a basso coverage sono rimosse
● sono causate da erorori di sequenziamento che non generano bubbles
o tips
Lezione 1
2
E' possibile generare sequenze complete di genomi utilizzando solo reads
corteda NGS, anche per organismi complessi;
Si possono creare contigs di buona qualità ad alto coverage, ma rimangono
molti gaps (principalmente perchè è più difficile generare paired reads);
Diverse piattaforme hanno diversi limiti; approcci ibridi (ad esempio 454 per
read lunghe e paired reads a basso coverage, più Illumina per alto
coverage) hanno avuto successo (ad esempio il genoma di tacchino);
Oppure si può combinare il sequenziamento di Sanger con il NGS (ad
esempio il geoma della vite).
Lezione 2
Ri-sequenziamento
•
Le tecnologie NGS sono invece molto adatte per risequenziare genomi gia
noti;
•
Importante per identificare differenze fra individui, popolazioni, ceppi, tipi
cellulari, tessuti in condizioni patologiche, etc.;
•
Si usa la sequenza nota del genoma come riferimento per mappare le reads;
Lezione 2
Ri-sequenziamento
La scarsa lunghezza delle reads non influisce negativamente sul risequenziamento
% of Paired K-mers with Uniquely
Assignable Location
100%
90%
80%
70%
60%
E.COLI
HUMAN
50%
40%
30%
20%
10%
0%
8
10
12
14
16
18
20
Length of K-mer Reads (bp)
[Jay Shendure]
Lezione 2
Sequenziamento del genoma umano
2001: Human Genome Project
2.7G$, 11 years
2007: 454
1M$, 3 months
Log10(price)
10
8
6
2008: ABI SOLiD
60K$, 2 weeks
2001: Celera
100M$, 3 years
4
2009: Illumina,
Helicos
40-50K$
2
2000
2011: 5K$,
a few days?
2012: 100$, <24
hrs?
2005
2010
Year
Lezione 2
Lezione 2
[Zhou et al.,
Protein Cell 2010]
Lezione 2
Allineamento di reads al genoma di riferimento
•
•
In progetti di risequenziamento, le
reads generate devono essere
mappate ad un genoma di riferimento
la cui sequenza è nota;
Algoritmi convenzionali come Blast o
Blat non sono adatti per mappare
milioni o miliardi di reads corte ad un
genoma che a sua volta puè essere
di grosse dimensioni;
Algoritmi:
• Cross_match
• ELAND
• Exonerate
• MAQ
• Mosaik
• SHRiMP
• SOAP
• Zoom!
Lezione 2
Indicizzazione del genoma
•
Genomi e reads sono troppo grandi per approcci diretti (ad es.
programmazione dinamica)
•
É necessario creare un indice del genoma
•
Lezione 2
Suffix tree
Suffix array
> 35 GBs
> 12 GBs
Seed hash tables
Many variants, incl. spaced seeds
> 12 GBs
La scelta dell'indice è critica per le performance della mappatura.
MAQ (Li, 2008)
La read da mappare è divisa in 4 segmenti di
lunghezza uguale (i seeds);
Se c'e' un mismatch (causato da errori di
sequenziamento, o da polimorfismi) questo
cadrà in uno dei 4 seeds, ma gli altri 3
avranno match perfetti nel genoma; se i
mismatch sono due, almeno due seeds
avranno lo stesso match perfetti;
Il genoma di riferimento è diviso in coppie di
segmenti della stessa misura, e indicizzato per
ricerca veloce;
Coppie di seeds della query sono ricercate nel
genoma indicizzato. Se si trova un match, si
cerca di estendere il match ai due seeds
mancanti;
Nonostante l'indice del genoma sia molto
grande, è possibile effettuare questa ricerca in
modo veloce per un grosso numero di reads.
Lezione 2
Trasformazione di Burrows-Wheeler
- Data una stringa T, un carattere speciale (e precedente a tutti i caratteri di T in ordine
lessicografico) viene appeso in coda a T;
- Tutte le rotazioni cicliche di T formano la matrice di Burrows-Wheeler;
- Le righe della matrice vengono ordinate in ordine lessicografico;
- I caratteri nell'ultima colonna della matrice ordinata costituiscono la trasformazione di
Burrows-Wheeler (tutto il resto è scartato).
T
BWT(T)
Burrows
Wheeler
Matrix
Last column
[Langmead et al., 2009]
Lezione 2
[Source: Wikipedia]
Lezione 2
BWT(T) è reversibile, cioè è possibile ricostruire da essa la stringa di partenza
[Source: Wikipedia]
Lezione 2
- BWT(T) è reversibile, cioè è possibile ricostruire da essa la stringa di
partenza;
- E' comprimibile, perchè caratteri identici finiscono spesso adiacenti uno
all'altro in sottostringhe (è usata dal compressore bzip2);
- Permette la ricerca veloce di sottostringhe (ad es. una read);
- Una volta trovato un buon match, se ne vogliono conoscere le
coordinate nella stringa di partenza (cioè nel genoma). Si può:
- ricostruire ogni volta il genoma originale (inefficiente);
- tenere traccia in un vettore delle coordinate di ogni nucleotide del
genoma nella BWT(T) (occupa molta memoria);
- tenere traccia in un vettore solo di alcune posizioni ad intervalli
fissi, trovare quello più vicino alla read in input, e ricostruire da li.
Lezione 2
- Con la trasformazione di Burrows-Wheeler è possibile indicizzare il
genoma umano in 1.1 Gbytes (2.2 includendo anche il vettore di
coordinate);
- E' possibile indentificare match di una read efficientemente senza dover
immagazzinare tutti i k-meri che compongono il genoma;
- Mediante accorgimenti è anche possibile tollerare match imperfetti senza
perdere troppo in efficienza.
Lezione 2
Bowtie (Langmead, 2009)
Lezione 2
Genomics Session
Lezione 2
Annotazione del genoma
Lezione 2
•
Ottenere la sequenza di un genoma è solo il primo passo verso la
comprensione di una amplissima gamma di processi biologici
•
Ad esempio ci si può chiedere:
•
Lezione 2
–
Cosa è trascritto?
–
–
Quali proteine si legano al DNA genomico, e dove?
Come è regolato il genoma (ad es. cosa è metilato)?
In altre parole, il genoma è un oggetto molto grande e complesso,
come funziona?
Figure 7.13 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Lezione 2
Quanti geni in un genoma?
Exons (regions of genes coding for protein
or giving rise to rRNA or tRNA) (1.5%)
Repetitive
DNA that
includes
transposable
elements
and related
sequences
(44%)
Introns and
regulatory
sequences
(24%)
Unique
noncoding
DNA (15%)
L1
sequences
(17%)
Repetitive
DNA
unrelated to
transposable
elements
(15%)
Alu elements
(10%)
Simple sequence
DNA (3%)
Lezione 2
Large-segment
duplications (5–6%)
Assegnare ad ogni nucleotide del genoma un possibile
ruolo. Principalmente (ma non solo) riguarda l'annotazione dei geni.
• Geni
– Codificanti proteine
– Geni per RNA
– Retrogeni
• Elementi regolatori
– Promotori
– Enhancers
– siRNA
• Elementi repetitivi
– LINES
– SINES
– Simple repeats
Lezione 2
Il trascrittoma è l'intero insieme di trascritti di RNA in una cellula, tessuto,
organo o individuo.
Il trascrittoma è cellula-specifico e dipendente dal tempo, cioè è funzione
dello stato della cellula, tessuto o individuo.T
Esistono diversi tipi di geni:
Geni per RNA non codificante
tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, microRNA
Geni codificanti proteine:
Procarioti
Niente introni
Regioni intergeniche corte
Eucarioti
Alternanza esoni-introni
Bassa densità nel genoma
I trascritti possono essere:
●
●
●
●
Lezione 2
Modificati
Soggetti a splicing
Editati
Degradati
Una serie di segnali esistono nel genoma e/o nel trascrittoma
Lezione 2
Questi segnali spesso occorrono sotto forma di particolari motivi di
sequenza;
L'identificazione di questi segnali in un genoma non annotato aiuta a
capire dove sono i geni, come sono regolati e cosa fanno
Lezione 2
Quanti geni in un genoma?
Lezione 2
Quanti geni nel genoma umano?
[Pertea & Salzberg, 2010]
Lezione 2
2010/2011
Quanti geni nel genoma umano?
●
2005, Dicembre: Ensembl release 35: 22218 geni (33869 trascritti)
●
2006, Aprile: Ensembl release 36: 23710 geni (48851 trascritti)
●
2010, Marzo: Ensembl release 57: 25643 geni (>100000 trascritti):
Lezione 2
2010/2011

Lezione 2 Assemblaggio del genoma

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