Diagnostica - Virbac Italia

I.R.
virbacnews
N° 3
Speciale diagnostica - giugno 2014
www.virbac.it
La diagnostica: dall’ambulatorio
al laboratorio
Sommario
Editoriale
Un viaggio nella diagnostica clinica ...........................................................................................................................................................................3
Angelo Giorgetti
BVT (Bio Veto Test)
La divisione diagnostica di Virbac...............................................................................................................................................................................4
Jérôme Morlet
Esami di laboratorio e diagnosi
Evidence Based Medicine ..............................................................................................................................................................................................5
Daniela Proverbio
Diagnostica delle retrovirosi
Speed® Duo FeLV/FIV: possibili casi di impiego................................................................................................................................................7
Nicoletta Rizzi
Attendibilità dei test rapidi
Speed® Duo FeLV/FIV raccomandato dagli esperti.......................................................................................................................................8
A cura di Virbac
Interazioni antigene - anticorpo
I test sierologici per la diagnosi di malattie infettive .......................................................................................................................................9
Emanuele Minetti - Ugo Bonfanti
Leishmaniosi canina
Speed® Leish K: screening pre-vaccinale e iter da adottare ..................................................................................................................12
Nicoletta Rizzi
Innovazione nella diagnostica
Il futuro a portata di mano: la spettrometria di massa .............................................................................................................................14
Tommaso Furlanello - Graziano Balestra
virbacnews
2
Pubblicazione a carattere non periodico
della Società Virbac e pertanto
non soggetta a registrazione ai sensi
degli Artt. 2 e 16 Legge n. 47/1948.
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
Tipografia
Aziende Grafiche Printing srl
Peschiera Borromeo (Mi)
Editoriale
■ Test e kit di laboratorio
Un viaggio nella diagnostica clinica
Angelo Giorgetti, DVM
Marketing manager
Virbac Italia
C
are Lettrici, Cari Lettori. Siamo
al terzo numero di Virbac News
che, dopo argomenti quali la leishmaniosi e le novità in dermatologia, è
completamente dedicato alla diagnostica.
Vorremmo farvi percorre insieme a noi
un viaggio attraverso questo aspetto così
peculiare della vita quotidiana di un clinico,
senza avere la pretesa di fare un trattato
approfondito, ma con l’obiettivo di sviluppare momenti di riflessione, di stimolare
eventuali approfondimenti, di approcciare
la materia in modo pragmatico, semplice
e utile. Tratteremo argomenti fondanti e
consueti nell’approccio diagnostico, ma
non mancheranno spunti relativi all’innovazione nonché all’esplorazione di nuove
frontiere e di metodiche avveniristiche.
Lo spirito di VirbacNews rispetta una visione semplice, quella cioè di dare spazio
a voci indipendenti a fianco della più accurata comunicazione aziendale, in modo
da presentare al lettore una pluralità di
conoscenze. Lo scopo ultimo rimane
quello di arricchirvi di informazioni utili,
nuove e di poter comunicare con voi
sulla nostra azienda e sulle idee che sono
la base dei nostri prodotti.
Come vedrete, Virbac ha una storia nel
mondo della diagnostica (non solo il range
dei test Speed per l’ambulatorio ma anche
kit di laboratorio come quello relativo all’individuazione dell’iperplasia prostatica benigna canina) contraddistinta da continua
ricerca scientifica e dallo sviluppo di nuovi
test, il tutto nel rispetto di standard di alto
livello e di buone pratiche di produzione.
Inoltre la dimensione internazionale di
Virbac ci permette un costante aggiornamento, usando le conoscenze e le metodiche
più avanzate e rendendole fruibili a livello
globale. A riprova di quanto appena detto
vorrei portarvi due esempi che rappresentano per noi il fiore all’occhiello della
nostra linea diagnostica: Speed Leish K e
Speed Duo Felv/FIV. Entrambi rappresentano
lo spirito innovativo della nostra ricerca
sempre orientata a fornire soluzioni allineate
con le più recenti conoscenze scientifiche,
mantenendo elevate le performance qualitative e di attendibilità.
In questo numero troverete prestigiosi
autori provenienti dal modo del laboratorio e dal mondo accademico, tutti con
una formazione veterinaria di altissimo
profilo e con un’esperienza di campo di
grande valore.
La prof.ssa Daniela Proverbio ci aiuterà a
capire come sia importante applicare la
medicina basata sulle evidenze (EBM) e
come sia sempre essenziale valutare gli
elementi di base dell’approccio diagnostico.
Una visione quindi più da clinico, costretto
quotidianamente a orientarsi grazie a dati
completi e strutturati, per far fronte alle
richieste sempre più competenti e specifiche dei propri clienti.
Il dott. Emanuele Minetti e il dott. Ugo
Bonfanti, invece, grazie all’accurata descrizione di metodiche diagnostiche di
uso frequente, ci porteranno a valutare
come i test rapidi e le analisi di laboratorio
non siano in antitesi, ma che anzi rappresentino due momenti distinti di una completa e accurata raccolta di dati che permette al clinico di orientarsi in modo oggettivo nella individuazione di una patologia.
Un’ulteriore autorevole voce, quella del
dott. Tommaso Furlanello, ci illustrerà
come si evolve il mondo del laboratorio
e come metodiche una volta riservate a
un uso eccezionale, oggi possono diventare
di routine ed essere un valido ausilio
nella pratica clinica.
A loro vorrei porgere i miei più vivi ringraziamenti per la proattività e il loro altissimo indice di professionalità.
Infine vorrei ringraziare il marketing team
di Virbac che ho il piacere di coordinare.
Infatti solo grazie a loro e al loro costante
impegno, alle loro competenze di primo
ordine, al loro entusiasmo, alla loro motivazione si possono realizzare prodotti
editoriali di questa levatura.
In ultimo, ma non per importanza, un
grazie anche a Le Point Vétérinaire Italie
che ci assiste in questa impresa supportando il nostro lavoro con precisione,
dandoci sempre una consulenza fattiva.
Buona lettura
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
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Animali da compagnia
Diagnostica
■ BVT (Bio Veto Test)
La divisione diagnostica di Virbac
Gli Speed test sono strumenti diagnostici rapidi e semplici da utilizzare
sia nella pratica clinica quotidiana che nelle situazioni d’emergenza
Jérôme Morlet, DVM
Global marketing manager - Diagnostic range
BVT - Virbac
N
ell’esercizio quotidiano della professione i metodi di diagnostica
rapida sono ormai diventati parte
essenziale del processo diagnostico. Queste tecniche rapide, di semplice esecuzione
e affidabili sono un valido aiuto per il veterinario tanto nella pratica di tutti i giorni
quanto nelle situazioni di emergenza, per
affinare la diagnosi e la prognosi in pochi
minuti, proprio “in presenza del paziente”.
Dal punto di vista economico, questi metodi sono poco costosi e possono essere
utilizzati anche per lo screening a scopo
profilattico di affezioni ancora subcliniche.
In questo contesto, Virbac offre un’ampia
gamma di test da utilizzare nella pratica
veterinaria quotidiana. L’impegno di Virbac
nel campo della diagnostica ha avuto inizio
nel 2003, quando ha acquisito Bio Veto
Test (BVT), un’azienda francese di biotecnologie, fondata dal dott. Gerard-Marie
Papierok, già direttore del laboratorio di
micologia dell’Istituto Pasteur.
Basandosi sullo know how di BVT nel campo
della batteriologia e dell’immunoassay, grazie
al quale è stato possibile sviluppare prodotti
di riferimento come Speed Duo FeLV-FIV
e test rapidi per l’identificazione batterica
e la determinazione dell’antibioticosensibilità,
il nuovo dipartimento diagnostico di Virbac
ha continuato sulla strada dell’innovazione,
con il principale scopo di fornire ai veterinari
pratici un ampio range di prodotti innovativi, usando le migliori tecniche diagnostiche, tra cui ricordiamo:
- 2007: Speed® Duo Leish/Ehrli primo
test combinato per l’identificazione della
leishmaniosi e dell’erlichiosi;
- 2009: Odelis® CPSE primo test per individuare l’ipertrofia prostatica benigna nel
cane;
- 2010: Speed® Leish K primo test per
l’individuazione degli anticorpi anti kinesine,
4
Gli strumenti diagnostici di Virbac vengono prodotti in Europa (nella foto, la sede di BVT a La Seyne sur Mer, Francia),
ma le unità produttive sono approvate anche dall’USDA (US Department of Agriculture) e dal MAAF (Ministero
dell’Agricoltura giapponese) per l’esportazione.
indicative della replicazione attiva di Leishmania nel cane;
- 2011: Speed® Duo Diro/Leish primo
test per l’individuazione simultanea di dirofilariosi e leishmaniosi
- 2012: Speed® V-Diar, con speciali accorgimenti ergonomici che consentono di
realizzare in allevamento l’identificazione
dei principali agenti causali della diarrea
bovina.
Oggi, un intero team di Virbac è specificatamente dedicato allo sviluppo, produzione,
vendita e supporto ai massimi livelli dei
prodotti diagnostici Virbac.
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
Un continuo miglioramento in campo
medico, la soddisfazione del cliente e la
conformità a tutti i requisiti normativi
applicabili, sono le principali linee guida
dell’attività diagnostica di Virbac. La qualità
dei prodotti, così come i processi di sviluppo
e produzione sono rigorosamente controllati
secondo le norme ISO 9001.
Oggi gli strumenti diagnostici di Virbac vengono prodotti in Europa, ma le unità produttive sono approvate anche dall’USDA
(US Department of Agriculture) e dal MAAF
(Ministero dell’Agricoltura giapponese) per
l’esportazione.
Diagnostica
Evidence Based Medicine
Tra gli ausili più importanti per il raggiungimento della diagnosi
clinica vi sono gli esami di laboratorio.
Animali da compagnia
■ Esami di laboratorio e diagnosi
Prof.ssa Daniela Proverbio DMV, PhD
Clinica Medica dei Piccoli Animali
Dipartimento di Scienze veterinarie
per la salute, la produzione animale
e la sicurezza alimentare (VESPA)
Università degli Studi di Milano
I
l corretto approccio alla diagnosi clinica
prevede l’applicazione di uno schema preciso e ripetitivo. Negli anni più recenti,
anche in Medicina veterinaria, è stata proposta
l’applicazione della medicina basata sulle evidenze (Evidence Based Medicine EBM).
Secondo questo metodo, durante la gestione
del paziente le decisioni devono essere prese
mediante l’uso coscienzioso delle evidenze
fornite dalla ricerca scientifica piuttosto che
sulla base delle esperienze personali del clinico.
Negli anni l’EBM è stata rivalutata e si è giunti
a un approccio bilanciato tra conoscenza ed
esperienza, in particolare riguardo alcuni
processi clinici quali la raccolta dell’anamnesi
e l’esame fisico del paziente, che richiedono
abilità e processi cognitivi che spesso non
possono essere formalizzati né standardizzati.
Tra gli ausili più importanti per il raggiungimento
della diagnosi clinica vi sono gli esami di laboratorio. Certamente per la scelta di questi
ultimi l’Evidence Based Laboratory Medicine
(EBLM) rappresenta un ausilio molto valido,
in quanto aiuta a conoscere la valutazione
oggettiva dei test, e il loro valore diagnostico
viene valutato in base alla sensibilità, specificità
e al valore predittivo positivo (VPP) o negativo
(VPN). L’EBLM permette di eliminare gli esami
inutili che non forniscono adeguato ausilio
per il clinico e di introdurre nuovi test, migliorando l’accuratezza e l’impatto clinico dell’esame.
Una volta effettuata la lista delle possibili
diagnosi differenziali, il clinico mette in atto un
piano diagnostico che ha lo scopo di localizzare
la sede dell’alterazione e di ricercarne il meccanismo fisiopatologico.
Definire l’esame da scegliere e
saper interpretare il risultato
Gli esami di laboratorio possono essere
richiesti per confermare un’ipotesi diagnostica,
per monitorare un paziente o per verificare la
correttezza o la veridicità di esami precedenti.
In qualsiasi caso, occorre considerare i fattori
pre analitici che hanno una grande influenza
sulla sensibilità e specificità del risultato. Ad
esempio, occorre tenere presente che per
molti test la sensibilità e la specificità variano
in base alla matrice biologica prescelta.
Importante è, quindi, non solo definire quale
indagine scegliere, ma occorre anche saper
interpretare il risultato che viene fornito dal
laboratorio.
Come decidere quale esame di laboratorio
richiedere?
In linea generale, occorre:
- identificare il biomarker maggiormente correlato all’evento clinico che stiamo valutando;
- individuare la metodologia più valida per
quel determinato esame;
- individuare il substrato biologico più idoneo;
- conoscere la sensibilità e la specificità del
metodo;
- conoscere il valore predittivo positivo o negativo del test, che è influenzato anche dal
dato epidemiologico della patologia.
Come richiedere gli esami al laboratorio?
La richiesta deve avvenire in base a un protocollo specifico riferito al sintomo o ai sintomi
principali (ad es. poliuria/polidipsia, ittero, anemia….).
Gli esami di laboratorio diventano inutili se
sono eseguiti superficialmente (ad esempio
se chi li richiede non ne sa valutare il risultato),
oppure se non viene effettuata una corretta
valutazione pre-analitica (ad es. scelta del substrato più adatto, corretta conservazione del
campione ecc…).
Di regola gli esami di laboratorio vengono richiesti per step successivi da esami più generici
e di base, detti di primo livello, fino ad esami
estremamente specialistici.
FIV e FeLV: una presenza
mondiale
Negli ultimi anni accanto agli esami ematologici
ed ematochimici tradizionali sono comparsi
in commercio test rapidi ad uso ambulatoriale.
Generalmente questi test si basano sulla
Aspetti clinici e di laboratorio di FIV e FeLV
SEGNI CLINICI
ALTERAZIONI
DI LABORATORIO
NEOPLASIE ASSOCIATE
FeLV
Anoressia/disoressia/
dimagramento
Ipertermia
Disidratazione
Patologia respiratoria
(riniti, infezioni alte vie)
Patologia gastroenterica (diarrea)
Patologia oculare (congiuntiviti)
Infezioni cavo orale (stomatiti)
Disordini mieloproliferativi
Anemia
Trombocitopenia
Neutro e/o linfopenia
Linfoadenomegalia/linfoadenopatia
Linfoma
FIV
Stomatite (spesso cronica
ulceroproliferativa)
Patologie neurologiche
centrali e/o periferiche
Patologie oculari
(uveiti, corioretiniti)
Anemia
Leucopenia
Linfoma/leucemia
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
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Animali da compagnia
Diagnostica
ricerca di anticorpi o di antigeni e vengono
utilizzati per la diagnosi di malattie parassitarie
e infettive (Dirofilaria immitis, Leishmania spp,
Ehrlichia spp, Rickettsia spp, leucemia felina, immunodeficienza felina).
Un esempio di test ambulatoriale ampiamente
diffuso è rappresentato dai test rapidi per il
virus dell’immunodeficienza felina (FIV) e il
virus della leucemia felina (FeLV), che spesso
vengono commercializzati in un unico kit.
Entrambi questi virus sono presenti a livello
mondiale con prevalenze variabili di infezione.
La prevalenza di FIV varia da 1 a 14% in gatti
sani mentre arriva fino al 44% in gatti sintomatici.
La FeLV ha una prevalenza inferiore all’1% nei
gatti casalinghi che vivono soli e sale fin oltre il
20% in gatti che vivono in nuclei numerosi. In
un recente studio condotto nel Nord Italia è
stata valutata la prevalenza di FIV e FeLV in
316 gatti di colonia, evidenziando una positività
del 6,6% per FIV e del 3,8% per FeLV.
Il FIV si ritrova nella saliva, nel sangue e in altri
fluidi corporei e la trasmissione avviene prevalentemente mediante morsi. Il FeLV è
presente nella saliva ed il passaggio tra gatti
avviene principalmente per via oronasale mediante la condivisione di ciotole e comportamenti sociali in particolar modo in ambienti
sovraffollati.
I gatti affetti da questi patologie virali presentano
alterazioni cliniche (letargia, anoressia, pallore
delle mucose, linfoadenomegalia, stomatite,
forme respiratoria delle alte e basse vie, congiuntiviti, alterazioni gastroenterico e neurologiche), e/o di laboratorio (anemia, neutropenia,
linfopenia, ipergammaglobulinemia, iperazotemia)
comuni ad altri processi morbosi virali/infettivi
e non. Per questo motivo la FIV e la FeLV
sono spesso presenti nell’elenco delle possibili
diagnosi differenziali. Risulta di fondamentale
importanza diagnosticare o escludere la presenza dell’infezione in tempi brevi al fine di instaurare un corretto approccio terapeutico
e/o profilattico (vedere tabella).
L’infezione da FeLV è caratterizzata da una
serie di patologie degenerative e proliferative
di origine mieloide, linfoide ed eritroide. I
soggetti si presentano alla visita con perdita di
peso, disidratazione, febbre, stomatite, rinite,
congiuntivite, associati ad una più alta incidenza
di forme neoplastiche rispetto ai gatti non
6
infetti. L’infezione da FIV causa una serie di
segni clinici associati che sono altrettanto
aspecifici e riflettono la maggiore suscettibilità
alle infezioni oppurtunistiche. Comunemente
questi soggetti si presentano alla visita clinica
per perdita di peso, letargia, disoressia/anoressia,
linfoadenomegalia, gengivostomatite, scolo
oculare, ipertermia. Anche in questi gatti è
molto più alta rispetto al resto della popolazione
la possibilità di incorrere in forme tumorali (in
particolare i linfomi).
Il sospetto diagnostico della presenza di queste
infezioni come causa dei sintomi clinici evidenziati, deve necessariamente essere confermato mediante la ricerca anticorpale o antigenica.
Test ambulatoriali
In commercio sono presenti numerosi kit
commerciali ad uso ambulatoriale, che si
basano su metodiche ELISA o di immunomigrazione rapida.
Per quanto riguarda la FeLV i test, che non
hanno alcuna cross reattività con i ceppi
vaccinali, vanno a ricercare l’antigene p27 del
virus della leucemia felina in sangue o siero,
mentre per la FIV vanno a ricercare gli anticorpi
prodotti contro il core proteico p24 del FIV
(metodo ELISA) o contro la proteina dell’envelope gp41 (RIM).
Questi test rapidi presentano una buona
sensibilità (94-96%) e specificità (98-99%),
anche se, come ogni test, possono presentare
falsi positivi e falsi negativi (VPP si aggira intorno all’80-90%, VPN intorno al 96-99%).
La corretta esecuzione delle procedure migliora ulteriormente la performance globale.
Ad esempio, i gatti sani devono essere
testati circa 12 settimane dopo l’esposizione
a gatti malati (rischio di viremia transitoria
per il test FeLV, e rischio di mancata risposta
anticorpale per il test FIV), mentre l’impiego
del siero al posto del sangue intero può facilitare la lettura del risultato. La facilità di
esecuzione e il buon rapporto sensibilità/specificità rende questi test rapidi adatti anche
per esami di screening. Infatti l’ infezione da
FIV e da FeLV spesso decorre in modo
asintomatico per cui tutti i gatti considerati
a rischio di esposizione devono essere
testati. Il test deve essere effettuato attorno
al quarto-sesto mese di vita (quando eventuali
anticorpi materni diretti contro il virus della
FIV non sono più presenti) a tutti i gattini
nati in libertà o di cui non si conosce esattamente l’anamnesi remota, e a tutti i gatti
(qualunque sia l’età) che vengono introdotti
in una nuova casa. L’esecuzione “preventiva”
del test permette, in caso di positività, di
mettere in atto fin da subito gli accorgimenti
necessari per la salute del paziente, di programmare al meglio il protocollo vaccinale
e di valutare l’eventuale convivenza con
altri gatti. I test di elezione per la diagnosi
delle patologie virali del gatto sono l’isolamento virale e/o l’immunofluorescenza per
quanto riguarda la FeLV e il Western Blot
per quanto riguarda la FIV. Tali tecniche
sono però eseguibili sono presso laboratori
specialistici con personale qualificato. Generalmente si ricorre al loro impiego solo
quando i test rapidi forniscono risultati
dubbi o non congrui con il sospetto clinico
o l’anamnesi del paziente.
Bibliografia
• Hosie MJ, Addie D, Belák S, Boucraut-Baralon Egberink CH, Frymus T, Gruffydd-Jones T, Hartmann K, Lutz H,
Marsilio F, Pennisi MG, Radford AD, Thiry E, Truyen U, Horzinek MC and Lloret A - Feline Immunodeficiency: ABCD
Guidelines on Prevention and Management. Journal of Feline Medicine and Surgery 2009 11: 575
• Lutz H, Addie D, Belák S, Boucraut-Baralon C, Egberink H, Frymus T, Gruffydd-Jones T, Hartmann K, Hosie MJ,
Lloret A, Marsilio F, Pennisi MG, Radford AD,Thiry E,Truyen U and Horzinek MC - Feline Leukaemia: ABCD Guidelines
on Prevention and Management. Journal of Feline Medicine and Surgery 2009 11: 565
• Spada E, Proverbio D, Della Pepa A, Perego R, Baggiani L, Bagnagatti De Giorgi G, Domenichini G, Ferro E and
Cremonesi F - Seroprevalence of feline immunodeficiency virus, feline leukaemia virus and Toxoplasma gondii in
stray cat colonies in northern Italy and correlation with clinical and laboratory data Journal of Feline Medicine and
Surgery2012 14: 369
• Collaudo VM, Domenech A, Miró G, Martin S, Escolar E, Gomez-Lucia E - Epidemiological Aspects and
Clinicopathological Findings in Cats Naturally Infected with Feline Leukemia Virus (FeLV) and/or Feline
Immunodeficiency Virus (FIV) Open Journal of Veterinary Medicine, 2012, 2, 13-20
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
Diagnostica
Speed® Duo FeLV/FIV: possibili casi di impiego
“Nonostante la prevalenza della FeLV si sia ridotta, l’identificazione
e la diagnosi della FeLV e della FIV restano più che mai di attualità”
Animali da compagnia
■ Diagnostica delle retrovirosi
Nicoletta Rizzi, DVM
Technical Service
Virbac italia
L
o screening e la diagnosi della FeLV e
della FIV fanno parte dell’attività quotidiana del veterinario pratico: per
realizzarli il professionista ha a disposizione
dei test rapidi, che si possono realizzare direttamente in ambulatorio e che gli permettono di sapere - in pochi minuti - lo status del
gatto rispetto ai retrovirus; si tratta del test
Speed® Duo FeLV/FIV, che rileva l’antigene
circolante P27 del FeLV e gli anticorpi diretti
contro la proteina GP40 del virus FIV.
Retrovirosi: screening
e diagnosi
In un animale sano, l’esecuzione del test
Speed® Duo FeLV/ FIV è opportuno per lo
screening prevaccinale, tra gli esami prechirurgici, prima di essere messo a contatto con
altri gatti o avviato alla riproduzione, o ancora
per i gatti donatori prima di una trasfusione.
In presenza di un quadro clinico polimorfo e
poco specifico, Speed® Duo FeLV/ FIV è indicato come esame complementare per valutare il coinvolgimento di retrovirus e, di
conseguenza, per adattare la terapia.Tuttavia,
anche alcune situazioni precise possono
essere dovute a una retrovirosi latente, anche
in questi casi è utile includere un test nell’iter
diagnostico.
Le raccomandazioni sui casi in cui è utile effettuare un test di screening per FeLV e FIV
sono pubblicate sia in Europa che negli Stati
Uniti e sono disponibili gratuitamente on
line all’indirizzo: www.abcd-vets.org (Gruppo
di esperti europei in medicina felina), oppure
all’indirizzo: www.catvets.com (Associazione
americana dei veterinari esperti in medicina
felina).
Retrovirosi e gengivostomatiti
In uno studio condotto negli Stati Uniti*
pubblicato in occasione del congresso dell’American College of Veterinary Internal Medicine
(ACVIM) 2011, relativo a 11.262 gatti colpiti
da un’affezione della cavità orale, si osserva
che tra gli animali inclusi nello studio il 6,8% è
positivo per FeLV e il 7,1% per FIV, mentre
una co-infezione FeLV/FIV è presente nell’1%
dei casi.
Relativamente alle sole stomatiti, la prevalenza
raggiunge il 12,2 % per la FeLV e il 13,9% per
la FIV, con il 2,2 % di co-infezioni.
Dal momento che in media la prevalenza di
queste malattie nella popolazione felina è
del 2,3% per la FeLV e del 2,5% per la FIV,
questo studio evidenzia un aumento significativo del rischio di retrovirosi in caso di
affezioni della cavità orale nel gatto.
Retrovirosi e ascessi
sottocutanei
Uno studio, pubblicato nel 2008** e relativo
a 967 gatti portati in visita per un ascesso
sottocutaneo o una ferita da morso, mostra
che il 19,3% di questi animali era, il giorno
della visita, positivo ad almeno uno dei due
virus. Quindi, uno screening FIV/FeLV dovrebbe essere previsto per tutti i gatti
portati in visita per una ferita dovuta a una
lotta con altri gatti o per un ascesso. Per i
gatti risultati negativi al test, bisognerebbe
prevedere di ripetere l’esame dopo 60
giorni, per tenere in considerazione il ritardo
della sieroconversione caratteristico delle retrovirosi (30 per FeLV e 60 giorni per FIV).
Queste differenti situazioni cliniche devono
indurre il veterinario a proporre uno screening
delle retrovirosi in modo tale che, se necessario,
sia possibile affrontare precocemente e nel
modo migliore queste patologie.
* Belows J. and coll. Seroprevalence of FeLV and FIV in cats with
oral disease. In : Proceedings of ACVIM Congress, 15-18 giugno
2011, Denver (USA), 707-708
** Goldkamp CE et coll. Seroprevalences of feline leukemia
virus and feline immunodeficiency virus in cats with abscesses
or bite wounds and rate of veterinarian compliance with current
guidelines for retrovirus testing. J AmVet Med Assoc. 2008 Apr
15;232(8):1152-8.
Esito positivo
Siero, plasma, sangue intero
con anticoagulante
Esito negativo
Impiego del test Speed® Duo FeLV/FIV
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
7
Animali da compagnia
Diagnostica
■ Attendibilità dei test rapidi
Speed® Duo FeLV/FIV raccomandato dagli esperti
Le performance di Speed® Duo FeLV/FIV sono state valutate comparandole con i metodi
di referenza: il Western Blot per la FIV e l’isolamento virale per la FeLV.
A cura di Virbac
U
no studio pubblicato nel Journal
of Feline Medecine and Surger y
(Har tmann et al, dicembre
2007) valuta le performance degli 8 principali test diagnostici per le infezioni da
FeLV e da FIV. Le performance di Speed®
Duo FeLV/FIV quali la sensibilità, la specificità, i valori predittivi positivi e negativi,
così come la facilità di lettura sono state
valutate comparandole con i metodi di
referenza: il Western Blot per la FIV e
l’isolamento virale per la FeLV.
Materiali e metodi
I sieri utilizzati per lo studio sono stati
prelevati da 536 gatti, selezionati random
fra i pazienti del Dipartimento di Medicina
degli animali da compagnia dell’Università
della Georgia ad Athens, USA. Tutti i test
sono stati realizzati secondo le raccomandazioni del fabbricante e l’operatore
non conosceva i risultati degli altri test
realizzati sullo stesso siero.
- Su tutti i sieri che avevano presentato
un risultato positivo FeLV ad almeno uno
dei test valutati, è stato realizzato un isolamento virale.
- Su tutti i sieri che avevano presentato
un risultato positivo FIV ad almeno uno
dei test valutati, è stato realizzato un
Western Blot.
- Una selezione aleatoria di sieri negativi
a tutti i test valutati, è stata referenziata
grazie all’isolamento virale (81 campioni)
o al Western Blot (100 campioni).
I criteri evidenziati per la valutazione
delle performance del test sono stati la
sensibilità, la specificità, il valore predittivo
positivo (VPP) e il valore predittivo negativo (VPN) (leggere a pag. 11).
Risultati
Nella popolazione studiata, la prevalenza
dell’infezione da FIV era del 10,3% e
quella dell’infezione da FeLV del 7,4%. Le
performance del test Speed ® Duo
FeLV/FIV sono elencate nella tabella (vedere).
Discussione
I risultati ottenuti dimostrano che Speed®
Duo FeLV/FIV è un test le cui performance
sono simili a quelle di un test di laboratorio
(ELISA su microplacche), mentre lo studio
comparativo dimostra che Speed® Duo
FeLV/FIV presenta la maggiore sensibilità e
la maggior specificità per la diagnosi di FeLV.
Inoltre, Speed® Duo FeLV/FIV:
- è citato come il test di scelta per la diagnosi e l’individuazione dell’infezione da
FeLV;
- dimostra eccellenti risultati per la ricerca
dell’infezione del gatto da virus FIV;
Performance del test Speed® Duo FeLV/FIV
Speed® DuoFeLV/FIV
Sensibilità
Specificità
Valore predittivo positivo
Valore predittivo negativo
Facilità di lettura
8
Test FeLV vs isolamento virale
94,7%
99,2%
90,0%
99,6%
98,5%
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
Test FIV vs Western Blot
96,3%
98,9%
91,2%
99,6%
99,2%
- si interpreta facilmente: la facilità di
lettura è stimata al 98,5% dei casi di
FeLV e al 99,2% dei casi di FIV.
Commenti
A partire dai risultati di questo studio, è
stato possibile calcolare l’efficacia diagnostica (Diagnostic Efficency od Overall
Accuracy) del test Speed® Duo FeLV/FIV
con i metodi di referenza. Questo criterio
definisce la percentuale dei risultati positivi
e negativi concordanti con i metodi di
referenza.
Efficacia Diagnostica =
(Veri Positivi FeLV + Veri Positivi FIV +
Veri Negativi FeLV + Veri Negativi FIV)
Somma dei risultati
L’insieme dei risultati ottenuti da Speed®
Duo FeLV/FIV concorda al 98,8%* con i
risultati ottenuti dall’isolamento virale
e dal Western Blot: Speed® Duo FeLV/FIV
presenta dunque un’efficacia diagnostica
ottimale.
* Efficacia diagnostica FeLV: 98,84%; efficacia diagnostica
FIV: 98,68%
Bibliografia
1) Hartmann et al. - Comparison of 6 in-house tests
for the rapid diagnosis of Feline Immunodeficiency
and Feline leukemia virus infections. Vet Record, 2001,
149 (11); 317-320
2) AAFP Guidelines, Current retroviral testing
guidelines
from
AAFP;
2005
http://www.aafponline.org/
3) Hartmann et al. - Quality of different in-clinic test
systems for feline immonudeficiency virus and feline
leukemia virus infection. J Feline Med Surg, 2007, 9
(6) ; 439-445
4) ABCD Guidelines on Feline Leukemia Virus, 2007
– http://www.abcd-vets.org/guidelines
5) Institute for algorithmic medicine, Houston, TX,
USA: The
medical
algorithm
project.http://www.medal.org – Chapter 39: Decisional
Analysis
Diagnostica
I test sierologici per la diagnosi di malattie infettive
Le metodiche diagnostiche utilizzate per identificare la presenza
di un patogeno si dividono in metodi diagnostici diretti e indiretti.
Emanuele Minetti, DMV
Specialista in sanità
pubblica veterinaria
Direttore Sanitario Amministratore delegato
BiEsseA srl Milano
L
a sierologia, nella diagnosi delle
malattie infettive, consiste nella
misurazione delle interazioni tra
antigene e anticorpo, per identificare - a
fini diagnostici - la presenza di un agente
patogeno o l’avvenuto contatto.
Tali interazioni possono identificare un
anticorpo specifico, fornendo per tanto
la prova che un animale è stato esposto
a un agente patogeno (antigene), oppure
possono essere utilizzati anticorpi specifici,
atti a identificare un antigene nel campione
che viene esaminato: tale prova è la dimostrazione di un’infezione, ma non evidentemente di malattia.
Metodi diagnostici diretti
e indiretti
Le metodiche diagnostiche utilizzate per
identificare la presenza di un patogeno
si dividono in metodi diagnostici diretti
e indiretti.
I test diretti permettono di identificare
direttamente il patogeno, o suoi frammenti, mediante ad esempio ricerca del
DNA, oppure di un antigene del patogeno
stesso. Alcuni esempi di test diretti sono
rappresentati dalla PCR (Polymerase Chain
Reaction), dall’isolamento virale, ma anche
da esami batteriologici, micologici, parassitologici, dalla citologia, e infine dal
rilievo di antigeni mediante l’utilizzo di
tecniche sierologiche. Ad esempio, test
diretti che utilizzano tecniche sierologiche
sono quelli atti all’identificazione dell’antigene della FeLV nel sangue, o di Giardia
nel materiale fecale.
I testi indiretti permettono invece di
identificare una sorta di risposta da parte
dell’organismo nei confronti dell’agente
eziologico. Tale risposta consiste solitamente nella produzione di anticorpi
diretti contro gli antigeni del patogeno.
Animali da compagnia
■ Interazioni antigene - anticorpo
Ugo Bonfanti, DMV
Diplomato ECVCP
Consulente scientifico Responsabile patologia clinica
BiEsseA srl Milano
Gli anticorpi vengono ricercati nel siero,
il quale reagisce con antigeni in sospensione (come ad esempio per la agglutinazione) o in fase solida (ad es. ELISA).
Il legame tra antigene e anticorpo viene
visualizzato mediante “anti-anticorpi”
legati a loro volta a sostanze che ne
permettono il rilevamento quali ad esempio cromogeni (ELISA) fluorocromi (IFA)
e par ticelle di lattice, visibili macroscopicamente.
I principali test indiretti sono rappresentati
da ELISA (Enzyme linked immunosorbent
assay), immunofluorescenza (IF), agglutinazione diretta, immunomigrazione rapida,
e immunocromatografia.
La matrice comunemente impiegata è
rappresentata da siero, sebbene per
alcuni test eseguibili anche a livello ambulatoriale, sia prevista la possibilità di
utilizzo anche di sangue intero con anticoagulante.
quali lo SNAP test, utilizzabili anche a livello ambulatoriale.
Immunofluorescenza (IF)
Anche con questa tecnica vengono svelati
eventuali anticorpi presenti nel siero dei
pazienti. In questo caso, però, in qualità
di antigene vengono impiegate cellule
infettate o direttamente il patogeno, coattato a un vetrino. In tal caso, per
valutare la positività, vengono usati antianticorpi, coniugati con fluoresceina, e la
reazione viene letta con un microscopio
a fluorescenza.
Mediante questa tecnica è possibile
fornire un “titolo” applicando diluizioni
scalari di siero in cui sono presenti gli
anticorpi, valutando la presenza o meno
di fluorescenza. In tal modo, il “titolo”
anticorpale corrisponderà all’ultima diluizione in cui si identifica fluorescenza.
Agglutinazione diretta (AD)
ELISA
Con tale tecnica (test “a legame primario”)
vengono ricercati anticorpi eventualmente
presenti nel siero dei pazienti, mediante
antigeni coattati sulla parete dei pozzetti
di una piastra. In questo modo, mediante
l’utilizzo di anti-anticorpi coniugati con
un enzima, messi a contatto con il siero
del paziente nel pozzetto, si evidenzia
l’eventuale presenza di anticorpi presenti
nel siero del paziente, mediante una modificazione di colore proporzionale alla
quantità di anticorpi.
Utilizzando tale tecnica si otterranno risultati semiquantitativi, ma oggettivi nel
caso di automatizzazione della metodica.
Questa metodica consiste nel classico
“ELISA a micropozzetti”, solitamente impiegati nei laboratori di diagnostica, e
deve essere distinta da test ELISA rapidi,
Con questa tecnica si ricercano anticorpi
diretti contro antigeni legati a microparticelle (specialmente particelle di lattice).
Se sono presenti anticorpi nel campione
questi si legheranno in maniera indissolubile alle micropar ticelle, a cui a loro
volta sono legati gli antigeni.
La positività può evidenziarsi mediante:
1) cartine: in tal caso la miscela costituita da
anticorpi, antigene e microparticelle viene
depositata su un supporto di colore nero. In
caso di presenza di anticorpi, la miscela, biancastra, formerà dei piccoli aggregati sotto
forma di puntini chiari su fondo scuro;
2) provette: in tal caso, la miscela si forma in
piccole provette o eventualmente nei pozzetti
di piastre ELISA. In caso di positività, il materiale
rimarrà in sospensione e sarà uniformemente
biancastro, mentre in caso di negatività il materiale liquido diventerà trasparente e si
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
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Animali da compagnia
Diagnostica
formerà un conglomerato/pellet biancastro
sul fondo della provetta/pozzetto.
Anche mediante questa tecnica è possibile
fornire un “titolo” anticorpale applicando
diluizioni scalari di siero in cui sono presenti gli anticorpi.
Immunomigrazione Rapida (IR),
Immunocromatografia (IC)
In questo caso viene fatto migrare il
siero – o eventualmente il sangue intero
- in cui sono potenzialmente presenti gli
anticorpi.
Questi si legano a un antigene marcato
con sostante par ticolari (rivelatori). Il
complesso antigene – anticorpo “migra”
fino a incontrare un anticorpo secondario,
a cui si lega in un complesso antigene –
anticorpo.
In caso di positività comparirà una banda
ben visibile ad occhio nudo.
Caratteristiche
dei test diagnostici
Limitazione impor tante, che accomuna
qualsiasi test diagnostico, è rappresentata
dal fatto di poter incorrere in falsi positivi
e falsi negativi: nessun test può diagnosticare in modo accurato e sicuro al
100% la presenza o l’assenza di una malattia.
Occorre quindi accettare il fatto che la
sensibilità e la specificità di un test utilizzato per diagnosticare una malattia infettiva non potranno mai raggiungere il
100%, anche se idealmente dovrebbero
raggiungere questa percentuale.
Ricordiamo che:
- la sensibilità diagnostica di un test è la
sua capacità di identificare correttamente
gli animali malati, ossia la probabilità che
un animale malato risulti positivo al test
impiegato, ossia ancora, la percentuale
di test eseguiti su animali malati che risultano positivi;
- la specificità diagnostica di un test è la
capacità di identificare correttamente gli
animali sani, ossia la probabilità che un
animale sano risulti negativo al test impiegato, ossia ancora, la percentuale di
test eseguiti su animali sani che risultano
negativi.
Sensibilità e specificità sono caratteristiche
proprie del test diagnostico, e sono definite
delle probabilità “pre-test”, risentendo in
realtà della reale prevalenza/incidenza della
malattia nella popolazione testata.
Per il veterinario è comunque importante
che sensibilità e specificità di un test
siano i Valori Predittivi Positivo e Negativo
del test stesso.
Il Valore Predittivo Positivo (PPV) - definito anche in modo più chiaro “Valore
predittivo di un test POSITIVO” - è la
Vantaggi e svantaggi dei test diagnostici sierologici
Test “rapidi”: immunomigrazione rapida, immunocromatografia
Vantaggi
• Facile utilizzo, semplice esecuzione, estremamente diffusi anche a livello ambulatoriale
• Possibilità di utilizzo di sangue intero, siero o plasma
• Risposta rapida
Svantaggi
• Meno specifici e meno sensibili di test di laboratorio; falsi positivi o negativi: necessario verificare con test più accurati a sensibilità e specificità maggiori
(ELISA – IF). In particolare per alcune malattie la sensibilità è medio - bassa, aumentando il rischio di falsi negativi
• Non forniscono titolo anticorpale
• Campioni densi o concentrati: difficile migrazione lungo il supporto
Test “da laboratorio”: ELISA, IF, AD
Vantaggi
• Possibilità di fornire un titolo anticorpale
• IF: test molto sensibile
• ELISA e AD: test sensibili, sebbene non come l’IF
• ELISA: test specifico, non legato a soggettività operatore
• ELISA: possibile automatizzazione lettura quindi maggiore oggettività
• Importanti per valutare evoluzione della malattia/risposta alla terapia: concetto di “sieroconversione”
Svantaggi
• Laboriosità
• Necessità di utilizzo di siero
• Necessità di acquisto di grossi confezionamenti
• Possibile variabilità legata a metodi - strumenti: stesso campione inviato a laboratori differenti: possibilità di ottenere risultati differenti
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Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
Diagnostica
Animali da compagnia
probabilità che un animale che risulta
positivo al test sia effettivamente malato.
Il Valore Predittivo Negativo (NPV) definito anche in modo più chiaro “Valore
predittivo di un test NEGATIVO” - è la
probabilità che un animale che risulta
negativo al test sia effettivamente sano.
PPV e NPV sono legati sia a sensibilità e
specificità del test, ma specie alla prevalenza della malattia nella popolazione
degli animali testati.
Ossia, l’esito POSITIVO di un test diagnostico in una popolazione in cui l’incidenza della malattia testata è bassa (poco
prevalente) anche in caso di test ad
elevata sensibilità e specificità, ha probabilità
più elevate di essere un falso positivo, rispetto ai casi in cui lo stesso identico
test venga eseguito in una popolazione
con un’elevata prevalenza/incidenza della
malattia.
Quindi, una volta eseguito il test, occorre
ricordare che il risultato risente della
prevalenza della malattia ricercata nella
popolazione esaminata.
A questo proposito, per ridurre al massimo le variabili legate ai test diagnostici,
è assolutamente consigliabile eseguire
questi accer tamenti solo su animali che
presentino segni clinici o esami di laboratorio riconducibili alla malattia che si
vuole diagnosticare. Questa accor tezza
- ripetiamo - limita sensibilmente in particolare il rischio di falsi positivi.
Conclusioni
Tutti i risultati delle indagini sierologiche
per le malattie infettive devono comunque
sempre essere interpretati alla luce di:
- cinetica anticorpale e relativa fase di
latenza: falsi negativi nelle fasi iniziali di infezione;
- tipo di infezione: acuta, persistente, ricorrente, con conseguente differente cinetica anticorpale;
- malattie immunodepressive – malattie da
immunocomplessi: falsi negativi per impossibilità a produrre anticorpi rilevabili.
Ricordando inoltre che:
- la negatività sierologica non sempre
permette di escludere una malattia.
I testi indiretti permettono di identificare una risposta da parte dell’organismo nei confronti dell’agente patogeno,
che consiste solitamente nella produzione di anticorpi diretti contro gli antigeni del patogeno. I principali test indiretti
sono rappresentati da ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), immunofluorescenza (IF), agglutinazione diretta,
immunomigrazione rapida, e immunocromatografia.
Quindi non tutti gli animali NEGATIVI
sono in realtà SANI;
- la positività sierologica permette di indicare l’esposizione a un antigene, ma
non permette di definire con sicurezza
che il soggetto sia infetto, o malato.
Sottolineando infine che:
- un antigene può venire eliminato dal paziente senza causare malattia, determinando
comunque positività al titolo anticorpale;
- l’anticorpo identificato può non essere
patognomonico di una specifica infezione
(ad es. anticorpi anti Coronavir us
felino/FIP);
- anticorpi possono essere presenti come
conseguenza di trasferimento passivo
(allattamento).
Per concludere, i test rapidi possono
comunque essere considerati un primo
impor tante step diagnostico rappresentando un buon compromesso tra semplicità di utilizzo, rapidità di risposta da
un lato, e discreta/buona sensibilità e
specificità dall’altro.
In caso di necessità di ulteriori
accertamenti/approfondimenti, come in
caso di risposte dubbie, o che non si allineano con i rilievi clinici, risultano evidentemente imprescindibili test laboratoristici
più accurati, dotati di maggiore efficienza
diagnostica.
Ricordiamo infine come sia sempre necessario - prima di acquistare un test - valutare
accuratamente quale test rapido possiede
le migliori performance documentandosi
con lavori scientifici e schede tecniche.
Non tutti i test rapidi posseggono infatti la
stessa accuratezza diagnostica.
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
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Animali da compagnia
Diagnostica
■ Leishmaniosi canina
Speed® Leish K: screening pre-vaccinale e iter da adottare
“Inserire lo screening pre-vaccinale della leishmaniosi in un iter
diagnostico è indispensabile per un uso ragionato del vaccino”.
Nicoletta Rizzi, DVM
Technical Service
Virbac italia
’arrivo sul mercato di CaniLeish®,
primo vaccino contro la leishmaniosi canina con Aic europea, richiede l’esecuzione di uno screening
prevaccinale sistematico, in conformità alle
raccomandazioni d’uso del prodotto.
Procedura da
attuare in caso di
screening
prevaccinale con
Speed® Leish K
positivo
L
La sierologia prevaccinale
Tra i metodi diagnostici, la sierologia è riconosciuta come la più adatta per lo
screening prevaccinale, soprattutto in
zona di endemia dove il numero di animali
portatori asintomatici può essere notevole.
L’immunofluorescenza indiretta (IFI) è il
metodo di riferimento, che consente di
quantificare gli anticorpi contro Leishmania
infantum.Tuttavia, questa tecnica è realizzabile
solo presso un laboratorio e richiede un
certo periodo di tempo tra la consegna
del campione e l’esito, il che la rende poco
adatta a uno screening di routine.
L’uso di test rapidi e affidabili, realizzabili in
ambulatorio in pochi minuti, permette di
determinare lo status sierologico dell’animale
durante la visita per la vaccinazione. Il test
Speed® Leish K è caratterizzato dalla capacità di evidenziare gli anticorpi anti-kinesine di Leishmania infantum, il che gli
Fase 1: Deporre una goccia di siero,
plasma o sangue intero con
anticoagulante mediante la pipetta.
In presenza di un test rapido
positivo, si raccomanda di
eseguire sistematicamente un
dosaggio degli anticorpi antiLeishmania. Con l’IFI è quindi
possibile precisare lo status
sierologico del cane nei conIl test Speed Leish K® permette di determinare lo status sierologico del fronti della leishmaniosi, in
cane durante la visita per la vaccinazione: un risultato negativo del test
autorizza il veterinario a procedere con la somministrazione del vaccino base al titolo anticorpale, e
CaniLeish®; un risultato positivo, invece, dovrà essere confermato e definire quindi l’iter da sequantificato mediante IFI.
guire:
- se il titolo IFI è fortemente
conferisce eccellenti caratteristiche diagno- positivo, superiore a 4 volte la soglia di postiche. Questo test, infatti, identifica gli sitività del laboratorio: vi è la for te probaanimali sieropositivi sin dai primi stadi bilità che il cane abbia in corso una leidell’infestazione parassitaria.
shmaniosi attiva. In questo caso la vacciUn risultato negativo del test Speed® Leish nazione non è raccomandata, e vanno
K, dunque, autorizza il veterinario a proce- previsti altri esami per effettuare una vadere con la somministrazione del vaccino lutazione clinica completa dell’animale;
CaniLeish®; un risultato positivo al test, in- - se il titolo IFI è debolmente positivo, tra
vece, dovrà essere confermato e quantificato 1 e 4 volte la soglia di positività del labomediante IFI (vedere schema).
ratorio: in questo caso, l’evoluzione del-
Fase 2: deporre 5 gocce di reagente
Speed® Leish K e aspettare 20 minuti.
Risultato negativo
Risultato positivo
Un risultato negativo al test Speed Leish K® autorizza il veterinario a procedere con la vaccinazione con CaniLeish®; un risultato positivo invece deve essere confermato e quantificato
mediante IFI (vedere schema).
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Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
Diagnostica
Animali da compagnia
l’infestazione non è ancora definita. È
necessario valutare la cinetica degli anticorpi, ripetendo l’IFI dopo tre mesi:
• se l’IFI torna negativa, significa che il
cane questa volta ha superato l’infezione
ed è possibile prevedere una vaccinazione;
• se il titolo è salito oltre 4 volte la
soglia di positività del laboratorio, c’è
una for te probabilità che si stia sviluppando una leishmaniosi attiva;
• se il titolo permane debolmente positivo,
è raccomandato un follow up sierologico
e clinico regolare:
• in rari casi può essere il laboratorio
stesso a “negativizzare” il titolo IFI (titolo
inferiore al valore soglia di riferimento
del laboratorio). In questi casi è possibile
procedere con la vaccinazione, tenendo
conto dell’anamnesi, dell’esame clinico e
del contesto epidemiologico.
Status sierologico
dell’animale vaccinato
Gli studi di validazione del vaccino CaniLeish® hanno mostrato, dopo la vaccinazione, una produzione transitoria di anticorpi anti Leishmania infantum diretti
contro le proteine del vaccino. Dal momento che l’IFI rileva la presenza dell’insieme degli anticorpi anti Leishmania, gli
anticorpi post vaccinali saranno evidenziabili tramite IFI e lo resteranno per 4
mesi circa.
In presenza di segni clinici indicativi di
leishmaniosi in un animale vaccinato, è
necessaria l’effettuazione di un esame
diagnostico per confermare o escludere
una leishmaniosi attiva.
Le kinesine di Leishmania sono proteine
non presenti nel vaccino CaniLeish®,
quindi Speed® Leish K, che rileva specificatamente gli anticorpi anti kinesine,
resta negativo dopo la vaccinazione.
Quindi, se i segni clinici sono dovuti a
un’infezione in corso, Speed® Leish K
sarà positivo; se invece Speed® Leish K
resta negativo, bisognerà prendere in
considerazione altre ipotesi diagnostiche.
Bibliografia
• CaniLeish : EPAR - Public assessment report http://www.ema.europa.eu
• Miró G, Cardoso L, Pennisi MG. and al. Canine leishmaniosis - new concepts and insights
on an expanding zoonosis : part two. Trends
Parasitol., 2008 ; 24 (8) : 371 - 7.
• Chêne J, Chabanne ., Morlet J. and Bourdoiseau
G. - Comparison of a rapid
immunochromatographic test (Speed Leish KTM,
BVT) with immunofluorescence assay for the
detection of anti-Leishmania infantum antibodies
in dogs. In Proceedings of the 2nd International
Congress on Canine Leishmaniasis. Pisa, Italy, 17
- 18 April 2010.
Speed® Leish K: iter diagnostico dello screening prevaccinale
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
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Animali da compagnia
Diagnostica
■ Innovazione nella diagnostica
Il futuro a portata di mano: la spettrometria di massa
“La spettrometria di massa viene utilizzata anche
per identificare prodotti incogniti”.
Graziano Balestra
Biotecnologo farmaceutico
Laboratorio d’Analisi
Veterinarie San Marco,
Padova
N
ell’ultimo decennio la spettrometria
di massa ha conosciuto uno sviluppo tecnologico eccezionale e il
suo uso si è esteso, dai centri di ricerca, ai laboratori clinici. Il notevole interesse è legato
all’elevata specificità e sensibilità analitica che
collocano questa metodica in una posizione
di vantaggio rispetto ad altre tecniche diagnostiche. A conferma di ciò bisogna considerare che tutte le attuali metodiche
immunologiche, di uso routinario, vengono
validate con metodi cromatografici/spettrometrici di massa. Un vantaggio importante di
queste tecniche è rappresentato dalla capacità di determinare numerosi biomarker, presenti in miscele complesse come il siero, in
una sola analisi (ad esempio, ormoni steroidei
nella loro totalità). Tale tecnica consente lo
studio di malattie metaboliche, endocrinopatie, monitoraggi terapeutici e indagini tossicologiche.
Il concetto fondante della spettrometria di
Tommaso Furlanello, DMV
PhD, Diplomato ECVCP
Laboratorio d’Analisi
Veterinarie San Marco,
Padova
[email protected]
www.sanmarcovet.it
massa è la ricerca diretta di molecole, in
base al rapporto di massa/carica (m/z). L’eliminazione dell’uso di anticorpi per la determinazione di queste sostanze ha consentito
un forte aumento della specificità e l’eliminazione della maggior parte degli interferenti
(emolisi, lipemia, ittero, ormoni similari/metaboliti) e del cosiddetto effetto matrice, generato dal fluido indagato. Un esempio
classico può essere rappresentato dalla misurazione del cortisolo mediante chemiluminescenza (immunodosaggio), ove, come è
stato dimostrato da numerosi studi internazionali, esistono forti limitazioni relative al
valore di questa metodica. Infatti, uno dei
principali limiti è la reattività dell’anticorpo
nei confronti di molecole con struttura
similare al cortisolo stesso (ad es. 11-deossicortisolo).
La maggior parte delle metodiche immunologiche, inoltre, è finalizzata alla determinazione
delle molecole non libere, ovvero legate a
Applicazioni della spettrometria
di massa con cromatografia liquida (esempi)
Ormoni
- cortisolo libero (sierico e urinario)
- aldosterone (sierico e urinario)
- catecolamine sieriche e urinarie (adrenalina, noradrenalina, dopamine e metanefrine)
- Free T4, Free T3, Reverse T3
- insulina
- progesterone, testosterone
Monitoraggio Farmaceutico
Ciclosporina, digossina, acido micofenolico (micofenolato), levetiracetam, zonisamide
Pannello Tossici
Organofosforici (carbaril, chlorpyrifos, coumafos, diazinon et al.)
Rodenticidi (brodifacaum, bromadiolone, cumaclor, cumatetril et al.)
Piretroidi (allethrin, cyfluthrin, cypermethrin, deltamethrin et al.)
Lattoni macrociclici (ivermectina, abamectina, doramectina et al.)
Metaldeide ecc.
14
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
proteine di trasporto. Tali molecole rappresentano una semplice stima dell’attività biologica della molecola stessa, in quanto l’effetto
metabolico è correlato alla forma attiva o libera. La spettrometria di massa, in questo
senso, è più adatta a misurare le forme
libere, metabolicamente attive, indipendentemente dai veicoli proteici.
Principi della spettrometria
di massa
La spettrometria di massa, oggi, viene utilizzata
non solo per determinazioni quantitative e
qualitative di composti noti, ma anche per
identificare prodotti incogniti e per chiarire
anche le proprietà strutturali e chimiche
della molecola. Questa tecnica inoltre è ampiamente utilizzata anche perché richiede
minime quantità di campione e soprattutto
riesce a determinare in miscele complesse
concentrazioni molto basse di analiti (pg/ml).
La caratteristica principale, che rende uno
spettrometro così selettivo, è quella di determinare la massa di una molecola in maniera
precisa dopo che questa è stata ionizzata
(conferimento di carica elettrica). Tre sono i
componenti chiave di tale strumento: una
sorgente che converte le molecole introdotte
in ioni in fase gassosa, l’analizzatore che
separa gli ioni in base al rapporto m/z (rapporto massa/carica) e un rilevatore che amplifica il segnale, generando uno spettro che
rappresenta l’immagine della molecola (vedere
figura 1).
Brevemente si elencano i passaggi per eseguire
una determinazione quantitativa di una molecola in spettrometria di massa partendo
da una matrice complessa come il siero:
preparazione del campione con ultracentrifugazione, precipitazione, diluizione e filtrazione,
separazione con tecniche cromatografiche
ultraperformanti, trasferimento del composto
in uno spettrometro di massa per essere io-
Diagnostica
Animali da compagnia
nizzato, separazione degli ioni in base al rapporto m/z, infine misurazione degli ioni e generazione di uno spettro.
Applicazioni di spettrometria
di massa nel laboratorio clinico
La gamma di analiti che un laboratorio dotato
di questa tecnologia può offrire, dopo aver
eseguito gli opportuni processi di ideazione
e validazione dei test, è immenso. Grazie a
queste strumentazioni si possono eseguire
indagini singole (ad es. cortisolo urinario),
oppure pannelli diagnostici (cortisolo, aldosterone e DHEA), in modo da esplorare in
modo completo la corteccia surrenalica. Un
altro esempio è la valutazione della funzione
gonadica tramite la misurazione contemporanea di estradiolo, progesterone, estriolo,
estrone e testosterone.
Una testimonianza dell’innovatività della metodica, che non richiede tecniche immunologiche, è data dalla misurazione dell’insulina
nel gatto, che non era realizzabile con metodiche che comprendessero l’uso di anticorpi
anti-insulina per la peculiare presenza nella
specie felina di anticorpi naturali anti-insulina,
che si associano a gravi interferenze diagnostiche con le metodiche classiche.
Infine, di grande interesse per il veterinario
può essere la possibilità di risolvere casi
a
1 - Cromatogramma di una molecola di L-tiroxina (linea rossa e blu) abbinato a uno spettro di massa tandem
(finestra nel quadrante a destra).
complessi di sospette intossicazioni negli
animali domestici eseguendo una ricerca di
sostanze tossiche anche a concentrazioni
molto basse partendo da una piccola quantità
di campione di sangue intero in K3EDTA, o
di urine. Inoltre tutto ciò permette di effettuare
successivi monitoraggi terapeutici per monitorare l’eventuale eliminazione della sostanza
tossica presente nell’organismo e pertanto
decidere se continuare o sospendere il trattamento farmacologico.
Conclusioni
Le metodiche di cromatografia abbinate a
spettrometria di massa tandem rappresentano
una vera e propria rivoluzione per il laboratorio
clinico, sia in Medicina umana che veterinaria.
Queste tecnologie, se impiegate dopo rigorose
indagini e messe appunto dei test, con opportune validazioni (Recovery, LOD, LOQ,
ripetibilità, esattezza e robustezza del metodo)
permettono l’esecuzione di un numero sempre crescente di indagini, sia singole che associate a formare pannelli diagnostici in
modo estremamente sensibile, selettivo e
preciso. In ambito endocrinologico, la possibilità
di evitare reazioni immunologiche per ottenere
dei dosaggi ormonali ha reso estremamente
popolare questa tecnologia in Medicina
umana e rappresenta ormai il gold-standard.
Nel prossimo futuro questa tecnologia ci
offrirà ancora nuovi ed entusiasmanti obiettivi
e traguardi, a partire dal mondo della metabolomica e proteomica.
Per approfondire
b
2a-2b - Due diversi spettrometri di massa tandem (MSMS), abbinati a un sistema cromatografico
ultraperformante ad alta capacità di carico.
• Denoroy L et al. - Ultra high performance liquid chromatography as a tool for the discovery and the analysis of
biomarkers of diseases: a review. J. Chromatogr. B 2013;927: 37–53
• Grebe SKG & Singh RJ, - LC-MS/MS in the Clinical Laboratory – Where to From Here? - Clin Biochem Rev
2011; 32: 5-31
• Kushnir MM et al. - Liquid chromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinical
laboratories - Clinical Biochemistry 2011;44: 77–88
• Leung KSY & Fong BMW. - LC–MS/MS in the routine clinical laboratory: has its time come? Anal. Bioanal.
Chem. 2014; 406: 2289-301
• Soldin OP & Soldin SJ. - Thyroid hormone testing by tandem mass spectrometry. Clinical Biochemistry 2011;
44: 89–94
Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014
15
PAD 0432