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XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA
FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y
PRODUCCIÓN DE RUMIANTES
12-15 de Julio de 2006
Lugo - Santiago de Compostela (ESPAÑA)
COMITÉ ORGANIZADOR
Presidentes
Prof. Pablo Díez Baños (Fe.Me.S.P.Rum)
Prof. José Luís Benedito Castellote (A.V.E.B.U)
Vicepresidentes
Dr. Lorenzo Monserrat Bermejo. Centro de Investigaciones Agrarias
de Mabegondo (España)
Prof. Luciano Sánchez García. Univ. Santiago de Compostela
(España)
Secretaria Científica
Prof. María Patrocinio Morrondo Pelayo. Univ. Santiago de
Compostela.
Tesorero
Prof. Joaquín Hernández Bermúdez. Univ. Santiago de Compostela.
Vocales
Prof. Cristina Castillo Rodríguez.
Prof. Pedro García Herradón.
Prof. María Marta López Alonso.
Prof. Ceferino López Sandez.
Prof. Rosario Panadero Fontán.
Prof. Adolfo Paz Silva.
Prof. Rita Sánchez-Andrade Fernández.
COMITÉ CIENTÍFICO
Prof. Paulino García Partida.
Prof. Bogo Fatur (Eslovenia).
Prof. Felipe Prieto Montaña.
Prof. Cándido Gutiérrez Panizo.
Prof. Arcangelo Gentile (Italia).
Prof. Pablo Díez Baños.
Prof. Mª Patrocinio Morrondo Pelayo.
Prof. José Luís Benedito Castellote.
Dr. Lorenzo Monserrat Bermejo.
Prof. Luciano Sánchez García.
Prof. Pedro García Herradón.
Prof. Gonzalo Fernández Rodríguez.
Dr. Hossein Hamali (Irán).
Profa. Marta López Alonso.
Profa. Cristina Castillo Rodríguez.
Prof. José Fernández Revuelta
EDICIÓN A CARGO DE:
PABLO DÍEZ BAÑOS
JOSÉ LUIS BENEDITO CASTELLOTE
MARÍA PATROCINIO MORRONDO PELAYO
JOAQUÍN HERNÁNDEZ BERMÚDEZ
CEFERINO MANUEL LÓPEZ SÁNDEZ
XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES
ACTO INAUGURAL DEL 14 Congreso Internacional de la
Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes.
(FeMeSPRum)
Excmo. Sr. Vicerrector de la Comunidad Universitaria y Compromiso Social, como
representante de Excmo y Sr. Rector da Universidade de Santiago de Compostela D. Jose
Manuel Mayán Santos.
Excelentisimo Sr. Conselleiro do Medio Rural (Xunta de Galicia) D. Alfredo Suárez Canal.
Ilma Sra. representante de la Consellería de Educación e Ordenación Universitaria.
Profesora Mª del Mar Yllera Fernandez
Ilmo Sr. Presidente del Consello Galego de Colegios Veterinarios de Galicia. D. Filemón
Rodríguez Rodriguez
Ilmo Sr. Presidente de la FEMESPRUM Prof. Antonio Pugliese (Univarsidad de Mesina,
Italia).
Ilmo. Sr. Prof. Paulino García Partida. Miembro fundador y Honorífico de la
FeMeSPRum.
Dignísimas autoridades, señoras y señores congresistas y acompañantes.
Es para mí un honor, al tiempo que un placer, darles la bienvenida, en nombre del Comité
Organizador, al 14 Congreso de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de
Rumiantes, cuyo acto inaugural celebramos en este salón noble del Colegio- Pazo de
Fonseca, sede central de la Universidad de Santiago de Compostela.
Mis primeras palabras han de ser de agradecimiento. A nuestra Universidad, en la persona
del representante, del Magnífico y Excelentísimo Sr. Rector. Agradecimiento también a
todas las autoridades y personas que representan Instituciones públicas y oficiales, por
acompañarnos en esta ocasión, y por su patrocinio personal y material, tan necesario para
poder realizar este evento.
Nuestro reconocimiento a todos ustedes, congresistas, por su presencia y por sus
importantes contribuciones científicas, y cómo no, también mi particular reconocimiento a
los miembros de los Comités Organizador y Comité Científico, así como a la Junta
directiva de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes. Todos han
aportado su inestimable ayuda, en la medida de sus posibilidades, e incluso, a veces,
sobrepasándolas con creces. No debo olvidar a las diferentes entidades y firmas privadas,
que han sido entusiastas patrocinadores materiales y colaboradores de nuestro Congreso.
Después de 18 años de la constitución de la FeMeSPRum, que nació en el seno de la
Asociación Mundial de Buiatría, las esperanzas e ilusiones de sus fundadores, (entre los que
no olvidamos al prof. Gentile, desgraciadamente ausente y a nuestro conferenciante de hoy,
prof. García Partida), se han ido cumpliendo a lo largo de los sucesivos congresos
internacionales, celebrados en distintas ciudades y países del entorno del mediterráneo.
Desde el ya lejano año de 1991, en Alghero (Cerdeña), hasta el último celebrado en Bari,
pasando por Salamanca, Téramo, Murcia, Bolonia, Lubliana, Sentarem, Giardini (Sicilia),
León, Túnez, Olvia (Cerdeña) y Estambul,
XI
¿Por qué un congreso dedicado a los rumiantes, propio de países del área de influencia
mediterránea? En primer lugar, las condiciones geográficas y climáticas, las propias
culturas y tradiciones ganaderas, son muy diferentes respecto de países y zonas situadas
más al norte de Europa. De ahí, que muchos temas de los que se vienen ocupando los
congresos de nuestra Federación (FeMeSPRum) dentro de la medicina, sanidad,
producción, etc, de los rumiantes, tengan sus peculiaridades.
En este sentido, hay dos hechos que actualmente cobran mucho interés.
Por una parte, la última ampliación de la UE (hasta los 25 países actuales) con todo lo que
ello implica sobre la producción, comercialización, control de distintas enfermedades, etc,
pues de todos es bien sabido que los agentes causales de enfermedades no entienden de
fronteras. Además, la aparición de enfermedades nuevas, exóticas y las emergentes. Todo
ello obliga a la profesión veterinaria a estar muy atenta a los avances científicos que se
produzcan, y a adquirir una preparación que le permita responder ante estos nuevos
desafíos y saber actuar con las pautas correctas ante estas situaciones.
La Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes, es una asociación
joven, que gracias al entusiasmo de sus fundadores, unido a la ilusión de los sucesores en su
dirección, ha venido cumpliendo sus objetivos a lo largo de los sucesivos años, de manera
particular a través de las reuniones internacionales, cuyas aportaciones científicas han
supuesto un considerable impulso a la medicina, sanidad y producción de los rumiantes en
las diversas zonas de la cuenca mediterránea.
Entre los temas tratados habitualmente en los congresos de la Federación, se incluyen
aspectos relativos a problemas clínico-médicos, infecciosos y parasitarios, así como los de
nutrición, selección y mejora de razas y producción de carne y leche principalmente, sin
excluir otros sobre la valoración de la calidad sanitaria, y calidad alimenticia de los diversos
productos derivados. Todo ello centrado esencialmente en explotaciones de grandes y
pequeños rumiantes.
Entre los objetivos científicos se cuenta también el estudio de las razas autóctonas de
rumiantes en diferentes zonas de la cuenca mediterránea, que tienen sus peculiaridades de
manejo y explotación y que, sobre todo, destacan por la alta calidad de sus productos, que
son muy apreciados por los consumidores.
Hoy hay un interés añadido por los rumiantes no domésticos (los silvestres), que aparte de
su importancia como especies de caza, están muy implicadas en la conservación del medio
natural. Curiosamente, algunas de estas especies son indicadoras de lo que podríamos
llamar “sanidad o calidad ambiental” y su conservación o introducción en determinadas
zonas, está adquiriendo un creciente interés.
En el mes de septiembre de 2005, en la preciosa y acogedora ciudad italiana de Bari,
aceptamos el encargo de la organización de esta 14ª edición del FeMeSPRum. Hoy
estamos en su comienzo, pero antes los organizadores, hemos tenido que salvar obstáculos
y dedicar horas de intenso trabajo. Todos estos esfuerzos los daremos por bien empleados
si, como esperamos, todo se desarrolla con normalidad y sobre todo, si contamos con el
apoyo y la participación activa de todos los asistentes.
Contamos con la inestimable ayuda de ponentes, muy cualificados en sus respectivas
especialidades, pero es con vuestra presencia y participación activa como se conseguirá el
nivel científico que todos deseamos.
XII
La discusión sobre los temas presentados y las conclusiones a las que se llegue, serán una
ayuda inestimable para abordar soluciones a muchos problemas sanitarios y productivos de
los rumiantes en las respectivas áreas de influencia de los países del Mediterráneo.
Hemos de estacar la participación de personas con nivel científico reconocido, que
mediante conferencias plenarias, ponencias en mesas redondas, o en forma de
comunicaciones orales o de póster, darán justa medida del contenido a este Congreso, y
cuyos trabajos pretenden contribuir a mejorar el bienestar de nuestras sociedades.
Por supuesto, no buscamos entrar en competencia con congresos habidos anteriormente.
Estamos seguros de que cada uno ha destacado especialmente en algún aspecto. Nosotros
sólo deseamos que, una vez más, esta ocasión sea un motivo y un foro de encuentro, que
propicie el intercambio fructífero de conocimientos y que, al mismo tiempo, sea un pretexto
para crear nuevos vínculos de amistad entre los socios de los distintos países.
Así pues, tenemos una amplia tarea para estos próximos días, que indudablemente tiene
mucho interés para todos nosotros, por lo que supone de intercambio y contraste de
conocimientos. En definitiva, nuestro objetivo no es otro que el Congreso responda a
criterios del mayor nivel científico en los temas a tratar, y que sus conclusiones contribuyan
a proponer las mejores soluciones a los distintos problemas que se plantean en los
rumiantes de las zonas de especial influencia mediterránea.
Estamos convencidos de que el resultado de las aportaciones científicas será muy positivo
para todos nosotros, pero también lo será para los colegas que trabajan en las instituciones y
en calidad de veterinarios clínicos, sin olvidar el interés que han de representar estos
trabajos para nuestros estudiantes.
Espero que disculpen las posibles deficiencias que hayamos tenido, pero quiero que sepan
también que estamos a su disposición en el Comité Organizador, para intentar solucionar
las dificultades que puedan surgir en estos próximos días. Lo que sí es seguro es que
también dispondrán de tiempo para acercarse a conocer las gentes, y disfrutar de la historia,
los monumentos (que son muchos) y la gastronomía (que es extensa e intensa), por lo
menos de las dos ciudades (Santiago de Compostela y Lugo), y seguramente también de
otros lugares de Galicia, que ofrecen numerosos atractivos.
Lo que les deseo a todos es que después del Congreso recuerden, con sumo agrado, su
estancia en estas tierras de Galicia, que desde siempre han sido y muy acogedoras, y
hospitalarias con sus visitantes.
Bienvenidos a todos y que entre todos realicemos un excelente trabajo.
Santiago de Compostela, 12 de julio de 2006
Pablo Díez Baños
José Luis Benedito Castellote
Presidentes del Comité Organizador del XIV Congreso Internacional de la Federación
Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes
XIII
ÍNDICE
CONFERENCIAS / CONFERENCES
FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES:
VEINTE AÑOS DE BUIATRÍA
García Partida, P. (Con la colaboración de Ruiz Abad, L.)....................................................1
APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA DEL ADN EN LOS
PROGRAMAS DE MEJORA GENÉTICA DE LOS RUMIANTES.
López Viana, J........................................................................................................................5
DISEASES RELATED TO COPPER, MOLYBDENUM AND SULPHUR INTERACTIONS
IN RUMINANTS.
Gooneratne, R. .......................................................................................................................8
MECANISMOS DEL ESTRÉS EN EL TORO DE LIDIA.
Illera, J.C.; Silván, G.; Gil-Cabrera, F.; Illera, M.J. .............................................................15
PARANFISTOMOSIS BOVINA: ENFERMEDAD EMERGENTE EN EL ÁREA
MEDITERRÁNEA.
Paz Silva, A..........................................................................................................................19
MESA REDONDA / ROUND TABLE
SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EN EL MEDITERRÁNEO
AGGIORNAMENTI SULLA TOXOPLASMOSI E NEOSPOROSI DEI RUMINANTI
DEL BACINO DEL MEDITERRANEO.
TOXOPLASMOSIS AND NEOSPORORIS UPDATES IN RUMINANTS OF THE
MEDITERRANEAN BASIN.
Scala, A. ...............................................................................................................................24
VACUNAS Y VACUNACIÓN EN LOS PEQUEÑOS RUMIANTES.
Martín Gómez, S. .................................................................................................................33
EVOLUCIÓN Y SITUACIÓN ACTUAL DE LA ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME
BOVINA (EEB).
Fernández Rodríguez, G.......................................................................................................45
XV
PROBLEMÁTICA DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS DE RUMIANTES EN EL
ÁREA MEDITERRÁNEA
CALIDAD DE LA CARNE DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS.
Sánchez García, L. ...............................................................................................................55
POSIBILIDADES Y FUTURO DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS DE PRODUCCIÓN
CÁRNICA.
Monserrat Bermejo, L. .........................................................................................................66
CRECIMIENTO Y CALIDAD DE LA CARNE DE TERNEROS DE RAZA MINHOTA.
Araújo, J.P............................................................................................................................70
PROBLEMAS SANITARIOS Y DE MANEJO EN RRUMIANTES SILVESTRES
DEL ÁREA MEDITERRÁNEA
INFECCIÓN POR PESTIVIRUS EN EL REBECO (Rupicapra pyrenaica) EN EL
PIRINEO CATALÁN.
Lavín, S.; Marco, I. ..............................................................................................................79
RILIEVI CLINICI, LEGISLATIVI, GESTIONALI, DI BENESSERE E PROTEZIONE
DEL MUFLONE IN SARDEGNA.
Cubeddu, G. .........................................................................................................................88
ANÁLISIS DEL ESTADO PARASITARIO DE RUMIANTES SILVESTRES EN EL
NORTE DE CASTILLA Y LEÓN.
Díez-Baños, N. .....................................................................................................................95
COMUNICACIONES CIENTÍFICAS/SCIENTIFIC COMMUNICATIONS
VALOR NUTRITIVO DE LA CARNE DE LOS TERNEROS DE RAZA RUBIA
GALLEGA: EFECTO DEL AMAMANTAMIENTO Y ÉPOCA DE PARTO.
NUTRITIVE VALUE OF RUBIA GALLEGA VEAL: EFFECT OF MATERNAL SUCKLING
AND THE CALVING SEASON.
Bispo, E.; Franco, D.; Amor, V.; Monserrat, L.; Moreno, T..............................................103
XVI
EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA CALIDAD
DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. I. TERNEROS.
EFFECT OF SLAUGHTERED WEIGHT AND SILAGE TYPE ON CARCASS, MEAT AND
FAT QUALITY. I. YOUNG BULLS.
Zea, J., Díaz, Mª D.; Carballo, J. A. ...................................................................................109
EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA CALIDAD
DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. II. TERNERAS.
FAT QUALITY. II. HEIFFERS.
Zea, J.; Díaz, Mª D.; Carballo, J. A. ..................................................................................119
LA PONTREMOLESE: UNA RAZZA BOVINA AUTOCTONA IN VIA DI
ESTINZIONE. PONTREMOLESE: AN ITALIAN BOVINE BREED IN ENDANGERED
STATUS
Goracci, J.; Giuliotti, L.; Benvenuti, N.; Verità, P.; Facdouelle, I. ....................................128
PRODUZIONE E QUALITA’ DEL LATTE DI CAPRE MALTESI ALLEVATE IN
SICILIA.
MILK YIELD AND QUALITY IN MALTESE GOATS REARED IN SICILY.
Zumbo, A.; Di Rosa, A.R.; Finocchiaro, R. .......................................................................136
EFFETTO DELLA STAGIONE DI PARTO SULLE CARATTERISTICHE QUANTIQUALITATIVE DEL LATTE DI CAPRE “ DERIVATE DI SIRIA”.
EFFECT OF THE “SASON OF KIDDING”ON THE QUANTITATIVE AND
QUALITATIVE CHARACTERISTICS OF THE MILK OF “DERIVATA DI SIRIA”GOATS.
Zumbo, A.; Di Rosa, A.R.; Amato, C.; Maresca, L. ..........................................................141
CORTISOL LEVELS AS INDICATOR OF STRESS IN DOMESTIC GOATS UNDER
DIFFERENT HOUSING SYSTEMS.
Fazio, E.; Medica, P.; Cavaleri, S.; Cravana, C.; Ferlazzo, A............................................147
INFECTION VALUTAZIONE DELL’APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON
INFEZIONE DA Brucella spp.
EVALUATION OF THE LACRIMAL SYSTEM IN SHEEP WITH Brucella spp.
Gruppillo, A.; Galia, S.; Bosco, V.R.F.; Parisi, F.; Mazzullo, G.; Pugliese, A. .................151
ANALISI CHIMICA DELL’UMORE ACQUEO NELLA SPECIE OVINA:
VALUTAZIONE COMPARATIVA CON CAMPIONI POSITIVI PER Brucella spp.
(REAL TIME PCR).
ANALYSIS OF AQUEOUS HUMOR IN THE SHEEP: COMPARATIVE EVALUATION
WITH SAMPLES POSITIVE TO Brucella spp. (REAL-TIME PCR).
Di Pietro, S.; Bosco, V.R.F.; Gruppillo, A.; Galia, S.; Venza, I.; Pugliese ,A. ..................156
XVII
Brucella spp. (REAL-TIME PCR) IN LACRIME, UMORE ACQUEO E VITREO DI
PECORE INFETTE. Brucella spp. (REAL-TIME PCR) INTO TEARS, AQUEOUS AND
VITREOUS OF INFECTED SHEEP.
Di Pietro, S.; Galbo, A.; Bonanno, G.; De Domenico, A.; Reale, S.; Giudice, E...............163
L’ESAME ANATOMO-PATOLOGICO AL MACELLO PER UNA MIGLIORE
CONOSCENZA E VALUTAZIONE DELLE RETROVIROSI OVINE IN TOSCANA.
THE ANATOMO-PATHOLOGICAL DIAGNOSIS IN SLAUGHTERHOUSE TO BEST
KNOWLEDGE AND EVALUATION OF OVI-CAPRINE PATHOLOGY BY
RETROVIRIDAE IN TUSCANY.
Bio, C.; Gregori, M.; Taccini, E.; Braca, G........................................................................167
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI LISOZIMA IN LATTE OVINO
NORMALE E MASTITICO.
EVALUATION OF LYSOZYME TITRATION IN NORMAL AND MASTITIC OVINE MILK.
Fratini, F.; Ebani, V.V.; Ampola, M.; Innocenti, E.; Forzale, F.; Periccioli, M.; Cerri, D.;
Andreani, E. .......................................................................................................................171
INTERACCIÓN ENTRE LAS INFECCIONES POR BVDV Y BoHV-1 EN ESTABLOS
LECHEROS DE ITALIA.
INTERACTION BETWEEN BVDV AND BoHV-1 INFECTION IN DAIRY HERDS IN
ITALY.
Cuteri, V.; Cittadini, F.; Romero Tejeda, A.; Preziuso, S.; Marenzoni, M.L.; Attili, A.R.;
Passamonti, F.; Giorgi, G.; Valente, C. ..............................................................................180
AGENTES INVOLUCRADOS EN LOS ABORTOS DE BÚFALOS (Bubalus bubalis)
PROVENIENTES DE LA REGIÓN CENTRAL DE ITALIA.
SELECTED AGENTS INVOLVED IN BUFFALO (Bubalus bubalis) ABORTION IN
CENTRAL ITALY.
Cuteri, V.; Attili, A.R.; Cittadini, F.; Preziuso, S.; Romero Tejeda, A.; Marenzoni, M.L.;
Valente, C...........................................................................................................................187
NIVELES DE CADMIO EN HÍGADO, RIÑÓN Y MÚSCULO EN GANADO OVINO
PROCEDENTE DE LEON (N.O. ESPAÑA).
CADMIUM LEVELS IN LIVER, KIDNEY AND MEAT IN SHEEP FROM LEON (N.W.
SPAIN).
Sierra Carro, J.A.; López Alonso, M.; García-Partida, P.; Escudero Población, A.; Benedito,
J.L.......................................................................................................................................194
MANEJO FARMACOLÓGICO DE LA GOTERA ESOFÁGICA OVINA.
FARMACOLOGICAL CLOSURE OF THE ESOPHAGEAL GROOVE IN SHEEP.
González Montaña, J.R.; López Méndez, S.; Alonso Díez, A.J.; Rejas López, J.; Álvarez
Nistal, R.; Prieto Montaña, F..............................................................................................201
XVIII
CIRCULATING TOTAL AND FREE IODOTHYRONINES LEVELS OF SHEEP (Ovis
aries): DIFFERENTIATED EFFECTS OF RESTRAINT AND SHEARING AND PREVIOUS
EXPOSURE TO SHEARING.
Medica, P.; Fazio, E.; Cravana, C.; Aronica, V.; Ferlazzo, A............................................206
DISMIELOGENESI SPINALE DEL BOVINO (SDM). SU DI UN CASO IN UN
VITELLO DI RAZZA BRUNA.
BOVINE SPINAL DYSMYELINATION (SDM). A CASE IN AN ITALIAN BROWN CALF.
Testoni, S.; Gentile, A........................................................................................................210
IMPIEGO DELLA TERMOGRAFIA AD INFRAROSSO QUALE MEZZO PER LA
DETERMINAZIONE DELLO STATO DI SALUTE E BENESSERE DEI RUMINANTI:
RISULTATI PRELIMINARI.
USE OF INFRARED THERMOGRAPHY FOR EVALUATING HEALTH AND WELFARE
STATUS IN RUMINANTS: PRELIMINARY RESULTS.
Morgante, M.; Gianesella, M.; Cannizzo, C.; D’alterio, G.; Stelletta, C............................215
OSSERVAZIONI LEGISLATIVE E MEDICO LEGALI SUI DANNI CAGIONATI DAI
RUMINANTI SELVATICI (Cervus elaphus ) IN SARDEGNA.
Cubeddu, G.M.; Pinna Parpaglia, M.L.; Cocco, R. ............................................................221
THE CLINICAL EFFICIENCY OF MINERASOL ON CATTLES, WHICH IS A NEW
TRACE ELEMENT COMBINATION.
Erman Or; M.; Kayar, A.; Gönül, R.; Dokuzeylül, B.; Rıza Kiziler, A.; Parkan, Ç.; Morkoç,
T.; Barutçu, B.....................................................................................................................226
PRIMI RISULTATI DI UN INDAGINE SULLA FREQUENZA DEGLI APLOTIPI ALFA
GLOBINICI IN RAZZE ISOLANE ITALIANE.
ALPHA GLOBIN HAPLOTYPE SCREENING IN ITALIAN ISLANDER SHEEP BREEDS:
PRELIMINARY RESULTS.
Alloggio, I.; Bramante, G.; Pieragostini, E. .......................................................................233
RELAZIONI TRA POLIMORFISMI GENETICI LATTOPROTEICI E LA QUALITA’
CHIMICO-FISICA E NUTRIZIONALE DEL LATTE OVINO.
RELATIONS BETWEEN MILK GENETIC POLYMORPHISMS AND THE CHEMICALPHYSICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF SHEEP MILK.
Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Cecchi, F.; Ceriotti, G.; Caroli, A. ...........................238
RELAZIONI TRA IL POLIMORFISMO GENETICO DELL αs1-CASEINA E LA
QUALITA’ CHIMICO-FISICA E NUTRIZIONALE DEL LATTE DI CAPRA.
RELATIONS BETWEEN THE GENETIC POLYMORPHISM OF αs1-CASEIN AND THE
CHEMICAL-PHYSICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF GOAT MILK
Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Chiatti, F.; Chessa, S.; Caroli, A..............................244
XIX
GENOTIPADO DEL SCRAPIE OVINO: ADAPTACIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS
PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS VARIANTES ALÉLICAS.
SHEEP GENOTYPED FOR SCRAPIE: ADJUSTMENT OF THE ANALYSIS METHOD
FOR THE IDENTIFICATION OF NEW ALLELIC VARIANTS.
Portela, C.; Bouzada, J.A.; Prado, C.; Areán, H.; Fernández, M.; López, M.; Fernández, A.;
Viana, J.L. ..........................................................................................................................250
CONTROL GENEALÓGICO EN LAS ESPECIES OVINA Y CAPRINA MEDIANTE
ANÁLISIS DE MARCADORES MICROSATÉLITE DE ADN.
SHEEP AND GOATS GENEALOGICAL CONTROL USING THE ANALYSIS OF DNA
MICROSATELLITE MARKERS.
Bouzada, J.A.; Portela, C.; Prado, C.; Areán, H.; Fernández, M.; Fernández, A.; Viana, J.L.
............................................................................................................................................256
RÉPONSE SUPEROVULATOIRE ET RÉCUPERATION D'EMBRYONS DE CHÈVRES
DONEUSES DE RACE BOER DANS LES PROCÉDURES DE TRANSFERT
D'EMBRYONS.
SUPEROVULATION RESPONSE AND EMBRYO RECOVERY OF DONOR DOES BOER
RACE IN EMBRYOTRANSFER PROCEDURES.
Grizelj, J.; Vince, S.; Tomaskovic, A.; Baril, G.; Makek, Z.; Getz, I.; Djuricic, D.;
Prvanovic, N.; Samardzija, M. ...........................................................................................264
FUNCIÓN DE LAS GLICOPROTEÍNAS ASOCIADAS A LA GESTACIÓN (PAGs) Y
PROGESTERONA EN DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LA GESTACIÓN Y
MORTALIDAD EMBRIONARIA PRECOZ EN VACAS.
ROLE
OF
PREGNANCY
ASSOCIATED
GLYCOPROTEINS
(PAG)
AND
PROGESTERONE IN EARLY PREGNANCY DIAGNOSIS AND EARLY EMBRIONIC
MORTALITY IN COWS.
Prvanovic, N.; Beckers, J.F.; Sulon, J.; Tomaskovic, A.; Cergolj, M.; Dobranic, T.; Grizelj,
J.; Samardzija, M.; Kocila, P..............................................................................................267
EFFETTO DEL MOMENTO DEL PARTO SULLA RIPRESA DELL’ATTIVITÀ
RIPRODUTTIVA IN PECORE DI RAZZA SARDA.
EFFECT OF THE LAMBING DATE ON THE RESUMPTION OF REPRODUCTIVE
ACTIVITY IN SARDA EWE.
Carcangiu, V.; Vacca, G.M.; Mura, M.C.; Marchi, B.; Falchi, L.; Bini P.P. .....................272
ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA E LEPTINA IN AGNELLE DI RAZZA SARDA.
LEPTIN AND REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA EWE LAMBS.
Carcangiu, V.; Vacca, G.M.; Parmeggiani, A.; Mura, M.C.; Fiori, M.; Pazzola, M.; Bini,
P.P. .....................................................................................................................................278
ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA NELLA CAPRA DI RAZZA SARDA ED ESPRESSIONE
GENICA DEL RECETTORE DELLA MELATONINA.
XX
REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA GOAT AND GENIC EXPRESSION OF
MELATONIN RECEPTOR.
Mura, M.C.; Carcangiu, V.; Luridiana, S.; Vacca, G.M.; Atzeni, M.; Falchi, L.; Bini, P.P.
............................................................................................................................................284
VALUTAZIONE
IGIENICO-SANITARIA
E
CARATTERIZZAZIONE
MICROBIOLOGICA DELLA CACIOTTA CAPRINA A LATTE CRUDO DELL’ISOLA
DI CAPRAIA.
HYGIENICAL EVALUATION AND MICROBIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF THE
GOAT CACIOTTA BY RAW MILK OF THE CAPRAIA ISLAND.
Cerri, D.; Innocenti, E.; Fratini, F.; Ebani, V.V.; Ampola, M.; Zucconi, C.; Andreani, E.
............................................................................................................................................289
OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS OSEAS PARCIALMENTE
PURIFICADAS A PARTIR DE HUESO BOVINO.
EXTRACTION OF PARTIALLY PURIFIED BONE MORPHOGENETIC PROTEINS FROM
BOVINE BONE.
Bustamante Cano, J.J.; Rivera Posada, J.; Fernández Revuelta, J.; Alonso Alonso, P.;
Alonso Diez, A.J..; González Montaña, J.R.......................................................................299
EFFECT OF THE REPEATED DOSES OF PROSTAGLANDINS ON THE UTERINE
DISCHARGES IN THE COWS WITH RETAINED FETAL MEMBRANES.
Hamali, H. ..........................................................................................................................306
VALUTAZIONE ECOGRAFICA DEL CAPEZZOLO MEDIANTE IMMERSIONE IN
ACQUA NELLA BOVINA IN LATTAZIONE ED ASCIUTTA.
EVALUATION OF TEAT BY WATER-FILLED CUP ULTRASONOGRAPHY IN
LACTATING AND DRIED COWS.
De Domenico, A.; Parisi, F.; La Spisa, M.; Pugliese, M.; Niutta, P.P.; De Majo, M.........309
ENDOPARASSITI IN UN ALLEVAMENTO DI PECORA ZERASCA, UNA RAZZA
AUTOCTONA ITALIANA.
ENDOPARASITES IN A FLOCK OF ZERASCA, AN ITALIAN AUTOCHTONOUS BREED
OF SHEEP.
Perrucci, S.; Bianchi, C.; Benvenuti, N.; Goracci, J.; Fichi, G.; Giuliotti, L......................318
XXI
POSTERS DE SANIDAD / HEALTH POSTERS
TREMATODOSIS PARASITARIAS EN BOVINOS SACRIFICADOS EN EL
NOROESTE DE ESPAÑA.
PARASITIC TREMATODOSIS IN SLAUGHTERED CATTLE FROM NW SPAIN.
Arias, M., Lomba, C., Painceira, A., Vázquez, L., Cienfuegos, S., Dacal, V., Pedreira, J.,
Sánchez-Andrade, R., Morrondo, M.P., Paz-Silva, A........................................................325
NUEVOS RETOS EN LA VETERINARIA DE LA GANADERÍA ECOLÓGICA EN
GALICIA.
NEW CHALLENGES OF VETERINARY IN GALICIAN ORGANIC FARMING.
Blanco Penedo, I.; López Alonso, M.; Miranda, M.; García Vaquero, M.; Gutierrez,B.;
Velasco, J.; Hernández, J.; Castillo, C.; Benedito, J.L. ......................................................333
HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ ÓSEA DESMINERALIZADA.
Bustamante Cano, J.J.; Rivera Posada, J.; Cano Quintero, W.; Robles Robles, R.; González
Montaña, J.R.; Prieto Montaña, F. .....................................................................................341
LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS DE DVB EN TANQUE DE LECHE COMO
HERRAMIENTA PARA LA DETECCIÓN DE EXPLOTACIONES CON ANIMALES
PERSISTENTEMENTE INFECTADOS.
BVDV BULK MILK ANTIBODY TESTING: AN ASSISTANCE FOR THE DETECTION OF
FARMS WITH PERSISTENTLY INFECTED ANIMALS.
Carnero, I.; Eiras, C.; Arnaiz, I. .........................................................................................345
LAS OVEJAS NO SON UN RESERVORIO ZOONÓTICO IMPORTANTE PARA
GIARDIA.
ADULT SHEEP MAY NOT BE AN IMPORTANT ZOONOTIC RESERVOIR FOR GIARDIA.
Castro-Hermida, J.A.; Almeida, A.; González-Warleta, M.; Correia Da Costa, J.M.; Mezo,
M. .......................................................................................................................................349
EVALUATION OF BOBEL-24 FOR TREATMENT OF EXPERIMENTAL
CRYPTOSPORIDIOSIS.
Castro-Hermida, J.A.; García-Presedo, I. González-Warleta, M.; Mezo, M. ; Fenoy, S.;
Rueda, C.; Del Águila, C....................................................................................................355
INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERON GAMMA (IFN-γ) EN
CULTIVOS DE LINFOCITOS DE BOVINOS CON HIPODERMOSIS.
MODULATORY EFFECT OF THE HIPODERMIN A ON THE SECRETION OF GAMMA
INTERFERON (IFN-γ) IN CULTURES OF LYMPHOCITES FROM CATTLE WITH
HIPODERMOSIS.
Dacal, V.; Panadero, R.; López, C.; Vázquez, L.; Díaz, P.; Pedreira, J.; Morrondo P.; DíezBaños, P. ............................................................................................................................362
XXII
INFLUENCIA DEL CONTROL ANTIPARASITARIO SOBRE NEMATODOS
GASTROINTESTINALES EN GRANJAS DE VACAS RUBIA GALLEGA.
INFLUENCE OF ANTHELMINTIC CONTROL PRACTICES ON GASTROINTESTINAL
NEMATODES IN RUBIA GALLEGA FARMS.
Díaz, P.; Pedreira, J.; Sánchez-Andrade, R.; Paz, A.; López, C.; Díez-Baños, P.; Morrondo,
P. ........................................................................................................................................370
INFLUENCIA DEL MANEJO SOBRE LA INFECCIÓN POR COCCIDIOS EN VACAS
DE RAZA AUTÓCTONA RUBIA GALLEGA.
INFLUENCE OF MANAGEMENT ON COCCIDIA INFECTIONS IN AUTOCHTHONOUS
RUBIA GALLEGA CATTLE.
Díaz, P.; Pedreira, J.; Sánchez-Andrade, R.; Paz, A.; Suárez, J.L.; Díez-Baños, P.;
Morrondo, P. ......................................................................................................................375
ESTUDIO PARASITOLÓGICO DEL GANADO OVINO EN LA PROVINCIA DE LEÓN
(ESPAÑA) MEDIANTE ANÁLISIS COPROLÓGICO.
PARASITIC STUDY OF SHEEP EN THE PROVINCE OF LEON (SPAIN) BY
COPROLOGICAL ANALYSIS.
Díez-Baños, N.; Martínez Delgado, A.; Hidalgo-Argüello, M.R.......................................380
INFLUENCIA DE LA LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA SOBRE LOS NIVELES DE
CADMIO EN GANADO OVINO EN LEÓN (N.O. ESPAÑA).
INFLUENCE OF THE GEOGRAPHIC LOCATION ON CADMIUM LEVELS IN SHEEP IN
LEON (N.W. SPAIN).
López Alonso, M.; Sierra Carro, J.A.; Escudero Población, A.; Benedito, J.L.; Prieto
Montaña, F. ........................................................................................................................384
ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DEL RIESGO DE EEB EN
GALICIA (ESPAÑA).
ANALYSIS OF THE GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE BSE RISK ON GALICIA
(SPAIN).
Allepuz, A.; López, A.; Forte, A.; Fernández, G.; Casal, J. ...............................................390
CLASIFICACIÓN DE ZONAS DE GALICIA SEGÚN CARACTERIZACIÓN DEL
RIESGO DE TUBERCULOSIS BOVINA.
CLASSIFICATION OF ZONES OF GALICIA (NORTH- WETS OF SPAIN) DEPENDING
ON THE RISK OF BOVINE TUBERCULOSIS.
Fernández, G.; Diéguez, F.J. ..............................................................................................393
ANÁLISIS DE RIESGO DE LENGUA AZUL EN GALICIA.
BLUE TONGUE RISK ANALYSIS IN THE GALCIA REGION OF SPAIN.
Fernández, G.; Diéguez, F.J. ..............................................................................................397
XXIII
VALIDACIÓN DEL ELISAi PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE A
INFECCIONES DE Brucella abortus EN GANADO VACUNO.
Francia, C.; Fernández, D.; Fernández, G. .........................................................................401
EL GANADO VACUNO COMO INDICADOR DE LA DEPOSICIÓN ATMOSFÉRICA
DE MERCURIO EN GALICIA (NO ESPAÑA).
CATTLE LIKE INDICATOR OF ATMOSPHERIC MERCURY DEPOSITION IN GALICIA
(NW SPAIN).
García Vaquero, M.; Benedito, J.L.; Blanco, I.; Miranda, M.; Gutierrez, B.; Hernández, J.;
Castillo, C.; López-Alonso, M. ..........................................................................................405
SUL COSIDDETTO “VITELLO PANCIONE”.
THE SO CALLED “PAUNCH CALF”.
Gentile, A.; Militerno, G.; Sconza, S.; Testoni, S. .............................................................410
CALIDAD SANITARIA DE LA LECHE CAPRINA DE RAZAS EUROPEAS
EXPLOTADAS EN EL BAJÍO MEXICANO.
SOMATIC CELL COUNT OF GOAT MILK PRODUCED BY EUROPEAN RACES
EXPLOITED IN THE MEXICAN BAJIO.
Fernández Pérez, M.; Castillo Juárez, H. Fernández Perrino, F.J.; Saltijeral Oaxaca, J.A.;
González Montaña, J.R. .....................................................................................................413
INFLUENCIA DE LA RAZA SOBRE LA DISTRIBUCIÓN ORGÁNICA DE COBRE EN
TERNEROS DE CEBO SUPLEMENTADOS CON COBRE.
INFLUENCE OF BREED ON ORGANIC COPPER ACCUMULATION IN FEEDLOT
CATTLE RECEIVING COPPER SUPPLEMENTATION.
Gutierrez, B.; López-Alonso, M.; Miranda, M.; Blanco, I.; Hernández, J.; Castillo, C.;
Velasco, J.; García Vaquero, M.; Benedito, J.L. ................................................................418
EFECTOS DE LA SUPLEMENTACIÓN CON MONENSINA O Saccaromyces cerevisiae
SOBRE PARAMETROS PRODUCTIVOS E HIDROELECTROLITICOS EN
TERNEROS EN FASE DE CRECIMIENTO.
EFFECTS OF MONENSIN AND Saccaromyces cerevisiae SUPPLEMENTATION ON
PRODUCTIVE AND HYDROELECTROLYTIC BALANCE IN GROWING FEEDLOT
STEERS.
Hernández, J.; Castillo, C.; Vázquez, P.; Pereira, V.; Vecillas, R.; López Alonso, M.;
Benedito, J.L. .....................................................................................................................423
CAMBIOS EN LOS VALORES SANGUÍNEOS DE L-LACTATO Y EN EL
RENDIMIENTO PRODUCTIVO ASOCIADOS AL PROCESAMIENTO DEL GRANO
EN TERNEROS DE CEBO.
CHANGES IN BLOOD L-LACTATE AND GROWTH PERFORMANCE ASSOCIATED TO
GRAIN PROCESSING IN FEEDLOT STEERS.
Castillo, C.; Hernández, J.; Vázquez, P.; Pereira, V.; López Alonso, M.; Gómez, J.J.;
Benedito, J.L. .....................................................................................................................428
XXIV
OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS PARASITARIOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO
DE TREMATODOSIS BOVINAS MEDIANTE ELECTROELUCIÓN.
GETTING PARASITIC ANTIGENS FOR THE DIAGNOSIS OF BOVINE TREMATODOSIS
BY ELECTROELUTION.
Francisco, I.; Lomba, C., Pardo, M.; Pedreira, J.; Suárez, J.L.; Sánchez-Andrade, R.; Díaz,
P.; Arias, M., Paz-Silva, A.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P. ..........................................433
IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS LEUCOCITARIAS EN MUESTRAS DE BOVINO
FIJADAS EN ETANOL.
CELL IDENTIFICATION IN ETHANOL-FIXED BOVINE SAMPLES.
LEUCOCYTE
López, C.; Panadero, R.; Dacal, V.; Vázquez, L.; Díaz, P.; Pedreira, J.; Morrondo, P.; Díez,
P. ........................................................................................................................................438
DATOS PRELIMINARES SOBRE LA PARASITOFAUNA DEL CIERVO (Cervus
elaphus) DE LA RESERVA REGIONAL DE CAZA DE RIAÑO (NE DE LEÓN,
ESPAÑA).
Martínez-Delgado, A.; Diez-Baños, N.; Hidalgo-Argüello, M.R. .....................................443
ESTUDIO DE LA PROTECCIÓN CON EL ANTÍGENO Fh15 MÁS
INMUNOMODULADORES EN OVINOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE
CON Fasciola hepatica.
ASSESSMENT OF STUDY WITH Fh15 ANTIGEN AND IMMUNOMODULATORS IN
SHEEP EXPERIMENTALLY INFECTED WITH Fasciola hepatica.
Morrondo, P.; Arias, M.S.; Pedreira, J.; Dacal, V.; Vázquez, L.; López, C.; Díez-Baños, P.;
Martínez, A.R.....................................................................................................................450
PRODUCCIÓN DE INTERLEUQUINA 10 EN GANADO VACUNO INFESTADO
EXPERIMENTALMENTE POR Hypoderma lineatum.
PRODUCTION OF INTERLEUKIN 10 IN CATTLE EXPERIMENTALLY INFESTED BY
Hypoderma lineatum.
Panadero, R.; Cienfuegos, S.; Dacal, V.; Vázquez, L.; Pedreira, J.; Díaz, P.; López, C.;
Díez-Baños, P.....................................................................................................................456
ESTADO ACTUAL DE LAS MIASIS QUE AFECTAN A LOS RUMIANTES
DOMÉSTICOS EN LA PENÍNSULA IBÉRICA.
CURRENT STATUS OF MYIASIS AFFECTING DOMESTIC RUMINANTS IN THE
IBERIAN PENINSULA.
Panadero, R.; Sánchez-Andrade, R.; Morrondo, P.; López, C.; Paz, A. Suarez, J.L.; DíezBaños, P. ............................................................................................................................461
XXV
APLICACIÓN CONJUNTA DE PRUEBAS DE DETECCIÓN DE RESISTENCIA
ANTIHELMÍNTICA in vivo E in vitro A BENCIMIDAZOLES Y LACTONAS
MACROCÍCLICAS EN TRICOSTRONGÍLIDOS OVINOS.
Pedreira, J.; Díaz, P.; Suárez, J.L.; Arias, M.; Lomba, C.; Painceira, A.; Sánchez-Andrade,
R.; Paz-Silva, A.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P............................................................467
ESTRATEGIA RECOMENDADA PARA EL DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LA
NEOSPOROSIS BOVINA EN LAS ADSG DE GALICIA.
RECOMMENDED STRATEGY FOR THE DIAGNOSIS AND CONTROL OF THE BOVINE
NEOSPOSOSIS IN THE ADSG OF GALICIA.
Pedreira, J.; Díaz, P.; Suárez, J.L.; Arias, M.; Lomba, C.; Painceira, A.; Sánchez-Andrade,
R.; Paz-Silva, A.; Díez-Baños, P.; Morrondo, M.P............................................................471
INFLUENCIA DE LA SUPLEMENTACIÓN CON MALATO EN DIETAS RICAS EN
GRANO Y CON ALTOS NIVELES DE FIBRA BRUTA SOBRE EL EQUILIBRIO
HIDROELECTROLÍTICO EN TERNEROS DE CEBO EN FASE DE CRECIMIENTO.
INFLUENCE OF MALATE SUPPLEMENTATION ON HYDROELECTROLYTIC
BALANCE IN GROWING FEEDLOT STEERS FED A HIGH-GRAIN, HIGH-FIBRE DIET.
Pereira, V.; Castillo, C.; Hernández, J.; Vázquez, P.; López-Alonso, M.; Gómez, J.J.;
Benedito, J.L. .....................................................................................................................474
DIFERENCIAS ENTRE LA SUPLEMENTACIÓN CON MONENSINA Y MALATO EN
DIETAS RICAS EN GRANO Y CON ALTOS NIVELES DE PROTEÍNA BRUTA
SOBRE EL EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO EN TERNEROS DE CEBO EN
FASE DE CRECIMIENTO.
DIFFERENCES BETWEEN MONENSIN AND MALATE SUPPLEMENTATION ON
HYDROELECTROLYTIC BALANCE IN GROWING FEEDLOT STEERS FED A HIGHGRAIN, HIGH-PROTEIN DIET.
Pereira, V.; Castillo, C.; Hernández, J.; Vázquez, P.; López-Alonso, M.; Vecillas, R.;
Benedito, J.L. .....................................................................................................................482
CONSIDERAZIONI CLINICHE SULLA DIARREA VIRALE DEI BOVINI (BVD).
Fiore, F., Cubeddu, G.M.; Lai, M.G.; Coda, S.; Pintori, G. ...............................................491
EFICACIA DE IVERMECTINA FRENTE A Oestrus ovis EN OVEJAS MEDIANTE
ELISA-INDIRECTO.
EFFICACY OF IVERMECTIN AGAINST Oestrus ovis IN SHEEP BY ELISA.
Ramírez, M.; Suárez, J.L.; García-Alba, C.; Díaz, P.; Scala, A.; Arias, M.; Morrondo, M.P.;
Díez-Baños, P.; Paz-Silva, A.; Sánchez-Andrade, R..........................................................496
XXVI
CHORIOPTIC MANGE IN DAIRY CATTLE: AN EPIDEMIOLOGICAL
INVESTIGATION IN SARDINIA (ITALY).
LA ROGNA CHORIOPTICA DELLA BOVINA DA LATTE: INDAGINE
EPIDEMIOLOGICA IN SARDEGNA (ITALY).
Scala, A.; Bonfanti, M. ; Leotta, G.; Rondoni Angioni, G.; Marongiu, M.; Nieddu, M.S.;
Mocci, G.............................................................................................................................500
VACCINAZIONE CONTRO LA CENUROSI NEGLI OVINI – PROVE DI CAMPO.
PRELIMINARY DATA ON FIELD TRIAL VACCINATION AGAINST COENUROSIS IN
SHEEP.
Varcasia, A.; Sanna Coccone, G.N.; Cocco, A.; Basciu, M.; Tosciri, G.; Fiori, I.; Pipia,
A.P.; Lightowlers, M.W.; Garippa, G.; Scala, A................................................................507
SEROPREVALENCIA DE DICROCELIOSIS EN BOVINOS DE RAZA RUBIA
GALLEGA..
Suárez, J.L.; Arias, M.; Díaz, P.; Lomba, C.; Painceira, A.; Pedreira, J.; Sánchez-Andrade,
R.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P.; Paz-Silva, A............................................................512
BIOLOGICAL AND NUTRITIONAL STRATEGIES FOR THE CONTROL OF
TRINCHOSTRONGYLE INFECTIONS IN GRAZING GOATS.
Gómez-Rincón, C.; Valderrábano, J.; Uriarte, J.................................................................516
PREVALENCIA DE LA FASCIOLOSIS OVINA Y ESTUDIOS DE RESISTENCIAS A
FASCIOLICIDAS EN LA PROVINCIA DE LEÓN.
PREVALENCE OF SHEEP FASCIOLOSIS AND ANTHELMINTIC RESISTANCE STUDY
IN LEON PROVINCE.
Vara-Del Río, M.P.; Martínez-Valladares, M.; Martínez-Delgado, A.; Rojo-Vázquez, F.A.
............................................................................................................................................523
FACTORES QUE INFLUYEN EN EL DESARROLLO DE LAS LARVAS DE
Hypoderma lineatum DURANTE SU PERMANENCIA EN EL ESÓFAGO DE BOVINOS
EN GALICIA.
FACTORS INFLUENCING THE DEVELOPMENT OF Hypoderma lineatum LARVAE
DURING THEIR PERMANENCE IN THE OESOPHAGUS OF GALICIAN CATTLE.
Vázquez, L.; Panadero, R.; López, C., Dacal, V; Díaz, P.; Pedreira, J.; Morrondo, P.; DíezBaños, P. ............................................................................................................................530
EXTRACTOS VEGETALES COMO ALTERNATIVA AL USO DE MONENSINA EN
LA NUTRICIÓN DE TERNEROS DE CEBO: EXTRACTOS VEGETALES.
VEGETABLE EXTRACTS AS MONENSIN ALTERNATIVE IN FEEDLOT CATTLE
NUTRITION: VEGETABLE EXTRACTS
Vázquez, P.; Pereira, V.; Castillo, C.; Hernández, J.; López Alonso, M.; Benedito, J.L. ..537
XXVII
FOLLICLE NUMBER AFFECTS IN VITRO DEVELOPMENTAL COMPETENCE OF
SHEEP OOCYTES.
Mossa F., Berlinguer F., Succu S., Madeddu M., Bebbere D., Leoni Gg., Naitana S. ......545
ETIOLOGÍA Y SENSIBILIDAD ANTIBIOTICA DE LA MAMITIS DE VERANO EN EL
OCCIDENTE DE ASTURIAS.
AETIOLOGY AND ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF SUMMER MASTITIS IN WEST
ASTURIAS.
Suárez De La Fuente, J.; García Paloma, J. A.; Suárez Sánchez, F, Lombardía Alvarez, V.;
Martinez Lopez, M. A.; Nieto Pardal, F. .............................................................................550
XXVIII
POSTERS DE PRODUCCIÓN / PRODUCTION POSTERS
INDAGINE SUL BENESSERE DEGLI OVINI DA LATTE IN PUGLIA: PRIMI
RISULTATI OTTENUTI ATTRAVERSO L’UTILIZZO DI DIFFERENTI INDICATORI
FUNZIONALI.
SURVEY INTO THE WELFARE OF DAIRY-SHEEP IN APULIA: PRELIMINARY
RESULTS FROM DIFFERENT FUNCTIONAL INDICATORS.
Rubino, G.; Alloggio, I.; Bramante, G.; Petazzi, F. ...........................................................555
INFLUENCIA DEL COLESTEROL EN EL DESARROLLO DE LOS EMBRIONES
BOVINOS CULTIVADOS in vitro.
Barrio, M.; Becerra, J.J.; Peña, A.I.; Quintela, L.A.; Deiros, J.; Rey, C.; Ruibal, S.Y.;
Herradón, P.G. ...................................................................................................................560
EFECTO DEL MOMENTO DE LA INCORPORACIÓN DE LA GLUCOSA AL MEDIO
DE CULTIVO SOBRE EL DESARROLLO DE LOS EMBRIONES BOVINOS
CULTIVADOS in vitro.
Barrio, M.; Peña, A.I.; Quintela, L.A.; Becerra, J.J.; Deiros, J.; Rey, C.; Ruibal, S.Y.;
Herradón, P.G. ...................................................................................................................566
INFLUENZA DI FATTORI CLIMATICI SULLE PRODUZIONI E SUI PARAMETRI
EMATOCHIMICI NELLA PECORA DI RAZZA SARDA.
INFLUENCE OF CLIMATIC FACTORS ON PRODUCTION AND HEMATOCHEMICAL
PARAMETERS IN SARDA BREED SHEEP.
Bini, P.P.; Sanna, M.; Lunesu, R.; Sanna, G.A.; Sanna, E.; Vacca, G..M.; Carcangiu, V.
............................................................................................................................................574
MANAGEMENT SYSTEMS AND MEAT QUALITY CHARACTERISTICS OF THE
MAREMMANA CATTLE BREED IN TUSCANY.
Bonanzinga, M.; Bozzi, R.; Giorgetti, A.; Sbarra, F.; Filippini, F. ....................................583
EVOLUCIÓN DE LA ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA EN LA
PROVINCIA DE LUGO (2000-2005).
EVOLUTION OF BSE IN LUGO PROVINCE (2000-2005).
Cantalapiedra, J.; Molinero J.; Darriba C.; Balado J.; Ocampo A.; Toubes J. ...................591
EFFETTO DELLA RESTRIZIONE IDRICA SULLE PRESTAZIONI PRODUTTIVE E
SU ALCUNI PARAMETRI EMATICI IN PECORE COMISANE ALLEVATE
INTENSIVAMENTE.
EFFECT OF WATER RESTRICTION ON PRODUCTIVE PERFORMANCES AND SOME
HAEMATIC PARAMETERS IN COMISANA SHEEP REARED UNDER INTENSIVE
CONDITIONS.
Casamassima, D.; Pizzo, R.; Palazzo, M.; Quaranta, A.; D’alessandro, A.G.;
Martemucci, G....................................................................................................................596
XXIX
EFECTO DE LA ÉPOCA DE NACIMIENTO EN EL CRECIMIENTO DE TERNEROS
RUBIA GALLEGA X NELORE CRIADOS EN BRASIL.
EFFECT OF BIRTH DATE ON GROWTH OF RUBIA GALLEGA X NELORE CALVES IN
BRAZIL.
Iglesias, A.; Ferreiro, J.M.; Cantalapiedra, J.; Ramella, J. L.; Sánchez, L. ........................608
APLICACIÓN DEL MUESTREO DE GIBBS EN LA ESTIMACIÓN DE
COMPONENTES DE VARIANZA Y PARÁMETROS GENÉTICOS PARA RASGOS DE
CRECIMIENTO EN LA RAZA RUBIA GALLEGA.
IMPLEMENTATION OF THE GIBBS SAMPLING FOR VARIANCE COMPONENTS AND
GENETIC PARAMETER ESTIMATION ON GROWTH TRAITS FOR RUBIA GALLEGA
CATTLE.
Gandoy, J.; Sánchez, L.; Iglesias, A...................................................................................612
CALIDAD DE LA CARNE DE AÑOJO Y DE TERNERA DE RAZA TUDANCA
ACOGIBLE A LA I.G.P. “CARNE DE CANTABRIA”.
Martínez Penagos, A.; Sanchez, L.; Monserrat, L.; Calderon, L.; Cimadevilla, C.; Humada,
M.J.; San Miguel, B.; Fernández Celis, E. .........................................................................616
CALIDAD NUTRICIONAL DEL LOMO DE LOS TERNEROS FINALIZADOS EN
PASTOREO Y CEBADERO.
NUTRITIVE QUALITY OF LOIN FROM CALVES FINISHED ON PATURE AND
FINISHED ON CONCENTRATE.
Bispo, E.; Monserrat, L.; Franco, D.; Pérez, N.; Moreno, T. .............................................623
EFFETTO DELLO STATO DI GESTAZIONE SULL’ANDAMENTO DI PARAMETRI
EMATOCHIMICI NELLA PECORA DA LATTE.
PREGNANCY STATUS EFFECT ON BLOOD PARAMETERS TREND IN DAIRY SHEEP.
Morgante, M.; Vazzana, I.; Gianesella, M.; Ferrantelli, V.; Cannizzo, C.; Stelletta, C. ...631
THE QUALITY OF OVINE OOCYTES IS RELATED TO THE KINETIC OF
MATURATION.
Berlinguer, F.; Succu, S.; Mossa, F.; Madeddu, M.; Bebbere, D.; Satta, V.; Leoni, G.G.;
Naitana, S. ..........................................................................................................................640
EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE CASEINICA DEL LATTE BUFALINO
CONGELATO.
THE EVOLUTION OF CASEIN FRACTION IN FROZEN BUFFALO MILK.
Alviti, G.; Loizzo, P.; Trani, A.; Pieragostini, E. ...............................................................645
XXX
APLICACIÓN DE UN IMPLANTE AURICULAR DE PROGESTERONA PARA EL
TRATAMIENTO DEL SÍNDROME DE REPETICIÓN DE CELOS EN LA VACA.
USE OF EAR PROGESTERONE IMPLANTS FOR TREATING REPEAT BREEDING
SYNDROME IN COWS.
Díaz, C.; Quintela, L.A.; Becerra, J.J.; Peña, A.I.; Rey, C., Barrio, M.; Ruibal, S.; Herradón,
P.G. ....................................................................................................................................649
EVALUACIÓN DEL POSTPARTO EN LA RAZA RUBIA GALLEGA.
Rey C.; Quintela L.A.; Peña A.I.; Becerra J.J.; Deiros J.; Barrio M.; Herradón P.G.........653
QUALIFICAZIONE DELL’AGNELLO ZERASCO: 1. PERFORMANCE IN VITA E
QUALITÀ DELLA CARCASSA.
QUALIFICATION OF ZERASCO LAMBS: 1. LIVE PERFORMANCE AND
CARCASS QUALITY.
Russo, C.; Preziuso, G.; D’agata, M.; Verità, P. ................................................................659
QUALIFICAZIONE DELL’AGNELLO ZERASCO: 2. QUALITÀ DELLA CARNE.
QUALIFICATION OF ZERASCO LAMBS: 2. MEAT QUALITY.
D’Agata, M.; Russo, C.; Serra, A.; Mele, M.; Preziuso, G.;Verità, P. ...............................663
CARATTERISTICHE MORFOMETRICHE DEL GLOBULO DI GRASSO DEL LATTE
OVINO (nota I): INFLUENZA DEL TIPO GENETICO E DELLA FASE DI
LATTAZIONE.
INFLUENCE OF GENETIC TYPE AND PHASE OF LACTATION. MORPHOMETRIC
CHARACTESISTICS OF SHEEP MILK FAT GLOBULES (part I):
Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Bianchi, L.; Pauselli, M.; Rossetti, E.; Verita, P......667
CARATTERISTICHE MORFOMETRICHE DEL GLOBULO DI GRASSO DEL LATTE
OVINO (nota II): RELAZIONI CON I PARAMETRI QUANTI-QUALITATIVI DELLA
PRODUZIONE.
MORPHOMETRIC CHARACTESISTICS OF SHEEP’S MILK FAT GLOBULES (part II):
RELATIONSHIP WITH SOME QUANTITATIVE AND QUALITATIVE PARAMETERS OF
MILK PRODUCTION.
Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Bianchi, L.; Pauselli, M.; Rossetti, E.; Verita, P......672
COMPOSIZIONE CHIMICA DEL TESSUTO MUSCOLARE DEL CAPRETTO SARDO
DA LATTE CHEMICAL COMPOSITION OF SARDINIAN SUKLING KID MUSCLE.
Vacca G.M.; Dettori M.L.; Daga C.; Carcangiu V.; Pazzola M.; Tilloca G. .....................678
XXXI
IL BENESSERE ANIMALE NELL’ALLEVAMENTO INTENSIVO DEL BOVINO DA
CARNE: CORRELAZIONE TRA SPAZIO LIBERO DISPONIBILE E PARAMETRI
PRODUTTIVI.
ANIMAL WELFARE IN INTENSIVE BEEF-CALF FARMING: THE RELATIONSHIP
BETWEEN
UNOBSTRUCTED
SPACE-ALLOWANCE
AND
PRODUCTION
PARAMETERS.
Pazzola, M.; Vacca, G.M.; Carcangiu, V.; Pintore, M.D.; Ouled Ahmed Ben Ali, H.; Bini,
P.P. .....................................................................................................................................685
XXXII
FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE
RUMIANTES: VEINTE AÑOS DE BUIATRÍA
GARCÍA PARTIDA, P.
Con la colaboración del Dr. LUIS RUIZ ABAD
Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. 28080 Madrid (España).
La creación de una federación transnacional cual es la de nuestra cuenca del Mediterráneo,
conllevo la necesidad de la misma, expuesta en foros internacionales por los diversos
especialistas que al acudir a los mismos, nos planteamos la necesidad de desarrollar una
organización que pudiera no solo agrupar a científicos de países de un mismo área
geográfica, sino que sirviera para solucionar problemas inherentes a estos países.
FEMESPRUM se origina en los Congresos mundiales de la Asociación Mundial de
Buiatria, creada esta Asociación por Rossemberg en Hannover, nos incorporamos a este
movimiento buiatras del mundo entero, si bien y desde su génesis pudimos evidenciar que
los problemas presentados por los países de la Europa verde no siempre iban a coincidir con
los nuestros, de ahí que iniciáramos contactos y reuniones de los delegados de nuestra área
para tratar de influir en los comités y seminarios de los periódicos congresos, estos hechos
se evidenciaron ya con rigor en el Congreso de Tel-Avit, cuyo presidente el Profesor
MAYER, hizo explicita referencia a la necesidad de que la Buiatria Mundial se ocupara no
solo de las enfermedades de los bovinos sino de llos problemas del resto de los rumiantes,
dado que en el Mediterraneo no es posible diferenciar su común problemática.
Es en Durban donde va a crearse el clima adecuado para que nuestras propuestas vayan
tomando sentido, ya que es aquí donde se elige Presidente de la A.M. de Buiatria al
Profesor ESPINASS de Francia, continuando de vocal por nuestro área el Prf. MAYER,de
Israel en este Congreso España obtuvo el mandato para la organización del Mundial de
Buiatria, a celebrar en Palma de Mallorca, aceptando las condiciones que nuestra aún
inexistente Federación propuso a la Asamblea General,
•
•
•
•
•
El titulo del Congreso seria Mundial de Buiatría (hasta Dublín se nomino de
“Enfermedades de los Bovinos”
Desde este Congreso se aceptaría por el Comité organizador Comunicaciones
científicas del resto de los rumiantes
Hasta un 20 % de los trabajos presentados podrían versar sobre Producción de
rumiantes
El Congreso de Palma de Mallorca debería de configurar en el
Mismo al máximo de científicos de los países del Mediterráneo
En DUBLIN y de acuerdo con la dirección de la Mundial de Buiatria programamos una
Reunión de los asistentes de nuestro área, demandando de los mismos su integración en los
trabajos del Congreso de Palma de Mallorca, y estableciendo las bases para crear si así se
estimara en su momento una Federación de países del Mediterráneo en este próximo evento
científico.
El Congreso de Palma de Mallorca (POR PRIMERA VEZ mundial de Buiatria, XV
Congreso) se anuncia en su documentación la convocatoria de una asamblea de los países
1
del Mediterráneo con el fin de plasmar la creación de nuestra Federación, esta nace bajo los
auspicios de la Mundial de Buiatria, ya que fue presidida por el Presidente de la Mundial de
Buiatria Prf. ESPINAS, actuando como secretario de la misma el de la propia Mundial Pr.
Mateus STOBER. El Comité científico de este Congreso aporto una considerable
contribución económica para el posterior desarrollo de esta iniciativa, se constituyo un
comité de notables entre los que se encontraban ESPINASSE por Francia J. GENTILE por
Italia que presidirá este comité, JAZBEZ por la antigua Yugoslavia, VAZ PORTUGAL,
por Portugal MAYER por Israel, GARCIA PARTIDA por España, actuando como
secretario el Prf TRENTI de Italia. La Asociación Italiana de Buiatria fue encargada del
desarrollo y tramitación de la nueva Federación, para lo cual no solo aporto su apoyo
logístico imprescindible sino que desembolso una importante cifra económica.
Giusepe GENTILE, a la sazón Presidente de la Facultad de Medicina Veterinaria de
Bolonia, organizo meses antes , dentro de los actos de celebración del noveno centenario de
la Universidad de Bolonia una “Conferencia Internacional” sobre “Sanidad y producción
bovina en el área del Mediterráneo”, ala cual acude el Presidente de la Mundial de Buiatria,
Prf. Espinasse.y los miembros de su directiva, E. Mayer y Dirksen, así como representantes
de F.A.O., O.M.S., O.I.E., y representantes de diversos servicios de países mediterráneos
como Malta Egipto, España, Sudan, Etiopía, Grecia, Chipre, y los miembros del Comité
constituido en Palma de Mallorca.
Un año después, 12-14 de mayo de 1989, y bajo los auspicios de la Sociedad Italiana de
Buiatria, en su XXI congreso, se reunió este comité en Gardone Rivera, aprobándose tras
su discusión los estatutos elaborados por Trenti y Soldati , tomando desde este momento
carta de naturaleza la FEDERACIÓN MEDITERRANEA DE SANIDAD Y
PRODUCCIÓN DE RUMIANTES. La cronología de estos eventos científicos hasta el que
hoy iniciamos en la Universidad de Santiago de Compostela es la Siguiente:
ALGHERO 1991
SALAMANCA 1992
TERAMO 1993
MURCIA 1996
BOLONIA 1997
POSTONIA 1998
SANTAREM 1999
SICILIA 2000
LEON 2001
OLBIA (Sassari) 2002
TUNEZ 2003
ESTAMBUL 2004
BARI 2005
SANTIAGO / LUGO 2006
Nuestros estatutos disponen que los Congresos serán organizados anualmente por una
Universidad, y no por un país concreto, contando en todo momento con la aportación de su
Asociación nacional de Buiatria.
2
Las aportaciones científicas tendrán que ser publicadas “in extenso” en los seis mese
posteriores a la celebración del congreso respectivo., se admitirán para su publicación en el
idioma del autor o autores, si bien deberá de aportar un resumen en Español, Francés o
Italiano.
Debemos hacer referencia al tiempo transcurrido entre Teramo y Murcia, recordando que en
ese tiempo se celebro el Congreso Mundial de Buiatria, en Bolonia, siendo Gentile y Trenti
sus organizadores, por lo cual este Congreso tuvo una parte satélite dedicado
específicamente a nuestra Federación.
La Universidad de Salamanca, fue la organizadora de la FERIA UNIVERSAL
GANADERA, dentro de la celebración del quinto centenario de la llegada de Colon a
América, se organizo un Congreso que fue presidido por Gentile y García Partida al haber
sido invitada la “Latino Americana de Buiatria” se incorporo a la organización su entonces
presidente el Dr. Ugarte, a la sazón vicepresidente de la Mundial de Buiatria.
Quiero especialmente destacar que la REAL ACADEMIA DE CIENCIAS
VETERINARIAS, celebro una sesión solemne en el paraninfo de la Universidad salmantina
para recibir como miembro de la misma al uruguayo Raúl Casas Olascoaga, quien presidirá
años más tarde el Congreso Mundial de Buiatria en Montevideo, el acto fue presidido por
el Prf. Illera actuando como padrino del recipendiario el Prf. García Partida.
Hemos de destacar que el celebrado en Postonia, en la recién creada Republica de
Eslovenia, tuvo una singular trascendencia , ya que fue el primer evento internacional que
organizo este joven país, el entonces Presidente de la Asociación Mundial de Veterinaria el
griego Apostolos Rantsios ,desarrollo la conferencia inaugural
disertando sobre “Algunas observaciones sobre la profesión veterinaria contemporánea”
Es en Postonia donde se celebra el X Congreso, por lo cual el Comité organizador hizo
entrega de placas acreditativas a los miembros de honor de esta Federación
El X Congreso se celebro en Túnez, como satélite del XXVII Congreso mundial de
Veterinaria. Los estatutos indican claramente que los congresos no serán adjudicados a
países concretos, sino a universidades de esos países, si bien en este caso el comité directivo
propuso esta variación a la asamblea, dado que por primera vez el FEMESPRUM
celebraría en la costa africana del Mediterráneo su congreso.
Al Presidente Gentile, le sucede el binomio Prieto Gutierrez Panizo, quienes y tras la
oportuna votación entregan en León al Profesor Pugliese la Presidencia, siendo reelegido
este por un segundo mandato cuatrianual en Estambul.
La aportación científica ha sido de 1194 artículos, y 114 ponencias. Distribuidos en la
siguiente forma, tomando a Alghero como valor base 100, la evolución se ve reflejada en la
siguiente gráfica.
La presentación de artículos referentes a Patología representa el 68,5 %, frente al 31,5 %
aportaciones vinculadas con la Producción animal.
El siguiente gráfico nos muestra el % de las diferentes especies, siendo los bovinos claro
esta la que nos muestra una mayor presencia, si bien al integrar a los pequeños rumiantes
ovejas y cabras observamos como alcanzan un numero similar de aportaciones que la de los
bovinos.es indudable que esto en parte se ha debido al efecto compensador de la P.A.C., ya
que el censo de estas especies se ha elevado notablemente gracias a la politica de
subvenciones de la U.E., si bien por el contrario en algúnos países la implantación de
cuotas lacteas ha venido a debilitar la presencia de explotaciones bovinas.
3
Nos hacemos eco de que los búfalos alcanzan un 4,1 % de nuestros contenidos, así como
hemos visto que las aportaciones sobre los “camélidos son testimoniales. No así lo
concerniente a rumiantes salvajes, su evolución e importancia insto a que en la Asamblea de
Bari, se determinara la conveniencia de que este Congreso de Santiago tuviera como tema
principal el de RUMIANTES SALVAJES.
EL FEMESPRUM lo constituyen 21 países con derecho a ser miembros natos, incluyendo
los no ribereños como Rumania Portugal y Siria.
Mantenemos relación con los sigioentes organismos y entidades:
OMS, FAO, UNESCO. Oficina Internacional de Epizootias, Consejo de Europa, Unión
Europea, Asociación Mundial de Veterinaria, Asociación Mundial de Buiatria, Sociedades
nacionales de Buiatria de la cuenca Mediterranea.
Asociación Latinoamericana de Buiatria, Asociación Centroeuropea de Buiatria.
Excelentísimo Sr. Presidente de FEMESPRUM, Profesore PUGLIESE (mio caro amichi
Antonio, esta es la síntesis los primeros veinte años de vida de nuestra Federación, si en
Slovenia alcanzamos la pubertad creo sinceramente que en Santiago y Lugo llegamos a
nuestra mayoría de edad,
Rector Magnifico de esta Universidad de Santiago, os confieso que cuando se me encargo
esta ponencia inagural, y pese a mi larga trayectoria Universitaria me sobrevino el lógico
nerviosismo de ocupar este histórico estrado de Fonseca, pero a la vez me senti
reconfortado al pensar que como unico representante de aquel comité de siete miembros
nuestra labor conjunta se iba a ver recompensada por estos tan gratos y emotivos momentos,
por todo ello y en recuerdo de los Profesores ESPINASSE, GENTILE, MAYER y VAZ
PORTUGAL, demando de vuestra autoridad permiso para rendirlos nuestro comun
homenaje postumo guardando un minuto de silencio
Para finalizar deseo como único de los siete integrantes del comité constitutivo hacer alguna
reflexión para el futuro.
Como habéis podido comprobar era una necesidad diferenciarnos de los países con un
elevado índice publio métrico, y ocuparnos de los pequeños rumiante y otras especies, así
como incorporar la producción animal, no obstante considero necesario que la
programación venidera se haga eco de la necesidad de que Femesprum se abra a otros
países ribereños, es la forma más convincente de favorecer el desarrollo buiatrico en estos
países, facilitar intercambios culturales y promover desde las propias Universidades con
Facultades de Veterinaria el estudio de los rumiantes, como principal elemento
transformador en alimentos , carne leche, mantequilla, cueros lana, el escaso manto vegetal
de nuestro campo, estableciendo a la vez un magnifico elemento conservador de nuestro
entorno natural, ya que son estos rumiantes ribereños, principalmente los pequeños
rumiantes y rumiantes salvajes, los que van ha tener un efecto corrector en el consumo de
subproductos y facilitaran la eliminación de restos vegetales, secos, tan peligrosos en el
estiaje.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN, HE DICHO
4
APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA DEL ADN EN LOS
PROGRAMAS DE MEJORA GENÉTICA DE LOS RUMIANTES.
LÓPEZ VIANA, J.
Jefe de área de Producción e Innovación Tecnológica. Xenética Fontao, S.A.
El gran desarrollo alcanzado por la Genética Molecular en las últimas décadas ha generado
numerosas aplicaciones en el campo de la Veterinaria. Los llamados "Proyecto genoma" de
las diferentes especies animales, son proyectos de investigación cuyo propósito es conocer
la secuencia de todo el ADN de la especie en cuestión. A diferencia de lo que ha ocurrido
en genética vegetal y en genética humana, en sanidad y producción animal la inversión
dedicada al desarrollo genómico ha sido mucho más reducida, sin embargo, las iniciativas
llevadas a cabo para secuenciar el genoma humano han servido de catalizador para cambiar
en los últimos 10 años el interés de los grupos de genética animal en la genómica, ésta es
una subdisciplina de la genética que tiene por objetivo la caracterización molecular de los
genomas completos.
Xenética Fontao, S.A. es una empresa especializada en la mejora genética, que se encarga
de la gestión del Centro de Selección y Reproducción Animal de Galicia. En el año 1999
creó el Laboratorio de Genética Molecular, como una nueva unidad para la prestación de
servicios mediante el empleo de la biotecnología del ADN en los campos de la Sanidad y la
Producción Agropecuaria. Esta unidad en el año 2001 quedó registrada como miembro
institucional de la I.S.A.G. (International Society for Animal Genetics) con el código
laboratorial E/X. La ISAG es el organismo encargado a nivel internacional para coordinar a
los distintos laboratorios y estandarizar protocolos, nomenclaturas y selección de paneles de
marcadores moleculares, que permitan que los resultados obtenidos por los distintos
investigadores sean objetivos y comparables. Esta Sociedad apoya de forma eficiente el
intercambio de trabajos de investigación, resultados y sus aplicaciones, mediante la
organización de conferencias, workshops, organizando test de comparación, publicación de
la revista Animal Genetics (diario oficial de la ISAG), y otras numerosas actividades.
Varios hechos ocurridos en las últimas décadas se pueden considerar como los responsables
del gran desarrollo actual de la genómica. En base a su aparición desde el punto de vista
cronológico cabría destacar los siguientes: el descubrimiento de las endonucleasas o
enzimas de restricción, el desarrollo de los métodos de secuenciación automática y los
descubrimientos de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain
Reaction) y los marcadores genéticos moleculares.
Con la aparición de las técnicas modernas de la biología molecular, surgieron diversos
métodos de detección de polimorfismo genético directamente a nivel del DNA. Los
marcadores moleculares son fragmentos de ADN que sirven de referencia para seguir la
transmisión genética de una generación a otra. En un sentido restringido, un marcador
genético es una entidad genética que manifiesta polimorfismo y se hereda de forma
mendeliana. El interés por detectar la variación molecular para diversas aplicaciones
prácticas ha conducido a un enorme incremento en el tipo y número de marcadores
disponibles para análisis genético.
Existen numerosas aplicaciones resultantes del estudio de los diferentes marcadores
genéticos moleculares en los programas de mejora genética animal, por su utilidad práctica
se podrían destacar las siguientes:
5
- Identificación genética: desde un estado muy temprano del desarrollo los individuos
poseen un genoma estable, este hecho permite hablar de lo que frecuentemente se ha
denominado la “huella genética” que, como la huella dactilar de un individuo, es única y
fácilmente evidenciable mediante técnicas moleculares, y permite la identificación del
individuo en todo momento y circunstancia. Los marcadores genéticos que se analizan hoy
en día para la realización de este tipo de pruebas, son los microsatélites o STRs (Short
Tandem Repeats). Estos marcadores son particularmente apropiados para este tipo de
pruebas por sus propiedades: son muy abundantes y están dispersos en todo el genoma, su
modelo de herencia es mendeliano en codominancia, son altamente polimórficos o con
elevado número de alelos y su análisis es de gran reproducibilidad experimental, con fácil
identificación mediante PCR, y muy apropiados para analizar mediante reacciones
múltiplex en los nuevos analizadores genéticos automáticos.
- La comparación del perfil genético obtenido del análisis de los microsatélites entre
individuos, proporciona numerosas aplicaciones prácticas, como son los análisis de
filiación, que permiten garantizar la fiabilidad y credibilidad de los libros genealógicos en
las distintas razas animales. Se trata de una prueba genética que se utiliza para comprobar el
pedigrí de un individuo. Confirmar la ascendencia de un animal garantiza el valor genético
del mismo, y por tanto su valor económico. La aplicación rutinaria de estos análisis en el
control de la reproducción, por inseminación artificial y/o transferencia de embriones,
permite evitar errores en ambos procesos y fraudes en el origen de semen o embriones; y
esto es importante debido al coste de los procesos involucrados, especialmente el del
material genético.
- El perfil genético que se obtiene al analizar diferentes muestras de un mismo individuo, se
puede aplicar al control de la trazabilidad o rastreabilidad de los productos. Así, por
ejemplo, en el caso de la industria de la carne o productos cárnicos, la utilización de los
marcadores de ADN permite asegurar una trazabilidad del 100%. La molécula de ADN,
además, tiene la ventaja de que es bastante estable a diferentes tratamientos (calor, salado,
ahumado, etc.), posibilitando así su estudio en cualquier punto de la cadena de producción.
- Diagnóstico de enfermedades genéticas: procesos provocados por alteraciones en los
genes, y que pueden ser a nivel de un gen, varios genes (poligenes) o incluso cromosomas
(trisomías, monosomías, etc.). La alteración genética puede producir por sí misma
directamente la enfermedad, o bien, determinar la resistencia o susceptibilidad a padecerla
(como ocurre por ejemplo en el Scrapie o Encefalopatía Espongiforme Transmisible ovina).
El interés del diagnóstico de las enfermedades genéticas se centra en la detección de los
animales portadores de estas anomalías hereditarias, sobre todo si se trata de animales
empleados como reproductores en los programas de mejora genética (productores de semen
para inseminación artificial, embriones para transferencia embrionaria u ovocitos para
fecundación in vitro), por la gran propagación que provocan de los mismos en la población,
ya que existen determinados sementales de los se comercializan cientos de miles de dosis
seminales.
- Diagnóstico de anomalías genéticas: todas las células diploides de un individuo presentan
la misma dotación cromosómica, sin embargo, ocasionalmente se puede producir un cambio
cromosómico después de la formación del zigoto, provocando que determinadas secciones
de tejidos contengan células con diferentes constituciones cromosómicas. Estos individuos
se conocen como mosaicos o quimeras. El síndrome Freemartin en bovino constituye el
6
ejemplo clásico de esta anomalía sexual en Medicina Veterinaria, y provoca infertilidad en
hembras nacidas gemelas de macho. El Freemartinismo no se puede prevenir, pero se puede
diagnosticar de forma precoz en el momento del nacimiento empleando la técnica de PCR.
- Identificación de variantes genéticas relacionadas con caracteres productivos o
morfológicos: como por ejemplo en las proteínas lácteas, donde numerosas investigaciones
realizadas a lo largo de los últimos treinta años, han demostrado que algunas de sus
variantes genéticas tienen efectos importantes sobre la composición de la leche, y sobre las
propiedades tecnológicas y el rendimiento para la fabricación quesera. Otras veces, estas
mutaciones originan cambios morfológicos, como ocurre en la raza vacuna Holstein, en la
que existen dos subpoblaciones en base a las variaciones en los genes responsables de la
coloración de la capa.
- Otras aplicaciones: existen otras muchas aplicaciones resultantes del estudio de los
marcadores genéticos moleculares, como son: la Identificación Racial, útil para evitar
actividades fraudulentas en la comercialización de ciertos productos nobles de determinadas
razas, empleando productos provenientes de animales de menor valor comercial; la
Identificación de Especies, de gran aplicación para evitar la sustitución parcial o total con
materias primas de menor calidad en productos elaborados, que no presentan características
físicas reconocibles; los estudios de Variabilidad Genética de las poblaciones, cuya
información puede ser empleada para conocer los límites existentes para la selección y la
mejora genética y, por lo tanto, para el control de las actuaciones en las diferentes razas
animales, y por último, la Selección Asistida por Marcadores, principal línea de
investigación actual de la genómica y que cada vez con más fuerza se está incorporando en
los programas de mejora genética, ya que contribuye a conseguir mayores ganancias
genéticas por unidad de tiempo, al ser posible la selección de los individuos sin necesidad
de su información fenotípica.
7
DISEASES RELATED TO COPPER, MOLYBDENUM AND SULPHUR
INTERACTIONS IN RUMINANTS
S.R. GOONERATNE
Cell Biology Group, Agriculture & Life Sciences Division
Lincoln University, Canterbury, New Zealand
KEY WORDS
Copper, molybdenum, sulphur, mineral interactions, polioencephalomalacia
ABSTRACT
Copper (Cu), molybdenum (Mo) and sulphur (S) are essential minerals for the functioning
of many biological processes in animals and humans and their interactions are widely
recognised as being important especially in ruminant nutrition. A small change in Mo or S
at concentrations encountered naturally in feed or herbage is capable of producing major
changes in absorption, distribution, or excretion of Cu, resulting in clinical syndromes of
either Cu deficiency or Cu toxicity in ruminants. Cattle given high S and low Cu in the feed
tend to have low blood thiamine (B1) concentration and succumb to polioencephalomalacia
(PEM).
INTRODUCTION
The importance of Cu, Mo, and S for proper functioning of many biological systems is well
documented (Underwood, 1977). Copper deficiency and Cu toxicity of grazing animals
occur in many parts of the world. The development of these two syndromes depends not
only on total Cu concentrations in the diet but also on other factors which influence the
absorption and availability of Cu. Of these, the concentrations of Mo and S in the diet are
most important. In addition, excess dietary iron (Fe) and zinc intakes can also
independently affect Cu absorption. Copper, Mo and S content of pasture and forage varies
with the species of plant, soil conditions and fertilizer used. The Cu content of ruminant
diets usually vary between 4 and 10 mg kg -1 dry matter (DM), Mo within the range of 0.1
to 5 mg kg -1 DM, and the total inorganic and amino acid S content between 1 and 3 g kg -1
DM. Ruminants are most susceptible to Cu deficiency and toxicity. A small change in
herbage Mo or S at concentrations encountered naturally in feedstuffs is capable of
producing a major change in absorption, distribution, or excretion of Cu in ruminants,
resulting in clinical syndromes of Cu deficiency, Cu toxicity or other associated syndromes
such as PEM. Copper toxicity is common in sheep, apparently because of their inability to
excrete excess Cu from the body (Gooneratne et al. 1985a). The pathogenesis of Cu toxicity
in sheep has been reviewed (Howell and Gooneratne, 1987). Although common in sheep,
Cu toxicity is rare in cattle. Cu deficiency is an important problem in both species although
cattle are more susceptible to Cu deficiency than sheep. Field studies have shown that
cattle fed high S and low Cu show low blood B1 levels and succumb to PEM. The emphasis
in this paper is on Cu, Mo, S and B1 interactions and the associated disease syndromes that
occur due to imbalances of these, namely, Cu deficiency, Cu toxicity and PEM.
8
COPPER DEFICIENCY
The first reports of naturally occurring problems in ruminants related to a lack of Cu that
responded to Cu therapy was “Salt-sick” of cattle in Florida (Neal et al, 1931) and
“Lecksucht” of sheep and cattle in Netherlands (Sjollema, 1933). Subsequently, an ataxic
disease of lambs due to Cu deficiency of ewes during pregnancy in Western Australia was
reported (Bennetts & Chapman, 1937). In most cases of Cu deficiencies in ruminants, a
range of clinical symptoms including scouring, growth depression, emaciation, anaemia,
achromotrichia, and excessive craving for salt have been reported (Underwood, 1977).
Genetic variation in Cu metabolism is seen in both sheep and cattle. Scottish Blackface
sheep are more prone to Cu deficiency (Wiener, 1987) because they absorb less Cu from the
intestines. Certain breeds of cattle like the Simmental are also sensitive to Cu deficiency
since they excrete more Cu in bile and urine (Gooneratne et al. 1994).
The biochemical basis for the clinical manifestations of Cu deficiency has been unravelled.
“Enzootic ataxia” in newborn and “swayback” in lambs occur due to a loss of cytochrome
oxidase enzyme activity, bone fragility and cardiovascular disorders due to a deficiency of
lysyl oxidase and therefore a lack of elastin - collagen cross linkages, anaemia due to a
derangement in mobilization and transport of Fe as a consequence of low ferroxidase
activity of the ceruloplasmin enzyme, coat colour changes in cattle and sheep and a loss of
crimp (“steely wool”) in sheep due to a lack of disulphide linkages in keratin, low
immuno-competence due to low superoxide dismutase enzyme activity, swelling of joints,
increased brittleness of bones, and loss of compact bone from the shaft of long bones due to
a deficiency of the enzyme lysyl oxidase, an important Cu-containing enzyme involved in
cross-linking of connective tissue, and loss of hair colour due to a deficiency of tyrosinase
enzyme.
COPPER TOXICITY
In many parts of the world, Cu toxicity is generally a rare occurrence now in grazing
animals. When it occurs, chronic Cu toxicity is usually seen only in small ruminants,
especially in sheep. However, cattle grazing areas rich in soil Cu, Cu accumulation can still
pose problems (Alonso, 2002). Among sheep, some breeds such as Texel are more prone to
Cu toxicity (Wiener, 1987). Sheep develop Cu poisoning on diets containing amounts of Cu
well tolerated by cattle. This is because in contrast to cattle, sheep have an inherent inability
to excrete excess Cu via bile (Gooneratne and Christensen, 1984). Diets containing 15 mg
kg -1 are dangerous especially if the Mo content is below 0.1 mg kg -1.
The clinical phase of Cu toxicity in sheep is characterised by the haemolytic crisis. At this
time, there is massive liver necrosis, the animal becomes dull and lethargic, pass soft faeces,
lose appetite, and the mucous membranes become jaundiced. It is now believed that the
massive liver damage and haemolysis are due to a sudden release of massive amounts of
Cu, Cu metallothionein, and acidic enzymes from the large lysosomes that rupture just prior
to haemolysis. Haemolysis and hypercupraemia overload the kidney tubular cells with
haemoglobin, Cu, and Fe and these lead to severe necrosis of renal tubules (Howell and
Gooneratne, 1987).
9
EFFECT OF Mo AND / OR S ON Cu METABOLISM
The principal site of the interaction between Cu, Mo, and S in ruminants is in the alimentary
tract. Sulphur compounds exacerbate molybdenosis and also appear to have an independent,
negative effect on Cu absorption. Suttle and Peter (1985) observed a negative correlation
between rumen sulphide and plasma Cu concentrations. There is also evidence that S and
Fe also have independent effects on liver Cu in calves, since removal of supplemental S
does not reduce the severity of Fe-induced Cu deficiency (Humphries et al. 1983). Excess
Mo can independently cause Mo toxicity in addition to Cu deficiency, especially in cattle. A
Cu:Mo ratio of 5:1 or less in forage is reported to cause molybdenosis. The typical
symptoms are severe scouring, and achromotrichia, and infertility. Excess Mo inhibits two
enzymes, sulphite oxidase and sulphide oxidase in the gut and liver. This affects conversion
of S2- to SO4 in the enterocytes. Excess S2- is now thought to be responsible for the
scouring. In addition, Mo forms a complex with S to form thiomolybdates (TM). Dick et al
(1975) and Suttle (1975) proposed that TM form spontaneously in the rumen. These
workers suggested that TM would react with Cu in the rumen to form an insoluble Cu-TM
complex and that most of this is not absorbed but eventually excreted in the faeces. The
role of rumen TM in the induction of Cu deficiency has since been confirmed by many
researchers and it has now been conclusively shown that TM when administered
intravenously (iv) over a prolonged period induces a full range of clinical signs (Gooneratne
et al. 1981a; 1981b) which are similar to those observed when excess dietary Mo and S are
given to sheep (Bremner and Young, 1978). It is established that tri (TM3) and
tetrathiomolybdates (TM4) are primarily responsible for the inhibitory effects on Cu
absorption from the gut. In ruminants, a relatively high dietary content of Mo ultimately
decreases liver Cu and provokes clinical signs of Cu deficiency. But frequently an increase
in plasma Cu levels is also observed. However, most of this Cu is not released into the
supernatant on precipitation of plasma proteins with 5% trichloroacetic acid (TCA).
Bremner (1976) has shown that the appearance of this TCA insoluble component was
contingent upon a simultaneous high intake of both Mo and S and did not appear if the
intake of either was low. Thus, it is not surprising that TM given either iv (Gooneratne et al.
1981b) or duodenally (Mason et al. 1980) produce a marked and an immediate increase in
plasma Cu most of which is TCA insoluble. It has been suggested that the presence of TCA
insoluble Cu in plasma reflects transformation of Cu to a more tightly bound (and thus
metabolically unavailable) form although in reality the significance of this fraction is still
not clear. Thiomolybdate compounds are absorbed from the rumen to bind reversibly to Cu
in albumin (Mason et al. 1982). The end result is a delay in transfer of Cu to extravascular
space and tissues including the liver. Thiomolybdates inhibit a wide range of Cu enzymes
in-vitro. The diamine oxidase activity of Cp is inhibited by all forms of TM in vitro,
particularly by TM4 (Kelleher and Mason, 1979).
When sheep are fed low to moderate Cu levels and given high dietary Mo and S (Allen and
Gawthorne, 1986), or TM4 iv (Gooneratne et al. 1981a), a rapid decline in the hepatic Cu
reserves occurs. Based on these findings Gooneratne et al (1981a) first suggested that iv
administration of TM4 might be of value in the control of Cu intoxication in sheep. In
contrast, if the sheep are maintained on a basal diet high in Cu and subjected to the same
high Mo and S exposure or TM4 (Gooneratne et al. 1981a), the Cu and Mo concentrations
10
in the liver increase markedly. In spite of this, the activities of SOD and cytochrome
oxidase in the liver are markedly reduced suggesting that much of the increased liver Cu is
not available for the normal liver metabolism (Allen and Gawthorne, 1986). Kidney Cu
accumulation occurs in sheep given either excess dietary Mo and S supplements (Marcilese
et al. 1969), or TM4 iv (Gooneratne et al. 1989a). The rate and degree of Cu accumulation
in the kidneys of sheep given TM appears to depend on several factors: a) Cu intake, b)
liver Cu concentration, and c) dosage of TM. The highest Cu (and also Mo) concentration
was found in the kidneys of sheep which received high oral Cu intakes and TM4 iv
(Gooneratne et al. 1981a; 1981b). Albumin may be one route whereby Cu and TM are
transferred to the kidney to accumulate therein, because degradation of modified albumin
molecules is slower. Changes in long bones of cattle and sheep fed excess Mo and S have
been reported (Underwood, 1977). Skeletal abnormalities can be induced in rats given TM4
at Mo levels of 6 to 20 mg Kg-1 DM in the diet (Mills et al. 1976). Abnormalities have been
reported in femur, tibia, fibula and cranium with changes in long bone growth being most
severe. Sheep given high doses of TM iv developed severe diarrhoea (Gooneratne et al
1981a), an indication of molybdenosis. Rats given TM4 for two weeks showed an increase
in mitochondrial abnormalities in the mucosal cells of the duodenum and jejunum, and
apoptosis and necrosis of the caecal and colonic mucosa (Fell et al. 1979). The cytochrome
oxidase activity of the intestinal epithelial cells was reduced indicating local interference in
the availability of Cu to these cells. Since S2- may be generated from TM, it is possible that
this S2- may have inhibited cytochrome oxidase directly.
Although bile is regarded as the major pathway of Cu excretion in all species, there are only
few reports on long term monitoring of Cu secretion via this route in ruminants (Symonds,
1982; Gooneratne et al. 1994). We have shown that iv TM lowers liver Cu levels in sheep
and increases excretion via faeces and urine (Gooneratne et al 1981a). But Cu excreted in
faeces may have originated from bile, endogenous secretion of saliva, gastric and intestinal
juices, or exogenous secretion of unabsorbed dietary Cu. Gooneratne and Christensen
(1984) and Gooneratne et al (1985) were the first to report that iv administration of TM4 to
sheep causes a dramatic increase in biliary Cu (and Mo) secretion. A subsequent study
carried out using radiolabel led 67Cu and 99Mo labelled TM4 (Gooneratne et al. 1989a;
1989b) showed that the increase in biliary Cu excretion originates mostly from the liver, but
a small proportion is probably transferred directly from plasma as a plasma Cu-TM
complex from the hepatic artery into the bile ductules in the vicinity of the portal triad as
suggested by Kressner et al (1984). The similar times of peak biliary Cu excretion patterns
when either 67Cu or 99Mo labelled TM4 is injected in sheep and the synchrony with which
both 67Cu and 99Mo are secreted into bile suggest similar pathways (transbiliary,
transhepatocellular and hepatolysosomal) of bile Cu excretion in either situation
(Gooneratne et al 1989a; 1989b). But during removal of Cu from long-term storage
compartment the transhepatocellular pathway appeared absent, while transbiliary and
hepatolysosomal pathways were still operative (Gooneratne et al. 1989b).
Tetrathiomolybdate predominantly enhances removal of Cu from the short-term liver Cu
storage compartment, but effects on the long-term storage compartments, albeit lower, are
still of significance. Based on these observations, the relative importance of the different
biliary Cu excretory pathways which become functional during long and short term liver Cu
11
depletion have been predicted (Gooneratne et al. 1989b). Sephadex G-75 gel filtration
studies have shown that the increased biliary Cu (and Mo) following TM4 administration is
mostly bound to a macromolecular form, and hence is not available to the animal
(Gooneratne et al. 1989e). Similar increases in biliary Cu associated with high dietary Mo
and S intakes by bovine have also been reported (Gooneratne et al. 1994). This study also
reported on genetic differences in biliary Cu excretion in cattle. Biliary Cu excretion in the
Simmental breed appears to be at least two-fold higher than in the Angus breed. This is
probably one of the reasons why Cu deficiency is observed more frequently in this breed.
TM4 administration increases faecal Cu (free of bile Cu) excretion indicating that this is
derived from either saliva or endogenous gastrointestinal secretions (Gooneratne et al.
1989a; 1989b). Increased urinary Cu excretion has been reported in sheep fed dietary
supplements of Mo and S (Marcilese et al. 1970). We have observed similar increases in
urinary Cu in sheep (Gooneratne et al. 1985) and cattle (Gooneratne et al. 1994) given
TM4.
EFFECT OF COPPER AND SULPHUR IN POLIOENCEPHALOMALACIA
Polioencephalomalacia is an acute disturbance in glucose metabolism in ruminants
characterized clinically by blindness, depression, and incoordination.
It is often
encountered in cattle after concentrate feeding. It can be caused by simple B1 deficiency, but
in most instances by thiaminase-produced analogues that can block pyruvate oxidation
(Loew and Dunlop, 1972). Sulphur is essential for ruminal microbial synthesis because it
contributes to microbial S- containing amino acids. Sulphur deficiency is not common in
ruminants but can occur when fed protein deficient diets. Critical S concentration is about
1g kg -1 DM. Addition of sulphate to the diet is also capable of inducing a B1 deficiency in
steers (Goetsch and Owens, 1986). Feedlot cattle fed S dioxide-treated high moisture barley
develop PEM. High S in the diet and/or water can induce a low ruminal pH. This can acidshock the ruminal bacteria to release bacterial cell surface bound thiaminase enzyme. Our
field studies have shown that cattle fed high S and low Cu show low blood B1 and succumb
to PEM (Gooneratne et al. 1989d). Animals that develop PEM in S toxicity, if not acutely ill
can recover and increase their blood B1 on Cu supplementation alone without B1
administration. Thus it appears that the mechanism underlying S-induced PEM involve a
three-way interaction between Cu, S and B1. When sheep with a lower B1 status are fed
excess dietary S, neurophysiologic abnormalities such as decreased conductivity and / or
excitability of nerve fibres along the auditory pathways [as measured by brain-stem
auditory evoke response (BAER) technique] can occur (Olkowski et al. 1989a). BAER
recordings correlate with the histopathological lesions in the brain stem of sheep. Sheep that
develop PEM on high-S diets also have a compromised immune function independent of Srelated Cu deficiency (Olkowski et al. 1989b). If Cu is low in a high S diet, then less Cu is
available for formation of Cu-S complexes such as CuS and TM, and hence more free S is
available to lower rumen pH and favour release of thiaminase I enzyme. But if the diet is
high in both Cu and S, it appears then that excess Cu probably chelates S and increases its
excretion in bile and urine. In such instance, occurrence of PEM is less likely.
12
REFERENCES:
Allen, J.D. and Gawthorne, J.M. 1986. Involvement of organic molybdenum compounds in
the interaction between copper, molybdenum, and sulphur. J. Inorg. Biochem. 27: 95-112.
Alonso, M.L., Benedito, J.L., Miranda, M., Castillo, C., Hernandez, J., Shore, R.F. 2002.
Interactions between toxic and essential trace metals in cattle from a region with low levels
of pollution. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 42:165-72.
Bennetts, H.W. and Chapman, F.E. 1937. Copper deficiency in sheep in Australia. Aust.
Vet. J. 13: 138 - 149.
Bremner, I. 1976. The effect of dietary molybdenum and sulphate on plasma copper
distribution in sheep. Proc. Nutr. Soc. 35: 21A
Bremner, I. and Young, B.W. 1978. Effects of dietary molybdenum and sulphur on the
distribution of copper in plasma and kidneys of sheep. Br. J. Nutr. 39: 325-335.
Dick, A.T., Dewey, D.W. and Gawthorne, J.M. 1975. Thiomolybdates and the
copper-molybdenum-sulphur interaction in ruminant nutrition. J. Agric. Sci. Camb. 85:
567-568.
Fell, B.F., Dinsdale, D. and El-Gallad, T.T. 1979. Gut pathology of rats dosed with
tetrathiomolybdate. J. Comp. Path. 89: 495-514.
Goetsh, A.L. and Owens, F.N. 1986. Thiamin passage to the duodenum in cattle fed
supplemental sulfur or thiamin. Fed. Proc. 45: 820.
Gooneratne, S.R. and Christensen, D.A. 1984. Increased copper excretion in bile after
thiomolybdate administration. Fed. Proc. 43:790.
Gooneratne, S.R., Howell, J.McC. and Gawthorne, J.M. 1981a. Intravenous administration
of thiomolybdate for the treatment and prevention of chronic copper poisoning in sheep.
Br. J. Nutr. 46: 457-468.
Gooneratne, S.R., Howell, J.McC. and Gawthorne, J.M. 1981b. An investigation of the
effects of intravenous administration of thiomolybdate on copper metabolism in chronic
Cu-poisoned sheep. Br. J. Nutr. 46: 469-480.
Gooneratne, S.R., Christensen, D.A., Chaplin, R.K. and Trent, A.M. 1985. Copper: Biliary
excretion in copper-supplemented and thiomolybdate-treated sheep. Pages 342-346 in C.F.
Mills, I. Bremner and J.K. Chesters, eds. In Proc. 5th Int. Symp. Trace Element
Metabolism in Man and Animals (TEMA5), Commonwealth Agriculture Bureaux, Farnham
Royal.
Gooneratne, S.R., Laarveld, B., Chaplin, R.K. and Christensen, D.A. 1989a. Profiles of
67
Cu in blood, bile, urine and faeces from 67Cu primed lambs: Effect of 99 Mo-labelled
tetrathiomolybdate on the metabolism of recently stored tissue 67Cu. Br. J. Nutr. 61: 355371.
Gooneratne, S.R., Laarveld, B., Chaplin, R.K. and Christensen, D.A. 1989b. Profiles of
67
Cu in blood, bile, urine and faeces from 67Cu primed lambs: Effect of 99Mo-labelled
tetrathiomolybdate on the metabolism of 67Cu after long-term storage. Br. J. Nutr. 61: 373385.
Gooneratne, S.R., Laarveld, B. and Christensen, D.A. 1989c. Effect of 67Cu and 99Mo
labelled tetrathiomolybdate on the distribution of 67Cu, Cu and copper 99Mo in bile fractions
in sheep. J. Inorg. Biochem. 35: 233-246.
13
Gooneratne, S.R., Olkowski, A.O. Klemmer, R.G., Kessler, G.A. and Christensen, D.A.
1989d. High sulfur related thiamine deficiency in cattle: A field study. Can. Vet. J. 30:
139-146.
Gooneratne, S.R., Symonds, H.W., Bailey, J.V. and Christensen, D.A. 1994. Effects of
dietary copper, molybdenum and sulfur on biliary copper and zinc excretion in Simmental
and Angus cattle. Can. J. Anim. Sci.
14
MECANISMOS DEL ESTRÉS EN EL TORO DE LIDIA.
ILLERA, J.C.; SILVÁN, G.; GIL-CABRERA, F.; ILLERA, M.J.
Dpto. Fisiología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.
28040 Madrid.
Una amplia gama de experiencias, distintas entre sí, provocan síntomas externos comunes.
“La expresión de las emociones en el hombre y los animales” (Darwin).
Fisiología del Estrés
El Dr. Hans Selye sentó las bases para el conocimiento y estudio posterior de los
cambios funcionales orgánicos de nuestro organismo que ocurren durante un estado de
estrés que experimente una persona (figura 1). Los sistemas orgánicos iniciales y
principales que se activan como respuesta al estrés son, a saber: (1) el sistema nervioso y
(2) el sistema endocrino. Ambos sistemas se conocen como el sistema neuro-endocrino.
Otros sistemas orgánicos se involucran y son eventualmente afectados durante las etapas del
estrés, tal como el sistema inmunológico, el sistema cardiovascular, el sistema
gastrointestinal (digestivo), entre otros. A continuación una descripción funcional de los
sistemas orgánicos que juegan un papel importante durante la respuesta física del cuerpo al
confrontarse con el estrés:
El Sistema Nervioso
El sistema nervioso del organismo humano se encuentra constituido por el sistema
nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP).
El sistema nervioso central (SNC) lo compone el encéfalo y la médula espinal y se
encuentra protegido por el cráneo y la columna vértebras, respectivamente. El encéfalo
consta de una estructura importante localizada en la región del diencéfalo, (base del
cerebro) conocida como el hipotálamo. Esta estructura posee un centro que controla las
emociones y ciertos impulsos básicos, a saber: el apetito, la sed, el sueño, la temperatura y
el metabolismo. En los inicios del estrés, el hipotálamo estimula a la pituitaria (hipófisis)
para que secrete diversas hormonas, incluyendo la hormona adrenocorticotrofa (ACTH). La
ACTH se transporta mediante la circulación y estimula a la corteza suprarrenal (localizada
sobre el riñón) para que libere cortisol. Inicialmente esta hormona aumenta la capacidad del
ser humano para afrontar efectivamente el estrés debido a que promueve la producción de
glucosa (para la generación de energía) y produce efectos antinflamatorios. Sin embargo,
eventualmente el cortisol provoca el degradamiento de proteínas y la disminución de las
reacciones inmunitarias, lo cual resultaría en una mayor propensión para la adquisición de
enfermedades (etapa final del estrés).
La médula espinal es aquella parte del SNC que se extiende a lo largo del agujero
vertebral de la columna espinal hasta la altura de la primera vértebra lumbar. Esta conectada
con el cerebro y el encéfalo. Se compone de materia gris (neuronas) y materia blanca. El
líquido encefaloraquídeo fluye entre el encéfalo y la médula. Su función básica consiste en
transportar información a través de los nervios que salen y entran al encéfalo.
El sistema nervioso periférico (SNP) esta compuesto del sistema nervioso somático
y el sistema nervioso autonómico (SNA) o vegetativo. Este último se ramifica en dos
secciones, a saber: el sistema nervioso simpático y el sistema nervioso parasimpático.
15
El sistema nervioso somático lleva información sensorial al SNC, y transmite las
órdenes motoras de éste hacia los órganos de los sentidos y músculos involuntarios. Regular
los intercambios con el ambiente externo.
Por otro lado, el sistema nervioso autónomo regula el equilibrio interno del cuerpo,
manteniendo los valores fisiológicos dentro de lo normal (homeostasia). Este sistema posee
dos grandes ramas, la simpática y parasimpática.
El sistema nervioso simpático prepara al cuerpo para la acción. Durante la etapa de
alerta del estrés, el sistema simpático se encarga de activar el organismo, vía el aumento de
la frecuencia respiratoria, la presión arterial, la frecuencia y volumen de las contracciones
cardíacas (las palpitaciones del corazón) la manufacturación de glucosa (azúcar) en el
hígado, la circulación en los músculos (lo cual agiliza el sistema esqueleto-muscular), la
liberación de epinefrina (adrenalina) de la médula renal, dilatación de las pupilas, la
disminución de la circulación en los órganos abdominales (estómago, intestinos), riñones y
piel y la reducción de la actividad digestiva. La actividad constante del sistema simpático
puede ser detrimental para los órganos del cuerpo, donde el resultado final sería un estado
de sobrecarga evidente en la fase de agotamiento que describe Selye.
Por el contrario, el sistema nervioso parasimpático controla la recuperación,
relajación y asimilación.
El Sistema Endocrino
Este es un sistema del cuerpo compuesto de órganos internos (glándulas endocrinas) que
secretan hormonas. Las hormonas son mensajeros (mediadores) químicos liberados dentro
de la sangre con el fin de ser transportados hacia células particulares (células meta) sobre
las cuales regulará su función metabólica. El sistema endocrino interacciona con el sistema
nervioso para coordinar e integrar la actividad de las células corporales. A lo largo del
transcurso de las fases del estrés, las glándulas y hormonas que participan con mayor
intensidad son la glándula pituitaria (hipófisis), la glándula suprarrenal y la glándula tiroide.
La hipófisis se encuentra conectada estructural y funcionalmente con el
hipotálamo. Posee dos (2) principales lóbulos, los cuales son, el lóbulo anterior
(adenohipófisis) y el lóbulo posterior (neurohipófisis).
La adenohipófisis ha sido tradicionalmente conocida como la "glándula endocrina
maestra" debido a sus numerosos productos hormonales, muchos de los cuales regulan la
actividad de otras glándulas endocrinas. Agentes estresores estimulan a la adenohipófisis
para que secrete cantidades aumentadas de ACTH. La producción de la hormona ACTH es
consecuencia directa de un factor hormonal liberado do por el hipotálamo como respuesta al
estresor. La ACTH actúa sobre la corteza suprarrenal para estimular la producción de
cortisol. El cortisol es el principal regulador de las respuestas adaptativas al estrés.
La neurohipófisis se localiza en la prolongación del hipotálamo y tiene una
relación directa con éste. Está formada por fibras nerviosas, células gliales y una red capilar.
Las neurosecreciones emitidas por el hipotálamo pasan por el sistema portahipofisario a la
neurohipófisis, donde son almacenadas en las protuberancias de las fibras nerviosas y luego
liberadas en los capilares, que las distribuyen en la circulación general. La neurohipófisis
segrega dos hormonas: la occitocina y la vasopresina u hormona antidiurética.
16
La glándula suprarrenal son órganos pares, con formas de pirámide, ubicadas sobre
la porción superior de cada riñón. Estas glándulas se componen estructural y
funcionalmente de dos (2) glándulas endocrinas, a saber: la corteza suprarrenal y la médula
suprarrenal.
La corteza adrenal produce una serie de hormonas que en colectividad se conocen
como glucocorticoides. La hormona destacada durante el estrés que pertenece al grupo de
los glucocorticoides es el cortisol. Los glucocorticoides tienen acción sobre el metabolismo
de la glucosa y son anti-inflamatorios. En un estrés prolongado, los glucocorticoides pueden
inducir a hiperglucemia (altos niveles de azúcar en la sangre) puesto que mantendrían una
producción constante de glucosa .
La médula adrenal secreta dos poderosas hormonas produce la médula adrenal, a
saber: epinefrina (o adrenalina) y la norepinefrina (o noradrenalina). La epinefrina prolonga
las respuestas que producen el sistema simpático.
La glándula tiroide juega una función importante durante el estrés de origen
psicosocial o físico estimula a la producción de tiroxina de la glándula tiroidea. Esta
hormona aumenta la tasa metabólica de los tejidos del cuerpo. Tales cambios afectan el
humor, la energía, la irritabilidad nerviosa y el nivel de alerta mental. El flujo sanguíneo
aumenta marcadamente, lo que ocasiona un aumento en la presión sanguínea.
El Síndrome de Adaptación General (SAG)
Como fue previamente señalado al principio de este capítulo, el Dr. Hans Selye
descubrió que los ratones sometidos bajo un estrés crónico (constante) manifestaban un
conjunto de signos y síntomas particulares. A esto él le llamó el Síndrome de Adaptación
General (figura 3) y, basado en las respuestas fisiológicas de estos animales, lo dividió en
tres fases muy particulares, conocidas como: alarma (o pelear e huir), resistencia
(adaptación) y desgaste (o fatiga, deterioro).
El síndrome de adaptación general representa un conjunto de respuestas
fisiológicas y psicológicas generales (no específicas) ante las demandas de un estrés
(positivo o negativo). Existen diferentes estímulos estresantes que quedan recogidos en el
siguiente esquema (esquema 1)
Es una tríada de procesos de adaptación sucesivos como respuesta a los estímulos
continuos (a largo plazo o crónico) del estrés.
Cuando hablamos de síndrome, no referimos a variedad o grupo de signos y
síntomas concurrentes de carácter físicos, mentales y de comportamiento indicativo de una
enfermedad.
La adaptación representa el síndrome de cambios hace posible que el cuerpo se
adapte para poder afrontar con efectividad el estrés. La funciones orgánicas del cuerpo
humano se modifican automáticamente, de manera que puedan ajustarse a los estresores
constantes que lo perturban en su medio ambiente sicosocial y físico.
Finalmente, el componente general es hace referencia a los estresantes generales
que inducen a un estado de estrés. El síndrome es producido únicamente por distintos
agentes estresores que inducen efectos generales (no específicos) a niveles de gran
magnitud en organismo.
17
La Fase de Alarma (Reacción de lucha o Fuga)
Es la respuesta fisiológica aguda inicial del organismo ante una amenaza. El
cuerpo reacciona al estresor y causa que el hipotálamo produzca un mediador bioquímico,
el cual a su vez provoca que la hipófisis secreta ACTH hacia la sangre. Esta hormona
estimula a la glándula adrenal a que libere epinefrina y otros corticoides. Como
consecuencia, se atrofia el timo (glándula constituyente del sistema glandular endocrino
ubicada detrás de la porción superior del esternón o hueso del pecho) y los ganglios
linfáticos. La actividad del sistema nervioso simpático aumenta. Esta etapa se caracteriza
por una baja resistencia ante los agentes productores de tensión.
La Fase de Resistencia (Adaptación)
El organismo trata de adaptarse al estrés continuo que lo afecta. Esta es una etapa
de reparación como resultado del deterioro ocurrido en la primera etapa. Esta etapa se
caracteriza por manifestaciones clínicas (físicas) y mentales.
La Fase de Fatiga o Desgaste (Deterioro)
Ante la incapacidad de afrontar la tensión (estresor) por más tiempo, ocurre un
desbalance homeostático (equilibrio interno) y fisiológico en el cuerpo, el organismo
colapsa y cede ante la enfermedad. Como resultado del estrés continuo, durante esta etapa
pueden surgir una variedad de enfermedades psicosomáticas, tales como hipertensión,
ataque al corazón, derrame cerebral, úlceras, trastornos gastrointestinales (e.g., colitis y
otras), asma, cáncer, migraña, alteraciones dermatológicas, entre otras condiciones.
18
PARANFISTOMOSIS BOVINA: ENFERMEDAD EMERGENTE EN EL ÁREA
MEDITERRÁNEA.
PAZ SILVA, A.
Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria de Lugo. Universidad de
Santiago de Compostela (España)
Definición e importancia
La organización mundial de la salud (OMS) define enfermedades emergentes como aquellas
“nuevas enfermedades producidas por agentes no identificados anteriormente, causantes de
problemas de salud pública”. En este caso nueva no quiere decir desconocida hasta la fecha,
sino que en los últimos años se ha mejorado el conocimiento de su extensión y gravedad.
Una definición más precisa podría ser la de “enfermedad de etiología infecciosa, por lo
general epizoótica, con carácter epidémico, e incidencia mayor en los últimos 20 años, que
afecta a diversas poblaciones de riesgo”.
La paramfistomosis es una trematodosis causada por parásitos de la familia
Paramphistomidae, que se caracterizan morfológicamente por la presencia de una ventosa
ventral o acetábulo en el extremo posterior, y su forma cónica. Tienen un ciclo biológico
similar a Fasciola hepatica, y de hecho comparten el hospedador intermediario,
principalmente caracoles del género Lymnaea y también coinciden en que el diagnóstico
que se hace de forma rutinaria consiste en la demostración de huevos en las heces de los
bóvidos infectados, empleando la técnica coprológica de sedimentación. A veces es un poco
difícil diferenciar los huevos de estos dos trematodos, lo que ha llevado a su diagnóstico
incorrecto.
Los paranfistomos afectan con mayor frecuencia a rumiantes jóvenes (terneros, cabritillos y
corderos), son causantes de alteraciones digestivas y hemáticas que a veces pueden llegar a
provocar la muerte de los animales. Existe evidencia de que estas alteraciones se deben
principalmente a los trematodos juveniles, mientras que se discute la patogenicidad de las
formas adultas.
Atendiendo a la definición de la OMS, se trata de una enfermedad emergente puesto que se
ha incrementado el conocimiento de su extensión: en los últimos años se ha diagnosticado
en diferentes países europeos como Italia, Francia o España, y americanos como México o
Argentina, donde además se ha comprobado que la prevalencia de paranfistomosis ha
aumentado en los últimos años, obteniéndose porcentajes que oscilan entre el 11% y el
40%. Es necesario destacar que en Francia, durante el periodo 1990-1999, la prevalencia de
paranfistomosis pasó del 5’2% al 44’7%, en tanto que la de fasciolosis no experimentó
variaciones.
La importancia de esta trematodosis queda reflejada por las cuantiosas pérdidas económicas
que se producen en industrias de lana, carne y leche.
En algunos estudios se ha postulado que una de las causas responsables del incremento de
vacas con paranfistomosis es la administración de tratamientos fasciolicidas eficaces,
mientras que no está muy extendida la utilización de productos de acción paranfistomicida.
19
Epidemiología y distribución
Se han descrito varias especies de trematodos Paramphistomidae, entre los que destacan los
géneros Paramphistomum (P. cervi, P. ichikawi, o P. microbothrium), Cotylophoron,
Gigantocotyle y Calicophoron. La especie más habitual en Europa es Calicophoron
daubneyi, que en España se ha descrito en el noroeste (Díaz et al., 2006).
La presencia de estos parásitos está asociada a ambientes húmedos, con abundante
vegetación, temperaturas moderadas, que constituyen el hábitat idóneo para el hospedador
intermediario. Como tal pueden actuar caracoles de los géneros Bulinus, Glyptanisus,
Indoplanorbis, Planorbis y Lymnaea, siendo estos últimos los más frecuentes en Europa y
América. La supervivencia de estos moluscos se ve favorecida en zonas con escasa
pendiente, que favorecen el encharcamiento de los terrenos.
En general, el riesgo de infección a lo largo del año está directamente relacionado con las
precipitaciones. En Europa predomina el clima atlántico, en el que las precipitaciones más
abundantes se registran en septiembre-noviembre. En España se ha comprobado que los
valores máximos de prevalencia en ganado vacuno se obtenían en el mes de septiembre
(Fig. 1), en tanto que en Francia fue entre enero y diciembre. Por el contrario, las cifras
máximas de eliminación se obtuvieron en junio y septiembre, respectivamente.
%
100
Epg
30
Prevalencia
90
Epg
25
80
70
20
60
50
15
40
10
30
20
5
10
0
0
E
F
M
A
My
J
Jl
Ag
S
O
N
D
mes
Fig. 1.- Prevalencia y cifras de eliminación de huevos de C. daubneyi
en ganado vacuno del NO de España.
Es posible encontrar caracoles infectados por miracidios de Fasciola hepatica y de
Calicophoron daubneyi. En algunos estudios se ha demostrado que los miracidios de
20
Calicophoron favorecen el desarrollo de los de Fasciola, lo que constituye un ejemplo del
fenómeno clásico de facilitación. También se ha comprobado que cuando las metacercarias
(fases infectivas de estos trematodos) abandonan las limneas, las de Fasciola lo hacen
agregadas, que favorece el mantenimiento de la humedad.
Como ya se ha citado enteriormente, los bóvidos se infectan mediante la ingestión de
metacercarias emitidas por los caracoles, que se desenquistan en el intestino; los
paranfistomos juveniles migran a través de la mucosa intestinal hasta alcanzar el rumen,
retículo e incluso abomaso, donde se transforman en parásitos adultos.
En el ganado vacuno pueden coexistir las dos especies de trematodos, las fasciolas en el
hígado y los paranfistomos adultos en el retículo y rumen.
No está clara la influencia de la edad en el grado de parasitación de los animales, pero se ha
comprobado que la prevalencia es significativamente superior en los vacunos de menos de 8
años. No se ha establecido relación entre la raza de los animales y la disponibilidad para
desarrollar la paranfistomosis.
Ciclo intraorgánico e inmunidad
Cuando los paranfistomos juveniles se encuentran en el intestino e inician la migración
hasta su localización definitiva, la presencia de espículas en su tegumento provoca la
aparición de pequeñas hemorragias responsables del descenso de los valores de los
parámetros de las series roja (eritrocitos, hematocrito) y blanca (leucocitos, linfocitos). Al
mismo tiempo se produce la liberación de productos de excreción/secreción con actividad
antigénica, que estimulan en el sistema inmunitario del ganado vacuno la producción de
anticuerpos.
Se ha demostrado que la infección por trematodos Paramphistomidae induce la aparición de
un grado de inmunidad casi completo frente a sucesivas reinfecciones; también se ha
comprobado que estas reinfecciones no se acompañan por un incremento en los valores de
anticuerpos, como sucede en el caso de fasciolosis.
Tratamiento y control
Según la Oficina Internacional de Epizootologías (OIE), en la prevención y control de las
enfermedades emergentes ha de basarse en dos aspectos: detección precoz y reacción rápida
(tratamiento) ante la enfermedad.
El diagnóstico rutinario de paranfistomosis se realiza mediante el análisis de muestras
fecales con la técnica de sedimentación, lo que supone algunos inconvenientes. En primer
lugar, la aparición de huevos del trematodo en las heces implica que los parásitos han
alcanzado el estado adulto (8-12 semanas post-infección), y la mayoría de las alteraciones
(a nivel intestinal) ya se han producido. En segundo lugar, como ya se apuntaba con
anterioridad la morfología de los huevos de paranfistómidos es similar a la de los de
Fasciola hepatica, salvo en la coloración, más amarillenta y oscura en estos últimos por la
presencia de pigmentos biliares. En nuestra opinión esto ha contribuido a que la
paranfistomosis no se haya diagnosticado en todos los casos en que se haya producido,
dando lugar a falsos negativos. Además, con ello también se ha sobrevalorado la presencia
de fasciolosis, lo que se ha traducido en un incremento en la utilización de fasciolicidas, y el
riesgo consiguiente de aparición de resistencias. En algunas encuestas epidemiológicas se
21
ha demostrado que el porcentaje de vacas con paranfistomos que eliminan huevos a través
de las heces es del 45%.
Con objeto de solucionar este problema del diagnóstico de paranfistomosis se ha aplicado la
técnica inmunoenzimática ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), que permite la
detección precoz de anticuerpos específicos frente a antígenos de Calicophoron,
especialmente de excreción/secreción. El principal inconveniente de esta técnica radica en
la existencia de un cierto grado de imunidad cruzada con antígenos de F. hepatica, que
dificulta la interpretación de los resultados. Sin embargo, y a diferencia de ésta, los valores
de anticuerpos (IgG) alcanzan valores elevados sólo cuando existe una infección activa.
Si se considera que entre las causas de la emergencia de la paranfistomosis en ganado
vacuno del área mediterránea se encuentra el diagnóstico erróneo y tardío que se consigue
Fig.
2.- Dinámica de IgG frente a antígeno de
excreción/secreción de C. daubneyi en ganado
vacuno tratado con Nilzan Plus®.
0,8
Grupo infectado no tratado
Grupo infectado tratado
Grupo no infectado
0,6
Tratamiento
0,4
0,2
0,0
-4
0
1
5
6
12
16
21
24
spt
con la sedimentación, la utilización del inmunoensayo sería una gran ayuda para mejorar las
posibilidades de detección de estas trematodosis. Incrementando la fiabilidad del
22
diagnóstico también se conseguiría reducir los tratamientos que se están aplicando frente a
F. hepatica, lo que a su vez disminuiría la posibilidad de aparición de cepas resistentes.
El control de la paranfistomosis bovina ha de basarse en la actuación sobre el hospedador
intermediario y su hábitat, y sobre el hospedador definitivo.
Las medidas orientadas a entorpecer la supervivencia de los caracoles implican todas
aquellas operaciones para reducir la presencia de agua en exceso en los prados (= drenado),
o la aplicación de productos de acción molusquicida como la cianamida cálcica, aunque su
elevado coste y los problemas ecológicos que se derivan desaconsejan esta última opción.
El tratamiento eficaz frente a los paranfistomos en el ganado vacuno exige su diagnóstico
preciso y precoz. Existen muy pocos productos eficaces frente a los trematodos
Paramphistomidae. Hace algunos años se postuló el empleo de antihelmínticos como el
nitroxynil, pero hoy en día el fármaco de elección es la oxyclozanida, que presenta una
excelente actividad sobre estos parásitos. Este principio activo se comercializa en un
preparado junto con levamisol, bajo el nombre de Nilzan Plus®, por la firma ScheringPlough™. Mediante ELISA se ha demostrado que los valores de IgG disminuyen después
del tratamiento eficaz con oxyclozanida, de modo que esta técnica inmunoenzimática
también se podría emplear para valorar la eficacia de los tratamientos frente a los
paranfistomos (Fig. 2).
BIBLIOGRAFÍA
Abrous M, Rondelaud D, Dreyfuss G, Cabaret J. (1999). Infection of Lymnaea truncatula
and Lymnaea glabra by Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi in farms of
central France. Veterinary Research, 30: 113-118.
Augot D, Abrous M, Rondelaud D, Dreyfuss G. (1996). Paramphistomum daubneyi and
Fasciola hepatica: The redial burden and cercarial shedding in Lymnaea truncatula
subjected to successive unimiracidial cross-exposures. Parasitology Research, 82: 623-627.
Díaz P, Lomba C, Pedreira J, Arias M, Sánchez-Andrade R, Suárez JL, Díez-Baños P,
Morrondo P, Paz-Silva A. (2006). Analysis of the IgG antibody response against
Paramphistomidae trematoda in naturally infected cattle. Application to serological surveys.
Veterinary Parasitology, 140: 281-288.
Mage C, Bourgne H, Toullieu JM, Rondelaud D, Dreyfuss G. (2002). Fasciola hepatica and
Paramphistomum daubneyi: changes in prevalences of natural infections in cattle and in
Lymnaea truncatula from central France over the past 12 years. Veterinary Research 33:
439-447.
Morrondo P, Sánchez-Andrade R., Díez-Baños P, Pérez L, López C. (1994). Dynamics of
Fasciola hepatica egg elimination and Lymnaea truncatula populations in cattle farms in
Galicia (North-West Spain). Research and Reviews in Parasitology. 54: 47-50.
Rangel-Ruíz LJ, Alborés-Brahms ST, Gamboa-Aguilar J. (2003). Seasonal trends of
Paramphistomum cervi in Tabasco, Mexico. Veterinary Parasitology, 116: 217-222.
Silvestre A., Sauve C., Cabaret J. (2000). Caprine Paramphistomum daubneyi (Trematoda)
infection in Europe. Veterinary Record, 146: 674-675.
23
AGGIORNAMENTI SULLA TOXOPLASMOSI E NEOSPOROSI DEI
RUMINANTI DEL BACINO DEL MEDITERRANEO.
SCALA, A.
Dipartimento di Biologia Animale, Sezione di Parassitologia e Malattie Parassitarie,
Università degli Studi di Sassari, Via Vienna 2 – 07100 Sassari, Tel. 39079229465, Fax
39079229464.
La Toxoplasmosi da Toxoplasma gondii e Neosporosi da Neospora caninum sono due
“recenti” parassitosi causate da protozoi Apicomplexa abbastanza simili, tanto che sino al
1984, anno in cui N. caninum è stato identificato da Bjerka et al. (1984) come un protozoo
distinto da T. gondii, il cui ciclo biologico peraltro è stato delineato con l’identificazione del
suo ospite definitivo, il gatto, solo a metà degli anni ’60. Questi due protozoi, oltre ad essere
accumunati da una spiccata rassomiglianza morfologica, possiedono anche un ciclo
biologico abbastanza sovrapponibile, caratterizzato da tre stadi infettivi: tachizoiti, cisti
tissutali e oocisti. I primi due si riscontrano in posizione intracellulare, soprattutto a livello
del SNC e, per T. gondii, anche a livello muscolare dei numerosi ospiti intermedi, che
comprendono anche la maggior parte dei ruminati oltre che a numerose altre specie animali.
Le oocisti, anche in questo caso straordinariamente simili sotto l’aspetto morfometrico, si
formano a seguito di fasi schizogoniche e gametogoniche che avvengono nell’intestino
tenue degli ospiti definitivi, quali il gatto e i felidi selvatici per T. condii, e il cane per N.
caninum, come recentemente provato da McAllister et al. nel 1998.
La Toxoplasmosi è considerata una delle più gravi e diffuse zoonosi a livello mondiale, così
come nei paesi del bacino del Mediterraneo. In particolare per l’uomo una fonte importante
di contagio risultano le cisti tissutali contenute nelle carni di animali da reddito. Queste si
possono sviluppare negli ospiti intermedi già 6-7 gg dopo l’assunzione per via orale di
oocisti o altre cisti tissutali e persistere anche per tutta la vita dell’ospite stesso. Nel gatto,
ospite definitivo della parassitosi e quindi possibile veicolo dell’infezione anche ai
ruminanti, il periodo di prepatenza che precede l'eliminazione delle oocisti varia a seconda
della forma parassitaria ingerita: in seguito all'ingestione di cisti tissutali quasi il 100% dei
gatti eliminerà oocisti entro 3-10 giorni; se l'infezione ha luogo per ingestione di oocisti o
tachizoiti, soltanto il 15-20% dei felini eliminerà oocisti dopo 19-48 giorni. Il ruolo del
gatto nella trasmissione dell’infezione nell’uomo viene talvolta messo in discussione: Luft e
Remington (1988) hanno ad esempio dimostrato che il possesso di gatti non costituisce un
fattore di rischio neanche per i soggetti immunodepressi.
L'importanza epidemiologica delle oocisti non va tuttavia sottovalutata, in quanto studi
condotti da Munday (1972), Omata et al. (1990) e Wallace (1969), hanno rilevato come
l'infezione risulti praticamente assente, sia nella popolazione umana che animale di piccole
isole e atolli che non siano mai stati abitati da gatti. E’ quindi evidente, soprattutto per i
ruminanti in quanto erbivori, il ruolo di questi felini attraverso l’eliminazione delle oocisti
che possono inquinare pascoli, insilati e granaglie, possa risultare determinante per
l’acquisizione dell’infezione, che si manifesta con la comparsa a “fine” ciclo delle cisti
tissutali o terminali.
La distribuzione e il numero di queste cisti che si sviluppano nell’ospite intermedio variano
da specie a specie: il riscontro è più frequente in suini, caprini e ovini, meno negli equini e,
infine, estremamente raro in manzi e bufali sebbene la sieroprevalenza può essere
24
estremamente elevata. Questi dati epidemiologici, insieme ai risultati di una recente
indagine di Cook et al. (2000) che mette in evidenza il trend negativo del consumo di carni
bovine in Europa a favore di quelle suine e ovine, evidenziano la scarsa rilevanza del ruolo
epidemiologico dei bovini nella toxoplasmosi umana.
Tuttavia la diffusione dell’infezione nei bovini allevati nei paesi del bacino mediterraneo
rilevata attraverso indagini soprattutto sierologiche si evince dall’esame della tabella n°1.
Egitto
Francia
“
“
Grecia
Israele
Periodo
campionamento
< 1990
< 1997
2004
2004-2005
< 1995
1985-90
N° campioni
esaminati
17
642
1961
93
8700
372
Italia
1999-2002
7194
Nazione
“
2006
1963
Prevalenza
(%)
29
92
48,6
65,6
23
25
28,4(IgG)
9(IgM)
49,1
“
1999-2005
29886
“
Marocco
Rep. Ceca
Serbia
Spagna
“
“
“
2006
2005
1982-89
2002-03
< 1991
1992-93
< 1996
< 1996
1043
261
886
511
550
541
2306
2306
19,2(IgG)
5,4(IgM)
51,3
27,6
55
84,5
35
12
35
34
“
2004
173 (feti)
23,1
Turchia
“
1990-92
1997
259
531
22
40
Metodica
Bibliografia
IHAT
IFAT
MAT
DAT
ELISA
IFAT
El Ridi et al., 1990
Cabannes et al., 1997
Aubert et al., 2006
Aubert et al., 2006
Stefanakis et al., 1995
Shkap et al., 1992
IFA
Masala et al., 2003
varie
metodiche
Villari et al., 2006
IFA
Masala et al., 2006
ELISA
ELISA
SFDT
MAT
IFAT
MAT
MAT
IFAT
varie
metodiche
ELISA
SFDT
Natale et al., 2006
Sawadogo et al., 2005
Hejlicek et al.,1994
Klun et al., 2006
Moreno et al., 1991
Mainar et al., 1996
Marca et al., 1996
Marca et al., 1996
Pereira-Bueno et al.,
2004
Oz et al., 1995
Altintas et al., 1997
Tuttavia nonostante il reperimento di queste sieropositività nel bovino, la ricerca degli
elementi parassitari di T. gondii in campioni di muscolo diaframmatico e cardiaco, spesso
conduce a dei risultati negativi; d’altro canto rari risultano essere anche i casi clinici di
toxoplasmosi in questa specie animale, compresi gli aborti (Boch e Supperer, 1980). Tutto
questo, insieme a studi sperimentali di riproduzione dell’infezione nel bovino (Rimmel e
Breuning, 1967, citati da Boch e Supperer, 1980), portano ad affermare addirittura che la
carne cruda di bovino e/o di vitello, nonché il fegato, non rappresenterebbero una fonte di
infezione nell’uomo (Janitschke et al., 1967, citato da Boch e Supperer, 1980).
In relazione a quanto sopra affermato verranno quindi riportati i dati sulla diffusione della
toxoplasmosi soprattutto nei piccoli ruminanti, in cui la parassitosi assume un interesse
zootecnico sanitario più rilevante. La maggior parte dei dati disponibili sulla diffusione di T.
gondii negli ovini riguardano, tra i paesi del bacino del mediterraneo, l’Egitto (29%) (El
Ridi et al., 1990), la Francia (dal 22 al 92%) (Cabannes et al., 1997; Aubert et al., 2006), la
Grecia (23%) (Stefanakis et al., 1995), Israele (25%) (Shkap et al., 1992), il Marocco
(27,6%) (Sawadogo et al., 2005), Repubblica Ceca (55%) (Hejlicek et al.,1994), Serbia
25
(84,5%) (Klun et al., 2006), Spagna (dal 12 al 35%) (Mainar et al., 1996; Moreno et al.,
1991; Marca et al., 1996; Pereira-Bueno et al., 2004), Turchia (dal 22 al 40%) (Oz et al.,
1995; Altintas et al., 1997) e l’Italia (dal 5,4 al 51,3%) (Masala et al., 2003; Masala et al.,
2006; Natale et al., 2006); Villari et al., 2006).
E’ evidente come la toxoplasmosi risulti ampiamente diffusa nelle nazioni sopramenzionate,
anche se appare difficile interpretare i dati a disposizione, in quanto viene spesso meno la
standardizzazione delle procedure diagnostiche impiegate per indagini attuate su categorie
di animali e metodiche differenti.
In particolare recentissime indagini sieroepidemiologiche svolte in Sardegna sulla
toxoplasmosi ovina in 22 allevamenti hanno evidenziato anticorpi nei confronti del
protozoo nel 51,3% degli ovini monitorati; nei vari allevamenti le siropositività variavano
dal 18,4% al 97,9% (Natale et al., 2006).
Tra gli ovini allevati in modo intensivo è stata osservata una prevalenza statisticamente
superiore (94%) rispetto a quelli allevati allo stato brado e semi-brado (44,2%), a
testimoniare il fatto che evidentemente il gatto inquina in modo nettamente superiore con le
proprie feci contenenti le oocisti di T. gondii gli alimenti destinati alle pecore allevate
intensivamente, quali insilati e granaglie.
Per ciò che concerneva invece i tassi di sieroprevalenza stratificati per fasce d’età, si è
potuto notare come questi tendevano ad aumentare con l’età; facevano tuttavia eccezione gli
agnelli di età inferiore ad un mese, in cui probabilmente si riscontrano ancora gli anticorpi
colostrali (Natale et al., 2006) (tabella n°2).
La ricerca del protozoo nei tessuti ovini non risulta sicuramente un compito semplice, in
quanto la densità delle cisti terminali risulta estremamente limitata. Anche l’eventuale
riscontro istologico talvolta pone dei problemi interpretativi in quanto si pone l’esigenza di
una diagnosi differenziale con le cisti di sarcosporidi, peraltro nettamente più diffuse
rispetto a quelle di T. gondii. Questa scarsa densità delle cisti terminali pone inoltre dei
problemi anche per ciò che concerne l’utilizzo di metodiche molto sensibili quali ad
esempio la PCR. Infatti, sempre ricerche in tal senso, condotte su ovini adulti della
Sardegna regolarmente macellati, in cui i tassi di sieroprevalenza normalmente risultano in
media oltre il 50%, il DNA di T. gondii è stato evidenziato tra i 323 di quelli esaminati di
miocardio, diaframma, esofago, lingua, massetere, fegato e milza, esclusivamente in 2
campioni di miocardio (0,6%) (Natale et al., 2006), nonostante il protozoo nell’isola risulti
l’agente abortigeno più importante in questa specie animale (Tola et al., 2002). In ogni caso,
il ruolo effettivo dell’ovino nella possibile trasmissione dell’infezione all’uomo, secondo
un’ampia indagine epidemiologica volta da Cook et al. (2000) condotta con lo scopo di
individuare le principali fonti di rischio cui sono esposte le donne in Europa, ha messo in
luce che, anche in virtù dei cambiamenti nelle abitudini alimentari, tra le principali fonti di
infezione va considerato il consumo di carni di agnello poco cotte.
26
Tabella n°2
Età
N° soggetti testati
N° capi positivi
Prevalenza (%)
Odds Ratio
< 1 mese
59
32
54,2%
1,00
< 1 anno
64
15
23,4%
0,26
1 anno
139
59
42%
0,62
2 anni
208
91
43,8%
0,66
3 anni
186
109
58,6%
1,19
4 anni
155
82
52,9%
0,95
5 anni
67
33
49,3%
0,82
> 5 anni
163
112
68,7%
1,85
Se per la toxoplasmosi tra i ruminanti il ruolo più importante era svolto dagli ovini e dai
caprini, per ciò che concerne invece la Neosporosi è sicuramente il bovino che subisce le
conseguenze negative più rilevanti, in quanto riconosciuta come la causa più frequente di
aborto in tutto il mondo.
Nei bovini la trasmissione di N. caninum può avvenire per via orale attraverso l'ingestione
di oocisti sporulate o di tachizoiti contenuti nelle lochiazioni degli animali che hanno
abortito a causa dell’infezione (trasmissione orizzontale) o più facilmente per via
transplacentare (trasmissione verticale) (Dubey, 1999). Nel cane invece può verificarsi,
oltre che con le modalità sopra riferite, anche attraverso l'ingestione di cisti terminali
contenute nei tessuti infetti di vari animali colpiti (McAllister et al., 1998).
Nel bovino N. caninum è in grado di determinare un'insufficienza riproduttiva con
ripercussioni sul prodotto del concepimento, potendo provocare riassorbimento e
mummificazione fetale, aborti sporadici, endemici o epidemici, nonché natimortalità o
nascita di soggetti clinicamente normali ma infetti cronicamente, mentre nel cane sono
descritte soprattutto forme congenite nei cuccioli che presentano una sintomatologia di tipo
neuro-muscolare (Dubey et al., 2003).
L'infezione sembrerebbe ormai aver raggiunto una diffusione cosmopolita e rendersi
responsabile di aborti in alte percentuali (Anderson et al., 1991; Anderson et al., 1995).
Inoltre sembrerebbe ormai assodato come la presenza del protozoo in un determinato
allevamento possa causare delle ripercussioni negative anche sulla produzione di latte
(Thurmond and Hietala, 1997).
Attualmente su questa infezione si stanno acquisendo velocemente numerosi dati grazie agli
studi condotti tramite la biologia molecolare (PCR) e soprattutto anche alla disponibiltà in
commercio di kits diagnostici in grado di rilevare anticorpi per N. caninum che non crossreagiscono con T. gondii e Sarcocystis spp. e che garantiscono una buona affidabilità
(Dubey, 1998; Bjorkman et al., 1999; Dubey, 1999).
La prevalenza degli anticorpi di N. caninum nella popolazione bovina europea è
estremamente varia, anche se i dati disponibili in letteratura al momento sono alquanto
27
limitati. Vengono riportate delle sieroprevalenze nelle popolazioni bovine della Francia del
5,6% (Ould-Amrouche et al., 1999) e della Repubblica Ceca del 3,9% (Vàclavek et al.,
2003). Esistono inoltre delle situazioni come quella della Spagna (35,4% degli animali
monitorati con circa il 60% delle aziende positive) (Lopez-Gatius et al., 2004; QuintanillaGozalo et al., 1999; Mainar-Jaime et al., 1999) e del Portogallo (28% che sale a 46% se si
restringe il campione ai soli allevamenti con problemi di ondate abortigene) (Canada et al.,
2004), in cui la prevalenza è tale da giustificare la sistematica ricerca di N. caninum in casi
di aborto; ve ne sono quindi delle altre, quali quella relativa alla Turchia, in cui non si è
riscontrata alcuna positività nei soggetti autoctoni. Motivo di preoccupazione è la
dinamicità epidemiologica dimostrata dal fatto che, sempre in Turchia, campionature
effettuate su discendenti di soggetti importati hanno individuato prevalenze dell’8,2% (odds
ratio 20,3) (Akca et al., 2005).
In Italia la presenza di N. caninum è stata più volte rilevata in feti abortiti e le indagini
sierologiche indicano un’ampia diffusione sul territorio nel bovino (Magnino et al., 1998;
Otranto et al., 2003). In particolare in Sardegna, indagini condotte tramite IFAT hanno
rilevato tassi di prevalenza del 64% nei bovini da latte monitorati (Masala et al. 2000),
mentre le aziende positive sono risultate il 55%, tramite l’analisi del latte di massa con un
test iscom ELISA (Varcasia et al. 2006). Le esperienze condotte anche in Italia, soprattutto
riguardo gli elevati valori di sieroprevalenza riscontrati in aziende in cui non si registrano
problemi di fertilità, pongono nuovi interrogativi sugli eventi che potrebbero scatenare la
patogenicità di N. caninum che determinerebbe l'aborto probabilmente solo in concomitanza
di particolari situazioni stressanti. Fattori di rischio importanti infatti per l’insorgenza e
persistenza dell’infezione, oltre che la presenza di più cani (eliminatori di oocisti) e pollame
(disseminatori di oocisti?) in azienda, viene ipotizzata anche l’azione immunosopressiva
esercitata dalle micotossine eventualmente presenti negli insilati, che determinerebbe una
rottura delle cisti del protozoo con la riacutizzazione della malattia (Wouda et al., 1999;
Wouda et al., 2000. Tuttavia le esperienze condotte in Sardegna a riguardo, confermano
l’importanza della trasmissione transplacentare dell'infezione, in quanto nelle feci dei cani
presenti nelle aziende monitorate, non si sono mai riscontrate oocisti del protozoo nelle loro
feci e anche i soggetti sieropositivi sono risultati in numero estremamente limitato. Tutto
questo in analogia con quanto rilevato anche in Germania in cui le analisi coprologiche
condotte su 8438 cani hanno consentito il riscontro di oocisti morfologicamente simili a
quelle di N. caninum esclusivamente nell’1,7% dei campioni esaminati (Barutzki et al.,
2003). E’ evidente quindi che eventuali sforzi "scientifici" nel ricercare una soluzione
profilattico/terapeutica al problema dovrebbero essere indirizzati soprattutto verso il bovino,
anche perché gli eventuali protocolli terapeutici proposti non sempre risultano attuabili per
via degli elevati costi relativi all’attuazione e ai residui dei farmaci nel latte.
Recentemente, tuttavia, il riscontro di DNA di N. caninum nel colostro di vacche
sieropositive pone nuovi interrogativi e ha portato ad ipotizzare anche una possibile
trasmissione orizzontale dell’infezione tramite questa via (Moskwa et al., in press).
E’ evidente quindi che queste parassitosi nei paesi del bacino del mediterraneo, seppure non
ancora indagate capillarmente e con metodiche standardizzate, sembrerebbero costituire un
importante problema zootecnico e, per quanto riguarda la toxoplasmosi, anche socialesanitario di non scarsa rilevanza, e che in quanto tali, necessitano di una particolare
28
attenzione non solo da parte degli addetti al settore, ma sicuramente anche di un adeguato
piano integrato di profilassi.
Ringraziamenti: Si ringrazia per la collaborazione la Dott.ssa Porqueddu Monica.
BIBLIOGRAFIA
Altintas K, Gungor C, Zeybek H, Yarali C (1997). Sabin-Feldman testi ile Ankara yoresi
koyunlarinda Toxoplasma gondii prevalansinin saptanmasi. Turk Parazitol Derg, 21: 63-65.
Akca A, Gokce H.I., Guy C.S, McGarry J.W. and Williams D.J.L.(2005). Prevalence of
antibodies to Neospora caninum in local and imported cattle breeds in the Kars province of
Turkey. Res Vet Sci,78(2):123-126.
Anderson ML, Blanchard PC, Barr BC, Dubey JP, Hoffmann RL, Conrad PA (1991).
Neospora-like protozoan infection as a major cause of abortion in California dairy cattle. J
Am Vet Med Assoc, 198: 241-244.
Anderson ML, Palmer CW, Thurmond MC, Dubey JP (1995). Neospora caninum and
neosporosis in animals 11 Evaluation of abortions in cattle attributable to neosporosis in
selected dairy herds in California. J Am Vet Med Assoc, 207: 1206-1210.
Aubert D, Amine S, Hermitte P, Gibout O, Geers R, Villena I (2006). Seroprevalence of
Toxoplasma gondii from cattle, sheep and goat in Champagne-Ardenne, France. Atti Toxo
& Food 2006, Palermo, Italy, p 37.
Barutzki D, Shaper R, (2003). Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002.
Parasitol Res, 90 Suppl 3, 148-150.
Bjerkas I, Mohn SF, Presthus J (1984). Unidentified cyst forming sporozoon causing
encephalomyelitis and myositis in dogs. Z Parasitenk, 70: 271-274.
Bjorkman C, Lunden A (1998). Application of iscom antigen preparations in ELISAs for
diagnosis of Neospora and Toxoplasma infections. Int J Parasitol, 28(1):187-93.
Boch J, Supperer R (1980). Parassitologia Clinica Veterinaria, Editrice Essegivi, Piacenza.
Cabannes A, Lucchese F, Hernandez JC (1997). Enquete seroepide- miologique sur
Toxoplasma gondii chez les ovins, bovins et felins dans le departement de la Gironde. Bull
Soc France Parasitol, 15:11-22.
Canada N, Carvalheira J, Meireles CS, Correia da Costa JM, Rocha A (2004). Prevalence of
Neospora caninum infection in dairy cows and its consequences for reproductive
management. Theriogenology, 62:1229–1235.
Cook AJ, Gilbert RE, Buffolano W, Zufferey J, Petersen E, Jenum PA, Foulon W, Semprini
AE, Dunn DT (2000). Sources of toxoplasma infection in pregnant women: European
multicentre case-control study. European Research Network on Congenital Toxoplasmosis.
BMJ, 15:127-128.
Dubey JP, Dorough KR, Jenkins MC (1998). Canine neosporosis: clinical signs, diagnosis,
treatment and isolation of Neospora caninum in mice and cell culture. Int J Parasitol, 28:
1293-1304.
Dubey JP (1999). Recent advances in Neospora and neosporosis. Vet Parasitol, 84: 349367.
Dubey JP, Venturini MC, Venturini L, McKinney J, Pecoraro M (1999). Prevalence of
antibodies to Sarcocystis neurona, Toxoplasma gondii, and Neospora caninum in horses
from Argentina. Vet Parasitol, 86: 59-62.
29
Dubey JP (2003). Review of Neospora caninum and neosporosis in animals. The Korean J
of Parasitol, 41(1):1-16
Dumètre A, Ajizenberg D, Rozette L, Mercier A, alarion N, Dardé ML (2006). Toxoplasma
gondii infection in sheep and free-range chickens from France: seroprevalence and isolate
genotyping by microsatellite analysis. Atti Toxo & Food 2006, Palermo, Italy, 48-49.
El Ridi AMS, Nada SMM, Aly AS, Habeeb SM, Aboul-Fattah MM (1990). Serological
studies on toxoplasmosis in Zagazig slaughterhouse. J Egypt Soc Parasitol, 20:677-81.
HejlicÏek K, Literak I (1994). Incidence and prevalence of toxoplasmosis among sheep and
goats in southern and western Bohemia. Acta Vet Brno, 63:151-159.
Janitschke K et al.(1967), citato da Boch J., Supperer R. (1980): Parassitologia Clinica
Veterinaria, Editrice Essegivi, Piacenza.
Klun I, Djurković-Djaković O, Katić-Radivojević S and Nikolić A (2006). Cross-sectional
survey on Toxoplasma gondii infection in cattle, sheep and pigs in Serbia: Seroprevalence
and risk factors. Vet Parasitol, 135(2): 121-131.
Klun I, Katić-Radivojević S, Nikolić A, Bobic B, Djurković-Djaković O (2006). Prevalence
and risk factor for Toxoplasma gondii infection in meat animals in Serbia. Atti Toxo &
Food 2006, Palermo, Italy, 75-76.
Lopez-Gatius F, Lopez-Bejar M, Murugavel K, Pabon M, Ferrer D, Almeria S (2004).
Neospora-associated abortion episode over a 1-year period in a dairy herd in north-east
Spain.
J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 51(7):348-352.
Luft BJ, Remington JS (1988). Toxoplasmic encephalitis. J Inf Dis, 157, 1-6.
Magnino S, Fabbi M, Rosignoli C, Marocchi L, Vezzoli F, Alborali L, Cammi G, Colombo
N, Colombo M, BergamiC, Mellini A (1998). Diagnosi sierologica di infezione da
Neospora caninum in aziende bovine da latte italiane. Atti della Società Italiana di Buiatria,
29: 287-291.
Mainar RC, de la Cruz C, Asensio A, Dominguez L, Vazquez- Boland JA (1996).
Prevalence of agglutinating antibodies to Toxoplasma gondii in small ruminants of the
Madrid region, Spain, and identification of factors influencing seropositivity by multivariate
analysis. Vet Res Commun, 20:153-159.
Mainar-Jaime RC, Thurmond MC, Berzal-Herranz B, Hietala SK (1999). Seroprevalence of
Neospora caninum and abortion in dairy cows in northern Spain. Vet Rec, 45(3):72-75.
Marca MC, Ramos JJ, Loste A, Saez T, Sanz MC (1996). Comparison of indirect
immunofluorescent antibody test and modified direct agglutination test methods for
detection of Toxoplasma gondii antibodies in adult sheep in Spain. Vet Parasitol, 67: 99103.
Masala G, Porcu R, Madau L, Tanda A, Ibba B, Satta G, Tola S (2003). Survey of ovine
and caprine toxoplasmosis by IFAT and PCR assays in Sardinia Italy. Vet. Parasitol, 117:
15–21.
Masala G, Tola S, Satta G, Angelici MC, Onni T, Patta C (2006). Epidemiology of
Toxoplasma infection in small ruminant in Sardinia, Italy. Atti Toxo & Food 2006,
Palermo, Italy, 17.
Masala G, Vidili A, Spissu P, Mentisci P, Porcu R, Scala A (2000). Preliminary study of
neosorosis in dairy cattle of Sardinia. International Congress of the Fe.Me.SPRum, 7:387392.
30
McAllister MM, Dubey JP, Lindsay DS, Jolley WR, Wills RA, McGuire AM (1998). Dogs
are definitive hosts of Neospora caninum. Int J Parasit, 28: 1473-1478.
Moreno T, Martinez-Gomez F, Hernandez-Rodriguez S, de Setefilla Martinez-Cruz M,
Martinez-Moreno A (1991). The seroprevalence of ovine toxoplasmosis in Cordoba, Spain.
Ann Trop Med Parasitol, 85:287-288.
Moskwa B, Pastusiak K, Bien J, Cabaj W (2006). The first detection of Neospora caninum
DNA in the colostrum of infected cows. Parasitol Res (in press).
Munday BL (1972). Serological evidence of Toxoplasma infection in isolated groups of
sheep. Res Vet Sci, 13:100-102.
Natale A, Porqueddu M, Capelli G, Mocci G, Marras MA, Sanna Coccone GN, Garippa G,
Scala A (2006). Sero-epidemiological update on sheep toxoplasmosis in Sardinia (Italy).
Atti Toxo & Food 2006, Palermo, Italy, 84-85.
Omata Y, Oikawa H, Kanda M, Mikazuki K, Nakabayashi T, Suzuki N (1990).
Experimental feline toxoplasmosis: humoral immune responses of cats inoculated orally
with Toxoplasma gondii cysts and oocysts. Jpn J Vet Sci, 52:865-867.
Otranto D, Llazari A, Testini G, Traversa D, Frangipane di Regalbono A, Badan M, Capelli
G (2003). Serprevalence and associated risk factors of neosporosis in beef and dairy cattle
in Italy. Vet Parasitol, 118(1-2): 7-18.
Ould-Amrouche A, Klein F, Osdoit C, Mohammed HO, Touratier A, Sanaa M, Mialot JP
(1999). Estimation of Neospora caninum seroprevalence in dairy cattle from Normandy,
France. Vet Res, 30(5):531-538.
Oz I, Ozyer M, Corak R (1995). Adana yoresi sigir koyun ve kecilerinde ELISA ve IHA
testleri ile toxoplasmosis'in yayginligÏinin arastirilmasi: a study on the prevalence of
toxoplasmosis in cattle, sheep and goats in Adana region by using ELISA and IHA tests.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 8:87-99.
Pereira-Bueno J, Quintanilla-Gozalo A, Pérez-Pérez V, Álvarez-García G, CollantesFernández E and Ortega-Mora LM (2004). Evaluation of ovine abortion associated with
Toxoplasma gondii in Spain by different diagnostic techniques Vet Parasitol, 121(1-2): 3343.
Quintanilla-Gozalo A, Pereira-Bueno J, Tabarés E, Innes EA, González-Paniello R and
Ortega-Mora LM (1999). Seroprevalence of Neospora caninum infection in dairy and beef
cattle in Spain. Int J Parasitol, 29:1201-1208.
Rimmel M, Breuning J (1967), citati da Boch J, Supperer R (1980). Parassitologia Clinica
Veterinaria, Editrice Essegivi, Piacenza.
Sawadogo P, Hafid J, Bellete B, Tran Manh Sung R, Chakdi M, Flori P, Raberin H, Bent
Hamouni I, Chait A, Dalal A (2005). Seroprevalence of T. gondii in sheep from Marrakech,
Morocco.Vet Parasitol, 10: 89-92.
Shkap V, Pipano E, Marcus S, Rapoport E (1992). The prevalence of Toxoplasma gondii
antibodies in sheep and cattle in Israel. Isr J Vet Med; 47:100-2.
Stefanakis A, Bizake A, Krambovitis E (1995). Seroprevalence of toxoplasmosis in the
sheep and goats of Crete, Greece. Bull Hell Vet Med Soc; 46:243-9.
Tenter AM, Heckeroth AR, Weiss LM (2000). Toxoplasma gondii: from animals to
humans. Int J Parasitol, 30: 1217-1258.
Thurmond MC, Hietala SK (1997). Effect of Neospora caninum infection on milk
production in first-lactation dairy cows. J Am Vet Med Assoc, 210: 672-674.
31
Tola A, Porcu R, Macciocu S, Chessa G, Casu LM, Sale S, Masala G (2002). Aborti ovini e
caprini in Sardegna: analisi riferita a Salmonella abortusovis, Toxoplasma gondii e Coxiella
burnetii, Atti XV Congresso SIPAOC, 15.
Václavek P, Koudela B, Modrýa D, Sedlák K (2003). Seroprevalence of Neospora caninum
in aborting dairy cattle in the Czech Republic. Vet Parasitol, 115(3):239-245.
Varcasia A, Capelli G, Ruiu A, Ladu M, Scala A, Bjorkman C (2006). Prevalence of
Neospora caninum infection in Sardinian dairy farms (Italy) detected by iscom ELISA on
tank bulk milk. Parasitol Res, 98(3):264-267.
Villari S, Mancuso G, Caracappa S, Currò V, Liga F, Vesco G (2006). Toxoplasma in sheep
in Sicily, Italy. Atti Toxo & Food 2006, Palermo, Italy, 15-16.
Wallace GD (1969). Serologic and epidemiologic observations on toxoplasmosis on three
Pacific attols. Am J Epidemiol, 90:103-111.
Wouda W, Bartels CJ, Schukken YH (1999). Characteristics of Neospora caninumassociated abortion storms in diary herds in The Netherlands (1995 to 1997).
Theriogenology, 52(2):233-245.
Wouda W, Dijkstra T, Kramer AM, Bartels CJ (2000). The role of the dog in the
epidemiology of neosporosis in cattle. Tijdschr Diergeneeskd,125(20):614-618.
32
VACUNAS Y VACUNACIÓN EN LOS PEQUEÑOS RUMIANTES.
MARTÍN GÓMEZ, S.
Doctor en Veterinaria. Jefe de Ventas Mercado Tradicional. CEVA SALUD ANIMAL
INTRODUCCIÓN
La Inmunología Veterinaria es una de las herramientas que cada vez tiene más
importancia en el quehacer del Veterinario puesto que “más vale prevenir que curar”
ascendiendo la medicina preventiva a los primeros lugares en la producción animal. Es una
ciencia abierta y compleja que ha avanzado considerablemente en los últimos años. Ya no
sólo es la ciencia que se encarga de estudiar básicamente la "producción de anticuerpos
(Ac), sueros y vacunas " sino que ya va formando parte de la vida cotidiana en muchas
facetas, así se habla no solo de inmunoprofilaxis, sino de inmunoterapia,
inmunodiagnostico, inmunofarmacología, inmunonutrición, inmunomodulación, etc, siendo
estas herramientas básicas en un futuro más o menos próximo.
La Inmunología, a través del sistema inmune, interrelaciona numerosos órganos de
los seres vivos, de modo que se implica en la regulación de numerosas funciones
fisiológicas del organismo que debemos conocer para entender mejor su importancia en el
animal. Por ejemplo: cuando un animal se pone en contacto con un agente infeccioso, se
activa el sistema inmune y todo el organismo se adapta para el mejor control del mismo:
fiebre -el aumento de temperatura dispara la alarma que pone en marcha ciertos
mecanismos de destrucción de agentes patógenos, incrementándose la multiplicación de las
células de defensa–; decaimiento del animal -el animal restringe sus movimientos para no
gastar energía puesto que toda ella se pone a disposición del sistema inmune- pérdida del
apetito –la digestión es una de las funciones del organismo que más energía gasta-, etc. Es
decir, los síntomas que el veterinario ve en el campo (fiebre, decaimiento y anorexia) son
resultados de la acción del sistema inmune frente al patógeno más que de la acción del
patógeno en sí. Incluso influye en los parámetros productivos de las especies de abasto ya
que la activación del sistema inmune (como respuesta, en ocasiones, a una agresión)
produce una serie de sustancias -citoquinas- que pueden influir muy negativamente en el
crecimiento de los animales (p.ej: inhiben las hormonas del crecimiento, provocan
situaciones de hipoglucemia, etc). ¿Has llegado a pensar que él feto es un cuerpo extraño
y que el parto puede ser un rechazo controlado por el sistema inmune?
La Inmunología es una ciencia con ciertas peculiaridades para cada especie animal
que el Veterinario especialista, en nuestro caso en los pequeños rumiantes, debe conocer
para comprender su funcionamiento y establecer los aspectos más prácticos de esta ciencia
en condiciones de campo:
-la VACUNA como herramienta y
-la VACUNACIÓN como acto clínico de prevención y control de patologías.
Los aspectos más destacados de estos dos conceptos -VACUNA y
VACUNACIÓN- serán expuestos en mi presentación atendiendo a diversos puntos de vista:
Investigación (Tesis Doctoral en inmunoprofilaxis), Clínica (veterinario clínico de
Coopetaritiva ganadera), Técnica (responsable técnico de Ceva Salud Animal para los
productos de pequeños rumiantes) y Comercial (Jefe de Ventas de Ceva Salud Animal,
Laboratorio multinacional).
33
1.- VACUNAS
“En el manejo de los medicamentos, el conocimiento y la aplicación de buenas prácticas
son imprescindibles para la obtención de los mejores resultados”
1.1.- ¿Qué es una vacuna?
Es un producto biológico, compuesto liquido que contiene una solución o suspensión de
agentes infecciosos (completos o no) o de toxinas –en cualquier caso antígenos específicostratados para que pierdan su capacidad patógena (muerte o inactivación) a los que se le
añade un adyuvante que potenciará la respuesta inmune.
El conjunto –antígeno (Ag)/adyuvante- permitirá estimular específicamente el sistema
inmunitario del animal vacunado con el fin de instaurar una protección inmunológica
(inmunidad humoral y/o celular) frente a patógeno/s incluido/s en la vacuna durante un
plazo más o menos largo.
1.2.- Antígenos y adyuvantes
Uno de los puntos clave para entender el funcionamiento de la diferentes vacunas es
precisamente tener claro su composición antigénica y el adyuvante que incorporan.
1.2.1.- Atendiendo al antígeno las vacunas las podemos clasificar en:
ANACULTIVO- Cualquier cultivo de un agente infeccioso cuya capacidad
patógena ha sido eliminada bien por métodos físicos (calor) o químicos (formol). Sólo se
refiere exclusivamente al cultivo del microorganismo, no indica nada respecto a la
capacidad antigénica que conserve ni a los factores de virulencia que elimina.
VACUNA MUERTA- Es un anacultivo, pero que necesariamente mantiene su
capacidad inmunógena y por tanto contiene los antígenos frente a los que pretendemos
vacunar. Toda vacuna muerta, partirá de un anacultivo, pero no todo anacultivo podrá ser
una vacuna.
BACTERINA- Vacuna muerta completa de naturaleza bacteriana.
TOXOIDE ó ANATOXINA- Es la toxina inactivada a la que se le ha hecho
perder su capacidad tóxica.
VACUNA VIVA- Contiene los microorganismos metabólica y antigénicamente
completos.
VACUNA VIVA ATENUADA/INACTIVADA - (la mayoría víricas son
atenuadas). La vacuna viva atenuada es una vacuna viva cuya virulencia ha sido disminuida
por medios naturales: pases sucesivos por animales de experimentación, por hospedador no
natural, por cultivos celulares sucesivos, por cultivo en medios limitantes (donde es
restringido algún factor de crecimiento o nutriente) o por cepas manipuladas genéticamente
para incapacitarlas en la expresión de uno o varios genes que se relacionan con la
virulencia. La inactivación suele ser un proceso en el que se incapacita al microorganismo
para la reproducción. Es lo mismo que el efecto bacteriostático de los antibióticos (impide
la replicación).
1.2.2.-Atendiendo a los adyuvantes:
Con la vacunación se pretende simular una infección natural a la que el organismo responde
con la activación del sistema inmune. En la infección natural el animal recibe un contacto
normalmente “constante” con el agente agresor (antígeno).
Los adyuvantes permiten presentar al sistema inmune los antígenos incorporados en las
vacunas de forma continuada en el tiempo simulando lo que ocurre en la naturaleza.
34
Los adyuvantes de por sí ya son una sustancia extraña para el organismo por lo que su
presencia ya activa al sistema inmune: se incrementa la producción de interleuquinas lo que
incrementa la multiplicación de células defensivas, etc.
Adyuvante de referencia: El hidróxido de aluminio: muestra un excelente compromiso
«reacción local/eficacia». Actúa por depósito en el punto de inoculación por lo que puede
generar focos de inflamación. Muy eficaces cuando se requiere la activación de la respuesta
humoral con generación de elevadas cantidades de anticuerpos. P. Ej.: frente a toxinas.
Actualmente, el desarrollo de nuevos adyuvantes es uno de los campos en los que más se
está avanzando a nivel de investigación, ya que tan importante es contar con el antígeno
adecuado en la vacuna como con el adyuvante que optimice la presentación del antígeno al
sistema inmune permitiendo su mejor respuesta. Ejemplos de adyuvantes en los que se está
investigando son: saponinas, ISCOM, interleuquinas, inmunoestimulates como el levamisol,
melatonina, etc.
1.3.- Importancia de los estudios epidemiológicos en el diseño de los productos
vacunales
Uno de los aspectos clave en el diseño de vacunas frente a una determinada enfermedad
deben ser los estudios epidemiológicos que indiquen qué agentes patógenos o qué especies
dentro de un mismo género o qué toxinotipos dentro de una misma especie están presentes
en el mapa microbiológico de la zona en la que se pretende usar la vacuna posteriormente.
En este sentido la Epidemiología Veterinaria no está, a mi juicio si lo comparamos con la
Medicina Humana, teniendo un papel relevante por lo que en un futuro sería de desear que
tanto Laboratorios productores de vacunas como Instituciones Científicas Veterinarias
apoyaran este tipo de estudios de gran utilidad para el control de las enfermedades.
1.4.- Conservación-embalaje de las vacunas
Si bien es claro la importancia tanto del antígeno como el adyuvante en la composición
vacunal, no es de menor importancia el embalaje a realizar para asegurar su correcto
transporte y manteniento de la cadena de frío.
Los últimos avances en este tipo de embalaje aparecidos en el mercado español de vacunas
para pequeños rumiantes hace referencia a:
-Caja de cartón aluminio: permite la mejor transmisión del frío desde la nevera a la
vacuna.
-Efecto tampón térmico del disolvente sobre el liofilizado. Fuera de lo que pueden ser
aspectos de marketing, lo importante es intentar asegurar el manteniendo de la temperatura
de conservación constante (normalmente el fabricante indica entre 2-8ºC). Así por ejemplo,
en vacunas que se componen de un liofilizado a reconstituir en un diluyente, este puede
utilizarse como tampón térmico siempre y cuando esté en contacto con el liofilizado.
Además, se evitan espacios muertos en la caja que también es importante desde un punto de
vista práctico en el almacenaje en frío de las vacunas.
1.5.- Seguridad-confianza en los productos biológicos
El Veterinario, el productor y el consumidor –que somos todos- exigimos unos productos
medicamentos para la mejora de la producción animal con la garantía de seguridad absoluta.
Por supuesto que esta solo se conseguirá en el caso de haber respetado las condiciones de
utilización marcadas.
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De ahí, que cada vez más la Agencia Española del Medicamento (Ministerio de Sanidad
y Consumo) esté muy focalizada en el cumplimiento de la FARMOCOVIGILANCIA
VETERINARIA:
De acuerdo con el RD 109/1995 de medicamentos veterinarios y con la directiva
2001/82/CE modificada por la Directiva 2004/28/CE por la que se establece un código
comunitario sobre medicamentos veterinarios, cualquier sospecha de reacción adversa
grave o inesperada o de reacción adversa en el ser humano debe ser inmediatamente
notificada al laboratorio titular del medicamento o a la Agencia Española de
Medicamentos y Productos Sanitarios. Existe para ello un formulario de Notificación de
supuestas reacciones adversas que debe rellenarse con el máximo de información posible
sobre el caso. Dicho formulario puedes encontrarlo en: www.agemed.es/index.htm
La investigación en el establecimiento de protocolos de seguridad previos a la
comercialización/utilización de las vacunas es esencial para este tipo de productos
medicamentosos. Varios grupos de Investigadores realizan su labor en este sentido. Sin
embargo, más estudios son necesarios (y de forma continuada) y por tanto la colaboración
entre los Laboratorios productores y los centros de investigación, parece día tras día ser más
importante.
2.- VACUNACIÓN
2.1.- ¿Qué es la vacunación?
La vacunación es una herramienta de prevención que permite al sistema inmune del animal
vacunado desarrollar una respuesta específica frente a una posible agresión. En la mayoría
de las ocasiones se alcanzar una protección inmunológica adecuada reduciendo la
posibilidad de contraer la infección. Ha demostrado ser el método más eficaz y
económico para controlar determinadas enfermedades de carácter infeccioso.
Podemos decir que la vacunación es un “método indirecto de actuación sobre el animal”, si
lo comparamos con la administración de un antibiótico, un antiparasitario u otro tipo de
medicamentos (vitaminas, etc), puesto que su éxito depende en gran medida de la
condición del sistema inmune del animal vacunado y de diversas circunstancias que le
rodean. Más indirecto todavía es la utilización de la “vacunación calostral”
(inmunoprofilaxis lactogénica), de gran importancia en los rumiantes en general –ver
apartados 2.3.- y 2.3.4.-- ya que su eficacia dependerá, además de la vacunación de la madre
y de la situación de su sistema inmune, de las condiciones de la administración del calostro
a los neonatos.
A pesar de que la acción de vacunar sea individual, de manera zootécnica en el ganado
ovino y caprino, se considera el lote o incluso el rebaño como unidad de trabajo.
La variabilidad individual existente en cuanto a la respuesta a la vacunación puede hacer
que en condiciones ideales sea muy difícil conseguir un 100% de la protección inmunitaria
deseada.
Desde un punto de vista más práctico tampoco debemos olvidar que la vacunación debe
ser una herramienta cuyo fin es mejorar la salud del rebaño para evitar pérdidas
económicas y por tanto mejorar la rentabilidad de las explotaciones.
Diversos factores debidos tanto a los animales, como al producto vacunal, como al material
utilizado en la vacunación, pueden variar la eficacia de la vacunación o el grado de
protección inmunológica adquirida tras la misma.
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2.2.- Condiciones ideales para realizar una correcta vacunación
2.2.1.- De los animales: cuidados antes, durante y después de la vacunación
Es esencial solo vacunar animales en buen estado general (sólo los ANIMALES SANOS
tienen capacidad para responder ante las vacunas): alimentación equilibrada, desparasitados
(los parásitos consumen mucha energía necesaria para que el sistema inmune reaccione de
forma adecuada a la vacunación y condicionan y desvían la respuesta inmune a Th2), sin
fiebre (una temperatura corporal por encima de lo normal puede indicar que el animal está
respondiendo a otra infección por lo que su sistema inmune desviará la atención de la
vacunación; por otro lado, este aumento de la temperatura puede eliminar las bacterias
incluidas en las vacunas vivas), buena condición corporal, no sometidos a condiciones de
estrés (produce inmunodepresión).
Identificar los animales vacunados y hacer un seguimiento del estado general (no olvidar
que el estrés producido por la vacunación puede favorecer la aparición de infecciones
latentes en el rebaño) así como del punto de inoculación.
Seleccionar el sitio correcto para la inoculación: por vía intramuscular son adecuados los
músculos del cuello y para la utilización de la vía subcutáneas la piel del cuello y la axila.
La zona corporal seleccionada debe estar limpia.
Durante la vacunación es importante que el animal este suficientemente quieto y tranquilo,
ello evitará accidentes y disminuirá el estrés que conlleva esta manipulación.
Evitar realizar la vacunación en días húmedos y en los que se ha sacado el abono puesto que
se aumenta la posibilidad de contaminación del punto de inoculación. De forma particular,
tener en cuenta la sensibilidad a veces exacerbada de las cabras a cualquier acto médico.
2.2.2.- De la vacuna y los protocolos de vacunación
Determinar la vacuna (por composición) y el programa vacunal más adecuados atendiendo
a los antecedentes patológicos de la explotación y de otras ubicadas en la misma área, al
sistema productivo y reproductivo seguido (a la carta en cada explotación en dependencia
de sus necesidades intentando no sobrecargarlos). Hay que tener en cuenta que la
vacunación no es un tratamiento aislado sino que requiere de una doble dosificación (en la
mayoría de los casos en primovacunaciones –ver apartado 2.3.-) y de dosis de recuerdo cada
cierto periodo, y en preparto si queremos realizar una vacunación calostral (ver apartado
2.4.-).
Respetar la cadena de frío sin olvidar que las vacunas vivas solo se conservan unas pocas
horas una vez abiertas. En el momento inicial de su manipulación cerciórese del aspecto
homogéneo del frasco. Una vez vacunados todos los animales propuestos descarte los
sobrantes vacunales.
Antes de su uso leer detenidamente el prospecto prestando especial atención a la fecha de
caducidad de la vacuna, la dosis adecuada siguiendo la vía de inoculación descrita y los
intervalos entre vacunaciones
2.2.3.- Del instrumental necesario
El material reservado para la inoculación (jeringuillas, pistola vacunadora o vacunador y
agujas) debe estar estéril y mejor ser de un solo uso.
En el momento de la inoculación colocaremos todo el material necesario en un lugar limpio,
cómodo para el manipulador y seguro para evitar accidentes.
La utilización de guantes de látex de un solo uso permitirá una manipulación higiénica.
Si es necesario la recomposición de la vacuna utilice el material anexo.
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Las agujas a utilizar deben ser adecuadas al tipo de animal a vacunar: como norma general
para animales adultos es suficiente con agujas de un calibre entre 16 y 18 y con una
longitud de 12 a 25 mm para inoculaciones subcutáneas y de 25 a 40 mm para las
inoculaciones intramusculares.
Idealmente utilizar agujas nuevas para cada animal o como mínimo cambiarlas cada 10
animales.
Cuando se esté cargando la jeringuilla expulsar el aire fuera de la jeringuilla para depositar
la dosis correcta.
2.3.- Respuesta vacunal
Como se ha desarrollado previamente, estrictamente el cometido de una vacunación es la
estimulación del sistema inmune del animal vacunado (respuesta vacunal) para que
proporcione un umbral de defensa humoral y/o celular por encima del considerado básico
que permita resolver una futura posible infección.
Si el tipo de vacunación realizada responde a Th-2 (mayoritariamente humoral), una de las
medidas más objetivas para medir la eficacia de la primovacunación es analizar la
seroconversión producida en un número representativo de animales vacunados entre los 15
días y 3 meses posteriores a la vacunación. Sin embargo, en animales que han podido tener
contacto con el agente patógeno la seroconversión sólo es válida si se ha utilizado vacunas
marcadas.
Primovacunación: Entendemos por primovacunación el primer contacto del animal con
una vacuna determinada independientemente de la edad en la que se practique la citada
vacunación. Este hecho es importante puesto que para conseguir una correcta
primovacunación con la mayoría de las vacunas –a excepción de las vivas-, es necesario que
el animal reciba dos contactos con el antígeno lo que se denomina “efecto booster”:
Tras la segunda inoculación, el batallón de linfocitos B de memoria específicamente
generados en el primer contacto con el antígeno, se movilizan rápidamente y producen una
mayor cantidad de anticuerpos específicos. De aquí la importancia de una segunda
inoculación en la primavacunación para conseguir una respuesta vacunal más eficaz.
Además, la aparición de las IgG es mucho más rápida, acortando el periodo de latencia.
Clásicamente se establece un periodo de 3 a 6 semanas entre las dos inoculaciones.
Si la primovacunación se realiza sobre animales neonatos, debemos recordar que su sistema
inmuniatario NO es totalmente maduro aunque puede responder pocos días después del
nacimiento. La reacción será más lenta y menos eficaz que el de un animal adulto. Además,
tenemos que tener en cuenta las posibles interferencias con los anticuerpos calostrales.
Revacunación: La respuesta generada en la primovacunación no es de por vida ya que la
población de células B de memoria desaparece y por lo tanto la capacidad de luchar
eficientemente contra el Ag disminuye con el tiempo.
La inoculación de recuerdo a intervalos regulares (normalmente bianual) permite mantener
la respuesta inmunitaria a largo plazo. En estas inoculaciones de recuerdo, la movilización
de los linfocitos B sensibilizados previamente, así como la generación de más linfocitos de
memoria, es más eficiente, por lo que la producción de anticuerpos (fundamentalmente IgG
como ya se ha explicado) es mayor y más rápida obteniéndose así una respuesta inmunitaria
más especializada para ese tipo de antígeno concreto.
Muy importante: la revacunación cada 6 meses es esencial en vacunaciones en las que se
desencadena fundamentalmente la vía humoral (Th- 2: genera poca memoria) (p. Ej.:
38
vacunación frente a las enterotoxemias; durante 6 meses aproximadamente tras la
vacunación hay liberación constante de antígeno y por tanto estimulación constante de
linfocitos B con la consecuente producción de Ac. Pasado este tiempo, y dado que en este
tipo de respuesta no se genera una gran memoria, no hay estimulación y por tanto no hay
producción de Ac y los animales quedan desprotegidos.
2.3.1.- Interpretación/medición de resultados
La cantidad de un anticuerpo específico frente a un agente patógeno que tiene el suero
sanguíneo (o calostral) de un animal se mide mediante lo que se denomina “título sérico de
anticuerpos”. P.ej.: en una muestra de sangre que recibimos del Laboratorio nos dicen que
el título frente a una determinada enfermedad es 1/128 ¿qué significa? Que el suero sigue
teniendo anticuerpos específicos después de ser diluido 128 veces. Cuanto más alto es el
denominador mas diluida está la muestra y por tanto indica una mayor concentración de
anticuerpos en el suero. Este título puntual no proporciona demasiada información ya que
puede estar condicionado por numerosos factores: contacto puntual con el antígeno, etc.
Una mayor información nos la da su evolución: seroconversión y cinética de anticuerpos.
La cinética de anticuerpos en la sangre nos describe la cantidad (título) y duración de los
anticuerpos circulantes en el tiempo. Por debajo del umbral de protección, el animal no
tiene defensas para asegurar una respuesta eficaz frente a una hipotética agresión del agente
patógeno. Seroconversión: un animal antes de haber tenido contacto con un agente
patógeno o ser vacunado no presenta anticuerpos específicos en su sangre, es seronegativo.
Después del contacto con el antígeno (infeccioso o vacunal) se produce la seroconversión al
poder detectarse títulos positivos de anticuerpos específicos en su sangre (ya es
seropositivo). Esta conversión puede usarse a nivel diagnóstico teniendo en cuenta que las
muestras se deben tomar de forma pareada con un intervalo mínimo de 15 días. La
seroconversión en cuanto a la vacunación mide la capacidad antigénica de la vacuna.
El mero hecho de hacer un perfil sérico proteico o determinar la cinética de anticuerpos
específicos para una determinada enfermedad NO va a dar la información completa sobre el
estado inmunológico del animal en general o frente a esa determinada enfermedad ya que
por un lado sólo estamos valorando la respuesta humoral y además sólo la sistémica sin
tener en cuenta la que se produce a nivel local.
¿Cómo puedo medir la capacidad inmunológica del rebaño?
Resulta difícil ya que como hemos visto debemos de tener en cuenta la inmunidad celular y
la humoral, y que además en ambas, parte de la respuesta se genera a nivel local y otra parte
a nivel sistémico. Hoy por hoy los análisis rutinarios que se realizan suelen ser de muestras
sanguíneas (por tanto sólo reflejan la inmunidad sistémica) y para medir únicamente
anticuerpos (por lo que no se valora la inmunidad celular). Teniendo en cuenta estas
premisas, realizar el perfil proteico del suero observando el % o concentración de
inmunoglobulinas de un número más o menos representativo de animales puede indicarme
el estado inmunitario del rebaño
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2.3.2.- Fallo en la respuesta vacunal
Según lo citado en el apartado 2.3.-, el fallo en la respuesta vacunal será la no consecución
de la protección inmunológica deseada, es decir una disminución de la eficacia de la
vacunación que no ha conseguido la respuesta suficiente en un notable número de animales
vacunados. ¿En qué porcentaje este fallo es debido a la propia vacuna –fallo vacunal-? Es
difícil de valorar puesto que son muchos los factores que intervienen.
Cuando se presentan los fallos en la respuesta vacunal y antes de achacar el problema a la
vacuna en cuestión, es importante descartar otros factores relacionados con los animales y
con el material utilizado para la vacunación que pueden también influir. Además, debemos
de descartar otras situaciones a menudo frecuentes:
-A veces lo que realmente ha habido es un mal diagnóstico y no se ha
vacunado frente al agente que hay que combatir.
-En otros casos lo ocurrido es la mala elección de la vacuna por no tener
entre sus objetivos el agente patógeno (o su toxina) en cuestión.
-No son fallos vacunales intentar obtener una respuesta terapéutica en vez de
profiláctica.
Reacciones generales tales como fiebre, decaimiento, anorexia, infartación de los ganglios
proximales al sitio de inoculación (indica la mayor división y proliferación de células
inmunes), pueden ser reacciones observadas tras la vacunación sin que puedan considerarse
reacciones adversa. Sin embargo, si tras una determinada vacuna se presentan tales
síntomas, estas deben describirse en el prospecto del producto vacunal.
El buen conocimiento del producto vacunal (muy importante seguir correctamente las
indicaciones del prospecto) así como de su manipulación y utilización son armas
imprescindibles para evitar la aparición de fallos en la respuesta vacunal y/o reacciones
adversas.
2.4.- El calostro: inmunoprofilaxis lactogénica. Gran importancia para los pequeños
rumiantes neonatos.
Capítulo aparte merece el calostro y su importancia en los pequeños rumiantes neonatos. El
calostro es la primera secreción láctea " primera leche" de las hembras mamíferas después
del parto. Contiene un nivel alto de varios nutrientes fundamentales para la salud y
viabilidad de la cría. Entre ellos destaca las inmunoglobulinas presentes de forma muy
concentrada en el calostro (ver apartado 2.3.1.). Este hecho es fundamental en el ganado
ovino y caprino debido al tipo de placenta sindesmocorial que poseen. A diferencia de la
especie humana la placenta de lo pequeños rumiantes se compone de numerosas capas que
separan la sangre materna y fetal. Por ello, el paso de anticuerpos de un compartimento al
otro es imposible durante la gestación y los corderos y cabritos nacen sin anticuerpos en su
sangre procedentes de su madre.
Así, la correcta ingestión de calostro materno provee a estos neonatos de la primera fuente
natural, específica y eficiente de protección inmunológica frente a una variedad de
microorganismos patógenos presentes en el medio. Por tanto, una de las estrategias más
importantes para mantener con vida y con buena salud tanto a los corderos es
asegurarse que reciban la cantidad y calidad de calostro adecuada durante las
primeras dos o tres horas de vida.
El fenómeno de la trasferencia de las inmunoglobulinas (Ig) desde la luz intestinal hasta la
sangre del recién nacido tiene un tiempo limitado, comenzando su regresión progresiva a las
40
12 horas de vida y finalizando aproximadamente a las 24 horas. Estos periodos varían para
las diferentes Ig, siendo inferior para las Ig más pesadas (IgM: pentámero). También varían
a la baja si el animal está estresado (p.ej.: frío, hacinamiento, etc)
2.4.1.- La composición inmunológica del calostro
Inmunoglobulinas (fundamentalmente IgG, IgM e IgA) que serán absorbidas por los
entericitos únicamente durante las 24 primeras horas de vida. A partir de ahí las
inmunoglobulinas (sobretodo IgA) presentes en la leche producirán una inmunidad local.
Un calostro de alta calidad debe contener >50 mg de inmunoglobulinas/ml. Este dato es
importante para determinar la valía de sustitos de calostros (ojo!!!! suplementos
comerciales)
Leucocitos que participan en la inmunidad celular del cordero neonato: solo pueden
absorberse los leucocitos de la madre biológica del cordero, lo que explica que los calostros
de otras hembras o de otras especies sean menos eficaces. Los leucocitos maternos del
calostro que no sean absorbidos por el neonato ejercen un efecto protector a nivel local
intestinal.
Citoquinas e interferón: que como hemos descrito desempeñan funciones de regulación del
sistema inmune y otras funciones fisiológicas
Conforme avanza la lactación el calostro se convierte en leche evidenciándose cambios en
su composición inmunológica.
El hecho de que la mayoría de la IgG e IgM del calostro provenga del suero sanguíneo nos
permite saber cual será la cantidad de estas Ig en el calostro (y por tanto saber la capacidad
inmunológica humoral de este calostro) fácilmente sólo mediante la determinación de la
concentración de Ig en una muestra de sangre tomada en un momento próximo al parto.
2.4.2.- Condiciones idóneas de ingestión de calostro por los pequeños
rumiantes neonatos
TODOS LOS CORDEROS RECIÉN NACIDOS NECESITAN CALOSTRO
Como norma en los pequeños rumiantes debemos administrar la cantidad de calostro
equivalente al 10% del peso vivo durante las 12-24 primeras horas de vida (p. Ej: un
cordero de 4,5 kg debe recibir 450 gr de calostro en ese periodo, recibiendo la mitad entre
las 4 a 8 horas después del nacimiento). Se debería permitir que los corderos mamen de sus
madres lo antes posible. En muchas ocasiones se debe ayudar al recién nacido:
AHIJAMIENTO, esta práctica es más eficiente que el posterior suministro de calostro por
biberón.
Las tomas debe ser entre 60 a 120 gramos a intervalos de 3 a 4 horas.
Es importante retirar el calostro rápidamente de la ubre de la madre después del parto
(mediante lactación u ordeño), ya que después del parto no se forman más proteínas
calostrales y comienzan procesos de reabsorción y degradación de las mismas así como de
otros componentes del calostro, se considera que un calostro retenido en la ubre conserva
una buena calidad sólo durante 2-4 horas.
Es crítico el que los corderos y cabritos reciban el calostro durante las primeras 24 horas de
vida para asegurar la correcta absorción de anticuerpos. El tamaño de los poros intestinales
existentes entre los enterocitos de los recién nacidos (permeabilidad intestinal) solo es lo
suficientemente grande para el paso de las inmunoglobulinas durante las primeras 24 horas
de vida. A diferencia de otras especies animales en los rumiantes se absorben todos los tipo
de inmunoglobulinas presentes en el calostro
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2.4.3.- Indicadores de la calidad inmunológica del calostro y de una buena
transferencia de anticuerpos calostrales al neonato:
En condiciones de campo se suele utilizar un densitómetro (calostrómetro): nos indica la
densidad del calostro. Ésta está directamente relacionada con la concentración de proteínas
presentes en el mismo lo que nos da una ligera idea de la cantidad de inmunoglobulinas que
contiene el calostro.
Sin embargo, para tener una mayor certeza es conveniente realizar un perfil proteico sobre
una muestra de calostro: específicamente nos indicará el contenido en Inmunoglobulinas.
Durante la etapa de transferencia de anticuerpos calostrales, parte de ellos se elimina
simultáneamente por la orina del neonato (se produce una inmunoglobulinuria=
proteinuria). Por ello, la utilización de una tira reactiva para la detección de proteínas en
orina nos indicará de forma indirecta la transmisión de anticuerpos calostrales. La
proteinuria solo se produce mientras dura la transmisión de anticuerpos calostrales.
2.4.4.- Vacunación de las madres en preparto
La vacunación de las madres antes del parto permite enriquecer inmunológicamente el
calostro: es el principio de la “vacunación calostral”. Además, los títulos de anticuerpos
específicos en leche son muy superiores y aunque no serán absorbidos vía intestinal,
proporcionarán al cordero inmunidad local.
En caso de primovacunación y para asegurar un enriquecimiento máximo del calostro, es
necesario separar la inoculación del parto al menos de 2 a 6 como máximo, obteniéndose
los mejores resultados cuando la inoculación se realiza a las 3 semanas preparto
En las ovejas no vacunadas en preparto la caída de los títulos de anticuerpos en leche y
calostro es más pronunciada que en las ovejas vacunadas en el preparto (inoculación entre
3-6 semanas previas al parto).
La vacunación en preparto de las madres es fundamental para proteger al neonato contra las
enfermedades de los 2-3 primeros meses de vida. Posteriormente, la eficacia de la
vacunación calostral dependerá de la cantidad y calidad del calostro administrado,
permitiendo a los neonatos retrasar la susceptibilidad a las infecciones hasta por lo menos
las 6-8 semanas de vida.
Si se produce un buen suministro y aprovechamiento del calostro, el suero de los recién
nacidos de madres vacunadas en preparto presenta títulos más elevados de anticuerpos
específicos y durante más tiempo manteniendo un nivel de defensa inmunológica superior
al umbral. En neonatos de madres no vacunadas la zona de indefensión inmunológica (zona
en la que el nivel de anticuerpos en suero está por debajo del umbral de protección) es
mayor que en neonatos amamantados por madres vacunadas.
!La vacunación de las hembras en el preparto contra enfermedades tales como la
enterotoxemia es de vital importancia para los neonatos, ya que de esta forma el calostro
contendrá los anticuerpos capaces de combatir estas enfermedades!
3.-MIS ANIMALES ESTÁN VACUNADOS, PERO ¿ESTÁN PROTEGIDOS?
La vacunación es un acto seguro aunque conlleva ciertos riesgos que deben ser siempre
valorados y tenidos en cuenta tanto por el Veterinario como por el propietario de los
animales.
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Manejo la explotación
Situación
epidemiológica
de la zona
Condiciones
inmunológicas
de los animales
Programa
sanitario
Agentes
patógenos:
presión de
infección
Programa
Vacunal
Respuesta
vacunal
A lo largo de todo este texto ha quedado refrendado la importancia de diversos parámetros
en la respuesta vacunal, no solo en cuanto a la vacuna, al animal y al acto de la vacunación,
sino también como se muestra en el gráfico anterior la interrelación entre el programa
vacunal dentro del programa sanitario integral de la explotación, las condiciones
inmunológicas del rebaño dentro del manejo general de la explotación y todo en una
situación sanitaria influida por el entorno. De aquí que siempre tenemos que tener muy en
cuenta que la vacunación como herramienta preventiva para el control de patologías debe
de realizarse en unas condiciones óptimas y para ello siempre debe venir asociada a la
profilaxis zootécnica, es decir, asociada a todos aquellos aspectos que mejoren las
condiciones de producción de los animales.
PROFILAXIS ZOOTÉCNICA
objetivos
disminuir las circunstancias
inmunosupresoras “control de estresores”
aumentar las circunstancias
inmunoestimuladoras
Para ello debemos vigilar:
Nutrición
Ventilación
Temperatura
Densidad
Transporte
Parasitación
Presión de infección
Bienestar animal es sinónimo de calidad inmunológica
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BIBLIOGRAFÍA
Manteca, Ch., Zorrilla, I., De Mora, F., Fariñas, F., Martín, S. Y Suárez, S. (2004) Guía
CEVAC de inmunología en ganado ovino. Primera parte. Edición: ICE SALUD. ISBN:
84-609-2457-2.
Manteca, Ch., Zorrilla, I., De Mora, F., Fariñas, F., Martín, S. Y Suárez, S. (2004) Guía
CEVAC de inmunología en ganado ovino. Segunda parte. Edición: ICE SALUD. ISBN
84-609-6268-7.
44
EVOLUCIÓN Y SITUACIÓN ACTUAL DE LA ENCEFALOPATÍA
ESPONGIFORME BOVINA (EEB)
GONZALO FERNÁNDEZ
Dpto. Patología Animal. Facultad Veterinaria de Lugo. Universidad de Santiago de
Compostela. Corresponding author. Tel +34 982285900; fax: +34 982252195.
E-mail address: [email protected] (G. Fernández).
Dado las características específicas de la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB) para
llevar a cabo un análisis sobre esta enfermedad es necesario tener en cuenta una serie de
consideraciones. Es un proceso que se caracteriza por su largo período de incubación
(media de 5-7 años), por producirse la infección principalmente en el primer año de vida de
los animales y por ser transmitida mediante alimentos contaminados. Por lo tanto, la
situación actual de la enfermedad no sólo va a ser reflejo de los condicionantes que se
producen en la actualidad, sino principalmente, de los que tuvieron lugar en el pasado.
En la actualidad, tras un máximo en los años previos, se ha observado una disminución de
casos en todos los países de la Unión Europea (UE), tanto en el Reino Unido (RU), donde la
enfermedad ha presentado su mayor expresión, como en el resto de los estados (figura 1).
Este hecho está llevando a una situación de reflexión sobre el futuro de los programas de
vigilancia y control de la enfermedad que se están llevando a cabo en todos los países
europeos. Para realizar este ejercicio reflexivo es imprescindible analizar tanto la evolución
de la enfermedad como la eficacia de las medidas establecidas en los últimos años.
400
350
300
Francia
España
Italia
Portugal
250
200
150
100
50
0
1985
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
Figura 1. Evolución de casos de EEB en estados europeos según año de nacimiento
45
Para realizar una valoración de la situación actual analizaremos los animales detectados
durante el año 2004 teniendo en cuenta su año de nacimiento (figura 2).
1000
65,5%
900
800
3,5%
700
600
30,6%
500
400
300
200
100
Nº
0
-1990
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
Figura 2. Año de nacimiento de los animales confirmados con EEB en la UE menos el RU
en el año 2004
Animales nacidos antes de 1994
A pesar de que son animales ya nacidos hace más de 10 años todavía representan un
porcentaje importante de los casos que se presentan en la actualidad (hasta un 30%). Este
período se caracterizó por la existencia de un gran número de casos de BSE en el RU. En
está época se van estableciendo medidas para evitar la exportación de la enfermedad desde
el RU que no fueron totalmente completadas hasta años después. Aparecen por primera vez
casos de la enfermedad en varios países europeos (figura 3).
46
Liechtenstein
Irlanda
Suiza
España
Dinamarca
Alemania
Holanda
Bélgica
Luxemburgo
Francia
Portugal
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Figura 3. Año de declaración del primer caso nativo de EEB en países de la UE-UK
Las medidas para evitar la diseminación de la enfermedad por medio de la alimentación
animal no son todavía establecidas de forma que una vez introducida en un país la
enfermedad pudo transmitirse a otros animales de la cabaña mediante piensos
contaminados.
Animales nacidos entre 1994 y 1998
Son los animales que representan todavía un mayor porcentaje de los casos que se presentan
en la actualidad (hasta el 65%).
Las medidas para evitar la exportación de la enfermedad desde el RU se van haciendo más
efectivas a lo largo de este período (figura 4).
47
80
70
60
Embargo animal RU
50
Embargo Portugal
Identificación RU
40
Identificación UE
Embargo subpr RU
30
Doc. Normalizado
ANIMO
20
10
0
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001
Figura 4. Año de implementación de medidas para evitar la diseminación entre países
Se establecen los primeros programas de vigilancia y control en diversos países de la UE y
las primeras bases comunes de epidemiovigilancia a nivel europeo. Aparecen casos por
primera vez en Holanda, Bélgica, Luxemburgo y Liechtenstein.
En este período todavía existen claras deficiencias en las medidas para disminuir su
disminación mediante la alimentación animal. Así, aunque se prohíbe la alimentación de
rumiantes con subproductos de mamíferos en el año 1994 en toda la UE, esta medida no se
considera totalmente efectiva en algunos estados miembros hasta años posteriores. Hasta el
final de este período no se fijan claramente los métodos de tratamiento de los subproductos
que inactivan el agente causal y que tardarán también un tiempo en ser aplicados de forma
efectiva. También no se aplica de forma general, salvo en países como el RU y
posteriormente en Francia, Irlanda y Portugal, la eliminación de los materiales específicos
de riesgo de la cadena de alimentación animal.
Este período se caracteriza también por la posibilidad de contaminaciones cruzadas en la
fabricación, distribución y dispensación con piensos con destino a animales no rumiantes.
Así, se han descrito en diversos países diferencias de presentación de la enfermedad en
distintas zonas dependiendo, por ejemplo, de la carga ganadera de porcino (figura 5).
48
A.Allepuz, J.Casal, A.Alba, A.Picado
G.Fernández, 2004
1994-1998
Figura 5. Comparación del censo de porcino en Galicia con las zonas con mayor número de
casos de EEB de los esperados en los animales nacidos en el período 1994-1998
Animales nacidos entre 1998-2000
Estos animales representan en la actualidad un número menos importante de casos (hasta el
3,5%).
Esta época se caracteriza por la efectividad de las medidas para evitar la exportación de la
enfermedad y un mucho menor número de casos en el RU. Aparecen los primeros casos de
BSE en España, Dinamarca y Alemania.
80
70
60
50
Piensos rumiantes
Cont. Cruzada
40
Tratamiento
MER
30
20
10
0
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001
49
Figura 6. Año de implementación de medidas para evitar la contaminación de piensos en
relación a la EEB
También las medidas para evitar la diseminación de la enfermedad por medio de la
alimentación animal se desarrollan más eficazmente (figura 6), lo que se ha reflejado en
diversos estudios realizados en los que se ha observado una variación en el patrón de
presentación de los casos de EEB (figura 7) y en una disminución en los animales
confirmados con la enfermedad nacidos desde el inicio de este período (figura 8)
1998-2000
p
h
s
.
8
9
9
1
y
l
u
J
r
e
t
f
A
4
9
.
7
7
5
1
.
8
4
8.
1
.
62
05
11
-4.
8
9
.6
70
71
8
.
0
3
2
1
.
2
5
1
5
.
5
2
5
8
.
0
3
2
Allepuz A., Lopez A., Forte A., Fernández G., Casal J 2006
Figura 7. Distribución geográfica de los casos de EEB de los animales nacidos durante el
período 1998-2004 en Galicia.
50
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1985
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
Figura 8. Animales declarados con EEB en España según su año de nacimiento.
A pesar de ello sigue siendo posible la contaminación cruzada de piensos con los de otras
especies y no es efectiva hasta el final del período la eliminación de los materiales
específicos de riesgo en la alimentación animal.
Esto hace que a pesar de las medidas establecidas todavía exista un número de casos no
desdeñable de animales nacidos en este período.
Animales nacidos a partir del enero de 2001
Dada la mayor eficacia de las medidas ya tomadas y las establecidas a final del año 2000
(para evitar contaminaciones cruzadas y eliminación efectiva de materiales específicos de
riesgo) son muy pocos los casos presentados en la UE de animales nacidos en este período.
En la figura 8 se pueden observar la disminución de animales nacidos desde el año 1997
Sin embargo, como efecto de la situación de los años anteriores y al largo período de
incubación de la enfermedad, se producen la mayor presentación de animales detectados
con la enfermedad en la UE distintos al RU (figura 9).
51
1200
1000
800
600
400
200
0
-1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Figura 9: Nº de casos de EEB en la UE menos el RU según año de presentación
Por efecto de la situación anterior y, en algunos casos, la mejora de los programas de
vigilancia se presentan por primera vez animales con BSE en muchos países europeos como
Grecia, Italia, República Checa, República Eslovaca, Austria, Eslovenia, Finlandia y
Polonia. También este período se caracteriza por la presentación de los primeros bovinos
detectados en países no europeos como Japón, Israel, Canadá o Estados Unidos y la
aparición de un caso de EEB en un caprino en Francia.
A pesar del bajo número de casos de animales nacidos en esta época y el bajo riesgo que
representan para la salud pública, éstos tienen una gran significación dado el alto nivel de
implantación de las medidas de control. Este mismo hecho se está observando en el RU con
casos nacidos a partir de la prohibición efectiva. La existencia de estos animales con BSE
ha llevado a cuestionar diferentes aspectos de la enfermedad, como por ejemplo su origen
primario, la posibilidad de existencia de casos esporádicos, el papel de la transmisión
vertical o la eficacia total de las medidas establecidas hasta una fecha dada. Aún es pronto
para obtener conclusiones y debe seguir observándose y analizando la presentación de estos
casos y su evolución en el tiempo. También es necesario la vigilancia y el seguimiento de
casos de EEB en pequeños rumiantes.
52
CONCLUSIONES
La experiencia adquirida nos permite valorar la eficacia de las medidas tomadas hasta el
momento y la influencia que tuvieron tanto en la prevalencia de la enfermedad como en la
distribución de ésta según las características de los territorios.
La implantación de sistemas de identificación y trazabilidad del ganado, el replanteamiento
de la policía sanitaria en relación a la alimentación animal y los subproductos de origen
animal, entre otros aspectos, que aunque han sido establecidos en base a la aparición de esta
enfermedad se mantendrán en el tiempo ya que son básicos para la sanidad animal y la
salud pública.
Sin embargo, la realidad epidemiológica de la enfermedad y la situación en cada estado
debe estudiarse y tenerse en cuenta a la hora de el mantenimiento de algunas medidas más
específicas.
La posibilidad de categorizar los estados según el riesgo, el desarrollo de nuevas técnicas
para la detección en piensos y materias primas de proteínas de origen animal, o para
tipificar cepas de encefalopatías espongiformes bovinas o para detectar animales infectados
“in vivo” y la evolución de la enfermedad, pueden permitir el establecimiento de medidas
adecuadas al riesgo en relación a los materiales específicos de riesgo, el tratamiento de
subproductos o los sistemas de vigilancia y medidas de erradicación. En definitiva adecuar
la estrategia a la nueva situación, de forma que asegurando la salud pública permita
desarrollar las actuaciones de una forma y con un coste proporcionado al riesgo.
BIBLIOGRAFÍA:
1-Abrial D., Calavas D., Jarrige N., Ducrot C. 2005. Spatial heterogeneity of the risk of
BSE in France following the ban of meta and bone meal in cattle feed. Prev. Vet. Med., 67,
69-82.
2-Allepuz A., Fernández G., Alba A., Casal J. 2005. Etude de la distribution spatiale des cas
déncéphalopathie spongiforme bovine (ESB) en Galice (2000-2004). Epidémiol. Et santé
anim. 47, 141-150
3-Allepuz A., López A., Forte A, Fernández G., Casal, J. 2006. Análisis of the geographical
distribution of the BSE risck on Galicia (Spain). 14 Congreso Internacional de la
Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes. Lugo-Santiago de
Compostela, Spain.
3- Baron T., Calavas D. 2005. Léncéphalopathie spongiforme bovine. Pathologie Biologie
53, 229-236.
4-Comisión Europea. 2005. “Hoja de ruta” para las EET. Bruselas. COM (2005) 322 final.
5-Comisión Europea. 2005. Report on the monitoring and testing of ruminants for the
presence of Transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in the EU in 2004.
Luxemburgo.
6-Cuenot M., Didier C., Abrial D., Gasqui P., Cazeau G., Ducrot C. 2003. Temportal and
spatial patterns of the clinical surveillance of BSE in France, analysed from January 1991 to
May 2002, trough a vigilance index. Vet. Res., 34, 261-272.
7-Defra.
2005.
Bovine
Spongiform
Encephalopathy
(BSE).
http://www.defra.gov.uk/animalh/bse/index.html.
8-Heim D., Mumford E. 2005. The future of BSE from the global perspective. Meat Science
70, 555-562.
53
9-Hoinville J.J. Declene in the incidence of BSE in cattle born after the introduction of the
feed ban. 1994. Vet. Rec., 134, 274-275.
10-Stevenson M.A., Morris R.S., Lawson A.B., Wilesmith J.W., Ryan J.B.M., Jackson R.
2005. Area-level risks for BSE in British cattle before and after July 1988 meat and bone
meal feed ban. Prev. Vet. Med., 69, 129-144.
54
CALIDAD DE LA CARNE DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS
SÁNCHEZ, L.
Dpto. Anatomía y Producción Animal. Facultad de Veterinaria. 27002 LUGO
Teléf. +34-982-252231 Ext. 22400. Fax 982-252195. E-mail [email protected]
I.- Situación actual del mercado
En el mercado actual de la carne bovina existen tendencias en las preferencias del consumo
que pueden ser interesantes para elaborar las estrategias del comercio a medio plazo. Nos
referimos a aspectos tan importantes como la calidad, la seguridad y la salud de los
consumidores.
Nuestros ciudadanos tienen unas legítimas elevadas expectativas en relación con la
seguridad y la calidad de sus alimentos. Los modernos sistemas de producción y las actuales
estructuras de comercio permiten que haya una transparencia total, no sólo en cuestiones
relacionadas con la salud de los animales y la seguridad de los alimentos, sino también por
lo que se refiere a unas normas de producción que respeten el medio ambiente y el bienestar
de los animales. Para cumplir estas expectativas y tener en cuenta el progreso técnico de los
últimos años, la UE ha llevado a cabo una profunda revisión de su legislación en el ámbito
de la seguridad alimentaria. Actualmente, este proceso de reforma ha finalizado casi
totalmente.
La nueva legislación alimentaria de la UE insiste mucho en los procesos de control a lo
largo de toda la cadena alimenticia, desde la granja hasta la mesa. La legislación alimentaria
general apoya una buena circulación de la información y una gestión de la calidad. Esta
filosofía refleja las exigencias de los consumidores y explota las oportunidades que ofrece
el progreso técnico. Es evidente que con controles únicamente sobre el producto final no se
podría proporcionar el mismo nivel de seguridad, calidad y transparencia al consumidor.
Conviene recordar que la reordenación de la política de producciones de la U.E. y
los últimos acontecimientos ocurridos en relación con la seguridad alimentaria, han hecho
reaccionar a productores y consumidores, reivindicando unas orientaciones más positivas y
acomodadas a las situaciones del mercado. Esta circunstancia ha motivado que los sólidos
cimientos que representan la ganadería tradicional vuelvan a tener actualidad, representando
por si mismas la salubridad de los alimentos producidos en esos tres signos que el
consumidor valora: sano, bueno y natural.
Como soluciones inmediatas, las autoridades comunitarias han reconducido los apoyos y
estrategias, fomentando la diversificación de las producciones para conseguir un mayor
equilibrio en el mercado entre la oferta y la demanda, pero más específicamente de los
productos que presentan determinadas características con connotaciones de calidad y
garantía de origen geográfico; la mayor parte de ellos proceden incluso de zonas poco
favorecidas y más periféricas, con lo que su promoción y mayor valor económico podría
asegurar una mejora de la renta de los ganaderos y el asentamiento en las poblaciones
rurales. Con esta filosofía se ha emitido el Reglamento (CE) Nº 510/2006 sobre la
protección de las indicaciones geográficas y de las denominaciones de origen de los
productos agrícolas y alimenticios.
Paralelamente se está observando que los consumidores tienden a otorgar mayor
importancia a la calidad que a la cantidad, polarizando su demanda en productos de un
origen determinado. Estamos en un momento en el que, junto a la mayor atención que se le
55
presta a las características perceptibles con los sentidos, se han puesto de manifiesto las
preocupaciones por la salud, por el medio ambiente, por la región productora y por las
cuestiones éticas incluso, como el bienestar de los animales.
Se quiere la calidad completa, tanto técnico-económica, como organoléptica,
sanitaria, dietética, nutritiva, culinaria o gustativa. Se desea, en definitiva, la calidad total,
influenciada por características y éstas por atributos que vienen a representar indicadores de
esa calidad. La más idónea combinación de estos indicadores, según la actitud de los
consumidores, nos va a proporcionar la mejor aceptabilidad de la carne(Sánchez, 1997).
Como consecuencia de los diferentes sistemas de producción y de las razas
utilizadas para desarrollarlos, el mercado de la carne presenta una gran heterogeneidad en
cuanto a los caracteres cuantitativos y cualitativos que definen los diferentes tipos de
canales comercializadas. Esta gran variabilidad, lejos de constituir un inconveniente para la
comercialización, representa de alguna manera, una cierta ventaja, por cuanto permite
ofrecer al mercado carnes marcadamente diferentes, que pueden satisfacer las más
encontradas diferencias de la demanda.
Sin embargo, cada día se pone más de manifiesto que esa oferta diversificada de la
carne debe de estar garantizada al comprador por unas cualidades y características
específicas, que en definitiva se van a relacionar con la categorización y calidad del
producto. Esta calidad va a depender directamente del tipo genético y de las prácticas de
explotación, en la proporción aproximada del 30 y 70%, respectivamente.
La raza es responsable de variaciones importantes en dos caracteres de la canal que
condicionan su calidad: la conformación y composición en carne, hueso y grasa, según el
gusto del consumidor. En un sistema determinado de producción, donde se presentan en
armonía los caracteres enumerados, éstos van a significar los criterios básicos que
prevalecen en todos los sistemas de valoración implicados en el comercio de la carne.
El sistema de producción, entendido como el conjunto de técnicas o peculiaridades
concernientes al manejo, alimentación, selección y reproducción que se realizan en el
ganado en función de la ecología y de los condicionamientos socio-económicos de una
determinada área geográfica, conlleva y determina sobre las canales dos características
cuantitativas de gran importancia económica: el peso de la canal y su edad cronológica, de
las que van a depender factores tan determinantes de la calidad como es la terneza. El
sistema de alimentación y manejo, lactación y suplementación natural, proporciona a su vez
algunos de los más importantes parámetros que influyen en la calidad de la carne, como son
el olor, aroma y sabor.
En las razas autóctonas de ganado (Sánchez, 1998), la producción especializada de
carne, viene a representar el principal aval de calidad, al poseer unas características
diferentes y diferenciadas de otras razas (composición de los tejidos, tamaño de la fibra
muscular, etc.), a las que se unen todas aquellas que se producen como consecuencia de un
manejo y alimentación tradicional (color del músculo, jugosidad, terneza y composición de
la grasa intramuscular).
Estos aspectos se han hecho valer por los ganaderos de las diferentes razas y se han
acogido al régimen de Denominaciones de Origen y Denominaciones Genéricas y
Específicas con el fin de hacer posible la diferenciación de las carnes que por sus
características raciales y de producción presentan una elevada calidad comercial.
56
Con los actuales planteamientos de mercado, hay que aceptar como muy válida la vieja
definición de calidad de la carne: Poder de atracción sobre el consumidor y capacidad para
satisfacer a éste cuando se convierte en consumidor. En la confluencia de estos dos factores
está la clave del éxito.
Conocer el grado de preferencias del consumidor significa la primera garantía que asegura
de alguna manera la mejor oportunidad de venta de la carne, sobre todo si ha existido o
completado una o varias fases de promoción del producto.
La Comisión Europea ha difundido unos estudios sobre el impacto de las campañas
promocionales de la carne de vacuno entre la población europea y los resultados son
altamente clarificadores.
En los quince países miembros de la U.E., cinco de cada diez europeos han oido hablar de
los productos con Denominaciones de Origen, cuatro de diez los han comprado alguna vez
y uno de cada diez los compra habitualmente. La encuesta indica que más de la mitad de los
europeos están dispuestos a pagar un poco más por estos productos.
El grado de conocimiento en España es mayor. El 88,7% de los encuestados valoran estas
campañas bien o muy bien y le resultan agradables de oir o ver (73,1%), las entiende bien
(89,8%) y le resultan informativas (80,6%).
La mayoría compra carne de vacuno, con una frecuencia de 7 o menos días (64,3%),
generalmente en la carnicería (70%) y en menor medida en supermercados o autoservicios
(25,4%). El tiempo medio que pasa entre que se compra la carne y se consume en el hogar
es de dos tres días para un 45,8% y de un día para un 40,3%.
Casi dos tercios de las personas que en alguna ocasión realizan la compra de productos de
alimentación opina que es imprescindible que la carne tenga un certificado de calidad
(63,1%) y un 32,2% cree que es bueno pero no imprescindible. Sin embargo, el consumidor
se fija habitualmente en determinadas características o particularidades, principalmente el
color, textura y cantidad de grasa, y en función de ellas realiza la elección, si tiene la
confianza necesaria en el producto o en el punto de compra.
Según la encuesta a la que nos estamos refiriendo, el color (77,5%), el corte de la carne
(51,1%) y le que no tenga grasa (45,1%), son los aspectos en los cuales se fija más la gente
a la hora de comprar carne de vacuno. El precio del kilo (34,6%), el tamaño del corte
(32,6%), la certificación de calidad (28,7%) y su lugar de procedencia (28,1%) son otros
aspectos a destacar.
Por lo que se refiere a la comparación de diferentes carnes, para la mayoría de la población
(68,7%) la carne de pollo es la más barata, si bien el 34% considera que la carne de vacuno
es la más sana. La carne de pollo es la más digestiva para un 51,9% de la población,
mientras que el 19,6% opina que es la carne de vacuno. Esta última es la preferida por el
37,2 de las personas siendo el pollo la preferida para el 19,3% y el cordero para el 20,1%.
La carne más consumida para la población es carne de vacuno con un 40,3% mientras que
el pollo lo es para el 29,2% .
57
A modo de resumen, y según los resultados de esta encuesta, se puede decir que los
consumidores valoran muy positivamente las carnes procedentes de las razas autóctonas,
con marca de calidad y que su atracción la polariza en el color, textura y contenido en grasa,
II. Características de calidad de la carne de las razas autóctonas
Las canales que proporcionan las razas autóctonas son de bovino joven y en su mayor
porcentaje están incluidas en la clasificación U de conformación, y 2-3 de estado de
engrasamiento, mejorando esta valoración con la edad, ya que las canales se hacen más
largas, espesas, profundas y compactas. La misma tendencia se observa en el color del
músculo, sobre todo en el grado de saturación del color, que se va haciendo más rojo a
medida que el animal se hace mayor.
En cuanto al color de la carne, se puede apreciar que los animales sacrificados a los diez
meses presentan un color claro (L = 41,08 en los machos y L= 38,48 en las hembras) con un
índice de rojo medio (a*= 9,70 en los machos y a*= 12,05 en las hembras), y por lo tanto
rosada, y con un elevado índice de amarillo (b*= 9,17 en los machos y b*=10,38 en las
hembras). La mayor luminosidad, tono y porcentaje de pigmentos hemínicos conducen a
que en los terneros de cría semiextensiva exista una mayor estabilidad del color.
El efecto del sistema de producción, época de nacimiento y año no parecen influir en la
jugosidad y terneza de la carne, si bien las mejores características de la terneza se
presentaron en las terneras de diez meses de edad, con un valor de fuerza de corte de 46,94
N/cm2.
El color de la carne es el criterio principal con el que los consumidores evalúan la calidad
de la carne y su aceptabilidad, incluso puede llegar instintivamente, a relacionarlo con la
terneza, grado de frescura y hasta con su sabor, aroma y jugosidad. De las características
organolépticas de la carne, quizás sea el color junto a la terneza, las que más influyen como
elementos o criterios para su elección por parte del consumidor.
Desafortunadamente, aunque el color rojo vivo de la carne es atractivo psicologicamente y,
por lo tanto influye, de una manera importante en la formación del precio de la canal, no
tiene por que ser el mejor indicador de la terneza, frescura u otras propiedades como el
flavor o la jugosidad. Decimos desafortunadamente, porque en España se produce un tipo
de carnes con menos intensidad de color, pero con unos buenos componentes de calidad.
Las preferencias de color por parte del consumidor varían entre países e incluso dentro del
mismo país según el hábito de consumo, nivel cultural, perjuicios adquiridos, etc.. El
consumidor español ha considerado durante mucho tiempo como favorable el color blanco
de la carne, ya que el mismo lo asocia a una edad joven del animal y con ello a una carne de
mayor terneza.
Frente a este comportamiento, en los países europeos de nuestro entorno se consume carne
de color rojo o rojo vivo, procedente de animales de más edad y con otros sistemas de
acabado.
En la actualidad, y con la introducción de un sentido más personal en los hábitos de
consumo, el propio consumidor ha manifestado un nuevo comportamiento que incluye la
valoración de todos los elementos de calidad de la carne. Con ello ha descubierto que las
carnes rosadas tienen tanto sabor y aroma como las carnes oscuras, pero con la ventaja de
que son más tiernas y con más atractivos culinarios.
58
Estos supuestos en el comportamiento de los consumidores han sido ratificados en España
por encuesta profesionalizada (Sánchez, 1994).
Por regla general, los sistemas de clasificación conceden una mejor puntuación a los colores
claros, por el rechazo del consumidor a las carnes de colores oscuros, que lo asocia con
carnes de animales viejos o alterados. Por estas inclinaciones del consumidor, aún llenas de
subjetivismo, había que considerar el color de la carne como criterio de clasificación,
aunque con sentido opcional, tal como lo contempla la normativa de la Unión Europea.
Además es una característica tridimensional, como la de todos los objetos que consta de un
atributo de calidad y dos atributos cromáticos (tono y saturación).
El color es una característica subjetiva, que depende de fenómenos puramente cerebrales
consecuencia de la excitación de ciertos centros del cortex por influjos nerviosos
procedentes de células fotosensibles de la retina. El color de un objeto dependerá pues de la
fracción de luz reflejada por él en cada longitud de onda de la distribución espectral de la
luz. En consecuencia, sus atributos son la claridad, tono, saturación y cromaticidad.
La claridad es el atributo que hace corresponder a cada color una equivalencia con una
escala de grises o bien la intensidad del color o cantidad de luz reflejada. Para nuestro caso,
se corresponde con el estado físico de la carne, especialmente de su superficie, ligada al pH
y otros factores postmortem que determinan el grado de hidratación y estado de las
proteínas musculares (Sañudo, 1990).
La intensidad del color aumenta con el contenido en mioglobina y depende de la
microestructura del músculo, que está a su vez influenciado por el pH: la intensidad del
color aumentará con el pH, dándonos carnes oscuras a partir de 6. La tonalidad variará en
función del estado de oxigenación u oxidación de la mioglobina: la mioglobina reducida no
oxigenada es rojo púrpura, la mioglobina reducida oxigenada es rojo vivo, mioglobina
oxidada es rojo oscuro y entraña una reacción de rechazo por el consumidor.
Debido a la preferencia por el color rojo brillante de la oximioglobina, la mayor parte de la
carne fresca se envasa con envolturas permeables al oxígeno (embarquetados), para su venta
en las grandes superficies. Por el contrario si la carne se envasa al vacío, el oxígeno no tiene
acceso a la carne y la actividad residual de los enzimas citocromo reducen la pequeña
cantidad de metamioglobina que pueda formarse en estas circunstancias y la convierten en
mioglobina de color rojo púrpura. Después se pueden dejar reoxigenar para la venta
quitándole la película, con lo cual se recupera el color rojo brillante de la oximioglobina.
Este proceder podría servir de base para el envasado centralizado de carne con IGP o DE
para su exportación, reservándose los embarquetados para las ventas en supermercados e
hipermercados.
La terneza mide la facilidad con que una carne puede ser masticada. Después del color, esta
cualidad es considerada como la más primordial por la mayor parte de los consumidores, de
manera que si la carne no es tierna se rechaza sistemáticamente aún cuando sea jugosa y
con buen sabor. La terneza varía con la cantidad y calidad del tejido conjuntivo y con el
grado de alteración de las proteínas estructurales en el curso de la maduración.
El tejido conjuntivo contiene esencialmente dos proteínas fibrilares, el colágeno y la
elastina. El colágeno es el principal responsable de la “terneza de base” de la carne, que
después va a estar afectada por la maduración, habiendo una relación estrecha entre la
terneza y el contenido en colágeno, que, por cierto, varía mucho de un músculo a otro. Sin
59
embargo, la cantidad de colágeno no es suficiente para explicar las variaciones de la
terneza, porque la dureza del músculo aumenta con la edad sin variación importante del
contenido total (Kopp, 1971). De otra parte, las características cualitativas del colágeno
juegan también un papel importante, fundamentalmente en el número y naturaleza de los
enlaces intermoleculares.
Las diferencias raciales son importantes para la terneza (May et al., 1975), habiéndose
observado que aumenta con el desarrollo muscular y disminuye en función del contenido de
colágeno (Boccard et al., 1980).
La jugosidad de la carne comprende dos acontecimientos simultáneos. El primero consiste
en la liberación del agua al comienzo de la masticación; el segundo es más prolongado y
resulta de la estimulación de la salivación por los lípidos. La jugosidad como cualidad
organoléptica depende entonces del poder de retención de agua, de la cantidad y, puede ser,
que de la naturaleza de los lípidos de la carne.
Las diferencias de jugosidad entre músculos de un mismo animal están todavía muy mal
explicadas. Se puede pensar que los factores que influencian el poder de retención de agua
afectan igualmente a la jugosidad. Sin embargo, el pH que es uno de los principales
determinantes del poder de retención de agua, tiene poca influencia sobre esta cualidad
organoléptica (Dransfield, 1981).
Pürchas y Davies (1974) discutieron la relación de la grasa intramuscular, sobre la base de
sus propias observaciones y muchos otros autores, y concluyen que existe una pobre
relación entre la tasa de este componente y la jugosidad en los bovinos. Lo que sí parece
estar más claro es que igual que el flavor , la jugosidad aumenta con el metabolismo
oxidativo (Valin et al., 1982).
El flavor de la carne está determinado por la composición química y los ingredientes
aportados a esta última por la cocción.
Los músculos presentan grandes diferencias de flavor. Por ejemplo, los músculos diafragma
o recto abdominal están considerados de tener un flavor mucho más desarrollado que el
psoas. El tipo metabólico parece ser un factor muy importante (Valin et al., 1982) y más
concretamente la grasa intramuscular y sobre todo la fracción fosfolipídica (Mottram y
Edwards, 1983), cuya tasa crece con la intensidad del flavor aumenta con la actividad de
este metabolismo.
Los perfiles de ácidos grasos obtenidos en la raza Rubia Gallega nos indican una
buena palatabilidad de la carne debido al nivel oleico. También son favorables los niveles
de ácidos grasos saturados, sobre todo el palmítico, teniendo en cuenta la influencia que
ejercen sobre los niveles de colesterol. Lo mismo ocurre con los niveles de araquidónico,
cuya importancia radica en el hecho de ser precursor de una gran variedad de eicosanoides,
que gobiernan la función inmune y otros factores como la presión sanguínea y la
contracción de ciertos músculos lisos. En cuanto a la proporción insaturados/saturados
representa un índice parámetrico positivo para la raza, ya que los ácidos grasos más
importantes por su cantidad e influencia en la jugosidad, como son el oleico (con valores
entre el 31,50 en machos de diez meses y 34,08 en hembras de siete meses) y palmítico
(cuyos niveles oscilan entre el 22,98 en hembras de siete meses y el 24,75 en hembras de
diez meses) tienden a permanecer estables. Los niveles de los ácidos eicosapentaenoico y
60
docosapentaenoico, resultan muy interesantes por sus efectos beneficiosos en la protección
contra enfermedades cardiovasuclares.
En este sentido, deberíamos considerar valor nutritivo y dietético que tiene la carne. Las
motivaciones de los humanos sobre las preferencias alimenticias no siempre coinciden
plenamente con las leyes de la alimentación, ya que se rigen fundamentalmente por las
necesidades fisiológicas, en especial el hambre, por el placer sensorial (gusto, olfato), placer
psicológico (promoción, distinción social), calidad de vida y precios (economía de tiempo y
esfuerzo en la preparación culinaria familiar) y por el temor a las enfermedades
(cardiovasculares, hipertensión, obesidad, aterosclerosis, etc.) que viene a representar la
característica de mayor valor en la calidad dietética.
Cada vez es mayor la atención que se presta a la ingesta de grasa, especialmente de origen
animal, sobre las enfermedades cardiovasculares y la relación de estas enfermedades con los
niveles de colesterol en la sangre.
Actualmente se cree que los ácidos grasos saturados, principalmente el palmítico, pero no el
esteárico, al parecer debido a su rápida conversión en oleico son los responsables en los
sujetos susceptibles, de la elevación del nivel de colesterol de baja densidad (LDL) que se
consideran negativas con respecto al nivel de colesterol y a la aparición de enfermedades
cardiovasculares.
Los ácidos grasos insaturados parecen tener un efecto opuesto, disminuyendo el nivel de
colesterol y de LDL. Los ácidos grasos poliinsaturados, de los cuales el linoleico es el más
importante desde el punto de vista cualitativo, parecen reducir al mismo tiempo la
concentración de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) que se consideran beneficiosas
en relación a la aparición de problemas cardiovasculares.
El ácido oleico, monoinsaturado, reduce el nivel de LDL y no el de HDL, por lo que se
considera más beneficioso. Ello explica la bondad atribuida al aceite de oliva frente a otros
aceites con contenido de ácido oleico inferior, como el de soja, el de girasol normal y el de
maíz. En todo caso, parece que la proporción LDL/HDL, que es más importante que la
cantidad de HDL, se ve reducida por los ácidos grasos poliinsaturados, por lo que pueden
considerarse beneficiosos desde este punto de vista.
Algunos ácidos grasos presentes en el pescado, especialmente pescado azul, como el
eicosapentaoico y el docosahexanoico, tienen propiedades antiagregantes de las plaquetas,
por lo que se consideran beneficiosos en la protección contra las enfermedades
cardiovasculares. El ácido linolínico (18:33) es un precursor metabólico y se encuentra en
algunos aceites vegetales.
A partir de estos conceptos pueden comprenderse los esfuerzos que se están realizando para
conocer la composición de la grasa de la carne en sus diferentes orígenes con el objeto de
mejorar la calidad dietética.
Quizá haya llegado el momento en el que el consumidor conozca, en cada carne de calidad,
su perfil de ácidos grasos como indicador más de esa calidad.
Las nuevas tendencias en los hábitos de consumo, a las que hemos hecho mención, nos
muestran un cambio importante en el tipo de animales y razas utilizadas para la producción
actual de carne bovina con una clara orientación hacia canales magras, con lo que el
producto consumido es muy diferente del que hace solamente 10 ó 15 años encontrábamos
en el mercado. Las diferencias conciernen, en particular, al componente lipídico en el que se
61
aprecia no sólo una disminución del contenido total de los lípidos (y del colesterol, por
supuesto) sino también un cambio sorprendente en la composición de los ácidos grasos.
Resulta profundamente modificada la relación existente entre las clases de ácidos grasos ,
con un aumento significativo del componente poliinsaturado y, en particular del ácido
linoleico. Este panorama, sin lugar a dudas positivo desde el punto de vista nutricional,
puede evidenciarse en algunas carnes en España como la Ternera Gallega, cuyos
porcentajes de ácidos grasos indican que la mayor proporción es de oleico (41,35),
siguiendo en cantidades porcentuales importantes el palmítico (24,18), esteárico (17,28) y
linoleico (4,35),
El incremento de la concentración de oleato influencia la palatabilidad y percepción de la
carne, de manera que, a medida que aumenta el porcentaje, se mejora la puntuación en los
paneles de cata. Las buenas proporciones de oleico en la carne de Ternera Gallega puede ser
una de las razones de su aceptación en el mercado por parte del consumidor, ya que esta
cantidad no debe de tomarse en términos absolutos sino en relación proporcional con los
contenidos de mirístico (2,59) y palmítico (24,18).
De otra parte, también hay que recordar que la proporción de jugos en el longissimus dorsi
está correlacionada negativamente con los contenidos de mirístico y palmítico y
positivamente con la relación de ácidos grasos insaturados/saturados, con lo que la
jugosidad de la Ternera Gallega (12,5) podría ser una de las consecuencias de la
composición de la grasa intramuscular y uno de los factores de influencia en la percepción
positiva del consumidor. De ahí, su importancia en utilizar estos atributos como indicadores
de calidad debidamente combinados con otros de tipo sensorial, higiénico o los que se
encuentran dentro del plan dietético que ya hemos comentado, incluyendo, por supuesto, los
de carácter positivo que influyen favorablemente en la salud y en el mejor desarrollo del
cuerpo humano.
Precisamente estos últimos conceptos, los que descubren la bondad de la carne, son los que
el consumidor conoce poco, nada o de forma muy general por que van a representar,
posiblemente, nuevos indicadores de la calidad de la carne que deben transmitirse
adecuadamente.
Los consumidores tienen que saber que con la disminución en el consumo de carne
(tendencia que actualmente se detecta) puede provocar en su cuerpo un estrés oxidante. El
estrés oxidante, agudo o crónico, influye de manera esencial en numerosos procesos
patógenos. Las investigaciones sobre la compleja correlación existente entre la nutrición
individual y el entorno de las que nos habla Kuklinski (1997), llegan a la conclusión de que,
en los seres humanos, en los países de industrialización avanzada, con áreas
tecnológicamente densas, está aumentando el riesgo de estrés oxidante. Los recortes en la
dieta pueden deteriorar el equilibrio Redox en vivo, por aporte insuficiente de
oligoelementos, selenio y zinc.
El aumento de colesterol, que depende de la edad, refleja una reacción de adaptación contra
el estrés oxidante y el colesterol protege las dobles capas fosfolipídicas contra los daños que
causa la oxidación. La disminución drástica del consumo de carne es un camino
equivocado, dado que el estrés oxidante secundario, por inducción, revela propiedades
aterogenéticas e inmunosupresoras. Se ha constatado un efecto protector del colesterol
contra el estrés oxidante, al igual que una correlación inversa, existente entre la
62
concentración de colesterol de membrana y el grado peroxidación de los lípidos en los seres
humanos.
El consumo de carne, al que nos estamos refiriendo, tiene también una relación importante
con el nivel de hierro, que el consumidor no se ha parado a pensar o no conoce.
Un nivel de hierro no adecuado, como el que se mide con la ferritina plasmática, que refleja
las reservas existentes en el hígado, es un problema generalizado en las mujeres jóvenes y
en los niños. En el estudio más reciente de la UE, un niño de cada ocho, con edad
comprendida entre el año y medio y los dos años y medio, presentaba niveles de
hemoglobina en la sangre inferiores a 11,0 g/dl, el nivel de anemia, según la definición de la
OMS. Un niño de cada cinco tiene un bajo nivel de hierro (ferritina plasmática < 10 ug/l).
Unas escasas ingestas de hierro protoheme, la forma de hierro que se encuentra en la carne,
se conectaron cos estas anomalías del nivel de hierro. Una reciente investigación que se
efectuó en Irlanda demostró un elevado predominio del bajo nivel de hierro en las
adolescentes y, una vez más, se indicó una significativa conexión existente entre la ingesta
de hierro procedente de la carne (hierro protoheme) y el bajo nivel de hierro. Dado que el
bajo nivel de hierro, al principio del embarazo, repercute seriamente en el peso del recién
nacido, ello representa un problema para la salud pública. Un nivel de hierro igualmente
bajo en los niños aumenta significativamente el riesgo de una escasa capacidad cognoscitiva
y de aprendizaje. Y ésta es, asimismo, otra cuestión que hay que analizar, como nos dice
Gibrey (1997)y, porque el consumidor se muestra muy sensible a todos los aspectos
relacionados con la salud, desde la gestación y durante lactancia hasta la senectud.
A causa del requerimiento proteico durante el embarazo, generalmente, todos están de
acuerdo sobre el hecho de que el RDA de proteínas debería contener, como mínimo, el 5065 por ciento de carne. Las proteínas de la carne presentan una mejor biodisponibilidad y
compatibilidad. La carne es la mejor fuente de aminoácidos esenciales y de varias vitaminas
y minerales. Entre éstos se encuentran el hierro, el zinc, el cobre, el selenio y las vitaminas
hidrosolubles. Al revés de la creencia más generalizada, los requerimientos de nutrientes, de
costumbre, no se duplican durante la gestación. Solamente el requerimiento de hierro, ácido
fólico y vitamina D aumenta en un 100% respecto a los niveles normales. Otros nutrientes,
como el calcio, la tiamina y la vitamina B6 aumentan en un 33-50 por ciento. Las proteínas,
el zinc y la riboflavina aumentan en un 20-25% aproximadamente, mientras que la energía,
el selenio, el magnesio, el yodo, la vitamina PP y las vitaminas A, B12 y C aumentan en un
18 por ciento o menos. Afortunadamente, todos estos nutrientes se dan en cantidades
abundantes y están biodisponibles en la carne, por ello, se aconseja la ingesta de cantidades
suplementarias de estos alimentos, durante la gestación y durante los primeros seis meses de
la lactancia.
Asimismo, la carne, como fuente de proteínas de primera calidad, va a influir
favorablemente en el crecimiento de los niños, el desarrollo de los jóvenes y en la mejor
alimentación de los ancianos.
El papel de la carne en el crecimiento del niño está relacionado con el incorrecto aporte
calórico y/o proteínico. La deficiencia en la estatura, concomitantemente con la
malnutrición calórico-proteica se caracteriza, a nivel hormonal, por las elevadas cifras de
hormona del crecimiento (GH), tanto basales como de estímulo específico. Sin embargo, las
somatomedinas (IGF) resultan muy bajas. Ello permite sacar la conclusión de que la
malnutrición puede ser considerada como una forma de insensibilidad a la GH, o bien, una
63
respuesta de adaptación del organismo que desvía la acción de la GH del crecimiento a la
supervivencia, aprovechando su capacidad lipolítica y anti-insulina. Dichas variaciones se
ven corroboradas por las modificaciones de los niveles plasmáticos de las proteínas
aglutinantes de las somatomedinas (BP o hinding proteins), que contribuyen a realizar esa
acción de “desvío” de las funciones de la IGF (Quaas, 1997).
Para los jóvenes, un aporte suficiente y equilibrado de carne es fundamental para un
correcto desarrollo del cuerpo, aspecto éste que deberá cuidarse mucho más en la tercera
edad, ya que los ancianos, por lo general, poseen un recambio de proteínas más bajo que el
de los jóvenes adultos y necesitan una ingesta más elevada de proteínas para conservar el
balance de nitrógeno.
Por lo tanto, podemos sacar la conclusión de que la carne y los productos cárnicos son una
fuente rica en micronutrientes (biodisponibles), que se insertan adecuadamente en una dieta
equilibrada y sana, y que este concepto puede servir como indicador de calidad más para
transmitir al consumidor.
Todos los indicadores de calidad de la carne que hemos descrito o comentado, están siendo
estudiados en las razas, lo que permitirá utilizarlos adecuadamente para mejorar la
confianza del consumidor.
Explotación extensiva de las razas autóctonas, complementando su cebo con alimentos de
suministro propio y comercialización de productos tradicionales de calidad, serán las claves
para el futuro.
BIBLIOGRAFÍA
Boccard, R.; C. Valin & B. Bonaiti (1980). Effect of genotype on pigment, lipid and
collagen content of the longissimus dorsi muscle in young bulls. 26e Congrés Europ.
Chercheurs Viande, Colorado Springs, 1: 271-274.
Brea, M.T. 1993. Efecto del pastoreo rotacional y continuo en un sistema de producción con
vacas de carne y su posible influencia en las características de la pradera. Tesis Doctoral.
Univ. de Santiago de Compostela.
Calvo, C. 2001. Estudio del crecimiento y de las características de la canal y de la carne del
ternero Rubio Gallego acogible a las primas de la PAC en rebaños de vacas nodrizas. Tesis
Doctoral. Fac. Veterinaria. Lugo.
Dransfield, E. (1981). Eating quality of dark-cutting beef. Curr. Top. Vet. Med. Anim. Sci.,
10: 37-57.
Gibrey, M.J. (1997). Relación existente entre el consumo de carne y el nivel de hierro. Ist
European Beef Congress. Venecia (Italia).
Kopp, J. (1971). Evolution qualitative du collagène musculaire de bovin en fonction de
l’âge des animaux. Consequences sur la tendreté de la viande. Bull. Techn. C.R.Z.V. Theix,
5: 47-54.
Kuklinski, B. (1997). Estrés oxidante provocado por la disminución de la carne en la
alimentación. Ist European Beef Congress. Venecia (Italia).
May, M.L.; M.E. Dikeman & R.R. Schalles (1975). Histology of exotic cross bovine
muscles. J. Anim. Sci., 41: 298 (Abstract).
Monserrat, L & Sánchez, L. 2000. Sistemas de producción de carne en pastoreo con Rubia
Gallega. Bovis, 92: 23-34.
64
Monserrat, L. 1990. Sistemas de producción de carne con vacas madres en Galicia. Mundo
Ganadero, 4: 35-43.
Mottram, D. S. & R.A. Edwards (1983). The role of triglicerides and phospholipids in the
aroma of cooked beef. J. Sci. Fd. Agric., 34: 517-522.
Pürchas, R.W. & H.L. Davies (1974). Meat production of friesian steers: the effect of
intramuscular on palatibility and the effect of growth rates on composition changes. Aust. J.
Agric. Res., 25: 667-677.
Quaas, L. (1997). Aspectos del consumo de la carne en las mujeres durante la gestación y
durante la lactancia. Ist European Beef Congress. Venecia (Italia).
Sánchez, L. (1997). Combinaciones actuales de los indicadores de calidad de la preducción
de carne de vacuno. Buiatría Española, 7 (2 A): 7-26.
Sánchez, L. (1994). La raza Rubia Gallega como productora de carne de calidad. Feagas, 2.
37-39.
Sánchez, L. (1998). Razas autóctonas y calidad de la carne. Feagas, 13. 10-14.
Sánchez, L. 2000. Modelo de la empresa familiar en la producción de carne de vacuno en
extensivo. Congreso Internacional de Producción y Sanidad Animal. Barcelona: 640-652.
Sánchez, L. 2001. Calidad de la carne y sistemas de producción en la raza rubia gallega.
Primeras Jornadas Ibéricas de Razas Autóctonas y Productos Tradicionales. Elvas.
Portugal.
Sañudo, C.; P. Alberti; J.L. Olleta & P. Santolaria (1990). Influence de la alimentation el de
l’individu sur l’evolution pendat la maduration, de la coleur de la viande bovine. 41 Annual
Meeting de EAAP. Toulouse.
Valin, C.; C. Touraille; P. Vigneron & C.E. Ashmore (1982). Prediction of lamb meat
quality traits based on muscle biopsy fibre typing. Meat Sci., 6: 257-263.
Zea, J.; Diaz, M.D. 1990. Producción de carne con pastos y forrajes. Ed. MundiPrensa.
65
POSIBILIDADES Y FUTURO DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS DE PRODUCCIÓN
CÁRNICA
POSSIBILITIES AND FUTURE OF LOCAL BREEDS OF MEAT PRODUCTION
LORENZO MONSERRAT BERMEJO
Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo. Apartado 10, 15080 A Coruña, España.
E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Because of its adaptation to environmental conditions, common location in less-favoured
areas and highlands where another more profitable agrarian speculation is not competitive,
the frequent necessity of the farmer presence to its managing and the necessity of growing
high biologic value food, local meat breeds are a very important resource for the country
development in less-favoured areas, so their possibilities are attached to:
I) The acknowledgment of their utility in mountain areas to fix population, to protect the
environment and to improve the landscape and biodiversity.
II) The production of singular food with very good quality, traded as IGP (Geographic
Protected Indication) or DOP (Protected Origin Denomination) directly to consumers in
fresh or as laboured products.
I) Utility of local breeds in highlands and less-favoured areas:
Beef production farms imply:
- Fixation of a minimum of agrarian active population due to the farmer presence, this helps
to avoid the appearance of mountain deserted areas that is one of the biggest problems. In
this way we should consider that the farmer steady is going to depend on the economic
viability of the exploitation on its own or together other recurs to cover the whole family
needs and the existence of infrastructure, media devices, services, etc. by the settlement.
- The observance, in a sensible and uncostly way, of the Good Agrarian Manners for the
environment, biodiversity and landscape preservation are kept in the regulations (CE)
1257/99 and developed in RD 3482/2000 and RD 4/2001, that also makes a good example
of this sort of actions for the non European Mediterranean countries and where it is
considered: - To limit soil erosion.- To keep or increase soil organic matter.- To keep soil
structure and permanent pasture surface.- To preserve a minimum entertainment level:
minimum stocking rate, landscape preservation and avoiding the undesirable vegetation
invasion. This steps are implicit in meat production systems on pasture because they don’t
consider lands tillage, animals distribute defections and it is interesting to use grassland in a
right way by means of a stocking rate that ensures a maximum use without over pasturing.
II) Production of singular food with a very good quality.
Local breeds produce meat that is different due to the breed and the geographical location
where they are adapted and have proper conditions to be candidates for DOP, IGP or
Ecologic Agriculture, these breeds are sensibly exploited on pasture which satisfied all
those consumers who prefer to buy meat of animals that have enjoyed animal welfare with
open rearing respecting the environment. Inside this atmosphere there are new possibilities
66
to improve beef trade, bearing in mind tourists that look for the countryside and free range
food consumption in situ or to take home.
To make local breeds play an important roll in highlands add to the highest economic
viability it is important to think about a group of critical points related to the management,
to the product quality and to the improvement of its added value. These critical points will
be enumerated without being very strict and knowing that there are several examples
developed in different Mediterranean areas.
Critical points in extensive management related to economic viability and its relation
with the environment:
- Stocking rate, grassing method and grassing pressure suitable to highest utilization
avoiding grass damage and over pasturing.
- Adaptation of forage production cycle and the herd nutritive necessities through: calving
or lambing grouping, annual variation in the stocking rate and forage preservation, variation
dam fat reserves and supplementation with concentrate.
- Food in scarcity periods like winter and summer.
- Providing shelters during pasturing periods and improving relations between farmer and
animals thinking of animal welfare and farmer security.
- Protection of isolated trees and singular specimens, and mainly avoid any damage in
forest areas.
Product quality and added value improvement:
- Enhancement of the traditional type: improving, through food and management, its
sensorial and nutritive value, mainly its content in ω3, CLA and PUFA/SFA, ω6/ω3 rates.
- Improving the marketing of less appreciated meat pieces: standing out their nutritive
quality and their functional amino acids content like taurine and carnitine and proposing
new easy cooking recipes.
- Trying to diversify the offer, adding different types to the traditional through slaughter
age, carcass fat score, sort of food the animal had during its life, etc.
- Improving direct selling of groups of different pieces of aged meat, studying the best
combination of pieces, the type of packaging that improves its presence and shelf life, etc.
All packages should have as much information as it is possible about its characteristics,
cooking attitude and quality.
- Encouraging the marketing of prepared and precooked products.
INTRODUCCIÓN
Las razas autóctonas de producción de carne por su adaptación a las condiciones del medio,
su ubicación normal en zonas desfavorecidas y de montaña donde no es competitiva una
especulación agraria más rentable, la necesidad frecuente de la presencia del ganadero para
su manejo y la producción de un alimento de alto valor biológico, constituye un recurso de
máxima importancia en el desarrollo rural en zonas desfavorecidas, estando en
consecuencia sus posibilidades ligadas a:
I) El reconocimiento explicito de su utilidad en zonas desfavorecidas y de montaña para la
fijación de población, la gestión del medio ambiente y el enriquecimiento del paisaje y
la biodiversidad. y
67
II) La producción de alimentos diferenciados de buena calidad comercializados como IGP o
DOP para vender, con preferencia, directamente al consumidor, añadiéndole el máximo
valor mediante la transformación o elaboración del producto
I) Utilidad de las razas autóctonas en las zonas desfavorecidas y de montaña
Las explotaciones de producción de carne suponen:
- La fijación de un mínimo de población activa agraria debido a la presencia del ganadero,
por lo que contribuye a evitar la desertización de las comarcas de montaña, que es uno de
sus problemas más importante. En este sentido hay que considerar que la permanencia del
ganadero va a depender de que la explotación tenga una rentabilidad adecuada para las
necesidades familiares, por si sola o como parte importante en un conjunto de diversos
recursos, y que exista una dotación suficiente en el entorno, de servicios, infraestructura,
comunicación, etc.
- El cumplimiento en una forma racional y económica de las normas de Buenas Practicas
Agrarias para la conservación del medio ambiente, la biodiversidad y el paisaje dispuestas
en el Reglamento (CE) 1257/99 y desarrollados en el RD 3482/2000 y RD 4/2001, que
constituye también, un ejemplo valido de este tipo de acciones para los países
mediterráneos no europeos, y en las que se considera: -Limitar la erosión. -Mantener o
restablecer la tasa de materia orgánica del suelo. -Mantener la estructura del suelo y la
superficie de praderas permanentes -Preservar un nivel mínimo de entretenimiento
considerando: carga mínima de ganado, conservación de elementos paisajísticos y evitando
la invasión de vegetación indeseable. Medidas implícitas en los sistemas de producción
racional de carne en pastoreo, ya que no contempla el laboreo de la tierra, los animales
distribuyen sus deyecciones, e interesa mantener las praderas con una utilización adecuada
mediante una carga ganadera que asegure el máximo aprovechamiento sin sobre pastoreo.
II) Producción de un alimento de buena calidad.
Las razas autóctona produce una carne singularizada por la raza y el medio geográfico al
que están adaptadas, que cumple las condiciones adecuada para aspirar a Denominación de
origen protegido (DOP), Indicación Geográfica protegida (IGP) o Agricultura Ecológica y,
explotada racionalmente en pastoreo colmar la sensibilidad de los cada vez mas numerosos
consumidores de adquirir carne de animales que han disfrutado de bienestar animal y han
sido criados en respeto a la conservación del medio ambiente. Dentro de este panorama se
abren posibilidades de mejorar la comercialización teniendo en cuenta el turismo que busca
el campo y el consumo de alimentos naturales in situ o para llevar a su casa.
Para que las razas autóctonas jueguen el papel importante que deben tener en las zonas de
montaña junto con una rentabilidad lo más alta posible, conviene tener en cuenta una serie
de puntos críticos y actuaciones convenientes en relación al manejo, la calidad del producto
y el incremento de su valor añadido, que vamos a enumerar sin pretender ser exhaustivos, e
indicando de antemano que existen bastantes ejemplos desarrollados total o parcialmente en
distintas comarcas de la cuenca mediterránea.
68
Puntos críticos en el manejo en relación a la rentabilidad y la relación con el medio
ambiente:
- Carga ganadera, método y presión de pastoreo adecuados al máximo aprovechamiento de
la hierba, evitando deterioro de la vegetación y el sobre pastoreo.
- Adaptación del ciclo de recursos forrajeros y el de necesidades del rebaño mediante:
Agrupación partos, Variación de la carga en pastoreo y conservación forrajes,
Movilización reservas corporales de la madre y Suplementación.
- Alimentación en épocas de escasez, invierno y/o verano.
- Previsión de refugios en pastoreo y mejora relación hombre- animal pensando en el
bienestar animal y la seguridad personal.
- Relación del animal con superficie arbolada, protección absoluta árboles aislados y
ejemplares excepcionales y en general prevención daños significativos en cualquier tipo
de superficie arbolada.
Calidad del producto y mejora del valor añadido:
- Potenciar el tipo tradicional: resaltando y/o mejorando mediante la alimentación y el
manejo, sus cualidades sensoriales y nutricionales con espacial interés en contenido ω3,
CLAs, e índices PUFA/SFA, ω6/ω3.
- Potenciar piezas poco apreciadas: resaltando sus calidades nutricionales y/o contenido en
aminoácidos funciónales tipo taurina y carnitina y, rescatando o proponiendo nuevas
formas culinarias de fácil ejecución y buenas forma de preparar
- Diversificar la oferta produciendo más tipo que el tradicional, bien diferenciados, por
edad, nivel engrasamiento, tipo de alimentación, etc.
- Fomentar y/o potenciar la venta directa en lotes envasados de carne madurada, estudiando
la mejor combinación de trozos de piezas, el tipo de envasado que mejore su presentación
y vida útil, etc. y contenga el máximo de información posible sobre sus características,
aptitud culinaria y calidad.
- Fomentar y/o potenciar la venta de producto semielaborados o elaborados.
69
CRECIMIENTO Y CALIDAD DE LA CARNE DE TERNEROS DE RAZA
MINHOTA
ARAÚJO, JOSÉ PEDRO.
Escola Superior Agrária de Ponte Lima – Instituto Politécnico de Viana do castelo
4990-706 Ponte de Lima, Portugal [email protected]
La raza bovina Minhota es una raza autóctona localizada en el Norte de Portugal,
que ha empezado su programa de mejora genética en el año 1997. Esta raza presenta como
principal aptitud la producción de carne.
En el presente trabajo se ha efectuado el estudio del crecimiento y de las
características físico y químicas de la carne de terneros de raza Minhota.
Entre el nacimiento y los 11 meses de edad el mejor ajuste se consiguió con la
regresión cúbica con un r2ajustado de 88,18%, 89,02%, respectivamente para machos y
hembras (P<0,001), traduciéndose en ganancias medias diarias de 1.171,9 g/día (machos) y
928,9 g/día (hembras). Con respecto al efecto del sexo en la ganancia media diaria de los
terneros hasta las dos edades del destete (6 y 9 meses), los machos continúan presentando
valores superiores, apreciándose además cifras mayores para los destetados a los 9 meses de
edad.
Para evaluar las características de calidad de la carne, se han empleado muestras de
L. thoracis de dos tipos de terneros: ligeros, sacrificados entre los 5 y 7 meses de edad, y
pesados, entre los 8 y 10 meses. No se encontraron diferencias significativas por efecto del
sexo en la carne de los dos tipos, habiéndose obtenido unos pH aceptables para la
comercialización de las canales. La carne presentó un color con una alta luminosidad, sin
influencia del sexo. No hubo diferencias significativas en las pérdidas de agua por
descongelación, por presión o por cocción y en la dureza de la carne de terneros ligeros y
pesados debidas al sexo. La carne de los terneros ligeros se ha visto afectada
significativamente por el sexo en la grasa, siendo los valores más elevados para en las
hembras.
INTRODUCCIÓN
La raza Minhota tiene como principal aptitud la producción cárnica, basándose en pequeñas
explotaciones familiares con un sistema tradicional de pastoreo de las vacas y la
estabulación y amamantamiento de los terneros. El sacrificio de éstos se realiza a dos
edades: a edad temprana, de 5 a 7 meses de vida, y los terneros pesados entre 8 y 10 meses,
produciendo unas canales muy apreciadas en el mercado regional portugués. El fin de este
estudio fue: a) estudiar el crecimiento de terneros de ambos los sexos de la raza Minhota,
utilizando curvas de crecimiento; b) estudiar el efecto del sexo en las características físico y
químicas de la carne.
MATERIAL Y MÉTODOS
CRECIMIENTO DE LOS TERNEROS
Entre el nacimiento y los 11 meses, se han utilizado los datos de pesos vivos de
312 terneros (161 machos y 151 hembras) con, por lo menos, dos pesadas, correspondiendo
a pesadas a diferentes edades entre Julio del año 2003 y Abril de 2005, en 178
70
explotaciones de 103 parroquias de 14 municipios del Entre Douro e Minho. La báscula
utilizada ha sido electrónica (modelo FX1-Iconix), con capacidad hasta 2000 Kg.
Ganancia del peso (nacimiento hacia 11 meses de edad): Se realizó el ajuste a
las curvas de crecimiento lineal y polinomial hasta el 3er grado.
Ganancia media diaria (GMD): Se han utilizado datos de 90 terneros con, al
menos, dos pesadas, la primera en el primer mes de edad y la última al destete (6 o 9 meses
de edad). Con el fin de determinar el efecto del sexo y de la estación de nacimiento sobre la
ganancia media diaria (GMD), se realizaron ANOVAs, basados en la suma de los cuadrados
tipo III (determinación de las medias marginales estimadas y error típico), mediante los
siguientes modelos lineales generales (PROC GLM):
- Nacimiento-destete
GMDijk = Si + Enj + β1Edijk + (SEn)ij + eijk (N=90)
Donde:
GMDijk = observación de la variable dependiente ganancia media diaria;
Si = el efecto fijo del sexo (i = 1, 2);
Enj = el efecto fijo de la estación de nacimiento (j = 1, ..., 4);
(SEn) ij; = interacción de segundo grado;
Ed = edad inicial (Covariable);
β1Edijk = coeficiente de regresión lineal que indica la dependencia del GMDijk con Ed (edad
inicial) en la ganancia media diaria.
eijk = el error aleatorio asociado a cada observación yijk.
Se analizó la significación estadística de la interacción de segundo grado,
biológicamente consistente y la covariable edad inicial, en este modelo, excluyéndose en el
caso de no ser significativas.
- Nacimiento-destete 6 meses
(N=56)
GMDij = Si + eij
Donde:
- Nacimiento-destete 9 meses
GMDij = Si + eij (N=34)
Donde:
Se ha utilizado el paquete estadístico SPSS 12.0.S for Windows versión 12.0.1. para el
análisis de los datos.
DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN LA CARNE
Se realizaron las determinaciones de calidad de la carne sobre un total de 45
muestras del total empleado para el estudio de la canal. La distribución según el tipo y sexo
se indican en el Cuadro 1.
71
Cuadro 1. Desglose de número de animales en el estudio de la carne.
Tipo
Sexo
Nº animales
Machos
17
Hembras
Machos
9
11
Hembras
8
45
Ligeros
Pesados
Total
TOMA DE MUESTRAS: Para el estudio de las características de la carne se empleó una
porción de lomo (10ª chuleta), que se extrajo entre las 48 horas postmortem en diversas
salas de despiece o carnicerías. La 10ª chuleta del L. thoracis de cada uno de los animales,
se etiquetó y se congeló lo más rápidamente posible para su posterior análisis en
laboratorio. En laboratorio se procedió a su descongelación lenta, con previa pesada, en
cámaras frigoríficas a 4ºC durante 24 horas. Sobre la primera porción se obtuvieron las
medidas de pH, color, dureza, capacidad de retención de agua (por presión y por cocción, a
la que añadimos las pérdidas por descongelación) y el análisis químico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CRECIMIENTO DE LOS TERNEROS
Los siguientes resultados han sido obtenidos con la totalidad de pesos de terneros
entre el nacimiento y los 11 meses de edad para ambos sexos (Figura 1).
Machos - El mejor ajuste se consiguió en la regresión cúbica con un r2 ajustado de 88,18%,
significativo estadísticamente al 99,99%.
Hembras - El mejor ajuste se consiguió igualmente con la regresión cúbica con un
r2ajustado de 89,02%, estadísticamente significativo al 99,99%.
3
Peso (kg)
2
y = -8E-06x + 0,0041x + 0,6114x + 47,998
600
3
2
y = -9E-06x + 0,0037x + 0,5662x + 46,56
500
2
2
r adj = 0,8902
r adj = 0,8818
500
400
400
300
300
200
200
100
100
0
0
0
100
200
Edad (días)
300
400
0
100
200
300
400
Edad (días)
Machos (r=0,9394; P < 0,00001)
Hembras (r=0,9435; P < 0,00001).
Figura 1. Curva de crecimiento de terneros machos y hembras de raza Minhota
(Polinomiales de 3ºgrado
En el Cuadro 2 y en la Figura 2 se representan los pesos estimados a edades padrón en
función de las curvas para ambos sexos.
72
Las ordenadas en el origen en los machos (30,0; 39,6 y 48,0 kg) y en las hembras
(37,4; 37,1 y 46,6 kg) en los modelos lineal, cuadrático y cúbico, respectivamente,
equivaldrían a la primera pesada (peso al nacimiento). En el modelo lineal, el peso al
nacimiento ha sido superior en las hembras (37,4 kg) con respecto al de los machos (30,0
kg), resultado contrario a lo que biológicamente es aceptable. Este hecho puede explicarse
por tratarse de una estimación de la curva desde el nacimiento al destete, en la que el
parámetro a, aún teniendo un significado especial, no deja de ser tan solo un punto más de
la curva. Los pesos vivos obtenidos al nacimiento de 52 terneros, han sido 43,5±1,38 kg y
42,9±1,29 kg respectivamente en machos y hembras (Araújo, 2005). Estos pesos se
encuentran en el rango definido por las estimativas obtenidas por los modelos cuadráticos y
cúbicos. Con respecto a los pesos estimados a edades posteriores, las diferencias entre los 3
modelos son biológicamente admisibles y similares.
Cuadro 2. Valores medios de los pesos y de las ganancias medias diarias a distintas edades en terneros
machos de raza Minhota.
Edad / rango
Machos
Hembras
Linear
Cuadrática
Cúbica
Linear
Cuadrática
Cúbica
30,0
39,6
48,0
37,4
37,1
46,6
Nacimiento
Peso
138,0
134,4
130,9
124,9
125,1
121,1
90 días
245,9
242,9
247,4
212,5
212,6
217,4
(kg)
180 días
353,9
365,1
364,4
300,1
299,7
297,4
270 días
1.054,0
920,7
977,5
827,9
0–90 días
1.199,5
1.205,7
1.294,4
966,3
972,5
1.069,8
GMD
90-180 días
1.357,4
1.300,6
967,5
889,2
(g/día)
180-270 días
1.199,6
1.205,6
1.171,9
973,0
972,6
928,9
0-270 días
En nuestro estudio, la diferencia entre sexos en la ganancia media diaria
nacimiento-270 días, alcanzó un 19,3%, 20,7% y 18,9% a favor de los machos, en los
modelos linear, cuadrático y cúbico respectivamente. Cima García (1996) señala una mayor
tendencia al crecimiento en los machos, especialmente a partir de los 5 meses y Sánchez
(1978) y Havstad et al. (1989) la encuentran a partir de los 6 meses. En la raza Rubia
Gallega, las diferencias empiezan a notarse a partir de los 180 días (Dios, 2000; Calvo
2001), siendo favorable para los machos, debido a la falta de diferenciación sexual en el
crecimiento entre el nacimiento y los 180 días, y que en este período aún no han empezado
a manifestarse en los terneros los efectos de las hormonas sexuales, que se irán acentuando
con la edad. De Behr et al. (2001), en la raza Azul Belga, manifiestan que las curvas de
crecimiento de ambos sexos son similares entre el nacimiento y los 8 meses de edad. En
nuestro caso las diferencias se acentúan antes de los 180 días. Este hecho puede ser
justificado porque en algunas situaciones las hembras que se destinan para reposición no
son alimentadas al mismo nivel que las que son sacrificadas a edades tempranas para carne.
73
Peso (kg)
364,4
400
350
300
250
200
150
100
50
0
247,4
297,4
130,9
217,4
48,0
121,1
46,6
0
90
180
270
Edad (días)
Machos
Hembras
Figura 2. Comparación de la curva de crecimiento estimada para ambos sexos (Nota:
Los valores indicadores se refieren a los obtenidos en el modelo cúbico).
GMD (g/día)
Con respecto a los pesos estimados a los 180 días en la raza Minhota (machos ≈
242-247 kg; hembras ≈ 212-217 kg), éstos son claramente superiores a los verificados por
Brito (2002) en la raza Arouquesa (138,8–machos; 123,5 kg–hembras), Barrosã (137,9–
machos; 124,7 kg–hembras) y Cachena (90,1– machos; 82,6 kg–hembras), manifestando
la superior capacidad de la Minhota en términos de crecimiento.
Por rango de edad se puede apreciar que, principalmente en los machos, las ganancias
medias diarias son inferiores en el primer período (nacimiento – 90 días), para aumentar en
las fases posteriores (Figura 3).
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
2º grado
3º grado
2º grado
Machos
3º grado
Hembras
Sexo
0 – 90
90-180
180-270
Figura 3. Ganancia media diaria de terneros de raza Minhota en función
del rango de edad y del modelo utilizado.
EFECTO DEL SEXO DEL TERNERO LA GANANCIA MEDIA DIARIA DE PESO
VIVO
Los terneros hasta las dos edades del destete (6 y 9 meses), los machos continúan
presentando valores superiores, apreciándose además valores superiores para los destetados
a los 9 meses de edad (cuadro 3).
74
Cuadro 3. Medias y error típico de la GMD por sexo.
6 meses
9 meses
Machos
Hembras
Sig.
Machos
Hembras
Sig.
1149,7±32,48
984,4±36,17
**
1165,2±33,76
1000,6±40,35
**
Sig: Nivel de significación *** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS no significativo
Las ganancias medias diarias obtenidas (1149,7±32,48 y 1165,2±33,76 en los
machos vs 984,4±36,17 y 1000,6±40,35 en las hembras) en la raza Minhota, muestran una
superioridad de los primeros en 14,0%. En la raza Rubia Gallega (Calvo, 2001) ha obtenido
aumentos diarios de peso vivo superiores en los machos (1271,2±15,54 vs 1050,1±14,90 en
las hembras), supremacía del 17,4%, influyendo en el mismo la época de parto. En este
mismo estudio no se apreciaron diferencias significativas para el peso al sacrificio entre
terneros destetados a los 6 y 8 meses, debido al crecimiento compensatorio.
CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DE LA CARNE - EFECTO DEL SEXO
En el cuadro 4 indicamos los resultados del efecto del sexo sobre las características
organolépticas de la carne.
El pH individual de la carne de todos los animales estuvo por debajo del 5,8, siendo un buen
indicador en la carne de ganado bovino.
Color del Longissimus thoracis - La luminosidad de la carne de los terneros ligeros y
pesados no varió significativamente entre sexos, aunque se observaron valores superiores en
los machos. Esta falta de diferenciación puede ser debido a que una menor luminosidad de
la carne de las hembras es debido a su mayor precocidad, por lo que su contenido en grasa y
consecuentemente el contenido en pigmentos es superior (Renerre, 1986), siendo
contrarrestada por la mayor actividad física de los machos (Seideman et al., 1982).
Con respecto al índice rojo, los machos presentarán mayores valores que las
hembras (P<0,05) en los ligeros y sin diferencias significativas en los pesados.
En cuanto al índice de amarillo de la carne, no se observaron diferencias
significativas entre machos y hembras, posiblemente porque estamos considerando
animales demasiado jóvenes para que existan grandes diferencias entre sexos. Con respecto
a los pesados, los machos presentaron mayores valores de amarillo (P<0,05).
75
Cuadro 4. Medias, error típico y nivel de significación de las características organolépticas de la carne
de los machos y hembras. Efecto sexo.
TIPO
SEXO
LIGEROS
PESADOS
SIG.
MvsH
Machos
5,42 ± 0,01
Hembras
5,43 ± 0,02
SIG.
NS
38,50 ± 0,58
15,46 ± 0,56
9,11 ± 0,36
36,83 ± 0,82
14,66 ± 0,68
7,65 ± 0,44
NS
NS
*
NS
NS
NS
3,01 ± 0,45
2,50 ± 0,61
NS
NS
20,34 ± 0,69
30,08 ± 0,63
20,11 ± 0,80
29,16 ± 0,72
NS
NS
NS
*
4,73 ± 0,37
4,41 ± 0,50
NS
4,39 ± 0,40
Dureza (kg)
SIG.: *** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS No Significativo
5,44 ± 0,48
NS
NS
Machos
Hembras
SIG.
5,41 ± 0,02
5,41 ± 0,03
NS
pH
CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS
COLOR del L. thoracis
NS
Luminosidad 39,96 ± 0,86 39,54 ± 0,97
*
Índice de rojo 13,14 ± 0,36 11,62 ± 0,36
8,15 ± 0,50
8,52 ± 0,52
NS
Índice
amarillo
CRA (%)
2,12 ± 0,33
2,66 ± 0,43
NS
Pérd.
Descong.
NS
Pérd. Presión 19,63 ± 1,40 18,18 ± 1,68
NS
Pérd. Cocción 27,60 ± 0,95 24,40 ± 1,25
NS
Capacidad de retención de agua y dureza - El sexo no afectó de forma significativa (P<0,05)
las pérdidas de agua por descongelación, por presión o por cocción de la carne de terneros
ligeros y pesados, punto que ratifican los resultados de Dios (2001) y Oliete (2003).
Dureza - No se encontraron diferencias significativas debidas al sexo, concordando con los
resultados de Paterson et al. (1988); Dios (2000); y, Calvo (2001) para terneros Rubio
Gallego sin destetar. Para Eilers et al. (1996), sin embargo, los valores de dureza de la carne
fueron algo más bajos en la carne de las hembras en los terneros ligeros, pudiendo ser
debidos a la menor tasa de colágeno en las hembras (Touraille, 1982; Hedrick et al., 1983);
o por la mayor cantidad de grasa que implica un mayor grado de veteado (Seideman et al.,
1982). Otros autores, por el contrario, achacan las diferencias a la mayor cantidad de fibras
blancas que presentan las hembras o al diferente valor de pH (Eilers et al., 1996) que no ha
sido observado en nuestro estudio.
Composición química - La carne de los terneros ligeros se ha visto afectada
significativamente por el sexo en el contenido de humedad y en la grasa, siendo los valores
más elevados para los machos en la humedad (76,10 vs 74,66%; P<0,01), y para la grasa en
las hembras (1,68 vs 0,99%; P<0,01) (Cuadro 5).
En los terneros pesados el contenido en grasa ha sido superior en las hembras (2,66
vs 1,49%; P<0,01), no encontrándose diferencias significativas en ninguno de los demás
constituyentes de la carne. El contenido de grasa del músculo, en el presente trabajo, ha sido
superior en las hembras que en los machos para el mismo peso vivo, justificándose por el
desarrollo precoz de las hembras con respecto a los machos. Así mismo, se ha demostrado
en la raza Rubia Gallega, Varela (2002) y Moreno (2004), que este aumento en el contenido
de grasa de las hembras, lleva asociado un descenso en el contenido de humedad con
respecto a los machos.
76
Cuadro 5. Medias, error típico y nivel de significación de la composición química de la carne de los
machos y hembras. Efecto sexo.
TIPO
LIGEROS
SEXO
Machos
PESADOS
Hembras
SIG.
Machos
COMPOSICIÓN QUÍMICA (%)
76,10 ±
74,66 ±
**
75,34 ± 0,23
Humedad
0,17
0,22
1,15 ±
1,15 ±
NS
1,15 ± 0,01
Cenizas
0,01
0,01
21,76 ±
22,51 ±
NS
22,02 ± 0,16
Proteína
0,21
0,26
0,99 ±
1,68 ±
**
1,49 ± 0,20
Grasa
0,13
0,17
SIG.: *** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS No Significativo
SIG.
MvsH
Hembras
SIG.
74,57 ± 0,28
NS
*
1,12 ± 0,01
NS
NS
21,65 ± 0,17
NS
NS
2,66 ± 0,26
**
***
CONCLUSIONES
Los terneros de raza Minhota producidos en sistemas de manejo tradicional
intensivo tienen un crecimiento elevado desde el nacimiento hasta los 11 meses de edad.
Los pesos obtenidos se han ajustado mejor a una ecuación cúbica, mostrando a los 90, 180 y
270 días, valores estimados de 131 kg, 247 kg y 364 kg en los machos, y de 121 kg, 217 kg
y 297 kg en las hembras.
En función de la edad al destete (6 y 9 meses) los machos presentaron ganancias
medias diarias superiores a las de las hembras. Así se han obtenido a los 6 meses, 1.150 g
en los machos y 984 g en las hembras, y a los 9 meses 1.165 g en los machos y 1.001 g en
las hembras, sin que la ganancia media diaria haya sido afectada por la estación de
nacimiento.
La carne presentó un color con una alta luminosidad, de tonos rosados pálidos y un
alto índice de amarillo, propio de los animales sin destetar. La dureza de la carne ha sido
reducida, inferior al 5,5 Kg/cm2, no encontrándose diferencias entre las dos edades de
sacrificio, debido a un contenido en grasa intramuscular alto y una baja capacidad de
retención de agua.
A pesar de que el mercado demanda terneros muy jóvenes, las escasas diferencias
que se han obtenido en las características de la carne entre las distintas edades, se aconseja
que el sacrificio de los terneros debería realizarse a edades más tardías a las practicadas en
la actualidad, sin que su calidad resultara mermada.
BIBLIOGRAFIA
Araújo, J.P. (2005). Caracterización etnológica, genética y productiva de la raza bovina
Minhota - Tese de Doutoramento. Universidad de Santiago de Compostela.
Brito, A.N. (2002). Contribuição para o estudo de algumas raças bovinas autóctones do
Noroeste de Portugal: Análise do sistema produtivo e caracterização biométrica, produtiva,
genética das raças bovinas Arouquesa, Barrosã e Cachena: perspectivas de evolução. Tese
de Doutoramento. Univ. Trás-os-Montes e Alto Douro.
Calvo (2001). Estudio del crecimiento y de las características de la canal y de la carne del
ternero Rubio Gallego acogible a las primas de la P.A.C. en rebaños de vacas nodrizas.
Tesis Doctoral. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela.
77
Cima García, M. (1996). El ganado vacuno de la raza Asturiana de los Valles. Pasado,
presente y futuro. Ed. ASEAVA. España.
De Behr, V.; Hornick, J.L.; Cabaraux, J.F.; Alvarez, A.; Istasse, L. (2001). Growth patterns
of Belgian Blue replacement heifers and growing males in commercial farms. Livestock
Prod. Sci., 71: 121-130.
Dios, A. (2000). Parámetros de calidad del ternero de raza Rubia Gallega pura y cruzada
con Holstein. Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela.
Eilers, J.D.; Tatum, J.D.; Morgan, J.B.; Smith, G.C. (1996). Modification of eary
postmortem muscle pH and use of postmortem ageing to improve beef tenderness. J. Anim.
Sci., 74: 790-798.
Havstad K.M.; Mcinerney M.J. Y Church S.B. (1989). Growth patterns of range beef calves
over discrete preweaning intervals. Can. J. Anim. Sci., 69: 865-869.
Hedrick, H.B.; Paterson, S.A.; Matches, A.G.; Thomas, J.D.; Marrow, R.E.; Stringer, W.C.;
Lipsey, R.J. (1983). Carcass and palatability characteristics of beef produced on pasture,
corn silage and corn grain. J. Anim. Sci., 57: 4-10.
Moreno, T. (2004). Efecto de la extensificación en la calidad de la carne y de la grasa de
animales acogibles a la I.G.P. "Ternera Gallega". Tesis Doctoral, Universidad de Santiago
de Compostela.
Oliete, B. (2003). Maduración de la carne de vacuno joven en Galicia. Tesis Doctoral.
Universidad de Santiago de Compostela.
Paterson B.C.; Jones K.W.; Gee D.H.; Costello W.J.; Romans J.R. (1988). Effects of
carcass chilling temperature on loin steaks from bulls and steers. J. Food Qual., 11: 43-52.
Renerre M. (1986). Influence de facteurs bilogiques et technologiques sur la coleur de
viande bovine. Bull Techn. CRZV Theix, INRA, 65: 41-48.
Sánchez, L. (1978). Raza vacuna Rubia Gallega. Situación actual, evolución y perspectivas
zootécnicas. Ed. L. Sánchez. Lugo.
Seideman, S.C.; Cross, J.R.; Oltjen, R.R.; Schanbacher, B.D. (1982). Utilization of the
intact male for red meat production. A review. J. Anim. Sci., 55: 286-294.
Touraille, C. (1982). Influence du sexe et de l'âge a l'abattage sur les qualités
organoleptiques des viandes de bovins Limousins abattus entre 16 et 33 mois. Bull Tech.
CRZV, 48: 83-89.
Varela, A. (2002). Estudio de las variables que afectan a la producción del tipo "Cebón".
Tesis Doctoral. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela.
78
INFECCIÓN POR PESTIVIRUS EN EL REBECO (Rupicapra pyrenaica) EN EL
PIRINEO CATALÁN
PESTIVIRUS INFECTION IN CHAMOIS (Rupicapra pyrenaica) IN THE CATALAN
PYRENEES
LAVÍN, SANTIAGO y MARCO, IGNASI.
Servicio de Ecopatología de Fauna Salvaje. Facultad de Veterinaria. Universidad
Autónoma de Barcelona.
PALABRAS CLAVE: pestivirus, enfermedad de la frontera, rebeco
ABSTRACT
During 2001 and 2002 an outbreak of a previously unreported disease was detected in the
chamois population of the National Hunting Reserve of Alt Pallars-Aran in the Catalan
Pyrenees (NE Spain), near the border with Andorra and France. A new virus belonging to
the Genus Pestivirus was isolated from several affected animals. Clinical signs of affected
chamois included weakness, extensive alopecia, skin hyper-pigmentation and cachexia.
In early 2005, a high mortality of chamois was observed at the National Hunting Reserve of
Cerdanya-Alt Urgell, an area close to the border with France, and about 40 km from the
2001-2002 outbreak. Affected animals presented with respiratory signs including dyspnoea
and blood exuding from the mouth and nostrils. At necropsy, severe pneumonia was
diagnosed as the cause of death in the early cases. In the last animals found dead in the
outbreak, pneumonia was not found however lesions similar to those of the 2001-2001
outbreak were observed, principally alopecia, skin hyperpigmentation. In all of them, a
Pestivirus was isolated. In June, a chamois with skin lesions was examined at the National
Hunting Reserve of Cadi, an area close to the southern border of the Cerdanya-Alt Urgell
Reserve, and from this individual a Pestivirus was also isolated. During the subsequent
months, tens of chamois were found dead over a large area of the Reserve. The census
performed revealed a dramatic decrease in the populations of both reserves and chamois are
continuing to die in these reserves.
79
INTRODUCCIÓN
A principios del año 2001, los guardas de la Reserva Nacional de Caza del Alt Pallars-Arán,
situada en los Pirineos centrales en la provincia de Lleida, detectaron una mortalidad
anormal de rebecos. El Departament de Medi Ambient de la Generalitat de Catalunya, en el
marco del Convenio de colaboración existente para el seguimiento del estado sanitario de
las poblaciones de ungulados salvajes, encargó al Servicio de Ecopatología de Fauna
Salvaje de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona el estudio y
seguimiento de la enfermedad.
Desde el inicio del 2001 hasta el verano de ese mismo año se observaron animales enfermos
y se encontraron algunos muertos. A principios de 2002, se volvieron a observar rebecos
con la misma sintomatología. Esta vez, la incidencia del proceso fue mayor, ya que se
observó un número muy elevado de rebecos enfermos y muertos. De forma similar al año
anterior, a principios del verano ya no se observaron más animales afectados. En la
vertiente francesa se produjo una situación similar durante el mismo periodo, pero apenas se
llevó a cabo ningún estudio de los animales afectados. En el Principado de Andorra, que
limita con el sector catalán afectado, únicamente se encontró un rebeco enfermo en el mes
de Agosto. Durante el año 2003, apenas se observaron rebecos afectados por la enfermedad.
Los rebecos enfermos presentaban debilidad marcada y dificultad de movimiento. Con
frecuencia, se desplazaban a las zonas bajas de las montañas, cerca de los torrentes, caminos
y carreteras. Algunos, mostraban un cambio de comportamiento (no huían ante la presencia
humana), e incluso se dejaban acercar y capturar fácilmente. Cuando se capturaba un
animal, el pelo se arrancaba con facilidad. Además, presentaban un estado de delgadez muy
marcado y una parasitación abundante por garrapatas. Durante la primavera, a partir del mes
de Abril aproximadamente, los rebecos observados enfermos tenían diversas partes del
cuerpo sin pelo y la piel presentaba un color oscuro. Los animales encontrados durante los
meses siguientes, presentaron una alopecia prácticamente total. El estudio detallado de los
rebecos afectados, detectó la presencia de un Pestivirus.
La evaluación de la mortalidad, tanto en el primer brote como en los posteriores, se realizo
comparando los censos de antes y después de la epizootia. A nivel local, en los valles
afectados la disminución se situó entre el 40 y 46 %, mientras que globalmente, en la
totalidad de la Reserva la disminución fue de un 30 %; de 3.880 rebecos censados en el año
2000, se pasó a un censo de 2.670 rebecos en el año 2002.
A finales del mes de Diciembre de 2004, un guarda de la Reserva Nacional de Caza de la
Cerdanya-Alt Urgell detectó un rebeco adulto enfermo. El animal, después de capturado,
fue trasladado a la Facultad de Veterinaria donde murió al poco tiempo de llegar. El animal
presentaba un proceso respiratorio (neumonía) que le había ocasionado la muerte. En los
meses de Febrero y principios de Marzo de 2005, se detecto una mortalidad muy elevada de
rebecos en esta Reserva. La sintomatología que presentaban los animales afectados era
compatible con un proceso respiratorio, similar al del primer animal encontrado en
Diciembre. Sin embargo, en los últimos animales afectados, se observaron las mismas
lesiones cutáneas que las encontradas en el brote que afectó durante los años 2001 y 2002 a
la Reserva del Alt Pallars-Aran. En los meses siguientes se encontraron decenas de
animales muertos. En esta Reserva, de 563 rebecos censados en 2004, en la actualidad no
quedan más de 30, lo que supone una disminución de más del 95%.
80
En el mes de Junio de 2005 se detectó el primer rebeco enfermo en la Reserva Nacional de
Caza del Cadí. Se trataba de un animal con una sintomatología similar a la descrita en la
Reserva del Alt Pallars-Aran durante los años 2001 y 2002. Posteriormente se registran
numerosos casos y después de realizar los análisis correspondientes se confirma que el brote
estaba asociado a un Pestivirus, al igual que en los casos anteriores. Durante los meses de
verano se encuentran rebecos enfermos y decenas de cadáveres y el proceso se extiende
afectando a los animales de una amplia zona del sector central de la Reserva. En esta
Reserva, a finales de 2005 se constata una disminución del 34%. En Francia, existe también
una fuerte disminución, según los sectores, que oscila del 30 al 75%. En el Principado de
Andorra prácticamente no se observan animales enfermos. En la actualidad, estamos
pendientes de los censos, pero la disminución de rebecos parece ser importantísima.
En la mayoría de los rebecos estudiados en los tres brotes se detectó la presencia de un
pestivirus. Se utilizaron técnicas inmunológicas de detección de antígeno (ELISA) y
técnicas moleculares de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Además, se ha podido
aislar el virus, que se caracterizó mediante técnicas moleculares. Estos estudios
determinaron que se trataba de un pestivirus no descrito previamente perteneciente al
genotipo ‘Border Disease’ (Enfermedad de la Frontera).
Durante los años 2003 y 2004 pudimos estudiar los rebecos de la Reserva del Alt PallarsAran. Utilizamos para ello muestras de rebecos cazados que eran recogidas por los guardas
durante el periodo cinegético. Pudimos constatar en estas zonas una prevalencia de
anticuerpos superior al 80% y la ausencia de animales enfermos. Estos resultados indican
que es presumible que hayan adquirido una defensa inmunológica suficiente como para que
no se produzca un nuevo rebrote del proceso. Desde entonces, parece que se está
produciendo una lenta recuperación de la población en esta Reserva del Alt Pallar-Aran.
También, estudiamos poblaciones de otros ungulados salvajes, en particular muflón, ciervo,
corzo y jabalí, que comparten el mismo territorio que los rebecos enfermos. En estos
animales no se había detectado el proceso. Los resultados de los análisis fueron negativos,
por lo que parece ser una enfermedad que afecta exclusivamente al rebeco. Igualmente, se
realizó un estudio de los rebaños de ovino y de vacuno que comparten el hábitat con el
rebeco en la zona afectada, y tampoco se detectó la presencia del virus.
A mediados de 2005, debido a la crítica situación, las Juntas Consultivas de las Reserva de
la Cerdanya-Alt Urgell y del Cadí-Moixeró deciden la suspensión de la caza del rebeco, a
pesar de que ya se habían sorteado y asignado los permisos. En el sector francés afectado
también se suspende la caza y desde los organismos franceses competentes y desde el
Departamento de Medio Ambiente de la Generalitat de Catalunya, se solicita al Gobierno
Andorrano que haga lo mismo en las zonas limítrofes. Los censos realizados en Andorra por
los guardas (Cos de Banders) en las zonas que no son reserva, constatan una disminución
aproximada del 50%, tal y como era de esperar, ya que son las reservas catalanas y
francesas las que nutren de rebecos al Principado. La administración andorrana decide
disminuir la caza de una semana a tres días. A pesar de ello, no se modifica el número de
permisos (108), cuando el censo arroja una cifra de 103 rebecos. Los márgenes de maniobra
en el Principado son pequeños, ya que la legislación andorrana concede los permisos en
función del número de cazadores, y no en función del número de rebecos.
En la actualidad la enfermedad se extienda al resto de la Reserva del Cadí-Moixeró. La
única zona donde no se han detectado rebecos enfermos es en la Reserva de Freser81
Setcases, donde existe una población muy importante de rebecos. Desde el Servicio de
Ecopatología de la Universidad Autónoma de Barcelona, seguimos trabajando e
investigando sobre esta enfermedad, ya que al tratarse de un proceso y de un virus
totalmente desconocidos, quedan muchas preguntas por contestar y un largo camino por
recorrer.
Los Pestivirus son un Género de virus pertenecientes a la Família Flaviviridae. Este
conjunto de virus afecta únicamente a los animales domésticos y salvajes, y son los
causantes de enfermedades tan importantes como la Peste Porcina Clásica, que afecta al
cerdo y que también puede afectar al jabalí, la Diarrea Vírica Bovina, que afecta al ganado
vacuno principalmente, y la Enfermedad de la Frontera o Border Disease, que afecta al
ganado ovino y caprino. De todas estas, la enfermedad más importante quizás sea la Peste
Porcina Clásica, ya que está clasificada como una enfermedad altamente contagiosa en la
lista de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE). Estos virus son diferentes variedades
y/o genotipos en cada caso, dentro del mismo Género Pestivirus, aunque hay que añadir que
existen muchas otras variedades que afectan a los animales salvajes. Son unos virus de tipo
ARN, lo que implica que presentan una gran variabilidad y/o mutabilidad, y además tienen
mayor capacidad para sobrevivir en el medio ambiente.
El virus de la Peste Porcina Clásica, a pesar de ser altamente contagioso, afecta básicamente
a los suidos domésticos y salvajes, entre ellos el cerdo doméstico y el jabalí. Los virus de la
Diarrea Vírica Bovina y de la Enfermedad de la Frontera, y sus variantes más próximas,
pueden infectar a una gran cantidad de animales salvajes, principalmente ungulados. Se han
aislado estos virus en especies de distintos continentes, como reno, ciervo, corzo, jirafa,
eland, ... Sin embargo, hasta la fecha nunca se ha había encontrado un Pestivirus en el
rebeco en ninguna parte de su área de distribución, y por lo tanto nunca se había asociado
con ninguna enfermedad, por lo que podemos afirmar que se trata de un proceso nuevo para
el rebeco y que nunca hasta ahora, había sido descrito. También cabe señalar que hasta la
fecha, nunca un Pestivirus se había asociado con una epidemia en ninguna especie salvaje, y
muy pocas veces se ha relacionado con una enfermedad en animales aislados. Por lo tanto,
la grave epidemia que está afectando al rebeco en el Pirineo se trata de un hecho totalmente
extraordinario.
Un aspecto especialmente destacable de los Pestivirus es la complejidad de su ciclo
biológico. En los animales domésticos se han descrito dos biotipos distintos, citopático y no
citopático. El primero es el causante de las enfermedades más graves en los animales
domésticos, mientras que el segundo no suele producir tanta mortalidad. Sin embargo,
existen algunas excepciones, y una de ellas es la del que afecta al rebeco, ya que hasta el
momento los virus aislados son de esta segunda categoría.
Los principales reservorios de los Pestivirus son los individuos persistentemente infectados
(IPI). Son animales que se han infectado durante la gestación y que no reconocen el virus
como extraño. Por tanto, no elaboran anticuerpos y a partir del momento que nacen,
eliminan gran cantidad de virus al exterior. Esta característica tan extraordinaria, hace que
sea una enfermedad muy complicada de detectar inicialmente, de controlar y de erradicar,
ya que puede darse la circunstancia de que animales sanos, estén eliminando virus e
infectando a otros animales. En los animales salvajes no se conoce la existencia de este tipo
82
de animales, aunque se cree que también se encuentran presentes, y que deben ser los
responsables del mantenimiento y propagación de la enfermedad.
Los síntomas de las infecciones por Pestivirus en los ungulado salvajes, al igual que ocurre
en los animales domésticos, dependen de la virulencia de la cepa del virus, del estado
inmunitario del animal, de la vía de transmisión y de la dosis infectiva. Pueden ser muy
variados, aunque principalmente se trata de una enfermedad intestinal, que produce
diarreas, en ocasiones hemorrágicas, como en el caso del ganado bovino, de una
enfermedad congénita y reproductiva, como en el ganado ovino, y de un síndrome
hemorrágico sistémico, como en el ganado porcino.
El diagnóstico de una infección por Pestivirus, se puede realizar mediante pruebas
serológicas para la detección de los anticuerpos (ELISA o seroneutralización). Estas son la
pruebas que habitualmente se utilizan para el estudio de la enfermedad. Sin embargo, como
hemos visto puede darse la circunstancia de que animales infectados por el virus no se
detecten mediante estos tests. Para poder detectarlos, se han de utilizar otras pruebas que
identifiquen el virus propiamente dicho, como ELISA de captura de antígeno,
inmunofluorescencia, técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y aislamiento
vírico.
El control del virus en los animales domésticos tendría que tener como objetivo
principal la identificación, aislamiento y eliminación de los individuos persistentemente
infectados. Ésta, juntamente con otras medidas de bioseguridad para minimizar el riesgo
de contacto de animales susceptibles con el virus, como la cuarentena, han demostrado
que son las principales medidas para el control de la enfermedad en los animales
domésticos. Las pautas vacunales correctamente diseñadas (momento de aplicación de
la vacuna, tipo de vacuna, etc.) también ayudaran. En los animales salvajes, medidas
como el aumento de la presión cinegética, no han sido efectivas en los casos de la Peste
Porcina del jabalí. Incluso, se considera que puede favorecer la expansión de la
enfermedad, debido a que se produce un aumento en el movimiento de los animales, lo
que provoca que se extienda más rápidamente la enfermedad.
Brote de enfermedad en el rebeco
A principios del año 2001, los guardas de la Reserva Nacional de Caza del Alt Pallars-Arán,
situada en los Pirineos centrales en la comarca del Pallars Sobirá, en la provincia de Lérida,
detectaron una mortalidad elevada de rebecos en el sector que linda con el Principado de
Andorra. El Servicio de Ecopatología de Fauna Salvaje de la Facultad de Veterinaria de la
Universidad Autónoma de Barcelona, nos encargamos del estudio del brote de enfermedad,
dentro del marco del Convenio de colaboración existente con el Departament de Medi
Ambient de la Generalitat de Catalunya, para el seguimiento del estado sanitario de las
poblaciones de ungulados salvajes en Cataluña.
El estudio de los animales afectados no permitió inicialmente el diagnóstico concreto de la
afección, ya que se trató de una enfermedad cuyos síntomas no se correspondían con las
enfermedades conocidas en esta especie y en otras especies próximas de ungulados de
montaña. Los rebecos enfermos presentaban dificultad de movimiento y debilidad durante
83
el desplazamiento, y con frecuencia eran observados en las zonas bajas de las montañas,
cerca de los ríos, caminos y carreteras. Algunos de ellos mostraban un cambio de
comportamiento, ya que no huían ante la presencia humana, e incluso, se dejaban acercar y
capturar fácilmente. Con el animal en mano, se podía constatar un estado de delgadez muy
marcado. Durante la primavera, los rebecos enfermos que se observaron tenían diversas
partes del cuerpo con alopecia e hiperpigmentación cutánea. Los animales encontrados
durante los meses siguientes, presentaron una alopecia prácticamente total. Únicamente
quedaba un poco de pelo en la cola, extremidades y ciertas partes de la cabeza,
principalmente las orejas.
A principios del año 2002, se volvieron a observar rebecos enfermos con la misma
sintomatología y tuvo lugar un rebrote de la enfermedad. Esta vez, la gravedad del proceso
fue mayor, ya que se observó un número mayor que el año anterior de rebecos enfermos y
muertos. Numerosos rebecos enfermos se pudieron capturar todavía con vida y fueron
trasladados y hospitalizados en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de
Barcelona. Sin embargo, ninguno logró recuperarse del proceso.
La evaluación de la mortalidad producida por una enfermedad en animales salvajes en un
medio tan agreste como es el Pirineo es muy difícil, ya que la mayoría de animales
enfermos y muertos no se pueden detectar. Una forma indirecta de calcularla es mediante
los censos que periódicamente se realizan en la Reserva. Tal y como se preveía, los peores
pronósticos se cumplieron, ya que fueron muchos los rebecos encontrados enfermos y
muertos, y lo que resultaba peor, que era los pocos rebecos vivos que se observaban.
Comparando los censos del periodo 2000-2002, es decir antes y después de la epizootia, se
constató un descenso importante de la población. A nivel local, en los valles afectados la
disminución se situó entre el 40 y 46 %, mientras que globalmente, en la totalidad de la
Reserva la disminución fue de un 30 %; de 3.880 rebecos censados en el 2000, se pasó a un
censo de 2.670 rebecos en 2002.
Durante los dos años que duró la epizootia, se pudieron estudiar un total de 20 rebecos
enfermos. En la mayoría de ellos, se detectó la presencia de un Pestivirus, mediante técnicas
inmunológicas de detección de antígeno (ELISA) y técnicas moleculares de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Además, mediante técnicas de cultivo vírico, se aisló el
virus de la mayoría de los rebecos enfermos. Para determinar que Pestivirus se trataba y
para poder compararlo con los otros Pestivirus conocidos, se llevó a cabo un estudio y
caracterización moleculares de los virus aislados. Estos estudios determinaron que no se
trataba de ninguna cepa previamente descrita, si bien mostraron una mayor similitud con las
cepas de Pestivirus de tipo ovino (Enfermedad de la Frontera).
Durante los años 2003 y 2004, se estudió la población de rebecos, aparentemente sana, de la
zona afectada, a partir de las muestras de los rebecos cazados, que eran recogidas por los
guardas durante el periodo cinegético. Se pudo constatar una prevalencia de anticuerpos
superior al 80% y la ausencia de animales enfermos. Estos resultados indicaron que
presumiblemente la población había adquirido una defensa inmunológica suficiente como
para que no sucediera un nuevo rebrote de la enfermedad. Desde entonces, parece que se
está produciendo una lenta recuperación de la población en esta Reserva.
84
También se estudiaron las poblaciones de otros ungulados salvajes de la Reserva, en
particular muflón, ciervo, corzo y jabalí, que comparten el mismo territorio con el rebeco, a
pesar de que no se había detectado ningún animal de estas especies con síntomas de la
enfermedad. Los resultados fueron negativos, por lo que parece ser una enfermedad que
afecta exclusivamente al rebeco. Igualmente, se realizó un estudio de los rebaños de ovino y
de vacuno que comparten el hábitat con el rebeco en la zona afectada, y tampoco se detectó
la presencia del virus.
Nuevo brote de enfermedad
A finales del año 2004, un guarda de la Reserva Nacional de Caza de la Cerdanya-AltUrgell, detectó la presencia de un rebeco adulto tumbado en el suelo con síntomas de
enfermedad. Los análisis efectuados determinaron un proceso respiratorio (neumonía) como
causa de la muerte. A finales del mes de Febrero y durante el mes de Marzo de ese mismo
año, se detecta una mortalidad masiva de rebecos en esta Reserva. La sintomatología de los
rebecos afectados es respiratoria y se comprueba que los animales fallecen por un proceso
infeccioso respiratorio, idéntico al del primer animal encontrado en Diciembre. Sin
embargo, en los últimos animales afectados, se observan las mismas lesiones cutáneas que
las encontradas en el brote que afectó durante los años 2001 y 2002.
Los estudios más detallados de los rebecos afectados, detectaron la presencia de un
Pestivirus en todos ellos, por lo que se confirmó la existencia de un nuevo brote de la
enfermedad. Se temía por que las consecuencias de la enfermedad fuesen dramáticas: se
encontraron muertos decenas de rebecos y se observaron muy pocos animales vivos en las
zonas que habitualmente ocupan durante esta época del año. Tuvo lugar un colapso de la
población, ya que la mortalidad producida fue extraordianriamente elevada.
En el mes de Junio de 2005 se detectó el primer rebeco enfermo en la Reserva Nacional de
Caza y Parque Natural del Cadí-Moixeró. Se trató de un animal con una sintomatología
similar a aquella descrita para el brote ocurrido en el Pallars, durante los años 2001 y 2002.
Se cumplieron las peores previsiones y se confirmó el brote de enfermedad asociado a un
Pestivirus en esta Reserva. Durante los meses de verano se encontraron rebecos enfermos y
decenas de cadáveres, y el proceso se fue extendiendo, afectando a una amplia área del
sector central de la Reserva.
Los censos que se realizaron en ambas Reservas, proporcionaron unos resultados
dramáticos. En la Reserva de Cerdanya-Alt Urgell, de 563 rebecos censados en 2004, se
detectaron únicamente 81 rebecos, lo que supone una disminución de alrededor del 86%. En
la Reserva del Cadí, las cifras no fueron tan apocalípticas, pero se constató una disminución
importante del 34%. En Francia, se constató también una fuerte disminución, según los
sectores, que oscila del 30 al 75%.
En la actualidad, la epizootia continúa su avance en el Parque Natural del Cadí-Moixeró y
se sigue temiendo por que la enfermedad se extienda al resto de las zonas protegidas del
Pirineo. Desde el Servicio de Ecopatología de la Universidad Autónoma de Barcelona,
seguimos trabajando e investigando sobre esta enfermedad, ya que al tratarse de un proceso
y de un virus totalmente desconocidos, quedan muchas preguntas por contestar y un largo
camino por recorrer.
85
El aspecto que más urgentemente cabría elucidar, es cómo detener o controlar la
enfermedad. Sin embargo, esta cuestión es difícil de contestar y de llevar a cabo, ya que las
enfermedades víricas en animales salvajes de vida libre, que afectan a una población tan
grande y en un medio tan agreste, como es el Pirineo, son difíciles de controlar. Al no
existir situaciones similares en el rebeco, podemos tomar como ejemplo la situación de la
epizootia de Peste porcina en el jabalí en centroeuropa. Después de años de investigación,
de intentos fallidos de erradicar la enfermedad mediante la caza intensiva de jabalís, en la
actualidad se está trabajando en la vacunación de los jabalíes mediante cebos por vía oral.
BIBLIOGRAFÍA
Becher, P., Avalos-Ramirez, R., Orlich, M., Cedillo-Rosales, S., Konig, M., Schweizer, M.,
Stalder, H., Schirrmeier, H., Thiel, H-J., 2003. Genetic characterization of novel pestivirus
genotypes: implications for classification. Virol. 311, 96-104.
Frolich, K., Jung, S., Ludwig, A., Lieckfeldt, D., Gibert, P., Gauthier, D., Hars, J., 2005.
Detection of a newly described pestivirus of Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica
pyrenaica) in France. J. Wildl. Dis. 41, 606-610.
Hurtado, A.; Aduriz, G.; Gomez, N.; Oporto, B.; Juste, R.A.; Lavin, S.; Lopez-Olvera, J.
and Marco, I. (2004). Molecular identification of a new pestivirus associated to an outbreak
of disease in the Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) in Spain. J. Wildl.
Dis., 40: 796-800.
Marco, I. and Lavin, S. (2003). Pestivirus in chamois from the Catalan Pyrenees (NE Spain)
in 2001 and 2002. Supplement to the J. Wildl. Dis., 39: 2-3.
Marco, I. y Lavín, S. (2005). Demographic collapse of the population of chamois
(Rupicapra pyrenaica) in the eastern Pyrenees due to disease associated with a pestivirus
infection. Supplement to the J. Wildl. Dis., 41.
Marco, I.; Rosell, R.; Mentaberre, G.; Casas, E.; Cabezón, O.; Velarde, R. y Lavín, S.
(2006). Pestivirus infection in chamois (Rupicapra pyrenaica): demographic collapse of the
population in the catalan Pyrenees (NE Spain). Wildlife Disease Association International
Conference. Connecticut (USA), 2006.
Marco, I.; Rosell, R.; Mentaberre, G.; Casas, E.; Cabezón, O.; Velarde, R. y Lavín, S.
(2006). Description of an outbreak of pestivirus infection in chamois (Rupicapra pyrenaica)
in the Pyrenees during 2005 and 2006. Seventh International Conference. European
Wildlife Disease Association. St. Vincent (Italia), 2006.
Marco, I., Lopez, J., Rosell, Vidal, E., Hurtado, A., Juste, R., Pumarola, M. y Lavín, S.
(2006). Severe outbreak of disease in southern chamois (Rupicapra pyrenaica) associated
with Border Disease virus infection. Vet. Microbiol. (en prensa).
Nettleton, P.F., Entrican, G., 1995 . Ruminant pestiviruses. Brit. Vet. J. 151, 615-642.
Nettleton, P.F., Gilray, J.A., Russo, P., Dlissi, E., 1998. Border Disease of sheep and goats.
Vet. Res. 29, 327-340.
Nettleton, P.F., 2000. Border Disease. In: Martin, W.B, Aitken, I.D. (Eds.), Diseases of
sheep, Blackwell Science, London, pp. 95-102.
Thiel, H., Collet, M.S., Gould, E.A., Heinz, F.X., Houghton, M., Meyers, G., Purcell, R.H.,
Rice, C.M., 2005. Family Flaviviridae. In: Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J.,
Desselberger U., Ball L.A. (Eds), Virus Taxonomy. Eight Report of the International
Comitee on Taxonomy Viruses, Elsevier Academic Press, New York, pp. 981–998.
86
Van Campen, H., Frölich, K., Hofmann, M., 2001. Pestivirus infections. In: Williams, E.S.,
Barker, I.K. (Eds.), Infectious diseases of wild mammals. Manson Publishing Veterinary
Press, London, pp. 232-237.
87
RILIEVI CLINICI, LEGISLATIVI, GESTIONALI, DI BENESSERE E
PROTEZIONE DEL MUFLONE IN SARDEGNA.
THE IMPORTANCE OF CLINICAL ASPECTS, LEGAL ASPECTS, MANAGEMENT,
STATUS OF HEALTH AND PROTECTION OF MOUFLONS IN SARDINIA.
CUBEDDU G.M
Istituto di Clinica Medica Veterinaria-Università di Sassari - Direttore G. Pintori.
KEY WORD: mouflons, management, protection, laws, environment.
SUMMARY
Our aim is to evaluate the status of health and wellbeing of mouflons in Sardinia.
We are going to consider clinical , and epidemiological and managing aspects, according to
the modern canons of protection of the mouflon’s health as well as to the medical aspects
related to the pathologies of the species in particular those trasmissible to other animals
and men. Italian Autochthonal population of mouflon is the Sardinian one ,there are ,infact,
4000. Sheep and it is subdivided into different units. We remember the ratification of the
agreement of Berna from the Italian Republic(Law n 503 of 05th -08-81)for protection of
wild life and natural enviroment in Europe which imposes measures to protect wild species
and those in danger of extinction.
The 75% of the mouflon population in Sardinia is abandoned, because there are not people
able to take care of them and because of the territory shape and uneven ground. The
conditions of life and survival of colonies of mouflons are different according to their place
as well as the institute involved in their protection.
Main Pathologies:Echinococcosi and Cenurosi, gastroenteric and bronchopulmonary
strongilosi, gastro-enteric “Tossiemie”, adenomatosi, tetanus, cherato-conjiiunctivitisin,
blue tongue, Q fever.
To sum up, we believe we are able to find solutions to some problems,in order to improve
the management and the state of health of animals. For example the “the endemic
agalassia”among Sardinian sheep could provoke serious effects on the population of
mouflons . We should improve a correct culture of natural parks in Sardinia in order to
encourage more vigilance , mutual help and cooperation among veterinarians, zoofile
guardians and corps of foresters ,more protection of these wild animals with opportune
interventions , and treatment so that pathologies couldn’t menace fauna in this island.
PREMESSA
Con questo lavoro ci proponiamo di valutare la situazione sanitaria e di benessere dei
mufloni in Sardegna, alla luce delle attuali leggi protezionistiche internazionali, nazionali e
regionali con l’obiettivo di migliorare il rapporto uomo-animale-ambiente in Sardegna.
Valuteremo pertanto gli aspetti clinici, epidemiologici e gestionali, secondo i moderni
canoni di tutela del benessere di questo animale selvatico in relazione agli aspetti sanitari
legati sia alle patologie della specie in particolare, sia a quelle trasmissibili agli altri animali
e all’uomo.
88
INTRODUZIONE
Il muflone è una sottospecie di ovis orientalis; è verosimile che la pecora domestica (ovis
aries) si sia originata, circa novemila anni fa, a partire proprio da ovis orientalis, e che le
popolazioni di muflone sardo-corse (uniche autoctone in Europa) si siano originate a loro
volta da pecore domestiche, via via inselvatichite, portate su queste due isole dall’uomo. Il
maschio adulto misura 135 cm di lunghezza, la femmina 120; l’altezza nel maschio è di 7090 cm, nella femmina 65-75 cm; il peso è di 30-40 kg nel maschio, 15-30 kg nella femmina
e nei neonati 2-3 kg.
Il trofeo è presente quasi esclusivamente nei maschi, mentre le femmine sono o sprovviste o
munite di un piccolo bozzo corneale. Il mantello è fulvo, marroncino chiaro d’estate, bruno
scuro d’inverno. Il suo habitat è nelle zone rocciose con pascoli e boscaglia, dal livello del
mare ai 1500 mt.
La riproduzione avviene tra settembre e novembre e i parti avvengono da febbraio ad aprile
con una gestazione di 150-160 giorni. E’distribuito nelle isole di Cipro, Corsica e Sardegna
in Europa, e inoltre nell’Asia minore attraverso l’Armenia, l’Iran, Iraq, Afghanistan,
Pakistan e India settentrionale. In Europa esistono numerosi nuclei in Germania, Repubblica
Ceca, Slovacchia, Ungheria, Slovenia e Austria.
La popolazione autoctona italiana del muflone è quella sarda che attualmente si aggira
intorno ai 4000 esemplari ed è suddivisa in numerosi nuclei tra loro disgiunti (tabella).
Diurno in autunno, inverno e primavera, crepuscolare nel periodo estivo.
Agile corridore, buon arrampicatore, molto fedele al proprio territorio.
Premesse legislative
A partire dalla “Dichiarazione Universale dei Diritti degli Animali” (UNESCO-Parigi 1510-78), numerose sono le indicazioni normative sulla tutela delle condizioni di vita e
protezione dei selvatici (Washington 1973, Berna 1979, Strasburgo 1976/79).
In particolare ricordiamo la ratifica della Convenzione di Berna da parte della Repubblica
Italiana (legge n. 503 del 05-08-81) per la conservazione della vita selvatica e dell’ambiente
naturale in Europa, la quale impone idonee misure per la protezione delle specie selvatiche,
con precisi riferimenti a quelle in grave pericolo di estinzione e dalle altre che potrebbero
esserlo in futuro. Questa legge tratta le problematiche igienico-sanitarie dei selvatici, il
prelievo venatorio etc.
Ma in particolare costituisce punto di riferimento la legge regionale Sarda n. 21 del 18-0594 la quale detta norme per la protezione degli animali: essa sinteticamente all’art.1
promuove nel territorio regionale un’adeguata protezione degli animali, e un loro miglior
rapporto con l’ambiente;
all’art. 2 detta norme di tutela e salvaguardia degli animali di qualsiasi genere e specie
affidando il controllo del rispetto delle stesse ai servizi veterinari delle A.S.R.L. (art. 18);
all’art. 16 poi obbliga chiunque detenga animali a provvedere ad un trattamento adeguato
alla specie, al mantenimento e alla nutrizione. Da ultima la legge regionale n. 23 del 27-098 recante norme per la protezione della fauna selvatica e per l’esercizio della caccia in
Sardegna.
89
Gestione
Della popolazione del muflone esistente in Sardegna il 75% circa risulta pressoché
abbandonato a se stesso; le popolazioni di molte zone non sono in alcun modo seguite dal
punto di vista igienico sanitario e anche l’attuazione delle operazioni di censimento
sistematico assume aspetti problematici, frequentemente per la mancanza di personale atto
ad effettuarlo oltre che per la particolare conformazione del territorio in alcuni casi
particolarmente accidentato. La tutela dei mufloni nelle località di Oschiri, Pattada, Monti,
Berchidda, Alà dei Sardi, Bonassai, Cuglieri, Gonnosfanadiga, Villassalto, è affidata
all’Ente Foreste della Sardegna; mentre quella delle località di Golfo Aranci, Isola di
Figarolo, Gennargentu, Montalbo di Siniscola, sono di pertinenza della Regione Autonoma
della Sardegna. Uno specifico accenno merita la colonia di mufloni collocata nell’isola di
Asinara già sotto l’egida del Ministero di Grazia e Giustizia sino al 1998, oggi Parco
Nazionale dove ancora non è ben chiaro a chi sia affidata la tutela e la gestione dei mufloni
(600 esemplari circa). Le condizioni di vita e/o di sopravvivenza delle varie colonie di
mufloni sono assai diverse a seconda della loro collocazione e degli enti ai quali è affidata
la loro tutela.
Principali Patologie
Nonostante le grandi difficoltà incontrate nel tentativo di una gestione sanitaria negli anni
(molti mufloni vengono casualmente rinvenuti morti in stato di avanzata decomposizione,
con la conseguente impossibilità di risalire alle cause della morte), abbiamo cercato
ugualmente di tracciare un quadro delle più comuni patologie di questo selvatico in
Sardegna.
La notevole diffusione di alcune malattie parassitarie trasmesse dal cane agli animali
d’allevamento ed allo stesso uomo (Echinococcosi e Cenurosi), costituisce da sempre uno
dei più gravi ed insoluti problemi igienico-sanitari che affliggono la Sardegna.
Una di queste parassitosi è la Cenurosi, sostenuta dalla forma larvale (Coenurus) della tenia
multiceps-multiceps, che allo stadio adulto vive nell’intestino tenue dei canidi domestici e
selvatici (cane, lupo, volpe). La malattia, che colpisce il sistema nervoso centrale degli
ovini, determinandone la morte e causando ingenti perdite economiche agli allevatori, è
stata in questi ultimi anni ripetutamente diagnosticata anche nel muflone. Le cause della
diffusione tra gli ovini selvatici vanno ricercate nel costante aumento del randagismo e
soprattutto del bracconaggio (introduzione di cani da caccia nelle aree occupate dai selvatici
e conseguente diffusione della parassitosi). Del tutto marginale appare invece “il ruolo
sostenuto dalla volpe”, potenziale diffusore del parassita tra i mufloni. Da studi da noi
effettuati sul campo si può affermare che solitamente la volpe non lede la scatola cranica
degli ovini morti, per asportare gli organi cerebrali, sede delle cisti parassitarie e non può
quindi essere responsabile della diffusione del parassita nell’ambiente. Non va dimenticato
infine che ben nove casi di cenurosi cerebrale diagnosticati nell’uomo su 60 circa descritti a
livello mondiale sono stati riscontrati in Sardegna. Le infezioni parassitarie maggiormente
segnalate in tutti i distretti della Sardegna sono costituite dalle comuni strongilosi gastrointestinali e broncopolmonari. Queste endoparassitosi, in generale, non comporterebbero
grave pericolo per gli animali stessi, ma, nell’isola, particolarmente siccitosa, si
assommano, per almeno otto mesi all’anno, alle infestazioni da zecche. La concomitanza di
90
questi fattori con le carenze di pascolo può creare seri pericoli per la sopravvivenza degli
animali.
Abbastanza numerosi sono stati i casi di gastro-entero-tossiemie, sia nel ritrovamento di
animali in decubito ( in particolare in concomitanza con le prime erbe ), sia riscontrati al
tavolo anatomo-patologico. Alcuni di questi soggetti sono stati recuperati alla vita selvatica
dopo idonea terapia.
L’adenomatosi polmonare, conosciuta anche come carcinoma polmonare dell’ovino ( OPC
), malattia neoplastica trasmissibile sostenuta da un virus che diffonde per via aerogena, è
presente da alcuni anni in un nucleo di mufloni allevati in cattività a scopo di ripopolamento
nel Centro Zooiatrico Regionale di Bonassai ( SS ). La malattia al suo esordio nel muflone
si è dimostrata altamente contagiosa e si è diffusa rapidamente nel gruppo, colpendo dopo
un anno il 20% della popolazione. Il muflone risultava indenne da questo tipo di malattia e
pare che la comparsa dell’adenomatosi sia da attribuire ad un errore gestionale messo in atto
nel centro zooiatrico di Bonassai, dove degli arieti francesi, verosimilmente affetti da questa
patologia, erano entrati in contatto con il gruppo dei mufloni. Da considerare inoltre che
mentre nell’ovino e nel caprino domestico la quasi totalità dei casi interessa la popolazione
adulta, nel muflone si assiste ad una sua comparsa anche in soggetti giovani ( pochi mesi di
età ), grazie alla possibilità di una trasmissione transplacentare del virus. Più preoccupante
appare il riscontro di un caso di adenomatosi in un soggetto proveniente da un’oasi
faunistica ( Montalbo- Siniscola-NU). Durante lo studio delle patologie del muflone si è
avuta, purtroppo, l’opportunità di diagnosticare alcuni casi mortali di tetano ( GennargentuSeui-Nu ), malattia raramente segnalata nei selvatici.
Negli animali, che presentavano un drammatico quadro clinico, erano evidenti soluzioni di
continuo agli arti, causate da filo spinato utilizzato per le recinzioni. Una tempestiva
assistenza ne avrebbe forse consentito il recupero.
Nella tarda primavera e durante la stagione estiva sono stati riscontrati diversi casi di
cherato-congiuntivite in alcuni soggetti di varia provenienza, senza accertamento
dell’eziologia, visti i risultati negativi degli esami effettuati. Tuttavia la presenza di zecche
induce a sospettare che l’agente causale sia la rickettsia. Tale affezione non si dimostra
particolarmente preoccupante, essendosi risolta spontaneamente, ad eccezione di qualche
soggetto precipitato in mare nella fase acuta ( cecità momentanea ) della malattia.
Blue Tongue
Per quanto riguarda poi la Blue Tongue, trasmessa come è noto dal vettore del genere
Culicoides, si suppone che il muflone possa avere, al pari di altri ruminanti selvatici, un
ruolo di serbatoio, ospitando il virus; tuttavia non si hanno a tutt’oggi certezze sullo stadio
clinico effettivo della patologia in questa specie. Sembra importante sottolineare
Non si hanno dati certi sulla presenza della malattia nel muflone in Sardegna; nell’anno
2001, durante la fase di massima acuzie negli ovini, si sono avute alcune segnalazioni su
diversi casi sospetti. Uno di questi, riguardante un muflone nell’isola dell’Asinara,
rinvenuto morto con sospetto della malattia, purtroppo non ha potuto essere sottoposto a
esami per l’avanzato stato di decomposizione della carcassa.
Febbre Q
Di particolare interesse la segnalazione di questa sindrome morbosa sull’ovino selvatico, sia
per la rarità della patologia in questa specie, ma soprattutto per i risvolti di sanità pubblica
91
che ne potrebbero derivare; la possibilità di infezione per molti animali e per l’uomo
(zoonosi) specialmente in un epoca in cui è sempre più evidente la tendenza a un recupero
dell’ambiente e a un maggiore approccio verso le popolazioni di selvatici, con l’istituzione
di numerosi parchi e oasi faunistiche, pone le basi per una profonda attenzione e conoscenza
nei confronti di questa patologia. Sull’isola di Asinara sono stati segnalati a distanza di
alcuni mesi l’uno dall’altro tre casi di febbre Q da Coxiella burnetii. Gli animali, due
femmine rispettivamente di 6 e 8 anni, e un maschio di circa 14 mesi, sono stati sottoposti
ad indagine clinica. Essi, ritrovati in condizioni di estrema debolezza, tali da lasciarsi
catturare con facilità, presentavano ipertermia, magrezza ed infestione massiva da zecche. I
soggetti, immediatamente ricoverati, con il sospetto di una forma clinica riferibile a
Rickettsiosi venivano sottoposti a terapia sintomatica e a una serie di prelievi di sangue che,
all’esame con immuno-fluorescenza indiretta evidenziavano positività verso Coxiella
Burnetii.
Due dei tre soggetti, dopo il secondo trattamento con tetracicline, mostravano netti segni di
miglioramento delle condizioni cliniche e venivano recuperati alla vita selvatica dopo circa
un mese dal ricovero, mentre la mufla di 8 anni veniva a morte 48 ore dopo il ricovero per
complicazioni broncopolmonari.
OSSERVAZIONI PERSONALI
Le considerazioni sin qui espresse impongono una serie di riflessioni sia sul piano
gestionale (protezione, tutela del benessere), sia su quello sanitario che comprendono tutto
il territorio della regione Sardegna. Sembra di poter affermare che le normative sulla tutela
del benessere dei mufloni in Sardegna, siano recepite in maniera sufficiente solo dall’Ente
Foreste,il quale, quantomeno, provvede ad assicurare ai mufloni il dovuto apporto idrico ed
alimentare insieme a condizioni di habitat compatibili. Pare invece da colmare la lacuna
dovuta all’assenza di un vero e proprio comparto clinico inteso come costante monitoraggio
della situazione sanitaria.
L’assenza di un piano protezionistico regionale idoneo nei riguardi di tutti i selvatici, e del
muflone in particolare, pare una grave inadempienza di quanto disposto dalla legge (L:R.
n° 21 18/05/94 art. 1 comma 2). Altrettanto grave sembra l’assoluto disinteresse da parte dei
Servizi Veterinari delle A.S.R.L. chiamati a vigilare sull’applicazione della suddetta legge
(Art.18 punto 1°). Particolare poi la gravissima disattenzione da parte dell’Ente Parco
nell’isola di Asinara dove la popolazione dei mufloni, in soprannumero, sembra esposta a
rischio sanitario.
CONCLUSIONI.
Con scopo propositivo, per concludere, cerchiamo di identificare alcuni correttivi, peraltro
di facile applicazione, finalizzati ad una più corretta gestione utile a migliorare la tutela
delle condizioni di benessere degli animali e alla limitazione dei rischi sanitari.
Non si può prescindere da una corretta conoscenza delle caratteristiche eto-fisiologiche del
muflone, della ecologia, della legislazione ambientale, dell’economia ambientale e
dell’antropologia. Un primo intervento da attuare è l’istituzione di operazioni di
monitoraggio sistematico che permettano di avere un’idea quanto più reale possibile del
numero di soggetti presenti in Sardegna. Sarebbe bene eseguire le osservazione nei periodi
di aprile-maggio ovvero dopo i parti e di agosto-ottobre, nel periodo degli amori; le fasce
92
orarie più idonee sono quelle che vanno dall’alba fino a metà mattinata e dal tardo
pomeriggio fino al tramonto, viste le abitudini prevalentemente crepuscolari di questo
ungulato; addentrarsi nelle zone interessate procedendo sempre contro vento e
possibilmente con il sole alle spalle. In seguito, conoscendo sempre meglio la logistica,
prendendo nota dei sentieri battuti dagli animali, occorre mettere in pratica una tecnica
intermedia tra il censimento per transetti e quello per battuta. In alcune aree, senza troppa
vegetazione è utile il censimento notturno con il faro: il muflone infatti si individua grazie
al particolare riflesso verde evidenziabile di notte attraverso gli occhi illuminati. Un’altra
metodica è quella di percorrere i sentieri a cavallo. In questo modo si favorisce senz’altro
l’osservazione delle abitudini degli animali che consentono una migliore gestione sia a
scopo conservativo che clinico-sanitario. Le osservazioni su echinococcosi e cenurosi
impongono un immediato rafforzamento dell’attuazione della legge sull’anagrafe canina e
prevenzione del randagismo; la trasmissione di queste parassitosi al muflone è
percentualmente scarsa, ma in alcuni distretti dove il randagismo canino ed il bracconaggio
stanno assumendo proporzioni dilaganti, il problema può diventare serio, viste anche le
continue aggressioni subite dai mufloni da parte di cani rinselvatichiti. Nei distretti dove il
muflone vive allo stato completamente selvatico (Nuorese, Asinara, Golfo Aranci) pare
opportuno creare ampi spazi all’interno del loro habitat naturale, recintati con materiale
idoneo tale da evitare, in occasione di traumatismi, l’insorgenza di patologie sostenute da
clostridi (tetano). Gli enti preposti dovrebbero istituire operazioni di monitoraggio
sistematico, sia per un quadro reale sul censimento, come già detto, sia attraverso
l’allestimento di sistemi di cattura soprattutto nelle stagioni siccitose, quando gli animali
vanno in cerca di cibo ed acqua, in modo da monitorare la popolazione valutando il quadro
metabolico della stessa con la possibilità di somministrare dei medicinali attraverso l’acqua
di bevanda. L’eventuale futura costituzione di oasi di ripopolamento dovrà tener conto della
realtà agro pastorale della zona scelta: alla luce degli ultimi riscontri epidemiologici (
adenomatosi polmonare) è necessario evitare quanto più possibile contatti tra ovi caprini
domestici ed erbivori selvatici, onde prevenire il rischio di trasmissione interspecifica di
patologie infettive: a tale proposito si nutrono fondati timori nei riguardi dell’agalassia
contagiosa, endemica tra le greggi sarde che potrebbe provocare effetti gravissimi sulle
popolazioni dei mufloni. Infine si auspica che una più corretta cultura dei parchi in
Sardegna possa favorire, con una vigilanza veterinaria permanente in sinergia con le guardie
zoofile ed il corpo forestale, una più corretta tutela del benessere di questi animali selvatici
mediante idonei e tempestivi interventi farmaco terapeutici con l’attuazione di efficaci
misure di profilassi nei confronti di patologie ad elevata morbilità e/o mortalità che possono
minacciare questa specie faunistica dell’isola.
BIBLIOGRAFIA
- AA.VV, 1994, “Asinara - storia, natura, mare e tutela dell’ambiente”, Carlo Delfino
Editore - Coda, Petruzzi, Fadda Ximenes, Muzzeddu, “Su di un caso di tetano nel muflone”
- Coda, Ximenes, Barbieri, “La cenurosi cerebrale nel muflone (ovis ammon musimon,
Shreber, 1792): considerazioni clinico-diagnostiche ed epidemiologiche”- Cubeddu,
Grimaldi, Pintori, Coda, Pinna Parpaglia, Cocco “Q fever: clinical and serological
findings in mouflon and goats on the Island of Asinara” - Cubeddu, Coda, Pintori, Porcu,
Satta, Bacciu, Masala, “Q fever: clinival and serological survey of mouflons and sheep on
93
the Island of Asinara”- Cubeddu, Pintori, Coda, Pinna Parpaglia, Cocco, “Cenurosi ovina e
bovina in Sardegna: osservazioni su randagismo e sanità pubblica” - Cubeddu, Pintori,
Coda, Ximenes, Ponti “Segnalazione di alcuni casi di Febbre Q in mufloni dell’Isola
dell’Asinara” - Cubeddu, Coda, Pinna Parpaglia, Panichi, Pollicino, 1997 “Il Muflone
sardo: benessere ed aspetti sanitari” - Cubeddu, Pintori, Panichi, Pollicino, 1997
“Benessere e protezione del Muflone in provincia di Sassari” - Fadda, Pittau, “Ritorna a far
paura la lingua blu”, da L’informatore agrario 48/2000 - Fabbri Massimo, 2001, “La
Caccia di Selezione”, Editoriale Olimpia - Gutierrez, Mattone , Valsecchi, 1998, “L’Isola
dell’Asinara. L’ambiente, la storia, il parco”, Poliedro - L. n° 222 del 12-4-73, G.U. n° 132
del 23-05-73 - L. n° 874 del 19-12-75 suppl. ord. G.U. n° 49 del 24-02-76 L. n° 503 del 0508-81 - L. n° 250 del 11-09-81 suppl. ord. G.U. n° 250 del 11-09-81 - L. n°244 del 28-0482 suppl. ord. G.U. n° 130 del 13-05-82 - L. n° 623 del 14-10-85 suppl. ord. G.U. n° 266
del 12-11-85 - D.P.R. n° 624 05-06-82 G.U. n° 240 del 01-09-82 - L.R.n° 21 del 18-05-94
B.U.R.A.S. - Martin, 1986, “Malattie della Pecora”, Esculapio - Mazzi Alessandro, 2000,
“Elementi di anestesia degli animali esotici e selvatici”, Calderoni Edagricole - Mustoni,
Pedrotti, Tosi, Zanon, 2002, “Ungulati delle Alpi. Biologia, riconoscimento, gestione”,
Nitida Immagine Editrice Perco Franco, 1977, “Il Muflone”, Ed agricole - Petruzzi, Del
Bue, “Cenurosi cerebrale in ovis musimon (muflone). Diagnosi e terapia” Ponti Fulvio,
1992, “Il patrimonio Capriolo”, Carlo Lorenzini editore - Rossi, Meneguez, “Patologie
dominanti nei ruminanti selvatici in Europa” - Ruiu Domenico, 1993, “Il Muflone”, Carlo
Delfino Editore
94
ANÁLISIS DEL ESTADO PARASITARIO DE RUMIANTES SILVESTRES EN EL
NORTE DE CASTILLA Y LEÓN.
DIEZ-BAÑOS, NATIVIDAD y HIDALGO-ARGÜELLO, Mª del ROSARIO
Unidad de parasitología y enfermedades parasitarias. Dpto. de Patología Animal: Sanidad
Animal.Facultad de Veterinaria.Universidad de León.Mail: [email protected]
Diversos organismos internacionales tales como la Oficina Internacional de
Epizootias (OIE), la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO), la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN.)
y la Organización Mundial de la Salud (0MS) son conscientes de la importancia de la fauna
silvestre; puesto que su protección es el modo de preservar la salud de los animales
domésticos y la del hombre; además de mantener un patrimonio y un equilibrio biológico
natural.
La Comunidad de Castilla y León aparece en el contexto de la Comunidad Europea
como la región más extensa (94.193 Km²) y con el record europeo de biodiversidad
continental, motivado por la presencia de factores favorables, tales como marco geográfico,
relieve, clima, superficie, vegetación potencial, baja demografía humana y escasa
utilización de recursos.
Entre las 44 especies de animales que legalmente son consideradas como
cinegéticas en Castilla y León, ocho son de caza mayor, siendo el corzo, rebeco, ciervo y
cabra montés cuatro de ellas. Estos rumiantes desempeñan un papel fundamental al actuar
como transformadores de la cubierta vegetal, servir de alimento a los predadores y
representar su explotación turística y/o cigenética una valiosa fuente de ingresos en áreas
marginales y de alta montaña.
Actualmente, en los espacios naturales confluyen una serie de factores como el
aislamiento geográfico, la ausencia o escasez de predadores, la reducción de recursos
vegetales, las traslocaciones de animales y el aumento de densidad de algunas especies que
determinan cambios drásticos en las relaciones animal/agente patógeno, y por ello se hace
necesario, desde el punto de vista sanitario, la intervención humana.
Estudios realizados en la última década confirman la hipótesis de que los parásitos
pueden regular las poblaciones de hospedadores. Se admite que animales muy parasitados
tienen menos capacidad para competir por territorios, lo que podría ocasionar que sea
eliminado de su hábitat primario y tenga que alimentarse en zonas con escaso alimento o de
peor calidad. Como consecuencia, los efectos de la infección se exacerban y el animal es
más vulnerable a los depredadores. Por otra parte, la alteración de los hábitos del
hospedador o su desaparición, obligaría al parásito a utilizar hospedadores nuevos, a los que
no están adaptados, provocando una situación patogénica conflictiva.
También, se sabe que la resistencia fisiológica del animal silvestre es mucho más
elevada que la del doméstico, de forma que en las infecciones agudas, es habitual que la
observación de los primeros síntomas sea la muerte. Del mismo modo que las infecciones
crónicas son muy difíciles de detectar clínicamente, ya que estos animales débiles son fácil
presa de los predadores de la zona.
En el diagnóstico de las enfermedades en los animales silvestres, cualquier cambio
en la conducta del animal puede ser tan útil o más que las técnicas habituales de
95
exploración. Son de gran ayuda las técnicas coprológicas pues permiten realizar el recuento
e identificación de huevos; pero presentan problemas tales como, toma individual de
muestra y poca correlación con el número de huevos y adultos presentes en el hospedador;
así mismo, las dificultades de la toma de sangre en animales silvestres vivos hacen que el
inmunodiagnóstico no sea muy factible. El carácter cinegético de estos rumiantes silvestres
hace que la técnica de elección para el diagnóstico sea la necropsia, ya que permite
recuperar, cuantificar e identificar dichos parásitos y así valorar el estado sanitario de estas
poblaciones para poder actuar en consecuencia.
El tratamiento farmacológico tiene en la fauna silvestre serias limitaciones como es fácil
comprender, es tremendamente caro y complicado. Por ello, la puesta en práctica de
programas de medidas preventivas es casi la única posibilidad de actuación y, el paso previo
pasa ineludiblemente, por la identificación de las especies parásitas implicadas en los
problemas patológicos presentes en el área geográfica, seguido del conocimiento de sus
prevalencias y de los factores epidemiológicos más importantes relacionados con sus
hospedadores y con el medio natural en que se encuentran.
Hay que tener presente, el papel de la fauna silvestre como reservorio de
infecciones para los animales domésticos pero; también hay que tener en cuenta el riesgo de
transmisión de parásitos de los animales domésticos a los silvestres; así como el aspecto
zoonósico de muchos de ellos. Los estudios efectuados demuestran la presencia en estos
rumiantes silvestres desde los parásitos mas sencillos (los protozoos) hasta los mas
complejos (los artropodos) pasando por los mas numerosos (los helmintos).
Desde 1994 hasta la actualidad, diversos miembros del Departamento de Patología
Animal: Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de León, ayudados por los
responsables de los Servicios Territoriales de Medio Ambiente de la Junta de Castilla y
León encargados de la gestión de las 3 Reservas Regionales de caza de León (figura 1),
estamos trabajando en problemas parasitarios que afectan a los rumiantes silvestres. Nuestro
objetivo es saber qué especies parásitas albergan estos ungulados y con qué intensidad se
presentan; de otra parte, comprobar la existencia de especies comunes a rumiantes silvestres
y domésticos, con posibilidad de infecciones recíprocas cuando ambos utilicen pastos
comunes; y finalmente, con estos datos queremos proporcionar información y
asesoramiento útil para el desarrollo de una correcta gestión de estos espacios naturales, y
de esta forma colaborar en el mantenimiento de las poblaciones sanas y estables.
Figura 1.- Áreas de muestreo
96
Los primeros estudios realizados al respecto en la Cátedra de parasitología de la Facultad de
Veterinaria de León datan de 1977-1979 con el estudio parasitológico de 42 rebecos
procedentes del entonces Coto Nacional de Caza de Reres (Asturias) y los resultados se
expusieron en el II Congreso Nacional de Parasitología celebrado en León en Octubre de
1979. El 85,71% de los animales se hallaron parasitados; siendo los vermes
gastrointestinales los parásitos más frecuentemente observados.
Posteriormente en 1983/84, se muestrearon 65 rebecos procedentes de la Reservas
Nacionales de Riaño, Mampodre y Reres; cuyos resultados se presentaron en las primeras
jornadas sobre la Montaña de Riaño, (Riaño, 1984) y en la IV Reunión Anual de la
Asociación de Parasitólogos Españoles, (Madrid, 1984). El 100% de los rebecos se hallaron
parasitados en mayor o menor cuantía por vermes gastrointestinales y pulmonares. Ante la
abundante presencia de vermes pulmonares de ciclo indirecto, (Protostrongylidae) se pensó
en determinar cual era el hospedador intermediario idóneo, observándose que Cochlicella
barbara y Cepaea nemoralis eran experimentalmente los moluscos más adecuados para la
evolución de las larvas de protostrongylidos. Trabajos presentados en el IV Congreso
Nacional de Parasitología, (Tenerife, 1985) y en la II Conferencia Mediterránea de
Parasitología (Jerusalem, 1987) y en la XII Conferencia Mundial para el Avance de la
Parasitología Veterinaria (Berlín, 1989).
Desde 1994 hasta la actualidad, se realiza el seguimiento parasitologíco en rebecos, corzos
y ciervos de las tres Reservas Regionales de caza del norte de León, y en este sentido se
viene observado la presencia casi constante de protozoos del género Eimeria spp
(prevalencias del 25-100%).,y Sarcocystis spp.(60-100%). La infección intestinal
producida por protozoos del género Eimeria es propio de explotaciones intensivas y
descuidadas, por ello enlos animales silvestres tienen menos importancia que en animales
domésticos, sin embargo la superpoblación puede conducir a la aparición de brotes con
mortalidad alta entre los jóvenes. Los sarcosporidios, protozoos presentes en tejido
muscular estriado (corazón, diafragma, esófago etc.) en forma de microquistes, son fases
intermedias cuyo hospedador definitivo son carnívoros domésticos, silvestres. Tienen en los
rumiantes silvestres gran representación, se le atribuye un poder patógeno relacionado con
la disminución de la capacidad de huida, sobre todo en rebeco. Trabajos incluidos en el IV
Congreso Ibérico de Parasitología (Santiago de Compostela,1995). I Congreso Internacional
de Medio Ambiente y Veterinaria (Caceres,1997). IX European Multicolloquium of
Parasitology (Valencia, 2004) y IX Congreso Ibérico de Parasitología (Coimbra, 2005).
Muchas especies de helmintos son compartidos por los animales domésticos y
silvestres, pero en estos últimos el grado de infección es generalmente bajo y los riesgos de
brotes excepcionales; su importancia radica en su condición de reservorios de muchos de
estos parásitos y en que algunos pueden ser zoonosis.
Normalmente, en los ungulados silvestres es escasa la presencia de trematodos
tales como Fasciola sp. y Dicrocoelium sp. con prevalencias que varian entre el 3 y 15%;
provocan parasitosis crónicas que se traducen en un mal estado general, los animales se
desplazan con dificultad, la muda del pelo se altera y la cuerna de los machos es de menor
calidad. La profilaxis se hace imposible en animales en libertad; se basaría en el saneado de
zonas pantanosas o en la eliminación de caracoles y/o hormigas en la zona; pero, ello
provocaría grandes alteraciones del medio.
97
Igualmente, en los rumiantes silvestres se observa la escasa presencia de cestodos
(del 1-10%) tanto en sus fases adultas (Moniezia sp.) como en sus formas larvarias (C.
tenuicollis). El diagnóstico de las cestodosis larvarias sólamente es posible mediante
necropsia y se podría tener una idea de su prevalencia al hacer un seguimiento coprológico
de los carnívoros de la zona; por ser estos los hospedadores definitivos. El control se
realizará evitando que los carnívoros ingieran vísceras de herbívoros muertos; mediante la
retirada, por parte de guardas y cazadores, de los rumiantes abatidos y/o hallados muertos,
así como, con la desparasitación periódica de los perros de caza.
En la Cordillera Cantábrica, prácticamente todos los ciervos, corzos y rebecos
adultos pueden albergar una treintena de nematodos gastroentéricos y entre ellos hay
especies de tricostrongílidos específicas de los silvestres, como es el caso de
Spiculopteragia spiculoptera en rebeco; Nematodirus europeanus en corzos y
Spiculopreragia böhmi en ciervo; asi como especies comunes como Ostertagia spp. y
Trichostrongylus spp. (Citas presentadas en el VII Internacional Helminthology
Symposium (Kosice, 1995). Las infecciones por nematodos del trato gastrointestinal se
producen con relativa facilidad, ya que su ciclo biológico es directo y que existe cierto
grado de gregarismo entre los rumiantes silvestres. Puesto que en la mayoría de los casos se
presentan infecciones multiespecificas, la acción patógena mancomunada de estos
nematodos tiene un efecto negativo sobre las reservas energéticas; los animales afectados
están abatidos, se desplazan con dificultad y se aislan de la manada, presentan trastornos
diarréicos, retraso en el crecimiento de la cuerna y pérdida considerable de vitalidad, lo que
puede repercutir desfavorablemente en la lucha por la supervivencia a que están sometidos
estos animales en los ámbitos naturales.
Con respecto a los nematodos pulmonares, hallamos prevalencias variables según
el hospedador del 8-35% para Dictyocaulus spp., es de destacar la presencia de
Dictyocaulus noerneri (=D. eckerti) en corzos. La presencia de los protostrongilidos es
algo mas elevada (15-65%), principalmente en rebecos y corzo Varestrongylus sp. y
Muellerius sp.; y en el ciervo Elaphostrongylus cervi. Datos expuestos en el VII European
Multicolloquium of Parasitology (Parma,1996) y VII Congreso Ibérico de Parasitología
(Oporto, 2001). La presencia de estos parásitos supone procesos de naturaleza inflamatoria
que provocan pequeñas áreas de neumonía lobular que pueden llegar a mermar la capacidad
de ventilación pulmonar; además, de ser una puerta de entrada de bacterias y virus que
agravarían el proceso (Pasteurella spp., Yersinia spp., tuberculosis, fiebre catarral maligna,
etc..).
Otro nematodo hallado en el 100% de los ciervos y que presenta una localización
subcutánea es Onchocerca spp. que se caracteriza por la producción de nódulos fibrosos en
el tejido subcutáneo (oncocercomas).
Seguramente, los artrópodos son los principales protagonistas entre los agentes
parasitarios causantes de procesos clínicos en los rumiantes silvestres. Además de la
infección por piojos, moscas productoras de miasis subcutáneas (Hypoderma spp.),
éstridos nasales (Oestrus sp.) y diversas especies de garrapatas, tienen especial importancia
en el norte de Castilla y León las sarnas, principalmente la sarna sarcóptica (Sarcoptes
scabiei) en rebeco y ahora en cabra montés.
En los pequeños rumiantes de la Cordillera Cantábrica se pueden encontrar
dípteros hemátofagos, conocidos como mosca araña (Lipoptena spp.) desde el 1% en
98
rebecos hasta el 40% en corzos; son infestaciones normalmente acompañadas de otros
ectoparásitos, en su mayoría, garrapatas. Datos aportados en el VI Congreso Ibérico de
Parasitología (Córdoba, 1999).
La invasión de la cavidad nasal y retrofaríngea por larvas de insectos (Oestrus sp.) es una
de las parasitosis más frecuentes en el ciervo. En casos graves, por infestación masiva sobre
todo en primavera y verano, la presencia de larvas de estos parásitos provoca inflamación
de la garganta dificultando la ingestión de alimentos y como consecuencia el animal
adelgaza; asimismo, la inflamación de la glotis, pueden dificultar el paso del aire, los
animales permanecen inmóviles, en posición ortopneica con las extremidades anteriores
abiertas, llegando a la muerte por asfixia.
Todos los rumiantes silvestres pueden ser portadores de garrapatas; los Ixódidos o
garrapatas duras son las más frecuentes y su tasa de infestación depende de la localización
geográfica. Nuestros estudios sobre ectoparásitos de los rumiantes silvestres en la Cordillera
Cantábrica, indican la presencia casi constante de infestaciones mixtas por Ixódidos; siendo
Ixodes ricinus y Haemaphysalis hispanica las más frecuentes en corzos e I. ricinus y
Dermacentor marginatus en rebecos. Inicialmente su acción patógena es hematófaga y
neurotóxica, pero su importacia radica en ser vector de enfermedades de diferente etiología
(Lyme, piroplasmosis, erlichias, etc..). Datos presentados en VI Congreso Ibérico de
Parasitología (Córdoba, 1999)
Sin duda una de las principales preocupaciones para Medio Ambiente en la Junta
de Castilla y León es la presencia de la sarna sarcóptica en estos ungulados. En mayo de
1993 surgió un brote de sarna en rebecos de la Reserva de Caza de Aller y de Caso en la
Cordillera Cantábrica vertiente asturiana. El brote de sarna sarcóptica fue detectado en las
inmediaciones del Pico Torres (Asturias), en una superficie de 10 km2. En la primavera de
1994 se detectaron nuevos rebecos afectados, ocupando una superficie de 50 km2, además
surgió otro brote en la Reserva de Piloña (Asturias), unos 20 Km en línea recta al norte del
sitio inicial. El origen de la sarna en estos animales se encuentra, según todos los indicios,
en la presencia en la zona de rebaños incontrolados de cabras con sarna sarcóptica. (fig 2 y
3, ácaro de la sarna obtenido por raspado cutáneo y rebeco con lesiones en el cuello).
Fig 2 Adultos/ninfas/larvas/huevos
Fig 3
En 1996 estos dos brotes de sarna siguieron extendiéndose hacia el Parque de
Covadonga (asturias) y la Reserva de Mampodre (León); en 1999 se detectaron rebecos con
sarna en la Reserva Regional de caza de Riaño (León) y en el 2000 ya estaba presente en
Picos de Europa. Actualmente, se ha detectado ya en Cantabría y en cabra montes de la
99
Reserva Regional de Riaño. (Fig.4). La superficie afectada llega a las 15.000 Has. De los
rebecos abatidos son mas machos que las hembras, con edad media de 5-6 años y con
incidencia mayor en primavera.
Fig 4.- Superficie de avance de la sarna sarcóptica en el rebeco de la Cordillera Cantabrica
Creemos importante resaltar tres aspectos que inciden directamente en la evolución
de esta epizootia: el aumento en los últimos tiempos de las poblaciones de ungulados
silvestres; las subvenciones a la ganadería de montaña, premiando el número de cabezas
existentes sin considerar su estado sanitario; y la falta de control sanitario en los animales
domésticos. Sin embargo, la cuarentena en animales de nueva introducción, el control de
cabras y ovejas de la zona, el incremento del aporte alimenticio y, si es posible, el
tratamiento con lactonas macrocíclicas; así como la eliminación de animales muy
parasitados podrán paliar el problema de sarna sarcóptica en estas poblaciones silvestres. Al
menos, con el plan de actuación seguido en nuestra comunidad, se estan observando zonas
en frenca recuperación.
PLAN DE ACTUACIONES FRENTE A LA SARNA DE LOS REBECOS EN
CASTILLA Y LEÓN
1.-Vigilancia intensa de las zonas afectadas y sobre todo en el frente de avance y caza
selectiva de animales afectados.
2.-Seguir con el Plan ordinario de caza y plan selectivo sobre las hembras para
mantener el equilibrio sex-ratio
3.-Aislamiento de poblaciones y tratamientos experimentales
4.-Control del ganado doméstico, diagnostico y tratamiento
5.-Solicitud declaración obligatoria de la sarna sarcopticas en pequeños rumiantes
domesticos
6.-Comunicación entre guarderías de las 3 Comunidades Autónomas implicadasComo
conclusión final, habría que insistir en la necesidad de realizar mayor número de estudios
para conocer la prevalencia de los procesos patológicos en los animales silvestres y su
epidemiológia, que son la base para el establecimiento de programas de control y profilaxis;
100
así como, la colaboración de la administración como gestora de las Reservas de Caza y
Parques Naturales y el impulso de la investigación en este área y el aporte de conocimientos
por parte de los profesionales de la Sanidad, entre los que el veterinario puede y debe jugar
un papel importante.
BIBLIOGRAFÍA
ARENAS, A y PÉREZ, A., 1993.- El ciervo en Sierra Morena. Servicio de Publicaciones
de la Facultad de Veterinaria de Córdoba.
CARRILLO, E.B et al., 1994.- The first reports of Dictyocaulus noerneri Raillet et Henri,
1907 (Nematoda: Trichostrongyloidea) in Spain. Research and Reviews in Parasitology. 54
(4): 265-267.
CARRILLO, E.B. et al., 1995.- Infección por Varestrongylus capreoli (Stroh & Schmid,
1938) Dougherty, 1945, en pulmones de corzo (Capreolus capreolus) en Galicia. IV
Congreso Ibérico de Parasitología. Santiago de Compostela.
CASSINELLO ROLDÁN, J., 1998.- El arrui Sahariano: un caprino ancestral en
Almería. Inst. de Estudios Almerienses. Diputación de Almería
COLLIN, B. , 1992.- Petit dictionnaire de la Médecine du gibier. Edit. Perron. Alleur,
Líège.
CORDERO DEL CAMPILLO, M. et al., 1994.- Índice Catálogo de Zooparásitos
Ibéricos. Secretariado de Publicaciones. Universidad de León.
CORDERO DEL CAMPILLO, M. y ROJO VÁZQUEZ, F.A., 1999.- Parasitología
Veterinaria. Parte III: parasitosis de los rumiantes. McGraw Hill Interamericana de
España, S.A.V. Madrid.
COSTA, L., 1992.- Una propuesta de gestión cinegética para el corzo (Capreolus
capreolus) en el Norte de España. Ecología, 6: 165-185.
DIEZ BAÑOS , P. et al., 1990.- Bronco-pulmonary helminths of chamois (Rupicapra
rupicapra) captured in north-west Spain: assessment from first stage larvae in faeces and
lung. Annales de parasitoligie Humaine et Comparée. 65: 74-79 Paris.
DIEZ BAÑOS , N., 1996.- Enfermedades parasitarias del ciervo, corzo y rebeco. Master
Universitario en Veterinaria y Fauna Salvaje. III Módulo. Edit: Colegio Oficial de
Veterinarios de Zamora. Zamora.
DIEZ BAÑOS , N. et al., 1997.- Parasitofauna en pequeños rumiantes silvestres
procedentes de la Cordillera Cantábrica de la provincia de León: presencia de
sarcosporidios. I Congreso Internacional de Medio Ambiente y Veterinaria.. Cácere: 547548..
DRÓDZ, J. & DUDZIŃSKI, W. , 1993.- Changes in the intensity of infection of the roe
deer Capreolus capreolus (L.), with abomasums nematodes in relation to host density in a
hunting ground. Acta Parasitologica. 38: 29-32.
FERNÁNDEZ, R. y MORALEJO, H., 1997.- Plan de gestión del rebeco (Rupicaprs
rupicapra) en la zona leonesa de Picos de Europa. Veterinaria y Fauna. Colegio Oficial de
Veterinarios de Zamora. Zamora.
GONZÁLEZ-CANDELA, M. y LEÓN VIZCAÍNO, L., 1999.- Sarna sarcóptica en la
población de arrui (Ammotragus lervia) del Parque Regional de Sierra Espuña (Murcia).
Galemys 11 (2): 43-58.
HIDALGO ARGÜELLO, Mª del R. et al., 2001.- Estudio parasitológico en ciervos
(Cervus elaphus) de la provincia de León. Acta Parasitológica Portuguesa. 8 (2): 156.
101
LAVIN, S. et al., 2000.- Experimental Infection of Chamois (Rupicapra pyrenaica parva)
with Sarcoptes scabiei Derived from Naturally Infected Goats. J. Vet.Med. B., 47: 693-699.
LEÓN VIZCAÍNO, L., 1990.- Patología de la sarna de la cabra montés en Cazorla.
Quercus 50: 22.
MARTINEZ FERNANDO, J. 1982 .- Parásitos del rebeco del Cantábrico (Rupicapra
rupicapra) en el Coto Nacional de Reres (Oviedo). Bol. Cien. Nat. I.D.E.A., 30: 9-22.
MORALEJO, H.A. et al., 1997.- Evolución y problemática de la enfermedad en el rebeco
cantábrico. La sarna amenaza picos de Europa. Trofeo, julio 97: 62-66.
NAVARRETE, I. et al., 1990 .- Parasites of roe deer (Capreolus capreolus) in Cáceres
province, Spain. 32 Internationalen Symposiums über die Erkrankungen der Zoo-und
Wildtierre. Eskilsuna.
ROSSI, et al., 1995.- The epizootiology of sarcoptic mange in chamois, Rupicapra
rupicapra, from the Italian Eastern Alps. Parassitologia. 37: 233-240.
ROSSI, et al., 1997.- A survey of the gastrointestinal nematodes of roe deer (Capreolus
capreolus) in a mountain habitat. Parassitologia 39: 303-312.
VALCÁRCEL, F. y GARCÍA ROMERO, C., 2000.- Endoparasitosis del ciervo. Ovis.
69: 13-79.
102
VALOR NUTRITIVO DE LA CARNE DE LOS TERNEROS DE RAZA RUBIA
GALLEGA: EFECTO DEL AMAMANTAMIENTO Y ÉPOCA DE PARTO
NUTRITIVE VALUE OF RUBIA GALLEGA VEAL: EFFECT OF MATERNAL
SUCKLING AND THE CALVING SEASON
BISPO E., FRANCO D., AMOR V., MONSERRAT L., MORENO T.
Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo, Apdo10,15080 A Coruña, Spain
ABSTRACT
wenty five calves of the Rubia Gallega (RG) breed and their mothers were used to
study the effect of maternal suckling and the calving season on nutritional meat value in RG
calves. 24h postmortem fatty acid profiles were determined by gas chromatography in L.
thoracis. Data was analyzed using ANOVA (SAS). Calves that were suckling until
slaughtering (Suprema) opposite to calves that were weaned 133d antemortem (Normal)
had in both autumn and winter calvings higher levels (mg/100g muscle) in satured fatty
acid, monounsaturated fatty acid and total fatty acid as well as CLA and α-linolenic,
although differences were only significant in winter calvings(340 vs. 265, p<0.05 SFA),
(243 vs. 189, p<0.05), ( 616 vs. 488, p<0,05. Total) (1.06 vs. 0.63, p<0.01, CLA) y (4.99
vs. 3.39, p<0.001, linolenic). In winter calving “Normal” veal had a n-6/n-3 index higher
than meat from “Suprema” calves (1.26 vs. 2.10, p<0.001). The calving season affected
fatty acid contents with higher values in winter calvings than autum calvings. To conclude,
there are nutritional differences between “Normal” veal and “Suprema” veal, in autumn and
winter.
INTRODUCCIÓN
Por motivos dietéticos y de salud los consumidores están cada día mas interesados en
la calidad nutritiva de los alimentos, especialmente en la cantidad de grasa y en su
composición en ácidos grasos por su incidencia en los problemas cardiovasculares y en la
obesidad, en este sentido es importante considerar la relación ácidos grasos
poliinsaturados/saturados PUFA/SFA. Se estiman como alimentos bajos en grasa los que
contienen menos del 5% (Food Advisory Comitee, 1990) y como índices favorables para
prevenir problemas cardiovasculares (Department of health, 1994) los de 0.45 como
mínimo en el de PUFA/SFA y 4.0 como máximo en el n-6/n-3. Así mismo es interesante
considerar el ácido linoléico conjugado (CLAs) por que previene procesos cancerígenos y
de obesidad, por su efecto beneficioso en el sistema inmunológico (IP y col., 1994; Wong y
cl., 1997) y porque es más abundante en la grasa animal que vegetal, especialmente en la de
los rumiantes (0.65% frente al 0.12% del cerdo, Fritsch y Steinhart, 1998).
La cantidad y composición de la grasa de la carne esta afectada por diferentes factores
como la raza, el manejo, la alimentación (Boccard y Bordes, 1986; Renerre 1982; Varela
2002; Huerta-Leidez y col., 1993; Malau-Aduli y col., 1998). El ternero tradicional de
Galicia se produce con la raza Rubia Gallega y se sacrifica alrededor de 8 meses sin
destetar, aun cuando por razones de producción de leche de la madre ligadas a su potencial
genético y a la alimentación pueden llegar al sacrificio destetados de forma natural. En los
sistemas de pastoreo la alimentación esta muy ligada a la época de parto de tal forma que se
ha comprobado que en las condiciones de Galicia con partos de otoño se puede llegar a un
destete muy tardío mientras que en los de invierno-primavera el agostamiento temprano de
103
la hierba reduce la producción de leche llegándose al destete natural a edades tempranas del
ternero, dependiendo de las condiciones climáticas, la fecha de nacimiento y el potencial de
producción de leche de la vaca.
Por otra parte Monserrat y col., (1999) han comprobado que para acabar
adecuadamente el ternero tradicional gallego producido en pastoreo es necesario llevarlo 2
ó 3 meses a cebadero siendo muy útil para el manejo el destetarlo previamente. Cuando el
ternero se destete dos meses antes del sacrificio no se encuentran diferencias con el
sacrificado sin destetar, en la calidad organoléptica y nutritiva de la carne, sin embargo
Moreno et al (2006) comprueba que el consumo de leche afecta a la composición de ácidos
grasos existiendo diferencias entre los terneros sacrificados sin destetar y los destetados 2
meses antes del sacrificio. Parece por tanto conveniente estudiar el efecto del consumo de
leche en condiciones de partos de otoño y primavera asociado al destete por razones de
manejo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para este estudio se utilizaron 25 terneros de la raza Rubia Gallega, de los cuales 13
nacieron en otoño y 12 nacieron en invierno, de los nacidos en otoño 7 fueron destetados
114d antes del sacrificio y 6 continuaron mamando hasta ir al matadero, el grupo de
terneros nacidos en invierno estaba compuesto por 6 que fueron destetados 151d antes del
sacrificio y 6 que no se destetaron.
Todos los terneros se criaron con sus madres en el pasto desde su nacimiento hasta su
entrada en cebadero aproximadamente cuatro meses y medio antes del sacrificio, durante
este periodo pastaron siguiendo un sistema de rotación de parcelas, ingirieron leche de sus
madres y concentrado administrado en comederos selectivos a los cuales las vacas no tenían
acceso. Las vacas, además del pasto, fueron alimentadas con silo de hierba administrado
directamente en las parcelas. Una vez en el cebadero los terneros se alimentaron de pienso
y heno y el grupo de animales no destetados tomaron además leche de sus madres.
Los animales se pesaron al nacer, al entrar en el cebadero, la semana de entrar y el día
antes de ir al matadero. Se sacrificaron en un matadero local siguiendo un procedimiento
convencional. Las canales permanecieron en el matadero y 24h después del sacrificio se
recogieron muestras de lomo de la 5ª a la 10ª costilla. En el laboratorio se aisló el
Longissimus thoracis y a partir de este músculo se extrajo la grasa mediante el método
Bligh and Dyer (1959), a continuación la grasa extraída se metiló utilizando el método
Morrison and Smith (1964) y finalmente se determinó el perfil de ácidos grasos utilizando
un cromatógrafo de gases. Los datos fueron analizados mediante el procedimiento de
análisis de varianza del paquete estadístico SAS (SAS,1999).
Los terneros de partos de invierno presentaron mayor contenido (mg/100g músculo) de
ácidos grasos totales, ácidos grasos saturados y monoinsaturados, aunque las diferencias
sólo fueron significativas para los animales que no fueron destetados (473 vs. 617, p<0.01),
(264 vs. 340, p<0.01) y 243 vs. 176, p<0.01), respectivamente (Tabla 1). En invierno, los
ácidos grasos totales así como los SFA y los MUFA fueron significativamente mayores en
los músculos de los animales que mamaron hasta el sacrificio (617 vs. 488, p<0.05) , (341
vs. 265, p<0.5) y (243 vs. 190, p<0.05). En los animales nacidos en otoño el contenido de
104
SFA, MUFA, PUFA y ácidos grasos totales fue mayor en el lomo de los animales que
mamaron hasta el sacrificio pero las diferencias no fueron significativas, únicamente se
observó una tendencia en los ácidos grasos saturados (264.4 vs. 225.9, p<0.1).
Tabla 1.- Contenido en ácidos grasos del lomo: efecto época de partos y
amamantamiento
PARTOS OTOÑO
PARTOS INVIERNO
Sig
Acidos
PARTOS
grasos
mg/100g
No
Destet.
Sig
No dest.
Destet
Sign N d
D
músc.
dest.
SFA
264.4
225.9
+
340.7
265.2
*
**
NS
MUFA
176.4
160.2
NS
243.1
189.6
*
**
NS
PUFA
32.2
33.3
NS
32.7
33.9
NS
NS NS
Total
473,1
419.4
NS
616.6
488.8
*
**
NS
ω3
C1833
C2033
C2053
C2263
13.0
4.42
1.13
3.26
4.19
11.6
3.32
1.38
2.96
3.97
NS
*
NS
NS
NS
14.1
4.99
1.02
3.68
4.37
10.7
3.39
1.08
2.79
3.47
*
***
NS
NS
+
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
ω6
18.2
21.0
NS
17.6
Cla911
1.03
0.60
NS
1.06
p<0.1 =+; p<0.05=*; p<0.01=**; p<0.001=***
22.5
0.63
*
**
NS
NS
NS
NS
El contenido total de ácidos grasos poliinsaturados fue prácticamente igual para todos
los grupos de animales. Sin embargo se encontraron diferencias significativas en los
contenidos de varios de ellos por separado. El contenido de ω3 fue significativamente
mayor en los animales nacidos en invierno que mamaron hasta el sacrificio respecto a los
que fueron destetados (14.1 vs 10.7, p<0.05). Por el contrario los niveles de ω6 (Tabla 1) y
por lo tanto el índice ω6 / ω3 (Tabla 2) fueron mayores en los animales destetados al entrar
en cebadero, aproximadamente dos meses antes del sacrificio, de nuevo los datos de las
muestras procedentes de partos de otoño no fueron significativas pero si lo fueron las de los
partos de invierno (18 vs 23, p<0.05) y (1.26 vs. 2.10, p<0.001). En los animales que
mamaron hasta el sacrificio se encontraron, (Tabla 1) niveles superiores de Cla 9:11 (1.06
vs. 0.63, p<0.01), de ácido α-linolénico (5 vs. 3.4, p<0.001) y de ácido docosahexanoico
(4.37 vs. 3.47, p<0.1).
105
Tabla 2.-Porcentaje de ácidos grasos e índices nutricionales del lomo: efecto de la época de
partos y del destete.
PARTOS OTOÑO
PARTOS INVIERNO
% sobre total
de ácidos
No
Destet. Sig
No
Destet Sign
grasos
dest.
dest.
%SFA
55.9
53.9
+
55.2
54.0
NS
%MUFA
37.2
37.9
NS
39.4
38.8
NS
%PUFA
6.8
8.1
NS
5.4
7.2
+
Índices
PUFA/SFA
0.12
0.15
+
0.09
0.13
+
ω6/ω3
1.42
1.82
NS
1.26
2.10
***
p<0.1 =+; p<0.05=*; p<0.01=**; p<0.001=***
Sig PARTOS
N dest Dest.
NS
+
+
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
SFA: saturated fatty acids
MUFA: monounsaturated fatty acids
PUFA: polyunsaturated fatty acids
ω3: Suma de C18:3n-3, C20:3n-3, C20:5, C22:5 y C22:6
ω6: Suma de C18:2, C18:3n-6, C20:2, C20:3n-6, C20:4 y C22:2
Cla911: Conjugated linoleic acid cis9, trans11
C1833: C18:3(n-3) : α-Linolenic acid
C2033: C20:3(n-3): Eicosatrienoic acid
C2053: C20:5(n-3): Eicosapentaenoic acid
C2263: C20:6(n-3): Docosadienoic acid
Tabla 3.- Efecto de la época de partos y del destete en el peso al sacrificio, el peso de la
canal y la ganancia media diaria.
PESOS
Peso
sacrificio
Gmd
total
Peso
canal
SUPREMA
OTOÑO
INVIERNO
Sig
NORMAL
OTOÑO
Sig AMAMANTAMIENTO
INVIERNO
Sign
OTOÑO
INVIERNO
379.0
384.0
NS
337.1
399.6
**
**
NS
1404.5
1420.0
NS
1244.2
1495.1
***
**
NS
198.1
202.5
NS
168.5
217.8
***
***
NS
p<0.1 =+; p<0.05=*; p<0.01=**; p<0.001=***
Los animales de partos de otoño pesaron al nacer 44.84kg y 163.64kg al entrar en el
cebadero y los de partos de invierno 45.13kg al nacer y 142.74kg al entrar en cebadero. Los
terneros nacidos en otoño entraron en cebadero con 117.87d de edad y los nacidos en
invierno con 84.9d.
Los terneros que estuvieron mamando hasta el sacrificio, permanecieron en el cebadero
entre 122 y 154d mientras que los que fueron destetados a su entrada en el cebadero
106
permanecieron en él entre 114 y 85 d. Todos los terneros fueron sacrificados con una edad
aproximada de 237d.
Los animales de partos de invierno presentaron, (Tabla 3), un peso al sacrificio
superior que los terneros nacidos en otoño, aunque las diferencias solo fueron significativas
en los animales destetados al entrar en cebadero (337 vs. 399, p<0.01)
La ganancia media diaria fue también mayor en los terneros nacidos en invierno frente
a los nacidos en otoño pero las diferencias sólo fueron significativas en los animales
destetados antes del sacrificio (1244 vs. 1495, p<0.001).
En cuanto a los animales nacidos en otoño tanto el peso al sacrificio como la ganancia
media diaria y el peso de la canal fueron significativamente mayores en los terneros que
estuvieron mamando hasta el sacrificio (379 vs. 337, p<0.01), (1404 vs. 1244.29, p<0.01) y
(198 vs. 168, p<0.001).
Se puede concluir que los terneros nacidos en invierno y destetados antes del sacrificio
mostraron niveles mas elevados de CLA, MUFA, SFA y ácidos grasos totales. Aunque no
hubo diferencias significativas entre el efecto destete y época de partos para el contenido en
PUFA, los terneros nacidos en invierno destetados y sin destetar mostraron contenidos
mayores de ω3 y ω6 PUFA respectivamente.
BIBLIOGRAFÍA
Bligh, E.G., & Dyer, W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification.
Canadian Journal of Biochemestry Physiology, 37,1911-1912.
Boccard, R. y Bordes, P (1959). Característiques qualitatives el tecnologiques des viandes
bovines: Influence des facteurs de poduction. Production de viande bovine. Edit. Micol. D.
INRA. París, 61-84
Health department (1994). Nutricional Aspects of Cardiovascular Disease. Report on
Health and Social Subjects no.46. Londoon: H.M. Stationary Office.
Englis Food Advisory Comitee (1990). Report on review of food laelling and advertising.
Her Majesty´d Stationery Office, London.
Huerta. Leindez, N.; Ríos, G. (1993). La castración del bovino a diferentes estadios de su
crecimiento. 1. Efectos sobre el comportamiento productivo. Rev. Fac. Agron. (LUZ), 10:
87-115.
Ip, C., Scimeca, J.A., Thompson, H.J. Conjugated linoleic acid cancer. Supp. 1994; 74(3):
1050-1054.
Malau-Aduli, A.E.O.; Siebert, B.D.; Bottema, C.D.K. y Pitchford, W.S. (1998). Breed
comparison of the fatty acid composition of muscle phospholipids in Jersey and Limousin
cattle. J. Anim. Sci., 76: 766-773.
Monserrat, L.; Carballo, J.A.; Brea, T.; Varela, A.; Sánchez, L.; Iglesias, A; Calvo, C. y
Dios, A. (1999), Producción de carne de vacuno joven con las razas Rubia Gallega,
Holstein Friesian y su cruce.
Memoria 1997 CIAM.: 103-105. Edit. Xunta de Galicia.
Moreno, T., Varela, A., Oliete, B., Carbalo, J.A., Sánchez, L., & Monserrat, L.(2006).
Nutricional caracteristics of veal from weaned and unweaned calves: discriminatory ability
of the fat profile. Meat Science, 73,209-217.
Morrison, W., & Smith, L.M. (1964). Preparation of fatty acid methyl ester and dimethylacetate from lipids with boron fluoride methanol. Journal of Lipid Research, 5, 600-608.
107
Renerre, M. (1982). La coleur de la viande et sa mesure. Bull Techen. CRZV Thies., 47,
47-54.
SAS Institute Inc., SAS/STAT (1999). Users Guide. Version 8, Cary, NC.: SAS Institute
Inc., 3884 pp.
Varela, A. (2002). Estudio de las variables que afectan a la producción del tipo “Cebón” .
Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela.
108
EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA
CALIDAD DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. I. TERNEROS
FAT QUALITY. I. YOUNG BULLS
ZEA, J., DÍAZ, Mª D. Y CARBALLO, J. A.
Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo. Consellería del Medio Rural. Xunta de
galicia
PALABRAS CLAVE: ensilado pradera, ensilado maíz, ácidos grasos.
ABSTRACT
The effect of the slaughter weight (375, 410, and 450 kg), in young bulls fed with
silage (maize or grass), in some characteristics of the carcass and the meat, as well as
outline of the fat acids of the meat was studied.
The increase of the slaughter weight improved the dressing percentage, carcass
conformation, carcass fattening, and meat marbling, without considerably affecting the
tenderness, water retention capacity, or the colour of the meat. The total of the saturated
fatty acids (SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), polyunsaturated fatty acids
(PUFA), ω-6 fatty acids, ω-3 fatty acids, either the PUFA/SFA or ω-6/ω-3 relationships
were modified by the increase of the slaughter weight.
The animals fed with maize silage have better dressing percentage, better carcass
conformation, more kidney fat, and the meat a little more light, than the ones fed with grass
silage, where there are more water losses. The kind of silage did not considerably affect any
of the nutritional index (SFA, MUFA, PUFA, ω-6, ω-3).
RESUMEN
Se estudia el efecto del peso de sacrificio (375, 410 y 450 kg) en terneros
alimentados a base de ensilado de maíz o pradera en algunas características de la canal y la
carne así como en el perfil de los ácidos grasos de la carne.
El incremento del peso de sacrificio mejora el rendimiento, la conformación, el
engrasamiento canal y el veteado de la carne, sin que afecte de modo importante a la
terneza, capacidad de retención de agua o color de la carne. El total de ácidos grasos
saturados (AGS), monoinsaturados (AGM), poliinsaturados (AGP), ω-6, ω-3, ni las
relaciones AGP/AGS o ω-6/ω-3 se ven modificadas por el aumento del peso de sacrificio.
Los animales alimentados con ensilado de maíz tienen mejor rendimiento, conformación,
mas grasa de riñonada y carne ligeramente más clara, que los alimentados con ensilado de
pradera, en los que las perdidas de agua en la carne por presión y cocción son mayores. El
tipo de ensilado no afectó significativamente a ninguno de los índices nutricionales
determinados (AGS, AGM, AGP, ω-6, ω-3).
109
INTRODUCCIÓN
El objetivo es la producción de canales, que dentro de su condición de procedentes de
forrajes, se adapten a la demanda del mercado. Al aumentar la ingestión de energía la carne
y el hueso disminuyen y la grasa aumenta, resultando carne con savor más agradable. En
general, se puede decir que el aumento del peso de sacrificio disminuye la relación
músculo/hueso y aumenta la grasa. Dado que los forrajes no son iguales (el ensilado de
maíz es más energético que el de pradera), las canales procedentes de distintos forrajes no
tienen por qué ser iguales.
El peso del animal y la alimentación afectan a la grasa intramuscular, subcutánea y
al perfil de los ácidos grasos que la componen. El incremento de la grasa se caracteriza por
el aumento del porcentaje de la fracción de triacilglicéridos (ricos en AGS y AGM) y por la
disminución, leve, del porcentaje relativo a las fracciones de fosfolípidos (ricos en AGP) y
colesterol; situación que determina cambios en los ácidos grasos totales.
MATERIAL Y METODOS
El diseño experimental fue: 2 ensilados (maíz y pradera) x 3 pesos de sacrificio (375, 410 y
450 kg), con 30 animales por tratamiento (10 de cada raza Rubia Gallega, Holstein-Friesian
o cruce de ambas).
La alimentación fue ensilado y 1,5 o 2 kg de pienso, según fuese de maíz o
pradera. Los piensos de cebada y soja, se formularon para que las ingestiones resultasen del
14 o 12% de proteina, según que los animales fuesen de más o menos de 270 kg. Los
ensilados pradera o maíz, bien conservados y fermentados, tenian: 64,72% y 70,02% de
digestibilidad de la materia organica, 9,21 y 10,86 MJ de energia metabolizable/kg MS y
11,88 y 7,79% de proteina.
A las 48 horas la media canal izquierda se cuarteo (entre la 5ª y 6ª costilla) y
despiezó, clasificandola por conformación (E+=15,.....P-=1) y engrasamiento (1=magro,
9=muy graso). Las determinaciones en el L. thoracis (de la 6ª a la 10ª costilla), fueron: pH,
coordenadas cromáticas: L* (luminosidad), a* (rojo) y b* (amarillo), dureza (con WarnerBratzler, muestras de 1x1x5 cm cocidas 45 minutos a 75ºC), consistencia (1=firme seca,
3=blanda húmeda) y veteado (1=trazas, 5=infiltrada). Las pérdidas por goteo (Offer y
Knight, 1982), por presión (Honikel, 1997) y por cocción (Hamm, 1977) se expresan en %
sobre la muestra fresca; la composición química según normas oficiales. En papel de
acetato se dibujaron las áreas del L. thoracis de la 6ª y 10ª, midiendolas en cm2, y los
diametros máximos A y B. En el L. thoraci, se determinaron los ácidos grasos saturados
(AGS), suma de los ácidos: C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0,
C20:0, C22:0, C23:0 y C24:0; los monoinsaturados (AGM): C14:1(n-5), C:15:1, C16:1(n7), C17:1, C18:1(n-9t), C18:1(n-9c), C20:1(n-9), C22:1(n-9) y C24:1(n-9); los
poliinsaturados (AGP): C18:2(n-6t), C18:2(n-6c), C18:3(n-3), C18:3(n-6), C20:2(n-6),
C20:3(n-3), C20:3(n-6), C20:4(n-6), C20:5(n-3), C22:2(n-6) y C22:6(n-3); los -3:
C18:3(n-3), C20:3(n-3), C20:5(n-3) y C22:6(n-3); y -6: C18:2(n-6t), C18:2(n-6c),
C18:3(n-6), C20:2(n-6), C22:2(n-6), C20:3(n-6) y C20:4(n-6); y las relaciones AGP/AGS y
-6/-3.
110
El efecto del aumento del peso de sacrificio en las ganancias de peso es más
acusado con ensilado de pradera (127 y 82 g/d de peso vivo y canal) que con el de maíz
(87 y 60 g/d). Los alimentados con maíz crecieron más (1223 y 689 g/d de peso vivo y
canal) que los alimentados con ensilado de pradera (1062 y 575 g/d) (Tabla I).
Tabla I.- Ingestión (kg MS/cabeza y día), peso vivo inicial y final (kg), ganancias de
peso (g/día) e índices de conversión de la materia seca (MS).
Ingestión
Ensilado
Pradera
Peso
sacrificio
375
ensilado
410
450
Peso vivo
Ganancia peso
Ind. conv. MS
vivo
canal
p. vivo
998ª
533ª
6.05
p.
canal
11.30ª
1062b
575ªc
5.99
11.04ªb
1125c
615cd
5.74
10.44b
370.04ª
1179cd
659de
6.28
11.24ª
b
de
687ef
6.25
11.13ª
e
f
6.19
10.90ªb
total
inicial
4.257ª
6.037ª
200.62
369.72ª
4.589ªb
6.369ªb
201.10
409.20b
4.675b
6.455b
202.75
450.88c
375
6.072c
7.407c
209.93
410
cd
cd
209.77
6.311
7.646
450
6.504
d
7.839
et
0.186
p<
0.01
Pradera
d
final
409.80
c
1223
212.82
449.80
1266
719
0.186
6.062
2.082
21.224
16.692
0.167
0.274
0.01
NS
0.001
0.001
0.001
NS
0.001
4.507
6.287
201.49
409.93
1062
575
5.92
10.93
Maíz
6.295
7.631
210.84
410.00
1223
689
6.24
11.07
et
0.081
0.081
1.734
1.240
80964
5.913
0.101
0.167
p<
0.001
0.001
0.001
NS
0.001
0.001
0.001
0.001
El incremento del peso de sacrificio mejoró el rendimiento (en 0,95 y 1,05 % con
ensilados de pradera y maíz), la conformación (en 0,97 y 0,87 puntos, con pradera o maíz),
el engrasamiento (en 0,70 y 0,56 puntos, en el mismo orden) y la grasa de riñonada (en 0,18
y 0,24 puntos) (Tabla II).
111
Tabla II.- Peso canal (kg), rendimiento (%), clasificación canal, grasa de riñonada (%) y
% de delantero, trasero y pistola en la canal.
Peso
Peso
sacrificio
Ensilado
canal
Pradera 375
410
Rendi- Clasific. canal Grasa % en la canal de
miento confor. engras. riñona. delante trasero pistola
62.01
49.38ªb
61.95
49.20ªb
1.30ab 38.08
61.92
49.02ª
1.27ab 38.00
62.00
49.63b
4.03ªc 1.33bc 38.18
61.82
49.34ªb
4.43bc 1.51c
38.38
61.62
49.02ª
0.169
0.005
0.067 0.194
0.001 NS
0.194
NS
0.199
0.05
192.62 51.96ª 5.90ª 3.93ª 1.12ª 37.99
ª
214.56 52.43ª 6.27ªb 4.30ªb 1.16ab 38.05
b
450
238.58 52.91ab 6.87bc 4.63b
c
Maíz
375
194.99 52.65ª 6.63abc 3.87ª
d
410
218.03 53.22ab 7.27c
b
450
241.60 53.70b 7.50c
c
et
p<
1.819
0.001
0.366 0.319
0.001 0.001
Pradera
Maíz
215.26 52.43 6.34
218.21 53.19 7.13
4.29
4.11
1.20
1.37
38.04
38.19
61.96
61.81
49.20
49.33
et
p<
0.930
0.05
0.094
NS
0.031 0.109
0.001 NS
0.110
NS
0.113
NS
0.169 0.149
0.005 0.001
Los alimentados con ensilado de maíz tienen mejor rendimiento (53.19 vs
52.43%), conformación (7.13 vs 6,34) y menos engrasamiento canal (4,11 vs 4,29), pero
más grasa de riñonada (1.37 vs 1,20%). Es reconocido que cuando aumenta la calidad de la
dieta lo hace el rendimiento y la conformación; y el ensilado de maíz es mas energético
que el de pradera. El aumento del peso de sacrificio no afectó a las proporciónes de
delantero o trasero, pero sí a la pistola, que disminuyó ligeramente.
Aunque parece que la proporción de carne y hueso en la canal disminuye con el
peso de sacrificio, no lo hace significativamente. Sin embargo, la grasa aumenta (Tabla III),
y lo hace con los dos tipos de ensilado, aunque algo más en el caso del maíz (0,96) que en
el de pradera (0,87 %).
112
Tabla III.- Composición de la canal y áreas de longissimus thoraci al nivel de la 6ª y 10ª
costillas.
% en la canal de
Área
L. % en la canal de carne
thoraci
Ensilado Peso
carne hueso grasa 10ª
6ª
extra 1ª
2ª
3ª
sacrificio
Pradera 375
74.25 21.38ª 4.37ª 62.57ª 28.70ª 10.39 38.86 6.83 18.02
410
73.94 21.15ª 4.91bd 64.99a 29.79a 10.36 38.68 6.74 18.01
b
b
450
73.83 20.93ª 5.24
bc
c
Maíz
375
c
b
67.47 32.73b 10.36 38.59 6.71
18.02
c
74.80 20.67ª 4.52ªd 62.57ª 28.62ª 10.73 38.96 6.95
18.00
c
410
74.60 20.40b 5.03bc 66.83b 31.26b 10.77 38.99 6.89
c
450
et
p<
Pradera
Maíz
et
p<
74.25
0.370
NS
74.01
74.55
0.154
0.05
20.27c
0.310
0.05
21.15
20.44
0.114
0.001
5.48c
0.163
0.001
4.84
5.01
0.095
NS
c
c
70.10c
1.417
0.001
65.01
66.50
0.584
0.1
33.57b
0.889
0.001
30.41
31.15
0.477
NS
10.45
0.154
NS
10.37
10.65
0.088
0.1
38.63
0.267
NS
38.71
38.86
0.136
NS
6.92
0.095
0.1
6.76
6.92
0.052
0.05
17.87
18.08
0.162
NS
18.01
17.98
0.095
NS
La cantidad de carne o hueso aumenta o disminuye ligeramente al alimentar con
ensilado de maíz. El aumento de la carne se tradujo en un incremento de la carne extra
(10,65 vs 10,37%) (sólo p<0,1) y de 2ª (6,92 vs 6,76%). Zea (1978), con ganado gallego
sacrificado a 400 kg, no obtuvo respuestas a dietas que variaron de 10,2 a 11,9 MJ de EM/
kg de MS. En uno de los tres experimentos se observó una ligera disminución en la
proporción de carne, mientras que en los otros se observó un pequeño aumento. Kousgaard
(1979), encontró que el porcentaje de carne aumenta con el nivel de nutrición, pero no
observó diferencias hasta niveles próximos al 85% de la ingestión energética máxima,
concluyendo que el nivel energético tiene poca influencia en la proporción de carne en la
canal.
El peso de sacrificio no afectó a las pérdidas de agua (Tabla IV). Las pérdidas por
presión o cocción fueron más altas en los animales alimentados con ensilado de pradera.
Aunque para Wismer-Pedersen (1994), la capacidad de retención de agua disminuye con la
edad, nuestros resultados se explican porque el intervalo de pesos de sacrificio fue pequeño
y para Sañudo (1992), la alimentación no es un factor importante de variación de las
pérdidas de agua.
113
Tabla IV.- Pérdidas en la carne por goteo, presión y cocción e índices cromáticos de la carne y grasa.
Perdidas
Ensilad Peso sacrificio
o
Pradera 375
Ind. cromáticos carne
Ind. cromáticos grasa
goteo
presión cocción
L*
1.55
24.44ªc
31.13
36.53ac
410
1.67
c
24.48ª
30.89
36.54
ac
450
1.60
25.00a
31.01
375
1.62
23.06b
410
1.55
450
1.53
et
0.068
p<
NS
Pradera
1.61
Maíz
1.57
et
0.037
p<
NS
Maíz
a*
b*
L*
15.50
7.88ª
68.77ª
ab
a*
b*
6.28ab
11.23ª
6.24ab
11.50ªb
15.42
7.86ª
68.13
36.28ª
15.70
7.94ab
67.45ab 6.64ª
29.42
37.74b
15.54
8.39b
67.51ab 5.91ab
12.39ª
23.41b
29.47
37.24bc
15.29
8.36ab
67.18ab 5.80b
10.82ª
23.62bc
30.36
36.82ac
15.58
8.32ab
66.61b
5.76b
10.57ª
0.340
0.614
0.325
0.210
0.180
0.638
0.271
0.349
0.005
0.1
0.01
NS
0.05
0.05
0.05
0.05
24.64
31.01
36.45
15.54
7.89
68.12
6.39
11.68
23.36
29.75
37.27
15.47
8.35
67.10
5.82
10.59
0.197
0.357
0.108
0.115
0.094
0.325
0.156
0.200
0.001
0.05
0.005
NS
0.001
0.05
0.05
0.001
12.30b
Únicamente el índice de luminosidad L* de la carne que disminuyó y el b* de la grasa que
aumentó (sólocon ensilado de maíz), variaron con el incremento del peso de sacrificio. La
ausencia de efectos importantes en el color se debería a que el aumento de la cantidad de
pigmentos con la edad no es lineal, sino que sigue una tendencia sigmoide (Journe y
Teissier, 1982), alcanzándose la cima a los 18-24 meses en el caso de animales de gran
formato.
Los índices cromáticos L* y b* de la carne resultaron mas altos, y los L*, a* y b* de la
grasa más bajos, cuando los animales reciben ensilado de maíz (Tabla V), lo que haría la
carne de estos animales más clara y la de grasa más obscura. Aunque para Sañudo, 1992) la
naturaleza de la alimentación no tiene demasiada importancia en los índices cromáticos de
la carne, también se ha indicado que un nivel energético alto disminuye la concentración de
pigmentos heminicos (Lawrie, 1977), lo que sería el caso de los animales alimentados con
ensilado de maíz.
114
Tabla V.- Veteado, consistencia, terneza, pH y composición química de la carne.
ConsisEnsilado Peso sacrificio
Veteado
Pradera 375
tencia
Composición química de la carne(%)
Dureza
pH
proteína
grasa
cenizas
humed.
1.08ª
1.11
7.39
5.48
21.73
0.82ª
1.21ª
76.24ª
410
1.23ab
1.11
7.32
5.47
21.68
0.99ab
1.20b
76.14ªb
450
1.38b
1.04
7.26
5.47
21.65
1.07b
1.20b
76.08ªb
375
1.17ac
1.09
7.15
5.50
21.83
0.96ab
1.20ab
76.00ab
410
1.19ac
1.12
7.32
5.50
21.76
1.04b
1.19b
75.97b
450
1.28bc
1.10
7.49
5.47
21.69
1.10b
1.19b
76.02ªb
et
0.061
0.040
0.285
0.017
0.078
0.079
0.005
0.093
p<
0.05
NS
NS
NS
NS
0.05
0.005
0.05
Pradera
1.23
1.09
7.32
5.47
21.69
0.96
1.20
76.15
Maíz
1.22
1.10
7.32
5.49
21.76
1.03
1.19
76.00
et
0.035
0.023
0.167
0.008
0.038
0.045
0.003
0.048
p<
NS
NS
NS
0.1
NS
NS
0.05
0.05
Maíz
El aumento del peso de sacrificio no afectó a la consistencia o a la terneza de la carne pero
sí al veteado, que aumentó (Tabla V). Según Shorthouse y Harris (1990), el peso vivo es
uno de los principales factores que determina la dureza de la carne, pero sin embargo, existe
un periodo, aproximadamente entre los 9 y los 16 meses de edad, en el que se produce una
estabilidad en la dureza de la carne (Touraille, 1982).
115
Tabla VI.- Ácidos grasos saturados (AGS), ácidos grasos monoinsaturados (AGM),
ácidos grasos poliinsaturados (AGP), ácidos ω-6 y ω-3 y relación AGP/AGS y ω-6/ω-3,
en la grasa del L.thoracis.
Peso
AGS
AGM AGP
AGP/A ω-6/ω-3
ω-6
ω-3
Ensilado sacrificio
GS
Pradera 375
1015.1 1279.8ªb 150.04 84.706 65.334 0.159
1.359
410
951.91 1174.3ª 136.19 74.349 61.838 0.158
1.255
450
987.93 1331.8ªb 142.97 77.041 65.930 0.156
1.241
b
Maíz
375
997.16 1274.3ª 136.27 74.090 62.180 0.145
1.241
410
1062.0 1472.8b 154.86 92.166 62.696 0.151
1.437
450
1035.7 1436.5ªb 141.28 82.698 58.581 0.146
1.461
et
84.204 105.697 136.187 9.915
3.851 0.017
0.180
p<
NS
0.05
NS
NS
0.1
NS
NS
Pradera
984.97 1262.0 143.07 78.699 64.367 0.158
1.285
Maíz
1031.7 1394.6 144.14 82.984 61.152 0.147
1380
et
40.954 51.407 5.429
4.822
1.873 0.008
0.087
p<
NS
0.1
NS
NS
NS
NS
NS
El tipo ensilado no modificó ni el veteado, ni la consistencia, ni la dureza de la
carne. Sin embargo, autores
como Bruce et al. (1991), concluyen que un aumento en el nivel de alimentación conduce a
una mejora de la terneza,que lo atribuyen al incremento del veteado, cosa que en nuestro
caso no ocurrió. Alberti et al., (1988) no encontraron diferencias en la terneza de la carne de
terneros alimentados con dietas más o menos energéticas. La grasa de la carneaumentó con
el peso de sacrificio (Tabla V) y la de humedad en los animales alimentados con ensilado
de maíz.
Ninguno de los AGS, AGM o AGP determinados fueron modificados, de forma
significativa, por el aumento del peso de sacrificio. El tipo de ensilado únicamente afectó
significativamente a los ácidos C22:0 (behenico) y C24:1(n-9) (nervonico), que resultaron
más altos en los terneros alimentados con ensilado de maíz.
El aumento del peso de sacrificio no afectó, de modo significativo, ni al total de
AGS, AGM o AGP, ni a los ácidos de las series ω-6 y ω-3, ni a las relaciones AGP/AGS o
ω-6/ω-3. El tipo de ensilado consumido tampoco parece afectar a ninguno de estos índices
nutricionales (Tabla VI). Hay autores como Weeb et al., (1998) que indican que el
incremento del peso de sacrificio influye en el perfil de los ácidos grasos (ligera
disminución de los AGP y un aumento de los AGS y de los AGM), o como Varela (2002,),
que encontró que el ácido estearico (C18:0) aumentaba y los AGP disminuían
ligeramente con el peso de sacrificio, lo que achacaron al aumento del engrasamiento. Si el
grado de engrasamiento es el principal responsable de las variaciones en el perfil de los
ácidos grasos se explican fácilmente nuestros resultados, pues nuestros animales tenían
menos grasa y peso que los de los autores comentados. Por otra parte, el aumento del
engrasamiento con el peso de sacrificio fue pequeño. No hay que olvidar que las razas
116
empleadas son de engrasamiento lento y tardío, y no sería suficiente para detectar de forma
significativa posibles variaciones en el perfil de los ácidos grasos de la grasa de infiltración
en el músculo L. Thoraci.
CONCLUSIONES
Incrementando el peso de sacrificio, de 375 a 450 kg, es posible mejorar la
conformación de la canal, más en los animales alimentados con ensilado de pradera que en
los alimentados con ensilado de maíz, sin que afecte de forma negativa a la calidad de la
carne, ni modifique el perfil de ácidos grasos de la misma.
Los animales alimentados con ensilado de maíz resultan mejores desde el punto de vista
carnicero, y ligeramente peores desde el punto de vista dietético (más AGS y menos AGP y
ω-3) que los de ensilado de pradera.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTI, P.; SAÑUDO, C.; LAHOZ, F.; JAIME, J.; TENA, T., 1988. Características de
la canal y de la calidad de la carne de los terneros cebados con dietas forrajeras y
suplementados con distintas cantidades de pienso. ITEA, 76: 3-4.
BRUCE, H.L.; BALL, R.O.; MOWATT, D.N.,1991. Effects of compesatory growth and
protein metabolism and meat tenderdess of beef steers. Can. J. Anim.Sci., 71: 659-671.
HAMM, R., 1977. Citado por Pla (2001)
HONIKEL, K. O., 1997. Reference method supported by OECD and their use in
mediterranean meat products. Food Chemestry, 9 (4): 573-582.
JOURNE, H. E.; TEISSIER, J. H., 1982. Caractéristiques et qualité de la viande de bovine.
Techn. Agric. 1: 3392-3411.
KOUSGAARD, K., 1979. Seminar: Energy and protein feeding standards for beef cattle.
Theix. Francia.
Lawrie, R.A., 1977. Ciencia de la carne. Ed. Acribia. Zaragoza. España.
OFFER, G.; KNIGHT, P., 1988. The structural basis of water-holding in meat. Part. 2: Drip
losses. En Developments in meat science, 4: 121-134. Ed. R. Lawrie. Elsevier. Oxford.
PLA, M., 2001. Medida de la capacidad de retención de agua. En Metodología para el estudio
de la calidad de la canal y de la carne en rumiantes., 173-179. Co V. Cañeque; C Sañudo.
Monografias INIA. Serie Ganadera nº 1 Madrid.
SAÑUDO, C., 1992. Calidad organoleptica de la carne. En Tecnologia u calidad de productos
carnicos., 29-44. Ed. M. J. Beriain. ETSIA. Pamplona.
SHORTHOUSE, W.R.; Harris, J.J.,1990. Effect of animal age on the tenderness of selected
beef muscle. J. Food of Technology, 55(1): 1-8
TOUREILLE, C., 1982. Influence du sexe et de l’âge a l’abattage sur les qualités
organoleptiques des viandes de bocins Limousins abattus entre 16 et 36 mois. Bull. Tech.
CRZV Theix, 48, 83-89.
VARELA, A., 2000. Estudio de las variables que afectan a la producción del tipo “Cebon”.
Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela. No publicada.
WEEB, E. C.; De Smet, S.; Van Nevel, C.; Martens, B.; Demeyer, D. Y., 1998. Effect of
anatomical location on the composition of fatty acids in double-muscled Belgian Blue
cows. Meat Sci., 50: 45-53.
117
WISMER-PEDERSEN, J., 1994. Química de los tejidos animales. En Ciencia de la carne y los
productos carnicos, 125-149. Ed. J.F. PRICE, B.S. SCHWEIGERT. Acribia. Zaragoza.
España.
ZEA, J., 1978. Utilización de forrajes para la producción de añojos de la raza Rubia
Gallega. Tesis Doctorales INIA nº 10. Madrid.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar su agradecimiento al INIA y a la Secretaría Xeral de
Investigación e Desenvolvemento de la Xunta de Galicia por la financiación de los
Proyectos: XM-99-003 (Mejora de la calidad de la canal y la carne de vacuno joven
alimentados a base de forrajes ensilados) y PGIDT02RAG50301PR (Efecto de la raza,
sexo, peso de sacrificio y dieta en el perfil de ácidos grasos de la carne de vacuno joven), de
los que se obtuvieron los datos aquí expuestos.
118
EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA
CALIDAD DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. II. TERNERAS
EFFECT OF SLAUGHTERED WEIGHT AND SILAGE TYPE ON CARCASS, MEAT
AND FAT QUALITY. II. HEIFERS
ZEA, J., DÍAZ, Mª D. Y CARBALLO, J. A. Centro de Investigaciones Agrarias de
Mabegondo. Conselleria del Medio Rural. Xunta de Galicia
PALABRAS CLAVE: ensilado pradera, ensilado maíz, ácidos grasos.
ABSTRACT
The effect of the slaughter weight (375, 410, and 450 kg), in heifers fed with maize silage
or grass silage, in some characteristics of the carcass and the meat, as well as outline of the
fat acids of the meat was studied.
The increase of the slaughter weight improved dressing percentage, the quantity of the meat
(it only improved the fatty in the heifers fed with grass silage), and meat marbling; without
considerably affecting the tenderness, the water retention or the colour of the meat.
The heifers fed with maize silage have better carcass conformation, more kidney fat, less
fattening carcass, the fat a little more dark and less water losses. The meat of the heifer fed
with maize silage has less polyunsaturated fatty acids (PUFA) and ω-3 fatty acids, than the
ones fed with grass silage.
RESUMEN
Se estudia el efecto del peso de sacrificio (375, 410 y 450 kg) en terneras
alimentados con ensilados de maíz o pradera en algunas características de la canal y la
carne así como en el perfil de los ácidos grasos de la carne.
El aumento del peso de sacrificio mejoró el rendimiento, la cantidad de grasa (el
engrasamiento sólo en las alimentadas con ensilado de pradera) y el veteado, sin que afecte
a la terneza, perdidas de agua o color de la carne.
Las terneras alimentados con ensilado de maíz tienen mejor conformación, mas grasa de
riñonada, menos grasa de cobertura, la grasa ligeramente más oscura y menores perdidas de
agua por presión. La carne de las terneras alimentadas con ensilado de maíz tiene menos
AGP y ω-3, que los alimentados con ensilado de pradera.
INTRODUCCIÓN
Se ha admitido que la conformación y el engrasamiento que se les exige a las
canales son difíciles de alcanzar con animales de maduración tardía alimentados con dietas
forrajeras y sacrificados a los pesos ligeros. De aquí que se recomiende un acabado con
concentrado. Sin embargo, estos mismos efectos se producen con el aumento del peso de
sacrificio: mejora la conformación, aumenta la grasa y disminuye la carne y el hueso,
mejorando en conjunto la calidad de la canal.
El objetivo es evaluar el efecto mejorante del incremento del peso de sacrificio
(375, 410 y 450 kg, que son usuales en Galicia) en la calidad de la canal, la carne y la grasa
de terneras alimentadas a base de ensilados de maíz o pradera, distintos energéticamente, lo
que “per se” puede afectar a las características de la canal, la carne y la grasa.
119
MATERIAL Y METODOS
El diseño experimental fue un factorial: 2 ensilados (maíz y pradera) x 3 pesos de
sacrificio (375, 410 y 450 kg), con 30 terneras por tratamiento (10 Rubias Gallegas,10
Holstein-Friesian y 10 cruzadas de ambas)
La alimentación consistió en ensilado a voluntad y 1,5 o 2 kg de pienso según fuese
ensilado de maíz o pradera. Los piensos, a base de cebada y soja, se formularon para que
las ingestiones resultasen con el 14% o el 12% de proteína bruta, dependiendo de que los
animales fuesen de más o menos de 270 kg. Los ensilados estaban bien conservados y
fermentados, resultando con digestibilidades de la materia orgánica de 70,02 y 64,72%;
proteína bruta de 7,79 y 11,88%; concentración energética de 10,86 y 9,21 MJ de EM/kg
MS, según fuese de maíz o pradera.
A las 48 horas, se cuarteo la media canal izquierda entre la 5ª y 6ª costillas. La canal se
clasificó según la UE (E+ =15,.....P-=1); para el engrasamiento la escala fue: magro=1,....
muy graso=9. Las determinaciones realizadas a las 24 horas en la carne (L. thoracis de la 6ª
a la 10ª costilla) fueron: pH, coordenadas cromáticas: L* (luminosidad), a* (rojo) y b*
(amarillo), dureza (con célula Warner-Bratzler sobre muestras de 1x1x5 cm cocidas 45
minutos a 75ºC), consistencia (1=firme seca, 3=blanda húmeda) y el veteado (1=trazas,
5=infiltrada). Las pérdidas por goteo (drip loss), por presión (capacidad de retención de
agua) y por cocción se expresan en % de muestra fresca; la composición química según
normas oficiales. Sobre papel de acetato se dibujó el perímetro L. thoracis en las costillas 6ª
y 10ª determinándose las áreas (cm2) y las distancias A y B (diámetros máximos
perpendiculares).
Para la determinación de los ácidos grasos se extrajo la grasa, y después de la
metilación se analizó según la norma ISO 5508. Se calculan: ácidos grasos saturados
(AGS), suma de los ácidos: C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0,
C20:0, C22:0, C23:0 y C24:0; ácidos grasos monoinsaturados (AGM), suma de los ácidos:
C14:1(n-5), C:15:1, C16:1(n-7), C17:1, C18:1(n-9t), C18:1(n-9c), C20:1(n-9), C22:1(n-9) y
C24:1(n-9); ácidos grasos poliinsaturados (AGP), suma de los ácidos: C18:2(n-6t),
C18:2(n-6c), C18:3(n-3), C18:3(n-6), C20:2(n-6), C20:3(n-3), C20:3(n-6), C20:4(n-6),
C20:5(n-3), C22:2(n-6) y C22:6(n-3); -3, suma de los ácidos: C18:3(n-3), C20:3(n-3),
C20:5(n-3) y C22:6(n-3); y -6, que son la suma de los ácidos: C18:2(n-6t), C18:2(n-6c),
C18:3(n-6), C20:2(n-6), C22:2(n-6), C20:3(n-6) y C20:4(n-6); y las relaciones AGP/AGS y
-6/-3.
El efecto del aumento del peso de sacrificio en las ganancias de peso vivo resultó
de 60 y 75 g/día con ensilado de pradera o maíz, y de 47 y 62 g/d cuando se considera el
peso canal. Los animales alimentados con maíz ensilado crecieron más que los alimentados
con ensilado de pradera (108 y 67 g/d de peso vivo y canal) (Tabla I).
120
Tabla I.- Ingestión (kg MS/cabeza y día), peso vivo inicial y final (kg), ganancias de peso (g/día) e índices de
conversión de la materia seca (MS).
Ingestión
Ensilad
o
Pradera
Peso vivo
Peso sacrificio
ensilado
total
inicial
final
375
4.192ª
5.975ª
202.41
201.12
410
4.306ª
6.089ª
Ganancia peso
Ind. conv. MS
vivo
canal
p. vivo
p. canal
373.12ª
925ª
473ª
6.46ª
12.54ªd
409.28
b
950
ab
ab
6.41ª
12.15ªb
b
985
bc
b
6.20ª
11.66b
498
450
4.324ª
6.107ª
202.07
449.35
375
5.909b
7.244b
208.75
369.90ª
1029cd
532bc
7.04b
13.52c
410
6.053
b
b
209.13
409.50
b
de
c
b
12.96cd
450
6.150b
7.485b
207.62
448.88b
1104e
594d
6.78b
12.64d
et
0.231
0.231
5.616
1.605
18.525
14.838
0.125
0.274
p<
0.001
0.001
NS
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
Pradera
4.266
6.049
201.87
410.58
954
505
6.35
12.11
Maíz
7.388
1054
520
565
7.01
6.028
7.363
208.50
409.73
1062
572
6.94
13.04
et
0.138
0.138
1.756
0.955
8.616
5.713
0.076
0.157
p<
0.001
0.001
0.01
NS
0.001
0.001
0.001
0.001
Con el incremento del peso de sacrificio mejoró el rendimiento (1,18 y 1,37 % con
ensilados de pradera y maíz), el porcentaje de grasa de riñonada (en 0,49 y 0,72) y el
engrasamiento de la canal (únicamente en el caso de ensilado de pradera en 0,40 puntos),
disminuyendo la pistola en las alimentadas con ensilado de pradera (Tabla II).
121
Tabla II.- Peso canal (kg), rendimiento (%), clasificación canal, grasa de riñonada (%) y %
de delantero, trasero y pistola en la canal.
Peso
Rendi- Clasific. canal Grasa
% en la canal de
Ensilado Peso sacrificio
Pradera
375
410
450
Maíz
375
410
450
et
p<
Pradera
Maíz
et
p<
canal
189.39ª
211.02b
233.39c
miento
50.73ª
51.55ab
51.91b
confor.
5.63ª
5.80ª
6.07ª
engras.
4.87ª
5.07ª
5.27b
riñona.
1.84ª
2.12ªb
2.33b
delante
35.98
36.08
35.99
trasero
64.02
63.92
64.01
pistola
50.76ª
49.95b
49.89b
187.59ª
212.07b
233.83c
1.753
0.001
50.72ª
51.79ab
52.09b
0.364
0.05
6.27ab
6.90b
7.00b
0.298
0.001
4.77ª
4.87ª
4.93ª
0.102
0.05
2.20ªb
2.83c
2.92c
0.166
0.001
35.69
35.82
35.85
0.166
0.1
64.31
64.18
64.15
0.166
0.1
50.67ª
50.37ªb
50.19ªb
0.229
0.01
211.27
211.17
0.783
NS
51.37
51.53
0.162
NS
5.83
6.72
0.1254
0.001
5.07
4.86
0.059
0.05
2.10
2.73
0.077
0.001
35.99
35.79
0.088
NS
64.01
64.21
0.089
NS
50.20
50.41
0.096
NS
Las terneras alimentadas con ensilado de maíz tienen mejor conformación (6,72 vs
5,83) y más grasa de
riñonada (2,73 vs 2,10), pero menos engrasamiento canal (4,86 vs 5,07) que los
alimentados a base de ensilado de
pradera lo que se explica por la mayor riqueza energética de las dietas de maíz (Andersen
et al., 1984). A diferencia de lo que había ocurrido con los machos no mejoró el
rendimiento.
La cantidad de grasa en la canal (Tabla III) aumenta con el peso de sacrificio,
aunque algo más en el caso del maíz (1,07 %) que en el de pradera (0,96 %). Con el
ensilado de maíz aumenta la cantidad de carne y disminuye la de hueso, sin que el tipo de
ensilado afecte a la grasa. Kousgaard (1979), alimentando terneros con cuatro niveles de
nutrición, encontró que el porcentaje de carne aumenta con el nivel de nutrición, pero no
observó diferencias importantes hasta niveles próximos al 85% de la ingestión energética
máxima, de lo que concluye que el nivel energético tiene una escasa influencia en la
proporción de carne en la canal.
122
Tabla III.- Composición de la canal y áreas de longissimus thoraci al nivel de la 6ª y 10ª
costillas.
% en la canal de
Ensilado
Peso
sacrificio
carne
hueso
Pradera
375
72.79ab
410
72.44ab
450
Maíz
Área L. thoraci
grasa
10ª
20.51ª
6.77ª
20.41ª
7.15ªb
72.14ª
20.13ªb
375
73.41b
410
450
% en la canal de carne
6ª
extra
1ª
2ª
58.33ª
27.70ª
10.95
37.45
6.42
17.80ª
58.58ª
28.72ªb
10.74
37.11
6.36
18.07ªb
7.73b
59.95ab
29.86b
10.69
36.75
6.31
18.23ªb
19.95ªb
6.65ª
59.34ab
27.76ª
11.32
37.40
6.49
18.04ªb
72.96ªb
19.57b
7.47b
63.54bc
30.51bc
11.04
37.04
6.42
18.29ªb
b
b
b
65.08
c
31.97
c
11.03
36.81
6.32
18.44b
7.72
3ª
72.77ª
19.51
et
0.399
0.262
0.241
1.522
0.695
0.221
0.317
0.086
0.180
p<
0.05
0.01
0.01
0.005
0.001
0.1
NS
NS
0.05
Pradera
72.46
20.35
7.22
58.95
28.76
10.80
37.10
6.37
18.03
Maíz
73.04
19.68
7.28
62.65
30.08
11.13
37.09
6.41
18.25
et
0.158
0.088
0.132
0.628
0.349
0.098
0.126
0.047
0.100
p<
0.01
0.001
NS
0.001
0.01
0.1
NS
NS
NS
La carne aumentó con el ensilado de maíz, lo que se tradujó en un incremento de la
carne extra (11,30 vs 10,80%), pero sólo con p<0.1. Otro efecto mejorante del maíz con
relación al ensilado de pradera es el aumento de las áreas del l. thoracis en la 6ª y 10ª
costilla (Tabla III), cosa que no había ocurrido con machos (Zea et al., 2006).
El aumento del peso de sacrificio no afectó a la intensidad de las pérdidas de agua
por goteo, presión o cocción (Tabla IV); si bien, las pérdidas por presión fueron más altas
en las alimentadas con ensilado de pradera, como había ocurrido con los machos (Zea et al.,
2006). Aunque Sañudo (1992) establece que la alimentación no es un factor importante de
variación de la capacidad de retención de agua, también encuentra que la jugosidad de la
carne de los animales alimentados a base de pienso es mayor que la de los alimentados a
pasto, lo que puede explicar nuestros resultados de mayores pérdidas por presión con el
ensilado de pradera, menos energético que el de maíz.
123
Tabla IV.- Pérdidas en la carne por goteo, presión y cocción e índices cromáticos de la
carne y grasa.
Ensilado Peso sacrificio
Pradera
375
410
450
Maíz
375
410
450
et
p<
Pradera
Maíz
et
p<
goteo
1.69
1.71
1.70
Perdidas
presión
24.12ªbd
24.44ab
24.77ª
cocción
29.85ab
30.10ab
30.42ª
Ind. cromáticos carne
L*
a*
b*
35.66ª 16.00
8.68
35.18ª 16.14
8.60
34.80ª 16.15
8.57
Ind. cromáticos grasa
L*
a*
b*
63.63ª
5.56
12.51ª
63.34ª
5.59
12.46ª
62.67ab 5.61
12.59ª
1.67
1.60
1.54
0.069
NS
23.42bc
22.79c
23.29cd
0.401
0.001
29.15ab
28.86b
30.01ab
0.519
0.05
37.14b
37.04b
36.79b
0.329
0.001
15.91
15.96
16.00
0.231
NS
8.69
8.76
8.83
0.198
NS
61.90bc
60.63cd
60.30d
0.538
0.001
4.94
5.04
4.89
0.285
0.1
10.62b
10.80b
10.91b
0.323
0.001
1.70
1.60
0.037
NS
24.45
23.17
0.227
0.001
30.12
29.34
0.298
0.1
35.21
36.97
0.177
0.001
16.09
15.96
0.127
NS
8.62
8.76
0.104
NS
63.21
60.94
0.292
0.001
5.58
4.95
0.142
0.005
12.52
10.78
0.182
0.001
La única variación debida al aumento del peso de sacrificio de los índices
cromáticos de la carne o la grasa fue el L* de luminosidad de la grasa, que disminuyó en
las terneras las alimentadas con ensilado de maíz (Tabla IV). Como en el caso de los
machos, (Zea et al., 2006) esto se debería a que el aumento de la cantidad de pigmentos con
la edad sigue una tendencia de tipo sigmoide, alcanzándose la cima a los 18-24 meses en el
caso de animales de gran formato (Renerre, 1982), como los nuestros, por lo que las
variaciones en el color de la carne no serian apreciables.
Al igual que había ocurrido con los machos (Zea et al., 2006), los índices
cromáticos de la grasa de las terneras alimentadas con maíz fueron más bajos (Tabla IV) y,
consecuentemente, la grasa más oscura. En la carne resultó más alto el índice L en las
alimentadas con maíz (al igual que en los machos). Dado que las variaciones son pequeñas,
se estaría de acuerdo con Sañudo (1992) en que en rumiantes la alimentación tiene poca
importancia en los índices cromáticos de la carne; aunque también se ha indicado que
niveles energéticos altos disminuyen la concentración en pigmentos heminicos (Lawrie,
1977).
124
Tabla V.- Veteado, consistencia, terneza, pH y composición química de la carne.
Ensilado
Pradera
Peso
sacrificio
375
410
450
Veteado
Consistencia
Dureza
pH
1.40ªc
1.69ªb
1.90b
1.08
1.13
1.11
6.91
7.12
6.87
5.46ª
5.45ab
5.43ab
21.66ab
21.55ª
21.55ª
1.77ª
2.17ªc
2.91bcd
1.18ª
1.17ab
1.16bc
75.39ª
75.11ª
74.39b
375
410
450
1.37c
1.72ªb
1.90b
0.114
0.005
1.03
1.12
1.06
0.045
NS
6.91
6.80
6.70
0.271
NS
5.46ª
5.43ab
5.42b
0.014
0.05
21.87b
21.77ab
21.64ab
0.086
0.01
1.99ª
2.55c
3.19d
0.187
0.001
1.16abc
1.17ab
1.15c
0.007
0.01
74.98ac
74.50bc
74.02b
0.193
0.001
1.66
1.66
0.054
NS
1.11
1.07
0.027
NS
6.96
6.80
0.159
NS
5.45
5.44
0.005
NS
21.59
21.76
0.043
0.005
2.28
2.58
0.072
0.005
1.17
1.16
0.004
NS
74.96
74.50
0.069
0.001
Maíz
et
p<
Pradera
Maíz
et
p<
Composición química de la carne(%)
proteína
grasa
cenizas humed.
El veteado aumentó con el peso de sacrificio, mientras que, como en el caso de los
machos (Zea et al., 2006), no afectó a la consistencia o a la terneza (Tabla V). El tipo de
ensilado no modificó el veteado, la consistencia o la terneza. Aunque se admite que el peso
o edad es un factor importante de la terneza, también se admite que existe un periodo,
aproximadamente entre los 9 y los 16 meses, en el que la dureza se estabiliza (Touraille,
1982); y aunque hay autores (Bruce et al., 1991) que encuentran que la terneza mejora con
el nivel de alimentación, otros (Alberti et al., 1988) no observan diferencias en la carne de
terneros alimentados con dietas más o menos energéticas.
125
Tabla VI.- Ácidos grasos saturados (AGS), monoinsaturados (AGM) y poliinsaturados
(AGP). Ácidos grasos de la serie ω-6 y ω-3 y relación AGP/AGS y ω-6/ω-3, en la grasa
intramuscular del L.thoracis.
Ensilado
Pradera
Peso
sacrificio
375
410
Maíz
Pradera
Maíz
AGS
AGM
AGP
ω-6
ω-3
AGP/AGS
ω-6/ω-3
1069.7
1461.6
147.01
81.220
65.789
0.150ª
1.285
62.598
b
1.314
b
1216.3
1593.7
142.72
80.118
0.120ª
450
1256.1
1766.5
141.96
80.354
61.609
0.118ª
1.371
375
1213.7
1699.7
134.83
77.307
57.525
0.117ªb
1.413
b
410
1142.4
1507.1
134.09
77.778
56.314
0.128ª
1.398
450
1183.1
1678.2
125.63
69.767
55.858
0.113b
1.300
et
92.687
152.851
11.117
9.724
4.300
0.015
0.189
p<
NS
NS
NS
NS
0.1
0.05
NS
1180.7
1607.3
143.90
80.564
63.332
0.129
1.323
1179.7
1628.3
131.52
74.950
56.566
0.119
1.370
et
44.013
72.582
5.079
4.617
2.042
0.007
0.090
p<
NS
NS
0.05
NS
0.05
NS
NS
Cuando el peso de sacrificio aumenta, disminuye el contenido en humedad y
cenizas, y aumenta el de grasa (Tabla V), independientemente del forraje consumido. La
carne de las terneras alimentadas con ensilado de maíz tiene más proteína y grasa y menos
humedad
De los AGS y AGM determinados, el aumento del peso de sacrificio incrementó el nivel de
los ácidos C16:0 (palmítico) y C16:1(n-7) (palmitoleico) en las terneras alimentadas con
ensilado de pradera, y de los AGP únicamente se modificó el C20:5(n-3)
(eicosapentaenoico), pero por el efecto del ensilado (más alto con el de pradera) no del
peso.
Ninguno de los índices nutricionales (AGS, AGM, AGP, AGP/AGS, ω-6, ω-3 o ω-6/ω-3)
se modificó por el efecto del peso de sacrificio, pero sí por el tipo de ensilado, resultando el
nivel de los AGP y ω-3 más alto en las terneras alimentadas con ensilado de pradera (Tabla
VI). En el caso de los machos (Zea et al., 2006), el tipo de ensilado no se había modificado.
Dado que hay autores (Malau-Aduli, 1997; Weeb et al., 1998) que indican que el aumento
de la cantidad de grasa se caracteriza por una ligera disminución de los AGP y un aumento
de los AGS y de los AGM, la aparición de estos efectos, que no se habían observado en los
machos, se explican porque la grasa de la carne aumentó en 0,30 puntos porcentuales al
pasar la alimentación de ensilado de pradera a ensilado de maíz (Tabla V); mientras que en
los machos este aumento no se había producido (Zea et al., 2006).
126
CONCLUSIONES
Con el incremento del peso de sacrificio, de 375 a 450 kg., se mejora el rendimiento, el
engrasamiento (grasa en la canal y en la carne y la de cobertura sólo en el caso de alimentar
con ensilado de pradera) y el veteado de la carne, sin que afecte de forma negativa a la
calidad de la carne, ni modifique el perfil de ácidos grasos de la misma. Las Terneras
alimentadas con ensilado de maíz tienen menos AGP y ω-3 que las que reciben ensilado de
pradera.
ALBERTI, P.; SAÑUDO, C.; LAHOZ, F.; JAIME, J.; TENA, T., 1988. Características de
la canal y calidad de la carne de terneros cebados con dietas forrajeras y suplementados con
distintas cantidades de pienso. ITEA, 76: 3-4.
ANDERSON, B. A,; LAUDERDALE, J. L.; HIKE, Y. M., 1984. Composition of food:
beef products-raw, processed, prepared. USDA Agriculture Handbook No. 8.
BRUCE, H.L.; BALL, R.O.; MOWATT, D.N.,1991. Effects of compesatory growth and
protein metabolism and meat tenderdess of beef steers. Can. J. Anim.Sci., 71: 659-671.
KOUSGAARD, K., 1979. Seminar: Energy and protein feeding standards for beef cattle.
Theix. Francia.
LAWRIE, R.A., 1977. Ciencia de la carne. Ed. Acribia. Zaragoza. España.
MALAU-ADULI, A. E. O.; SIEBERT, B. D.; BOTTERNA, C. D. K.; PITCHFORD, W.
S., 1997. A comparison of the fatty acid composition of tricylglycerols in adipose tissue
from Limousin and Jersey cattle. Aust. J. Agric. Res., 48: 715-722.
RENERRE, M., 1986. Influence de facteurs biologiques et technologiques sur la coleur de
viande bivine. Bull. Techn. CRZV Theix INRA, 65: 41-48.
SAÑUDO, C., 1992. Calidad organoleptica de la carne. En Tecnologia u calidad de productos
carnicos., 29-44. Ed. M. J. Beriain. ETSIA. Pamplona.
TOUREILLE, C., 1982. Influence du sexe et de l’âge a l’abattage sur les qualités
organoleptiques
des viandes de bocins Limousins abattus entre 16 et 36 mois. Bull. Tech. CRZV Theix, 48, 8389.
WEEB, E. C.; DE SMET, S.; VAN NEVEL, C.; MARTENS, B.; DEMEYER, D. Y., 1998.
Effect of anatomical location on the composition of fatty acids in double-muscled Belgian
Blue cows. Meat Sci., 50: 45-53.
ZEA, J., DÍAZ, MªD., CARBALLO, J. A., 2006. Efecto del peso de sacrificio y del tipo de
ensilado en la calidad de la canal, la carne y la grasa. I. Terneros. En este mismo volumen.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar su agradecimiento al INIA y a la S. X. de I. e D. de la Xunta de
Galicia por la financiación de los Proyectos: XM-99-003 (Mejora de la calidad de la canal y
la carne de vacuno joven alimentado a base de forrajes ensilados) y
PGIDT02RAG50301PR (Efecto de la raza, sexo, peso de sacrificio y dieta en el perfil de
ácidos grasos de la carne de vacuno joven), de donde proceden los datos, así como a D.
Eduardo Jimenez Domínguez y a D. José Tasende Fraga, por el cuidado y el manejo del
ganado.
127
PONTREMOLESE: AN ITALIAN BOVINE BREED IN ENDANGERED STATUS
LA PONTREMOLESE: UNA RAZZA BOVINA AUTOCTONA IN VIA DI
ESTINZIONE
GORACCI J., GIULIOTTI L., BENVENUTI N., VERITÀ P., FACDOUELLE I.
Department of Animal Production, University of Pisa, Viale delle Piagge, 2, 56124, Pisa
(Italy),tel. +39.050.2216892, fax +39.050.2216901, [email protected]
ABSTRACT
Pontremolese is a double attitude Tuscan bovine breed recognized as “reliquia” by FAO
and recorded since 1985 in the book of Local Breeds with a Restricted Diffusion. Since
many years, most of the rustic genotypes have been involved in specific programs dealing,
on one hand, with the preservation and the protection of biodiversity and, on the other, with
the promotion of the typical products derived from a strong animal-environment bond.
Among all, Pontremolese was one of the least influenced autochthonous breeds by the local
plans of promotion. The aim of this work was to outline the history of Pontremolese breed
and to analyse its present status. Only 26 subjects resulted in two farms near Lucca
(Tuscany) and 4 involved in a FAO safeguard project. In addition, the C.I.Z. Research and
Genetics Centre situated in Pisa is storing more than 1300 semen doses from seven
Pontremolese bulls. Today, none of the animals live in their native area: the Lunigiana
countryside. Zoometric data was collected in order to typify the existing subjects. Such a
severe decline, must provide rapid action plans in order to avoid the extinction of the
Pontremolese genotype.
KEY WORDS: Pontremolese, bovine, autochthonous breed.
RIASSUNTO
La Pontremolese è una razza a duplice attitudine autoctona della Toscana, riconosciuta
dalla FAO come “reliquia” e inserita dal 1985 nel Registro Anagrafico delle Popolazioni
Bovine Autoctone e Gruppi Etnici a Limitata Diffusione. Da molti anni le razze rustiche
italiane sono state coinvolte in specifici programmi riguardanti sia la conservazione e
protezione della biodiversità, sia la promozione di produzioni tipiche caratterizzate da un
forte legame col territorio. Lo scopo di questo studio è stato quello di prendere in esame la
storia di questa razza e di analizzarne la situazione attuale. Sono stati inoltre raccolti i dati
zoometrici al fine di tipizzare i soggetti attualmente presenti. E’ stata rilevata la presenta di
soli 26 animali in due allevamenti situati in Garfagnana vicino a Lucca (Toscana) e 4 in
un’azienda sperimentale (in Abruzzo) coinvolta in un progetto di salvaguardia della FAO.
Presso il Consorzio per l’Incremento Zootecnico di San Miniato (Pisa) sono stoccate circa
1300 dosi di seme di 7 tori Pontremolesi. Lo studio effettuato mette in luce la situazione di
estrema gravità in cui si trova questa razza ormai non più allevata nel suo luogo di origine
(Lunigiana). Si rendono quindi necessari ulteriori e rapidi piani di azione di recupero al fine
di scongiurarne l’estinzione.
PAROLE CHIAVE: Pontremolese, bovini, razze autoctone.
128
INTRODUCTION
HYSTORICAL ANALYSIS AND CONSISTENCE DEVELOPMENT - The origin of
Pontremolese breed are uncertain: some Authors assumed that it could derive from
Parmigiana (Reggio Emilia district), a type of Reggiana breed (Lisi, 1893) characterized by
cross with Alpina and Giurassica (Pucci, 1912); some assured that it could descend from
Iberian, Asian or Alpine wild-type (Marchi and Mascheroni, 1925) and finally some
retained that it seems to came from the reddish tinted horned animals that lived in the
Tyrrhenic coast of Italy more than one hundred years ago (Pucci, 1912). In 1935 the Herd
Book of Pontremolese breed was set up, after that there is information about the consistence
of the cattle shed (Fig. 1).
Fig. 1. Numerical consistence of Pontremolese breed until 70’s.
Year
Author
Number of animals
1940
Secchiari et al., 2002
15.000
1950
Parisi, 1950
10.000
1960
Technical Land Office, 1960
5.700
Owing to the introduction of non-autochthonous breeds described as follow and the coming
of the first agricultural machines, Pontremolese breed underwent a rapid decline, reaching
up to 13 subjects (Fig. 2) in the mid 80’s (Ciampolini, 1993).
Fig. 2. Consistence of Pontremolese breed from 80’s to present time.
60
Number of animals
50
40
30
20
10
0
1983 1993 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Year
In 1985 this breed has been included in the book of Local Breeds with a Restricted
Diffusion and in various safeguard programs coordinated by Tuscan Region (i.e. 50/97 and
64/04 Regional Laws). Moreover, Pontremolese was recognized as “reliquia” genotype by
FAO (2000).
129
The aim of this work was to outline the history of Pontremolese breed and to analyse its
present status regarding consistence, morphometric and morphological traits.
GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION - Pontremolese were bred in the Appenninic
Mountains and into the Magra and Vara valleys (La Spezia and Massa Carrara), but also in
Piacenza and Pavia areas (“Oltrepò Pavese” region), as stated by Bonadonna in 1950.
Animals are named in different ways in each district (i.e. Bettolesi). With the 1935 law
enactment, two different breeding areas were identified: one in Zeri and Valdentana areas
where pure Pontremolese subjects were reared, and another in the rest of Pontremoli area
and in a part of La Spezia province where Bruna or Garfagnina crosses were preferred in
order to obtain more productions.
ATTITUDES AND PRODUCTIONS - Pontremolese were considered as triple-attitude
breed, even if milk (almost 10-15 q/year with the average of 3.7% of fat content) and meat
productions (40-63% of yield at slaughtering for calves, cows or steers) were not
satisfactory at all (Lisi, 1922; Marchi and Mascheroni, 1925; Parisi, 1950). In fact, the
severe lack of milk produced in this place drove farmers to cross the autochthonous
genotype with Swiss cows, even with higher costs of purchasing and maintenance.
Bonadonna (1950) revealed also Bruna Alpina crosses aimed at the same purpose. On the
contrary, meat was considered a high quality product (Bonadonna, 1950) generally greatly
demanded (Mascheroni, 1931). In spite of its medium size, Pontremolese was considered as
a rustic, sturdy and stress-resistant breed, characterized by strong limbs and great
adaptability to mountain sloping pastures (Meardi, 1883). In fact, in the past, cows were
utilized for not-drudgery agricultural labour (Marchi and Mascheroni, 1925), while steers
were used for hard chores, as marble slabs transport from quarries to Carrara harbour
(Mazzoni, 1933).
DESCRIPTION - In the Herd Book (1935) and in the book of Local Breeds with a
Restricted Diffusion (1985) Pontremolese biometrical and morphological parameters were
outlined. In Fig. 3, Standard measures obtained in researches conducted in the last 70 years
are reported in Fig. 3.
130
Fig. 3. Comparison between zoometric data of Pontremolese breed.
D.M. 18/3/1935
Category
Bulls > 3 years
Bulls 1 year
Cows
Heifers
Secchiari et al., 2002
Height
Weight
Height
mean (cm) mean (kg) mean (cm)
135
600
128-150
120
200
128
450
125-138
118
300
-
Our results
Weight
Height
Weight
mean (kg) mean (cm) mean (kg)
550-600
119
474
111
150
400-450
118
400
99
190
Coat - Presence of sexual dimorphism: female show reddish colour lighter than males; both
display a clear back-lumbar line and black orbits. Skin - Medium thickness skin with thin
and short hair. Head - Straight profile, poll with a dip covered by a red tuft in the middle.
Horns - Presence of sexual dimorphism: lyre-shaped in female and elliptic in male; both
reveal yellowish horns in the base and dark at the top. Trunk - Prominent withers and
sloping rump. Tail - Thin with dark tuff at the top. Fore limbs - Muscled and sloping
shoulders, thin shin and dark hooves. Hind limbs - Large and lean. Udder - Globose with
quite big teats (Fig. 4).
Fig. 4. Historical photo of Pontremolese (1916) taken from “Il Corriere Apuano” (2006).
MATERIALS AND METHODS
The study was conducted on all the 26 Pontremolese subjects resulted in two farms near
Lucca (Tuscany). After a direct inspection in order to collect all useful information about
livestock, a questionnaire with data regarding activities, land, structures, animals, rearing
techniques, nutrition and productive traits was filled out. Morphologic and morphometric
traits were collected on all the animals, evaluating head width, forehead-nose bridge, ear
length, withers height, rump height, chest width, body length, back width and ischiatic
131
width (Meregalli, 1980). Measurements were carried out with animals in standing position
on flat land, using a measuring tape and a Lydtin stick. Colour of coat, muzzle, limbs and
skin were noted. Means and variances were estimated using J.M.P. software (2002).
RESULTS AND DISCUSSION
Farms are situated at 500-600 m above sea level and the average surface of each farm is
almost 10 ha, divided into pastures, crops and woods. One farm also reared Garfagnina
bovine breed, pigs and Massese sheeps. Animals generally grazed from spring to late
autumn (May-October/November), while the rest of the year they were kept in tether or
loose housing systems without the use of outdoor areas, owing to rigorous winter climate
and sloping upland pastures (15-20%).
The Pontremolese population totalled 26 subjects, divided into 16 cows, 5 bulls, 2 heifers
and 2 calves at inspection time. In addition, the C.I.Z. Research and Genetics Centre in Pisa
is storing more than 1300 semen doses from seven Pontremolese bulls.
Animals were slaughtered at different ages: 4/5 months (veal with less than 200 kg of live
weight), 15/16 months (calf of about 230/250 kg) and 19/20 months (calf of about 500 kg).
Nutrition was based on hay, natural and seeding pastures and on maize, barley, bran and
soybean supplement. Bulls and cows began their reproductive activity at about 2 years;
cows generally live more than 10 years, while bulls are slaughtered at the age of 3 years.
Births occurred in barn in order to obtain an effective control of the animals and were
distributed throughout the year, with the concentration in spring and autumn. Twins births
occurred rarely (less than 5%). Calves were weaned at 6 or 7 months.
132
Fig. 4. Zoometric data of Pontremolese subjects (mean ± err.std).
Head
Forehead-nose
Ear
Withers
Category
Weight
width
bridge
length
height
Bull
474.0±79.22 24.2±1.42
46.0±1.32
14.8±0.60
119.3±5.37
Cow
400.0±17.35 21.5±0.51
45.9±0.95
17.6±0.65
118.4±1.93
Calf
150.0±0
22.5±2.00
43.7±1.25
15.7±1.25
111.0±11.0
Heifer
190.0±0
19.0±0
39.0±0
18.0±0
99.0±0
Rump
height
Chest
width
Body length
Back
width
Ischiatic
width
Bull
124.7±4.46
65.0±5.17
107.9±5.77
41.4±4.20
48.2±3.40
Cow
124.5±2.34
62.6±1.66
106.8±2.01
37.5±1.18
45.0±1.03
Calf
115.5±10.5
55.0±3.0
92.5±1.5
33.5±4.0
38.5±2.0
106.0±0
54.0±0
79.0±0
28.5±0
35.0±0
Category
Heifer
Compared to previous studies (D.M. 18/3/1935; Secchiari et al., 2002), our results (Fig. 3
and 4) underlined smaller and lighter subjects, revealing an evolution of the morphological
traits of Pontremolese breed.
Fig. 5. Frequency of colour characteristics.
Regarding morphologic traits, Pontremolese coat was fairly brown, but the colour of the
muzzle, limbs and eyes and nose area were more heterogeneous, as previously reported in
Fig. 5.
133
CONCLUSIONS
This work underlined the constant and gradual numeric decrease of Pontremolese subjects
in the years, leading to a present severe risk of extinction. Besides, today none of the
animals live in their native area (Lunigiana countryside), moving them away from all
valorisation projects linked with the development of that rural territory. Thanks to the
presence of several semen doses and the inclusion of Pontermolese in FAO safeguard
projects, appropriate and well-timed plans could be useful only if managed in a rapid and
determined way.
REFERENCES
BONADONNA T. (1950). Zootecnia speciale. Vol. II. Ed. Istituto Editoriale Cisalpino,
Varese: 984-988.
CIAMPOLINI R. (1993). Le popolazioni animali autoctone della Toscana. APA, Pisa: 7-8.
IL CORRIERE APUANO (2006). La mucca Pontremolese, razza del tempo passato. Anno
XCIX, 1 Aprile,
DECRETO MINISTERIALE (1935). Libro genealogico. 18 Marzo, M.A.F., Italy.
DECRETO MINISTERIALE (1985). Registro Anagrafico delle Popolazioni Bovine
Autoctone e Gruppi Etnici a Limitata Diffusione, 19 luglio, M.A.F., Italy
FAO (2000). World Watch List for Domestic Animal Diversity. Roma, Italy.
J.M.P. (2002). J.M.P. User’s Guide ver. 5.0, S.A.S. Institute Inc., Ed. Cary (NC), USA.
L.R. 50 (1997). Tutela delle risorse genetiche autoctone. BUR n. 30, 26/07/1997, Italy.
L.R. 64 (2004). Tutela e valorizzazione del patrimonio di razze e varietà locali di interesse
agrario, zootecnico e forestale. BUR n. 46, 24/11/2004, Italy.
LISI G. (1893). Conferenza di zootecnia agli allevatori di bestiame nella provincia di Massa
Carrara. Ed. Tipografia Sanguinetti e Figli, Carrara, Italy.
LISI G. (1922). I bovini di razza Pontremolese. Carrara, Italy.
MARCHI E. and MASCHERONI E. (1925). Zootecnia speciale. Nuova Enciclopedia
Agraria Italiana, parte VI: Zootecnia. Ed. UTET, Torino: 895-900.
MASCHERONI E. (1931). Biblioteca Agricola. I bovini da carne. Ed. Paravia & C.,
Torino: 44-45.
MAZZONI R. (1933). Biblioteca Agricola. I bovini da lavoro. Ed. Paravia & C., Torino:
22.
MEARDI F. (1883). Relazione sulla VII circoscrizione (province di Cuneo, Torino,
Alessandria, Novara, Piacenza e circondari di Bobbio e Voghera). Atti della Giunta per
l’inchiesta agraria e sulle condizioni della classe agricola. Vol. VIII, tomo 1, fasc. I, Ed.
Forzani e C., Roma: pp. 1067.
MEREGALLI A. (1980). Conoscenza morfofunzionale degli animali domestici. Ed.
Liviana Editrice, Padova (Italy): 300pp.
PARISI O. (1950). I bovini. Ed. UTET, Torino: 494-495.
PUCCI C. (1912). Atlante monografico delle principali razze bovine Italiane. Fasc. I, Ed.
Istituto Monografico Italiano, Firenze, Italy.
134
SECCHIARI P., MELE M., SERRA A., FERRUZZI G., PISTOIA A. (2002).
Pontremolese. Risorse genetiche animali autoctone della Toscana. ARSIA – Regione
Toscana. Ed. Effemme Lito srl, Firenze: 61-66.
TECHNICAL LAND OFFICE (1960). Atlanti di zootecnia. Allevamenti Italiani. 1 Bovini.
Ed. R.E.D.A., Roma: 125-128.
ACKNOWLEDGEMENTS
The Authors thank Olivia Paganelli and Brunella Antonioli for technical assistance.
Work supported by ARSIA founds (Tuscan Region).
135
PRODUZIONE E QUALITA’ DEL LATTE DI CAPRE MALTESI ALLEVATE IN
SICILIA
MILK YIELD AND QUALITY IN MALTESE GOATS REARED IN SICILY
ZUMBO A.1, DI ROSA A.R.1, FINOCCHIARO R.2
1
Dip. MO.BI.FI.P.A. - Università di Messina, Polo Universitario dell'Annunziata, 98168
Messina, Italy
2
Dip. S.En.Fi.Mi.Zo. – Università di Palermo, Viale delle Scienze, 90128 Palermo, Italy
ABSTRACT
The present research would like to contribute to the improvement of the Maltese goat,
among the most productive of Sicilian breeds. Milk quantity and quality characteristics
were investigated in 60 lactating Maltese goats of different ages and order of kidding.
Every month individual daily yields were recorded and individual milk samples were taken
to determine the concentrations of fat, protein and lactose, the somatic cell count (SCC),
pH, titration acidity (°SH) and clotting properties, using the parameters r (clotting time), k20
(curd firming time) and a30 (curd firmness). Results show that the daily milk yield was
higher for the goats in the fourth and higher parity, while the protein and fat levels were
higher in the primiparous goats. Goats with multiple kids showed significant higher daily
milk yield (1979 g vs1839 g), lactose percentage (4.84 vs. 4.76) and SCC (log10 2.64 vs
log10 2.54) than does with single kids. The elastometric parameters of the milk from the
goats in the third parity showed higher "r" values than the other goats. The clotting time “r”
and curd firmness “a30” of the milk from goats that have had multiple kids were better than
from goats with single kids.
KEY WORDS: Maltese goat, milk quality, clotting properties
INTRODUZIONE
In Italia la consistenza del patrimonio caprino, in continua diminuzione da decenni, ha fatto
registrare negli ultimi anni una certa inversione di tendenza. L’attuale popolazione caprina
ammonta a più di un milione di capi, di cui oltre 800.000 sono capre. Questo patrimonio è
concentrato prevalentemente nel meridione e nelle isole, mentre la restante parte è
distribuita nell’Italia centrale e settentrionale, con preminenza di quest’ultima sulla prima.
Nel meridione e nelle isole sono presenti principalmente animali rustici e quindi meglio
adatti alle condizioni di allevamento tipiche di tali regioni, ma con portata lattea individuale
di modica entità ed allevati in greggi di scarsa consistenza (il 90 % non supera i 50 capi).
Nell’Italia centro-settentrionale si è invece diffuso un allevamento di tipo intensivo, fondato
sullo sfruttamento di capre altamente selezionate, ad elevato potenziale produttivo, per lo
più di provenienza estera. Secondo i dati forniti dall’ASSONAPA, la produzione nazionale
di latte di capra ammonta a 1.400.000 quintali, quantitativo questo, non rilevantissimo se
confrontato con i capi allevati, ma che rappresenta comunque un primo segnale
dell’evoluzione di questo allevamento. Al di là delle cifre della consistenza numerica e
della produzione di latte, che da sole risultano quanto meno insufficienti e non consentono
di fotografare nel suo complesso questo momento di evoluzione, si può dire che il
fenomeno più interessante e significativo sia rappresentato proprio dalle trasformazioni
strutturali dell’allevamento che hanno comportato una sua specializzazione insieme
136
all’adozione delle più moderne tecnologie. Questa evoluzione che si è registrata nel settore
caprino, ha fatto sentire i suoi benefici effetti anche in Sicilia . Nell’isola vengono allevati
circa 122.000 caprini (ISTAT 2001), di questi la maggior parte è rappresentata da razzepopolazioni in via di definizione come la “Capra Messinese” e “l’Argentata dell’Etna”,
mentre il resto numericamente inferiore è costituito da razze etnicamente definite come la
Camosciata delle Alpi, la Saanen, la Girgentana, la Derivata di Siria e la Maltese (Zumbo et
al. 1998). Quest’ultima originaria dell’Asia Minore, si è diffusa nei paesi del mediterraneo,
e dall’isola di Malta, da cui prende il nome, è giunta in Italia attraverso la Sicilia
(Portolano, 1987). Proprio nella nostra isola questa capra da sempre ha trovato un habitat
ideale tanto che oggi da molti viene considerata una razza autoctona. La Maltese, docile e
rustica, adattabile a diversi ambienti, mostra una spiccata attitudine lattifera. Il suo latte è
caratterizzato dall’assenza dell’odore e sapore ircino, destinato in passato al consumo
diretto, oggi viene utilizzato per la produzione di formaggi caprini o caseificato con quello
di altre specie per la produzione di formaggi tradizionali siciliani.
Scopo della presente ricerca è stato quello di fornire un contributo allo studio della quantiqualità del latte prodotto da questa razza, considerata tra le più produttive tra quelle che
vengono allevate in Sicilia.
MATERIALE E METODI
L’indagine è stata condotta nel corso della lattazione, analizzando il latte individuale di 60
Capre Maltesi, di diversa età ed ordine di parto, provenienti da un allevamento sito in
provincia di Agrigento. L'alimentazione era basata sull’utilizzo di pascoli polifiti ed
integrata con la somministrazione di 1000 g capo/die di un mangime per capre in lattazione
avente la seguente composizione chimica (SS 87,2 %; PG 15,5 %/ss; FG 26,3%/ss; NSC
35,7%/ss; UFL 0,84/kg di ss) ripartito tra la mattina e la sera e somministrato dopo la
mungitura.
A partire dal primo mese di lattazione, con cadenza mensile e per l’intera durata di essa, è
stato eseguito il controllo individuale della quantità di latte prodotto nel corso di due
mungiture giornaliere, effettuate alle ore 6:30 ed alle 17:30; contemporaneamente sono stati
prelevati campioni individuali di latte per la determinazione del grasso, delle proteine totali,
del lattosio e del contenuto in cellule somatiche attraverso l'apparecchio Combifoss 6200
(Foss Electric). Sui singoli campioni sono stati anche determinati il pH, l'acidità titolabile
(°SH) e tramite tracciato lattodinamografico l'attitudine alla coagulazione del latte con
apparecchio Formagraph (Foss Electric) attraverso i parametri r (tempo di coagulazione),
k20 (velocità di formazione del coagulo) e a30 (consistenza del coagulo) utilizzando la
metodica proposta dalla Commissione ASPA 1995.
I dati ottenuti sono stati sottoposti ad elaborazione statistica, impiegando un modello di
analisi della varianza (SAS, 1990) a due fattori: ordine di parto e tipo di parto. L'ordine di
parto è stato suddiviso in primo, secondo, terzo, quarto ed oltre, mentre il tipo di parto
comprende due livelli: parto singolo e gemellare. È stata inoltre effettuata un analisi delle
correlazioni di Pearson.
137
RISULTATI E DISCUSSIONE
Le produzioni medie giornaliere (Tab 1) sono state superiori per le capre di quarto parto ed
oltre (P ≤ 0.01) in accordo con quanto riportato da Giaccone et al. (1995) su capre Derivate
di Siria e da Zumbo et al (2004) su “Capre Messinesi” entrambe allevate in Sicilia. Per
quanto riguarda l’aspetto qualitativo, il contenuto percentuale di grasso e proteine è
risultato, al contrario maggiore nelle capre di primo parto, caratterizzate da una minore
produzione di latte. Il contenuto in CCS ha fatto registrare un valore significativamente
inferiore per le capre di primo parto. Relativamente al tipo di parto le capre con parto
gemellare hanno mostrato differenze statisticamente significative (P ≤ 0.05) riguardo alla
produzione di latte ( 1979 vs 1839), alla percentuale di lattosio (4.84 vs 4.76) e al contenuto
in cellule somatiche CCS (log10 2.64 vs log10 2.54). In particolare la maggiore produzione
di latte nelle capre con parto plurimo, potrebbe essere giustificata dall’effetto della
maggiore quantità di ormoni placentari prodotti lungo l’arco della gravidanza e dalla
maggiore azione di suzione dei capretti nelle capre con parti plurimi (Zumbo et al. 2004).
Per quanto riguarda i parametri lattodinamografici riportati in Tabella 2 le capre di terzo
parto hanno messo in evidenza valori maggiori di "r" e minori di "a30", che sono risultati
significativi rispetto a quelli registrati per le capre di primo, secondo e quarto parto ed
oltre. Per il tipo di parto valori maggiori per il tempo di coagulazione e minori per la
consistenza del coagulo si sono avuti per le capre con parto singolo.
Nessuno dei due fattori considerati (ordine di parto e tipo di parto) ha influenzato la velocità
di formazione del coagulo.
Dall'analisi delle correlazioni (Tab.3) si evince la nota associazione negativa tra quantità e
qualità del latte. Infatti è emersa una correlazione negativa tra la percentuale di grasso e
proteine e la produzione media giornaliera di latte ( r=-0.265 e r=-0.181, rispettivamente)
in accordo con quanto riportato da Costantinou (1984) e da Zumbo et al (2004).
Per il lattosio, analogamente a quanto ottenuto da Riggert (1980) e da Kala e Prakash
(1990) è stata evidenziata una correlazione positiva (r=0.247) tra produzione totale di latte e
contenuto percentuale in lattosio. Significativa (P< 0,05) è risultata anche la correlazione
tra quantità di latte ed il contenuto in cellule somatiche (r= - 0.125).
Negativa è risultata la correlazione tra la consistenza del coagulo (a30) e il contenuto in
cellule somatiche, che viceversa è apparso correlato positivamente con il tempo di
coagulazione, confermando, pertanto, il ruolo negativo esercitato da queste cellule sulle
caratteristiche casearie del latte. Positiva è stata la correlazione tra la percentuale di
proteina ed il parametro a30 ( r= 0.385; P≤0,01). Tutti i parametri lattodinamografici sono
risultati correlati positivamente con il pH.
CONCLUSIONI
Le indicazioni emerse da questo studio contribuiscono ad ampliare le conoscenze sulla
buona capacità produttiva della capra Maltese. Si è osservato,infatti, che il latte prodotto da
queste capre, elevato dal punto di vista quantitativo presenta delle caratteristiche di qualità
e di attitudine alla trasformazione casearia che lo rendono sicuramente idoneo per la
produzione di pregiati formaggi freschi e stagionati.
138
Tabella 2 - Medie stimate dei parametri lattodinamografici
Fattori
Livelli
r (min)
k20 (min)
a30 (mm)
1
8.36± 0,47 A
4.25±0.29
34± 1.61 a
2
8.47±0.46 A
4.24±0.30
33± 1.58 a
Ordine di
3
9.52±0.50 B
4.92±0.32
31± 1.69 b
parto
7.56 ±0.48 C
4.36±0.31
34± 1.62 a
≥4
Tipo di
1
9.07± 0.34 A
4.20±0.23
31±1.16 a
Parto
2
8.07± 0.33 B
4.22±0.20
34± 1.12 b
Lettere minuscole e maiuscole diverse sulla stessa colonna indicano differenze significative
rispettivamente per P<0.05 e P<0.01.
Tabella 3- Matrici dei coefficienti di correlazione (%)
Prodl Grasso Proteine Lattosio pH
atte
Prod.latte 1
-0.265** -0.181** 0.247** 0,074
°SH
CCS
r
a30
k20
0.038
-0.125*
0.157*
0.125*
0,138
Grasso
-0.220** 0.237**
0.168** 0.015
0.037
Proteine
Lattosio
pH
°SH
CCS
r
a30
k20
1
0.082
-0.109
0,075
1
0.307** 0,072
0.498** -0.150**
-0.290** 0.385**
0.040
1
0.382** -0.296**
0.208** 0.301**
0.025
-0.121*
-0.118*
0.375** 0.218**
0.173*
1
-0.301**
-0.128*
0.314**
-0.101
1
0,165*
-0.203**
0,105
1
0.264**
0.273**
1
-0.082
0.085
1
1
°SH – acidità titolabile; CCS – contenuto cellule somatiche; r – tempo di coagulazione; k20
- velocità di formazione del goagulo; a30 - consistenza del coagulo
• = P < 0.05; **= P < 0.01
BIBLIOGRAFIA
ASPA, (1995) Commissione metodologie di valutazione della produzione quantiqualitativa del latte - Metodi di analisi del latte delle principali specie di interesse
zootecnico. Università degli Studi di Perugia.
BERTONI G., BERNABUCCI U., ROSATINI U. (1988) Rapporto tra indice di
gemellarità e produzione lattea in pecore di razza Comisana. Atti VIII Convegno
SIPAOC. Pp 69-75
CHIOFALO L., MICARI P., CHIOFALO V., ZUMBO A., MESSINA F., (1992)
Composizione chimica, cellule somatiche lattodinamografia e caseine nel latte di
caprini, di aree interne della Sicilia, seguiti nel corso della lattazione, Atti S.I.S.Vet
XLVI.
COSTANTINOU, A., (1984) Studies on the lactation of Damascus goat and growth of
their kids.Anim. Breed. Abstr., 52, 336 (Abstr)
139
FINOCCHIARO R., SARDINA M.T., BUDELLI E., VAN KAAM J.B.C.H.M.,
RUNDO SOTERA A. ZUMBO A., PORTOLANO B., (2004) Indagine preliminare sul
polimorfismo lattoproteico in diverse popolazioni caprine allevate in Sicilia. Atti XVI
Congresso SIPAOC, Siena, pg 281.
FINOCCHIARO R., ZUMBO A., RUNDO SOTERA A., SARDINA M.T.,
PORTOLANO B., (2005) La Capra Messinese: risorsa genetica autoctona Siciliana.
Informatore Zootecnico,
GIACCONE, P., PORTOLANO, B., BONANNO, A., ALICATA, M.L., TODARO,
M., (1995) Aspetti quanti-qualitativi della produzione lattea nella popolazione caprina
Derivata di Siria. Zoot. Nutr. Anim., 21, pp. 97-109.
ISTAT (2001) V Censimento dell’Agricoltura, su www.Istat/Banche-dati.htm
KALA S.N. & PRAKASH B. (1990) Genetic and Phenotipic parameters of milk yield
and milk composition in two Indian goat breed. Small Rum. Res. 3,475-484
LOUCA A., MAVROGENIS A., LAWLOR J. (1975) The effect of early weaning on
the lactation performance of Damascus goats and growth rate of the kids. Animal
Production, 20:213-218
MORGANTE M., RANUCCI S., DE VUONO F., (1995) Fattori di variabilità non
infettivi del numero di cellule somatiche nel secreto mammario di pecore e capre. Nota
II. Fattori Zootecnici e individuali. Acta Med. Vet. 41, 429-438.
PORTOLANO N. (1987) Pecore e capre Italiane. ED. Ed agricole, Bologna, 1987, 1336
RIGGERT E.H. (1980) Milk yield of German improved fown goats in lactations 1-8
Anim. Breed. Abstr., 48,360 (Abstr)
ROGUINSKY M., POUTREL B., SECO J.P., PILLET R., (1980) Etude cellulaire et
bacteriologique sur les laits de tropeau de chevres. Le lait, 60, 27-32.
SAS, 2001. Statistical Analysis System user's guide National Academy Press,
Washington D.C.
ZUMBO A., CHIOFALO L., LIOTTA L. (1998) Indagini sulla produzione del latte
nella capra “Argentata dell'Etna”. Parametri quanti-qualitativi. XIII Congresso Naz.
SIPAOC, Palermo, 16-19 Aprile 1998, pg. 441-444.
ZUMBO A., CHIOFALO V., PORTOLANO B., CHIOFALO L. (1999) Clotting
properties of milk from “Derivata di Siria” goat during the lactation. VII Congresso
Fe.Me.S.P.Rum, Santarem (Portogallo) 21 – 24 Aprile, pg. 171-174
ZUMBO, A., CHIOFALO, L., LIOTTA, L., (2000) La Capra Argentata dell’Etna.
L’allevatore di ovini e caprini. 1, pp. 1-2
ZUMBO A., CHIOFALO B., LIOTTA L., RUNDO SOTERA A., CHIOFALO V.,
(2004) Quantitative and qualitative milk characteristics of Nebrodi goats., South
African Journal of Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212.of Animal Science, 34 Suppl.
1, 210- 212.
RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia per la fattiva collaborazione l’Assistente Tecnico Sig. Dell’Acqua Stellario
della Sezione di Zootecnica e Nutrizione Animale del Dip. MO.BI.FI.PA.
dell’Università degli Studi di Messina.
140
EFECTO DE LA ESTACION DEL PARTO SOBRE LAS CARACTERISTICAS
CUANTI-CUALITATIVAS DE LA LECHE DE CABRA “DERIVADAS DE SIRIA”
EFFECT OF THE “SEASON OF KIDDING”ON THE QUANTITATIVE AND
QUALITATIVE CHARACTERISTICS OF THE MILK OF “DERIVATA DI SIRIA”GOATS
ZUMBO A., DI ROSA A.R., AMATO C., MARESCA L.
Dept. MO.BI.FI.P.A. - University of Messina, Polo Universitario dell'Annunziata, 98168
Messina, Italy
ABSTRACT
In this study, the quantity and quality of milk production of the “Derivata di Siria”- goats
reared in Sicily was evaluated , and the impact of he « season of kidding» (fall and winter )
was defined.
The investigation was carried out on 60 “Derivata di Siria” goats reared in the province of
Agrigento. The quantitative and qualitative parameters of the goats’ milk production were
significantly influenced by the season in which the kidding took place. In fact , the goats
that were raised during fall evidenced a longer period of lactation (225d vs 130d, P≤0,01), a
higher daily milk yield ( 1,65 kg/d vs 1,57 kg/d , P≤0,05 ) , major fat levels (4,21 vs 3,90
%, P≤0,01) and protein levels ( 3,52 vs 3,22 %, P≤0,01),as well as a better milk clotting
properties.
KEY WORDS: ”Derivata di Siria” goat, season of kidding, milk quality
INTRODUCCION
En el ambito del patrimonio caprino criado en Sicilia, encontramos una raza-poblaciòn de
pelaje rojo màs o menos oscuro denominada “derivada de Siria” o “roja Mediterranea”.
Esta poblaciòn caprina se origina de la cabra de Damasco o de Siria criada en los paises del
norte de Africa y llega a Sicilia en la época en la que Roma extendiò su imperio a las
tierras Mediterraneas Afro-Asiàticas (Portolano 1987). Gracias a los florecientes
intercambios comerciales entre Medio-oriente y Mediterraneo y gracias a la civilizaciòn
Arabe, se importaron en Sicilia ovejas y cabras provenientes del Norte de Africa y de las
islas de Malta y de Cipre (Schembri , 1995).
En el tiempo, mediante cruces con otras poblaciones caprinas y posterior mestizaje
selectivo, se llega a la constituciòn del grupo etnico presente hoy en Italia, que se diferencia
de forma màs o menos sustancial de la cepa originaria.
Esta poblaciòn , en el ultimo decenio, ha adquirido una importancia siempre mayor en el
contexto de la crianza caprina Siciliana.
Actualmente, segùn los datos facilitados de la asociaciòn de Criaderos regionales de Sicilia,
las productoras criadas son de cerca de 130000 para una estima complesiva de casi 20000
cabezas distribuidas entre las nueve provincias Sicilianas. La poblaciòn derivada de la Siria
encuentra su espacio tambièn en otras regiones de Italia como la Basilicata, la Calabria, la
Campania y el Lazio. Rusticalidad, adaptaciòn a ambientes nuevos, producciòn làctea,
proliferaciòn elevada son caracteristicas que sitùan a esta cabra al mismo nivel de la màs
noble y difundida cabra Maltese.
La intenciòn de este estudio, considerando la funciòn que la capricultura puede desarrollar
en las ares internas de la Sicilia, ha sido realizar una bùsqueda sobre la cabra “ derivada de
141
Siria” con el fin de aprofundizar el conocimiento de la composiciòn fisico-quimica de la
leche y su actitud a la trasformaciòn casearia.
Bajo esta òptica se ha considerado el estudio de la estaciòn del parto, que sabemos puede
representar uno de los factores en grado de modificar las caracteristicas cuanti-cualitativas
de La leche durante la lactancia.
MATERIAL Y METODOS
La bùsqueda se ha realizado sobre 60 cabras “Derivadas de Siria” provenientes de una cria
situada en provincia de Agrigento.Se han individuado las cabras pròximas al parto y se
identificaron con un collar numerado.Para cada sujeto se han registrado los datos referentes
a la fecha del parto, la edad al parto y el numero de cabritos nacidos.El règimen alimentario
al que han sido sometidas las cabras durante el periodo de prueba estaba basado en el
provecho para el pasto de los recursos forestales disponibles en cada estaciòn, integradas, a
excepciòn de la primavera, con habichuelas enteras.A partir del segundo mes de lactancia,
mensualmente se ha realizado el control individual de la cantidad de leche producido en el
curso de ordenar dos veces diarias, efectuadas a las horas 7:00 y a las 16:00;
contemporaneamente se tomaron muestras individuales de la leche para la determinaciòn de
la grasa, de las proteinas totales, de la lactosa y del contendo en cèlulas somàticas mediante
el aparato Combifoss 6200( foss Electric). Sobre cada maestra ademàas se han determinado
PH, acidez titulable,(°SH) y mediante trazado lactodinamogràfico la actidud a la
coagulaciònde la leche con el aparato Formagraph ( foss electric) mediante los paràmetros r
(tempo de coagulaciòn), k20 ( velocidad de formaciòn del coagulo) y a30(consistencia del
coagulo) usando el mètodo recomendado de la Comisiòn ASPA 1995.
Para la eleboraciòn estadistica los paràmetros considerados fueron la cantidad total de
leche, el porcentaje de grasa, proteinas y lactosa, el contendo en cèlulas somàticas (CCS), il
PH, la acidez titulable(°SH) y los paràmetros elastomètricos r, k20 y a30. El factor
considerado en el anàlisis meses de octubre, novembre y dicembre y aquellas con parto en
enero, febrero y marzo, definendo otoñal el primer periodo e invernal el segundo.
El analisis estadistico se realizò con ANOVA del software estadistico SAS (2001).
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Parametros cuantitativos
La estaciòn del parto(tab.1) ha influenciado claramente la producciòn total de leche.Estos
resultados vienen interpretados en funciòn de la duraciòn de la lactancia, ya que las cabras
con parto otoñal presentan lactancias màs largas respecto a las cabras con parto invernal
(225d vs 130d, P ≤0,01)ya que en Sicilia por efecto de la sequia durante el verano, las
lactancias terminan al final de julio.Ademàs, el efecto de la estaciòn se puede apreciar
particolarmente esaminando las medias estimadas relativas a la producciòn diaria.
De hecho, la mayor producciòn diaria (tab.1) de las cabras con parto invernal respecto a
aquellas con parto otoñal (1,65 kg/d vs 1,57 kg/d, P≤ 0,05)es un indice claro de como la
estaciòn puede influenciar la producciòn de la leche,tambien màs allà de la duraciòn de la
lactancia.A la estaciòn del parto convergen por tanto toda una serie de factores que pueden
influenciar distintamente la productividad de las cabras, siendo entre estos la causa
principal la disponibilidad para alimentarlas.Siendo esta mayor durante la primavera,
consiente a las cabras con parto otoñal una mayor duraciòn de la lactancia, con repercusiòn
142
directa sobre la productividad total;Por el contrario las cabras con parto invernal se
aprecia una mayor producciòn diaria pero que con la llegada del verano, presentan una
reducciòn del tiempo de lactancia, que al final supone una fuerte limitaciòn de la
producciòn total.
Parametros cualitativos
Por cuanto interesa a la cualidad de la leche, en la tabla 2 se hace referenzia a los
porcentuales de grasa, proteinas y lactosa.Tambien para la cualidad la estacion del parto se
ha demostrado como factor importante de variaciòn. En efecto son las cabras con parto
otoñal las que evidencian un portentaje de grasa màs elevado (4,21% vs 3,90 %, P≤ 0,01) y
de proteinas ( 3,52% vs 3,22%, P≤ 0,01) respecto a aquellas que paren en los meses
invernales.Estas variaciones podrian deberse al efecto de las distintas fuentes alimentarias
a disposiciòn para los animales en las dos estaciones productivas para mantener sus
necesidades en las distintas fases de la lactancia.En el periodo otoño-inverno caracterizado
caracterizado por una escasa disponibilidad del pasto , la alimentaciòn viene integrada con
habichuelas , mientras que en los meses primaverales las cabras consumen exclusivamente
forraje verde que consumen en el prado.Este ultimo por su elevada composiciòn de agua y
proteinas, pemite la màxima expresiòn de la productividad quantitativa, como se ha
evidenciado en los niveles productivos diarios obtenidos en la estacion invernal.Por otra
parte, el pasto verde, representando la unica fuente alimentaria podria no ser por si mismo
equilibrado, particolarmente en lo que se refiere a fibra y calorias, para mantener una
correcta producciòn de gasa y proteinas.Por otra parte, la observada relaciòn negativa entre
producciòn diaria y cualidad de la leche se justifica plenamente ,del punto de vista
fisiologico, que el aumento de esta corresponda una disminuciòn de la calidad, a no ser que
se intervenga sobre la alimentaciòn.Por ultimo no se puede excluir que tambièn la menor
duraciòn de la lactancia pueda contribuir a un posterior empeoramiento de la cualidad de la
producciòn total de la leche, debido a que la suspensiòn anticipada de la lactancia, al que
van en contra las cabras que paren en inverno,excluye la fase final de la lactancia,
caracterizada de un aumento de la tasa de gasa y proteinas.
Es importante recordar como el porcentaje de lactosa no ha sido influenciado por la
estaciòn del parto.La lactosa, de hecho, como se encuentra en la literatura, es el
componente màs estable de la leche.
Actitud a la coagulaciòn
El pH (tab.3) ha registrado un valor estadisticamente màs bajo en las cabras con parto en
otoño respecto a aquellas con parto invernal.(6,65 vs 6,72 ,P≤ 0,05 ).No existe ninguna
diferencia entre los dos grupos respecto a la acidez titulable(°SH). Por cuanto reguarda al
contenido en cèlulas somàticas (CCS)se ha observado un valor màs alto, aunque no
estadisticamente significativo en las cabras con parto invernal (5.73 vs 5.96).En relaciòn a
los paràmetros elastomètricos (tab.4) se han registrado diferencias estadisticamente
significativas para el tempo de coagulaciòn (r) y para la consistencia del coagulo( a30
)Especificamente la leche de las cabras con parto otoñal ha demostrado una mejor actitud a
la coagulaciòn respecto a las cabras con parto invernal visto que los valores de r han sido
menores( 8.25 vs 10.83, P≤ 0,05)mientras aquellos de a30 superiores (40 vs 35, P ≤ 0,01)
Estos resultados podrian explicarse por los menores valores del pH y del contenido de
cèlulas somàticas obtenido en la leche producila por las cabras con parto otoñal.Se
observa, de hecho, en la literatura que un aumento en la acidez de la leche y una
143
disminuciòn del contendo en cèlulas somàticas provoca una disminuciòn del tiempo de
coagulaciòn y un aumento de la consistencia del coàgulo que se traduce en una mejor
caseificaciòn.
CONCLUSIONES
El estudio efectuado ha demostrado el notable efecto que la estaciòn del parto ha ejercido
sobre la producciòn cuantico-cualitativa de la leche, influendo indirectamente, a travès de la
disponibilidad de pastos estacional, sobre la desarrollo de la lactancia y la duraciòn de la
misma.
Para evitar estos problemas asociados a la estaciòn del parto, seria por tanto conveniente la
administraciòn de raciones adecuadas de alimentos, suficientes para poder mantener la
producciòn de la leche de estas cabras, sea del punto de vista cualitativo que quantitativo.
Por otro lado,los resultados obtenidos de este estudio, la buena cantidadnumèrica, la
difusiòn en buena parte del territorio Siciliano, son motivos seguramente vàlidos para
considerar la cabra “ derivada de Siria” merecedora de tutela y valorizaciòn.
Tabla 1 – Producciòn total de leche, duraciòn de la lactancia y producciòn diaria
Estaciòn
Producciòn total de
Duraciòn lactancia
Producciòn diaria
leche
(d)
(kg/d)
(kg)
Otoño
352,4 A
225 A
1,57 a
Invierno
213,5 B
130 B
1,65 b
Sobre columna a,b = P≤ 0,05; A, B = P≤ 0,01
Tabla 2 – Percentaje de grasa, proteinas y lactosa (medias estimadas)
Estaciòn
Grasa %
Proteinas %
Lactosa %
Otoño
4,21 A
Invierno
3,90 B
Sobre columna A, B = P≤ 0,01
3,52 A
3,22 B
4,64
4,62
Tabla 3 – Valores de pH, °SH y cèlulas somàticas (medias estimadas)
Estaciòn
pH
°SH
CCS Log10
Otoño
6,65 a
Invierno
6,72 b
Sobre columna a, b = P≤ 0,05
7.25
7.20
Tabla 4 – Parametros elastometricos: r, k20 e a30 (medias estimadas)
a30 (mm)
Estaciòn
r (min)
40 A
Otoño
35 B
Invierno
Sobre columna A, B = P≤ 0,01
144
8.25 A
10.83 B
5.73
5.76
k20 (min)
1.84
1.92
A.I.A. (1992) Controlli della produttività del latte in Italia. Roma 1992
ASPA, (1995) Commissione metodologie di valutazione della produzione quanti-qualitativa
del latte - Metodi di analisi del latte delle principali specie di interesse zootecnico.
Università degli Studi di Perugia.
CHIOFALO L., MICARI P., CHIOFALO V., ZUMBO A., MESSINA F., (1992)
Composizione chimica, cellule somatiche lattodinamografia e caseine nel latte di caprini, di
aree interne della Sicilia, seguiti nel corso della lattazione, Atti S.I.S.Vet XLVI.
CHOUEIRI E. (1974) The damascus goat, the future milking animal of the Mediterranean
countries. Animal Breeding Abstract, 42:441
COSTANTINOU, A., (1984) Studies on the lactation of Damascus goat and growth of their
kids.Anim. Breed. Abstr., 52, 336 (Abstr)
FINOCCHIARO R., SARDINA M.T., BUDELLI E., VAN KAAM J.B.C.H.M., RUNDO
SOTERA A. ZUMBO A., PORTOLANO B., (2004) Indagine preliminare sul polimorfismo
lattoproteico in diverse popolazioni caprine allevate in Sicilia. Atti XVI Congresso SIPAOC,
Siena, pg 281.
FINOCCHIARO R., ZUMBO A., RUNDO SOTERA A., SARDINA M.T., PORTOLANO
B., (2005) La Capra Messinese: risorsa genetica autoctona Siciliana. Informatore
Zootecnico,
GIACCONE, P., PORTOLANO, B., BONANNO, A., ALICATA, M.L., TODARO, M.,
(1995) Aspetti quanti-qualitativi della produzione lattea nella popolazione caprina Derivata
di Siria. Zoot. Nutr. Anim., 21, pp. 97-109
GIACCONE P., PORTOLANO B., TODARO M., (1998) La capra Derivata di Siria
allevata in Sicilia. Ed. Italo Latino-Americana Palma, Palermo.
LOUCA A., MAVROGENIS A., LAWLOR J. (1975) The effect of early weaning on the
lactation performance of Damascus goats and growth rate of the kids. Animal Production,
20:213-218
MAVROGENIS A.P., COSTANTINOU A., LOUCA A. (1984) Enviromental and genetic
causes of variation in production traits of Damascus goats. Animal Production, 38: 99-104
MORGANTE M., RANUCCI S., DE VUONO F., (1995) Fattori di variabilità non infettivi
del numero di cellule somatiche nel secreto mammario di pecore e capre. Nota II. Fattori
Zootecnici e individuali. Acta Med. Vet. 41, 429-438.
PORTOLANO N. (1987) Pecore e capre Italiane. ED. Ed agricole, Bologna, 1987, 1-336
ROGUINSKY M., POUTREL B., SECO J.P., PILLET R., (1980) Etude cellulaire et
bacteriologique sur les laits de tropeau de chevres. Le lait, 60, 27-32.
SAS, 2001. Statistical Analysis System user's guide National Academy Press, Washington
D.C.
SCHEMBRI S. (1987) Capra di Siria, così sbarcò in Sicilia. L’allevatore di ovini e caprini,
4 (5):3-4
ZUMBO A., CHIOFALO L., LIOTTA L. (1998) Indagini sulla produzione del latte nella
capra “Argentata dell'Etna”. Parametri quanti-qualitativi. XIII Congresso Naz. SIPAOC,
Palermo, 16-19 Aprile 1998, pg. 441-444.
ZUMBO A., CHIOFALO V., PORTOLANO B., CHIOFALO L. (1999) Clotting properties
of milk from “Derivata di Siria” goat during the lactation. VII Congresso Fe.Me.S.P.Rum,
Santarem (Portogallo) 21 – 24 Aprile, pg. 171-174
145
ZUMBO, A., CHIOFALO, L., LIOTTA, L., (2000) La Capra Argentata dell’Etna.
L’allevatore di ovini e caprini. 1, pp. 1-2
ZUMBO A., CHIOFALO B., LIOTTA L., RUNDO SOTERA A., CHIOFALO V., (2004)
Quantitative and qualitative milk characteristics of Nebrodi goats., South African Journal of
Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212.of Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212.
146
CORTISOL LEVELS AS INDICATOR OF STRESS IN DOMESTIC GOATS
UNDER DIFFERENT HOUSING SYSTEMS
FAZIO E., MEDICA P., CAVALERI S.*, CRAVANA C., FERLAZZO A.
Department of Morphology, Biochemistry, Physiology and Animal Productions, Unit of
Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Messina.*Veterinary surgeon
KEY WORDS: cortisol, goats, housing systems, stress
SUMMARY
Aim of this study was to define the adrenocortical response to differentiated effects of
housing systems of goats. Circulating cortisol levels of No. 32 Camosciata delle Alpi goats
(No. 23 females and No. 9 males) were evaluated, by taking into account the influence of
the different stabling, and were divided in three groups, respectively Group A: No. 10
females stabled in paddock, aged 1-2 years, Group B: No. 9 males stabled in paddock,
aged 1 - 3 years and Group C: No. 13 females half-stabled, aged elder than 2 years.
Significative effects of stabling (F= 4.20; p<.02) were obtained for cortisol modifications.
Females stabled (Group A) showed cortisol mean levels equal to 66.16 ± 15.57 nmol/L,
males stabled (Group B) showed cortisol mean levels equal to 65.38 ± 17.86 nmol/L and
females half-stabled (Group C) showed cortisol mean levels equal to 50.17 ± 12.16
nmol/L. No significative differences were obtained between female and male subjects.
However, stabled goats, both females (p< .02) and males (p< .01), showed higher cortisol
levels than half-stabled subjects. The reduction in adrenocortical response observed in
half-stabled goats in spring may also probably reflect their better coping environmental
strategies with respect to stabled goats. Endocrine data regarding physiological responses
to different stress factors under different housing systems of goats will help in designing
facilities and in determining management practices that are ideal for productive and
reproductive goat performances.
INTRODUCTION
Different types of stressors may elicit varying degrees of responses in animals. Some
housing systems can be a source of stress for goats and domestic animal in general
(Hargreaves and Hutson, 1990; Blackburn 1995; Le Neindre et al., 1996; Palestrini et al.,
1998). Many physiological indicators can be used to evaluate the coping environmental
strategies, and consequently the adaptative capacities of animals to different types of
housing systems, such as concentrations of plasma cortisol, glucose, and creatine kinase,
that are useful indicators of stress and muscle damage in goats (Kannan et al., 2000).
Data are very limited on physiological responses to stress in goats. Some published
information is available on the effect of preslaughter stress on meat quality in goats
(Kannan et al., 2000; 2001; 2002; 2003). Plasma cortisol concentration increase within 30
min after the beginning of transport and reach a peak value at 1 h in adult male goats; in
addition, young goats had higher plasma cortisol concentrations than older ones.
Conversely, the magnitudes of cortisol responses to transport stress in old goats were
greater compared with young goats, which resulted in significant age main effects (Nwe et
al., 1996).
147
The isolation of goats from their social group can cause increased emotional stress,
reflected by elevated cortisol concentrations. When social isolation was not combined with
holding treatment, the stress levels were significantly lower in goats that were able to
maintain visual contact with other animals (Kannan et al., 2002).
The study was undertaken in order to add information to the literature on the goat’s
adaptative response to different housing systems.
The study was carried out on a total of No. 32 Camosciata delle Alpi goats, No. 23 females
and No. 9 males, submitted to different stabling. In according to stabling the subjects were
divided in three groups, respectively Group A (No. 10 non pregnant females stabled in
paddock, aged 1-2 years), Group B (No. 9 males stabled in paddock, aged 1 - 3 years) and
Group C (No. 13 non pregnant females half-stabled, aged elder than 2 years). Blood
samples were collected by jugular vein at 03.00 p.m., in basal conditions, in every groups.
Circulating cortisol levels were determined in duplicate by immunoenzymatic assays
supplied by RADIM. Statistical analysis by one-way repeated measures analysis of
variance (ANOVA) was applied. Significant differences between female and male subjects,
and among Group A, B and C were assessed using Student’s paired t-test. The level of
significance was set at <.05. All calculations were performed using the PRISM package
(GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
RESULTS
Data obtained are presented as mean ± standard deviation (S.D.) in Figure 1.
Significant differentiated effects of stabling (F= 4.20; p< .02) were obtained for cortisol
modifications.
Females stabled (Group A) showed cortisol levels equal to 66.16 ± 15.57 nmol/L, males
stabled (Group B) showed cortisol levels equal to 65.38 ± 17.86 nmol/L and females halfstabled (Group C) showed cortisol levels equal to 50.17 ± 12.16 nmol/L. No significant
differences were obtained between different gender and age of stabled subjects.
As compared to basal values of Group C, Group A and B showed respectively increases of
cortisol levels both in stabled female (p<.02) and in stabled male (p<.01) subjects.
148
Figure 1 - Circulating cortisol levels (M ± S.D.) of domestic goats under different housing
systems
90
*
**
80
cortisol (nmol/L)
70
60
50
40
30
20
10
0
Group A
Explanation:
.01
Group A= stabled females
Group B= stabled males
Group C = half-stabled females
Group B
Group C
vs Group C: * P< .02; **P<
DISCUSSION
Data obtained showed higher circulating cortisol levels both in stabled female and male
than in half-stabled female goats.
This preliminary investigation has shown that different housing systems may affect the
adrenocortical responses of domestic goats. Although goats are gregarious animals, prefer
to live in social groups and appear to enjoy human contact, in our experimental conditions
agitation was caused by the presence and manipulation by an unfamiliar person, which
was reflected by an increase of cortisol levels more in half-stabled than stabled subjects.
However, in all the three types of housing system, cortisol levels remained within the
physiological range -equal to 65 ± 8 nmol/L- reported for goats (Kaneko, 1989), probably
indicating a good adaptative capacity in these species under different housing conditions.
The regulation of adrenocortical response to cope with different environmental conditions
is a complex processes in all mammals; therefore, the difference in glucocorticoid
production between stabled and half-stabled goats, used in this study, can be taken as the
adaptative response to different housing systems.
149
The reduction in adrenocortical response observed in half-stabled goats in spring may
probably reflect better coping environmental strategies than for stabled goats. The ability
to produce the lowest amount of cortisol may partially explain the superiority of adaptation
in half-stabled subjects. In addition, our data confirm lower cortisol mean levels reported
in Alpine and Saanen goats exposed to sun radiation in a paddock without shade than the
in same goats stabled in a paddock with shadow area (Rodriguez-Martinez et al., 2002).
However, the lowest cortisol levels in half-stabled female goats could also be due to the
oldest age of subjects. This result confirm data previously obtained by Kannan et al.,
(2003) that showed as young subjects had higher plasma cortisol concentrations than older
ones after transport stress.
The magnitude of cortisol changes following different housing systems suggests that
stabled domestic goats aged 1-3 years had higher cortisol levels than half-stabled goats
elder than 2 years.
This study showed the importance and efficacy of the determination of circulating cortisol
levels as an indicator of stress in domestic goats of different age under different housing
systems.
Further research on the role of other variables such as corticotrophin-releasing hormone
(CRH) and CRH-binding protein, may explain how goats deal with housing systems, and
how it affects productive and reproductive performance.
REFERENCES
1) Blackburn H.D., J. Anim. Sci. (1995), 73, 302-309. 2) Hargreaves A.L. and G.D.
Huston, Appl. Anim. Behav. Sci. (1990), 26, 253-256. 3) Le Neindre P. et al., Appl. Anim.
Behav. Sci. (1996), 49, 73-81. 4) Palestrini C. et al., Small Ruminant Research (1998), 27,
177-181. 5) Kaneko J.J. In: "Clinical Biochemistry of Domestic Animals" (1989), (J.J.
Kaneko, ed), Acad. Press, Inc. NY. 6) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2000), 78, 14501457. 7) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2001), 79, 447. 8) Kannan G. et al., J. Anim. Sci.
(2002), 80, 1771-1780. 9) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2003), 81, 1499-1507. 10) Nwe
T.M. et al., Small Rum. Res. (1996), 20, 129-135. 11) Rodriguez-Martinez R. et al., J.
Anim. Sci. (2002), 80, 291.
150
APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON INFEZIONE DA Brucella spp.:
REPERTI ISTOPATOLOGICI GHIANDOLARI ED ELETTROFORESI
LACRIMALE
LACRIMAL SYSTEM IN SHEEPS WITH Brucella spp INFECTION: GLANDULAR
HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS AND LACRIMAL ELECTROPHORESIS.
GRUPPILLO A., GALIA S., BOSCO V.R.F., PARISI F., MAZZULLO G.*, PUGLIESE
A.
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina; * Dipartimento di
Sanità Pubblica Veterinaria, Università di Messina.
PAROLE CHIAVE: apparato lacrimale, Brucella spp., pecora, real time PCR, istologia,
elettroforesi.
KEY WORDS: lacrimal system, Brucella spp., sheep, real time PCR, histology,
electrophoresis.
RIASSUNTO
La ricerca è stata effettuata su n°20 pecore adulte siero-positive a Brucella spp.. Obiettivi
del presente lavoro sono stati: individuare la presenza del batterio nell’apparato lacrimale
attraverso la real-time PCR (ghiandola lacrimale principale e lacrime) e valutare eventuali
lesioni isto-patologiche ghiandolari in rapporto alla presenza del batterio a livello oculare.
Infine, determinare l’assetto quali-quantitativo del pattern proteico lacrimale, mediante
elettroforesi su gel d’agarosio, al fine di evidenziare variazioni nella composizione proteica
lacrimale. I tessuti ed i liquidi biologici prelevati sono stati sottoposti a real-time PCR per
Brucella spp. La positività dei campioni è risultata del 100% per quanto riguarda il secreto
lacrimale e leggermente inferiore per le ghiandole lacrimali.
L’esame istologico effettuato sulle ghiandole positive alla PCR ha messo in evidenza la
presenza di un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede perivascolare,
verosimilmente riconducibile all’azione patogena delle brucelle sui tessuti presi in esame.
L’elettroforesi lacrimale ha permesso di identificare nelle lacrime, su un valore di proteine
totali di 7 g/dl, le seguenti frazioni proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR) (valore
medio: 15.82%); albumina (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare (37.55%) ed
immunoglobuline (20.85%).Tali valori non presentano modificazioni significative rispetto
al pattern proteico lacrimale fisiologico di specie.
SUMMARY
The research was carried on n°20 adult sheep serum-positive to Brucella spp. The
objectives of this study were: to detect the bacterium into the lacrimal system using the real
time PCR on the principal lacrimal gland and the tears, and to evaluate the histopathological lesions in the gland relate to the presence of the bacterial cell into the eye.
Another aim was to determine the quali-quantitative protein lacrimal pattern using the
agarose gel electrophoresis, underlying the possible variations in the protein composition of
tears. On the biological samples the real-time PCR to detect Brucella spp. was carried. The
lacrimal samples were all positive, while the lacrimal glands showed a lower positivity. The
histological examination performed on the positive to Brucella spp. lacrimal glands showed
the presence of an inflammatory perivascular infiltration, that can be related to the action of
151
the pathogen into the tissues. The lacrimal electrophoresis allowed to identify into the tears
the following protein fractions (total protein: 7 g/dl): proteins with a rapid migration (PMR)
(mean value: 15.82%); albumin (25.77%); lactoferrin with elevated molecular weight
(37.55%) and immunoglobulines (20.85%). Those values not show significant differences
in respect to the physiological lacrimal protein pattern of this animal specie.
PREMESSA
La brucellosi ovi-caprina, sostenuta prevalentemente da Brucella melitensis, è un’infezione
cosmopolita ad elevata contagiosità e rappresenta una tra le malattie zoonosiche più diffuse
in tutto il bacino del Mediterraneo. L’uomo può contrarre l’infezione per via diretta, ossia a
seguito del contatto con animali infetti, oppure per via indiretta attraverso il consumo di
latte non pastorizzato o formaggi freschi ottenuti da latte infetto (1). Nella specie ovina
l’infezione può realizzarsi per via orale, per via transplacentare e attraverso il coito; inoltre,
soprattutto negli animali stabulati al chiuso la mucosa congiuntivale può rappresentare una
via di trasmissione dell’infezione da non sottovalutare. Il batterio, una volta introdotto
nell’ospite e moltiplicatosi nei fagociti e nel tessuto linfoide, determina reazioni flogistiche
a carattere granulomatoso (granuloma brucellare), essudatizio-necrotizzante o purulento in
organi quali milza, fegato, midollo osseo e linfonodi. Possono inoltre essere coinvolti anche
l’apparato genitale (utero e placenta di femmine gravide, con conseguente aborto), la
mammella (micromastite interstiziale granulomatosa), i reni, il testicolo, l’epididimo, le
articolazioni, le guaine tendinee, le borse sinoviali e l’apparato oculare. In quest’ultimo
caso, le manifestazioni oculari più comunemente riportate sono rappresentate da forme di
episclerite, uveite, neuropatia ottica ed endoftalmite (2-7).
Considerato l’importante ruolo svolto dalla specie ovina nell’ambito dell’epidemiologia
della malattia e la carenza di dati bibliografici relativi alla brucellosi oculare in questa
specie animale, obiettivo del presente lavoro è stato quello di effettuare una valutazione
delle strutture oculari in pecore infette. In particolare, abbiamo rivolto la nostra attenzione
all’apparato lacrimale (ghiandola lacrimale principale) e al secreto lacrimale, dal momento
che l’occhio ed i suoi annessi possono rappresentare la prima via di penetrazione del
patogeno nell’organismo ospite e la sede di una prima reazione immunologica locale.
MATERIALI E METODI
La nostra ricerca è stata effettuata su n°18 pecore adulte, di razze diverse, sottoposte al
piano nazionale di eradicazione della brucellosi ovina e caprina. Su tutti i soggetti, prima
della macellazione, si è proceduto ad effettuare: prelievo di sangue, esame oftalmologico e
raccolta del secreto lacrimale di ciascun occhio tramite pipette Eppendorf, munite di
puntale, poste tangenzialmente alla mucosa del fornice congiuntivale ventrale. Subito dopo
l’abbattimento è stata effettuata l’enucleazione dei globi oculari e, successivamente, il
prelievo delle ghiandole lacrimali principali.
Parte di tessuto ghiandolare ed un aliquota di secreto lacrimale sono stati sottoposti a realtime PCR per Brucella spp., Mycoplasma spp. e Chlamydophila spp., con limite di
rilevabilità di 1 equivalente genomico per ml.
I rimanenti campioni lacrimali, mantenuti in ambiente refrigerato (4°C) durante il trasporto
in laboratorio, sono stati sottoposti ad esame spettrofotometrico, per la determinazione del
contenuto proteico totale, e ad elettroforesi zonale su gel d’agarosio, per valutare l’assetto
152
quali-quantitativo del pattern proteico. L’identificazione di alcune frazioni proteiche
contenute nelle lacrime è stata possibile grazie al confronto con protidogrammi di siero
proveniente dagli stessi soggetti e sottoposti a migrazione parallela nelle medesime
condizioni. La comparazione dei tracciati è stata possibile assumendo come riferimento la
migrazione dell’albumina sierica, in quanto la quota di albumina lacrimale è anch’essa di
derivazione ematica e la velocità di migrazione è identica in entrambi i campioni.
Dai preparati istologici delle ghiandole lacrimali, previa fissazione dei tessuti in formalina
tamponata al 10% e inclusione in paraffina, sono state ottenute sezioni di 4 µm di spessore,
successivamente colorate con Ematossilina-Eosina (EE).
RISULTATI
La positività dei campioni per Brucella spp alla real-time PCR è risultata del 100% nel
secreto lacrimale e del 41,66% nelle ghiandole. Di queste ultime, il 22,22% è risultato
positivo solo a Brucella spp mentre nel 19,44% del campione esaminato la positività era
legata alla compresenza di Brucella spp e Mycoplasma spp;
La positività dei campioni per Mycoplasma spp. alla real-time PCR è risultata del 94,44%
nel secreto lacrimale e del 69,44% nelle ghiandole, di cui il 50 % è risultato positivo solo a
Mycoplasma spp. e il 19,44% a Brucella spp., associata a Mycoplasma spp. (Tabella 1 e 2);
ancora, tutti i campioni sono risultati negativi per Chlamydophila spp.
Nelle ghiandole lacrimali negative alla RT PCR per Brucella spp. l’esame istologico non ha
messo in evidenza lesioni istopatologiche riconducibili all’azione patogena svolta dal
batterio.
Nelle ghiandole lacrimali risultate positive a Brucella spp. la valutazione istologica ha
permesso di evidenziare un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede
perivascolare e costituito prevalentemente da una popolazione linfo-istiocitaria e scarse
plasmacellule.
Relativamente al secreto lacrimale la concentrazione media delle proteine totali nei
campioni oggetto di studio è stata di 7 g/dl.
L’elettroforesi lacrimale, condotta in parallelo con la foresi sierica degli stessi soggetti
quale campione di riferimento, ha permesso di identificare nelle lacrime le seguenti frazioni
proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR), albumina, lattoferrina ad elevato peso
molecolare ed immunoglobuline. Le rispettive concentrazioni medie erano: PMR =1,13 g/dl
(15.82%); albumina =1,75 g/dl (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare =2,61 g/dl
(37.55%); immunoglobuline =1,49 g/dl (20.85%).
Specie batterica
Tipo di
campione
Secreto
Ghiandola
Tabella 1. Positività di ghiandole lacrimali e secreto.
Specie batterica
BRUCELLA SPP.
MICOPLASMA SPP.
CHLAMYDOPHILA SPP.
100%
41,66%
94,44%
69,44%
-
153
Tabella 2. Positività nella ghiandola lacrimale principale.
BRUCELLA SPP. TOTALE
BRUCELLA SPP. +
7 (19,45%)
18 (50%)
25 (69,45%)
MICOPLASMA SPP. +
8 (22,22%)
3 (8,33)%
11 (30,55%)
MICOPLASMA SPP. 15 (41,67)%
21 (58,33)%
36 (100%)
TOTALE
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
La brucellosi rappresenta nel nostro paese un notevole problema per la salute pubblica, in
quanto è caratterizzata da un’elevata diffusibilità tra la popolazione, comprese le categorie a
rischio.
Il coinvolgimento dell’apparato oculare in corso di brucellosi è un’evenienza tutt’altro che
rara nell’essere umano, in cui sono stati osservati episodi di uveite ricorrente ed
endoftalmite e più raramente cheratocongiuntivite e dacrioadenite. Al contrario, scarso
interesse è stato riservato alle possibili lesioni oculari determinate da Brucella spp. negli
animali da reddito (biblio).
I risultati del presente lavoro sottolineano la presenza di Brucella spp a livello oculare nelle
pecore, con particolare riferimento ad un interessamento dell’apparato lacrimale, come
evidenziato dall’elevata positività dei test diagnostici impiegati, sia a livello del fluido
lacrimale (100% di positività alla RT PCR) che delle strutture ghiandolari (40 % circa di
positività). Tali riscontri, se da una lato evidenziano che il batterio può essere presente in
elevate concentrazioni anche a livello oculare, dall’altro testimoniano la possibilità che le
lacrime di animali infetti possono rappresentare un veicolo di trasmissione della brucellosi
all’uomo e ad altri animali di non trascurabile interesse.
Le lesioni istopatologiche riscontrate a livello delle ghiandole lacrimali positive tramite RTPCR a Brucella spp., pur non potendo essere considerate patognomoniche dell’infezione
brucellare, possono essere verosimilmente ricondotte all’azione flogogena svolta da tali
batteri sui tessuti ghiandolari presi in esame, confermando l’esistenza di una stretta
correlazione tra brucellosi e lesioni oculari. La presenza dell’infiltrato linfoplasmocitario
perivascolare ghiandolare può essere riconducibile, esclusivamente, all’azione flogogena di
Brucella spp., considerata la negatività dei campioni esaminati a Chlamydophila spp. e
l’assenza di lesioni istopatologiche ghiandolari in quei soggetti risultati positivi unicamente
a Mycoplasma spp.
I dati ottenuti nel presente lavoro rappresentano la prima segnalazione del coinvolgimento
della ghiandola lacrimale principale in corso di infezione naturale di brucellosi ovina, così
come dimostrato per le strutture extraoculari del bovino soltanto in seguito ad esposizione
sperimentale al batterio. Diversamente nell’uomo sono già state riportate manifestazioni
extra ed endo-oculari della malattia, con quadri clinici riferibili ad uveiti, endoftalmiti,
dacrio-adeniti e neuriti ottiche (biblio).
La valutazione elettroforetica delle proteine lacrimali degli animali infetti, comparata con il
pattern proteico lacrimale della specie ovina in condizioni fisiologiche, non ha evidenziato
differenze significative relativamente alla composizione quali-quantitativa del pool proteico
lacrimale.
154
Il quadro elettroforetico lacrimale riscontrato testimonia un normale funzionamento del
sistema di produzione delle lacrime, evidentemente non inficiato in maniera significativa
dalla presenza dei batteri in sede oculare.
Ancora, la presenza di elevate concentrazioni di materiale genetico brucellare nelle strutture
esterne dell’occhio (vedi tabella) può confermare, in analogia con quanto riportato in
letteratura per la specie bovina (Meador VP et al., 1988), che la via congiuntivale possa
rappresentare la porta d’ingresso della brucella nell’organismo ospite anche negli animali
oggetto di studio.
Quanto affermato sottolinea l’importanza di un precoce controllo diagnostico dei fluidi
oculari, considerato che la oculo-congiuntivale rappresenta una via di trasmissione non
trascurabile nell’ambito dell’epidemiologia della malattia, non potendo escludere a nostro
avviso un contagio diretto intra ed interspecifico con tale materiale biologico, anche in
assenza di lesioni oculari macroscopiche.
Riteniamo, infine, che il nostro lavoro possa rappresentare un nuovo traguardo nell’ambito
dell’epidemiologia e della profilassi della brucellosi, considerato che il riscontro di brucelle
nella ghiandola lacrimale principale e nel secreto lacrimale di pecore infette è un reperto di
nuova acquisizione, espressione della colonizzazione del patogeno nel segmento esterno
dell’occhio.
BIBLIOGRAFIA
Hall WH (1991): Brucellosis. In: Evans AS & Brachman PS (Eds). Bacterial infection in
humans.
Plenum, New York, pp.133-149.
Güngör K, Bekir NA, Namiduru M (2001). Acta Ophthalmol Scand, 79, pp. 76-78.
Bekir NA, Güngör K, (1999). Acta Ophthalmol Scand, 77, pp. 357-358.
Bekir NA, Güngör K, Namiduru M (2001). Eur J Ophthamol, 10, pp. 259-261.
Solanes MP, Heatley J, Arenas F & Ibarra GG (1953). Am J Ophthamol, 36, pp. 675-689.
Tabarra KF & Al-Kassimi U (1990). Am J Ophthamol, 74, pp. 249-250.
Walker J, Sharma OP & Rao NA (1992). Am J Ophthalmol, 75, pp. 374-375.
155
ANALISI CHIMICA DELL’UMORE ACQUEO NELLA SPECIE OVINA:
VALUTAZIONE COMPARATIVA CON CAMPIONI POSITIVI PER BRUCELLA
SPP. (REAL TIME PCR)
OVINE AQUEOUS HUMOR CHEMICAL ANALYSIS: COMPARATIVE EVALUATION
WITH SAMPLES POSITIVE TO BRUCELLA SPP. (REAL-TIME PCR)
DI PIETRO S., BOSCO V.R.F., GRUPPILLO A., GALIA S., VENZA I., PUGLIESE A.,
DIPARTIMENTO DI Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina, Italia *Dipartimento di Specialità Chirurgiche – Sezione di Oftalmologia, Policlinico
Universitario di Messina, Italia
KEY WORDS: Brucella spp.; ovine specie; principal lacrimal gland; tears; Real Time
PCR; electrophoresis
PAROLE CHIAVE: Brucella spp.; specie ovina; ghiandola lacrimale principale; secreto
lacrimale; Real Time PCR; elettroforesi
SUMMARY
In this study the Authors evaluated the composition of aqueous humor of adult sheep
positive to real-time PCR for Brucella spp., comparing with that of healthy sheep to detect
the quali-quantitative differences of the examined fluid related to the presence of bacterial
cell.
Aqueous humor samples were obtained via paracentesis of the anterior chamber of n° 18
infected sheep and n° 10 healthy sheep (control group). Chemical analysis included
measurement of concentration of sodium, potassium, magnesium, chloride, calcium,
phosphorus, glucose, urea as well as pH. With the exception of potassium, calcium and
phosphorus concentrations, values of aqueous humor composition did not differ
significantly between to Brucella spp. positive sheep and control group. Mean ± SD values
for the control group and the sample group, respectively were: sodium 149±2.86 and
143.5±12.35 mmoli/l, potassium 5.08±0.62 and 8.24±1.49 mmoli/l; magnesium 1.9±0.14
and 1.8±0.16 mg/dl; chloride 127.4±2.36 and 123.2±11.06 mmoli/l; calcium 3.74±0.41 and
4.19±0.49 mg/dl; phosphorus 3.84±0.37 and 4.78±0.73 mg/dl; glucose 14.7±7.8 and
4.4±9.2 mg/dl; urea 51.3±14.4 e 44.7±9.3mg/dl. The pH ranged from 7.0 to 8.0 for both
groups. The potassium, calcium and phosphorus concentrations were significantly higher in
aqueous humor samples positive for Brucella spp.
RIASSUNTO
Nel presente lavoro gli Autori valutano la composizione dell’umore acqueo di pecore adulte
positivo alla Real Time PCR (PCR quantitativa) per Brucella spp. confrontandolo con
quello di pecore sane, al fine di evidenziare eventuali modificazioni quali-quantitative del
liquido esaminato correlabili alla presenza del batterio.
L’umore acqueo è stato prelevato da n° 18 pecore infette e da n°10 pecore sane (gruppo
controllo). L’analisi chimica ha incluso le concentrazioni di sodio, potassio, magnesio,
cloro, calcio, fosforo, glucosio, urea e la valutazione del pH. Ad eccezione dei valori di
potassio, calcio e fosforo, la composizione dell’umore acqueo non differiva
significativamente tra le pecore positive alla Brucella spp. ed il gruppo controllo. I valori
medi ± DS del gruppo controllo e del gruppo campione per ciascun parametro esaminato
156
erano rispettivamente: sodio 149±2.86 e 143.5±12.35 mmoli/l, potassio 5.08±0.62 e
8.24±1.49 mmoli/l; magnesio 1.9±0.14 e 1.8±0.16 mg/dl; cloro 127.4±2.36 e 123.2±11.06
mmoli/l; calcio 3.74±0.41 e 4.19±0.49 mg/dl; fosforo 3.84±0.37 e 4.78±0.73 mg/dl;
glucosio 14.7±7.8 e 4.4±9.2 mg/dl; urea 51.3±14.4 e 44.7±9.3mg/dl. Il pH dell’umore
acqueo variava da 7 a 8 per entrambi i gruppi. Le concentrazioni di potassio, calcio e
fosforo risultavano più elevate nell’umore acqueo positivo per Brucella spp.
INTRODUZIONE
L’umore acqueo, liquido trasparente presente nella camera anteriore e posteriore
dell’occhio, viene prodotto attraverso un processo di filtrazione a livello dell’endotelio
fenestrato dei capillari oculari e mediante passaggio di ioni a livello dell’epitelio ciliare con
diversi meccanismi di trasporto trans-membrana: diffusione, ultrafiltrazione e secrezione
attiva. Tale fluido, considerato un ultrafiltrato del plasma, è composto da proteine,
immunoglobuline, enzimi, lipidi ed elettroliti (11).
La concentrazione elettrolitica nell’umore acqueo è legata alla distribuzione dei vari siti di
trasporto ionico a livello delle cellule epiteliali pigmentate e non pigmentate. Ancora oggi
non è stato stabilito un unico modello di trasporto transepiteliale di elettroliti a livello del
corpo ciliare, per la complessità dell’epitelio stesso (sincizio epiteliale ciliare), dei processi
di ultrafiltrazione regolati dalla pressione arteriosa sistemica, nonché dei differenti
meccanismi di trasporto nelle diverse specie animali (2; 4; 10; 17). Numerose sono le
ricerche presenti in letteratura relative allo studio dei processi deputati alla formazione
dell’umore acqueo e all’analisi quali-quantitativa dello stesso negli animali, in condizioni
fisiologiche e patologiche (1; 5; 7; 8; 12; 14; 15; 18; 19; 20). Questo in considerazione della
possibilità di utilizzare l’occhio animale quale modello sperimentale nell’ambito
dell’oftalmologia comparata.
Obiettivo del presente lavoro è stato quello di valutare in pecore adulte la composizione
ionica dell’umore acqueo risultato positivo a Brucella spp. tramite Real Time PCR (PCR
quantitativa); al contempo, è stato comparato l’assetto elettrolitico dell’umore acqueo di
questi soggetti con quello di pecore sane, al fine di evidenziare eventuali modificazioni
quali-quantitative del liquido esaminato correlabili alla presenza del batterio.
L’interesse per l’argomento risiede principalmente nella constatazione che la brucellosi,
malattia endemica nell’area geografica considerata, può determinare lesioni oculari anche
di grave entità, frequentemente segnalate nella specie umana, più raramente in quella
animale.
MATERIALI E METODI
Oggetto del presente studio sono state n° 18 pecore adulte, di razze diverse, destinate alla
macellazione nell’ambito del piano di eradicazione nazionale della brucellosi ovi-caprina e
n°10 pecore sane, costituenti il gruppo controllo. Immediatamente prima della
macellazione, gli animali venivano sottoposti a prelievo di sangue e a visita oftalmologica,
dalla quale non si evidenziava alcuna lesione oculare macroscopica. Subito dopo
l’abbattimento, su ciascun animale veniva eseguita l’enucleazione del globo oculare. I
campioni di umore acqueo venivano ottenuti mediante centesi della camera anteriore,
aspirando circa 1 ml di liquido da ciascun occhio enucleato. In relazione alle dimensioni
dell’occhio ovino, un ago da 20 gauge veniva inserito in camera anteriore
157
perpendicolarmente alla cornea, qualche millimetro anteriormente al limbus, senza
intaccare l’iride. Tale procedura veniva effettuata entro un’ora dopo la morte. I campioni di
umore acqueo, mantenuti in ambiente refrigerato durante il trasporto in laboratorio,
venivano sottoposti a metodica Real Time PCR per la ricerca di Brucella spp., dalla quale
veniva confermata la presenza di materiale genetico del batterio nei soggetti appartenenti al
gruppo campione e l’assenza dello stesso nel gruppo controllo. Al contempo, sugli stessi
campioni venivano determinate, tramite spettrofotometria, le concentrazioni di sodio,
potassio, magnesio, cloro, calcio, fosforo, glucosio, urea e valutato il pH. I medesimi
rilevamenti venivano eseguiti sui campioni di sangue, previa centrifugazione degli stessi.
I dati ottenuti sono stati valutati statisticamente, calcolando la media aritmetica (M) e la
deviazione standard (DS) dei singoli parametri. Inoltre, è stata effettuata una comparazione
tra i valori dei parametri ottenuti dall’umore acqueo e quelli del siero rispettivamente di
pecore sane e di pecore infette, applicando il T di Student per dati non appaiati e
considerando significative le differenze per p<0,05.
RISULTATI
Nelle tabelle sono riportati i valori minimo, massimo, medio e deviazione standard dei
parametri valutati nel siero e nell’umor acqueo di pecore sane e con infezione da Brucella
spp.
Nelle pecore sane, gruppo controllo, la concentrazione del cloro ([Cl-]) nell’umor acqueo
(HA) è risultata significativamente più elevata rispetto al siero, con un valore medio di
127,4 ± 2,37 mmol/l contro 111,84 ± 2,77 mmol/l nel siero e con una differenza (∆) di
15,56 mmol/l (p<0.001). Una situazione inversa è stata osservata, invece, per le
concentrazioni di sodio, potassio, calcio, magnesio e fosfati, così come per i metaboliti
dosati, glucosio e azoto.
Nelle pecore con infezione brucellare, le concentrazioni di cloro, sodio e magnesio nell’HA
sono simili a quanto osservato nelle pecore sane e, sebbene siano stati riscontrati valori
lievemente più bassi, la differenza non è risultata significativa. La concentrazione del
potassio, viceversa, presenta valori notevolmente più elevati nell’umor acqueo sia rispetto
al siero (con ∆= 3,32 mmol/l) che a quelli osservati nelle pecore sane (p<0,001). I livelli di
calcio e fosforo nell’umore acqueo sono, invece, significativamente più elevati rispetto agli
animali di controllo (rispettivamente p<0.02 e p<0,001).
Relativamente ai due metaboliti valutati, azoto e glucosio, questi presentano livelli inferiori
nell’HA rispetto al siero, così come visto per le pecore sane.
158
Na (mmol/L)
Min
Max
M
DS
K (mmol/L)
Ca (mg/dL)
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
144.0
160.0
154.3
4.5
145.0
153.0
149.0
2.9
107.0
116.0
111.8
2.8
124.0
131.0
127.4
2.4
4.3
6.8
5.3
0.8
4.0
5.8
5.1
0.6
11.5
12.8
12.2
0.3
2.9
4.2
3.7
0.4
∆ (HA-Siero)
Min
Max
M
DS
Cl (mmol/L)
- 5.3 #
+ 15.6 *
Mg (mg/dL)
P (mg/dL)
-
0.2
- 8.4 *
Azoto (mg/dL) Glucosio (mg/dL)
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
2.2
2.8
2.5
0.3
1.7
2.1
1.9
0.1
5.0
7.3
6.4
0.2
3.3
4.3
3.8
0.4
49.0
58.0
54.0
3.7
31.0
71.0
51.3
14.5
50.0
80.0
68.4
6.0
1.0
42.0
16.1
12.2
∆ (HA-Siero)
- 0.6 *
- 2.6 *
- 2.7
- 52.3
Tab 1 – Livelli di alcuni elettroliti e metabolici nel siero e nell’umore acqueo (HA) di
pecore sane
Confronto statistico (T-test): HA vs Siero * = p<0.001; # = p<0.02
Na (mmol/L)
Cl (mmol/L)
K (mmol/L)
Ca (mg/dL)
Min
Max
M
DS
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
140.0
152.0
146.6
2.9
102.0
165.0
143.5
12.4
100.0
113.0
104.8
3.3
85.0
144.0
123.2
11.1
4.1
6.0
4.9
0.7
6.1
11.3
8.2
1.5
9.2
101.0
8.9
0.9
3.1
5.1
4.2
0.5
∆ (HA-Siero)
Min
Max
M
DS
∆ (HA-Siero)
- 3.1
+ 18.4 *
Mg (mg/dL)
P (mg/dL)
-3.3 *
- 4.7 *
Azoto (mg/dL) Glucosio (mg/dL)
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
Siero
HA
1.5
2.8
1.9
0.3
1.6
2.3
1.9
0.2
4.4
11.3
7.2
1.9
3.5
6.2
4.8
0.7
36.0
72.0
55.7
9.7
29.0
55.0
44.7
9.3
18.0
117.0
64.1
25.0
0
35.0
8.1
14.2
- 0.1
- 2.4 *
- 11.0 #
- 55.9 *
Tab 2 - Livelli di alcuni elettroliti e metaboliti nel siero e nell’umore acqueo (HA) di
pecore con infezione brucellare. Confronto statistico (T test): Ha vs Siero * = p<0.001; # =
p<0.02.
159
Na (mmol/L)
Sane
Infette
K (mmol/L)
Ca (mg/dL)
Siero *
HA
Siero *
HA
Siero
HA *
Siero *
HA #
154.3
146.6
149.0
143.5
111.8
104.8
127.4
123.2
5.3
4.9
5.1
8.2
12.2
8.9
3.7
4.2
Mg (mg/dL)
Sane
Infette
Cl (mmol/L)
P (mg/dL)
Azoto (mg/dL)
Glucosio (mg/dL)
Siero *
HA
Siero
HA *
Siero
HA
Siero
HA
2.5
1.9
1.9
1.9
6.4
7.2
3.8
4.8
54.0
55.7
51.3
44.7
68.4
64.1
16.1
8.1
Tab 3 – Livelli medi di alcuni elettroliti e metaboliti nel siero e nell’umore acqueo (HA) di
pecore sane e con infezione brucellare. Confronto statistico (T test): Pecore infette vs
Pecore sane * = p<0.001; # = p<0.02.
DISCUSSIONE
Le ricerche presenti in letteratura relativamente all’umore acqueo delle diverse specie
animali riguardano principalmente la composizione chimica di tale fluido oculare, con
particolare riferimento ai meccanismi fisiologici di trasporto di alcuni elettroliti attraverso
l’epitelio ciliare, considerata la stretta correlazione esistente tra composizione qualiquantitativa dell’umore acqueo e patogenesi del glaucoma (3; 13; 16; 18). Inoltre, recenti
studi hanno evidenziato una maggiore similitudine nel trasporto ionico tra l’occhio di
bovini, ovini e suini e l’occhio umano rispetto a quanto riferito per il coniglio,
comunemente impiegato in ricerche sperimentali, sottolineando la necessità di utilizzare
l’occhio di tali specie animali quale modello sperimentale per gli studi sull’umore acqueo
nell’uomo (3; 7; 10).
I risultati del presente lavoro consentono di effettuare alcune considerazioni.
I valori di alcuni parametri chimici considerati nel presente studio, con particolare
riferimento alle concentrazioni degli ioni Cl-, K+ e Na+ dell’umore acqueo di pecore sane,
rientrano entro i range fisiologici della specie ovina, secondo quanto riportato in letteratura
(10). Per quanto riguarda, invece, i restanti parametri esaminati (Ca++, P-, Mg-, glucosio ed
urea) riteniamo che i dati riferiti al gruppo controllo possano essere considerati quali valori
di riferimento per la specie in esame, considerati gli scarsi riferimenti bibliografici in
merito.
L’osservazione di elevati livelli di cloro nell’umor acqueo di pecore sane è in accordo con
quanto riportato da altri Autori (10) in uno studio su campioni di umor acqueo prelevato in
vivo in diverse specie animali. In queste indagini viene ipotizzato un trasporto attivo
dell’elettrolita attraverso l’epitelio ciliare con un flusso netto dal sangue all’umor acqueo,
ritenuto il principale responsabile della formazione del fluido stesso, come già dimostrato in
altre specie (uomo, bovino, suino) (16; 19).
Anche i livelli di sodio e potassio sono simili a quanto riportato nel precedente studio,
mentre per gli altri elettroliti non è possibile fare confronti in quanto non esistono valori di
riferimento.
160
Negli animali con infezione da Brucella spp. si osserva un netto aumento dei valori di
potassio e fosforo (p<0,001) nell’umor acqueo rispetto alle pecore sane, più lieve per il
calcio (p=0,02). Sodio, cloro e magnesio sono invece stabili. Nel determinismo di queste
alterazioni possono essere chiamati in causa diversi meccanismi: alterazioni sistemiche, con
interferenza del patogeno sui diversi metabolismi, o modificazioni locali, come variazioni
del flusso attraverso i processi ciliari, della permeabilità della barriera emato-acquosa e
dell’attività secretoria dell’epitelio dei corpi ciliari.
I livelli di azoto e di glucosio, inferiori nell’umor acqueo rispetto al sangue, concordano
con quanto riportato in letteratura (6; 9; 11). In particolare, è stato riscontrato che i livelli di
carboidrati e di azoto nell’umor acqueo sono circa l’80% di quelli del plasma. Poiché i
carboidrati passano per diffusione nel fluido endoculare, la differenza tra i due comparti
potrebbe essere la conseguenza di un loro consumo da parte della lente e della cornea. Per
quanto riguarda le concentrazioni di azoto, queste non possono essere in equilibrio con
quelle plasmatiche, poiché i composti azotati attraversano molto lentamente la barriera
emato-acquosa, come dimostrato in studi condotti nel cane.
In conclusione, il presente lavoro rappresenta un ulteriore contributo allo studio oltre che
della brucellosi oculare, non sufficientemente studiata nella specie ovina, anche dei
meccanismi fisiopatologici inerenti la formazione e la modificazione quali-quantitativa
dell’umor acqueo in diverse situazioni cliniche. In particolare l’occhio ovino, per le
peculiarità morfo-funzionali assimilabili a quelle della specie umana, potrebbe essere
utilizzato come modello sperimentale nelle ricerche di oftalmologia comparata, risultando
particolarmente adatto a studi patogenetici e farmacologici, per la valutazione dell’efficacia
di nuove molecole e del monitoraggio degli effetti, a fini prognostici.
BIBLIOGRAFIA
Aubin M.L., Gionfriddo J.R., Mama K.R., Powell C.C.: Analysis of aqueous humor
obtained from normal eyes of llamas and alpacas. Am. J. Vet. Res., 2001, 62 (7):10601062.
Bill A.: Blood circulation and fluid dynamics in the eye. Physiol. Rev., 1975, 55:383-417.
Candia O.A., To C.H., Gerometta R.M., Zamudio A.C.: Spontaneous fluid transport across
isolated rabbit and bovine ciliary body preparations. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2005, 46
(3): 939-947.
Cole D.F.: Secretion of the aqueous humour, Exp. Eye Res., 1977, 25, 161-176.
Crook R.B., Takahashi K., Mead A., Dunn J.J., Sears M.L.: The role of NaKCl cotransport
in blood-to-aqueous chloride fluxes across rabbit ciliary epithelium. Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci., 2000, 41, 2574-2583.
Davson H. and Weld C.B.: Studies on the aqueous humour. Am J. Physiol., 1941, 134:1.
Do C.W. and To C.H.: Chloride secretion by bovine ciliary epithelium: a model of aqueous
humor formation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2000, 41, 1853-1860.
Drolet R., D’Allaire S., Chagnon M.: The evaluation of post-mortem ocular fluid analysis
as a diagnostic aid in sows. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 1990, 2 (1), pp.
9-13.
Duke-Elder S.: The aqueous humour, In: System of ophthalmology. Vol. IV: physiology of
the eye. St Louis: CV Mosby, 1969.
161
Gerometta R.M., Malgor L.A., Vilalta E., Leiva J., Candia O.A.: Cl- concentrations of
bovine, porcine and ovine aqueous humor are higher than in plasma. Exp. Eye Res., 2005
(80):307-312.
Gum G.G., Gelatt K.N., Ofri R.: Physiology of the eye, in: Veterinary Ophthalmology,
Lippincot W. and W. Ed., 1999, pp. 151-181.
Hazel S.J., Thrall M.A., Severin G.A., Lauerman L.H.Jr., Lavach J.D.: Laboratory
evaluation of aqueous humor in the healthy dog, cat, horse and cow. Am. J. Vet. Res., 1985,
46 (3):657-659.
Holland M.G. and Gipson C.C.: Chloride ion transport in the isolated ciliary body. Invest.
Ophthalmol., 1970, 9, 20-29.
Kong M.C.W. and To C.H.: Chloride secretion by porcine ciliary body epithelium. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci., 2003 (ARVO E-abstract 3428).
McLaughlin B.G. and McLaughlin P.S.: Equine vitreous humor chemical concentrations:
correlation with serum concentrations, and post-mortem changes with time and
temperature. Can. J. Vet. Res., 1988, 52:476-480.
Saito Y. and Watanabe T.: Relationship between short-circuit current and unidirectional
fluxes of Na and Cl across the ciliary epithelium of the toad: demonstration of active Cl
transport. Exp. Eye Res., 1979, 28, 71-79.
Shahidullah M., Wilson W.S., Yap M., To C.H.: Effects of ion transport and channelblocking drugs on aqueous humor formation in isolated bovine eye. Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci., 2003, 44, 1185-1191.
To C.H., Do C.W., Zamudio A.C., Candia O.A.: Model ionic transport for bovine ciliary
epithelium: effect of acetazolamide and HCO3-. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2001, 280,
C1521-C1530.
To C.H., Kong C.W., Chan C.Y., Shahidullah M., Do C.W.: The mechanism of aqueous
humor formation. Clin. Exp. Optom., 2002, 85, 335-349.
Wiederholt M. and Zadunaisky J.A.: Membrane potentials and intracellular chloride
activity in the ciliary body of the shark. Pflugers Arch., 1986, 407, S112-S115.
162
Brucella spp IN LACRIME, UMORE ACQUEO E VITREO DI PECORE INFETTE,
ATTRAVERSO LA REAL-TIME PCR.
Brucella spp (REAL-TIME PCR) INTO TEARS, AQUEOUS AND VITREOUS HUMOR OF
INFECTED SHEEP
DI PIETRO S., GALBO A.*, BONANNO G., DE DOMENICO A., REALE S.**,
GIUDICE E.
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina, *Azienda Unità
Sanitaria Locale n° 5 – Messina, **I.Z.S. “A. Mirri” - Sicilia
PAROLE CHIAVE: Brucella spp., fluidi oculari, real-time PCR, ovini.
KEY WORDS: Brucella spp., ocular fluids, real-time PCR, ovine.
RIASSUNTO
Obiettivo del presente lavoro è stato quello di avvalersi della real-time PCR quale
strumento di elevato valore diagnostico nel riscontro della Brucella spp. in lacrime, umore
acqueo e corpo vitreo di pecore risultate positive ai test routinari impiegati nei piani di
eradicazione della malattia. La real-time PCR è stata effettuata su n° 18 pecore risultate
infette da Brucella spp. (esami sierologici); in particolare, il test biomolecolare è stato
eseguito su n°18 campioni di lacrime e su n°36 campioni rispettivamente di umore acqueo e
di vitreo. Il DNA di Brucella spp. è stato evidenziato in tutti i campioni lacrimali (100% di
positività), in n° 29 campioni di umore acqueo (80% di positività), in n° 23 campioni di
corpo vitreo (63% di positività). Sulla base dei risultati del presente lavoro è possibile
affermare che la real-time PCR può essere applicata per l’evidenziazione della Brucella
spp. nell’apparato oculare di pecore infette, quale test diagnostico altamente sensibile e
specifico.
SUMMARY
The objective of this study is to apply the real-time Polymerase chain reaction (PCR) as a
tool with a high diagnostic value to detect Brucella spp. in tears, aqueous and vitreous
serum-positive to Brucella spp.. Real-time PCR assay was performed in n° 18 infected
sheep: 18 lacrimal samples and respectively 36 aqueous and vitreous samples. Brucella
DNA was detected in all lacrimal samples (positivity: 100%); in 29 aqueous (positivity:
80%); and in 23 vitreous samples (positivity: 63%). On the basis of the results it is possible
to underline that real-time PCR can be applied to detect Brucella spp. in the ocular
apparatus of infected sheep, as a diagnostic tool with high sensitivity and specificity.
INTRODUZIONE
Brucella spp., batterio Gram-, è responsabile di diverse affezioni acute e/o croniche nelle
varie specie animali, uomo compreso. Nell’animale l’infezione può avvenire per via
digerente, respiratoria, attraverso la mucosa oculo-congiuntivale, vaginale o attraverso
soluzioni di continuo; nell’uomo si stabilisce sia per contatto diretto con animali e materiali
infetti sia per via indiretta attraverso l’ingestione di materiale contaminato. Una volta
all’interno dell’organismo ospite, il batterio, riconosciuto dalle cellule immunocompetenti,
superata la barriera linfonodale, si riversa nel circolo ematico, dando luogo ad una
batteriemia primaria con localizzazione in diversi organi (1). Prescindendo dalle più note
163
lesioni che il microorganismo può determinare in organi e tessuti, una particolare menzione
nell’uomo riguarda l’apparato oculare, dove Brucella spp. può determinare entità
nosologiche di una certa importanza che se non diagnosticate in tempo possono sortire degli
effetti alquanto gravi come: episcleriti, uveiti, neuropatie ottiche ed endoftalmiti (2), oltre a
forme di cheratocongiuntivite e dacrioadenite, con elevate concentrazioni di Brucella spp. a
livello delle ghiandole lacrimali (3). Nel cane Brucella canis è stata isolata dall’occhio e
riconosciuta responsabile di uveite ed endoftalmite (4), mentre nel cavallo Brucella abortus
viene ritenuta potenziale agente di uveite ricorrente da immunocomplessi (5); diversamente
dalle rare segnalazioni riportate in letteratura relativamente alle lesioni oculari da Brucella
spp. nel cane e nel cavallo, nella specie ovina i riferimenti bibliografici sono carenti. Scopo
del nostro lavoro è stato quello di valutare tramite la real-time PCR la possibile diffusione
della cellula batterica nei diversi tessuti oculari, al fine di evidenziarne la capacità di
determinare lesioni oculari. La diagnosi della malattia con i metodi di routine è abbastanza
controversa in quanto sia la siero agglutinazione rapida che la fissazione del complemento
danno luogo a reattività crociate; l’esame colturale, sebbene specifico, è abbastanza
indaginoso. L’uso di test biomolecolari, nel nostro caso della Real-Time PCR (PCR
quantitativa), consente una diagnosi certa e rapida, confermando uno stato di infezione
prima ancora che si verifichi la siero conversione nel soggetto. Inoltre essendo un’analisi
quantitativa, permette di conoscere la carica batterica del microrganismo e di valutare
meglio i potenziali danni creati dallo stesso.
MATERIALI E METODI
Il nostro studio è stato effettuato su n°18 pecore adulte, di razze diverse, tutte femmine,
risultate positive ai test di routine (SAR e FC) previsti dal piano nazionale di eradicazione
della brucellosi ovi-caprina. Prima della macellazione, che si è svolta presso il mattatoio di
Messina, tutti i soggetti, previa contenzione manuale, sono stati sottoposti ad esame
oftalmologico ed al prelievo del secreto lacrimale tramite pipette Eppendorf munite di
puntale, dalla porzione mediale del fornice congiuntivale inferiore. Subito dopo
l’abbattimento si è proceduto all’enucleazione del globo oculare ed al prelievo, tramite
centesi, dell’humor acqueo e dell’humor vitreo. I liquidi biologici prelevati sono stati
sottoposti a real-time PCR per Brucella spp., con limite di rilevabilità di 1 equivalente
genomico/ml.
Il sistema di PCR in real-time è stato sviluppato su Light Cycler (Roche), sfruttando la
chimica TaqMan che prevede l’uso di una coppia di primers e di una sonda marcata, scelte
omologhe ad una porzione del gene 16S. I test sono stati effettuati sulla base di una curva di
taratura, ottenuta saggiando diluizioni successive in base 10, di una soluzione di DNA di
Brucella equivalente a 106 batteri per ml. Secondo tale schema, sono stati ottenuti 6 punti
per curva, in un intervallo compreso tra 106 e 101 equivalenti genomici per ml di campione
estratto.
La miscela di reazione per il test è stata sviluppata come segue: FastStart DNA Master
Hybridization Probes (Roche)1x, 1pmol/l per ciascun primer, 0,125pmol/l di sonda
marcata, 5 l di estratto di DNA e H2O fino al completamento del volume di reazione
(20l ).
Per quanto riguarda il programma di analisi, in seguito ad una iniziale denaturazione di 3
min a 95°C, si sono realizzati i seguenti cicli di reazione con 45 ripetizioni: 95°C per 5 sec,
164
60°C per 8 sec, 72°C per 10 sec. Il test biomolecolare è stato eseguito su n°18 campioni di
lacrime e su n° 36 campioni rispettivamente di umore acqueo e vitreo. La specificità e la
sensibilità del sistema sono state infine calcolate rispettivamente su campioni sicuramente
negativi e sicuramente positivi.
RISULTATI
Il DNA di Brucella spp. è stato evidenziato in tutti i campioni di secreto lacrimale (100% di
positività), in n° 29 campioni di umore acqueo (80,55% di positività) e in n°23 campioni di
corpo vitreo (63,89% di positività). In tabella 1 vengono riportati i dati relativi alla realtime PCR effettuata sui fluidi oculari, suddivisi in diverse classi, in relazione al numero di
equivalente genomico della cellula batterica presente in 1 ml di campione. In tabella sono
riportate inoltre le percentuali di positività rispetto al numero totale dei campioni.
Tabella 1
Liquido biologico
Eq. Gen/ml
1-100
Eq. Gen/ml
101-1000
Eq. Gen/ml
Totale positivi
> 1001
Lacrime
Humor acqueo
Humor vitreo
2 (11,11%) 15 (83,33%) 1 (5,56%)
21 (58,33%) 8 (22,22%) 0 (0%)
21 (58,33%) 2 (5,56%)
0 (0%)
18 (100%)
29 (80,55%)
23 (63,89%)
Le prove di ripetibilità hanno sempre confermato l’assenza di falsi positivi su campioni veri
negativi, (Specificità 100%) e l’assenza di falsi negativi su campioni veri positivi
(Sensibilità 100%). In tal senso è anche stata dimostrata la scarsa influenza che la matrice
di partenza può avere sul test.
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIÓN
Da quanto riportato in tabella si evince che la Brucella spp. è presente in tutti i fluidi
esaminati, con maggiore incidenza nelle lacrime, nelle quali si riscontra una positività del
100%. La maggiore concentrazione del batterio nel secreto lacrimale supporta l’ipotesi di
una possibile penetrazione della brucella nell’organismo attraverso la via congiuntivale
anche nell’animale (1), così come riportato nell’uomo, dove sono state descritte più
frequentemente forme di dacrioadenite (2). Il rilevamento del DNA batterico a livello
dell’apparato oculare conferma la possibilità di localizzazione del batterio in queste
strutture anche nella specie ovina, in analogia con quanto riscontrato nell’uomo (6), e
depone per una diffusione per via ematica del microorganismo.
Il mancato riscontro di lesioni macroscopiche a carico dei tessuti oculari, nelle pecore
oggetto di studio, può essere rapportato ad uno stadio acuto della malattia; nell’uomo,
infatti, viene riportato che le uveiti in corso di brucellosi si instaurano nella fase cronica,
quale esito di una reazione immunitaria (7). In assenza di lesioni, la RT-PCR positiva viene
considerata nell’uomo una tecnica importante per diagnosticare l’infezione in fase precoce,
al fine di evitare l’instaurarsi di lesioni alquanto gravi, quali forme di endoftalmite con
conseguente perdita di funzionalità dell’organo (8).
Sulla base di quanto riscontrato è auspicabile, nell’ambito dell’oftalmologia comparata,
l’impiego di campioni lacrimali per la diagnosi di brucellosi oculare nell’uomo, considerata
165
la non invasività della tecnica di prelievo. La presenza del batterio a livello di humor
acqueo e vitreo in discrete quantità, esorta l’applicazione della real-time PCR anche su
questi fluidi.
La Real-time PCR risulta così essere un importante strumento di diagnosi e ricerca sia in
medicina umana che in medicina veterinaria, in quanto rappresenta un metodo rapido,
specifico (100%) e sensibile (100%) per la diagnosi e la quantificazione del patogeno.
Tramite la RT-PCR, viene valutata la carica batterica totale e non quella infettante. Questa
tecnica però non consente di effettuare un distinguo tra batterio vivo e morto, per cui risulta
opportuno associare a suddetta tecnica la semina su terreni di coltura oppure valutare la
presenza del genoma batterico al tempo “t0” nel campione, seminarlo in brodo e sempre con
lo stesso metodo, valutare la crescita esponenziale del genoma al tempo “t1”.
Se da un lato la RT PCR non riesce a discriminare tra batterio vivo o morto, dall’altro
considerata l’elevata diffusione della brucellosi tra la popolazione, in particolare tra le
categorie a rischio, non si puoéscludere che i fluidi oculari possano rappresentare un
veicolo di trasmissione anche per l’uomo, coem viene riportato per gli animali.. A tal
proposito sono ancora in itinere le ricerche riguardanti l’esame colturale dei campioni
oculari, al fine di accertare la possibilita` di crescita e moltiplicazione del batterio sul
materiale organico e il conseguente potere patogeno dello stesso.
In considerazione degli scarsi riferimenti bibliografici, riteniamo opportuno sottolineare il
carattere innovativo dell’applicazione della Real-time PCR, nella diagnosi della brucellosi
oculare nelle pecore, nonché la possibilità di quantificare, con tale metodica, la presenza del
patogeno nelle strutture oculari. Riteniamo anche che il presente studio sia da considerare
un importante contributo alle ricerche scientifiche condotte nell’ambito dell’oftalmologia
comparata.
BIBLIOGRAFIA
1) Farina R (1998) Brucella. In: Farina R e Scatozza F “Trattato di Malattie Infettive degli
Animali” II ed., UTET, Torino, pp. 155-179. 2) Güngör K, Bekir NA, Namiduru M (2001),
Acta Ophthalmol Scand, 79, 76-78. 3) Bekir NA, Güngör K, Namiduru M (2000), Eur J
Ophthalmol, 10 (3), 259-61. 4) Martin C.L. (1999) Ocular Manifestations of Systemic
Disease. In: Gelatt K.N. “Veterinary Ophthalmology” III ed. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 1409-1411. 5) Moore C.P. (1990) Disease of the Eye. In: Smith B.P. “Large
Animal Internal Medicine” ed. The C.V. Mosby Company, USA pp 1216, 1233. 6)
Bourcier T, Cassoux N, Karmochkine M, Lehoang P (1998), J Fr Ophtalmol, 21 (2), 126-7.
7) Walker J, Sharma OP, Rao NA (1992), Am J Ophthalmol, 75, 374-5. 8) Van Rooyen
MM, (1981), S Afr Med J. 60 (5), 206-7.
166
THE ANATOMOPATHOLOGICAL EXAMINATION AS A TOOL TO A BETTER
KNOWLEDGE OF RETROVIRUS INFECTION OF SHEEP. A CONTRIBUTE
FROM A SLAUGHTERHOUSE IN TUSCANY.
BIO C*, GREGORIº Mº, TACCINI Eº, BRACA G º
* USL 8 Toscana, Italy º Department of Animal Pathology, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Pisa, Italy
ABSTRACT
The authors present some result of a wide and long research program since 1989 on ovine
pathology by Retroviridae Maedi/Visna, Caprine Artritis enceephalitis, adenomatosis; observation of anatomic-clinical reports in inspective visit at regional slaughterhouse
(2001-2005), - immunocytochemical and histopathological confirmation at laboratory, description of changes in target organs: lung, udder, articulation and central nervous
system. Furthermore consideration prevailing practically-applied has been presented. In
conclusion the authors think that in central Italy the ovi-caprine pathology by retroviridae
need a bigger engagement of studies and research by the most advanced technologies but
also a heavier attention in veterinary public health both in slaughterhouse and in farms.
KEY WORDS: retrovirus, sheep, anatomopathology, slaughterhouse
INTRODUCTION
“The dysplastic jaagziekte-like pneumopathy” was first recognized in Italy in 1959 (10) as
a naturally occurring disease of sheep. Since then several researchers of Pisa University
have performed investigations regarding retrovirus induced pathology in naturally (1, 2, 9,
12) and experimentally (5, 6, 7, 8) infected sheep. Both the lentvirus-induced pathology
(maedi-visna and caprine arthritis encephalitis) and the OPA (jaagsiekte, sheep pulmonary
adenomatosis, or ovine pulmonary carcinoma) have been anatomopathologically,
histologically and immunohistochemically investigated.
Among the importance of laboratory investigations, such as immunohistochemistry and
virus isolation, we believe that the description of the anatomopathological findings detected
during post mortem examination in a slaughterhouse should contribute to a better
knowledge about the pathology and epidemiology of ovine retrovirosis in Tuscany.
MATERIAL AND METHODS
The Authors show data regarding retrovirus induced pathology in slaughtered sheep.
The anatomopathological findings have been obtained from the slaughterhouse of medical
district number 8, in Tuscany. Since 2001 a post mortem examination has been performed
on a total amount of 39740 sheep. These findings have been integrated with histological
and immunohistochemical data obtained from a previously performed research programme
about ovine retrovirus (Department of Animal Pathology, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Pisa, Italy).
167
RESULTS
Table 1 shows all the findings regarding both lentivirus-induced pathology and OPA
obtained from the above mentioned slaughterhouse.
year
2001
2002
Number of animal
slaughtered
s
total number adults
41873
5360
46510
8650
2003
2004
45660
37610
13320
6900
2005
26990
5510
Maedi affected
OPA affected
sheep
sheep
animals
%
animals
%
205
3.8
42
0.7
386
4.4
61
0.7
0.4
421
3.1
60
5
370
5.3
67
0.9
1.0
293
5.3
57
4
Table 1
Anatomo-pathological and histological findings Lungs
On gross examination, the lungs of Maedi Visna Virus (MVV) and caprine artrithis
encephalitis virus (CAEV) infected animals appear enlarged and heavy, they failed to
collapse and demonstrate diffuse and scattered grey foci on pleural and cut surfaces in
perilobular design.
The typical form of ovine pulmonary adenomatosis (OPA) is characterized by tumour
formation in the craniodorsal part of the lungs. The tumour appears as solitary or multiple
white, dry and hard nodules underneath the pleura or deep in the parenchyma.
The most common histological finding in MVV infected sheep consist of interstitial
lymphoproliferative pneumonitis of different severity. The interstitium appears heavily
infiltrated by monuclear inflammatory cells. The presence of perivascular, peribronchiolar
cuffs and pseudofollicular aggregates formed by lymphocytes and macrophages, is a
constant feature. These findings are related to BALT attivation. Furthermore in pregress
forms it is possible to observe both alveolar secondary epithelialization and myocellular
hyperplasia.
OPA represents a neoplastic pathology which would be defined as a bronchioalveolar
adenocarcinoma. Histological changes are characterized by atypical primary cuboidal or
columnar cells proliferation, which often exhibites papillary growth patterns.
The coexistence of
both MVV interstitial lymphoproliferative pneumonitis and
adenomatosis is rare but possible. Secondary inflammation, due to polimicrobic infection or
parasitic concumitant disease, is very common. In these cases the primary pathology related
to retrovirus infection might be not clear and the gross examination shows heterogeneous
lesions. Histology and immunohistochemistry might be useful for final diagnosis.
Mammary gland. In the slaughterhouse the mammary pathology is difficult to detect during
post mortem examination since the mammary gland is removed immediately from the
carcass.
The characteristic MVV-induced pathology in the mammary gland mainly consists in a
chronic indurative mastitis, characterized by diffuse hardening of the gland. The
168
coexistence of both this type of mastitis and polimicrobic inflammation is very common. It
may results in heterogeneus anatomopathological lesions.
Microscopic changes consist on a diffuse accumulation of mononuclear cells especially
lymphocytes, with follicle formation close to the lactiferous ducts and secondary fibrosis.
Immunohistochemical investigation can be useful to discriminate retrovirus-induced
pathology from mycoplasmosis.
Mastitis is frequent in infected sheep and free or cell-associated virus may be excreted with
colostrum. Newborn lambs might became infected by colostrum as previously reported (6).
Viral antigen may be immunocitochemically detect in intestinal epithelial cell of these
lambs.
Joints. In slaughtered sheep, joints were not carefully inspected and gross lesions were
rarely observed. Lentivirus-induced arthritis may involve the carpal or tarsal joints. Clinical
changes are characterized by claudication, hardening and joint’s stiffness.
The synovial wall often shows both epithelial damage and diffuse infiltration of
mononuclear cells, mainly lymphocytes. Histological examination of chronic lesions shows
fibrotic and prolferative changes involving the synovial wall.
The immunohistochemical investigation is essential to detect virus antigen. Differential
diagnosis includes micoplasmosis and polimicrobic diseases.
Central Nervous System. In the slaughterhouse the anatomopathological examination of the
central nervous system is usually difficult to perform due to the enforced norm that
prevents the opening of the box cranial. Furthermore macroscopical changes were not
usually detectable. Histologically the disease is characterized by a non-suppurative
leucomyelitis with mononuclear perivascular cuffing and demyelination. The presence of
the virus might be confirmed by immunohistochemistry on paraffin-embedded tissue
samples.
Pathological changes involving other organs are not usually observed.
CONCLUSION
The results obtained in the slaughterhouse of Tuscany medical district number 8 reflects the
epidemiological situation of ovine retrovirus-induced pathology in Italy.
We believe that a great importance has to be given to ovine pathology induced by
retrovirus, so that proper action can be taken in order both to limit the spreading of the
disease and to implement stricter sanitary laws regarding animals’ international commerce.
Furthermore, nowadays it is possible to perform an investigation on blood samples and
tissutal samples in order to make an early clinical diagnosis (3, 11).
Finally, we believe that the amount of the above described pathology has and is current
being underestimated both due to the medical authorities’ insufficient attention and because
of diagnostical difficulties faced by the veterinary service.
169
BIBLIOGRAPHY
Braca G, Renzoni G, Rossi G, Taccini E, Vitali CG. Atti FeMeSpRum 3, 20/1,1993.
Braca G, Renzoni G, Taccini E. Rivista di parassitologia 6, 56, 1989.
Cubeddu T, Alberti A, Cuccurru C, Pittau M. Summa 1, 6, 15-17, 2002.
Lamberti M, Strola M, Guarda F. Summa I. 35-40, 2006.
Preziuso S, Renzoni, Allen TE, Taccini E, Rossi G, De Martini JC Braca G. Veterinary
Microbiology 104, 157-164, 2004.
Preziuso S, Taccini E, Rossi G, Mariotti F, Braca G, De Martini JC. XIX Meeting of
American Society for Virology, vol 1, pp 155, Fort Collins, Colorado, USA, 2000.
Preziuso S, Renzoni G, Bandecchi P, Taccini E, Braca G. Proceeding 19º Meeting ESVP,
vol 5, 148-149, Thessaloniki, Greece, 2001.
Preziuso S, Taccini E, Rossi G, Renzoni G, Braca G. European Journal of Histochemistry,
4, 47, 373-378, 2002.
Renzoni G, Tolari F, Taccini E, Cantile, Braca G. Ovine lentivirus infection. Schweiz Arch
Tierheilk, 132, 409, 1990.
Romboli B. Annali Facoltà Medicina Veterinaria Pisa, XII, 49,1959.
Sanna E, Sanna MP, Capucchio MT, Guarda F. Large Animals Review 7, 5, 43-48, 2001.
Taccini E, Rossetti P, Renzoni G, Braca G. Atti SIPAOC 10, 113, 1992.
170
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI LISOZIMA IN LATTE
OVINO NORMALE E MASTITICO
EVALUATION OF LYSOZYME TITRATION IN NORMAL AND MASTITIC OVINE MILK
FRATINI F.1, EBANI V.V.1, AMPOLA M.2, INNOCENTI E.3, FORZALE F.4,
PERICCIOLI M.4, CERRI D.1, ANDREANI E.1
1
Dipartimento Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti – Università di Pisa;
2
Dottorando in Produzioni Animali, Sanità ed Igiene degli Alimenti nei Paesi a Clima
Mediterraneo; 3Dottore di ricerca in Patologia dei piccoli ruminanti 4 Libero Professionista.
PAROLE CHIAVE: lisozima, latte ovino, carica batterica totale
KEY WORDS: lysozyme, ovine milk, total bacterial count
ABSTRACT
The aim of the study was to determinate the concentration of lysozyme in normal ovine
milk at several lactation orders and in mastitic milks as well. 436 milk samples from
sardinian sheeps has been seed on blood agar and PCA (Plate Count Agar). Collected sera
from each sample and sera collected from 20 samples from subjects showing clinical and
subclinical mastitis, has been analyzed by Lysoplate Assay. Total bacterial count of normal
milk resulted <5000 UFC/ml and no microrganism responsible of mastitis has been
isolated.
28 of 436 samples (6,4%) showed lysozyme concentration (l.c.) < 0,025 µl/ml, 61 samples
(14%) showed a l.c. of 0,025 µl/ml, 255 (58,5%) a l.c. of 0,05 µl/ml, 87 (19,9%) a l.c. of
0,1 µl/ml and 5 samples (1,2%) a l.c. of 0,2 µl/ml. About lactation orders, we found that
l.c. increased sensibly together with the number of lactations, from second to fourth and
decreased in fifth lactation. In mastitic milk l.c. reached in 70% (14/20) of cases, values
>0,2 µl/ml.
INTRODUZIONE
Il lisozima è un enzima ad azione batteriolitica presente in diversi liquidi biologici (sangue,
latte, saliva e secreto lacrimale) sia degli animali che dell’uomo. Dal punto di vista chimico
si tratta di una glicosidasi, nota anche come muramidasi, in grado di idrolizzare il
peptidoglicano, polisaccaride che rappresenta la componente principale della parete
cellulare batterica; questa molecola risulta costituita da unità alternate di acido Nacetilmuramico e N-acetilglucosamina legate tra loro da legami alfa 1-4-glicosidici. Il
lisozima realizza la propria azione batteriolitica catalizzando la rottura del legame
glicosidico che vede impegnato l’atomo di carbonio in posizione 1 dell’acido Nacetilmuramico (Streyer L., 1996). L’azione litica espressa dal lisozima, per quanto efficace
su numerosi germi patogeni e non, risulta massima nei confronti di Micrococcus
lysodeickticus o Micrococcus luteus e questa caratteristica può essere sfruttata per
evidenziarne la presenza e la concentrazione in determinati liquidi biologici.
Contrastanti sono le opinioni dei diversi Autori per quanto concerne la presenza e la
concentrazione di tale enzima nel latte bovino (Goudswaard J. et al., 1978; Sarwar A. et al.,
2001; Shi J. et al., 2004; Piccinini R. et al., 2005); secondo alcuni sembrerebbe attestarsi su
valori relativamente bassi nel latte normale, mentre aumenterebbe nel latte mastitico, altri
Autori riferiscono invece dell’impossibilità di stabilire un trend definito di concentrazione
171
essendo questo un dato estremamente variabile e soggetto all’influenza di molteplici fattori
quali la razza, lo stadio della lattazione, le condizioni ambientali ed alimentari etc. Scarsi
sono invece in letteratura i dati riguardanti la concentrazione di lisozima nel latte ovino sia
in condizioni fisiologiche che in corso di mastite clinica o subclinica (Moroni P. et al.,
1997).
Con la presente indagine si è voluto verificare la concentrazione di lisozima nel latte di
pecore di un gregge di razza sarda in condizioni fisiologiche a diversi ordini di lattazione;
sono stati inoltre presi in considerazione 20 campioni di latte ovino mastitico.
MATERIALI E METODI
L’indagine si è svolta nei periodi compresi tra Gennaio-Maggio 2005 e Gennaio-Maggio
2006 in un allevamento di pecore di razza sarda ufficialmente indenne da brucellosi,
ubicato in provincia di Grosseto costituito da 250 soggetti, provvisto di mungitrice
meccanica; l’alimentazione si effettua mediante pascolo per tutto l’anno, nel periodo
invernale la razione viene integrata con fieno polifita e avena. Tra gli animali sono stati
selezionati 100 capi suddivisi in quattro gruppi di lattazione nell’anno 2005 (19 soggetti in
1° lattazione; 27 soggetti in 2° lattazione; 29 soggetti in 3° lattazione; 25 soggetti in 4°
lattazione). Nell’anno 2006 la consistenza dei gruppi di lattazione ha subito inevitabili
variazioni dovute al management di allevamento (animali deceduti per cause naturali,
soggetti tolti dalla produzione perché a fine carriera etc). Pertanto il numero complessivo
degli animali sottoposti ad indagine nel 2006 è stato di 117, dei quali 92 rimasti dall’anno
2005 e 25 agnelle di rimonta in 1° lattazione nell’anno 2006. In dettaglio i vari soggetti
erano così ripartiti per lattazione:
25 nuovi soggetti in 1° lattazione, 21 soggetti in 2° lattazione, 27 soggetti in 3° lattazione,
23 soggetti in 4° lattazione, 21 soggetti in 5° lattazione. Il prelievo dei campioni è stato
effettuato in corrispondenza della mungitura serale previo lavaggio, detersione, disinfezione
e asciugatura accurata dei capezzoli eliminando i primi getti di latte. I campioni raccolti in
totale sono stati 456, dei quali 436 relativi alle varie lattazioni (Tabella 1) e 20 campioni di
latte mastitico prelevati da altrettante pecore di razza sarda appartenenti a diversi
allevamenti presenti in provincia di Grosseto. Ciascun campione è stato seminato su piastre
Petri contenenti terreno Agar-sangue incubate per 24 ore a 37°C al fine di isolare eventuali
agenti patogeni. I campioni di latte tal quale e le rispettive diluizioni scalari da 10-1 a 10-5 in
acqua peptonata sterile sono stati seminati in terreno PCA (Plate Count Agar) ed incubati
per 48 ore a 37°C per la determinazione della carica batterica totale (CBT). Le diluizioni
10-1 e 10-2 sono state inoltre seminate su terreno Baird Parker ed incubate per 48 ore a 37°C
al fine di isolare eventuali microrganismi appartenenti al genere Staphylococcus. In seguito
a questa fase preliminare ogni campione è stato trattato per l’estrazione del siero mediante
la metodica descritta da Carlsson et al. (1989) opportunamente modificata: 10 ml di latte
del campione sono stati trasferiti in provette sterili e successivamente addizionati di 50 µl di
una soluzione di caglio Rennet From Calf Stomach (Sigma®) al 2% in acqua bidistillata;
dopo incubazione in termostato a 30°C per mezz’ora e conseguente formazione del coagulo
si è proceduto alla rottura meccanica dello stesso e alla rimozione della caseina e del grasso
tramite centrifugazione a 3500 rpm per 30 minuti a 4°C. Il siero così ottenuto è stato
aspirato e dispensato in provette eppendorf e stoccato a -20°C fino alla prova per la
determinazione della concentrazione di lisozima (Lysoplate Assay). Per la prova di
172
Lysoplate Assay è stato necessario allestire una sospensione di Micrococcus luteus; per tale
sospensione è stato impiegato il ceppo ATCC n° 4698 (Sigma®) liofilizzato; dopo semina
del ceppo su piastre di Tryptose Agar (Difco®) e incubazione di 24 ore a 37°C, le colonie
sviluppatesi sono state prelevate mediante un tampone sterile e sottoposte a lavaggio in
acqua bidistillata sterile; raccolta la maggior quantità possibile di patina batterica le cellule
sono state sottoposte a centrifugazione a 3000 rpm per 15 minuti, è stato eliminato il
surnatante ed è stato ripetuto il lavaggio in acqua bidistillata sterile; il pellet cellulare è stato
infine sospeso in PBS a pH 6.2 fino al raggiungimento di una densità ottica pari a 1.25 a
550 nm determinata tramite spettrofotometro CGA tipo CP 2300. La sospensione è stata
inattivata in autoclave a 121°C per 15 minuti, lasciata raffreddare a temperatura ambiente e
successivamente stoccata a -20°C fino al momento dell’impiego per il test Lysoplate Assay
su piastra. Per la suddetta prova si è fatto riferimento a quanto riportato da Lie et al.(1986)
effettuando le opportune modifiche: è stato necessario allestire un terreno all’agarosio
all’1% in PBS a pH 6,2; sono state dispensate su piastra, nelle medesime proporzioni (circa
25 ml), terreno all’agarosio e sospensione di Micrococcus luteus. Dopo solidificazione del
terreno nella piastra a temperatura ambiente sono stati praticati dei pozzetti del diametro di
5 mm per un totale di 32 pozzetti per piastra; un numero superiore avrebbe potuto
determinare sovrapposizione degli aloni di lisi e difficoltà nell’interpretazione dei risultati.
In otto pozzetti sono state dispensate le diluizioni standard di lisozima H.E.W.L. (Sigma®)
(circa 50 µl), corrispondenti alle concentrazioni di 0,025 µg/ml, 0,05 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,2
µg/ml, 0,5 µg/ml, 1µg/ml, 2 µg/ml, 3 µg/ml, da impiegare per il confronto degli aloni di
lisi, nei rimanenti pozzetti sono stati dispensati i sieri da testare. Le piastre sono state
incubate in camera umida per 18 ore a 37°C. La lettura della prova è stata effettuata
mediante la misurazione del diametro degli aloni di lisi utilizzando un calibro e
l’interpretazione è stata realizzata mediante il confronto con gli aloni delle diluizioni
standard; inoltre le prove sono sempre state eseguite in doppio e interpretate da due
operatori per ridurre al minimo la probabilità di errori sistematici.
RISULTATI
Nel Grafico 1 vengono rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml)
nei campioni di latte esaminati per ogni gruppo di lattazione relativi all’anno 2005; nel
grafico 2 invece vengono rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima
(µg/ml) per l’anno 2006, tenendo presente che la prima lattazione riguarda agnelle al primo
parto, e quelle successive si riferiscono a gruppi di animali del 2005 aumentati di una
lattazione.
173
Grafico 1
Concetrazione Lisozima Campioni/lattazione 2005
38
40
35
35
Concentrazione
lisozima (ug/ml) <
0,025
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,025
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,05
Concentrazione
lisozima (ug/ml) 0,1
35
N ° C a m pio ni
30
25
20
20
13
15
11
10
9
10
6
6
3
5
5
2
0
0
Concentrazione
lisozima (ug/ml) 0,2
4
1
1
2
0
0
I
II
III
IV
Lattazione
Grafico 2
Concetrazione Lisozima Campioni/lattazione 2006
40
34
35
N ° C a m pio ni
30
25
26
26
21
20
20
15
14
14 13
14
10
10
0
9
6
5
3
5
10
23
1
0
0
0
1
2
1
0
I
II
III
Lattazione
174
IV
V
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
< 0,025
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,025
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,05
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,1
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,2
Grafico 3
Concetrazione Lisozima Campioni/lattazione
80
72
70
61
61
N ° C a m pio ni
60
50
40
40
27
30
20
24
21
2022
11
6
10
0
21
11
3
0
1
1
2
10
7
3
9
2
1
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
< 0,025
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,025
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,05
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,1
Concentrazione
lisozima (ug/ml)
0,2
0
I
II
III
IV
V
Lattazione
Nella Tabella 1 vengono riportati nel dettaglio i dati relativi alla concentrazione di lisozima
(µg/ml) e la rispettiva percentuale nei campioni di latte esaminati, distinti per ordine di
lattazione.
Tabella 1
Risultati Campioni latte normale distinti per lattazione
Lattazione
I
II
III
IV
V
N° campioni
Concentrazione Lisozima (µg/ml)
Percentuale (%)
20/88
22/88
40/88
6/88
3/96
11/96
61/96
21/96
1/112
11/112
72/112
27/112
1/112
2/97
7/97
61/97
24/97
3/97
2/43
10/43
21/43
9/43
1/43
< 0,025
0,025
0,05
0,1
< 0,025
0,025
0,05
0,1
< 0,025
0,025
0,05
0,1
0,2
< 0,025
0,025
0,05
0,1
0,2
< 0,025
0,025
0,05
0,1
0,2
22,7
25
45,5
6,8
3,1
11,5
63,5
21,9
0,9
9,8
64,3
24,1
0,9
2,1
7,2
62,9
24,7
3,1
4,6
23,3
48,9
20,9
2,3
175
Nei Grafici 4, 5, 6, 7 e 8 vengono rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima
(µg/ml) per ciascun ordine di lattazione.Nel Grafico 9 vengono invece rappresentati i dati
relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml) nei campioni di latte mastitico, mentre in
Tabella 2 vengono riportati nel dettaglio i medesimi dati per i 20 campioni analizzati con le
rispettive percentuali.
Grafico 4,5
II lattazione
I lattazione
61
70
40
60
22
20
50
N° Campioni
N° Campioni
40
35
30
25
20
15
10
5
0
6
40
21
30
11
20
3
10
< 0,025
0,025
0,05
0,1
0
< 0,025
Concent razione lisozima (ug/ml)
0,025
0,05
0,1
Grafico 6,7
III lattazione
70
70
60
60
50
40
27
30
11
20
1
61
50
N° Campioni
N° Campioni
IV lattazione
72
80
40
24
30
20
1
10
10
7
2
3
0
0
< 0,025
< 0,025
0,025
0,05
0,1
0,025
0,05
0,1
0,2
0,2
Concentrazione lisozima (ug/ml)
Grafico 7,8
Campioni latte mastitico
V lattazione
7
7
25
21
6
N° Campioni
N° Campioni
20
15
10
9
10
5
2
1
5
5
4
3
3
2
2
1
1
1
1
0
0
0,025
< 0,025
0,025
0,05
0,1
0,05
0,1
0,2
0,5
0,2
Conc. Lisozima (ug/ml)
176
1
2
Tabella 3
Concentrazione lisozima campioni latte mastitico
Percentuale
Concentrazione
N° campioni
(%)
Lisozima (µg/ml)
2/20
0,025
10
1/20
0,05
5
3/20
0,1
15
7/20
0,2
35
5/20
0,5
25
1/20
1
5
1/20
2
5
Gli agenti eziologici isolati e tipizzati mediante Api System (BioMerieux®) dai 20 campioni
di latte mastitico analizzati sono i seguenti: 3 ceppi di Staphylococcus hyicus, 1 di
Staphylococcus intermedius, 2 di diStaphylococcus epidermidis, 1 di Staphylococcus
simulans, 9 di Staphylococcus aureus, 1 di Streptococcus dysgalactiae, 1 di Streptococcus
mitis, 1 di Escherichia coli e 1 di Pseudomonas aeruginosa.
CONCLUSIONI
Per quanto concerne l’andamento della concentrazione di lisozima (µg/ml) nei gruppi
suddivisi per lattazione negli anni 2005 e 2006 si osserva come i medesimi soggetti in
prima lattazione nel 2005 e in seconda nel 2006 si abbia un notevole incremento del
numero di campioni con aumento della concentrazione di lisozima: i campioni con
concentrazione > 0,025 µg/ml in prima lattazione nel 2005 passano dal 60,5% (23/38)
all’85,7% (36/42) quando nel 2006 i soggetti si trovano in seconda lattazione; i capi che
erano in seconda lattazione nel 2005 e quindi in terza nel 2006 presentano invece valori
pressoché invariati di concentrazione di lisozima; considerando i valori di concentrazione >
0,025 µg/ml nel 2005 abbiamo l’85,2% (46/54) dei campioni che passa all’88,9% (48/54);
lo stesso dicasi per quei soggetti che si trovavano in terza lattazione nel 2005 e quindi in
quarta nel 2006; per i soggetti inseriti in quarta lattazione nel 2005, e quindi in quinta
lattazione nel 2006, si assiste ad una inversione di tendenza nella concentrazione
dell’enzima in quanto si osservano valori più simili a quelli della prima lattazione. Da un
attenta analisi dei risultati si rileva come in prima lattazione i valori complessivamente
risultino piuttosto bassi; il 47,7% dei campioni presenta concentrazioni ≤0,025µg/ml, il
45,5% presenta valori pari a 0,05 µg/ml e solo il rimanente 6,8% presenta concentrazioni
dell’enzima equivalenti a 0,1 µg/ml. In seconda lattazione la concentrazione di lisozima nel
latte ovino subisce invece un apprezzabile incremento evidenziato dalla diminuzione della
percentuale dei campioni la cui concentrazione di lisozima risulta ≤0,025µg/ml (14,6%) e
dal notevole aumento della percentuale dei campioni con concentrazione pari a 0,05 µg/ml
(63,5%); il restante 21,9% dei campioni si attesta su valori pari a 0,1 µg/ml. In terza
lattazione il trend positivo di incremento della concentrazione di lisozima nel latte sembra
proseguire avendo fornito valori pressoché sovrapponibili a quelli ottenuti nel corso della
seconda lattazione; nello specifico il 10,7% dei campioni si è attestato su valori
≤0,025µg/ml, il 63,4% su valori pari a 0,05 µg/ml, il 24,1% su valori pari a 0,1 µg/ml e il
177
rimanente 0,9% è dato da un campione che si presenta per la prima volta con
concentrazione pari a 0,2 µg/ml. L’andamento della concentrazione dell’enzima in quarta
lattazione si attesta su valori analoghi (il 9,3% dei campioni presenta concentrazioni
≤0,025µg/ml, il 62,9% concentrazioni pari a 0,05 µg/ml, il 24,7% concentrazioni pari a 0,1
µg/ml, il 3,1% concentrazioni pari a 0,2 µg/ml). In quinta lattazione si può invece osservare
come la concentrazione di lisozima subisca un’inversione del trend riportandosi su valori
molto più simili a quelli della prima lattazione (il 27,9% dei campioni si attesta su valori di
0,05 µg/ml) pur mantenendosi numerosi i sieri con concentrazioni pari allo 0,1 µg/ml
(20,9%). Sulla base di questi risultati possiamo affermare che la concentrazione di lisozima
nel latte ovino sembra permanere su valori generalmente bassi in prima lattazione per
subire un sostanziale incremento in seconda lattazione, mantenere tale concentrazione su
livelli pressoché costanti in terza e quarta lattazione per poi subire un decremento
significativo in quinta lattazione. Per quanto riguarda la concentrazione di lisozima nel latte
mastitico possiamo affermare che questa è notevolmente superiore rispetto a quella del latte
normale. Il 70% (14/20) dei campioni si attesta su valori ≥ 0,2 µg/ml. Le maggiori
concentrazioni di lisozima si sono avute in corrispondenza dei campioni di latte i cui agenti
eziologici responsabili di mastite erano rappresentati da Staphylococcus aureus,
Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. In merito alla
CBT del latte normale possiamo affermare che questa si è attestata su valori medi ≤ 1000
UFC/ml, con punte massime di 5000 UFC/ml, quindi valori molto contenuti che non
consentono di mettere in relazione la carica batterica con la concentrazione di lisozima. La
CBT relativa ai campioni di latte mastitico ha fornito un valore medio di circa 18 milioni
UFC/ml; analizzando i due dati si evidenzia come esista un legame di proporzionalità
diretta tra CBT del latte mastitico e concentrazione di lisozima. In considerazione di quanto
sopra esposto sarebbe auspicabile verificare l’ereditabilità della concentrazione di lisozima
nel latte ovino; nel caso in cui questa venisse dimostrata, potrebbe essere impiegata per
contenere l’insorgenza di mastiti. A fianco dei vantaggi dovuti alla presenza di lisozima nel
latte ovino per le attività antibatteriche aspecifiche proprie dell’enzima e per gli effetti
tecnologicamente positivi nell’industria lattiero-casearia (migliore resistenza della cagliata,
riduzione del tempo di coagulazione etc.), possono sussistere degli svantaggi; la stessa
attività antibatterica che per certi aspetti può essere considerata positiva per inibire flore
microbiche alteranti, deterioranti o patogene, può altresì esplicare effetti negativi sui batteri
lattici indispensabili nelle trasformazioni lattiero-casearie. Pertanto, nella produzione di
formaggi pecorini tradizionali e non prodotti con latte crudo, sarebbe opportuno selezionare
ceppi di batteri lattici, impiegabili come starter, resistenti all’azione litica del lisozima, cosa
che per altro già avviene per altre tipologie di formaggio vaccino quali Grana Padano,
Provolone e Asiago (Wasserfall F. et al., 1979; Giangiacomo R. et al., 1992).
BIBLIOGRAFIA
Carlsson A., Björck L., 1989. Lactoferrin and Lysozyme in milk during acute mastitis and
their inhibitory effect in Delvotest P. Journal of Dairy Science. 72: 3166-3175.
Giangiacomo R., Nigro F., Messina G., Cattaneo T.M.P., 1992. Lysozyme: just an additive
or a technological aid as well? Food additives and contaminants. 9 (5): 427-433.
Goudswaard J., Bakker-de Koff E.C., van Ravenswaaij-Kraan H.P., 1978. Lysozyme and
its presence in bovine milk and serum.. Tijdschr Diergeneeskd. 103 (8): 445-450.
178
Lie Ø., Syed M., Solbu H., 1986. Improved Agar Plate Assay of bovine lysozyme and
haemolytic complement activity. Acta Vet. Scand. 27: 23-32.
Moroni P., Cuccuru C., Zecconi A., Manunta L., Pittau M., Contini A., 1997. Correlazione
tra infezioni mammarie, conta cellulare e contenuto in lisozima e nagase nel latte di pecore
sarde. Atti della S.I.S.Vet. 1997 433-434.
Piccinini R., Binda E., Belotti M., Casirani G., ZecconiA., 2005. Comparison of blood and
milk non-specific immune parameters in heifers after calving in relation to udder health.
Vet. Res. 36: 747-757
Sarwar A., Enbergs H., and Klug E., 2001. Influences of parity, age and mineral and trace
element mixture on lysozyme activity in mare’s milk during early lactation period.
Veterinarski Arhiv. 71 (3): 139-147.
Shi J., Aono S., Lantz E., Wei Y., Dykstra C., 2004. Vetmed Archives. (Poster)
Streyer L., 1996. Il lisozima è una proteina compatta con un avvolgimento complesso.
Biochimica. 248-249.
Wasserfall F., Teuber M., 1979. Action of egg white lysozyme on Clostridium
tyrobutyricum. Applied and Environmental Microbiology. 38 (2): 197-199.
179
INTERACTION BETWEEN BVDV AND BOHV-1 INFECTION IN DAIRY HERDS
IN ITALY
CUTERI V., CITTADINI F.1, ROMERO TEJEDA A., PREZIUSO S., MARENZONI
M.L.1, PASSAMONTI F.1, ATTILI A.R., GIORGI G.1, VALENTE C.1
Department of Veterinary Science, University of Camerino, Italy
1
Department of Diagnostic Pathology and Veterinary Clinic, Infectious Diseases Unit,
University of Perugia, Italy
KEY WORDS: Bovine Herpesvirus 1, Bovine Viral Diarrhoea Virus, dairy herds,
seroprevalence, Central Italy
ABSTRACT
Bovine Viral Diarrhoea (BVD) is endemic in cattle in most countries, reaching a level of
0.5-2% persistently infected (PI) animals. Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR) is a
disease of domestic and wild animals due to Bovine Herpesvirus 1 (BoHV-1). Both
infections are associated with several economic losses worldwide. The aim of this study
was to verify the serological situation of both diseases using a commercial ELISA test in 45
herds sampling 1,716 animals from 4 regions of Central Italy, where voluntary eradication
program for IBR was planed. In addition, the BVDV seronegative animals were tested with
an antigen capture ELISA (AgELISA-IDEXX) to identify PI animals. 26.3% and 25.5% of
samples were positive respectively for IBR and BVD, meanwhile both antibodies were
detected in 10.7% sera. All the BVDV seronegative animals were negative to AgELISA. PI
animals are the principal source of infection in a farm, but viral transmission can occur also
in their absence, as demonstrated by the serological results obtained in this work. The
results demonstrate that IBR and BVDV are highly diffused in bovine herds of Central
Italy, and the application of voluntary eradication programs is needful to contain further
diffusion of the infection and to reduce the economic losses.
INTRODUCTION
Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus, family
Flaviviridae, which includes Border Disease Virus and Classical Swine Fever Virus, three
viruses that cause important losses to the livestock industry (Tautz, et al., 1998).
Pestiviruses are small enveloped viruses of 40 to 60 nm diameter with a genome consisting
of a single positive stranded RNA of about 12.5 kb (Hamers et al., 2001; Brock, 2003).
BVDV is classified by biotype and genotype. Two biotypes classification, cytopathic (CP)
and noncytopathic (NCP), is based on the presence or absence of visible cytopathic effects
in infected cell cultures, and although both biotypes infect cattle and cause disease, the
majority of BVDV isolates from the field are NCP (Bolin, 2004). In other hand, BVDV
genotypes (I and II) are detected by polymerase chain reaction (PCR) for nucleotide and
antigenic differences (Ridpath, et al., 1998). Type I BVDV strains include the classic BVDV
isolates, which are commonly used in laboratory reference and vaccine strains, meanwhile
genotype II comprises the BVDV strains associated with high mortality, acute and peracute
infections (Sandvik, 1999; Saliki et al., 2004).
The virus has a worldwide distribution with serum antibody prevalences ranging
from 19% to 90% (Brock, 2004; Lindberg et al., 2005). BVDV infections cause a complex
180
of diseases in cattle, ranging from mild signs to lethal mucosal disease (MD), but infections
have the greatest impact when they occur in the breeding season or during pregnancy
(Greiser-Wilke et al., 2003). This can result in a significant reduction in calving and cause
abortions or malformations, but most importantly can lead to the birth of persistently
infected (PI) calves (Grooms, 2004). The PI animals are thus not detected by the commonly
used AbELISA test, represent the most important reservoir of BVDV within herds and play
a significant role in spreading of infection by direct contact with susceptible animals (Houe,
1999; Brock, 2003; Smith, 2004).
A general model for successful BVD control involves bio-security, virus
elimination, monitoring and immunization (Lindberg et al., 2005). The key to BVD control
is to prevent foetal infections in early gestation, interfering with the process by which PI
animals are generated. An other critical point in BVD control is to detect and remove all PI
animals at a young age in order to reduce the risk of transmission of virus to other animals.
This risk could be minimized also by vaccination programs (Brock, 2004; Kelling, 2004).
The Bovine Herpesvirus type 1 (BoHV-1) belongs to the family Herpesviridae,
subfamily Alphaherpesvirinae, is worldwide distributed and causes significant economic
losses to the cattle industry (Ackermann et al., 2006). The genome of BoHV-1 consists of a
linear DNA molecule of about 140 kb that codes for approximately 70 proteins. This virus
is associated with several clinical manifestations in both beef and dairy herds, such as
rhinotracheitis (IBR), vulvovaginitis, balanopostitis, conjunctivitis, meningoencephalitis
and several forms of reproductive disorders. BoHV-1 replicates in the up respiratory or
genital tracts and gain access to neurons for establishment of latency in the corresponding
ganglia (Takiuchi et al., 2005). Although IBR is a respiratory illness, the agent is not easily
transmitted by aerosol. In contrast, salivation onto feed and movement of contaminated
feed from positive groups to negative groups have been found to be the major source of
BoHV-1 transmission in fattening units.
The most severe effect of BoHV-1 as a reproductive pathogen is seen in pregnant
animals, because if the infection becomes systemic, the virus can reach uterus, leading to
either embryonic or foetal death and abortion (Biuk-Rudan et al., 1999; Boelaert et al.,
2005).
An important activity in an eradication program is the annual surveillance by
serological surveys. Europe has a long history of fighting against BoHV-1 infections,
however only a small number of countries has achieved the goal of IBR-eradication.
Successful eradication programs based on serological tests and slaughter policies have been
carried out in different countries and they suggest the movement restriction of infected
animals and the seropositive cattle removing and replacing with seronegative animals. In
most of these countries vaccination is widely used according voluntary program, which
may help to decrease the economical losses due to disease (Ackermann et al., 2006) and the
recent availability of gE- marker vaccines represents an important tool to immunize
susceptible animals, allowing their detection by specific serological tests.
Serological surveys on BVDV and BoHV-1 infection prevalence in Italy are
limited. The studies are mainly carried out in the North Italy, where the bovine
concentration is higher. Luzzago et al. (1999) found a prevalence of 53.3% of BVDV
infection by seroneutralization in 375 out of 704 sera collected in 29 dairy herds. Castrucci
et al. (1997) found a prevalence of 35.0% of BoHV-1 infection in 2,245 out of 6,415 sera
181
collected in North Italy and tested by seroneutralization. Very few data are available about
BVDV and BoHV-1 prevalence in Central Italy, where a survey carried out in 4 farms
revealed a BoHV-1 prevalence of 38.6% (Castrucci et al., 1997) and where a BVDV
prevalence of 31.4% was found (Ferrari et al., 1999).
In Italy BVD and IBR are not included in compulsory control programs but, on the
basis of the available epidemiological data, some authors recommended the implementation
of voluntary eradication programs in order to limit the economic losses and to reduce the
diffusion of these viruses.
Due to the high economic importance of these diseases, the aim of this preliminary
study was to investigate the epidemiological situation in four regions of Central Italy in
herds where voluntary IBR and BVD eradication programs were started.
a) Animals
Forty-five herds from 4 different regions of Central Italy (Umbria, Marche, Lazio
and Toscana) were selected on the basis of the history of reproductive disorders and of the
absence of BoHV-1 and BVDV vaccination programs. A total of 1,716 Holstein Friesian
animals with an average age between 6 months and 5 years were sampled to obtain sera.
The farms were stratified according to the number of animals to ensure a representative
sampling and the sera were stratified in two groups by age, of 6-15 months or older than 15
months. This latter group was divided in pregnant and not pregnant cows. In each herd an
inquiry was conducted to characterize herd management, animal density, contact with cattle
from other farms, observation of clinical disease, replacement and vaccination practices
adopted. The dimension of the samples allowed estimating with 95% of confidence the
proportion of infected farms and it was calculated for an expected prevalence of infection
of 10%.
b) Serological Test
Samples of blood were collected in tubes without anticoagulant and centrifuged at
2500 rpm for 20 minutes in order to obtain sera samples. The sera were refrigerated and
tested within 2 days with two commercial ELISA kits (BVDV Antibody test kit and IBR-gB
Antibody test kit; IDEXX Herd Check Laboratories) in order to detect serum antibodies
against BVDV and BoHV-1. The IBR-gB enzyme immunoassay is based on the detection of
specific antibodies to the BoHV-1 glycoprotein B (gB), meanwhile the BVDV antibody kit
detects antibodies against the non structural proteins NS3 of BVDV. With the aim to
identify PI animals, the BVDV antibody negative sera obtained from 6-15 months old
animals were tested with a commercial ELISA kit (BVDV Antigen/serum, IDEXX- Herd
Check Laboratories) to detect the structural glycoprotein Erns (gp44-48) of BVDV.
The serological tests were carried out following the manufacturer’s instructions.
Briefly, the antibody detection kits required the sera incubation in antigen–coated wells.
After washing unbound materials, a specific peroxidase-conjugated monoclonal antibody
was added for being detected with substrate/chromogen solution. In case of BVDV antibody
test kit, the conjugated antibody was directed to the bovine antibodies bound to the antigens
coated to the plates. In case of IBR-gB antibody test kit, a competitive reaction was
obtained using a peroxidase-conjugated antibody directed to the gB of the BoHV-1 coated
to the plate. This antibody does not bind to the BoHV-1 antigen when the antigenic
182
determinant has been previously blocked by antibodies in the test serum. The BVDV
antigen kit required the sera incubation in antibody-coated wells. Captured BVDV antigen
was detected by specific antibodies and a peroxidase conjugated antibody. In every test, the
color absorbance generated by the substrate-chromogen reaction was measured using a
spectrophotometer (Labsystem Multiscan) at a single wavelength of 450 nm.
The statistical analysis of the data was carried out using the STATA Program
version 5 and the significativity of differences was evaluated by Chi-square test.
RESULTS AND CONCLUSIONS
The serological survey carried out in the selected herds demonstrated that 37
(82%) out of 45 herds were contemporaneously infected by both BoHV-1 and BVDV. In
particular, 451 (26.3%) out of 1,716 animals tested were positive for BoHV-1, 438 (25.5%)
were positive for BVDV. 185 animals (10.8%) were positive for both tests (Tables 1 and 2).
68 (6.9%) out of the 984 pregnant cows older than 15 months had history of reproductive
problems, and 10 were seropositive for BoHV-1, 18 for BVDV, 37 for both BoHV-1 and
BVDV, and 3 were negative. 195 out of 310 animals aged between 6 and 15 months resulted
negative for BVDV antibodies and the ELISA test aimed at the detection of BVDV antigen
resulted negative in all the animals.
BoHV-1
BVDV
Reproductive
Animals
Total
disorders
+
+
6-15 months
310
0
109
201
115
195
> 15 months
422
0
124
298
101
321
and
not
pregnant
cows
> 15 months
984
68
218
766
222
762
and pregnant
cows
total
1716
68
451
1265
438
1278
Table 1: BoHV-1 and BVDV serological results by the class of age
BVDV
BoHV-1
+
+
185
253
266
1012
total
451
1265
Table 2: BoHV-1 and BVDV serological results
total
438
1278
On the basis of the BVDV serological results, the herds were subdivided in three
classes: seronegative herds, seropositive herds with no recent cases of infection and
seropositive herds with recent infection (Table 3). An herd was considered seronegative if
all the tested animals resulted seronegative for BVDV. Seropositive herds were considered
with recent infection if BVDV antibodies were found in animals aged between 6 and 15
months, while they were considered with no recent infection if the animals aged between 6
and 15 months resulted seronegative, similarly as reported by Ferrari et al. (1999).
183
Herds status
n. of
herds
6
n. of animals
tested
217
N. of Abpositive and %
0 (0%)
Seronegative herds
Seropositive
herds
with no recent BVDV
32
1170
323 (27.6%)
infection
Seropositive
herds
with recent BVDV
7
329
115 (34.9%)
infection
Total
45
1716
438 (25.5%)
Table 3: BVDV serological results by class of herds
n. of PI animals
0
0
0
0
The purpose of this study was to evaluate the sanitary status of dairy herds with
history of reproductive disorders in Central Italy, with particular reference to BoHV-1 and
BVDV infections. In order to exclude interferences in the seroprevalence evaluation due to
vaccine-induced antibodies, the herds included in the study did not apply vaccination
programs for both the two viruses.
The samples tested revealed a BoHV-1 seroprevalence of 26.3%, significantly
lower (p<0.001) than the 35.0% and 38.6% reported by Castrucci et al. (1997) respectively
in North and Central Italy. Similarly, the BVDV seroprevalence detected was 25.5%,
significantly lower (p<0.001) than 53.3% and 31.4% reported respectively by Luzzago et
al. (1999) in North Italy and by Ferrari et al. (1999) in Rome province (Central Italy). These
data reveal that the situation in Central Italy regarding BoHV-1 and BVDV is not so critical
as in other Italian regions, where spontaneous eradication programs began some years ago
because the high seroprevalence and the economic losses, but the seroprevalence detected
in the present work suggest that control measures would have to be planed also in the areas
studied. The seroprevalence differences observed in different geographic areas can be
attributed manly to the differences in size and management between North Italian herds and
Central Italian herds. In particular, in the North Italian herds the cattle are more numerous
and the animal-to-animal contact is closer, resulting in higher risk of viral transmission and
consequently in higher seroprevalence. Other differences could be explained by the
characteristic of the animals included in the study. Our samples were similar to those tested
by Ferrari et al. (1999), while Luzzago et al. (1999) tested animals with no history of
vaccination in the last two years and included also the 0-6 months old animals, which could
have passive antibodies.
BVDV PI animals are considered the principal source of infection in a farm and
within herds, and direct contact between these animals and susceptible animals is the most
important infection route (Brock, 2004, Niskanen et al., 2003; Lindberg et al., 2005). In our
case, none of the 195 BVDV seronegative and 6-15 months old animals resulted positive for
the viral antigen in blood samples, demonstrating the absence of PI animals in the 7
seropositive herds with recent BVDV infection. Moen et al. (2005) have recently
demonstrated that transmission of BVDV by direct or indirect causes can take place over a
prolonged period of time in absence of PI animals, and this is the most probable
explanation of the recent viral infection in herds with no presence of PI animals observed in
184
this study. For this reason, a complete voluntary eradication program should include also
strategies to prevent BVDV transmission in absence of PI animals, with particular reference
to avoiding the use of semen not previously tested for BVDV.
Several studies are worldwide carried out to evaluate BoHV-1 or BVDV
seroprevalence, but very few studies evaluate the distribution of both the viruses
contemporaneously. Our study revealed that 185 (10.8%) out of 1716 cattle were
contemporaneously seropositive for BoHV-1 and BVDV antibodies, and 37 (20%) of them
had history of reproductive problems. The reproductive disorders were reported more
frequently (p<0.01) in animals seropositive for both BoHV-1 and BVDV than in animals
seropositive for only one of the two viruses or than in seronegative animals. These data
suggest that the association between BoHV-1 and BVDV infection could increases the rate
of reproductive problems, as previously suggested by Biuk-Rudan et al. (1999).
The results of this study demonstrate a diffusion of BoHV-1 and BVDV in dairy
herds in Central Italy, and the contemporaneous infection by the two viruses is responsible
for the increase of reproductive problems. Eradication programs should be thus directed to
the control of both the two infections. BVDV eradication programs based on the detection
and slaughtering of PI animals is not recommendable in this case, because recent infection
in absence of PI animals occurred, and more attention have to be paid to the origin and to
the “sanitary status” of the semen used in reproductive practice.
REFERENCES
Ackermann M, Engels M. Pro and contra IBR-eradication. Vet Microbiol. 2006 Mar
31;113(3-4):293-302
Biuk-Rudan N, Cvetnic S, Madic J, Rudan D. Prevalence of antibodies to IBR and BVD
viruses in dairy cows with reproductive disorders. Theriogenology. 1999 Apr 1;51(5):87581.
Boelaert F, Speybroeck N, de Kruif A, Aerts M, Burzykowski T, Molenberghs G, Berkvens
DL. Risk factors for bovine herpesvirus-1 seropositivity. Prev Vet Med. 2005 Jul 12;69(34):285-95.
Bolin SR, Grooms DL. Origination and consequences of bovine viral diarrhea virus
diversity. Vet Clin North Am Food Anim. Pract. 2004 Mar;20(1):51-68.
Brock KV. The persistence of bovine viral diarrhea virus. Biologicals. 2003 Jun;31(2):1335.
Brock KV. Strategies for the control and prevention of bovine viral diarrhea virus. Vet Clin
North Am Food Anim Pract. 2004 Mar;20(1):171-80.
Castrucci G, Martin WB, Frigeri F, Ferrari M, Salvatori D, Tagliati S, Cuteri V. A
serological survey of bovine herpesvirus-1 infection in selected dairy herds in northern and
central Italy. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1997 Sep;20(4):315-7.
Ferrari G, Scicluna MT, Bonvicini D, Gobbi C, Della Verità F, Valentini A, Autorino GL.
Bovine Viral Diarrhoea (BVD) control programme in an area in the Rome province (Italy).
Veterinary Microbiology 1999, 64:237-245
Greiser-Wilke I, Grummer B, Moennig V. Bovine viral diarrhea eradication and control
programs in Europe. Biologicals. 2003 Jun;31(2):113-8.
Grooms DL. Reproductive consequences of infection with bovine viral diarrhea virus. Vet
Clin North Am Food Anim Pract. 2004 Mar;20(1):5-19.
185
Hamers C, Dehan P, Couvreur B, Letellier C, Kerkhofs P, Pastoret PP. Diversity among
bovine pestiviruses. Vet J. 2001 Mar;161(2):112-22.
Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea
virus (BVDV) infections. Vet Microbiol. 1999 Jan;64(2-3):89-107.
Kelling CL. Evolution of bovine viral diarrhea virus vaccines. Vet Clin North Am Food
Anim Pract. 2004 Mar;20(1):115-29.
Lindberg A, Houe H. Characteristics in the epidemiology of bovine viral diarrhea virus
(BVDV) of relevance to control. Prev Vet Med. 2005 Nov 15;72(1-2):55-73.
Luzzago C, Piccinini R, Zepponi A, Zecconi A. Study on prevalence of bovine viral
diarrhoea virus (BVDV) antibodies in 29 Italian dairy herds with reproductive problems.
Veterinary Microbiology 1999, 64:247-52.
Moen A, Sol J, Sampimon O. Indication of transmission of BVDV in the absence of
persistently infected (PI) animals. Prev Vet Med. 2005 Nov 15;72(1-2):93-8
Niskanen R, Lindberg A. Transmission of bovine viral diarrhea virus by unhygienic
vaccination procedures, ambient air, and from contaminated pens. Vet J. 2003
Mar;165(2):125-30.
Ridpath JF, Bolin SR. Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viral diarrhea virus
(BVDV) by PCR. Mol Cell Probes. 1998 Apr;12(2):101-6
Saliki JT, Dubovi EJ. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections. Vet
Clin North Am Food Anim Pract. 2004 Mar;20(1):69-83.
Sandvik T. Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhea virus infections in
cattle. Vet Microbiol. 1999 Jan;64(2-3):123-34.
Smith DR, Grotelueschen DM. Biosecurity and biocontainment of bovine viral diarrhea
virus. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2004 Mar;20(1):131-49.
Takiuchi E, Medici KC, Alfieri AF, Alfieri AA. Bovine herpesvirus type 1 abortions
detected by a semi-nested PCR in Brazilian cattle herds. Res Vet Sci. 2005 Aug;79(1):85-8.
Tautz N, Meyers G, Thiel HJ. Pathogenesis of mucosal disease, a deadly disease of cattle
caused by a pestivirus. Clin Diagn Virol. 1998 Jul 15;10(2-3):121-7.
186
VALUTAZIONE DEI PRINCIPALI AGENTI INFETTIVI CAUSA DI ABORTO
NEL BUFALO (BUBALUS BUBALIS) NEL CENTRO ITALIA
SELECTED AGENTS INVOLVED IN BUFFALO (BUBALUS BUBALIS) ABORTION IN
CENTRAL ITALY
CUTERI V., ATTILI A.R., CITTADINI F.1, PREZIUSO S., ROMERO TEJEDA A.,
MARENZONI M.L.1, VALENTE C.1
Department of Veterinary Science, University of Camerino, Italy. 1Department of
Diagnostic Pathology and Veterinary Clinic, Infectious Diseases Unit, University of
Perugia, Italy
KEY WORDS: buffalo, abortion, aetiology, diagnosis
ABSTRACT
Studies on the infectious agents of abortion in buffalo (Bubalus bubalis) are uncommon and
very few is known about his health status in Italy. In order to investigate this situation, a
serological survey has been carried out in 9 buffalo farms of Central Italy with history of
reproductive disorders. During 2005, 505 buffalo sera were tested using commercial
antibody-detection ELISA for BoHV-1, BVDV (IDEXX), Chlamydophila abortus
(CIVTEST), Leptospira hardjo (EVL-diagnostic division) and Neospora caninum (VMRD,
Inc.).
All buffalos were negative for L. hardjo while 72 (14.26%) sera had antibodies against
BVDV. Overall prevalence of 7.33% and 2.38% has been estimated respectively for BoHV1 and C. abortus. All herds were infected by N. caninum with a prevalence of 50.10%. A
closed association between seropositivity and abortion was found only for N. caninum
infection and the prevalence value was significantly higher (P<10-4) in the aborting group
(79.45%) than in the non-aborting group (45.14%). Abortion occurred in the first trimester
of pregnancy, and the administration of Toltrazuril and/or Sulphadiazine and Trimethoprim
to all the animals was efficacious in reducing N. caninum infection and in preventing the
reproductive disorders. This study suggested a correlation between N. caninum infection
and abortion in buffalo.
INTRODUZIONE
In Italia il bufalo (Bubalus bubalis) ha ormai assunto nell’economia agricola un posto
importante tanto da risultare, nel panorama zootecnico, una delle tipologie di allevamento
in continua crescita con una popolazione stimata approssimativamente intorno ai 200.000
animali. In virtù della crescente domanda di latte da parte dell'industria di trasformazione,
l’aumento di tali animali ha interessato contemporaneamente sia aree tradizionalmente
vocate che zone nuove, tanto che in alcune circostanze l'allevamento bovino è stato
sostituito con quello bufalino (Pisanelli et al., 2005). Se fino a pochi anni fa il bufalo era
presente soltanto in Campania e nel Lazio, oggi si assiste ad una diffusione su tutto il
territorio nazionale. In Puglia si concentra il 2,1% del patrimonio bufalino italiano
(BioBank, 2001) ed aumenti nella consistenza di questa specie si sono registrati nella
pianura padana (Bertoni et al., 2001) e in Lombardia (Bronzo et al., 2003).
187
La particolare fisiologia della riproduzione del bufalo, specie poliestrale tendenzialmente
stagionale con ripristino dell’attività ciclica ovarica in fotoperiodo decrescente, e l’elevata
variabilità della durata del calore pongono notevoli limiti alla produzione. A causa
soprattutto dell’anestro (o subestro) stagionale, il bufalo rappresenta una delle specie
animali sprovvista di performaces sia produttive che riproduttive soddisfacenti (Singh et al.,
2000). Il danno economico che ne può derivare risulta rilevante soprattutto quando, oltre ai
caratteri fisiologici, entrano in gioco svariate cause che concorrono a determinare infertilità
e aborto.
Un ruolo importante nell’eziologia dell’aborto è da attribuire agli agenti di natura infettiva.
Alcuni microrganismi solitamente in grado di determinare aborto quali Brucella spp.,
Campylobacter spp., Tripanosoma evansi (Lohr et al., 1986), Serratia marcescens (Das et
al., 1988), Yersinia enterocolitica (Das et al., 1986), Listeria monocytogenes e Salmonella
spp. devono essere ancora meglio definiti.
Ricerche condotte in Africa e in Malesia hanno dimostrato una positività sierologica,
rispettivamente, dell’1,7% (Myburgh et al., 1990) e del 31% (Bahaman et al., 1987) nei
confronti di alcuni sierotipi di Leptospira. Le informazioni circa la diffusione di Leptospira
interrogans nella specie bufalina allevata in Italia sono ancora modeste pur essendo stata
riscontrata in passato una prevalenza del 67,2% (Ciceroni et al., 1995).
Virus della Rinotracheite infettiva e della Diarrea virale tipici del bovino sono stati isolati
in concomitanza di aborto e sindromi respiratorie in associazione al virus erpetico del
bufalo di tipo 1, Bubaline herpesvirus-1 (BuHV-1), che risulta strettamente correlato oltre
che a BoHV-1 anche a BoHV-5. Anticorpi anti BoHV-1 sono stati evidenziati in diverse
specie di ruminanti, bufalo compreso, dimostrando la suscettibilità all’infezione anche di
questa specie animale e suggerendo un suo possibile ruolo come “reservoirs” (Thiry et al.,
2006). Anche in Italia De Carlo et al. (2004) hanno isolato e successivamente identificato
mediante tecniche di biologia molecolare, il BuHV-1 da tamponi nasali di due bufale sane,
non vaccinate nei confronti della Rinotracheite infettiva del bovino ma sieropositive per
BoHV-1. Tale situazione conferma la correlazione tra i due herpesvirus del bovino per la
presenza di geni codificanti le glicoproteine D e B e il virus del bufalo.
In ulteriori indagini condotte sul bufalo in India sono state registrate prevalenze del 52.5%
per BoHV-1 (Renukaradhya et al., 1996) e del 23.21% per BVDV (Sudharshana et al.,
1999), mentre in Egitto gli animali sieropositivi per BVDV erano il 52% (Zaghawa, 1998).
In questo contesto, a fianco di microrganismi tradizionalmente ritenuti agenti d’infertilità e
aborto, è segnalata la crescente prevalenza di patogeni emergenti anche di origine
parassitaria. Relativamente al ruolo di Neospora caninum, protozoo intracellulare
appartenente al phylum Apicomplexa, famiglia Sarcocystidae, nel determinismo dell’aborto
nel bufalo, alcune segnalazioni e diverse indagini epidemiologiche si sono succedute
rapidamente in tutto il mondo, Italia compresa. Indagini recenti sviluppate in sud d’Italia
(Guarino et al., 2000) e in Egitto (Dubey et al., 1998) hanno registrato valori di prevalenza,
rispettivamente, del 34,6% e del 68%. Sieropositività del 64% e del 53% sono state
segnalate rispettivamente mediante il test di immunofluorescenza e di agglutinazione
(NAT), in bufale naturalmente infette allevate nello Stato di S. Paolo, Brasile (Fujii et al.,
2001).
Lo scopo della ricerca è stato quello di valutare il coinvolgimento di alcuni agenti di natura
infettiva nel determinismo dell’aborto nella specie bufalina allevata in Italia, in seguito alla
188
segnalazione di disordini riproduttivi verificatesi in 9 aziende della provincia di Latina.
Pertanto si è proceduto alla valutazione della prevalenza nei confronti di BoHV-1, BVDV,
Leptospira interrogans serovar Hardjo, Chlamydophila abortus e Neospora caninum, al
fine di definire la diffusione di tali agenti di infezione e correlare la loro presenza con i
disordini riproduttivi.
La finalità della ricerca è stata rivolta anche all’individuazione di un intervento sanitario
immediato capace di contenere soprattutto i danni derivanti dall’aborto.
MATERIALI E METODI
L’indagine è stata condotta nell’anno 2005 in 9 allevamenti bufalini siti nella provincia di
Latina nei quali si erano verificati casi di infertilità e aborto. Tutte le aziende erano
costituite da unità produttive ad indirizzo zootecnico-specializzato e gli animali erano tenuti
in una forma di allevamento stabulato con paddocks e tettoie, con pascolo in regime di
semilibertà. In accordo con il programma di eradicazione applicato in Italia (Decreto
27/8/1994 n. 651), gli animali erano regolarmente sottoposti ai controlli sanitari nei
confronti di Brucellosi, Leucosi e Tubercolosi. Nessun allevamento praticava la
vaccinazione nei confronti di BoHV-1, BVDV e Chlamydophila.
Gli aborti, riferiti all’anno precedente, si registravano tra il primo trimestre e il quinto mese
di gestazione e si presentavano a carattere sporadico in alcune aziende, mentre in altre
coinvolgevano più bufale contemporaneamente e spesso gli stessi animali in gravidanze
successive.
I prelievi di sangue, effettuati nel mese di gennaio su 505 bufali, hanno interessato sia gli
animali che avevano abortito sia quelli sospetti di aborto silente o riassorbimento fetale. Per
ogni allevamento è stata campionata anche la popolazione di controllo, rappresentata da
soggetti che non avevano manifestato disordini riproduttivi.
Sul siero, ottenuto per centrifugazione, sono state effettuate indagini per la ricerca di
anticorpi nei confronti di BoHV-1 (Bovine Rhinotracheitis virus antibody test Kit,
Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA), BVDV (Bovine Viral Diarrhoea Virus
Antibody Test Kit Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA), Chlamydophila abortus
(CIVTEST Bovis Chlamydia PS, Hipra, S. A. Laboratorios, Amer, Spain), Leptospira
interrogans serovar Hardjo (EVL-Diagnostic division, The Netherlands) e Neospora
caninum (VMRD, Inc.Pullman, WA, USA), seguendo le indicazioni delle ditte produttrici.
Nel mese di febbraio 2005, sulla base dei risultati sierologici, gli animali sono stati
sottoposti a trattamento chemioterapico nei confronti di Neospora caninum, seguendo il
protocollo formulato da Cuteri et al. (2005). Agli annutoli è stato somministrato per via
endovenosa Toltrazuril 50 mg/ml (Baycox® - Bayer), mentre agli adulti Sulfadiazina
200mg/ml e Trimethoprim 40 mg/ml (Norodine 24® - Bayer). Nel trattamento sono stati
inclusi anche i cani, considerati l’ospite definitivo in grado di eliminare le oocisti infettanti,
ai quali è stato somministrato Toltrazuril per via orale. L’utilizzo periodico di disinfettanti
fenolici, diluiti all’1%, garantiva la disinfezione dei ricoveri.
Nel mese di dicembre dello stesso anno tutti i bufali sono stati nuovamente testati
sierologicamente nei confronti di N. caninum e i risultati sono stati confrontati con quelli
ottenuti prima del trattamento.
189
Per la valutazione statistica dei risultati è stato utilizzato il Programma STATA versione 5 e
la significatività delle differenze è stata valutata attraverso il test del χ2 e dell’Odds ratio,
con intervalli di confidenza del 95%.
RISULTATI E CONCLUSIONI
I risultati dell’indagine sierologica condotta nel mese di gennaio 2005 sono riportati
integralmente nella figura 1. La ricerca di anticorpi ha evidenziato positività per il virus
della Diarrea virale del bovino in 8 delle 9 aziende saggiate con una prevalenza media del
14,26%.
In tutte le aziende sono state riscontrate positività sierologiche nei confronti di BoHV-1 e di
N. caninum, interessando, rispettivamente, 37 (7.33%) e 253 (50,10%) dei 505 bufali
saggiati. I dati hanno mostrato una prevalenza per C. abortus del 2,38%, mentre tutti gli
animali sono risultati negativi alla ricerca di anticorpi nei confronti di Leptospira
interrogans serovar Hardjo.
L’analisi dei dati ha evidenziato un’associazione statisticamente significativa tra
sieropositività per N. caninum e soggetti con storia di disordini riproduttivi rispetto al
gruppo di animali che non aveva mai presentato ipofertilità o aborto (χ2 = 29,41; P<10-4)
(Tabella 1). La misura del grado di tale associazione è stata valutata mediante il calcolo
dell’Odds Ratio (OR) con un valore di 4,70 (2.60 < OR < 8.49).
Figura 1. Agenti abortigeni e sieroprevalenza.
60%
50,10%
50%
40%
BoHV-1
BVDV
30%
C. abortus
20%
L. hardjo
14,26%
N. caninum
7,33%
10%
2,38%
0
0%
Agenti abortigeni
190
Tabella 1. Correlazione tra sieropositività ed aborto.
Prevalenza
Agenti
Abortigeni
Aborto (n = 73)
Non aborto (n = 432)
BoHV-1
8,22% (CI95 1,77 - 14,67)*
7,18% (CI95 4,73 - 9,62)
BVDV
10,96% (CI95 3,62 – 18,30)
14,81% (CI95 11,45 – 18,18)
Chlamydophila abortus
-
2,78% (CI95 1,22 - 4,33)
Leptospira interrogans serovar
Hardjo
Neospora caninum
-
-
79,45% (CI95 69,96 – 88,94)
45,14% (CI95 40,43 - 49,85)
* CI95: Intervallo di Confidenza del 95%.
Sulla base dell’alta prevalenza di N. caninum, allo scopo di contenere gli aborti è stato
ritenuto opportuno intervenire con tempestività sperimentando il protocollo applicato in
precedenza nel bovino. Nella tabella 2 sono riassunti i risultati relativi alla prevalenza per
N. caninum prima (T0) e dopo (T1) il trattamento. In particolare, dei 73 animali che avevano
abortito prima del trattamento, 47 (64,38%) erano sieropositivi solo per N. caninum, 6
(8,23%) per N. caninum e BVDV e 4 (5,48%) sia per N. caninum che per BoHV-1. Un solo
soggetto, con anamnesi di disordini riproduttivi, aveva anticorpi nei confronti di tutti e tre
gli agenti aborigeni (1,37%).
Durante i mesi di trattamento, in tutti gli allevamenti, è stata registrata una significativa
diminuzione (P < 10-4) degli episodi di aborto e nessuno tra i bufali risultati in precedenza
negativi ha contratto infezione da Neospora o ha abortito. L’intervento chemioterapico non
può prescindere dall’attento controllo dei potenziali fattori di immunodepressione derivanti
dalle concomitanti infezioni virali che potrebbero giustificare i 9 dei 16 casi di aborto
osservati ancora dopo l’applicazione del protocollo terapeutico.
Tabella 2. Sieroprevalenza per Neospora caninum prima e dopo il trattamento.
Trattamento
Numero di animali con
anamnesi di aborto
siero + per N. caninum
Prevalenza
per
Neospora caninum
(T0)
58/73
79,45% 1 (CI95 69,96 – 88,94)
n = 73
(T1)
16/58
27,59% 1 (CI95 15,73 – 39,44)
n = 58
CI95: Intervallo di Confidenza del 95%; 1(P < 10-4).
La dimostrazione dell’infezione da N. caninum in ben 58 soggetti che avevano abortito,
ribadisce l’importanza di questo protozoo quale agente di aborto anche nella specie bufalina
e suggerisce un ampliamento delle indagini volte a determinare la reale diffusione di N.
191
caninum negli allevamenti bufalini italiani e la corretta valutazione del suo ruolo quale
causa di aborto ed ipofertilità.
In accordo con quanto riportato in bibliografia (Sudharshana et al., 1999), anche nella
nostra indagine è stata confermata la maggiore diffusione di BVDV rispetto a BoHV-1.
Negli allevamenti oggetto di studio i caratteri tipici dell’infezione da BoHV-1, come aborto
negli ultimi 4 mesi di gestazione e sindrome respiratoria, non sono stati osservati, a
conferma della bassa prevalenza riscontrata (7,33%). Il valore modesto riportato in questa
indagine contrasta con un risultato di positività del 52,5% riportato da altri autori
(Renukaradhya et al., 1996).
I risultati possono contribuire alla conoscenza della possibile correlazione tra agenti di
natura infettiva e i disordini riproduttivi osservati nel bufalo ed in particolare sottolineano
l’importanza di N. caninum quale agente abortigeno. Considerando l’importanza dell’aborto
nella gestione economica di un’azienda e dei possibili riflessi che può avere in ambito di
sanità pubblica, risulta essenziale sviluppare una maggiore conoscenza del fenomeno per
promuovere gli interventi gestionali opportuni. Pur rimanendo in parte irrisolti alcuni
problemi legati all’allevamento bufalino, l’impiego dell’indagine sierologica rappresenta un
valido mezzo diagnostico in grado di fornire informazioni sullo stato sanitario degli
animali.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Bahaman A.R., Ibrahim A.L. Adam H. (1987). Serological prevalence of leptospiral
infection in domestic animals in West Malaysia. Epidemiol. Infect. Vol. 99 (2): 379-392.
Bertoni G., Piccioli Capelli F., Carli D (2001). L’allevamento bufalino nel nord Italia.Atti 1
Congr. All. del bufalo, Eboli (SA): 20-27.
http://www.biobank.it/it/BIObiobank.asp
Bronzo V., Fedeli R., Moroni P., Casula A., Pisoni G., Antonimi M., Sgoifo Rossi C.,
Ruffo G. (2003). Infezioni mammarie e contenuto in cellule somatiche del latte in
allevamenti bufalini della Lombardia. Atti SiSVet Ischia (Napoli). Vol. LVII: 179-180.
Ciceroni L., D’Aniello P., Russo N., Picarella D., Nese D., Lauria F., Pinto A., Cacciapuoti
B. (1995). Prevalence of leptospire infections in buffalo herds in Italy. Vet. Rec. Vol 137
(8): 192-193.
Cuteri V., Nisoli L., Preziuso S., Attili A.R., Guerra C., Lulla D., Traldi G. (2005).
Application of a new therapeutic protocol against Neospora caninum-induced abortion in
cattle: a field study. JAVA. Vol. 4 (5): 510-514.
Das A.M., Paranjape V.L., Pitt T.L. (1988). Serratia marcescens infection associated with
early abortion in cows and buffaloes. Epidemiol. Infect. Vol. 101(1):143-149.
Das A.M., Paranjape V.L., Winblad S. (1986). Yersinia enterocolitica associated with third
trimester abortion in buffaloes. Trop. Anim. Health Prod. Vol. 18(2): 109-112.
De Carlo E., Re G.N., Letteriello R., Del Vecchio V., Giordanelli M.P., Magnino S., Fabbi
M., Mazzocchi C., Bandi C., Galero G. (2004). Molecular characterisation of a field strain
of bubaline herpesvirus isolated from buffaloes (Bubalus bubalis) after pharmacological
reactivation. Vet. Rec. Vol. 154 (6): 171-174.
Decreto 27/8/1994, n. 651 Ministero della Sanità, G.U. 26/11/1994 serie generale n. 277.
192
Dubey J.P., Romand S., Hilali M., Kwok O.C., Thulliez P. (1998). Seroprevalece of
antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in water buffaloes (Bubalus
bubalis) from Egypt. Int. J. Parasitol. Vol 28: 527-529.
Ferroglio E., Wambwa E., Castiello M., Trisciuoglio A., Prouteau A., Pradere E., Ndungu
S., Meneghi D. (2003). Antibodies to Neospora caninum in wild animals from Kenya. East
Afr. Vet. Parasitol. Vol. 118: 43–49.
Fujii T.U., Kasai N., Nishi S.M., Dubey J.P., Gennari S.M. (2001). Seroprevalence of
Neospora caninum in female water buffaloes (Bubalus bubalis) from the southeastern
region of Brazil. Vet. Parasitol. Vol 99: 331-334.
Guarino A., Fusco G., Savini G., Di Francesco G., Cringoli G. (2000). Neosporosis in water
buffalo (Bubalus bubalis) in southern Italy. Vet. Parasitol. Vol. 91: 15-21.
Lohr K.F., Pholpark S., Siriwan P., Leesirikul N., Srikitjakarn L., Staak C. (1986).
Trypanosoma evansi infection in buffaloes in North-East Thailand. II. Abortions Trop.
Anim. Health Prod. Vol. 18 (2): 103-108.
Myburgh J.G., Bengis R.G., Bester C.J., Chaparro F. (1990). Serological reactions to
Leptospira species in buffalo (Syncerus caffer) from the Kruger National Park.
Onderstepoort J. Vet. Res. Vol. 57 (4): 281-282.
Pisanelli G., Martella V., Pagnini U., De Martino L., Lorusso E., Iovane G., Buonavoglia
C. (2005). Distribution of G (VP7) and P (VP4) genotypes in buffalo group A rotaviruses
isolated in Southern Italy. Vet. Microbiol. Vol. 110 issue 1-2: 1-6.
Renukaradhya G.J., Rajaseklar M., Raghavan R. (1996). Prevalence of infectious bovine
rhinotracheitis in southern India. Rev. Sci. Tech. Vol. 15 (3): 1021-1028.
Singh, J., Nanda AS., Adams GP (2000) The reproductive pattern and efficiency of female
buffaloes. Anim. Repr. Sci. Vol. 60-61: 593-604.
Sudharshana K.J., Suresh K.B., Rajaseklar M. (1999). Prevalence of bovine viral
diarrohoea virus antibodies in India. Rev. Sci. Tech. Vol. 18 (3): 667-671.
Thiry J., Keuser V., Muylkens B., Meurens F., Gogev S., Vanderplasschen A., Thiry E.
(2006). Ruminant alphaherpesviruses related to bovine herpesvirus 1. Vet. Res. Vol. 37:
169-190.
Zaghawa A. (1998). Prevalence of antibodies to bovine viral diarrhoea virus and/or border
disease virus in domestic ruminants. Zentralbl Veterinarmed B. Vol 45 (6): 345-351.
193
NIVELES DE CADMIO EN HÍGADO, RIÑÓN Y MÚSCULO EN
GANADO OVINO PROCEDENTE DE LEON (N.O. ESPAÑA).
CADMIUM LEVELS IN LIVER, KIDNEY AND MEAT IN SHEEP FROM LEON (N.W.
SPAIN)
SIERRA CARRO, J.A.b; LÓPEZ ALONSO, M.a; GARCÍA-PARTIDA, P.c; ESCUDERO
POBLACIÓN, A.b; BENEDITO, J.L.a
a
Universidad de Santiago de Compostela, Departamento de Patología Animal, Facultad
de Veterinaria.
b
Universidad de León, Departamento de Patología Animal: Medicina Veterinaria,
Facultad de Veterinaria.
c
Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria.
ABSTRACT
The aim of this study was to determine the levels of cadmium in meat and offals in sheep
from León (NO Spain), and to compare them with levels in other countries and with the
maximum tolerance levels in products for human consumption established by European
Community.
Samples of liver, kidney, muscle and blood of 255 adult ewes (3-10 years) were collected at
the slaughterhouses of Leon Province in 2004-2005. The samples were processed with acid
digestion and cadmium levels were determined by ICP-OES.
The mean cadmium concentrations (expressed arithmetic mean±SE) were 149±11 µg/kg
fresh weight in liver, 751±42 µg/kg in kidney and 14.8±2.8 µg/kg in muscle. In general,
cadmium levels in our study were slightly higher than of the most countries studies. In
León 4% of livers, 24% of kidneys and 2% of muscles above the maximum tolerance levels
established by European Community.
PALABRAS CLAVE: cadmio, hígado, riñón, músculo, ganado ovino, León
INTRODUCCIÓN
Los procesos agrícolas e industriales han dado lugar a la liberación de muchos metales
tóxicos al medio ambiente, aunque también pueden aparecer concentraciones relativamente
altas de forma natural. Si hablamos de potenciales efectos adversos sobre la salud humana y
animal, el cadmio está entre los elementos que han causado una mayor preocupación. Esto
es debido a que es fácilmente transferido a través de la cadena alimentaria y no se conoce
que sirva para ninguna función fisiológica esencial por el contrario, cuando está presente en
concentraciones elevadas puede causar importantes daños como fallo renal, anemia,
hipertensión o daño hepático (Friberg y col., 1979).
Uno de los aspectos más importantes de la contaminación ambiental para el hombre es la
ingesta de estos elementos tóxicos con la dieta. Puesto que esta situación se debe limitar a
un mínimo inevitable, se ha puesto mucha atención en los niveles de estos elementos en la
dieta. La carne y productos derivados constituyen una parte importante de la dieta humana.
Aunque los niveles de elementos tóxicos en el músculo son generalmente bajos, las
asaduras, como el hígado y el riñón, acumulan frecuentemente mayores concentraciones de
estos elementos que otros alimentos (López Alonso y col., 2000). Ante esta situación la
194
Unión Europea en el año 2001 estableció unos niveles máximos admisibles para los
productos animales destinados al consumo humano (European Comisión, 2001).
Por todas estas razones se hace necesario monitorizar los niveles de cadmio en carnes para
evitar el consumo de carnes con unos niveles de cadmio excesivos. Así en muchos países se
han llevado a cabo programas de monitorización para evitar la distribución de alimentos
que podrían plantear un riesgo para la salud humana si fueran consumidos como por
ejemplo en Noruega (Kluge-Berge y col., 1992), Suecia (Jorhem y col., 1989, 1991, 1996),
Holanda (Vos y col., 1987, 1988), Finlandia (Niemi y col., 1991), Polonia (Falandysz 1991,
1993, 1994), Australia (Langlands y col., 1987, 1988), Canadá (Salisbury y col., 1991),
Eslovenia (Doganoc, 1996).
Los objetivos de este estudio se centran en determinar los niveles de cadmio en carne y
vísceras en ganado ovino procedente de León (NO España), compararlos con las
concentraciones de cadmio en ganado ovino en otros países y con los niveles máximos
admisibles para productos cárnicos establecidos por la Unión Europea.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestreo
La recogida de las muestras se llevó a cabo en varios mataderos de la provincia de León
entre Noviembre de 2003 y Octubre de 2005, pudiendo así conocer la procedencia exacta
de los animales, por medio de la Guía de Origen y Sanidad Pecuaria, garantizar que todas
las muestras (hígado, riñón y músculo) perteneciesen al mismo animal, y evitar problemas
de contaminación por el manejo de las mismas. Se recogieron muestras de un total de 251
hembras adultas, con un edad comprendida entre los 3 y 10 años, Se descartaron aquellos
animales que por cuestiones sanitarias eran objeto de decomiso.
Las muestras fueron recogidas siempre de la misma procedencia anatómica mediante el
empleo de cuchillos de plástico para evitar contaminación. La muestra de hígado se tomó
del lóbulo cuadrado (200 g aproximadamente), para el riñón se recogió el riñón derecho y
la muestra de músculo se recogió de los pilares del diafragma. Las muestras se recogieron
en bolsas de polipropileno debidamente identificadas y se mantuvieron refrigeradas hasta su
transporte en el mismo día al laboratorio.
Una vez en el laboratorio, las muestras se limpiaron de grasa, tejido conectivo y principales
vasos sanguíneos. En el caso del riñón las muestras fueron homogeneizadas para evitar
posibles diferencias en la concentración de elementos entre la corteza y la médula renal.
Una vez limpias de cada muestra de tejido se tomaron 3 submuestras de 10 g
aproximadamente que se colocaron en bolsas de polipropileno debidamente identificadas.
Todas las muestras de cada animal se colocaron en una única bolsa identificada con el
código del animal, congelándolas a -18ºC hasta su posterior análisis laboratorial.
Digestiones
Todas las muestras de hígado, riñón y músculo (2 g aproximadamente) se pesaron de forma
precisa en los vasos de digestión utilizando una balanza electrónica SALTER- AND,
modelo ER-60 A. A cada muestra se le añadieron 5 ml de ácido nítrico concentrado,
(Suprapur Grade, Merck 69%), 2 ml de peróxido de hidrógeno 30% p/v y 1 ml de agua
ultrapura. A continuación se cerraron los vasos y se sometieron a un proceso de digestión
195
en un sistema microondas (marca Milestone Ethos Plus) La solución resultante se diluyó
con agua ultrapura hasta un volumen final de 25 ml y se almacenó en tubos de
polipropileno hasta su posterior análisis químico.
Determinación laboratorial
La determinación de los niveles de cadmio se llevó a cabo por Espectroscopía de Emisión
con Fuente de Plasma Acoplado (ICP-OES). Los análisis se realizaron en el Laboratorio
FISQUITECNAL perteneciente a los servicios centrales de la Universidad de Santiago de
Compostela.
Durante todo el estudio se llevó a cabo un estricto programa de control de calidad analítica.
En cada lote de 10 muestras se incluía un blanco y una muestra de material de referencia
certificado. El límite de detección de la digestión ácida se calculó como tres veces la
desviación estándar de los blancos. Los límites de cuantificación, expresados como la
concentración de cada analito en el tejido, se calcularon teniendo en cuenta el peso de la
muestra y la disolución empleada. Estos límites de cuantificación fueron 12.0, 24.5 y 15.8
µg/kg para hígado, riñón y músculo respectivamente. Los estudios de recuperación analítica
se llevaron a cabo empleando un Material de Referencia Certificado (Pig Kidney CRM 186,
BCR Reference Materials) con una concentración certificada de cadmio de 2.71 µg/kg peso
seco, obteniendo un porcentaje de recuperación de 95.0% a lo largo de todo el estudio.
Encontramos unas concentraciones medias de cadmio (expresadas como media
aritmética±SE) de 149±11 µg/kg peso fresco en hígado, 751±42 µg/kg en riñón y 14.8±2.8
µg/kg en músculo (Tabla 1). Los niveles de cadmio en riñón fueron 5 veces superiores a los
descritos en hígado, mientras que los niveles en músculo fueron muy bajos con un 77% de
las muestras por debajo del límite de detección. En la mayoría de estudios realizados en
distintas especies animales se han descrito resultados similares con niveles mucho más altos
en hígado y riñón con respecto al músculo. Esto pone de manifiesto que el hígado y el riñón
son los principales órganos de acumulación crónica de cadmio debido a que tienen
capacidad de síntesis de metalotioneínas, a las cuáles se une el cadmio (Friberg y col.,
1979); sin embargo en el músculo los niveles son siempre bajos situándose en la mayoría de
las muestras por debajo del límite de detección, ya que en este tejido el cadmio no puede
inducir la síntesis de dichas proteínas, pasando al hígado y al riñón donde sí va ser fijado a
estas proteínas (Webb, 1979).
Las concentraciones de cadmio en ganado ovino han sido determinadas en muchos países
(Tabla 2). Antes de comparar los resultados obtenidos en el ganado ovino de León con
estudios realizados en otros países debemos señalar que estas comparaciones deben
realizarse con cierta precaución porque pueden existir diferencias entre los distintos
estudios en la edad de los animales, el tipo de muestra analizada (en riñón corteza, médula
ó todo el órgano ya que los niveles en corteza renal suelen ser mayores; (Friberg y col.,
1979) ó diferencias en el análisis de los datos (como el límite de detección o el valor
asignado a las muestras que se encuentran por debajo del límite de detección) que hacen
que los datos no sean fácilmente comparables entre sí. Al comparar los resultados obtenidos
en ganado ovino de León con estudios llevados a cabo en otros países observamos que en
Italia (Amodio-Cocchieri y Fiore, 1987) los niveles de cadmio son superiores en los tres
196
tejidos estudiados; estos autores atribuyeron estos niveles tan elevados al hecho de que los
forrajes locales que constituían el alimento del ganado ovino contenían también elevados
niveles de cadmio. Los niveles encontrados en Australia (Langlands y col., 1988) también
fueron superiores a los encontrados en León, estos autores atribuyeron estos elevados
niveles de cadmio al consumo de suelo de las ovejas al pastar debido a que por las
características físicas, químicas y geológicas del suelo y a la aplicación de superfosfatos
que aumentaban los niveles de cadmio en estos suelos. En USA (Coleman y col., 1992)
encontraron niveles sensiblemente superiores a los descritos en León pero solamente los
riñones superaban en alguna ocasión los límites regulatorios fijados en 2 mg/kg. En el resto
de los países los niveles fueron sensiblemente menores a los descritos en el ganado ovino
de León.
En un estudio realizado en ganado vacuno en León, López Alonso y col. (2004)
determinaron unos niveles de cadmio de 59,6, 318 y 8,51 µg/kg en hígado, riñón y músculo
respectivamente. Si comparamos estos valores con los descritos en el ganado ovino
observamos que son menores lo que puede deberse a que gran parte del ganado ovino se
cría en régimen extensivo consumiendo forrajes y pastos locales a diferencia del ganado
vacuno criado en régimen intensivo y alimentado principalmente con piensos compuestos.
La Unión Europea en el año 2001 estableció unos niveles máximos admisibles de cadmio
para productos cárnicos de 0,5, 1 y 0,05 mg/kg en hígado, riñón y músculo,
respectivamente. Estos niveles máximos admisibles fueron superados en un 4, 24 y 2% de
las muestras de hígado, riñón y carne respectivamente. Este hecho es común en otros países
aunque hay que señalar que los límites tolerables fijados para el consumo humano son
distintos en los diferentes países siendo los establecidos por la UE los más restrictivos. En
Australia no destinan al consumo humano los riñones de vacas y ovejas de más de 18 meses
porque en muchas ocasiones superan la concentración máximas permitidas fijada en 2,5
mg/kg (Morcombe y col., 1994). En Grecia, Antoniou y col. (1995), encontraron que un
50% de los riñones y un 14,7% de los hígados de ganado caprino superaban los límites
permitidos para consumo humano (riñón 3, hígado 1 mg/kg) por lo que señalan que el
consumo de estas vísceras debería ser prohibido. En Canadá Salisbury y col. (1991)
describieron que en équidos un 98,6% de los riñones y un 77% de los hígados superaban el
límite máximo permitido de 1 mg/kg, por lo que se recomendó que estos órganos no fueran
utilizados para la alimentación humana ni animal. En Holanda (Vaessen y Ellen (1985)
encontraron que un 22% de los riñones y un 3% de los hígados superaban los límites
máximos para el consumo humano fijados en 1 mg/kg para el hígado y 3 mg/kg para el
riñón. En Polonia Falandysz y col. (2005) observaron que en ciervos cazados entre 20002001 una serie de riñones sobrepasaban los límites legales fijados en este país. Según
observamos en la mayoría de los estudios son el hígado y el riñón los órganos que
normalmente exceden los límites máximos fijados para el consumo humano, a diferencia de
la carne que en raras ocasiones excede estos límites. Así López Alonso y col. (2002)
indican que la carne, a pesar de ser consumida en mayor cantidad, contribuye poco a la
ingesta de cadmio; sin embargo el consumo de asaduras (principalmente hígado y riñón)
aún en pequeñas cantidades puede ser una fuente significativa de este elemento sobre todo
si el ganado procede de zonas relativamente contaminadas. Ante esta situación Prankel y
col. (2005) señalan que la extracción rutinaria del hígado y el riñón del ganado ovino adulto
197
es una buena opción para reducir la ingesta de cadmio en el hombre procedente de estos
animales.
CONCLUSIONES
Las concentraciones de cadmio en el ganado ovino de León fueron generalmente bajas y
comparables a las descritas en otros países. Puesto que un 24% de las muestras de riñón y
un 4% de las muestras de hígados de animales ovinos adultos superaron los niveles
máximos admisibles establecidos por la UE no se recomienda el consumo de estos órganos.
Tabla 1: Niveles de cadmio en hígado, riñón y músculo en ganado ovino de la provincia de
León
N (<LD)
Media
ES
Mediana
Mínimo
Máximo
Hígado
251 (3)
149
10,5
98,1
5,99
1477
Riñón
250 (1)
751
41,8
559
12,3
3906
Músculo
251 (195)
14,8
2,79
7,90
7,90
693
Tabla 2. Niveles de cadmio en hígado, riñón y músculo (µg/kg) de ganado ovino en
estudios realizados en otros países.
País
Nueva Zelanda
Italia
Australia
Holanda
Canadá
Polonia
Alemania
USA
Kuwait
Suecia
Suecia (corderos)
Islandia
(corderos)
Hígado
100
219 (30)
298 (563)
89 (123)
60 (155)
56 (5)
271 (62)
240 (34)
44 (16)
310 (11)
45 (96)
Riñón
250
1035 (30)
956 (552)
289 (124)
170 (155)
250 (5)
547 (71)
830 (34)
301 (16)
1000 (42)
120 (98)
58 (96)
Músculo
178 (30)
31 (714)
6 (49)
< 5 (5)
2 (72)
3,4 (43)
1,9 (98)
Referencia
Solly y col. (1981)
Amodio-Cocchieri y col. (1987)
Langlands y col. (1988)
Vos y col. (1988)
Salisbury y col. (1991)
Falandysz (1991)
Schulz-Schroeder (1991)
Coleman y col. (1992)
Husain y col. (1996)
Jorhem (1999)
Jorhem (1999)
Reykdal y col. (2001)
BIBLIOGRAFÍA
Amodio-Cocchieri, A.; Fiore, P. 1987. Lead and cadmium concentrations in livestock bred
in Campania, Italy. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 39: 460-464.
198
Antoniou, V; Zantopoulos, N. 1995. Selected heavy metal concentrations in goat liver and
kidney. Vet. Human. Toxicol. 37 (1): 20-22.
Coleman, M.E.; Elder, R.S.; Basu, P. 1992. Trace metals in edible tissues of livestock and
poultry. Journal of AOAC International. 75 (4): 615-625.
Doganoc, D. 1996. Lead and cadmium concentrations in meat, liver and kidney of
Slovenian cattle and pigs from 1989 to 1993. Food Additives and Contaminants. 13 (2):
237-241.
Falandysz, J. 1991. Manganese, copper, zinc, iron, cadmium, mercury and lead in muscle
meat, liver and kidneys of poultry, rabbit and sheep slaughtered in the northern part of
Poland, 1987. Food Additives and Contaminants. 8 (1): 71-83.
Falandysz, J. 1993b. Some toxic and essential trace metals in cattle from the northern part
of Poland. The Science of the Total Environment. 136: 177-191.
Falandysz, J.; Kotecka, W.; Kannan, K. 1994. Mercury, lead, cadmium, manganese, copper,
iron and zinc concentrations in poultry, rabbit and sheep from the northern part of Poland.
The Science of the Total Environment. 141: 51-57.
Falandysz, J.; Szymczyk-Kobrzynska, K.; Brzostowski, A.; Zalewski, K.; Zasadowski, A.
2005. Concentrations of heavy metals in the tissues of red deer (Cervus elaphus) from the
region of Warnia and Mazury, Poland. Food Additives and Contaminants. 22(2): 141-149.
127
Friberg, L.; Kjellström, T.; Nordberg, G.; Piscator, M. 1979. Cadmium, en Friberg,L.;
Nordberg, G.F.; Vouk, V.B. (eds). Handbook on the Toxicology of Metals. 1st ed. Ed.
Elsevier/North Holland Biuomedical Press. Pp. 355-381.
Jorhem, L.; Sundström, B.; Astrand, C.; Haegglund, G. 1989. The levels of zinc, copper,
manganese, selenium, chromium, nickel, cobalt, and aluminium in the meat, liver and
kidney of swedish pigs and cattle. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 188: 39-44.
Jorhem, L.; Slorach, S.; Sundström, B.; Ohlin, B. 1991. Lead, cadmium, arsenic and
mercury in meat, liver and kidney of Swedish pigs and cattle in 1984-88. Food Additives
and Contaminants. 8 (2): 201-212.
Jorhem, L.; Sundström, B.; Engman, J.; Astrand-Yates, C.; Olsson, I. 1996. Levels of
certain trace elements in beef and pork imported to Sweden. Food Additives and
Contaminants. 13 (7): 737-745.
Kluge- Berge, S.; Skjerve, E.; Sivertsen, T.; Godal, A. 1992. Lead, cadmium, mercury and
arsenic in Norwegian cattle and pigs. 3rd World Congress, Foodborne Infections and
Intoxications. Berlín, pp. 745-748.
Langlands, J.P.; Donald, G.E.; Smith, A.J. 1987. Analysis of data collected in a residue
survey: copper and zin concentrations in liver, kidney and muscle in Australian sheep and
cattle. Aust. J. Exp. Agric. 1987. 27: 485-491.
Langlands, J.P.; Donald, G.E.; Bowles, J.E. 1988. Cadmium concentrations in liver, kidney
and muscle in Australian sheep and cattle. Australian Journal of Experimental Agriculture.
28: 291-297.
López Alonso, M.; Benedito, J.L.; Miranda, M.; Castillo, C.; Hernández, J.; Shore, R.F.
2000b. Toxic and trace elements in liver, kidney and meat from cattle slaughtered in
Galicia (NW Spain). Food Additives and Contaminants. 17(6): 447-457.
López Alonso, M.; Prieto Montaña, F.; Miranda, M.; Castillo, C.; Hernández, J.; Benedito,
J.L. 2004. Interactions between toxic (As, Cd, Hg, and Pb) and nutritional essential (Ca,
199
Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Zn) elements in the tissues of cattle fron NW Spain.
Biometals. 17: 389-397.
Morcombe, P.W.; Petterson, D.S.; Masters, G.H.; Ross, P.J.; Edwards, J.R. 1994. Cadmium
concentrations in kidneys of sheep and cattle in Western Australia. I. Regional Distribution.
Aust. J. Agric. Res. 45: 851-862.
Niemi, A.; Venäläinen, EJ.; Hirvi, T.; Hirn, J; Karppanen, E. 1991. The lead, cadmium and
mercury concentrations in muscle, liver and kidney fron Finnish pigs and cattle during
1987-1988. Z. Lebensm. Unter. Forsch. 192: 427-429.
Prankel, S.H.; Nixon, R.M.; Phillips, C.J.C. 2005. Implications for the human food chain of
models of cadmium accumulation in sheep. Environmental Research. 97: 348-358.
Salisbury, C.D.C.; Chan, W.; Saschenbrecker, P. 1991. Multielement concentrations in liver
and kidney tissues from five species of Canadian slaughter animals. J. Assoc. Off. Anal.
Chem. 74 (4): 587-591.
UE. 2001. Commission Regulation No 466/2001 of 8 March 2001 setting maximum levels
for certain contaminants in foodstuffs. Official Journal of the European Communities.
Vaessen, H.A.M.G.; Ellen, G. 1985. Arsenic, cadmium, mercury, lead and selenium in
slaugther-animals. A survey of 10 years of investigation in The Netherlands (in Dutch).
Netherlands Journal of Nutrition. 46: 286-288.
Vos, G.; Hovens, J.P.C.; Delft, W.V. 1987. Arsenic, cadmium, lead and mercury in meat,
livers and kidneys of cattle slaughtered in The Netherlands during 1980-1985. Food
Additives and Contaminants. 4 (1): 73-88.
Vos, G.; Lammers, H.; van Delft, W. 1988. Arsenic, cadmium, lead and mercury in meat,
livers and kidneys of sheep slaughtered in The Netherlands. Z. Lebensm. Unters. Forsch.
187: 1-7.
Webb, M. 1979. The metallothioneins, en Webb, M. (ed). The chemistry, biochemistry and
biology of cadmium. Topics in environmental health. Vol. 2. ed. Elsevier/North-Holland
Biomedical Press. Pp. 195-266.
200
MANEJO FARMACOLÓGICO DE LA GOTERA ESOFÁGICA OVINA
FARMACOLOGICAL CLOSURE OF THE ESOPHAGEAL GROOVE IN SHEEP.
GONZÁLEZ MONTAÑA JR, LÓPEZ MÉNDEZ S, ALONSO DÍEZ AJ, REJAS LÓPEZ
J, ÁLVAREZ NISTAL R, PRIETO MONTAÑA F.
Dpto. Medicina Veterinaria. Facultad de Veterinaria. Universidad de León.24007. León.
E-mail: [email protected].
RESUMEN
La gotera esofágica o gotera reticular es una estructura anatómica, a modo de canal, que se
halla en el aparato digestivo de los rumiantes. Su funcionamiento supone un mecanismo
primario y prácticamente exclusivo de los lactantes, permitiendo que el calostro y la leche
pasen directamente al abomaso, sin caer en el retículo y rumen. El conocimiento de
diversos factores fisiológicos, así como de las manipulaciones farmacológicas del reflejo de
la gotera reticular, tanto para estimularlo como para inhibirlo, resultan de gran interés en la
administración oral de diversos medicamentos, en el tratamiento de algunas patologías, así
como un mejor aprovechamiento de algunos alimentos.
Para su estimulación hemos aplicado lisina-vasopresina (LVP) i.v. a distintas ovejas y
concentraciones (0,1, 0,08 y 0,06 UI/kg) con el objeto de determinar la dosis mínima eficaz
capaz de estimular el cierre de la gotera esofágica.
Comprobamos su funcionamiento mediante visualización directa por laparoscopia, así
como mediante el incremento de la glucemia tras la administración oral de soluciones
glucosadas. Observamos que a dosis de 0,1 y 0,08 UI/kg se produce el cierre de la gotera
reticular de forma eficaz y el incremento de la glucemia en todas las ovejas, no sucediendo
cuando la concentración era de 0,06 UI/kg. Los efectos secundarios advertidos a dosis altas
de LVP y el pobre efecto a dosis bajas conllevan a que recomendemos su uso a dosis de
0,08 UI/kg.
PALABAS CLAVE: vasopresina, gotera reticular, oveja, glucemia
SUMMARY
The esophageal groove or reticulated groove is an anatomical structure, like channel, which
is situated in the digestive device of the ruminants. His functioning supposes a primary and
practically exclusive mechanism of the nursing ones, allowing that the calostrum and the
milk should happen directly to the abomaso, without falling down in the retículo and
rumen.
Esophageal or reticular groove closure is a useful technique for the oral administration of
drugs and the treatment of some illness. Lysine-vasopressin was injected intravenously to
the sheeps. It was used several concentrations (0.1, 0.08 and 0.06 IU/kg) to find the
minimal effective doses. The reticular groove closure was observed by laparoscopy. It was
administered oral glucose to measure the increase of glycemia.
We found that 0.1 and 0.08 IU/kg caused the groove closure and an increase in glycemia in
all the animals. We propose the use of the lower effective doses (0.08 IU/kg) due to the
secondary effects of vasopressin.
KEY WORDS: lysine-vasopressin, reticular groove, sheep, glycemia
201
INTRODUCCIÓN
La gotera esofágica, tambien llamada surco reticular, es una estructura anatómica, a modo
de canal, que se halla en el aparato digestivo de los rumiantes. Su funcionamiento supone
un mecanismo primario y prácticamente exclusivo de los lactantes, permitiendo que el
calostro y la leche pasen directamente al abomaso, sin caer en el retículo y rumen, evitando
con ello que se produzcan fermentaciones indeseadas. Aunque como hemos indicado es un
mecanismo presente en los animales lactantes, también en la edad adulta es posible
estimular este reflejo mediante la administración de diversas sustancias entre las que se han
citado sulfato, acetato y cloruro de cobre, sulfato de zinc, sulfato de cobalto, soluciones de
sacarosa, clonidina, lactosuero o diversas concentraciones de sulfato sódico o de cloruro
sódico.
Parece ser que las sales de sodio (cloruro, sulfato, bicarbonato, acetato, etc.) son más
eficaces en el ganado vacuno para estimular el cierre de la gotera, mientras que en la oveja
el sulfato de cobre es altamente efectivo (Watson y col, 1944; Riek, 1954). Los resultados
presentados en diversas investigaciones son contradictorios, así la respuesta de los animales
es variada frente a las distintas sustancias ensayadas y a diferentes concentraciones. Así se
ha comprobado que la gotera reticular permaneció abierta en 2 de 6 ovejas a las que se les
aplicó cloruro de sodio al 0,9%. El cierre de la gotera esofágica y paso de un líquido con
contraste desde el esófago distal al orificio retículo-omasal y abomaso se observó en 5 de
10 animales estimulados con sulfato de cobre y en 6 de 10 ovejas que recibieron sulfato de
cobalto.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para el presente ensayo utilizamos 9 ovejas a las que aplicamos lisina-vasopresina (LVP)
([Lys8]-vasopressin Sigma, 250 UI/mg) i.v. a distintas concentraciones (0,1, 0,08 y 0,06
UI/kg) para intentar determinar la dosis mínima eficaz capaz de estimular el cierre de la
gotera esofágica. Elegimos estas dosis por ser las que ocasionalmente se citan en la
bibliografía para l estímulo del reflejo en ovejas y en otras especies.
La comprobación del reflejo se realizó de dos maneras, bien directamente mediante
visualización directa del esfínter cardial del surco reticular o indirectamente mediante el
rápido incremento de la glucemia.
Para comprobar de forma directa su funcionamiento y para aproximarnos a la dosis
efectiva, hemos empleado la laparoscopia visualizando el cierre del esfínter cardial de la
gotera esofágica previa ruminotomía en la fosa paralumbar izquierda en 3 de esos animales,
al mismo tiempo que se administraba oralmente una solución acuosa coloreada con azul de
metileno.
Para determinar el posible incremento de la glucemia tras el cierre de la gotera esofágica
administramos LVP a diferentes dosis (0,1 UI/kg en 2 ovejas, 0,08 UI/kg en 5 ovejas y 0,06
UI/kg en las 2 ovejas restantes). Inmediatamente tras la aplicación de la LVP
administramos una solución glucosada vía oral (1000 ml) mediante sonda introducida en el
tramo inicial del esófago. Realizamos la experiencia 7 veces en cada oveja, con
extracciones sanguíneas a los 15 minutos postratamiento para valorar la glucemia, que se
midió mediante un autoanalizador Hitachi 704.
202
Mediante visualización directa comprobamos que la administración i.v. de LVP a dosis de
0,1 UI/kg P. V., provoca el cierre de la gotera esofágica, estimula el cierre del esfínter
cardial, y con ello solamente una pequeña cantidad de la solución coloreada cae hacia
rumen discurriendo, por tanto, el resto hacia abomaso. Al administrar la LVP a la dosis de
0,08 UI/kg P. V. se produjo la estimulación de la gotera esofágica de manera similar a lo
descrito anteriormente. Con una dosis menor de LVP (0,06 UI/kg P. V.) observamos que la
mayoría del agua coloreada cae al rumen, lo que nos induce a pensar que la gotera
esofágica no se cierra completamente.
En la segunda parte de la experiencia comprobamos que en las dos ovejas a las que se
administró la LVP i.v. a dosis de 0,1 UI/kg, seguida del aporte de una solución glucosada
vía oral, se produjo un importante incremento de la glucemia en todos los ensayos. A los 15
minutos postadministración la glucemia asciende desde valores iniciales entre 25 mg/dl y
62,5 mg/dl hasta valores de 72,1 mg/dl y 187,5 mg/dl. Cuando la dosis de LVP fue de 0,08
UI/kg P. V. la glucemia aumentó en todos los animales desde 42,6 y 68,8 mg/dl a 54,3 y
158,9 mg/dl a los 15 minutos postratamiento. Sin embargo la aplicación de 0,06 UI/kg P. V.
de LVP o no provocó un incremento de la glucemia o éste fue mínimo.
Con dosis de LVP de 0,1 UI/kg P. V. hemos observado ligeras reacciones adversas en el
animal como inquietud, temblores, taquipnea y adopción reiterada de posturas de micción y
flatulencia. Estos síntomas no aparecieron o lo hicieron muy levemente con 0,08 UI/kg de
LVP. No se percibieron con dosis menores.
Estas reacciones adversas encontradas están justificadas por el efecto que la lisinavasopresina ejerce sobre la musculatura lisa y por las alteraciones del tono vagal y
simpático, dando lugar a vasoconstricción, a disminución del flujo sanguíneo, así como a
bradicardia y taquipnea (Gross, 1988).
El rápido incremento en la glucemia en las ovejas a las que se les administró la LVP a dosis
de 0,08 y 0,1 UI/kg P. V. sólo puede ser atribuido al cierre de la gotera esofágica. Ello
permite que la solución glucosada llegue directamente hasta abomaso, desde donde se
absorbe rápidamente. Sin duda se ha debido a la acción de la lisina-vasopresina al estimular
la musculatura de la gotera esofágica (Mikhail, 1986; Rehage, 1986; Ruckebusch y col,
1991). Una evolución similar ha sido comprobada por diversos investigadores al utilizar
protocolos similares para el tratamiento de la cetosis bovina (Rehage 1986; Scholz y
Rehage, 1987) y también en la gestosis ovina (El-Hamamsy y col, 1990).
La no variación de la glucemia o las ligeras variaciones observadas cuando la LVP se
aplicó a dosis de 0,06 UI/kg P. V. pueden ser debidas a que parte de la solución glucosada
cae hacia rumen, donde es fermentada, sin llegar a abomaso debido al cierre incompleto de
la gotera esofágica.
203
200. 0
200.0
150. 0
150.0
100. 0
100.0
50. 0
50.0
0. 0
0
+15 mi n
LVP 0 , 0 6 U I / k g P . V.
0.0
0
LVP 0,08 UI/kg P.V.
+ 15 min
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
0
LVP 0,1 UI/kg p.V.
+ 15 min
Las figuras muestran la variación en la glucemia observada en los diferentes muestreos
realizados en algunas de las ovejas con las diferentes dosis de LVP.
CONCLUSIONES
Tras los efectos adversos observados a dosis altas de LVP y el cierre incompleto de la
gotera a la menor concentración utilizada recomendamos el empleo de LVP a dosis de 0,08
UI/kg P. V. ya que los efectos secundarios son mínimos y se produce la estimulación de la
gotera esofágica de forma eficaz.
EL-HAMAMSY HT; EL-NEWEEHY TK; ABDOU OM; KUBESY AA. 1990. Clinical
significance of oesophageal groove vasopressin induced closure. II. A new concept in the
oral glucose treatment of pregnancy toxaemia in ewes. Veterinary Medical Journal Giza,
38 (3): 373-384.
GROSS DR. 1988. Fármacos que afectan al equilibrio acuoso y electrolítico. En: Booth,
N.H.; McDonald, L.E. Farmacología y terapéutica veterinaria. Acribia. Zaragoza (España):
559- 566.
MIKHAIL M. 1986. Untersuchung uber die wirksamkeit von vasopressin auf die
schundrinnen kontraktion beim erwachsenen Rind und deren Nutzuna bei Behandlung an
Durchfall erkrankter Rinder. Hannover Tierarztl. Hochsch. Diss.
204
REHAGE J. 1986. Untersuchungen zur Wirksamkeit oraler Glucosegaben nach Auslosung
der Magenrinnenkontraktion in der Ketose-Therapie von Milchkuhen. Hannover Tierarztl.
Hochsch. Thesis, 163 pp.
RUCKEBUSCH Y; PHANEUF LP; DUNLOP R. 1991. Physiology of small and large
animals. Ed. Decker. Ontario (Canadá): 576 pp.
SCHOLZ
H;
REHAGE
J.
1987.
Untersuchungen
zur
Nutzung
der
Schlundrinnenkontraktion in der Behandlung interner Erkrankungen des erwachsenen
Rindes. 4. Behandlung primarer Ketosen. Tierarztliche Umschau, 42 (8): 606-612.
205
CIRCULATING TOTAL AND FREE IODOTHYRONINES LEVELS OF SHEEP
(OVIS ARIES): DIFFERENTIATED EFFECTS OF RESTRAINT AND SHEARING
AND PREVIOUS EXPOSURE TO SHEARING
MEDICA P., FAZIO E., CRAVANA C., ARONICA V., FERLAZZO A.
Department of Morphology, Biochemistry, Physiology and Animal Productions, Unit of
Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Messina.
KEY WORDS: total and free iodothyronines, sheep, restraint, shearing
SUMMARY
Aim of the study was to contribute to the characterization of mechanisms involved in
thyroidal response to physical and psychological stress of sheep. Circulating T3, T4, fT3 and
fT4 levels of No. 40 Pinzirita sheep (No. 20 male and No. 20 female subjects) were
evaluated in basal conditions, after restraint and after shearing, by taking into account the
influence of the previous exposure to shearing. In according to previous experience, the
subjects were divided in two groups, respectively Group A (No. 20 sheep, aged 1-2 years,
no previously exposed to shearing) and Group B (No. 20 sheep, aged elder than 2 years,
previously exposed to shearing). Significative effects of both restraint and shearing stresses
were recorded on total and free iodothyronines modifications of sheep in Groups A and B.
As compared to basal values, sheep no previously exposed to shearing showed T3, T4, fT3
decreases and unmodified fT4 levels after restraint and increases after shearing. Sheep
previously exposed to shearing showed T3 and fT3 decreases after restraint and increases
after shearing, and T4 and fT4 increases after both restraint and shearing. The lowest T3
levels in basal conditions and after shearing and the highest fT3 levels in basal conditions
were also recorded in sheep previously exposed to annual shearing. Female subjects
showed higher total and free iodothyronines levels than male subjects. Changes in
thyroidal hormones could then be used as a measure of the stress associated with
management practices.
INTRODUCTION
A variety of handling procedures are undertaken during the management of domestic
sheep. Many of these procedures are promoted by physical facilities, human handler,
climate and the social and economic environment. Treatments are undertaken either to
attain production goals (e.g. shearing, tail docking, weaning and classing) and for reasons
of health maintenance (e.g. vaccination, dipping and drenching, marking) (Hargreaves and
Hutson, 1997). The effect of handling experience may depend on the age at which
handling occurs, and it may be possible to exploit the sensitivity of sheep to learning at
certain ages. Habituating sheep to handling routines, familiarizing them with yard
configurations and training leader sheep at critical learning periods may improve later
handling (Hargreaves and Hutson, 1997). Habituation may also lead to improvements in
sheep handling. The physiological stress response to handling may decline over several
exposures (Hargreaves and Huston, 1990; Fordham et al., 1989), although this is often
slight and may depend on the nature and severity of the procedure (Jephcott et al., 1986).
Since the shearing induces variations of plasma cortisol, β-endorphin, T3 and T4 (Mears
and Brown, 1997; Mears et al., 1999), ACTH and cortisol (Medica et al., 2005), PRL and
206
haematological parameters (Carcangiu et al., 2001), aim of the study was to contribute to
the characterization of mechanisms involved in thyroidal response (total and free
iodothyronines) to physical and psychological stress of sheep exposed to restraint and
shearing, by taking into account the influence of previous exposure to shearing.
The study was carried out on a total of No. 40 Pinzirita sheep, No. 20 male subjects and
No. 20 female subjects, submitted to shearing procedure (isolation, restraint, shearing). In
according to previous experience the subjects were divided in two groups, respectively
Group A (No. 20 sheep, aged 1-2 years, no previously exposed to shearing) and Group B
(No. 20 sheep, aged elder than 2 years, previously exposed to shearing procedures). Blood
samples were collected by jugular vein at 05.00 p.m., in basal conditions, before the
shearing management, and the day after, at 08.00 a.m., after restraint and at the end of
shearing.
Serum total and free iodothyronines concentrations (T3, T4, fT3, fT4) were determined in
duplicate by immunoenzymatic assays supplied by RADIM. Statistical analysis by one-way
repeated measures analysis of variance (ANOVA) was applied. Significant differences
between basal conditions, after restraint and after shearing, and between Group A and B
were assessed using the Student’s paired t-test. The level of significance was set at <.05.
All calculations were performed using the PRISM package (GraphPad Software Inc., San
Diego, CA).
RESULTS
Data obtained are presented as mean ± standard deviation (S.D.) in Table 1.
Restraint effects (p< .01) in Group A and both restraint (p< .01) and shearing effects (p<
.05) in Group B were obtained for T3 modifications. As compared to basal values, Group A
and B showed decreases of T3 (p< .01) after restraint and increases, significative only for
Group B (p< .001), after shearing. As compared to restraint values, increases were
obtained after shearing both in Group A (p< .01) and Group B (p< .001).
Shearing effects (p< .01) in Group A and restraint (p< .05) and shearing effects (p< .01) in
Group B were obtained for T4 modifications. As compared to basal values, Group B
showed an increase of T4 (p< .05) after restraint; increases after shearing of Group A (p<
.01) and Group B (p< .001) were shown. As compared to restraint values, increases were
obtained after shearing both in Group A (p< .001) and in Group B (p< .05).
Restraint (p< .05) and shearing (p< .01) effects in Group A and only shearing effect (p<
.01) in Group B were obtained for fT3 modifications. As compared to basal values, Group
A and B showed increases of fT3 (p< .001) after shearing. As compared to restraint values,
increases were obtained also after shearing both in Group A and in Group B (p< .001).
Shearing effects (p< .01) in Group A and Group B were obtained for fT4 modifications. As
compared to basal values, Group A (p< .01) and B (p< .001) showed increases of fT4 after
shearing. As compared to restraint values, increases were obtained after shearing both in
Group A (p< .01) and in Group B (p< .001).
Sheep previously exposed to shearing practice showed the lowest T3 levels both in basal
conditions and after shearing (p< .05).
207
Data obtained showed higher total and free iodothyronines levels in female than in male
subjects.
DISCUSSION AND CONCLUSIONS
Data obtained showed that T3 concentrations were affected by restraint and shearing
practices, T4 by restraint and only partially by shearing, fT3 and fT4 by shearing.
The suppressed T3 and fT3 increase after restraint in sheep, such as induced by
confinement and weaning in lambs (Medica et al., 2000), and by food deprivation only for
T3 in stressed sheep (Wronska-Fortuna et al., 1993), could be interpreted as a reduction in
perceived stimulus severity. In contrast, the increases of T3 and fT3 after shearing showed
that this practice was more stressful than restraint. Moreover the highest fT3 levels in basal
conditions in sheep previously exposed to shearing showed a preferential utilization of free
respect to total iodothyronines.
However, although an increase of T4 was described after restraint only in sheep previously
exposed to shearing, these increases were more significative after shearing than after
restraint both in Group A and in Group B. Moreover, previous studies showed that T4 and
T3 concentrations were not affected by tail docking, castration, weaning, isolation and
restraint in lambs (Mears and Brown, 1997).
Also fT4 increases after shearing showed that this practice was more stressful than
restraint. The increases of total and free iodothyronines levels were probably due also to
thermal stress associated with shearing practice both in Group A and in Group B.
The magnitude of total and free iodothyronines changes following restraint and shearing
practices suggests that restraint was a moderate stressor in sheep while shearing was a
severe stressor. Moreover, the lowest T3 levels in basal condition and after shearing in
Group B showed that the previous exposure to this practice could induce an habituation to
the stimulus probably, inducing the suppressed increase of T3 levels.
REFERENCES
Carcangiu V. et al., Atti S.O.F.I.Vet. (2001), 4, 31-33
Fordham D.P. et al., Anim. Prod. (1989), 49, 103-107
Hargreaves A.L. and G.D. Huston, Appl. Anim. Behav. Sci. (1990), 26, 253-265
Hargreaves A.L. and G.D. Huston, Livestock Prod. Sci. (1997), 49, 121-138
Jephcott E.H. et al., Res. Vet. Sci. (1987), 43, 97-100
Medica P. et al., Proc. 8th Internat. Congr. Fe.Me.S.P.Rum. (2000), 105-109
Mears G. J. and F.A. Brown, Can. J. Anim. (1997), 77, 689-694
Mears G.J. et al., Can. J. Anim. Sci. (1999), 79, 35-38
Wronska-Fortuna D. et al., Pharmacol. Biochem. Behav. (1993), 45, 601-606.
208
Table 1 - Mean serum (M ± S.D.) levels of T3, T4, fT3 and fT4 in sheep before and after
exposure to restraint
and shearing
SHEEP
Serum levels
Basal
After restraint
ANOVA
After shearing
ANOVA
Basal
After restraint
ANOVA
After shearing
ANOVA
Basal
After restraint
ANOVA
After shearing
ANOVA
Basal
After restraint
ANOVA
After shearing
ANOVA
NO PREVIOUSLY
EXPOSED
Group A (No. 20)
T3 (nmol/l)
4.40 ± 1.34
3.47 ± 1.31b
F=12.72 p<.01
4.93 ± 1.38B
F=1.59 n.s.
T4 (nmol/l)
144.97 ± 53.81
140.33 ± 44.89
F=0.66 n.s.
199.339 ± 56.52bC
F=13.53 p<.01
fT3 (pmol/l)
3.88 ± 1.72
3.25 ± 1.34
F=3.77 p<.05
8.47 ±3.47cC
F=87.05 p<.01
fT4 (pmol/l)
1.48 ± 0.63
1.49 ± 0.56
F=0.20 n.s.
2.06 ± 0.69bB
F=12.99 p<.01
PREVIOUSLY
EXPOSED
Group B (No. 20)
3.41 ± 1.15α
2.71 ± 1.18b
F=14.33 p<.01
4.01 ± 1.29aCα
F=5.00 p<.05
136.81 ± 34.62
154.18 ± 40.71a
F=5.74 p<.05
209.56 ± 56.58cA
F=43.40 p<.01
4.98 ± 2.30α
4.29 ± 2.44
F=3.15 n.s.
10.15 ± 4.56cC
F=53.33 p<.01
1.52 ± 0.53
1.55 ± 0.45
F=0.23 n.s.
2.14 ± 0.60cC
F=52.54 p<.01
In parenthesis the number of subjects
vs basal values: a= p< .05; b= p< .01; c=p< .001
vs restraint: A= p< .05; B= p< .01; C= p< .001
vs Group A: α=p< .05
209
DISMIELINIZZAZIONE SPINALE DEL BOVINO (SDM). SU DI UN CASO IN UN
VITELLO DI RAZZA BRUNA
TESTONI S., GENTILE A.*
Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Padova, Italia
*Dipartimento Clinico Veterinario, sezione di Medicina Interna, Bologna, Italia
RIASSUNTO
Gli autori descrivono gli aspetti clinici, diagnostico-collaterali ed isto-patologici di
un caso di Dismielinizzazione Spinale Bovina (SDM) in un vitello di razza Bruna italiana,
di cinque giorni di etá, sottoposto alla nostra attenzione a causa di una grave forma di
tetraparesi congenita.
Alla visita clinica, nonostante lo stato sensoriale normale e l’appetito conservato,
erano presenti decubito laterale, incapacità ad alzarsi e mantenere la stazione quadrupedale,
tetraparesi, iperestensione degli arti posteriori, leggero opistotono, riflesso flessorio
aumentato. Gli esami emato-biochimici routinari, le indagini radiografiche della colonna
vertebrale e la mielografia non evidenziavano nulla di anomalo.
Dallo studio del certificato genealogico emergeva la presenza di soggetti giá conosciuti
portatori di SDM, sia in linea materna che paterna.
L’esame istologico del midollo spinale, determinante per la diagnosi definitiva, mostrava
una grave forma di ipomielinizzazione bilaterale simmetrica del fascicolo Gracile, del tratto
Spinocerebellare e del tratto Solcomarginale.
Sulla base della visita clinica, del certificato genealogico e dell’esame istologico
del midollo spinale era emessa diagnosi di Dismielinizzazione Spinale.
PAROLE CHIAVE: Dismielinizzazione Spinale, razza Bruna, malattie genetiche
SUMMARY
The authors describe the clinical, diagnostic-collateral and histo-phatologic
findings of a case of Bovine Spinal Dysmyelination (SDM) in a five-day old Brown calves
submitted due to congenital tetraparesis.
The calf was alert and showed physiological appetite. The animal was lying in
lateral position and was unable to stand up or support itself; furthermore there were
extension of the limbs and opisthotonos. The calf responded by kicking on pressuring the
interdigital skin.
Haematological and biochemical parameters, radiographies of the vertebral
column and mielography were normal.
Pedigree information showed ancestors carrier of SDM.
Histological examination of the spinal cord revealed a severe bilateral symmetric
hypomyelination at the level of the Gracile funiculus, Spinocerebellar tract and
Sulcomarginal tract.
Clinical examination, pedigree information but especially the histological
examination supported the clinical suspect of Bovine Spinal Dysmyelination.
KEY WORDS: Spinal Dysmyelination, Brown breed, hereditary diseases
210
INTRODUZIONE
Nella collezione delle malattie genetiche che negli ultimi decenni hanno
preoccupato il mondo allevatoriale della razza Bruna, posizione dominante è stata assegnata
alla Mieloencefalopatia Progressiva Degenerativa Bovina (BPDME o sindrome Weaver) ed
alla Atrofia Muscolo Spinale (SMA), alle quali, in termini piú contenuti, puó essere
aggiunta la c.d. Aracnomelia. Seppure giá descritta, invece, scarsa attenzione è stata
riservata alla Dismielinizzazione Spinale (SDM, Bovine Spynal Dysmyelination), per la
quale, in effetti, si trovano rare segnalazioni in letteratura.
Quanto sopra ha valso anche in Italia, dove accanto a evidenze di sindrome
Weaver (Baldrighi M. et al., 1992), Atrofia Muscolo Spinale (Testoni et al., 2002) ed
Aracnomelia (Testoni e Gentile, 2004), nessuna segnalazione è giunta fino ad oggi in
riferimento alla Dismielinizzazione Spinale.
Quanto sopra motiva questa nota che intende fare menzione proprio di un caso di
SDM recentemente sottoposto alla nostra attenzione, evenienza per la quale dobbiamo dare
merito al rapporto di collaborazione instaurato negli ultimi anni con i veterinari operanti sul
campo.
DESCRIZIONE DEL CASO
Si tratta di un vitello, di razza Bruna Italiana, femmina, di 5 giorni di vita.
Anamnesi. Fin dalla nascita la vitella, nonostante la vivacità e l’appetito conservato non si
era mai alzata, passando la maggior parte del tempo completamente sdraiata, e solo se
aiutata poteva mantenere per alcuni minuti la posizione di decubito sternale. A nulla erano
valsi i rimedi terapeutici a base di specialità polivitaminiche.
Dal certificato genealogico, come vedremo nel dettaglio in seguito, risultava che,
tra gli antenati, erano presenti portatori sia di Atrofia Muscolo Spinale che di
Dismielinizzazione Spinale.
Visita. A dispetto di uno stato del sensorio normale ed un appetito buono, si potevano
notare: stato di nutrizione scadente, decubito laterale permanente, opistotono,
iperestensione degli arti, coda sollevata. Nonostante la scomoda posizione del corpo la
testa, le orecchie e gli occhi venivano mossi in modo del tutto normale dimostrando un
vivace interesse nei confronti dell’ambiente circostante. Il passaggio dal decubito laterale a
quello sternale avveniva solo con un aiuto e questa posizione poteva essere mantenuta per
poco tempo. In decubito sternale, il collo e gli arti non manifestavano nessuno degli
atteggiamenti anomali precedentemente descritti. La stazione quadrupedale non poteva
essere in alcun modo assunta.
La risposta del bipede posteriore al riflesso flessorio era esagerata, estrinsecandosi
in un continuo scalciare; lo stesso atteggiamento compariva anche evocando i riflessi
perianale e pannicolare (nella porzione posteriore del corpo).
A completamento della visita clinica era udibile, all’ascoltazione del torace, un
leggero rinforzo del murmure vescicolare.
Approfondimenti diagnostici. Nulla di significativo ai fini diagnostici emergeva dalle
indagini emato-biochimiche routinarie (esame emocromocitometrico; determinazione di
proteine totali, ALT, AST, ALP, CK, GGT, creatinina, urea) cosí come negativa risultava la
ricerca di anticorpi per Neospora e BVDV.
211
Anche gli esami radiografici, sia in bianco che contrasto, della colonna vertebrale
risultavano nella norma.
Esame dei certificati genealogici. Dallo studio dei certificati genealogici emergeva quanto
segue:
- il nonno materno (A) era portatore sia di SDM che SMA, ed era fratello, per
parte di padre (B), della nonna paterna;
- B, libero da tare genetiche, era però figlio di un toro (C) portatore di SDM;
- C era figlio di un toro (D) anch’esso portatore di SDM.
Il toro D era White Cloud Jason Elengatn. Come vedremo in seguito questo toro
viene considerato il responsabile della diffusione della SDM in Europa (Agerholm and
Anderson, 1995; Nissen et al., 2001).
Diagnosi differenziale. Da quanto sopra il nostro ragionamento differenziale prendeva in
considerazione: malattie infettive (BVDV o Neospora durante la gravidanza), malattie
ereditarie del sistema nervoso (SMA e SDM), miopatie congenite, malformazioni della
colonna vertebrale e/o del midollo spinale (emivertebre, siringo-idromielia) potevano essere
citate nel nostro ragionamento diagnostico differenziale.
Sulla base degli esami eseguiti, peró, potevamo già escludere infezioni da BVDV e
Neospora, nonché patologie compressive o malformative della colonna vertebrale e del
midollo spinale, mentre lo studio dei certificati genealogici sempre più concretizzava il
sospetto di una malattia ereditaria; in particolare una forma di Dismielinizzazione Spinale
o, seppure con minor probabilità, una forma precoce di Atrofia Muscolo Spinale.
ESAME POST MORTEM
Macroscopicamente erano presenti i segni di una polmonite apicale ed un leggero
idrocefalo del ventricolo laterale sinistro.
L’esame PCR per Neospora, eseguito su campioni di encefalo, fegato e cuore, escludeva in
maniera definitiva il possibile ruolo di questo agente biologico.
L’esame istologico evidenziava lesioni in tutti i tratti del midollo spinale: a livello delle
corna ventrali, si osservavano motoneuroni ipercondensati e cellule della microglia. Nel
fascicolo Gracile, nei segmenti dorsale e ventrale del tratto spinocerebellare e nel tratto
solcomarginale erano presenti aree di ipomielinizzazione (colorazione Luxol Fast Blu) con
singole guaine mieliniche dilatate e macrofagi intramurari.
I reperti istologici compatibili con un quadro di SDM confermavano i nostri
sospetti e fugavano qualsiasi dubbio su una forma precoce di Atrofia Muscolo Spinale
(Troyer et al., 1993).
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
La Dismielinizzazione Spinale è stata descritta in Germania (Hafner et al., 1993), e
successivamente in Danimarca (Agerholm et al., 1994) e Svizzera (Stocker et al., 1996), e,
sulla base delle segnalazioni citate, puó essere considerata una malattia ereditaria del
sistema nervoso centrale, a carattere autosomico recessivo, tipica dei bovini di razza
Bruna.
La responsabilità della diffusione della patologia viene attribuita ad un toro
americano utilizzato negli anni ’60, White Cloud Jason’s Elegant -US148551. A tale
proposito non può sfuggire che, ancora una volta, come già visto per l’Atrofia Muscolo
212
Spinale e la sindrome Weaver, un toro di oltreoceano viene incriminato come responsabile
della comparsa di una malattia genetica.
I vitelli ammalati, fin dalla nascita, non si alzano e stanno in decubito laterale; si possono
osservare tremori e debolezza muscolare. Lo stato mentale, l’appetito e le grandi funzioni
organiche sono normali.
Istologicamente le lesioni sono localizzate nella sostanza bianca del midollo spinale: aree
simmetriche e bilaterali di dismielinizzazione nel tratto ascendente del funicolo gracile, nel
tratto ascendente dorsale spinocerebellare e nel tratto discendente solcomarginale, a livello
di intumescenze cervicale e lombare.
Altre malattie possono provocare quadri di ipomielinizzazione, comunque
differenziabili da quelli che si osservano in corso di SDM:
il virus BVD, responsabile oltre che di disturbi di crescita ed aborto
fetale di disturbi neurologici, annovera fra le malformazioni a carico
del sistema nervoso centrale l’ipomielinizzazione (Binkhorst et al.,
1983);
nella razza australiana Murray Grey è stata descritta una forma
ereditaria di ipomielinizzazione; le lesioni a carico della sostanza
bianca sono localizzate nelle aree marginali dei funicoli ventrale e
laterale ma in forma meno grave che nella SDM (Richards and
Edwards, 1986);
altri due difetti ereditari di mielinizzazione sono stati descritti nei vitelli
di razza Limousine (Harper et al., 1990) e Charolais. Nel primo caso si
tratta di lesioni focali di demielinizzazione a carico del cervelletto; nel
secondo caso di placche eosinofiliche formate da oligodendrociti
ipertrofici e guaine mieliniche in alcune regioni dell’encefalo e del
midollo spinale (Blakemore et al., 1974).
Recenti studi localizzano il gene della SDM sul cromosoma 11 (BTA 11) (Nissen
et al., 2001) e tra i geni candidati ha suscitato un particolare interesse EGR4 (early growth
response 4 gene). EGR4 fa parte di un gruppo di geni con funzioni molto simili tra loro e
nell’uomo mutazioni di EGR2 determinano difetti a carico della mielina. Recentemente
però lo stesso autore ha smentito una possibile responsabilità di EGR4 nella SDM (Nissen
et al., 2003) ed altri autori hanno dimostrato che topi deficienti di EGR4 si sviluppavano
normalmente (Tourtellotte et al., 1999).
La strada per l’identificazione genetica è ancora lunga ed al momento non si
dispone neanche di un marker genetico per l´ identificazione dei soggetti portatori; l’unico
modo per individuare animale portatori è attraverso la segnalazione di vitelli ammalati,
motivo per il quale risulta fondamentale la segnalazione di casi clinici.
BIBLIOGRAFIA
Baldrighi M., Scanziani E. e Perotti G. “La mieloencefalopatia progressiva degenerativa
bovina (sindrome weaver) della razza Bruna” Obiettivi e documenti veterinari, 4: 73-75,
1992
Blakemore W. F., Palmer A. C. and Barlow R. M.: “Progressive ataxia of Charolais cattle
associated with disordered myelin”. Acta neuropathol, 29: 127-139, 1974
213
Binkhorst G. J., Tournee D. L. H., Wouda W., Straver P. J. and Vos J. H.: “Neurological
disorders, virus persistence and hypomyelination in calves due to intrauterine infections
with bovine virus diarrhoea virus. I. Clinical symptoms and morphological lesions”. Vet Q,
5: 145-155, 1983
Hafner A., dahme E., Obermaier G., Schmidt P. e Dirksen G. “Spinal dysmyelination in
New-Born Brown Swiss x Braunvieh Calves“ J. Vet. Med. B, 40: 413-422, 1993
Harper P. A. W., Fraser G. C., Boulton J. G. and Brown N. R.: “Multifocal encephalopathy
in Limousin calves”. Austr Vet J, 67: 111-112, 1990
Agerholm J.S., Hafner A., Olsen S. e Dhane E. “Spinal Dysmyelination in Cross-Bred
Brown Swiss Calves“. J. Vet. Med. A, 41: 180-188, 1994
Agerholm J.S. e Anderson O. “Inheritance of Spinal Dysmyelination in Calves”. J. Vet.
Med. A, 42: 9-12, 1995
Nissen P.H., Shukri N.M., Agerholm J.S., Fredholm M. e Bendixen C. “Genetic mapping
of spinal dysmyelination in cross-bred American Brown Swiss cattle to bovine
Chromosome 11”. Mammalian Genome, 12: 180-182, 2001
Nissen P.H., Thomsen B., Offenberg H., Thomsen P.D. e Bendexen C. “Cloning and
characterization of the bovine EGR4 gene and evaluation as candidate gene for bovine
spinal dysmyelination”. Animal Genetics, 34 (2): 124-131, 2003
Richards R. B. and Edwards J. R.: “A progressive spinal myelinopathy in beef cattle”. Vet
Pathol, 23: 35-41, 1986
Stocker H., Pusterla J.B., Lutz H. e Ossent P. “A new hereditary disease in Braunvieh in
Switzerland: Spinal Dysmyelination (SDM) in newborn calves“.
, 1996
Testoni S., Gentile A., Castagnaro M. e Lugli M. “Atrofia Muscolo Spinale del bovino. Su
di un caso in un vitello di razza Bruna”. Obiettivi e Documenti Veterinari, 3: 25-29, 2002
Testoni S. e Gentile A. “Arachnomelia in four Italian Brown calves”. Veterinary Record,
155: 372, 2004
Tourtellotte W.G., Nagarajan R., Auyeung A., Mueller C. e Milbrandt J. “Infertility
associated with incomplete spermatogenic arrest and oligozoospermia in Egr4-deficient
mice“. Development, 126: 5061-71, 1999
Troyer D., Cash W.C., Vestweber J., Hiraga T. e Leipold H.W. “Review of spinal muscular
atrophy (SMA) in Brown Swiss cattle”. J Vet Diagn Invest, 5: 303-306, 1993
214
IMPIEGO DELLA TERMOGRAFIA AD INFRAROSSO QUALE MEZZO PER
LA VALUTAZIONE DELLO STATO DI SALUTE E BENESSERE DEI
RUMINANTI: RISULTATI PRELIMINARI
USE OF INFRARED THERMOGRAPHY FOR EVALUATING HEALTH AND WELFARE
STATUS IN RUMINANTS: PRELIMINARY RESULTS
MORGANTE M.,, GIANESELLA M., CANNIZZO C. *, D’ALTERIO G.,
STELLETTA C.
Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Università degli Studi di Padova, 35020
Legnaro (PD), Italy. Tel. +390498272942 Fax +390498272954, E-mail:
[email protected]
KEY WORDS: Infrared thermography, health, welfare, ruminants
ABSTRACT
Infrared thermography generates images of the superficial body temperature measurements
in real time, is fast, non-invasive and it is considered a good diagnostic tool. The thermal
information detected by the instrument is the expression of tissue metabolism and blood
circulation: an increase or decrease might be linked to a pathological or physiological
variation. The aim of this work was to investigate the potentiality of infrared thermal
camera (ITC) use in same different animals: cows, sheep, goats and wild ruminant.
Different body areas were evaluated by thermography: face, lombar, abdominal, mammary,
vulvar and podalic regions. On ovine and caprine we suppose that the best areas can be
posterior abdomen and vulvar region, because do not need shearing and it is always protect.
For all our study we used a control group in order to reduce environmental effect and to
compare ∆T. On lactating cows, variations in superficial body temperature were observed
according to partorition time distance and time from dry off while in lactating cows, we
could show no negative abdominal local impact (inflammatory process) following
rumenocentesis. The use of thermography warrants further surveys in field conditions and,
with the correction of natural conditions by standardised ones, can get information on
species-specific algorithm.
INTRODUZIONE
Nel campo della biologia e della medicina veterinaria l’applicazione della termografia ad
infrarossi è relativamente recente; finora sono stati condotti studi principalmente nella
clinica del cavallo sportivo (Bowers et al., 2004; Eddy, 2001; Weil, 1998; Turner, 1991;) e
degli animali da reddito (Nikkhah et al., 2005; Berry et al., 2003; Tessier et al., 2003;
Tivey e Benhazi 2002; Scott et al., 2000). Gli studi su animali selvatici sono stati finora
condotti principalmente su animali in stato di cattività (Kastberger G. e Stachl R., 2003),
oppure per il censimento numerico degli esemplari nelle riserve naturali. Il funzionamento
della termocamera si basa sulla rilevazione senza contatto dell’energia termica emessa dagli
oggetti con detector aventi proprietà piroelettriche. Questa energia viene poi convertita
attraverso circuiti integrati in un segnale elettronico che viene in seguito elaborato da
software specifici al fine di produrre immagini digitali e realizzare calcoli analitici della
temperatura attraverso il computer. La visualizzazione delle immagini ad infrarosso,
immagini termiche o radiazioni di calore, viene fatta utilizzando diverse colorazioni in
215
scala per mettere in evidenza i punti caldi, quelli freddi e le differenze di calore esistenti tra
le varie parti della superficie esaminata. Si ottiene così una rappresentazione del gradiente
termico tra zone diverse del corpo e un modello della distribuzione termica dell’oggetto. la
radiazione infrarosso può essere emessa, assorbita, riflessa e trasmessa. Così la
termocamera non rileva soltanto la radiazione dovuta alla temperatura dell’oggetto, come
avviene per un corpo nero reale, ma anche quella che origina dalle zone circostanti e viene
riflessa dall’oggetto stesso. Entrambe queste radiazioni variano anche in base
all’assorbimento atmosferico e il valore della misurazione può essere influenzata anche
dalla temperatura ambientale. Per una rilevazione precisa della temperatura superficiale
dell’oggetto è quindi opportuno considerare tali fenomeni ed è possibile inserendo dei
parametri che permettano di tener conto delle caratteristiche dei vari corpi e delle situazioni
ambientali in cui si opera, in modo da correggere i fattori di disturbo della misurazione
sopra ricordati. Tali parametri sono l’emissività dell’oggetto, la temperatura riflessa, la
temperatura atmosferica, la distanza tra oggetto e termocamera e l’umidità relativa. Le
telecamere ad infrarossi attualmente sul mercato sono in grado di produrre immagini ad
elevatissima risoluzione, tenendo conto delle variabili e dei parametri citati, in tempo reale
e possono individuare anche piccole differenze di temperatura in un ampio range. Ciò
consente di scattare immagini termografiche nitide anche di oggetti molto piccoli, molto
grandi o in movimento. Si possono poi riprendere filmati e salvare fotogrammi, per
eseguire analisi dettagliate e complete di eventi dinamici. Passi in avanti sono stati fatti
anche nei software di supporto; infatti, confrontare visivamente immagini termiche può
essere difficile perchè a volte si tratta di cambiamenti di temperatura minimi, che è
impossibile individuare a occhio nudo; sono state così rese disponibili funzioni che
permettono di analizzare le immagini termografiche mostrando le differenze e consentendo
di elaborare modelli statistici più accurati. Tra i vantaggi dell’utilizzo della termografia c’è
la mancanza di contatto che permette di mantenere lontano l’operatore da eventuali rischi e
la rende una tecnica non invasiva evitando interferenze sull’oggetto, come possibili effetti
meccanici sulla superficie. Il suo impiego riduce inoltre la necessità di manipolazione,
rendendola utile per ricavare informazioni da oggetti difficili da raggiungere, non
avvicinabili o in movimento. La rapidità di cattura dell’immagine nell’ordine dei
millisecondi facilita poi la misurazione in situazioni dinamiche. Scopo del presente lavoro è
fornire un primo screening delle esperienze finora condotte in campo veterinario mediante
l’utilizzo della termocamera ad infrarossi nei ruminanti e proporre alcune possibili nuove
applicazioni illustrandone i vantaggi e le limitazioni.
MATERIALI E METODI
Durante gli anni 2005 e 2006 sono stati effettuate numerose prove per valutare l’utilizzo
pratico della termocamera ad infrarossi per la valutazione dello stato di salute e benessere
dei ruminanti allevati. A tale scopo è stata utilizzata una termocamera utilizzata nelle
esperienze è il modello ThermaCAM P25 della FLIR Systems. Le immagini ad infrarosso
sono state memorizzate dallo strumento in formato JPEG standard su scheda Flash
estraibile da 128 Mb e, tramite collegamento USB o inserimento della scheda di memoria
nella porta del PC, le immagini sono state successivamente trasferite su computer grazie al
software ThermaCAM QuickView e analizzate con il programma ThermaCAM Reporter
216
7.0, basato su Microsoft Word. In particolare la termocamera è stata utilizzata su ruminanti
selvatici, pecore, capre e bovine da latte.
Ruminanti selvatici: L’esperienza sugli animali selvatici è stata condotta in Val di Rhêmes
e a Valsavarenche, in due vallate parallele della Valle d’Aosta, che sono in parte comprese
nel territorio del Parco Nazionale del Gran Paradiso. Sono effettuate numerose riprese
termografiche di stambecchi e camosci a differente distanza. Effettuare le rilevazioni è
risultato talvolta difficile perché non sempre era possibile avvicinarsi a sufficienza a tutti gli
animali selvatici avvistati e inoltre il modello di termocamera a disposizione non è dotato di
zoom. Il periodo in cui sono state condotte le rilevazioni, il mese di maggio, rappresenta il
momento ideale per osservare gli ungulati da vicino in quanto tendono ancora a stare verso
valle per alimentarsi, essendo i pascoli alpini, posti a quote più alte, ancora ricoperti di
neve. Gli avvistamenti di gruppi di camosci sono stati numerosi, ma le rilevazioni
termografiche a breve distanza sono state impossibili, poiché questo animale ha uno spazio
di fuga maggiore rispetto allo stambecco. Le esperienze fatte ci suggeriscono che la
termografia ad infrarosso potrebbe essere utilizzata per il censimento degli animali
selvatici, in condizioni in cui sia difficile distinguerli dall’ambiente circostante,
permettendo di osservare anche animali nascosti tra la vegetazione e non facilmente
individuabili neppure con il binocolo.
Con la termografia inoltre, i censimenti potrebbero essere condotti nelle ore notturne senza
recare disturbo agli animali con l’utilizzo di riflettori utilizzati nei metodi tradizionali.
Molto spesso però le immagini termografiche come quelle ottenute, eseguite da così
lontano e senza l’ausilio di uno zoom, offrono dei risultati che non apportano un vantaggio
sostanziale i rispetto ai metodi tradizionali, infatti non sono in grado di fornire i dettagli che
permettono di distinguere i maschi dalle femmine e le diverse specie. Se lo scopo
dell’indagine termografica è quello di ricavare informazioni riguardanti lo stato clinico
degli animali, in questo tipo di immagine le parti anatomiche sono poco definite e i
gradienti di temperatura corporei non si riconoscono nei particolari. Per questi motivi le
immagini raccolte a distanza elevata con questo strumento non possono fornire ulteriori dati
riguardanti lo stato patologico o le condizioni fisiologiche dell’animale. Un problema della
tecnologia ad infrarosso è che molte specie hanno una pelliccia spessa e che si presenta
diversa tra soggetto e soggetto. Infatti il pelo folto scherma la radiazione infrarosso e ciò
impedisce una misurazione della temperatura superficiale che abbia un significato
attendibile sullo stato termico dell’animale. Tuttavia l’occhio è una parte del corpo che non
presenta questo inconveniente e perciò può rappresentare un mezzo per ottenere
un’accurata misurazione della temperatura corporea una volta stabilito il valore oltre il
quale il soggetto risulta essere ipertermico. Se la termografia si rivelasse sensibile ed
affidabile nel rilevare una patologia tanto da permettere un’identificazione precoce dei
soggetti ammalati, questa tecnologia potrebbe essere un mezzo utilizzabile per il controllo
di alcune malattie trasmissibili ed arrivare ad una riduzione della loro incidenza o
all’eradicazione. Il suo utilizzo sarebbe vantaggioso per diminuire il rischio di diffusione,
per esempio, di forme infettive o infestive nelle popolazioni di selvatici e ridurre la
possibilità di contagio degli animali domestici per il contatto nelle zone di pascolo comuni.
217
Piccoli ruminanti: Sulle pecore sono state eseguite delle prove termografiche per osservare
se la temperatura superficiale di certe regioni del corpo potessero essere correlate ad un
particolare stato fisiologico dell’animale. Ciò permetterebbe una futura applicazione dello
strumento, ad esempio, nella diagnosi a distanza, non invasiva, della gravidanza e anche
nella rilevazione di gestazioni multiple. Le misurazioni termografiche sono state eseguite a
livello della testa, del dorso, della groppa, e del perineo. Le regioni del dorso e della groppa
si sono rilevate non appropriate per questo tipo di indagine. Infatti in queste zone il vello
non era della stessa lunghezza e densità per tutti gli animali e sebbene ci si fosse
preoccupati di separare ed abbassare il pelo, le differenze di temperatura erano
presumibilmente influenzate molto più da questo elemento di disturbo o dalla la modalità di
allargamento del vello per mettere in evidenza la cute che da fattori interni dell’animale
legati al suo stato fisiologico. Sono state effettuate scansioni nelle ragione perineale di
alcune pecore e capre e con il software è stata calcolata la temperatura media di un area
selezionata a livello della vulva. Sarebbe interessante indagare le possibili correlazioni tra
la temperatura a questo livello e la fase del ciclo riproduttivo per verificare la capacità dello
strumento nel rilevare i calori. Infatti lo strumento potrebbe essere utile per mettere in
evidenza i primi segni dell’estro rilevando precocemente un ingrossamento dei tessuti
attorno alla vulva per l’aumentato flusso sanguigno e l’edema. Ciò sarebbe utile per
migliorare le capacità di individuare il momento adatto per l’inseminazione e per valutare la
sincronizzazione degli estri. Tuttavia per questo scopo sarebbe meglio disporre di un
software superiore a quello usato, che, invece di selezionare sull’immagine termografica
un’area rettangolare squadrata, permetta di considerare il profilo reale della regione
anatomica da studiare in modo da ottenere valori della temperatura media relativi solo alla
parte che interessa, tralasciando le zone circostanti che potrebbero alterare i risultati. Sono
state eseguiti termogrammi delle mammelle di alcune pecore. In entrambi i casi alla
palpazione si poteva percepire la presenza di una ciste che dall’esame termografico appare
come una area localizzata più fredda. Rilevare immagini ad infrarosso della regione
mammaria potrebbe essere utile anche per rilevare precocemente uno stato infiammatorio e
le mastiti subcliniche. Le immagini ad infrarosso delle teste potrebbero essere utili per
evidenzare precocemente lesioni localizzate a questo livello come avviene per esempio per
la blue tongue. Inoltre le rilevazioni termografiche potrebbero essere associate a risultati di
studi sperimentali sul comportamento animale per osservare la possibilità di utilizzo di
questo strumento per indagare temi di psicologia animale, come ad esempio la
lateralizzazione cerebrale. Nelle pecore c’è da puntualizzare, in fine che la presenza del
vello impedisce l’effettuazione di termogrammi di alcune regioni senza dover effettuare
precedentemente una adeguata tricotomia.
Vacche da latte: La termografia in questi animali potrebbe essere utilizzata per monitorare
costantemente i processi automatizzati nelle grandi aziende che intendono investire
maggiormente nella tecnologia e sono in grado di ammortizzarne i costi della
strumentazione in breve tempo. In particolare l’installazione di termocamere fisse nei
locali, in determinati punti strategici (come la sala di mungitura, la posta o la mangiatoia),
potrebbe essere utile per un controllo continuo degli animali e dell’ambiente permettendo la
rilevazione precoce di stati patologici o fisiologici particolarmente utili per la gestione
dell’allevamento, garantendo un notevole vantaggio in termini di benessere per l’animale e
anche per l’economia dell’ azienda. Sono già stati citati gli studi riguardanti l’impiego della
218
termografia ad infrarosso per la rilevazione dell’estro (Hurnik et al., 1985), la diagnosi
precoce delle mastiti (Scott et al., 2000; Berry et al., 2003) e delle patologie degli arti
(Nikkhah et al., 2005). Nelle nostre esperienze in proposito lo strumento è stato in grado di
rilevare lesioni localizzate in alcune vacche, una tumefazione a livello del tarso e una
lesione interdigitale sulla superficie soleare del piede. In entrambi i casi si può osservare
come lo strumento rilevi la zona interessata dall’infiammazione per l’aumento di
temperatura localizzato che la caratterizza. La termografia si è rilevata anche molto utile
per valutare le differenze di temperatura superficiale che si evidenziano in relazione a
diversi stimoli ambientali, quali ad esempio somministrazione dell’alimento, variazioni
dello stato emotivo, e delle condizioni climatiche.
CONCLUSIONI
Il preliminare approccio pratico alla termografia ha permesso di individuare ulteriori
possibili applicazioni della tecnologia ad infrarosso nel campo della medicina veterinaria
indicandone i pregi, ma talvolta anche gli attuali limiti e cercando di individuare quali
potrebbero essere le necessità e i percorsi futuri da seguire per ottenere maggiori vantaggi
da questa tecnica diagnostica. I valori di temperatura superficiale misurati in alcune delle
termografie raccolte nelle esperienze sul campo probabilmente non sono reali perché
influenzati da fattori esterni che non sempre è stato possibile controllare (come esposizione
al sole, correnti d’aria, distanza). Nell’analisi termografia di queste immagini è quindi
opportuno tener conto maggiormente delle differenze di temperatura tra le diverse aree
termografate più che del loro valore assoluto. Per eliminare gli elementi di disturbo esterni
durante una rilevazione termografia sarebbe utile valutare il “∆T”, vale a dire la differenza
di temperatura tra due misurazioni dello stesso soggetto, raccolte in due momenti diversi,
per esempio prima e dopo la somministrazione della razione. In questo modo i diversi
valori di ∆T tra gli animali dipenderanno più probabilmente da fattori interni. Per ottenere
risultati affidabili e ripetibili c’è poi la necessità di standardizzare altri parametri che
potrebbero influenzare le misurazioni, come l’età o il sesso del soggetto. Inoltre sarebbe
opportuno studiare le equazioni di regressione per valutare la relazione statistica tra questi
fattori e la temperatura superficiale rilevata dallo strumento e ricavare l’accuratezza a
seconda che la misurazione sia stata eseguita con l’animale in posizione, frontale, laterale o
posteriore nel caso di soggetti liberi. Sempre per ottenere risultati che siano il più possibile
reali sono necessari studi per stabilire dei valori di emissività specifici per ogni specie
animale. Infatti in questo lavoro è stato impostato lo stesso valore (0,93) in tutti i casi,
prendendo il dato riportato in bibliografia per gli studi sugli animali e sul manuale dello
strumento per la cute umana. Tuttavia è presumibile che animali con densità del pelo e
colore del mantello diversi, avendo una superficie con caratteristiche di assorbimento e
riflessione dei raggi incidenti su di essa differenti, non abbiano lo stesso valore di
remissività.
Lo studio è stato finanziato con il contributo del progetto BEN-O-LAT del Ministero delle
Politiche Agricole e Forestali.
*Dottorato di ricerca finanziato dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie.
219
BIBLIOGRAFIA
Berry, Kennedy, Scott, Kyle and Schaefer, 2003. Daily variation in the udder surface
temperature of dairy cows measured by infrared thermography: potential for mastitis
detection. Canadian Journal of Animal Science 83: 687-693.
Bowers, Gandy, Anderson, Ryan and Willard, 2004. Assessment of pregnancy in the mare
using digital infrared Thermography. American Society of Animal Science/American
Society of Dairy Science National Meeting.
Eddie Y-K Ng and NM Sudharsan, 2004. Computer simulation in
conjunction with medical thermography as an adjunct tool for early
detection of breast cancer. http://www.biomedcentral.com/1471-2407/4/17
Hurnik, Webster, and DeBoer, 1985. An investigation of skin temperature differentials in
relation to estrus in dairy cattle using a thermal infrared scanning technique. Journal of
Animal Science 61: 1095-1102.
Kastberger G, Stachl R. Infrared imaging technology and biological applications. Behav
Res Methods Instrum Comput. 2003 Aug;35(3):429-39.
Nikkhah, Plaizier, Einarson, Berry, Scott and Kennedy, 2005. Short communication.
Infrared thermography and visual examination of hooves of dairy cows in two stages of
lactation. Journal of Dairy Science 88: 2749-2753.
Scott, Schaefer, tong and Lacasse, 2000. Use of infrared thermography for early detection
of mastitis in dairy cows. Canadian Journal of Animal Science 80: 764-765.
Scott, Schaefer, tong and Lacasse, 2000. Use of infrared thermography for early detection
of mastitis in dairy cows. Canadian Journal of Animal Science 80: 764-765.
Tessier, Du Tremblay, Klopfenstain, Beauchamp, Baulianne, 2003. Abdominal skin
temperature variation in healthy broiler chickens as determined by thermography. Poult Sci
82: 846-9.
Tivey D., Benhanzy T., 2002. The potential to asses environmental conditions within pig
production system.
Tong, Schaefer, and Jones, 1995. Detection of por quality beef using infrared
thermography. Meat Focus International 4: 443-445.
Turner TA. Thermography as an aid to the clinical lameness evaluation. Vet Clin North Am
Equine Pract. 1991 Aug;7(2):311-38.
Weil M, Litzke LF, Fritsch R. Diagnostic validity of thermography of lameness in horses.
Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere. 1998 Nov;26(6):346-54.
220
OSSERVAZIONI LEGISLATIVE E MEDICO LEGALI SUI DANNI CAGIONATI
DAI RUMINANTI SELVATICI (CERVO) IN SARDEGNA
LEGISLATIVE AND FORENSIC OBSERVATIONS ON THE DAMAGES CAUSED ON
THE WILD SARDINIAN RUMINANTS.
CUBEDDU G. M. , PINNA PARPAGLIA M. L., COCCO.R. , CARTA A*.
Istituto di Clinica Medica Veterinaria-Università di Sassari.
*Tecnico Faunistico.
KEY WORD: deer, damages, laws.
SUMMARY
The authors value with critical ability the problems derivate from the damage caused by
the deer in Sardinia. Particularly they highlight the crescent burden of the Regional
Administration, called at the compensation for damage provoked by the wild fauna (deer) at
the car in transit on the public road; they consider moreover the interpretative and
applicative problems in theme of damages provoked at the agricultural productions and at
work make ready on cultivated and grazed ground provoked by wild fauna, particularly
that protect. For this purpose they take the law’s dictation n.157 (11/02/92) of the Italian
State into account (norms for the wild fauna’s protection), comparing from forensic point of
view the objective problems.
At the end, considering the crescent increase of the compensation request, they take the first
sentence emitted by the judge into account, condemning the regional Administration to pay
the damages at the car’s owner involved in the incident.
They conclude proposing some corrective suggestions useful for the protection of the
species besides a correct interpretation of the law in force.
PREMESSA
Scopo del presente lavoro è quello di valutare le problematiche che evidenziano gli oneri
crescenti per l’amministrazione regionale, chiamata al risarcimento dei danni provocati
dalla fauna selvatica ai veicoli in transito su strade pubbliche. Gli autori considerano inoltre
le difficoltà interpretative delle leggi di settore valutando criticamente le note emanate dalla
stessa Regione Sardegna.
INTRODUZIONE
Il cervo sardo è stato introdotto in Sardegna dall’uomo tra il 1200 e il 700 a.C. e si è in
seguito diffuso su tutto il territorio dell’isola, favorito dalle rigogliose foreste presenti.Le
deforestazioni, gli incendi boschivi, il bracconaggio, la caccia (dal 1939 divieto totale della
caccia al cervo) e l’apertura di nuove strade avevano ridotto drasticamente la presenza del
cervo sardo in tre soli areali distinti e isolati: addirittura alla fine degli anni 60 la
popolazione era talmente ridotta da essere inserita dalla I.U.C.N. (Unione Internazionale
Conservazione della Natura) tra le specie minacciate di estinzione. Attualmente le
popolazioni naturali del cervo sardo si trovano in tre distinte zone della Sardegna
meridionale, senza soluzione di continuità.
Da alcuni decenni, grazie ai progetti di tutela e di reintroduzione iniziati negli anni 70
dall’attuale Ente Foreste, si è assistito a un notevole incremento delle popolazioni naturali.
221
Il cervo sardo ora è presente in circa 6500 esemplari nelle aree del Sulcis, del Sarrabus,
nell’Arburese (Arbus-Montevecchio), negli areali del Monte Lerno (Pattada) e del Monte
Linas (Villacidro). Alcuni esemplari sono stati introdotti qualche anno fa in provincia di
Nuoro nel territorio di Sorgono.
A fronte però dell’aumento della popolazione del cervo negli ultimi anni si stanno
verificando una serie di problematiche legate sia all’incidentistica stradale provocata dal
cervo stesso, sia a danni agli erbai delle aziende zootecniche che confinano con le zone più
popolate dagli stessi cervi. A ben valutare la legislazione in materia non sempre è agevole
offrire la giusta risposta a chi abbia subito danni, diretti o indiretti, ma soprattutto appare
sempre più confuso il quadro relativo alla responsabilità oggettiva di chi dovrà risarcire i
danni stessi.
MATERIALE E METODI
Oggetto del nostro lavoro è un incidente stradale avvenuto circa due anni fa nella zona di
Montevecchio quando, in prossimità di una curva, un grosso cervo sbucato all’improvviso
da un cespuglio si era bloccato in mezzo alla strada e, nonostante il tentativo di frenata del
conducente, l’esemplare finì fatalmente contro l’automobile. L’impatto, mortale per il cervo
provocò la distruzione della parte anteriore dell’auto oltre a danni fisici ai due occupanti la
vettura. I legali del conducente, nella convinzione che i cervi fossero di proprietà della
regione, come tutta la fauna selvatica, chiedevano il risarcimento dei danni alla regione
stessa. I funzionari regionali risposero con un secco “No” giustificando il fatto con la
motivazione che, pur essendo proprietari degli animali, sarebbero impossibilitati a
custodirli e controllarli, essendo fauna selvatica la quale tale non sarebbe se non potesse
vivere, spostarsi e riprodursi liberamente nel proprio ambiente naturale. I legali del
conducente, per niente soddisfatti del mancato risarcimento citarono una sentenza del
giudice conciliatore di Isernia che condannava la Regione Molise a pagare i danni per un
caso analogo.La Regione Sarda è proprietaria dei cervi e come tale deve rispondere dei
danni da essi provocati. Nella fase processuale sono state esibite le testimonianze, la perizia
dei danni dell’auto, la certificazione della ASL della morte dell’animale e la giurisprudenza
precedente. I legali della Regione sostenevano la loro estraneità delegando il caso e la
responsabilità alla provincia. La sentenza finale da parte Giudice di Pace ha stabilito che le
competenze sono esclusivamente della regione Sardegna, e dopo aver accertato che il cervo
aveva praticamente investito l’auto emetteva la sentenza condannando la regione al
risarcimento di € 1572,22 (oltre agli interessi maturati) e di € 1150 per le spese di giudizio.
A seguito della prima sentenza in tal senso,l’assessorato alla difesa dell’ambiente della
regione, trasmetteva una nota della presidenza (area legale) alle province e all’ Ente
Foreste evidenziando l’impossibilità allo stato attuale ad approntare una valida linea
difensiva atta a contrastare le sempre più frequenti pretese risarcitorie. Ciò in quanto la
maggior parte dei danni si riferisce a sinistri stradali provocati da animali selvatici che
attraversano le sedi stradali in punti totalmente privi di recinzioni ai margini delle
carreggiate. Nella nota si richiama altre si l’esigenza di predisporre apposite recinzioni o
qualsiasi altra opera utile ad ostacolare e impedire il transito degli animali selvatici sulle
strade, con particolare riferimento alle zone attigue ad oasi di protezione faunistica, nonché
l’istallazione di apposita segnaletica idonea a destare la massima attenzione da parte degli
automobilisti.
222
Osservazioni Personali: I fatti su esposti ci permettono di fare alcune riflessioni medicolegali e legislative in merito alla osservanza delle norme vigenti, soprattutto rapportate ai
concetti di tutela e protezione dei selvatici in Sardegna, senza per altro dimenticare la
responsabilità extra-contrattuale che potrebbe rivelarsi particolarmente ingente in caso di
esiti mortali per le persone nei sinistri provocati dagli animali stessi. Al riguardo si
evidenzia che recentemente in occasione di una pubblica udienza un Giudice Istruttore del
Tribunale di Sassari ha manifestato agli avvocati della Regione la necessità che la Regione
stessa appronti tutte le misure atte ad evitare il perpetuarsi di detti sinistri. La
giurisprudenza trattata nel libro IV delle obbligazioni definisce l’obbligazione un vincolo
giuridico in conseguenza del quale siamo costretti ad assolvere qualcosa secondo i principi
giuridici del nostro ordinamento. Le obbligazioni derivano anche da fatto illecito o da ogni
altro fatto o atto idoneo a produrle (art. 1973 C.C.). Ancora l’art.2043 dello stesso Codice
dispone che chiunque provochi o con dolo o con colpa un danno ingiusto ad altri sia
obbligato a risarcire il danno. Ancora dal libro delle obbligazioni deriva l’art.2052 (danno
cagionato da animali) secondo il quale:
“il proprietario di un animale o chi se ne serve per il tempo in cui lo ha in uso è
responsabile dei danni cagionati dall’animale, sia che fosse sotto la sua custodia, sia che
fosse smarrito o fuggito,salvo che provi il caso fortuito”.
E’ evidente che quest’ultimo art.2052 sembra riferirsi nella fattispecie ad animali o da
reddito o d’affezione e non in particolare ai selvatici, ma è pur vero che a giudicare il
dettato dell’art.1 comma 2 della legge 21 appare chiaro che la Regione risulti l’unica
proprietaria della fauna selvatica in Sardegna. La stessa legge infatti recita che la regione
detta norme di tutela per gli animali di qualsiasi genere e specie esistenti sull’isola.
Altrettanto chiara appare l’interpretazione relativa alla legge dello stato n. 157 la quale
afferma senza ombra di dubbio che la fauna selvatica è patrimonio indisponibile dello stato.
Ne discende che per la Sardegna, Regione a statuto speciale la norma sia totalmente
sovrapponibile. Oltretutto la legge regionale n.23 del 29/07/1998 dal titolo: norme per la
protezione della fauna selvatica e per l’esercizio della caccia in Sardegna, all’articolo 3
comma 1 dichiara che la fauna selvatica costituisce bene ambientale della regione ed è
tutelata, insieme al suo habitat naturale, nell’interesse generale della comunità regionale,
nazionale ed internazionale. Ancora all’articolo 12 la suddetta legge affida alle province
compiti di pianificazione, di tutela dell’ambiente e della fauna selvatica. Tra gli altri
compiti le province provvedono a predisporre la proposta del piano provinciale faunisticovenatorio, a favorire la riproduzione naturale della fauna selvatica, ad accertare gli
eventuali danni alle colture provocati dalla fauna selvatica stessa.Di difficile interpretazione
appare la lettura dell’articolo 59 della suddetta legge, dove si tratta del risarcimento dei
danni arrecati alla produzione agricola e zootecnica, alle coltivazioni e ai pascoli dalla
fauna selvatica. Il comma 2 del suddetto articolo pone in carico alla Regione il risarcimento
dei danni provocati nelle oasi permanenti di protezione faunistica e di cattura, nelle zone
temporanee di ripopolamento e cattura. Al comma 4 infine il regolamento di attuazione
disciplina le modalità per l’erogazione dei risarcimenti, tenuto conto delle priorità, dei
parametri e dei criteri individuati dal piano faunistico-venatrio Regionale. La legge 157
Italiana dell’11/02/1992 (norme per la protezione della fauna selvatica omeoterma e per il
223
prelievo venatorio, all’articolo 1 recita chiaramente che la fauna selvatica è patrimonio
indisponibile dello Stato ed è tutelata nell’interesse della comunità Nazionale ed
Internazionale. La stessa legge all’art.26 tratta del risarcimento dei danni prodotti dalla
fauna selvatica e demanda alle regioni la costituzione di un fondo destinato alla
prevenzione e ai risarcimenti. Come si evince da quanto su esposto, nessuna delle leggi
nazionali o regionali tratta nello specifico del risarcimento dei danni arrecati ad autovetture
e/o persone.E’ evidente a tutti come sempre con maggiore frequenza si verifichino incidenti
che interessano la fauna selvatica in Sardegna. In tale contesto inoltre si pone con
particolare attenzione il diffondersi sempre maggiore dell’interesse del pubblico e delle
istituzioni nei confronti della fauna selvatica.Queste riflessioni, unicamente allo scopo di
evidenziare l’attualità dell’argomento e la necessità che non si incorra in cattiva
impostazione nella risoluzione di quesiti sempre più attuali. La responsabilità civile da cui
deriva l’obbligazione a riparare il danno consegue ad atti dolosi o colposi che arrechino
danni ingiusti a carattere patrimoniale e viene a gravare su coloro i quali “direttamente o
indirettamente” li hanno causati. La responsabilità civile ha due tratti essenziali che la
caratterizzano: da una parte l’esistenza di un danno, dall’altra il carattere forzato ed
involontario dell’obbligazione a riparare il danno stesso. Dunque qualunque fatto doloso o
colposo che cagiona ad altri un danno ingiusto, obbliga colui il quale lo ha commesso a
risarcire il danno stesso (art. 2043 del C.C.). La responsabilità civile comporta quindi il
risarcimento del danno economico subito dal terzo per colpa dell’autore. Nel caso in
oggetto, a norma del art. 2052 del C.C. il proprietario di un animale o chi se ne serve per il
tempo che lo ha in uso è responsabile dei danni cagionati dall’animale, sia che si trovi sotto
la sua gestione, sia che si trovi sotto la sua custodia, ovvero che si sia smarrito o fuggito.
Orbene, da tutto ciò deriva la conseguenza del risarcimento legato a disposizioni ben
precise. Sembra inequivocabile, dalla lettura delle normative succitate, che la regione in
questo caso sia l’unica proprietaria degli animali e quindi responsabile dei danni. Di grande
negligenza sembra inoltre la risposta dei funzionari della regione, nel momento in cui
affermano di essere impossibilitati alla custodia ed al controllo dei cervi, in quanto fauna
selvatica. Quantomeno discutibile appare il tentativo, da parte dei legali della regione, di
voler delegare la responsabilità alla provincia. Infatti così facendo, si vuole creare solo
grande confusione nell’interpretazione delle norme, che peraltro sono chiarissime. Sono,
entrambi gli esempi, un chiaro caso di inadempimento delle obbligazioni.Inadempimento
che si può intravedere anche nella scarsa informazione, da parte degli organismi
competenti, sulla possibilità di risarcimento agli agricoltori che abbiano subito danni da
parte di animali della fauna selvatica ( rare sono a tutt’oggi le richieste in tal senso ).
CONCLUSIONI:
Per favorire una più corretta applicazione delle leggi in tema di fauna selvatica si
propongono alcuni suggerimenti utili a prevenire le problematiche in oggetto. Innanzitutto
un lavoro sinergico di regione e province per recintare con materiale idoneo gli areali
occupati dai cervi, tali da mantenere il loro habitat naturale, rispettando peraltro quei
concetti di tutela del benessere degli animali previsti dalle normative vigenti, oltre a
prevenire gli incidenti. L’adeguamento della segnaletica stradale può favorire, al momento,
una maggiore prudenza da parte degli automobilisti, oltre ad una diversa possibilità di
valutazione della responsabilità, di fronte a segnali che, pur indicando il pericolo di
224
attraversamento di animali selvatici, non vengono adeguatamente rispettati: in questo modo
si potrebbe individuare un concorso di responsabilità, con dimezzamento delle spese per
l’istituzione regionale.Si auspica infine che sia la regione che le organizzazioni di categoria
intervengano con maggiore informazione nei confronti degli agricoltori che abbiano subito
danni alle colture, i quali, molto spesso, non rivolgono le dovute richieste di risarcimento
per la non conoscenza delle norme. Solo con il rispetto di queste misure, peraltro di non
difficile applicazione, si favorisce un corretto rapporto uomo-animale-ambiente, oltre a
prevenire molti dei danni sempre più numerosi ed incidenti che potrebbero avere
conseguenze anche più drammatiche.
BIBLIOGRAFIA
Canuto e Tovo, Medicina Legale, 1970; Censimento del cervo sardo-R.A.S- Ente Foreste,
2005; Codice Civile, art. 1973,2043,2052; Cubeddu G.M.; Pintori G.; BassuG.;
ManincheddaG.- Differenti valutazioni sul danno e risarcimento in ovini di razza sarda-Atti
VIII Congresso SIPAOC-1988; Gasparini U-Appunti di Medicina Legale VeterinariaEd.Esculapio,1983; Legge 11/02/1992-suppl ord. G.U. n. 46 del 25/02/92; Legge n. 623 del
14/10/85 suppl. ord. G.U. n. 266 del 12/11/85; L. R. N. 21 del 18/05/94, B.U.R.A.S.; L.R.
N. 23 del 29/07/98, B.U.R.A.S; Nota Pres. R.A.S. Prot. L 5461 del 25/10/2005.
225
THE CLINICAL EFFICIENCY OF MINERASOL® ON CATTLES, WHICH IS A
NEW TRACE ELEMENT COMBINATION*
MEHMET ERMAN OR1, ABDULLAH KAYAR1, REMZĐ GÖNÜL1, BANU
DOKUZEYLÜL1, ALĐ RIZA KIZILER2, BĐRSEN AYDEMĐR2, ABDULLAH AKSU3,
ÇAĞLA PARKAN1, TAMERCAN MORKOÇ4, BORA BARUTÇU2
1
Istanbul University, Veterinary Faculty, Department of Internal Medicine, 34320 AvcilarIstanbul/TURKEY
2
Istanbul University, Cerrahpaşa Medicine Faculty, Department of Biophysics,
Cerrahpaşa-Istanbul/TURKEY
3
Chemical Oceanography, University of Đstanbul, Enstitute of Marine Science and
Management Vefa-Istanbul/TURKEY
4
Interhas Limited Company, Ankara/TURKEY.
* The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University.
Project No. UDP-776/07062006”
SUMMARY
Cattle breeding has an important place in the country economy. Cattle, milk, meat
and skin of which we benefit from have an industrial importance in terms of breeding in our
country. Diseases caused by micro and macro elements are of great importance. Very
significant signs like debility, lack of appetite, decrease in efficiency, anemia, diarrhea,
fertility disorders are seen in animals. In the study, it is aimed to determine the effect of the
clinical use of Minerasol® which is a new mineral combination on some element levels
(Fe, Cu, Zn, Mg, Ca). Approximately 10 ml of blood with and without anticoagulant was
drawn from 25 cattle in the faculty farm and both the hemogram parameters and serum
element levels were determined. Then 20 cc drug diluted with serum physiologic was
administered IV to each, blood was drawn one week later and changes were determined.
All the element levels were measured in AA-680 Shimadzu atomic absorption
spectrophotometry in Biophysics Department of Đstanbul University Cerrahpaşa Faculty of
Medicine, hemogram parameters were measured in Đ.U. Veterinary Faculty Central
Analysis Laboratory and the data were statistically assessed.
When the levels before and after the treatment were examined, it was determined
that there were increases in Fe, Cu, Zn, Mg and Ca element levels and these increases were
significant for Fe and Zn in the level of p<0.001.
Consequently, it was decided that with the inclusion of minerasol which is a new
trace element combination into the routine care and nourishment program, the problems
related to the deficiency of trace elements would be eliminated and predisposition in terms
of bacterial viral and parasitic diseases would be prevented.
KEY WORDS: Minersol, Serum, Fe, Cu, Zn, Mg and Ca.
INTRODUCTION
The importance of many inorganic elements classified as macro and micro
elements in nourishing and growing of animals is accepted (2, 20). The diseases caused by
deficiency or excess of macro and micro elements in animals are of great importance (20).
Insufficient or excess intake of one or more elements ruins the normal functions and the
226
inaccurate rates between elements can prevent the healthy functioning of the organism (6,
20). Trace elements have an important role on growth, reproduction and productivity of
domestic animals. Mineral deficiency or imbalance observed in nearly everywhere in the
world causes significant losses in terms of both production and economy (5, 7, 9, 10, 11,
20). The main clinical symptoms of trace element deficiencies in animals are diarrhea,
anemia, loss of hair, depigmentation, growth disorders in bones, difficulty in walking, scurf
in skin, curving, hyperkeratosis, parakeratosis, lack of appetite, fertility disorders, decrease
in reproductivity, young animal growth disorders, tetany, decrease in protein synthesis,
immune deficiencies, abortus related to non-infectious reasons and pica (1, 6, 13, 17, 20,
21). It is reported that the losses caused by trace elements are as important as the losses
caused by infectious and parasitic diseases (20). Trace elements are very important for
increasing resistance to diseases in living organisms (6, 20). While deficiencies of trace
elements like cobalt, copper, iron, iodine, manganese, selenium or zinc cause losses in
reproduction and lactation, diseases like milk fever (hypocalcemia), grass tetany
(hypomagnesemia) and abomasum displacement (alcalemia, hypochloremia and
hypocalcemia) are characterized with electrolyte disorders and are generally observed in
the first stage of lactation and cause significant economical losses (5, 7, 9, 10, 11, 22). That
is why minerals like calcium-phosphate are of essential importance in both adult and
growing cattle (18).
However in many cases, it is difficult to find out since electrolyte imbalances show
no clinical symptom (7). Littledike et al. (12) reported that there were few studies on the
comparison of mineral levels in different cattle races and effects of body composition on
mineral level. The consulting organizations recommended by Agricultural Research
Commission study groups declare that the major minerals in cattle breeding are to be
determined and yet, there is a limited number of studies on the effect of trace elements on
animals in our country (18, 20).
Minerasol® used in this study is a hypertonic infusion solution that includes
calcium, phosphate, potassium, magnesium and sodium salts and iodine, iron, cobalt and
zinc trace elements. Mineal substances and trace elements are critical co-enzymes
necessary fort he activation of the effects of biologically important substances like
hormone, enzyme, vitamin and other functional proteins (22). Any deficiency causes
specific or non-specific disorders in cells’ metabolism.
In this study planned under the light of all these information, the effects of
Minerasol® application, a new mineral combination, on blood serum parameters were
examined, its efficiency on cattle breeding and its safety on the treatments of diseases
caused by macro and micro element deficiencies.
MATERIAL AND METHOD
This study was carried out in Đ.U. veterinary faculty farm. 25 cattle that were
determined to be healthy after the clinical examination were included to the study.
About 10 ml of blood with or without anticoagulant was drawn from the animals
before drug administration and both hemogram parameters and serum element levels were
determined. Then, each animal were administered IV 20 cc Minerasol® that includes
calcium phosphonat 65.00 mg, potassium chloride 4 282 mg, calcium gluconat 300.00 mg,
potassium lodide 50.00mg, sodium lodide 50.00mg, magnesium chloride 6 H2O 19.64 mg,
227
iron (II) chloride 4 H2O 12.96 mg, cobalt (II) chloride 6 H2O 0.164 mg, zinc chloride
0,1355 mg in one ml, blood was drawn one week later and changes were determined . All
the element levels were measured in AA-680 Shimadzu atomic absorption
spectrophotometry in Biophysics department of Đstanbul University Cerrahpaşa Faculty of
Medicine , hemogram parameters were measured in Đ.U. Veterinary faculty Central analysis
Laboratory and the data were statistically assessed.
FINDINGS
When the Minerasol® levels before and after the application were examined it was
determined that there was no statistically significant change in hemogram levels but there
was increases in Fe, Cu,, Zn, Mg and Ca element levels and that these increases were
significant in p<0.001 level (Table 1).
Table 1: Changes in hemogram levels and blood serum parameters before and 1 week after
Minerasol® administration(n=25).
Parameter / Unit
Red Blood Cell (RBC) (106/mm3)
Hematocrite (HCT) (%)
Trombocyte (PLT) (103/mm3)
Leucocyte (WBC) (103/mm3)
Hemoglobine (HGB) (g/dl)
Fe (µg/dL)
Cu (µg/dL)
Zn (µg/dL)
Mg (mg/dL)
Ca (mg/dL)
Before the treatment
X
± Sx
6,32 ± 0,87
27,07 ± 4,54
310,90 ± 80,00
22,00 ± 18,09
9,75 ± 1,02
102,45 ± 13,31
91,16 ± 9,34
105,40 ± 15,37
2,1±1,59
10.3±0,75
After the
treatment
X ± Sx
6,40 ± 0,87
26,78 ± 3,27
286,44 ± 46,58
14,78 ± 12,03
9,88 ± 1,11
135,76 ± 12,26
102,88 ± 11,39
126,84 ± 12,24
2,2±1,60
10,5±0,76
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
N.S.
***
N.S.
***
N.S.
N.S.
N.S.= p > 0.05, ***p<0.001
DISCUSSION
Compared to other countries, while our country is one of the leading countries in
terms of economically valuable animal count, its place is much worse than expected in
terms of products like meat, milk and skin obtained from these animals (1, 6). Deficiency of
trace elements plays as much role as infectious and parasitic diseases in the formation of
this table (20, 21). A similar appearance was observed in Trakya and after discussions with
breeders and veterinary physicians it was reported that there were many diseases caused by
parasites and trace element deficiencies. Particularly, complaints like walking disorders in
calves, fertility related problems, loss of weight, diarrhea, predisposition to infections,
decrease in fleece quality were compatible with symptoms reported in literature (2, 16).
Calcium is present in the structure of tissue and bones and is necessary for healthy
bone, muscle and nerve function. It is essentially responsible for blood clotting. It enables
the interaction of reticuloendolthelial system and suprarenal gland (22). It has a regulatory
effect on acute and chronic metabolic abnormalities and reproduction activities due to its
effect on phosphate interim metabolism. It is necessary for healthy bone and dental growth
228
and its maintenance (22). It is also known that, calcium and phosphate deficiencies cause
many metabolic diseases (4, 7, 11, 18). In our study, when the changes in calcium level of
blood serum, an increase in calcium quantity was observed. It was decided that injections of
calcium with phosphate could decrease the risk of metabolic diseases.
Copper has an important role in hemoglobin shaping and body growth, symptoms
like failure in metabolic funstions like immune function, increase in mortality rate, debility,
depigmentation, walking disorders, demyelinization in nerve tissues, low osteoblastic
activity and loss of weight caused by the failure of oxidation in tissued and diarrhea are
reported (17, 20). Copper and zinc are the most important essential minerals necessary for
the normal functioning of animals’ reproduction functions (23). Zinc is an essential mineral
for healthy skin, hair and nail situation, reproduction, bone and cartilage growth,
carbonhydrate, lipid and protein metabolism, enzyme and immune system. It has a vital role
in DNA synthesis. Decrease in consumption, decrease in growth rate, growth retardation,
anormal eustrus behaviour, decrease in testicle magnitude, spermatogenesis malfuction,
decrease in the development of secondary sex organs and fertility, decreases in resistance to
infections, significant compression on immune response, pathological changes in skin and
hair, parakeratosis are observed in the animals with zinc deficiency (20, 22) Magnesium is
necessary for bone and tooth formation and the maintenance of normal muscle functions. It
was reported that the inclusion of Zn, Cu and Mg to the ration in sufficient rates plays an
important role for fertilization and increasing the life chance of embryo (23). In this study
we observed that serum Cu, Zn and Mg levels increased after injection and it might be
efficient on preventing the diseases related to these minerals.
Nelson et al. (14) reported that they found the serum zinc level as 32-40 µg/dL in a
herd where anorexia, wool eating, alopecia, hyperkeratosis and parakeratosis was observed.
In our study it was determined that 105,40±15,37 µg/dl serum zinc levels before injection
were within normal levels for cattle (69,97-130,8 µg/dL) (3) and that this levels increased
to 126,84±12,24 µg/dl after administratiom of Minerasol and that this increase was
statistically significant(p<0.001).
Normal blood serum Cu levels reported by several authors (8, 13) are respectively
between 59-101 µg/dL and 80-120 µg/dL. Altınbaş and Fidancı (3) reported that normal
copper level was between 69,85-162,56 µg/dL in cattle. In our study, it was observed that
copper levels increased in a statistically nonsignificant fashion however both values were
within the normal limits reported by the authors. Although the authors (16) reported that the
risk of enzootic ataxia increased with the blood copper levels under 50 µg/dL, it was
observed that no such risk was present in the animals in our farm and Minerasol
administration completely eliminated this risk by increasing the serum copper level more.
Statistically nonsignificant increase was observed in serum magnesium level and it
was determined that it might be efficient for preventing diseases due to magnesium
deficiency.
Although Smith (19) reported that normal blood serum iron level was 57-162 µg/dl
in cattle, in our study it was observed that blood serum copper level was within the normal
limits before injection (102,45±13,31µg/dL) and its increase was statistically significant
(p<0,001) after Minerasol administration (135,76±12,26 µg/dL) however this value was
within the normal limits reported.
229
Fe deficiency along with the Cu deficiency is known to cause violent anemiae and
predisposition to parasitic diseases. Iron enters the structure of hemoglobin necessary for
moving oxygen from lungs to body cells. In case of insufficiency, decrease in immune
response, cell mediated immune abnormalities may be seen and the killing ability of
neutrophilia can be significantly reduced (22). Authors (1, 15) reported that high amount of
cobalt, zinc, cadmium, mangane and copper found in ration decreased the absorption of
iron. In our study it was observed that the blood erythrocyte count, hematocrit level and
hemoglobin level before and after the injection did not change and that this was compatible
with the presence of blood serum Fe and Cu levels within normal limits before injection
(19).
Potassium administered to the animals with minerasol administration are necessary
for the maintenance of cellular integrity and for healthy nerve and muscle function. Sodium
and Chlorine are necessary for the maintenance of healthy nerve and muscle function (22).
Đodine is the structural component of thyroid hormones called Thyroxine and
triiodothyronine and has a regulatory and activating effect on metabolism. The normal
growth and proper functioning of reproduction organs depend on the thyroid situation.
Since blind and hairless calves, abortus in cows can be seen in its deficiency, iodine
supplementation in various concentrations has a positive effect on reproduction
performance. cobalt is necessary for Vitamin B12 synthesis in the large intestine of pigs
and horses. The field experiences indicate that the copulation performance in sheep and
cattle is deteriorated and ovarium function is deteriorated in cattle, the rate of getting
pregnant, deliveries and milk and wool production decreased (22). However, although we
did not have the chance to examine the changes in K, Na, Cl, I and Co levels in blood
serum after the injection, it was decided that these were increased similarly to the others
and this may be effective on preventing diseases due to mineral deficiencies.
Minerasol is used for treating, preventing specific or non-specific diseases and
disorders caused by deficiency, lack or imbalance of the components (Zinc, Cobalt, Đodine,
Iron, Sodium, Potassium, Phosphor, Calcium, Magnesium) in its constitution and
supporting the animal (22).
It’s specific areas of use are grass tetany, milk fever, bone disorders, disorders in
hair and skin related to zinc, anemia related to iron and cobalt deficiency (vitamin B12),
hairless calves sue to iodine deficiency and it is used for removing the negative situations
caused by the deficiency of substances in its constitution mentioned in pharmacological
properties section. It can be used for prophylaxis during pregnancy and lactation fort he
prevention of diseases which are likely to develop since the need of animals for substances
within Minerasol is increased during these periods (22).
Consequently, it was decided that with the inclusion of minerasol which is a new
trace element combination into the routine care and nourishment program, the problems
related to the deficiency of trace elements would be eliminated in a short time and
predisposition in terms of bacterial viral and parasitic diseases would be prevented.
230
REFERENCES
Ağaoğlu, Z.T. (1991): Ülkemiz Hayvancılığında Bazı Đz elementler ve Önemleri. Veteriner
Hekimler Vakfı Dergisi, 57-62.
Altıntaş, A., Uysal, H., Yıldız, S., Goncagül, T.(1990): Akkaraman ve Melezlerinde Serum
ve Yapağı Örneklerinde Karşılaştırmalı Mineral Durumu. Lalahan Hayv. Araş. Derg., 30
(1-4): 40-57.
Altıntaş, A., Fidancı, U.R. (1993): Evcil Hayvanlarda ve Đnsanlarda Kanın Biyokimyasal
Normal Değerleri. AÜ Vet Fak Derg. 40, 173-186.
Beighle, D.E., Boyazoğlu, P.A., Hemken, R.W., Serumaga-Zake, P.A. (1994):
Determination of calcium, phosphorus, and magnesium values in rib bones from clinically
normal cattle. Am J Vet Res, Vol 55, No 1, 85-89.
Blood, D.C:, Radostits, O.M. (1989): Diseases caused by nutritional deficiencies.
Veterinary Medicine, Seventh Ed., Bailliere Tindall, W.B. Saunders, Londan, Part Two,
1150-1229.
Çamaş, H., Bildik, A., Gülser, F.: Toprak, Bitki ve Koyunların Kanında Bazı Đz
Elementlerle (Cu, Mo, Zn, Co, Mn) Sülfat (SO4) Miktarlarının Araştırılması. Pro.no:
VHAG-966. Van, 1994.
Dakka, A.A., Abdel-All, T.H.S. (1992): Studieson minerals picture in the blood sera of
egyptien Sheep. Assiut Vet Med J. Vol 28, No 55, 242-249.
Ghosal, A.K., Mathur, G.N. (1992): Zinc, copper and iron contents of blood serum of cattle,
sheep in semiarid Tract of Rjasthan. Ind J Anim Sci, (62),5, 441-442.
Graham, T.W. (1991): Trace element deficiencies in cattle. Vet Clin North Am Food Anim
Pract., 7(1):153-215.
Đmren, H.Y., Şahal, M. (1990): Metabolizma hastalıkları. Veteriner Đç Hastalıkları,
Aydoğdu ofset matb. Ankara, 841-1000.
Jones, H.C., Fontenot, J.P., Veit, H.P. (1990): Physiological and pathological effects of
feeding high levels of magnesium to steers. J Anim Sci. 68, 4400-4413.
Littledike, E.T., Wittum, T.E., Jenkins, T.G. (1995): Effect of breed, intake and carcass
composition on the status of several macro and trace minerals of adult beef cattle. J Anim
Sci. 73:2113-2119.
Martin, D.W., Mayes, P.A., Rodwell, V.W.: Harper’s Review of Biochemistry. 19th.
Edition Lance Medical Publications, Los Altos, California, 1983.
Nelson, D.R., Wolff, W.A., Blodgett, D.J., Leucke, B., Ely, R.W., Zachary, J. F. (1987):
Zinc Deficiency in Sheep and Goats: Three Field Cases. JAWMA, 184, 12, 1480-1485.
Pirkle, J.L., Schwartz, J.Landis R., Harlan, R.W. (1985): The Relationship Between Blood
Lead and Blood Pressure and Its Cardiovasculer Risk Đmplications. American Journal of
Epidemiology, 121: 246-258.
Ruls, R.(1990): Mineral Levels in Animal Health Diagnostic Data. 3rd., ed., The Iowa State
University Press Ames.
Sharma, M.C., Chinmay, J., Pathak, N.N., Kaur, H. (2005): Copper status and enzyme, hormone,
vitamin and immune function in heifers. Res Vet Sci. 79, 113-123.
Shupe, J.L., Butcher, J.E., Call, J.W., Olson, A.E., Blake, J.T. (1988): clinical signs and bone
changes associated with phosphorus deficiency in beef cattle. Am J Vet Res, 49:9, 1629-1636.
Smith, B.P. (2002): Large animal internal medicine. Mosby, Inc. Third Ed., USA.
231
Şahin, T. (1999): Endoparazitli koyunlarda bazı iz element ve biyokimyasal parametrelerin
seviyeleri üzerine araştırmalar. Doktora Tezi. Y.Y. Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst., Van.
Underwood, E.J. Trace Elements in Human and Animal Nutrition, Academic Press,
London, 1997.
www.interhas.com/interhas/ilaclar/minerasol.jpg
Yıldız, A., Balıkçı, E. (2004): Đneklerin Kan Serumlarındaki Bazı Mineraller ile
Embriyonik Ölüm Arasındaki Đlişki. YYÜ Vet Fak Derg, 15 (1-2):11-15.
232
PRIMI RISULTATI DI UN INDAGINE SUL POLIMORFISMO AI GENI ALFA E
BETA GLOBINICI IN RAZZE ISOLANE ITALIANE
ALPHA AND BETA GLOBIN POLYMORPHISM IN ITALIAN ISLANDER SHEEP
BREEDS: PRELIMINARY RESULTS
ALLOGGIO, I., BRAMANTE, G., PIERAGOSTINI, E.
Dip. PROGESA- Università di Bari. Via Amendola, 165/A, Bari (BA). Tel. 0805442842,
Fax 0805442828, Email [email protected]
KEY WORDS. Haemoglobin , gene frequency, alpha globin triplicated haplotypes, HBB,
HBA, PAGIF.
ABSTRACT
Previous researches highlighted the high haemoglobin polymorphism of Apulian native
sheep, mainly due to the alpha globin genetic system. The unusual presence of haplotypes,
characterised by extra-numerary genes, was suggested to be the effect of a possibly
adaptive response to the Apulian enzootic parasites. Unfortunately, in the literature there
are no data on other breeds originating in different geographical areas, and, at present,
haemoglobin polymorphism is not among the favourite research subjects. According to the
necessity of expanding the data set, this work reports the preliminary results obtained from
a screening in Italian islander sheep breeds. Thus, in 12 different flocks located in Apulia,
465 blood samples were taken from 156 Comisana (C ) sheep, 159 Sarda (S) sheep and
150 Valle del Belice (VdB) sheep. Haemolysates were prepared from EDTA samples and
analysed by PAGIF. The results indicate that when compared with Apulian native sheep,
the three breeds show slight differences as to the HBA2H gene frequency and a decreased
number of HBBA genes; particularly VdB exhibits no HBBA and rare HBA1A, while
show almost the same frequency of triplicated haplotypes as Apulian native sheep.
INTRODUZIONE
Ricerche precedenti hanno messo in evidenza nelle razze autoctone pugliesi un elevato
polimorfismo emoglobinico legato non solo alla presenza di alleli beta globinici quanto ad
una variabilità quali quantitativa del sistema alfa globinico (Pieragostini et al., 1994;
Pieragostini et al., 2005). Poiché non esistono dati di riferimento in letteratura che
consentano un organico confronto con risultati ottenuti su altre razze originarie di altri
ambienti abbiamo ritenuto necessario ampliare il data set a nostra disposizione, rivolgendo
la nostra attenzione a razze non pugliesi ed in particolare a tre razze isolane italiane. Alla
base di questa scelta sta il fatto che gli allevatori pugliesi hanno dimostrato scarsa affezione
nei confronti degli ovini autoctoni rivolgendo la loro attenzione a razze specializzate ed in
particolare, nell’ambito degli ovini da latte, nelle ultime decadi, dopo tentativi infruttuosi
con razze nordeuropee (Pieragostini, Petazzi, 1999), hanno indirizzato le loro preferenze
verso le razze isolane italiane ed in particolare la Comisana e la Sarda che hanno
cominciato a diffondersi a partire dagli anni ’80; recente è invece la comparsa della Valle
del Belice. Considerando l’ipotesi di valore adattativo avanzata per il polimorfismo
emoglobinico registrato nelle razze autoctone pugliesi sia per quanto riguarda gli alleli al
locus beta (HBB) (Pieragostini et al., 1994; Pieragostini et al., 2005) che gli arrangiamenti
233
genici del sistema alfa (Pieragostini et al., 2003) ed il fatto che le razze isolane
summenzionate provengono da
ambienti con caratteristiche simili sia a livello
pedoclimatico che della diffusione dei parassiti emotropici enzoootici, questo lavoro si
pone come obiettivo una ricognizione del polimorfismo emoglobinico delle razze
summenzionate per le quali scarse sono le informazioni al riguardo.
MATERIALI E METODI
Campionamento. Lo schema di campionamento riportato in tabella 1 è stato elaborato,
considerando la dimensione totale del gregge e campionando tutti i maschi presenti nelle
diverse aziende.
Analisi del fenotipo. Dai singoli campioni di sangue in EDTA sono stati ottenuti gli
emolisati da analizzare mediante focalizzazione isoelettrica su gel di poliacrilamide
(PAGIF) con aggiunta di separatori (Di Luccia et al. 1992). La valutazione densitometrica
delle bande è stata effettuata mediante Ultrascan XL associato ad un densitometro laser
equipaggiato con software Gelscan 2.0 della Pharmacia-LKB (Uppsala Sweden). Questo
metodo consente di verificare la presenza dei varianti globinici noti, di valutarne la quantità
e conseguentemente stabilire la posizione dei diversi geni alfa nell’aplotipo in base alla loro
espressione (Pieragostini et al., 2003). La presenza di aplotipi alfa soprannumerari è stata
confermata analizzando il campione mediante RP-HPLC come descritto in Pieragostini et
al. (2003).
Calcolo delle frequenze. Il calcolo delle frequenze geniche è stato effettuato mediante
conteggio diretto. La deviazione standard delle frequenze geniche è stata calcolata secondo
la formula
s=
4 MF
pq
dove Ne =
è stato ottenuto considerando che i maschi campionati
2 Ne
N
corrispondevano alla totalità delle presenze nel gregge (Tab.1).
Nomenclatura. La nomenclatura utilizzata fa riferimento alle linee guida per la
nomenclatura dei ruminanti (Andresen et al., 1995) per quanto riguarda i geni, mentre per
gli aplotipi segue il modello adottato in Pieragostini et al., 2003.
234
Tab. 1. Schema di campionamento che illustra il sistema di raccolta dei dati.
Sampling scheme defining how the data have be obtained.
Farm
B1
Farm
B2
Farm
D
Farm
E
Farm
G (b)
Farm
L (a)
Farm
M
Farm
A
Farm
F
Farm
G (a)
Farm
I
Farm
C
Farm
H
Farm
L (b)
Total
Bree
d
F
M
N° of samples
C
20
1
21
26
C
18
1
19
20
C
35
7
42
400
C
36
4
40
150
1
1
1
200
C
N° of samples per
breed
Flock size
C
18
2
20
C
12
1
13
S
30
10
40
260
S
35
5
40
800
S
36
3
39
203
S
33
7
40
VdB
52
38
90
800
VdB
33
7
40
320
VdB
9
367
11
98
20
465
156
159
150
13
417
300
3910
Purebred group
810
1680
1420
In tabella 2, sono riportate le frequenze alleliche calcolate ai loci alfa e beta globinici
confrontate ai dati di letteratura. Il dato più immediato riguarda il polimorfismo al locus
beta per il quale, rispetto alle razze pugliesi, si osserva l’atteso decremento latitudinale di
geni HBBA proposto da Ordas (2004) che nel caso della Valle del Belice si traduce in un
assenza totale.
235
Tab 2. Confronto delle frequenze alleliche osservate ai loci alfa e beta nelle tre razze
esaminate con dati di letteratura.
Allele frequency at the alpha and beta globin genetic systems in the breeds under study
compared with literature.
HBA1
L
HBA1
A
HBA1
D
HBA2
H
HBA3
H
HBBA
Comisana
0,899
0.101
0.000
0.109
0.035
0.052
Present paper
Sardinian
0.975
0.025
0.000
0.085
0.013
0.031
Present paper
Valle del Belice
0.963
0.037
0.000
0.115
0.070
0
Breed
References
Present paper
Pieragostini et al.
and Di Luccia et
al., 1995
Pieragostini et al.,
2005
Altamurana (126)
0.927
0.049
0.025
0.119
0.072
0.095
Gentile di Puglia
(294)
0.783
0.131
0.029
0.257
0.074
0.117
?
?
0.025
?
?
0.103
Pieragostini et al.,
1994
0.980
0.020
0.000
0.030
Hadjjsterkotis et
al., 1995
Leccese (996)
Sardinian (258)
0.010
Il polimorfismo del sistema alfa richiede un analisi più articolata ed in particolare, HBA1L,
che con leucina in positione 113 sembra rappresenti il residuo ancestrale comune alla
maggior parte dei Bovidae (http://us.expasy.org/sprot/), è il gene wild type; HBA1A è
maggiormente frequente nella razza Comisana (oltre il 10%) rispetto alle altre due nelle
quali è sotto la soglia del 5%. Confrontando le frequenze di HBA2 H nelle tre razze si nota
che a fronte di un 8,5% nella Sarda, sia la Comisana che la Valle del Belice sono attestate
sull’11%; la differenza tra le due consiste nel fatto che, considerando che HBA1 A si trova
sempre associato con HBA2 H, il valore della Comisana è da imputare prevalentemente alla
alta frequenza dell’aplotipo AH che al contrario nella Valle del Belice è molto meno
frequente dell’aplotipo LH (Tab.3).
Gli aplotipi triplicati sono stati trovati con una frequenza pari a quella delle razze pugliesi
solo nella Valle del Belice mentre nella Comisana ed ancor più nella Sarda sembra siano
abbastanza rari. Complessivamente la razza Sarda è quella che presenta il più basso livello
di polimorfismo relativamente al sistema alfa globinico. Interessante notare che i nostri
risultati sono pressoché sovrapponibili a quelli trovati da Hadjjsterkotis et al., 1995; se,
infatti si considera che detti autori non hanno rilevato separatamente la presenza di HBA2H
e HBA3H, si ottiene lo stesso valore di frequenza; va inoltre sottolineata l’assenza di geni
HBA1D i quali però non sono presenti in nessuna delle tre razze esaminate. Nel
complesso, le razze isolane risultano meno polimorfiche delle razze pugliesi; in dettaglio si
osserva che la Comisana somiglia alla Gentile di Puglia per la presenza relativamente
elevata di aplotipi AH e la Valle del Belice si accosta all’Altamurana per la frequenza dei
geni HBA2H e HBA3H. Questo ultimo dato, in particolare, ci incoraggia ad andare avanti
nell’indagine del polimorfismo ai loci alfa, vuoi su altre razze mediterranee che su razze
originarie di ambienti continentali.
236
Tab. 3. Frequenze degli aplotipi alfa nelle tre razze esaminate e relativo valore di
deviazione standard (s).
Haplotype frequency (± s) at the alpha globin genetic systems.
Breed
LL
s
LH
s
AH
s
LLH
s
Comisana
0,809
0,010
0,056
0,006
0,101
0,007
0,035
0,005
Sardinian
0,903
0,005
0,060
0,004
0,025
0,003
0,013
0,002
Valle del Belice
0,765
0,008
0,128
0,007
0,037
0,003
0,070
0,005
Ringraziamenti. Gli Autori ringraziano il dott. Giuseppe De Felice ed il Dott. Antonio Nisi
per la preziosa collaborazione nella ricognizione delle aziende i cui responsabili si sono
tutti distinti per disponibilità e cortesia. Un grazie particolare va al dott. Raffaele Sbano che
in qualità di proprietario dell’allevamento più numeroso si è sobbarcato l’onere di ospitarci
due volte. Questo lavoro è stato finanziato dal MIUR (PRIN 2004) e dell’Università di
Bari.
BIBLIOGRAFIA
Andresen E., Broad T.E., Brown S., Cooper D.W., Di Stasio L., Dolling C.H.S., Fleet M.: Hill
D.F.: Lauvergne J.J., Lundie R.S., Maddox J., Nicholas F.W. Rae AL., Renieri C., Sponenberg
D.P., Tucker E.M. (1995) Revised Guideline for gene nomenclature in Ruminants, 1993. Genet.
Sel. Evol. 27, 89-93.
Di Luccia A., Iannibelli L., Pieragostini E., Ferrara L. (1992) Phenotyping haemoglobin
polymorphisms of sheep. Small Ruminant Res. 7, 189-194.
Di Luccia A., Pieragostini E., Dario C., Ferrara L. (1995) Gene diversity in Mediterranean
Bovid globin chain. In: Proceedings Joint EAAP-FAO-CIHEAM International Symposium on
"Mediterranean animal germoplasm and future challenges" Benevento, Italy, 23-25 October
1995, pp. 135-138.
Hadjisterkotis E. Manca L. Naitana S. Masala B. (1995) A comparative study on the
haemoglobin polymorphism of domestic sheep of the islands of Chios Cyprus and Sardinia.
Comp. Biochem. Physiol. A-Physiol. 112, 547-552.
Ordás J.G. (2004) Structure of European ovine populations from directional autocorrelations
between proteins. J. Anim. Breed. Genet. 121, 229-241.
Pieragostini E., Dario C., Bufano G. (1994) Haemoglobin phenotypes and haematological
factors in Leccese sheep. Small Ruminant Res. 2, 177-185.
Pieragostini E., Petazzi F. (2000) Genetics and tolerance to tick borne diseases in South Italy)
experience in studying native Apulian and exotic sheep breeds. Parassitologia 41, 89-94.
Pieragostini E., Petazzi F., Di Luccia A. (2003) The relationship between the presence of extra
globin genes and blood cell traits in Altamurana sheep. Gen. Sel. Evol. 35(1), S121-S133.
237
RELATIONSHIP BETWEEN MILK GENETIC POLYMORPHISM AND
PHYSICO-CHEMICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF SHEEP MILK
MARTINI M.1, SALARI F.1, SCOLOZZI C.1, CECCHI F.1, CERIOTTI G.2, CAROLI A.3
1
Dipartimento di Produzioni Animali, Università degli Studi di Pisa, 56124 Pisa, Italy.
2
Dipartimento VSA, Università degli Studi di Milano, 20134 Milano, Italy.
3
Dipartimento Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università degli Studi di Brescia,
Viale Europa, 11- 25123 Brescia, Italy. Tel.: +39-030 3717658, Fax: +39-030 3701157. Email: [email protected]
KEY WORDS: Genetic Polymorphism, Milk Quality, Fat Globules, Sheep.
ABSTRACT
Individual milk samples (n = 72) were collected from Massese ewes bred in Central Italy.
Milk phenotypes were typed by isoelectrofocusing. Milk samples were analysed for the
physico-chemical composition. The lipid fraction was evaluated by the morphometric
analysis of milk fat globules and by the determination of the fatty acids composition. The
relationships between the genetic polymorphism of s1-casein (s1-cn) and -lactoglobulin
(-lg) and the qualitative properties of milk were statistically evaluated. The comparison
was performed between genotypes s1-cn AC vs CC, and -lg AA vs AB. Some interesting
relationships were found between milk protein genotypes, fat globule morphometric
characteristics, and fatty acid composition. A higher amount of smaller milk fat globules
was associated to s1-cn AC (vs CC) and -lg AB (vs AA) genotypes, and a higher content
of long-chain fatty acids was associated to -lg AA (vs AB) genotype.
INTRODUCTION
In the ovine species, the investigation on milk protein genetic variability has shown
an interesting and complex protein pattern, but the genetic control of the variation observed
was demonstrated only in few cases. Genetic polymorphism was demonstrated at the
protein level for -lactoglobulin (-lg; three variants: A, B and C; Bell and McKenzie,
1967; Erhardt, 1989), and s1-casein (s1-cn; three variants: A, C, Welsh/D; King 1966;
Richardson and Creamer, 1976; Ferranti et al., 1995; Chianese et al., 1996). The A and B
variants of -lg are ubiquitous. Their frequencies in the most important Italian dairy ewe
breeds are reported by Amigo et al. (2000).
Recently, three single nucleotide polymorphisms (SNP) have been described at s1cn, cn, and κ-cn, all resulting in amino-acid exchanges (Ceriotti et al., 2004).
Despite the limited genetic knowledge on milk protein variability in sheep,
interesting relationships between genetic milk protein variants and traits of economical
interest were already described (i.e. Rampilli et al., 1992; Pirisi et al., 1999). Relationships
of such variation with milk quality, composition, and technological characteristics have
been found at αs1-cn, where D allele is less favourable for cheese making than the most
common C variant. Contradictory results have been obtained regarding ovine -lg. Some
works found significant relationships between the main variants A and B and milk
production (Bolla et al., 1986; Bolla et al., 1989; Fraghì et al., 1996; Nudda et al., 2000), fat
and protein content (Garzon and Martinez, 1992; Giaccone et al., 1997; Rampilli et al.,
238
1997; Dario et al., 2003), while other studies did not reveal any influence on milk traits
(Barillet et al., 1993; Recio et al., 1997).
The aim of this work was to investigate the relationship between milk genetic
polymorphisms and physico-chemical and nutritional quality of sheep milk. Particular
attention was given to fatty acid composition and fat globule morphometric characteristics.
Animals and genotyping. Milk samples were taken from 72 Massese ewes of first
and second lambing order; all the animals came from a single herd located in the province
of Pisa (Tuscany) and were raised according to the semi-extensive system, involving use of
natural pastures and hay with the integration of small amounts of concentrate feed (never
superior to 300 g/day) given to the animals at the time of milking. All individual samples
were taken from morning milking and were refrigerated until use. Genotypes were
determined by isoelectrofocusing analysis of individual milk samples according to Chessa
et al. (2003).
Chemical analysis. Milk samples were analyzed for: percentage of dry matter,
protein, fat and lactose by infrared analysis (Milkoscan, Italian Foss Electric); density, pH,
percentage of casein, ash, phosphorus and calcium (A.O.A.C., 1990), somatic cell count
(SCC) (Fossomatic), colony forming units (C.F.U.); non-fat dry matter was calculated to be
the difference between dry matter and fat content.
Morphometric analysis. Number of fat globules mL-1 of milk and diameter was
measured in each milk sample according to Scolozzi et al. (2003).
Fatty Acids Composition. Milk fat extraction was performed according to following
method: ammonia 25% (0.4 ml), ethil alchool 95 % (1 ml) and exane (5ml) were added to 2
g of milk. After vortexed, samples were centrifuged at 3000 rpm and 5 °C for 15 min to
obtain the phase separation. The upper layer was collected and whole procedure was
repeated two times. Extracted fat was dried, weighed and dissolved in hexane (Secchiari,
2003). The fatty acids of milk were analyzed by gas-chromatography as the methyl ester
derivates after trans-esterification with sodium methoxide (Christie, 1982); the gaschromatographic apparatus Perkin Elmer Auto System was equipped with a FID detector
and a capillary column (Omegavax 320, 30 m length, 0.25 µm thickness), with helium as
carrier gas. The peak areas of individual fatty acids were identified for means of previous
fatty acids standards (Sigma-Aldrich) injection and quantified as percent of total fatty acids.
Total CLA comprises a pool of isomers (cis-9, trans 11 and 10, 12) of octadecadienoic acid.
Statistical Analysis. Frequency distribution of total measured milk fat globules was
evaluated according to their size: fat globule diameters were divided into ten classes of 1m class widths, from 0 to >9m, subsequently grouped to establish three size categories
of fat globules: small globules (SG) with diameter <2m (0.29% of total measured milk fat
globules), medium-sized globules (MG) with a diameter of 2-5m (40.9 % of total
measured milk fat globules) and large globules (LG) with diameter >5m (58.81% of total
measured milk fat globules). In this way, each milk sample was classified according to the
percentage of milk fat globules that were included in these three size categories.
Statistical analyses were performed with the GLM procedure of SAS software (SAS
Institute, Inc., Cary, NC) using a linear model to estimate the effect of s1-cn and -lg
genotype on the qualitative properties of milk. The model included also the parity as fixed
239
effect. The comparison was performed between genotypes s1-cn AC vs CC, and -lg AA
vs AB.
Genetic polymorphism was found at s1-cn (92% CC, 8% AC genotype frequencies)
and -lg (50% AA and 50% AB). Some relationship were found between milk protein
genotypes, fat globule morphometry, and fatty acid composition (table 1 and 2), while no
significant difference was found between the milk protein genotypes considered for milk
physico-chemical parameters.
Table 1. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for variables significantly
differing at s1-cn.
s1-cn AC
s1-cn CC
LSM
SE
LSM
SE
P
SG
2.87
0.92
0.83
0.26
0.005
MG
44.09
6.18
25.25
1.71
0.009
LG
54.03
6.42
73.92
1.78
0.006
CL1
0.995
0.333
0.198
0.092
0.034
CL2
1.877
0.656
0.635
0.182
0.087
CL3
6.693
1.671
2.984
0.463
0.048
CL4
17.132
3.244
7.347
0.900
0.010
CL8
7.804
3.278
14.566
0.909
0.064
CL9
3.132
2.148
8.057
0.596
0.042
CL10
0.651
2.451
6.370
0.680
0.038
SG: small globule %; MG: medium globule %; LG: large globule %; CL1, CL2,...CL10: %
of fat globules in the size classes defined in Materials and Methods.
Table 2. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for variables significantly
differing at -lg.
-lg AA
-lg AB
LSM
SE
LSM
SE
P
SG
1.280
0.472
2.424
0.595
0.037
CL1
0.404
0.170
0.789
0.214
0.050
CL2
0.877
0.335
1.636
0.423
0.050
LCFA
50.866
0.412
49.762
0.520
0.023
C18:0
12.440
0.316
11.252
0.398
0.002
SG: small globule %; LCFA = long-chain fatty acids %; CL1, CL2: percent of fat globules
in the size class defined in Materials and Methods.
A higher amount of smaller milk fat globules was associated to s1-cn AC (vs CC)
and -lg AB (vs AA) genotypes, and a higher content of long-chain fatty acids was
240
associated to -lg AA (vs AB) genotype. The effect of milk protein genotypes on milk fat
globule size is interesting for the possible relationship with milk nutritional and
technological quality. In recent years the process leading to the formation of lipid droplets
within the endoplasmatic reticulum has been elucidated (Mather and Keenan, 1998), but the
biochemical mechanisms responsible for the formation and release of fat globules of
various sizes have not yet been clarified, nor is the biological significance of their different
morphometric characteristics fully known. Few studies investigated the relationship
between milk fat globule size and technological properties of milk. A higher content of SG
was found related to a higher milk total protein content (Lopez and Dufur, 2001; Martini et
al., 2004). For cheese-making, it seems that smaller globule keeps more water, thus being
more useful for soft cheeses (Michalski et al., 2003).
As for the fatty acids composition, a highly significant difference (P<0.002) was
found between -lg AA and AB in C18:0 content (12.44 vs 11.25). According to Jensen
(1990), C18:0 tends to lower the haematic cholesterol level, whereas Ulbricht and
Southgate (1991) did not demonstrate any hypocholesterolemic effect for this fatty acid.
The biological role of -lg is still unclear. Due to its in vitro homology with retinol (Pérez
and Calvo, 1995) and some fatty acids (Narayan et al., 1997; Kontopidis et al., 2002), -lg
was proposed as a retinol binding protein in the intestine of newborns (Sawyer et al., 1985;
Pérez and Calvo, 1995) and as a protein involved in both transport and metabolism of
dietary lipids (Pérez and Calvo, 1995). Spector et al. (1970) found that the strength of the
relationship between β-lg and long fatty acids increases from C16:0, to C18:0, to C18:1.
According to Perez and Calvo (1995), the bound between β-lg and fatty acids increases the
protein stability against proteolitic degradation.
This work is a first hint of the importance of milk protein polymorphism on
morphometric characteristics of milk fat globules and fatty acid composition in the ovine
species. The biological explanation of these effects is to be investigated, in order to
evaluate their possible implications for animal breeding.
ACKNOWLEDGEMENT: Research supported by PRIN 2005.
REFERENCES
A.O.A.C. 1990. Official Methods of Analysis. 15th ed. Association of Official Analytical
Chemist, Arlington, VA.
Amigo, L., Recio, I., Ramos, M. 2000. Genetic polymorphism of ovine milk proteins: its
influence on technological properties of milk – A review. Dairy J., 10: 135–149.
Barillet, F., Mahè, M.F., Pellegrini, O., Grosclaude, F., Bernard, S. 1993. Genetic
polymorphism of the milk proteins in the French Lacaune breed. Hung. J. of Anim. Prod.
(Suppl.1), 199-207
Bell, K., and H.A. McKenzie. 1967. The whey proteins of ovine milk. β-lactoglobulins A
and B. Biochim. Biophys. Acta., 147: 23-134.
Bolla, P., Caroli, A., Mezzelani, A., Rizzi, R., Pagnacco, G., Fraghì, A., Casu, S. 1989.
Milk protein markers and production in sheep. Anim. Genet., 20 (suppl.1): 78-79.
Bolla, P., Caroli, A., Rizzi, R., Acciaioli, A. 1986. Relazioni tra polimorfismo della βlattoglobulina e caratteri produttivi nella pecora Massese. Atti XL Congresso SISVet, 197206.
241
Ceriotti, G., Chessa, S., Bolla, P., Budelli, E., Bianchi, L., Duranti, E., Caroli, A. 2004.
Single nucleotide polymorphisms in the ovine casein genes detected by Polymerase Chain
Reaction - Single Strand Conformation Polymorphism. J. Dairy Sci., 87: 2606-2613.
Chessa, S., Bolla, P., Dario, C., Pieragostini, E., Caroli, A. 2003. Polimorfismi genetici
lattoproteici nella razza ovina Gentile di Puglia: monitoraggio mediante focalizzazione
isoelettrica. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54: 191-198.
Chianese, L., Garro, G., Mauriello, R., Laezza, P., Ferranti, P., and F. Addeo. 1996.
Occurrence of five αs1-casein variants in ovine milk. J. Dairy Res., 63: 49-59.
Christie, W.W. 1982. A simple procedure of rapid transmethylation of glycerolipids and
cholesteryl esters. J. Lipid Res., 23: 1072-1075.
Dario, C., Carnicella, D., Pieragostini, E., Caroli, A. 2003. Effect of β-lactoglobulin
genotype on ovine milk composition. Proceedings IX World Congress of Animal
Production, Porto Alegre, Brasile, 26-31 ottobre 2003, Session 2: Small ruminants
production, CD-ROM.
Erhardt, G. 1989. Evidence for a third allele at the β-lactoglobulin (β-lg) locus of sheep
milk and its occurrence in different breeds. Anim. Genet., 20: 197-204.
Ferranti, P., Malomi, A., Nitti, G. Laezza, P., Pizzano, R., Chianese, L. and F. Addeo. 1995.
Primary structure of ovine αs1-casein: localization of phosphorylation sites and
characterization of genetic variants A, C and D. J. Dairy Res., 62: 281-296.
Fraghì, A., Carta, A., Pilla, F., Sanna, S.R., Cappio-Borlino, A. 1996. β-lactoglobulin
polymorphism in Sarda dairy sheep: influence on milk yield. Proc. 47th Annual Meeting of
European Association for Animal Production, Lillehammer, Norway. 47, 42.
Garzon, A.I., Martinez, J. 1992. Beta-lactoglobulins (β-lg) in Manchega sheep breed:
relationship with milk technological indexes in handcraft manufacture of Manchego cheese.
Proc. 23rd Conference of the International Society of Animal Genetics, Interlaken, Austrian
Republic. 23, 106.
Giaccone, P., Di Stasio, L., Panno, M., Todaro, M. 1997. Trend of milk composition during
the lactation for different β-lactoglobulin genotype. Proc. 51st Meeting of the Italian
Society of Veterinary Science, Perugia, Italy. 51, 429-430.
Jensen, R.G., Ferris, A.M., and C.J. Lammi-Keefe. 1991. The composition of milk fat.
Proc. Symp. Milk fat-composition, function and potential for change. J. Dairy Sci., 74:
3228-3243.
King, J.W.B. 1966. The caseins of sheep's milk. In “Polimorphismes Biochimiques des
Animaux”. Inst. Nat. Recherche Agronomique, Paris, 427-431.
Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. 2002. The ligand binding site of β-lactoglobulin:
evidence for a function? J. Mol. Biol., 318: 1043-1055.
Lopez, C. and E. Dufur. 2001. The Composition of the milk fat globule surface alters the
structural characteristics of the coagulum. Journal of Colloid and Interface Science, 233:
241-249.
Martini, M., Scolozzi, C., Cecchi, F., and F. Abramo. 2004. Morphometric analysis of fat
globules in ewe’s milk and correlation with qualitative parameters. It. J. Anim. Sci., 3: 5560.
Mather, I.H., and T.W. Keenan. 1998. Origin and secretion of milk lipids. J. Mammary
Gland Biol. Neoplasia, 3: 259-273.
242
Michalski, M. C., Gassi, J. Y., Famelart, M. E., Leconte, N., Camier, B., Michel, F., and V.
Briard. 2003. The size of native milk fat globules affects physico-chemical and sensory
properties of Camembert cheese. Lait, 83: 131-143.
Narayan, M., Berliner, L.J. 1997. Fatty acids and retinoids 1 bind independently and
simultaneously to β-lactoglobulin. Bioch. 36: 1906–1911.
Nudda, A., Feligini, M., Battacone, G., Campus, R.L., Pulina, G. 2000. Effects of βlactoglobulin genotypes and parity on milk production and coagulation properties in Sarda
dairy ewes. Zoot. Nutr. Anim., 26: 137-143.
Perez, M.D. and M. Calvo. 1995. Interaction of β-lactoglobulin with retinol fatty acids and
its role as a possible biological function for this protein: a review. J. Dairy Sci., 78: 978988.
Pirisi, A., Piredda, G., Papoff, C.M., Di Salvo, R., ,Pintus, S., Garro, G., Ferranti, P., and L.
Chianese. 1999. Effects of sheep alpha s1-casein CC, CD and DD genotypes on milk
composition and cheesemaking properties. J. Dairy Res., 66: 409-419.
Rampilli M., Locci F., Bardin M.G., Bolla P., Caroli A. 1992. Stabilità termica del siero di
latte ovino. Atti XXVII Simposio Internazionale di Zootecnia, Milano, 4 Aprile 1992: 167174.
Rampilli, M., Cecchi, F., Giuliotti, L., Cattaneo, T. M. P. 1997. The influence of βlactoglobulin genetic polymorphism on protein distribution and coagulation properties in
milk of Massese. breed ewes. In Milk protein polymorphism, International Dairy
Federation. 1 Brussels, Belgium. pp. 311-315.
Recio, I., Fernandèz-Fournier, A., Matìn-Alvarez, P.J., Ramos, M. 1997. β-lactoglobulins
polymorphism in ovine breeds: influence on cheesemaking properties and milk
composition. Lait, 77: 259-265.
Richardson, B.C. and L.K. Creamer. 1976. Comparative micelle structure v. the isolation
and characterization of the major ovine caseins. N.Z.J Dairy Sci. Technol., 11: 46-53.
Sawyer, L., Papiz, M.Z., North, A.C.T., Eliopoulos, E.E. 1985. Structure and function of
bovine β-lactoglobulin. Biochem. Soc. Trans., 13: 265.
Scolozzi, C., Martini, M., and F. Abramo. 2003. A method for identification and
characterization of ewe's milk fat globules. Milchwissenschaft, 58: 490-493.
Secchiari, P., Antongiovanni, M., Mele, M., Serra, A., Buccioni, A., Ferruzzi, G., Paoletti
F., Petacchi, F. 2003. Effect of kind of dietary fat on the quality of milk fat from Italian
Fresian cows. Livest. Prod. Sci., 83: 43-52.
Spector, A.A. and J.E. Fletcher. 1970. Binding of long-chain fatty acids to β-lactoglobulin.
Lipids, 5: 403.
Ulbricht, T.L.V., and D.A.T.Southgate. 1991. Coronary heart disease: seven dietary factors.
The Lancet, 338: 985-992.
243
RELATIONSHIP BETWEEN GENETIC POLYMORPHISM OF αs1-CASEIN AND
PHYSICO-CHEMICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF GOAT MILK
MARTINI M.1, SALARI F.1, SCOLOZZI C.1, CHIATTI F.2, CHESSA S.2, CAROLI A.3
1
Dipartimento di Produzioni Animali, Università degli Studi di Pisa, 56124 Pisa, Italy
2
Dipartimento VSA, Università degli Studi di Milano, 20134 Milano, Italy
3
Dipartimento Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università degli Studi di Brescia,
Viale Europa, 11- 25123 Brescia, Italy. Tel.: +39-030 3717658, Fax: +39-030 3701157. Email: [email protected]
KEY WORDS: Genetic Polymorphism, Milk Quality, Fat Globules, Goat.
ABSTRACT
A total of 56 milk individual samples from Camosciata goats bred in Central Italy
were collected. Milk protein phenotypes were typed by isoelectrofocusing. Moreover, the
s1-casein polymorphism was investigated at the genomic level, analysing the DNA
extracted from the milk somatic cells. Milk samples were analysed for the physicochemical composition. The lipid fraction was evaluated by the morphometric analysis of the
fat globules, and by the determination of the fatty acids composition. The relationships
between s1-casein genetic polymorphism and milk quality were evaluated statistically. In
particular, the favourable effect of the AA genotype on total protein, casein, and non-fat dry
matter was confirmed, whereas the homozygous FF genotype was associated with a higher
Ca content. A significant effect was detected of s1-casein genotype on the following milk
fatty acids: C14:1, C17:0, C18:3 n3, C20:0, C21:0, C20:4. Among them, C18:3 n3 and
C20:4 are of particular interest from the nutritional point of view.
INTRODUCTION
The analysis of casein variation in domesticated goat (Capra hircus) is quite
complex, because a large number of mutations involve the four coding genes (Rando et al.,
2000; Caroli et al., 2006). Deep relationships of such intense genetic variation with
functional and biological properties affecting milk quality, composition, and technological
characteristics have been found mainly at the goat s1-casein (s1-cn) level (Martin 1993;
Grosclaude et al., 1994), which is characterized by a high quantitative and qualitative
variation.
Considerable differences in the clotting speed, curd firmness and cheese yield were
evidenced among the s1-cn alleles in goat milk (Remeuf, 1993; Delacroix-Buchet et al.,
1996). The best parameters were obtained by homozygous s1-cn AA. Allele A gives goat
cheese the sweetest flavour, while allele F the sharpest (Vassal et al., 1994; Lamberet et al.,
1996). Neveu et al. (2002) suggested that the s1-cn polymorphism is involved in the
secretion process of goat milk proteins which is apocrine instead of merocrine as in bovine
milk. In fact, casein accumulation in the endoplasmic reticulum leads to dilation of the
cisternae that could disturb the whole secretion process, including lipids. The authors
suggested that the apocrine pathway of secretion described in the goat could be the
consequence of the dysfunction observed in the intracellular transport of caseins when s1casein is lacking. Contarini et al. (1999) observed that a low content in αs1-cn in goat milk
is linked to a higher content of C4:0, C6:0, C14:0, C16:0, C16:1, C18:3, and C20:0.
244
The aim of this work was to further investigate the relations between s1-cn
polymorphism and the physico-chemical and nutritional quality of goat milk.
Animals and genotyping. Milk samples were taken from 56 Camosciata goats bred in
Central Italy. All individual samples were taken from morning milking and were
refrigerated until use. Genotypes were determined by isoelectrocusing analysis of
individual milk samples according to Caroli et al. (2001) and at the DNA level, by
analysing the DNA extracted from milk with different typing methods (Jànsa Pérez et al.,
1994, Ramunno et al., 2000; Cosenza et al., 2001).
Chemical analysis. Milk samples were analyzed for: percentage of dry matter,
protein, fat, and lactose by infrared analysis (Milkoscan, Italian Foss Electric); density, pH,
percentage of casein, ash, phosphorus and calcium (A.O.A.C., 1990), somatic cell count
(SCC) (Fossomatic), colony forming units (C.F.U.); non-fat dry matter was calculated to be
the difference between dry matter and fat content.
Morphometric analysis. Number of fat globules mL-1 of milk and diameter was
measured in each milk sample according to the method of Scolozzi et al. (2003).
Fatty Acids Composition. Milk fat extraction was performed according to following
method: ammonia 25% (0.4 ml), ethil alchool 95 % (1 ml) and exane (5ml) were added to 2
g of milk. After vortexed, samples were centrifuged at 3000 rpm and 5 °C for 15 min to
obtain the phase separation. The upper layer was collected and whole procedure was
repeated two times. Extracted fat was dried, weighed and dissolved in hexane (Secchiari,
2003). The fatty acids of milk were analyzed by gas-chromatography as the methyl ester
derivates after trans-esterification with sodium methoxide (Christie, 1982); the gaschromatographic apparatus Perkin Elmer Auto System was equipped with a FID detector
and a capillary column (Omegavax 320, 30 m length, 0.25 µm thickness), with helium as
carrier gas. The peak areas of individual fatty acids were identified for means of previous
fatty acids standards (Sigma-Aldrich) injection and quantified as percent of total fatty acids.
Total CLA comprises a pool of isomers (cis-9, trans 11 and 10,12) of octadecadienoic acid.
Statistical Analysis. Frequency distribution of total measured milk fat globules was
evaluated according to their size: fat globule diameters were divided into ten classes of 1m class widths, from 0 to >9m, subsequently grouped to establish three size categories
of fat globules: small globules (SG) with diameter <2m (40.3% of total measured milk fat
globules), medium-sized globules (MG) with a diameter of 2-5m (55.7 % of total
measured milk fat globules) and large globules (LG) with diameter >5m (4.0% of total
measured milk fat globules). In this way, each milk sample was classified according to the
percentage of milk fat globules that were included in these three size categories.
Statistical analyses were performed with the GLM procedure of SAS software (SAS
Institute, Inc., Cary, NC) using a linear model to estimate the effect of s1-cn on the
qualitative properties of milk. The model included also the parity as fixed effect.
245
Table 1 and 2 shows the significant differences detected among s1-cn genotypes.
The favourable effect of the AA genotype on total protein, casein, and non-fat dry matter
was confirmed. Moreover, the homozygous FF genotype was associated with a higher Ca
content (table 1).
A significant effect was detected of s1-casein genotype on the following milk fatty
acids: C14:1, C17:0, C18:3n3, C20:0, C21:0, C20:4 (table 2). The trend for genotype is
represented in figure 1. Some indications can be extrapolated about the possible effect of
the different allele, such as a higher C20:0 content linked to the F allele, a higher C18:3n3
content linked to A allele, and a lower C20:4 content linked to E allele.
Among the fatty acids significantly affected by s1-cn genotype, the presence of
myristoleic acid (C14:1) in plasma was shown to be a diagnostic value in patients with
defects of long-chain fatty acid oxidation (Onkenhout et al., 1995). From the nutritional
point of view the alpha-linolenic acid (C18:3n3) is an essential fatty acid, precursor of
omega-3 fatty acids, which are known for their favourable effects on human health (Baro et
al., 2003; Hardman, 2004, Sangiovanni and Chew, 2005; Blondeau and Schneider, 2006).
The arachidonic acid (C20:4), belonging to the omega-6 series, has a double effect on
human health, both playing a positive role on the formation of embryonic neuronal cells
and in the first life years (Sala-Vila et al., 2006), and acting as a precursor of prostaglandins
and leucotriens which are pro-inflammatory molecules in adult life (Tapiero et al., 2002).
The results obtained are a preliminary suggestive indication of important relations
between s1-cn alleles and the fatty acid profile of goat milk in the Camosciata, and support
the need for further researches on the subject.
ACKNOWLEDGEMENT: Research supported by PRIN 2005.
Table 1. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for physico-chemical
parameters (%) significantly differing at s1-cn genotype.
s1-cn
Varia AA (n = 6)
AE (n =
AF (n =
EE (n = 3)
EF (n =
FF (n = 5)
ble
12)
20)
10)
SE
LS
SE LSM SE LSM SE LSM SE LSM SE LSM
M
Protei 3.25 0.11 3.17A 0.1 2.88B 0.0 3.03AB 0.1 2.73C 0.0 2.81B 0.092
Ba
b
b
b
n
4
20
48
22
81
A
B
AB
B
Casei 3.16 0.16 2.93 0.1 2.71 0.0 3.02
0.1 2.49 0.1 2.65B 0.137
B
a
b
n
9
79
72
82
21
A
B
AB
0.1 7.66C 0.1 7.80B 0.128
n.f.d. 8.35 0.15 8.20 0.1 7.82 0.0 7.98
B
m.
9
68
68
71
14
Ca
0.10 0.01 0.09B 0.0 0.08B 0.0 0.08B 0.0 0.09B 0.0 0.13A 0.012
B
5
15
06
16
10
A,B
…: P≤0.01; a,b…: P≤0.05
n.f.d.m: non-fat dry matter
246
Table 2. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for fatty acid composition (%)
significantly differing at s1-cn genotype.
s1-cn
AA (n = 6)
Fatty
acid
C14:1
C17:0
C18:3n3
C20:0
C21:0
C20:4
A,B
LSM
1.17Bbc
0.72BC
0.29abc
0.89ABab
0.09bc
0.19Aab
SE
0.067
0.045
0.030
0.116
0.019
0.028
AE (n = 12)
LSM
1.33Ab
0.81A
0.32ab
0.70Bab
0.10abc
0.12Bd
SE
0.071
0.048
0.031
0.123
0.020
0.030
AF (n = 20)
LSM
1.22Bb
0.79B
0.33a
0.92ABa
0.12a
0.18ABbc
SE
0.028
0.020
0.013
0.049
0.008
0.012
EE (n = 3)
LSM
1.32ABb
0.74BC
0.26c
0.60Bb
0.12ab
0.17ABbcd
SE
0.071
0.049
0.032
0.125
0.020
0.030
EF (n = 10)
LSM
1.14Bc
0.72C
0.29bc
0.96ABa
0.08bc
0.15ABcd
SE
0.048
0.032
0.021
0.083
0.014
0.020
FF (n = 5)
LSM
1.09Bc
0.73BC
0.28bc
1.11Aab
0.07c
0.22Aa
SE
0.054
0.037
0.024
0.094
0.015
0.023
…: P≤0.01; a,b…: P≤0.05
Figure 1. Trend of fatty acid composition per genotype.
1.4
1.2
C14:1
1
C17
0.8
C18:3n3
0.6
C20
C21
0.4
C20:4
0.2
0
AA
AE
AF
EE
EF
FF
REFERENCES
A.O.A.C. 1990. Official Methods of Analysis. 15th ed. Association of Official Analytical
Chemist, Arlington, VA.
Baro, L., Fonolla, J., Pena, J.L., Martinez-Ferez, A., Lucena, A., Jimenez, J., Boza, J.J.
2003. N-3 Fatty acids plus oleic acid and vitamin supplemented milk consumption reduces
total and LDL cholesterol, homocysteine and levels of endothelial adhesion molecules in
healthy humans. Clin. Nutr., 22: 175-182.
Blondeau, N., and Schneider, S.M. 2006. Les acides gras essentiels de la famille des
omega-3 et la santé de la mère et de l’enfant. Nutrition Clinique et Métabolisme. 20: 68-72.
Caroli, A., Chiatti, F., Chessa, S., Rignanese, D., Bolla, P. and G. Pagnacco. 2006.
Focusing on the goat casein gene complex. J. Dairy Sci. 89 (in press).
Caroli, A., Jann, O., Budelli, E., Bolla, P., Jäger, S., and G. Erhardt. 2001. Genetic
polymorphism of goat κ-casein (CSN3) in different breeds and characterization at DNA
level. Anim. Genet., 32: 226-230.
Contarini, G., and M. Povolo. 1999. http:\\www.ilclodi.it\Luino.htm
247
Christie, A. 1982. A simple procedure of rapid transmethylation of glycerolipids and
cholesteryl esters. J. Lipid Res., 23: 1072-1075.
Cosenza, G., Illario, R., Rando, A., Di Gregorio, P., Masina, P., and L. Ramunno. 2003.
Molecular characterization of the goat CSN1S101 allele. J. Dairy Res., 70: 237-240.
Delacroix-Buchet, A., Degas, C., Lamberet, G., Vassal, L. 1996. Influence des variants AA
et FF de la caséine αs1 caprine sur le rendement fromager et les caractéristiques sensorielles
des fromages. Lait, 76: 217-241.
Grosclaude, F., Ricordeau, G., Martin, P., Remeuf, F., Vassal, L., and J. Bouillon. 1994. Du
gène au fromage: le polymorphisme de la caséine αs1 caprine, ses effets, son évolution.
INRA Prod. Anim., 7: 3-19.
Hardman, W.E. 2004. (n-3) Fatty acids and cancer therapy. J. Nutr., 134 :S3427-3430.
Jànsa Pérez, M., Leroux, C., Sanchez Bonastre, A., and P. Martin. 1994. Occurrence of a
LINE element in the 3'UTR of an allelic form of the goat alphas1 -casein gene associated
with a reduced level of protein synthesis. Gene, 147:179-187.
Lamberet, G., Degas, C., Delacroix-Buchet, A., Vassal, L. 1996. Influence des caractères
liés aux allèles A et F de la caséine αs1 caprine sur le flaveur chèvre: fabrications
fromagères avec échange de protéines et de matières grasses. Lait, 76 : 349-361.
Martin, P. 1993. Polymorphisme génétique des lactoprotéines caprines. Lait, 73: 511-532.
Morgan, F., Bodin, J.P., Gaborit, P. 2001a. Lien entre le niveau de lipolyse du lait chèvre et
la qualité sensorielle des fromages au lait cru ou pasteurisé. Lait 81: 743-756.
Morgan, F., Gaborit, P. 2001b. The typical flavour of goat milk products: technological
aspects. Internat. J. Dairy Technol., 54: 38-40.
Neveu, C., Riaublanc, A., Miranda, G., Chich, J.F., Martin, P. 2002. Is the apocrine milk
secretion process observed in the goat species rooted in the perturbation of the intracellular
transport mechanism induced by defective alleles at the αs1-casein locus? Reprod. Nutr.
Dev., 42: 163-172.
Onkenhout, W., Venizelos, V., van der Poel, P.F., van den Heuvel, M.P. and BJ Poorthuis.
1995. Identification and quantification of intermediates of unsaturated fatty acid
metabolism in plasma of patients with fatty acid oxidation disorders. Clinical Chemistry,
41: 1467-1474.
Ramunno, L., Cosenza, G., Pappalardo, M., Pastore, N., Gallo, D., Di Gregorio, P., and P.
Masina. 2000. Identification of the goat CSN1S1F allele by means of PCR-RFLP method.
Anim. Genet., 31: 342.
Rando, A., Ramunno, L., and P. Masina. 2000. Mutations in casein genes. Zoot. Nutriz.
Anim., 26: 105-114.
Remeuf, F. 1993. Influence du polymorphisme génétique de la caséine αs1 caprine sur les
caractéristiques physico-chimiques et technologiques du lait. Lait, 73: 549-557.
Sala-Vila, A., Campoy, C., Castellote, A.I., Garrido, F.J., Rivero, M., Rodriguez-Palmero,
M., and M.C. Lopez-Sabater. 2006. Influence of dietary source of docosahexaenoic and
arachidonic acids on their incorporation into membrane phospholipids of red blood cells in
term infant. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 72: 21-28.
SanGiovanni, J.P., and Chew, E.Y. 2005. The role of omega-3 long chain polyunsaturated
fatty acids in health and disease of the retina. Progress in Retinal and Eye Research, 24: 87138.
248
Scolozzi, C., Martini, M., and F. Abramo. 2003. A method for identification and
characterization of ewe's milk fat globules. Milchwissenschaft, 58: 490-493.
Secchiari, P., Antongiovanni, M., Mele, M., Serra, A., Buccioni, A., Ferruzzi, G., Paoletti
F., Petacchi, F. 2003. Effect of kind of dietary fat on the quality of milk fat from Italian
Fresian cows. Livest. Prod. Sci., 83: 43-52.
Tapiero, H., Nguyen, G., Couvreur, P., and K.D. Tew. 2002. Polyunsaturated fatty acids
(PUFA) and eicosanoids in human health and pathologies. Biomedicine and
Pharmacotherapy, 56: 215-222.
Vassal, L., Delacroix-Buchet, A., Bouillon, J. 1994. Influence des variants AA, EE et FF de
la caséine αs1 caprine sur le rendement fromager et les caractéristiques sensorielles des
fromages traditionnels: premières observations. Lait, 74: 89-103.
249
GENOTIPADO DEL SCRAPIE OVINO: ADAPTACIÓN DEL MÉTODO DE
ANÁLISIS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS VARIANTES ALÉLICAS
(SHEEP GENOTYPED FOR SCRAPIE: ADJUSTMENT OF THE ANALYSIS METHOD
FOR THE IDENTIFICATION OF NEW ALLELIC VARIANTS)
PORTELA, C.; BOUZADA, J.A.; PRADO, C.; AREÁN, H.; FERNÁNDEZ, M.; LÓPEZ,
M.; FERNÁNDEZ, A. y VIANA, J.L.
Laboratorio de Xenética Molecular. Xenética Fontao S.A., Fontao-Esperante, Apdo 128.
27080 Lugo (España). [email protected] [email protected]
RESUMEN
Numerosas investigaciones realizadas en los últimos años han permitido detectar una serie
de posiciones polimórficas dentro de la secuencia del gen PRNP ovino, que codifica para la
proteína prión (PRP). Más de una veintena de estas mutaciones dan lugar a cambios en la
secuencia aminoacídica de la PRP. De todos estos polimorfismos, se ha prestado atención
especial a los que afectan a los codones 136, 154 y 171, ya que está descrita su relación con
la distinta susceptibilidad/resistencia de los ovinos a padecer Scrapie (Encefalopatía
Espongiforme Transmisible Ovina).
Los protocolos de genotipado empleados hasta el momento en la mayoría de los
laboratorios analizaban solamente cuatro posiciones polimórficas, la segunda posición de
los codones 136 y 154, y la segunda y tercera posiciones del codon 171, lo que permitía la
identificación de 5 haplotipos denominados ARQ, VRQ, AHQ, ARR y ARH.
En el presente trabajo se describen las modificaciones realizadas en el método de análisis
para la identificación de dos nuevas variantes alélicas, resultantes del polimorfismo
detectado en las primeras posiciones de los codones 136 y 171, y que se denominan TRQ y
ARK, respectivamente. Los análisis han sido realizados en animales inscritos en el libro
genealógico de la raza ovina Assaf, que gestiona la Asociación Española de Criadores de la
Raza Ovina Assaf (ASSAF.E).
PALABRAS CLAVE: scrapie, ovino, PRNP, haplotipos.
ABSTRACT
Numerous studies developed in the last years have allowed to detect different polymorphic
positions in the PRNP gene sequence, which codifies for the prion protein (PRP). More
than twenty of these mutations provoke changes in the PRP amino acid sequence. A special
attention has been paid to polymorphisms affecting the 136, 154 and 171 codons since it is
described their relation with the different sheep susceptibility/resistance to suffer Scrapie
(Sheep Transmissible Spongiform Encephalopathies).
At present, genotyping protocols used by most labs only analyze four polymorphic
positions (second nucleotide of 136 and 154 codons, second and third positions of 171
codon) allowing the identification of five haplotypes: ARQ, VRQ, AHQ, ARR and ARH.
In the current study, we describe the adjustment in the analysis method in order to detect
two new allelic variants, resultanting from the polymorphism detected in the first positions
of 136 and 171 codons, called TRQ and ARK, respectively. These analyses have been
realized in animals inscribed in the Assaf Sheep Breed Herdbook, which manages the
Breeders Spanish Association of the Assaf Sheep Breed (ASSAF.E).
250
KEY WORDS: scrapie, sheep, PRNP, haplotypes
INTRODUCCIÓN
La Tembladera o Scrapie es una Encefalopatía Espongiforme Transmisible (EET) que
afecta a ovejas y cabras, que fue descrita por primera vez hace más de 250 años y a la que
sólo muy recientemente se la ha prestado atención, debido a la alarma social generada, por
la posible transmisión al hombre de este tipo de enfermedades desde la especie bovina,
mediante ingestión de material infectado. La sintomatología incluye prurito,
hiperexcitabilidad, temblores, falta de coordinación en la marcha para acabar en parálisis y
finalmente producir la muerte del individuo. El desarrollo de la enfermedad presenta largos
periodos de incubación y da lugar a la degeneración progresiva del sistema nervioso central
que, en etapas avanzadas de la enfermedad, adquiere el característico aspecto
espongiforme.
En ovinos, se ha establecido la influencia del locus PRNP en la mayor o menor resistencia
de los animales a padecer la enfermedad. Este gen se ubica en el cromosoma 13 y da lugar a
una proteína de 256 aminoácidos (Castiglioni et al., 1998). En la tabla 1 aparecen descritos
algunos de los polimorfismos aminoacídicos detectados en esta proteína que han sido
descritos en la bibliografía (Clouscard et al., 1995; Belt et al., 1995; Bossers et al., 1996;
Hunter et al., 1996; Torisson et al., 1998; Thorgeirsdottir et al., 1999; Billinis et al., 2004;
Acín et al, 2004; Zhang et al., 2004; Acutis et al., 2004; Goldmann et al, 2005).
101
112
116
127
136
137
Salvaje
Q
M
A
G
A
R
T
P
A
V
V
T
Variantes
alélicas
Codón
S
138
141
143
M
S
L
H
T
N
F
R
R
151
154
167
168
171
R
R
G
H
172
174
175
R
P
S
L
Q
Y
Q
R
D
E
H
H
C
K
176
180
189
195
196
211
241
Q
N
H
G
T
E
K
T
L
S
T
R
P
S
Q
S
Y
R
De todos estos polimorfismos, los que afectan a los codones 136, 154 y 171 son los que se
han descrito como más relacionadas con el grado de padecimiento de la enfermedad. En los
últimos años, la gran mayoría de los laboratorios han estado realizando un sistema de
análisis que permitía genotipar, únicamente, la segunda posición nucleotídica de los
codones 136 y 154, y la segunda y tercera posiciones del codón 171, mediante una técnica
denominada “primer extension analysis" (Syvanen, 1999; Sauer et al., 2000), lo que daba
lugar a la identificación de 5 haplotipos denominados, respectivamente, ARQ, VRQ, AHQ,
ARR y ARH. Con esos datos, se ha establecido que, en general, los animales ARR/ARR
son los más resistentes y los VRQ/VRQ son los más sensibles a padecer la enfermedad
(Dawson et al., 1998).
Utilizando este mismo protocolo, en el laboratorio de Xenética Molecular de Xenética
Fontao, S.A., se han detectado animales, en los cuales la señal de lectura correspondiente al
alelo salvaje, de la segunda posición del codón 171, aparecía con un tamaño
considerablemente menor en homocigosis y apenas perceptible cuando aparecía en
251
heterocigosis. El fragmento del gen, donde están incluidas las posiciones polimórficas
motivo de análisis, fue secuenciado, detectando con ello la existencia de un polimorfismo
en la primera posición del codón 171. Este polimorfismo ya aparecía citado en la
bibliografía pero no había sido incluido, hasta el momento, en los análisis más
habitualmente llevados a cabo. El alelo al que da lugar se denomina ARK (aparece el
aminoácido Lisina en lugar del Glutamina). A consecuencia de ello, surge por un lado la
necesidad de modificar el protocolo de análisis para poder genotipar este tipo de animales
de manera inequívoca y, posteriormente, incluir todas las posibles combinaciones de este
alelo en las tablas de los grupos de riesgo de padecer la enfermedad que actualmente se
usan y que condicionan los esquemas de selección de los animales.
En el presente trabajo se describen las modificaciones realizadas en el método de análisis
para la identificación de dos nuevas variantes alélicas, resultantes del polimorfismo descrito
en las primeras posiciones de los codones 136 y 171, denominadas TRQ y ARK,
respectivamente. Los análisis han sido realizados en animales inscritos en el libro
genealógico de la raza ovina Assaf, que gestiona la Asociación Española de Criadores de la
Raza Ovina Assaf (ASSAF.E).
MATERIAL Y MÉTODOS
Material Biológico: Se han analizado un total de 1391 animales machos pertenecientes a 55
ganaderías de la Asociación de Ganaderos de la raza Assaf (ASSAF.E). Las muestras
utilizadas consistieron exclusivamente en sangre entera usando EDTA K3 como
anticoagulante, extraídas y remitidas al laboratorio por técnicos de la Asociación.
Extracción de ADN: Se llevó a cabo utilizando la 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied
Biosystems), siguiendo el protocolo de extracción BloodPrepTM Chemistry y usando los
reactivos recomendados por el fabricante. Previo a la extracción, las muestras de sangre se
congelan a -80oC durante un mínimo de 10 minutos, para provocar la lisis celular y facilitar
la liberación del ADN. Posteriormente, se incuban en estufa a 58oC durante 30min, 50µl de
la muestra añadiendo 15µl de Proteinasa K y 85µl de Buffer de Digestión. Tras la
incubación se añaden 600µl de Solución de Purificación, y se procede con el protocolo de
extracción, en el que se realizan pasos consecutivos de purificación y lavado para eliminar
los restos celulares, para acabar recogiendo el ADN mediante dos soluciones de Elución.
Genotipado: Se llevó a cabo mediante la técnica denominada “primer extension analysis”
(Syvanen, 1999 y Sauer et al., 2000) usando el ABI PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit de
Applied Biosystems, lo que permitió analizar, de forma simultánea, las 4 posiciones
polimórficas que condicionan los 3 codones citados. La PCR inicial se ha llevado a cabo
usando los siguientes cebadores: 5’-TCAAGGTGGTAGCCACAGTCAGT-3’ y 5’CCACTCGCTCCATTATCTTGATGT-3’ lo que da lugar a la amplificación de un
fragmento de 356bp del exón III (entre las bases 353 y 708 del ORF) y que incluye las 4
posiciones nucleotídicas cuyo polimorfismo se desea estudiar. Las defosforilaciones y las
reacciones de “primer extensión" se realizaron según los protocolos que acompañan al ABI
PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit de Applied Biosystems. La modificación del protocolo
de análisis desarrollada en este laboratorio consiste en la inclusión, en la reacción de
“primer extensión”, de dos nuevos cebadores que permiten analizar, adicionalmente a las 4
posiciones anteriores, la primera posición de los codones 136 y 171 y que, por lo tanto,
permiten poner de manifiesto los alelos TRQ y ARK. Los resultados obtenidos fueron
252
visualizados mediante una electroforesis capilar en un 3130xl Genetic Analyzer de Applied
Biosystems y la posterior lectura se llevó a cabo usando el software Genemapper® .
Secuenciación de ADN: Fue llevada a cabo por el Servicio de Secuenciación de ADN de la
empresa Sistemas Genómicos, S.L. de Paterna (Valencia).
En la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos para los 7 haplotipos analizados en el
gen PRNP en los animales de la raza ovina Assaf. Se han analizado un total de 1391
animales y se han encontrado 16 genotipos diferentes de los 28 posibles para los haplotipos
analizados. Se han encontrado 6 alelos diferentes ya que no ha aparecido ningún animal con
el alelo TRQ. El Alelo ARK ha sido encontrado tanto en homocigosis como en
heterocigosis con los demás alelos existentes en los animales analizados hasta el momento.
Tabla 2. Frecuencias genotípicas y alélicas en el gen PRNP en los animales de la raza
ovina Assaf analizados.
Frecuencias Genotípicas
Frecuencias Alélicas
Genotipos
Total
Frecuencia
Alelo
Frecuencia
AHQ/AHQ
5
0,00359
ARQ
0,45327
AHQ/ARH
6
0,00431
ARR
0,37383
AHQ/ARK
7
0,00503
ARH
0,07441
ARH/ARH
9
0,00647
AHQ
0,05715
ARH/ARK
19
0,01366
ARK
0,04098
ARK/ARK
7
0,00503
VRQ
0,00036
ARQ/AHQ
82
0,05895
TRQ
0,00000
ARQ/ARH
97
0,06973
ARQ/ARK
39
0,02804
ARQ/ARQ
267
0,19195
ARR/AHQ
54
0,03882
ARR/ARH
67
0,04817
ARR/ARK
35
0,02516
ARR/ARQ
509
0,36592
ARR/ARR
187
0,13444
ARR/VRQ
1
0,00072
Total
1391
Los resultados obtenidos señalan a los alelos ARQ y ARR como los más frecuentes en los
animales analizados, siendo el primero alrededor de un 8% más frecuente que el segundo.
Esta sería una situación intermedia entre lo que ocurre en las razas autóctonas españolas, en
las que el alelo ARQ es claramente el más frecuente (sobre un 70%) y las razas ovinas
explotadas en nuestro país pero no originarias de España (53,05% para ARR y 39,55% para
el ARQ). La frecuencia encontrada para los alelos ARH y AHQ es algo más elevada que las
253
observadas en otras razas explotadas en España, y la frecuencia del alelo VRQ resultó ser
considerablemente más baja en los animales analizados en este trabajo (Villalobos y Barba,
2003; Bouzada et al., 2004; Viana et al., 2004; Viana et al., 2005).
El alelo ARK ha sido encontrado en estudios llevados a cabo con ovinos de distintas zonas
del mundo, en Oklahoma (Desilva et al., 2003), en España (Acín et al., 2004), en Italia
(Acutis et al., 2004) o en Grecia, aunque la frecuencia del alelo ARK en estos estudios es
considerablemente menor al 4,1% encontrado en los animales de raza Assaf analizados.
Hasta el momento no se dispone de datos concluyentes en cuanto al grado de
susceptibilidad/resistencia de los animales portadores del alelo ARK frente a la
enfermedad. Por lo tanto, en el grupo de animales analizados en el presente trabajo se han
encontrado 107 animales (7,69% de los analizados), de los que no se dispone de
información real sobre el riesgo a padecer Scrapie.
Tabla 3. Frecuencia de los distintos grupos de riesgo en la raza ovina Assaf.
Grupos
R1
R2
R3
Genotipos
ARR/ARR
ARR/AHQ y AHQ/AHQ
ARR/ARH, ARR/ARQ y ARQ/AHQ
Nº animales
187
59
658
Proporción (%)
13,44
4,24
47,30
Susceptibilidad
Muy bajo riesgo
Bajo riesgo
Bajo riesgo
R4
AHQ/ARH, ARH/ARH, ARQ/ARH,
ARQ/ARQ AHQ/VRQ y ARR/VRQ
380
27,32
Riesgo ocasional
R5
ARQ/VRQ, ARH/VRQ y VRQ/VRQ
0
0,00
Alto riesgo
Sin Clasificar
ARK/ARK, ARR/ARK, ARQ/ARK,
AHQ/ARK, ARH/ARK
107
7,69
Desconocida
BIBLIOGRAFÍA
ACÍN, C., MARTÍN-BURRIEL, I., GOLDMANN, W., LYAHYAI, J., MONZÓN, M.,
BOLEA, R., SMITH, A., RODELLAR, C. BADIOLA, J.J. Y ZARAGOZA, P. (2004).
Prion protein gene polymorphisms in healty and scrapie-affected Spanish sheep. J. Gen.
Virology, 85: 2103-2110.
ACUTIS, P.L., SBAIZ, L., VERBURG, F., RIINA, M.V., RU, G., MODA, G.,
CARAMELLI, M. Y BOSSERS, A. (2004). Low frequency of the scrapie resistanceassociated allele and presence of lysine-171 allele of the prion protein gene in Italian
Biellese ovine breed. J. Gen. Virology, 85: 3165-3172.
BELT, P.B.G.M.; MUILEMAN, I.H.; SCHREUDER, B.E.C.; BOSDERUITJER, J.;
GIELKENS, A.L.J. Y SMITS, M.A. (1995). Identification of five allelic variants of the
sheep PrP gene and their association with natural scrapie. J. Gen. Virol., 76: 509-517.
BILLINIS, C., PSYCHAS, V., LEONTIDES, L., SPYROU, V., ARGYROUDIS, S.,
VLEMMAS, L., LEONTIDES, S., SKLAVIADIS Y PAPADOPOULUS, O. (2004). Prion
protein gene polymorphisms in healthy and scrapie-affected sheep in Greece. J. Gen.
Virology, 85: 547-554.
BOSSERS, A.; SHREUDER, B.E.C.; MUILEMAN, I.H.; BELT., P.B.G.M. Y SMITS,
M.A. (1996). PrP genotypes contribute to determining survival times of sheep with natural
scrapie. J. Gen. Virol., 77: 2669-2673.
254
BOUZADA, J.A., LUQUE, J., VEGA, M.O., DONADO-MAZARRÓN, M.E., GALLEGO,
R. Y PÉREZ GUZMÁN, M.D. (2004). Susceptibilidad genética al scrapie en las variedades
blanca y negra de la raza ovina Manchega. ITEA. 100A, 81-87.
CASTIGLIONI, B., COMINCINI, S., DRISALDI, B., MOTTA, T. Y FERRETI, L. (1998).
Comparative mapping of the prion gene (PRNP) locus in cattle, sheep and human with
PCR-generated probes. Mammalian Genome, 9: 853-855.
CLOUSCARD, C., BEAUDRY, P., ELSEN, J.M., MILAN, D., DUSSAUCY, M.,
BOUNNEAU, C., SCHELCHER, F., CHATELAIN, J., LAUNAY, J.M. Y LAPLANCHE,
J.L., (1995). Different allelic effects of the codons 136 and 171of the prion protein gene in
sheep with natural scrapie. J. Gen. Virol., 76: 2097-2101.
DAWSON, M.; HOINVILLE, B.; HOSIE, B.D. Y HUNTER, N. (1998). Guidance on the
use of PrP genotyping as an aid to the control of clinical scrapie. Vet. Rec. 142: 623-625.
GOLDMAN, W., BAYLIS, M., CHIHOTA, C., STEVENSON, E. Y HUNTER, N. (2005).
Frequencies of PrP gene haplotypes in British sheep flocks and the implications for
breeding programmes. Journal of Applied Microbiology, 98: 1294-1302
HUNTER, N. (1996). Genotyping and susceptibility of sheep to scrapie. En: Methods in
Molecular Medicine: Prion Diseases, 211-221. Ed. Baker, H., Ridley, R.M. y Totowa, N.J.:
Humana Press Inc
RUÍZ DE VILLALOBOS E. Y BARBA CAPOTE, C. (2003) Estudio de Genotipado de la
ganadería ovina española de selección en relación al Scrapie. FEAGAS, 24: 52-59.
SAUER, S., LECHNER, D., BERLIN, K., LEHRACH, H., ESCARY, J.L., FOX, N., Y
GUT G., (2000). A novel procedure for efficient genotyping of single nucleotide
polymorphisms. Nucleic Acids Res., 28: E13.
SYVANEN, A.C., 1999. From gels to chips: “minisequencing” primer extension analysis
of point mutations and single nucleotide polymorphism. Hum. Mutat., 13:1-10.
THORGEIRSDOTTIR, S., SIGURDARSON, S., VROMANS, M.E.W., LANGEVELD,
J.P.M. Y SMITS, M.A., (1999). PrP gene polymorphism and natural scrapie in Icelandic
sheep. J. Gen. Virol., 80: 2527-2534.
THORISSON, H.N., THORGEIRSDOTTIR, S. SIGURDARSON, S., GEORGSSON, G. Y
PALSDOTTIR, A., 1998. Two novel PrP allelic variants found in Icelandic sheep. Abs.
Simp. In Prion and Lentiviral Diseases. XIX Northern Lights Neuroscience Symposium,
96.
VIANA, J.L., BOUZADA, J.A., PRADO, C., ADÁN, S., FEIJOO, J.B., FERNÁNDEZ,
M., RIVERO, G. y FERNÁNDEZ, A. (2004). Aplicación del análisis de diferentes
marcadores moleculares en el plan de conservación de la raza ovina Ovella Galega. XXIX
Jornadas Científicas y VIII Internacionales de la Sociedad Española de Ovinotecnia y
Caprinotecnia, 374-375
M., RIVERO, G. y FERNÁNDEZ, A. (2005). Evaluación de posibles alternativas en el
programa de conservación de la raza ovina Ovella Galega para aumentar la resistencia
genética al scrapie. XXX Jornadas Científicas y IX Internacionales de la Sociedad Española
de Ovinotecnia y Caprinotecnia, 154-157.
ZHANG, L., LI, N., FAN, B., FANG, M. Y XU, W. (2004). PRNP polymorphism in
Chinese ovine, caprine and bovine breeds. Animal Genetics, 35: 457-461.
255
CONTROL GENEALÓGICO EN LAS ESPECIES OVINA Y CAPRINA
MEDIANTE ANÁLISIS DE MARCADORES MICROSATÉLITE DE ADN
SHEEP AND GOATS GENEALOGICAL CONTROL USING THE ANALYSIS OF DNA
MICROSATELLITE MARKERS
BOUZADA, J.A.; PORTELA, C.; PRADO, C.; AREÁN, H.; FERNÁNDEZ, M.;
FERNÁNDEZ, A. y VIANA, J.L.
Laboratorio de Xenética Molecular. Xenética Fontao S.A., Fontao-Esperante, Apdo 128.
27080 Lugo (España). [email protected] [email protected]
RESUMEN
Los actuales programas de mejora genética y conservación de razas en peligro de extinción
necesitan de métodos que permitan la identificación de los animales de manera precisa e
inequívoca, así como la correcta asignación de las relaciones de parentesco.
El laboratorio de Xenética Molecular de Xenética Fontao S.A. ha desarrollado un protocolo
de trabajo capaz de responder a estas necesidades, optimizando la metodología empleada
para conseguir una gran fiabilidad en los resultados obtenidos. Su base es el análisis de 14
marcadores microsatélite de ADN, que puede completarse con otros 6 adicionales para
resolver casos complejos. Estos marcadores han sido elegidos, respectivamente, de las listas
propuestas en los Tests de Comparación Internacional de ADN Ovino y Caprino 2003-04 y
2005-06 por la I.S.A.G. (Sociedad Internacional para la Genética Animal), de la cual este
laboratorio es miembro institucional (Código ISAG: E/X).
En este trabajo se describe la metodología empleada en el proceso de análisis, así como los
resultados obtenidos en varias razas ovinas y caprinas. La probabilidad de exclusión global
(PEG) resultó ser muy elevada para todas ellas, lo que permite realizar las asignaciones y
exclusiones de parentesco de una manera muy fiable.
PALABRAS CLAVE: mejora genética, microsatélites, probabilidad de exclusión, ISAG.
ABSTRACT
The current programs of genetic improvement and preservation of breeds in extinction
danger need methods for the accurate and unequivocal animal identification, as well as, the
correct assignment of parentage relations.
The Molecular Genetic Lab of Xenética Fontao, S.A. has developed a work protocol in
order to solve these needs, optimizing the applied methodology to obtain a great reliability
in their results. This methodology is based on the analysis of 14 DNA microsatellite loci,
which can be improved with six additional markers to solve complex cases. These markers
have been chosen, respectively, among the proposed lists in the 2003-04 and 2005-06 sheep
and goats DNA International Comparison Tests of I.S.A.G. (International Society for
Animal Genetics), of which our Lab is an Institutional Member (ISAG Code: E/X).
In this study, the methodology used in the analysis process is described, as well as the
obtained results for several sheep and goat breeds. The global exclusion probability (PGE)
was very high for all of them, which allows very reliable parentage assignments and
exclusions.
KEY WORDS: genetic improvement, microsatellites, exclusion probability, ISAG.
256
INTRODUCCIÓN
Una necesidad fundamental de los esquemas de selección y mejora genética o de
conservación de razas en peligro de extinción es disponer de un sistema preciso e
inequívoco de identificación de los animales, así como la correcta asignación de las
relaciones de parentesco. Esta necesidad es todavía mayor en el ganado ovino y caprino ya
que, aunque se empieza a utilizar inseminación artificial con sincronización de celos,
todavía es habitual el manejo en extensivo de rebaños de un número considerable de
animales con monta natural libre, utilizando un número elevado de sementales.
Consciente de ello, el laboratorio de Xenética Molecular de Xenética Fontao S.A. ha
diseñado un protocolo de trabajo para intentar cubrir estas necesidades, teniendo en cuenta,
además, que el coste debe ser asequible y los resultados deben estar disponibles en un corto
espacio de tiempo, siendo, además, totalmente repetibles en otros laboratorios que sigan la
nomenclatura de la ISAG (Sociedad Internacional para la Genética Animal), de la cual este
laboratorio es miembro institucional (Código ISAG: E/X). La base de esta metodología de
trabajo, tanto en ovinos como en caprinos, se asienta en el análisis de 14 marcadores
microsatélite de ADN elegidos de la lista propuesta por la I.S.A.G., en el Test de
Comparación Internacional de ADN Ovino y Caprino 2003-04. Recientemente, se han
puesto a punto seis nuevos marcadores (ILSTS08, ILSTS30, INRA006, McM42,
OarFCB11, TGLA53) propuestos también por la ISAG en el Test de Comparación
Internacional de ADN ovino y caprino 2005-06, lo que permitirá ampliar el número de loci
analizados en los casos donde no es posible excluir entre varios padres propuestos,
aumentando así la probabilidad de exclusión y, por lo tanto, la capacidad del test para
resolver casos de filiación complejos.
En el presente trabajo se presenta la metodología de trabajo llevada a cabo en este
laboratorio. Se muestran, además, los resultados obtenidos hasta estos momentos, después
de haber analizado la correspondiente lista de 14 marcadores microsatélite en 3385 caprinos
y 1956 ovinos de varias razas explotadas en la península Ibérica, también se indican las
condiciones laboratoriales de análisis óptimas y el software diseñado para agilizar la
obtención de los resultados.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material Biológico: Se han analizado un total de 5341 animales, 1956 pertenecientes a 4
razas ovinas y 3385 a 3 razas caprinas explotadas en la península Ibérica. Los animales
presentan amplia distribución de edades, pertenecen a ambos sexos y están inscritos en los
Libros Genealógicos de las correspondientes razas. Las muestras estuvieron constituidas,
mayoritariamente, por sangre entera y fueron recogidas en tubos estériles con
anticoagulante EDTAK3. Alguna de las asociaciones remitentes de muestras ha optado por
el envío de raíces de pelo o lana y, en algún caso, se han recibido muestras de suero
sanguíneo, semen o pabellón auditivo.
Extracción de ADN: Se llevó a cabo utilizando la 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied
Biosystems), siguiendo el protocolo de extracción BloodPrepTM Chemistry o NucPrepTM
Chemistry, según el tipo de muestra y usando los reactivos recomendados por el fabricante.
En el caso de muestras de sangre entera, previo a la extracción, estas se congelan a -80oC,
durante un mínimo de 10 minutos, para provocar la lisis celular y facilitar la liberación del
ADN. Posteriormente se incuban, a 58ºC durante 30 minutos, 50µl de la muestra añadiendo
257
15µl de Proteinasa K y 85µl de Buffer de Digestión. Tras la incubación se añaden 600µl de
Solución de Purificación, y se continúa con el protocolo de extracción, en el que se realizan
pasos consecutivos de purificación y lavado para eliminar los restos celulares, para acabar
recogiendo el ADN mediante dos soluciones de Elución.
Amplificación de secuencias: Se han diseñado dos reacciones de PCR multiplex, una para
caprinos y otra para ovinos en las que se amplifican simultáneamente 14 loci microsatélite
utilizando el Qiagen® Multiplex PCR kit suministrado por Qiagen® en un GeneAmp® PCR
system 9700 de Applied Biosystems. Los loci amplificados en caprinos son los siguientes:
BM1258, CSRD247, HSC, ILSTS19, ILSTS87, INRA005, INRA023, INRA063, MAF65,
McM527, OarFCB20, SRCRSP5, SRCRSP8 y SRCRSP23. En la PCR múltiplex de ovinos
se amplifican los loci: BM1258, CSRD247, HSC, INRA023, INRA063, MAF65, MAF214,
McM527, OarAE129, OarCP49, OarFCB20, OarFCB304, SPS113 y SPS115. Todos estos
marcadores han sido elegidos de la lista propuesta por la I.S.A.G. en el Test de
Comparación Internacional de ADN Ovino y Caprino 2003-04. Recientemente se ha puesto
a punto una nueva reacción de PCR múltiplex con 6 nuevos loci microsatélite (ILSTS08,
ILSTS030, INRA006, McM42, OarFCB11 y TGLA53), propuestos, en este caso, por la
ISAG en el Test de Comparación Internacional de ADN ovino y caprino 2005-06 y que
completa los anteriores paneles en los casos que sea necesario una mayor capacidad de
exclusión. Las condiciones de amplificación son las que se describen en
http://www.isag.org.uk/pdf/2005_PanelsMarkersSheepGoats.pdf.
Tabla 1: Marcadores microsatélite utilizados, marcaje empleado y rango alélico
encontrado.
Loci
INRA005
ILSTS19
CSRD247
SRCRSP23
ILSTS87
INRA063
HSC
BM1258
SRCRSP5
SRCRSP8
OarFCB20
MAF65
McM527
INRA023
Caprino
Marcaje
VIC
VIC
VIC
6-FAM
6-FAM
6-FAM
6-FAM
NED
NED
NED
PET
PET
PET
PET
Rango
113-123
142-154
216-240
77-107
133-151
169-181
270-298
96-124
163-181
212-244
93-107
117-141
152-170
195-215
Loci
OarCP49
OarFCB304
CSRD247
SPS113
INRA063
SPS115
HSC
BM1258
OarAE129
MAF214
OarFCB20
MAF65
McM527
INRA023
Ovino
Marcaje
VIC
VIC
VIC
6-FAM
6-FAM
6-FAM
6-FAM
NED
NED
NED
PET
PET
PET
PET
Rango
74-132
146-192
205-257
126-154
167-217
237-253
263-297
98-130
135-161
183-267
87-119
121-145
158-180
199-220
Loci
INRA006
ILSTS08
Panel Auxiliar
Marcaje
VIC
VIC
Rango
100-144
150-190
6-FAM
122-144
McM42
ILSTS30
NED
NED
70-100
140-180
TGLA53
PET
147-197
OarFCB11
Análisis de los polimorfismos: Se llevó a cabo mediante electroforesis capilar de
fragmentos de ADN marcados por fluorescencia, en el analizador genético ABI Prism®
3130xl Genetic Analyzer, empleando el software de análisis GeneMapper™ de Applied
Biosystems.
Base de datos: Las propuestas de análisis recibidas y los resultados obtenidos del análisis
de polimorfismos son, directamente, incorporados en una base de datos diseñada
específicamente donde se realizan de manera automática las exclusiones de paternidad. La
base de datos permite, además, la posibilidad de buscar posibles madres o padres
compatibles, además de los propuestos inicialmente por el ganadero. Esta búsqueda se
258
puede hacer entre todos los animales hembra o macho, según el caso, existentes en la base
de datos o limitando la búsqueda a solo animales pertenecientes a la misma ganadería.
Estudios estadísticos: Se estudiaron los siguientes parámetros de variabilidad:
Heterocigosidad (H) (Ott, 1992), Contenido de Información Polimórfica (PIC), calculado
según la fórmula de Botstein et al., (1980), Probabilidad de Exclusión de cada marcador
(PE) según la expresión propuesta por Jamieson y Taylor (1997) y global (PEG) del
conjunto de los 14 marcadores utilizados.
En las tablas 2 y 3 se presentan los resultados generales para cada uno de los 14 loci
microsatélite analizados en las especies caprina y ovina respectivamente. Se observa que,
en las dos especies, todos los marcadores elegidos presentan valores de PIC (Contenido en
Información Polimórfica) superiores a 0,5, lo que los hace altamente informativos.
Los 14 marcadores utilizados en la especie caprina presentan una probabilidad de exclusión
global (PEG) del 99,9989% (la mayor probabilidad de exclusión individual la proporciona
el SRCRSP23, microsatélite que a su vez presentó el mayor número de alelos, y la menor el
INRA005, que une a su bajo número de alelos al hecho de que uno de ellos presente una
frecuencia próxima al 60%). El número medio de alelos para las secuencias estudiadas es
de 10 (con unos valores que oscilan entre los 6 encontrados en el INRA005 y el ILSTS19 y
los 16 del SRCRSP23). Estos valores son superiores a los encontrados en trabajos
similares, aunque analizando un número menor de animales, realizados en algunas razas
caprinas explotadas en España. En ellos se citan números promedio de alelos de 6,95 en la
raza caprina Majorera (Acosta et al., 2005), de 8,22 en la Blanca Andaluza (Martínez et al.,
2004) o de 8,67 (Viana et al., 2004a), 8,32 (Martínez et al., 2005ª), o 9,79 (Bouzada et al.,
2005) en la Murciano-Granadina, utilizando paneles en los que se incluyen algunos de los
marcadores que se analizan en el presente estudio. Los valores encontrados son también
superiores a los publicados para 12 razas caprinas chinas (Li et al., 2002) con un promedio
de 6,90 alelos en cada una ellas.
259
Tabla 2. Resultados obtenidos en los loci microsatélite analizados en animales de raza
caprina
Locus
Nº de alelos
Rango
H
PIC
PE
BM1258
14
96-124
0,8286
0,8074
0,6628
CSRD247
7
216-240
0,7760
0,7413
0,5645
HSC
15
270-298
0,8886
0,8762
0,7723
ILSTS19
6
142-154
0,6367
0,6030
0,4205
ILSTS87
10
133-151
0,6734
0,6433
0,4685
INRA005
6
113-123
0,6067
0,5684
0,3832
INRA023
11
195-215
0,8364
0,8153
0,6721
INRA063
7
169-181
0,6733
0,6283
0,4348
MAF65
13
117-141
0,7809
0,7540
0,5959
McM527
8
152-170
0,6628
0,6109
0,4150
OarFCB20
7
93-107
0,5594
0,5251
0,3455
SRCRSP5
9
163-181
0,7513
0,7160
0,5390
SRCRSP8
11
212-244
0,6940
0,6528
0,4643
SRCRSP23
16
77-107
0,8801
0,8683
0,7584
Media:
10
0,73186
0,70072
PEG: 0,9999891
H: Heterocigosidad, PIC: Contenido de información polimórfica, PE: Probabilidad de
exclusión, PEG: Probabilidad de exclusión global.
260
Tabla 3. Resultados obtenidos en los loci microsatélite analizados en animales de raza
ovina
Locus
Nº de alelos
Rango
H
PIC
PE
BM1258
12
98-130
0,7725
0,7437
0,5778
CSRD247
20
205-257
0,8399
0,8234
0,6925
HSC
20
263-297
0,8675
0,8564
0,7452
INRA023
15
190-220
0,8577
0,8420
0,7160
INRA063
19
167-217
0,7819
0,7544
0,5933
MAF65
12
121-145
0,7665
0,7285
0,5463
MAF214
19
183-267
0,6976
0,6629
0,4834
McM527
12
158-180
0,8121
0,7861
0,6293
OarAE129
6
135-161
0,6575
0,5850
0,3674
OarCP49
25
74-132
0,8547
0,8402
0,7177
OarFCB20
13
87-119
0,8732
0,8598
0,7432
OarFCB304
25
146-192
0,8108
0,7918
0,6481
SPS113
12
126-154
0,7660
0,7307
0,5550
SPS115
13
237-253
0,8201
0,7957
0,6420
Media:
15,93
0,69629
0,67657
PEG:0,9999991
H: Heterocigosidad, PIC: Contenido de información polimórfica, PE: Probabilidad de
exclusión, PEG: Probabilidad de exclusión global.
En el caso de la especie ovina, los 14 marcadores utilizados proporcionan una probabilidad
de exclusión global del 99,9999% (la mayor probabilidad de exclusión individual la
proporciona el HSC y OarFCB20, microsatélites con un número de alelos próximo a la
261
media y la menor el OarAE129, que presenta solo 6 alelos). El grado de polimorfismo
encontrado en los loci analizados es elevado, con un número medio de alelos de 15,93 (los
valores oscilan entre los 6 encontrados en el OarAE129 y los 25 OarCP49 y OarFCB304).
En trabajos realizados en otras razas ovinas explotadas en España se han encontrado
números promedio de alelos de 7,04 en la raza ovina Palmera (Martínez el al., 2005b), de
13,64 en la Ovella Galega (Viana et al., 2004b) o de 8 en la raza Merina y 5,23 en la raza
Churra Lebrijana (Zamorano et al., 1998) utilizando varios de los marcadores empleados en
este estudio y analizando un número menor de individuos.
Los marcadores elegidos, tanto en el panel de caprinos, como en el de ovinos, presentan
una elevada capacidad de exclusión, lo que los hace muy útiles a la hora controlar las
genealogías en estas dos especies, algo fundamental en los esquemas tanto de selección y
mejora genética como de conservación de razas en peligro de extinción Los marcadores
utilizados (elegidos de las listas de la I.S.A.G.) presentan además la ventaja de que
permiten compartir y comparar los resultados obtenidos con los que se obtengan, para ésta
u otras razas ovinas y caprinas, en cualquier laboratorio I.S.A.G., que se haya sometido a
los Test de Comparación Internacional de Ovinos y Caprinos.
A pesar de la alta capacidad de exclusión que ofrecen los paneles propuestos para la especie
caprina y la ovina se han encontrado un reducido número de casos en los cuales no es
posible excluir entre dos o más posibles progenitores. Para poder resolver estos casos
hemos intentado aumentar la capacidad de exclusión con la puesta a punto de un panel
adicional con 6 marcadores microsatélite (ILSTS08, ILSTS030, INRA006, McM42,
OarFCB11 y TGLA53), elegidos de la lista propuestas por la ISAG en el Test de
Comparación Internacional de Ovinos y Caprinos del año 2005/06.
ACOSTA, J.M., MARTÍNEZ, A.M., PESTANO, J., CABELLO, A., BROWN, R.P.,
SARAH-REY, S. Y DELGADO, J.V. (2005). Caracterización genética de la cabra
Majorera de Fuerteventura con Microsatélites. Arch. Zootec., 54: 261-266.
BOTSTEIN, D., WHITE, M., SKOLNIK, M. Y DAWIS, R.W. (1980). Construction of a
genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American
Journal of Human Genetics, 32: 314-331.
BOUZADA, J.A., PRADO, C., AREÁN, H., MUÍÑO, R., LÓPEZ, M., FERNÁNDEZ, A.,
CANALS, A., CASTILLO, J. Y VIANA, J.L. (2005). Metodología analítica para el control
genealógico en la raza caprina Murciano-Granadina mediante análisis de microsatélites de
ADN. XXX Jornadas científicas y IX internacionales de la Sociedad Española de
Ovinotecnia y Caprinotecnia, 121-124.
JAMIESON, A. Y TAYLOR, ST.C.S. (1997). Comparisons of three probability formulae
for parentage exclusion. Animal Genetics, 28:387-400.
LI, M., ZHAO, S., BIAN, C., WANG, H., WEI, H., LIU, B., YU, M., FAN, B., CHEN, S.,
ZHU, M., LI, S., XIONG, T. Y LI, K. (2002). Genetic relationships among twelve Chinese
indigenous goat populations based on microsatellite analysis. Genet. Sel. Evol., 34: 729744.
262
MARTÍNEZ, A.M., CARRERA, M.P., ACOSTA, J.M., RODRÍGUEZ-GALLLARDO,
P.P., CABELLO, A., CAMACHO, E. Y DELGADO, J.V. (2004). Análisis molecular de la
cabra Blanca Andaluza. Arch. Zootec., 53: 221-224.
MARTÍNEZ, A.M., VEGA-PLA, J.L., LOZANO, J.M., CARRERA, M.P., ACOSTA,
J.M., Y CABELLO, A. (2005a). Caracterización genética de la cabra Murciano-Granadina
con microsatélites. Arch. Zootec., 54: 327-331.
MARTÍNEZ, A.M., VEGA-PLA, J.L., BRAVO, M.J., BARBA, C., CARABALLO, J. Y
DELGADO, J.V. (2005b). Caracterización genética de la oveja Palmera con microsatélites.
Arch. Zootec., 54: 363-367.
OTT, J. (1992). Strategies for characterizing highly polymorphic markers in human gene
mapping. Am. J. Hum. Gen., 51: 283-290.
VIANA, J.L., BOUZADA, J.A., PRADO, C., AREÁN, H., MUIÑO, R., LÓPEZ, M.,
CANALS, A., CASTILLO, J. y FERNÁNDEZ, A. (2004a). Control genealógico en la raza
caprina Murciano-Granadina mediante análisis de microsatélites de ADN. IV Congreso
ibérico sobre recursos genéticos animales.
M., RIVERO, G. y FERNÁNDEZ, A. (2004b). Aplicación del análisis de diferentes
marcadores moleculares en el plan de conservación de la raza ovina Ovella Galega. XXIX
Jornadas científicas y VIII internacionales de la Sociedad Española de Ovinotecnia y
Caprinotecnia, 374-375.
ZAMORANO, M.J., RUITER, J., TOWNSEND, S., CRUICKSHANK, R., BRUFORD,
M., BYRME, K., RODERO, A. Y VEGA-PLA, J.L. (1998). Polimorfismos de DNA en las
razas ovinas Merino y Churra Lebrijana. Arch. Zootec. 47: 267-272.
263
SUPEROVULATION RESPONSE AND EMBRYO RECOVERY OF DONOR DOES
BOER RACE IN EMBRYOTRANSFER PROCEDURES
GRIZELJ, J.¹, VINCE, S.¹, TOMAŠKOVIĆ, A.¹, BARIL, G.², MAKEK, Z.¹, GETZ, I.¹,
ðURIČIĆ, D.³, PRVANOVIĆ, N.¹, SAMARDŽIJA, M.¹
¹Clinic for obstetrics and reproduccion, Veterinary College, University of Zagreb,
Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, Croatia
²INRA Tours, 37 380 Nouzilly, France
³Veterinary Practice ðurñevac d.o.o., Malinov trg 7, 48 350 ðurñevac, Croatia
KEY WORDS: goat, embryo, superovulation, collection
ABSTRACT
This article examined the technique of in vivo production of goat embryos as well as the
obstacles associated with those procedures. The goal of a superovulation treatement is to
increase the genetic influence of valuable does by the system «mother-daughter». This
treatement reduces the transporting costs of genetic material, quarantine and the risk of
disease transmission (1). The techniques of superovulation as well as the transfer of
embryos should significantly contribute to the build-up of the genetically superior flocks.
Although, only a small number of does were treated, this technique along with the freezing
and transferring of obtained embryos should contribute significantly to the genetic
improvement of the flocks. These can be applied in the near future due to commerical and
sanitary reasons and should encourage further studies.
INTRODUCTION
The basic goal of a superovulation treatement to donor does and thereafter the transfer at
the preimplant stage of the embryo into the previously prepared recipient is to increase the
genetic influence of valuble does by the system «mother-daughter» as one doe, in the
traditional system of husbandry, kid only 2 goatlings per year, all together 6 or 8 during
whole life.
Although, the procedures of transfer are less developed and much less practiced than in the
cow industry, this possibility considerably reduces the costs of (international) transport of
genetic material, quarantine, the sanitary risk of disease transmission, and particularly the
problems of aclimatization (climatic, alimentary and sanitary) (2). It is established that the
embryos in the morula and blastocyst stage contain zona pellucida which presents the
natural barrier for disease transmission (2). The techniques of superovulation as well as the
transfer of embryos should significantly contribute to the building-up of the genetically
superior flocks of goats with controlled disease transmission.
PREPARATION OF DONOR DOES
Boer does were superovulated with the following procedure:
Day 0 (D0) - donor does were hormonally treated by inserting the vaginal sponges (chronogest, 40mg of cronolone - flugestone acetate) with steroid progestative action through 11
days.
D9 start of superovulation pFSH treatement i/m in decreasing doses.
264
For pFSH treatement 200mg of Folltropin – V (Vetrepharm, Canada) was used for each doe
and divided into 6 parts in decreasing concentration and applied at 12 hours
intervals. Thus, doses were 2 times 50mg pFSH for the D9 and 2 times 25mg for the D10
and D11 as well.
At the same time with the first application of pFSH (D9), 50µg of cloprostenol (0,2mL
Estrumate) was applied as well.
As alternative to Folltropine – V it is possible to use Stimufol (Merial, France) which
contains 40% of LH action. Folltropin – V is a purified porcine FSH with a very low
content of LH.
D12 (D0) detection of oestrus 24 hours after removing the vaginal sponges. Does are
«hand-mated» (presented one by one to the buck) if the he-goat was accepted. If rejection
occurs, hand-mating is attempted every 4 hours for the does not observed in oestrus earlier.
The next morning (D13) hand mating is repeated if doe is still in oestrus.
COLLECTION OF EMBRYOS
7 days after the first mating (D7) laparotomyc lavage of the uterus is performed.
Donor does are subjected to an alimentar and hydric diet 24h before the collection.
The anesthetic procedure is performed by application of xylazine 0,11mg/kg i/m; 10min
later ketamine 5,5mg/kg i/m.
Donor does are positioned in dorsal recumbent, inclinated anteroposterior from 30 to 45º,
medioventral laparotomy is performed with a 10cm incision. The uterus and ovaries are
exteriorised, the number of corpora lutea is counted and punction of the basis (at the level
of the lig. intercornualis) and tip of the horn (close to the junction utero-tubarica) is
performed. The lavage of each horn is performed by retrograde perfusion of 40mL of PBS
+ 2g/L BSA + 50mg/L Kanamycin. During the lavage, the horn is slightly massaged. The
obtained liquid is searched, thereafter, the embryos are evaluated and then transfered into
the prepared recipient does or freezed.
RESULTS
Our research was carried out as a part of a pilot project of cryopreservation of goat
embryos. Three goats and one buck Boer race were included.
Goats responded with 16 ovulations on average, and the success of lavages were 89,6%
(43/48CL).
One out of three goats suffered early luteolysis, although the vaginal sponge were inserted 3
days after the occurence of oestrus. Nevertheless 4 retarded morulas and 15 unfertilized
ovocytes were found.
From the other two goats 24 embryos were recovered (13 morulas, 3 early blastocysts, 2
blastocysts, 5 expanded blastocysts and 1 hatched blastocyst), all transferable.
IMPORTANT FACTORS
The first ovulations occure 62±6h after removing the sponge, and about 12h elapse between
the first and the last ovulation (3).
The embryos enter uterus from the 4th day and onward (2). The legislation requirements
due to sanitary reasons are to transfer the embryos before the hatching, which occurs from
265
the 8th day onward (2). When freezing the goat embryos, it is recommended to lavage the
uterus on the 7th day because the blastocysts (and morulas) support the procedure well (4).
With this treatment, does will, on average, have 14 ovulations (from 0 to 40) of which 11
will be fertilized, 7 will be transferable, and finally 4 goatlings delivered, if transfer is
performed immediately or 3 if the embryos are freezed before being transfered (1).
Also to be considered is the occurence of partial or total early luteolysis of corpora lutea in
10-35% of does (1), which as a consequence has a big percentage of retarded and
degenerated, non - transferable embryos. Sometimes the consequences of that phenomenon
could be minimized by insertion of vaginal sponges 2,5 or 3 days after the occurence of
oestrus (D3) and maintained till the moment of lavage.
On the other hand, induction of superovulation by pFSH treatement will, after the 3rd or 4th
treatement, evoke a decreased ovulatory response because of the occurence of anti pFSH
antibodies in 70-80% of does (2).
Nevertheless, repetitive use of oFSH will not provoke a decreased ovulatory response, but,
commercially available oFSH (Ovagen, ICP, New Zealand) has a great variability among
different lots.
Consecutive lavages of uterus are less successful because of growths that appeared in the
uterus and on the ovaries which compromise the fertility and the success of lavage (3). The
next treatement should be performed after a minimum of 2 months; or 5 months, if kidding
has ocurred (2).
Although, only a small number of does were treated, this technique along with the freezing
and transfering of obtained embryos should contribute significantly to the genetic
improvement of flocks and would have commercial and sanitary reasons for application in
the near future and should encourage further studies.
REFERENCES
Chemineau P, Baril G, Leboeuf B, et al. Implications des progres recents en physiologie de
la reproduction pour la conduite de la reproduction dans l'espece caprine. INRA
Prod.Anim. 1999; 12(2): 135-146.
Baril G, Brebion P, Chesne P. Manual de formacion practica para el transplante de
embriones en ovejas y cabras. Cuadernos tecnicos de la FAO. Estudios FAO: Produccion y
sanidad animal. Rome, Italy, 1995
Cognie Y, Baril G. Le point sur la production et le transfert d'embryons obtenus in vivo et
in vitro chez la brebis et la chevre. INRA Prod.Anim. 2002; 15(3): 199-207.
Cognie Y, Baril G, Poulin N, et al. Current status of embryo technologies in sheep and goat.
Theriogenology. 2003; 59: 171-188.
Grizelj, J., Vince, S., Tomašković, A., et al. Hormonal treatements of donor does in
embryotransfer procedures. Proceedings 7th Middle European Buiatric Congress, Radenci,
Slovenia, 23-25.
266
FUNCIÓN DE LAS GLICOPROTEÍNAS ASOCIADAS A LA GESTACIÓN (PAGs)
Y PROGESTERONA EN DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LA GESTACIÓN Y
MORTALIDAD EMBRIONARIA PRECOZ EN VACAS
ROLE OF PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEINS (PAG) AND
PROGESTERONE IN EARLY PREGNANCY DIAGNOSIS AND EARLY EMBRIONIC
MORTALITY IN COWS
PRVANOVIC, N.¹*, BECKERS, J.F.², SULON, J.², TOMASKOVIC, A.¹, CERGOLJ, M.¹,
DOBRANIC, T.¹, GRIZELJ, J.¹, SAMARDZIJA, M.¹, KOCILA, P.³
¹Clinic for obstetrics and reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of
Zagreb, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Croatia
²Department of Animal Endocrinology and Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Liege, Belgium
³Veterinary Practice Cakovec, R. Steinera 7, 40000 Cakovec, Croatia
*contact person. Email: [email protected], Tel: 385 1 2390 323, Fax: 385 1 2390 320
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate the role of pregnancy associated
glycoproteins (PAG) and progesterone in early pregnancy physiology in cows as well as
possibility of using PAG as diagnostic tool in diagnosis of embrionic mortality.
In our research we used 74 cows of simmental breed aged 3-7 years, already used
in reproduction and calved every year. We divided cows in 3 groups: pregnant cows
(n=30), nonpregnant cows (n=20) and cows experienced embrionic mortality (n=24).
According to ultrasound (17 and 35 days after AI) and laboratory findings for progesteron
and PAG in sera samples collected between 12. and 45. days after AI every 72 h, we
concluded:
It is impossible to determine embrionic mortality on basis of progesterone profil,
but it is easy to distinguish pregnant from nonpregnant cows, if cows are supposed to be
pregnant more than 21 day.
In group of cows with embryonic mortality, it occured 17-24 days after conception
in 98% cows. It was visible in drastic decrease of PAG 7,5-9 days later (7,5-9 days consists
T2 for PAG in first month of pregnancy). Using PAG for pregnancy diagnosis enables us to
prove existence of alive vital embryo in uterus 24 days after conception.
RESUMEN
Este artículo examina la función de las glicoproteínas asociadas a la gestación (PAGs) y
progesterona en fisiología precoz de la gestación en vacas. También trata la posibilidad de
utilizar PAGs como herramienta de diagnóstico en la mortalidad embrionaria precoz.
Nuestra investigación incluyó 74 vacas Simenthal, de 3-7 años de edad, ya utilizadas en
reproducción y paridas cada año. Las vacas fueron divididas en 3 grupos: vacas gravidas
(n=30), vacas no gravidas (n=20) y vacas que sufrieron mortalidad embrionaria precoz
(n=24). Según los resultados de las pruebas de ultrasonido (17 y 35 días después del IA) y
de las comprobaciones en laboratorio de cada 3 días de suero para progesterona y PAGs
(entre 12 y 45 días después del IA) concluimos:
267
Es imposible determinar la mortalidad embrionaria precoz solamente con un perfil
de progesterona. En cambio, es fácil distinguir vacas gravidas de las que no lo están, si la
gestación dura más de 21 días.
En el tercer grupo de vacas, la mortalidad embrionaria precoz se dio en el 98% de
los casos entre 17-24 días después de la concepción. Se dio una visible disminución drástica
de PAGs 7,5-9 días después (T2 de PAGs en el primer mes de gestación son 7,5-9 días).
El uso de PAGs como diagnóstico de gestación nos permite mostrar la existencia
de un embrión vivo y vital 24 días después de la concepción.
INTRODUCTION
Pregnancy associated glycoprotein has been found in the serum of pregnant cattle and used
as a pregnancy marker (Perenyi, 2002). As pregnancy failure occurs, PAG concentrations
dropped and disappeared from maternal blood. Sequential assays of these proteins between
day 24 and term are useful for studying the course of pregnancy, although it does not allow
discrimination between early embryonic mortality and non-fertilization (Mialon et al.,
1993). As PAG molecules are the products of the trophoblastic cells, it was suggested that
their determination in maternal blood can be useful for prediction of fetal well-being and
help to detect early placental abnormalities, embryonic mortality or abortion (Ectors et al.,
1996.). Heifers expressing pregnancy failure between days 16 and 35 after AI have shown
wide variation in pregnancy specific protein 60 (PSP60) concentrations at days 28 and 35.
This phenomenon was explained by the variation in the time of embryo death (Mialon et
al., 1993). This author reported some cases where at day 50 ultrasonic scanning and signs
of oestrus indicated that the embryo was already dead, however till this day the PSP60
concentrations were increasing. Decreasing PSP60 concentrations were observed in some
animals before day 50, were according to ultrasonic examination, the conceptus was still
alive.
Pregnancy specific protein B ( BPSPB) test in conjunction with milk progesterone test was
used to determine the time of the embryonic death (Humblot et al., 1988). In most of the
early failures an elevation in the PSPB concentrations was not detectable, or only after day
24. No coefficient of correlation between PSPB and progesterone concentration was
significant at any days of gestation studied. Significant difference was found in the rate of
mean PSPB levels between pregnant cows and cows showing late embryonic mortality
between days 24 and 30-35 after AI. In their study it was not possible to predict the
occurrence of embryonic mortality.
After invitro production of embryos or cloning, the PAG follow up in plasma samples
collected weekly was able to monitor embryonic or fetal mortality (Ectors et al., 1996,
1997). In that studies it was concluded that significantly increased PSP60 levels could
indicate abnormal placental development.
In veterinary practice, PAG and PSPB RIAs in biological fluids are helpful to confirm
clinical diagnoses established by ultrasonography (Szenci et al., 1998.) Cows presenting an
initial positive and then negative ultrasonographic diagnosis expressed decreasing PAG
concentrations (Szenci et al., 1998) The high progesterone and PAG concentrations
confirmed the presence of a live conceptus ansd a functional corpus luteum at the time of
the first ultrasonographic examination. After the time of embryonic mortality occurred, the
PAG levels had already decreased, while progesterone concentrations have shown that the
268
corpus luteum was maintained in three of four cases. Following embryonic mortality using
ultrasonography, PAG and PSPB concentrations decreased steadily, in one animal these
protein concentrations did not reach the threshold level (Szenci et al., 1998). Mentioned
authors were able to diagnose late embryonic and fetal mortality cases retrospectively in
seven cows using PSPB RIA test and in four cows using PAG RIA test (Szenci et al.,
2000).
Because of the large individual variations in PAG concentrations in maternal blood, only
the marked decrease or disappearance in serum/plasma concentrations of these proteins can
be a no controversial, predictive sign of embryonic or fetal death.
Our research included 74 simmental cows, 3-7 years old, which were regularly used in
reproduction and calved every year. According to ultrasound findings (17. and 35. day
after artificial insemination; AI) the cows were divided in 3 groups: pregnant cows (n=30),
nonpregnant cows (n=20) and cows suffered embryonic mortality (n=24). Cows which
were suspect to be pregnant by both examinations were divided into pregnant group. Cows
who were considered to be pregnant according to first ultrasound finding and nonpregnant
according to the last were divided into embryonic mortality group. Cows considered to be
nonpregnant by both ultrasound findings were divided into nonpregnant group. Blood
samples were collected every 72 hours between 12. and 45. day after AI and level of
progesterone and pregnancy associated glycoproteins (PAG) were determined. We used
double RIA assay to determine level of PAG according to method described by Zoli (1992)
and modified by Beckers (1995). Sensitivity and specificity of method consisted 80%.
Level of progesterone was determined using ELISA method and Ovuchek commercial kits
(Biomedica). Sensitivity and specificity of method consisted 86%.
RESULTS
Table 1: Middle values for PAG level in blood from day 12 till day 45 after AI every 72 h
for all groups
Number of sampling
1
2
3
4
5
Pregnant cows
0,894656
1,453688
2,103688
2,700969
3,520063
Embryonic mortality
1,115524
0,905095
0,577143
0,41981
0,405
Nonpregnant cows
0,011167
0,019889
0,006222
0
0
269
Kretanje koncentracije PAG od 24. do 45. dana nakon UO za
sve skupine krava
4
ng/ml
3
gravidne krave
2
embrionalna smrtnost
negravidne krave
1
0
1
2
3
4
5
broj uzorka
Table 2: Middle values for progesterone level in blood at day 12., 21. and 35 after AI
Number of sampling
1
2
3
Pregnant cows
6,379625
7,587156
8,869406
Embryonic mortality
1,115524
0,905095
0,577143
Nonpregnant cows
3,761444
1,019222
4,108048
Razina progesterona u svih skupina krava 15., 21. i 35. dan nakon
UO
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
gravidne krave
embrionalna smrtnost
negravidne krave
1
2
3
CONCLUSIONS
According to ultrasound (17 and 35 days after AI) and laboratory findings for
progesteron and PAG in sera samples collected between 12. and 45. days after AI every 72
h, we concluded:
It is impossible to determine embrionic mortality on basis of progesterone profil,
but it is easy to distinguish pregnant from nonpregnant cows, if cows are supposed to be
pregnant more than 21 day.
In group of cows with embryonic mortality, it occured 17-24 days after conception
in 98% cows. It was visible in drastic decrease of PAG 7,5-9 days later (7,5-9 days consists
T2 for PAG in first month of pregnancy). Using PAG for pregnancy diagnosis enables us to
prove existence of alive vital embryo in uterus 24 days after conception.
270
REFERENCES
Ectors FJ, Drion PV, Delval A, Smith LC, Sulon J, Zaaier D, Szenci O, Remy B, Beckers
JF, Ectors F (1996): Interests of pregnancy follow up in cows after embryo transfer special
focusing on IVP/NT origin; 12th Annual Meeting of AETE, Proceedings, pp 95-102
Ectors FJ; Sulon J, Delval A, Remy B, Drion PV, Beckers JF, (1997): Bovine pregnancy
associated glycoprotein profiles as indicators of trophoblastic function after invitro
manipulation or culture; 30th Conference of Physiology and Pathology of reproduction
32:pp1-13
Humblot P, Camous S, Martal J, Charlery J, Jeanguyot N, Thibier M, Sasser RG (1988):
Pregnancy specific protein B, progesterone concentrations and embryonic mortality during
early pregnancy in dairy cows, J. Reprod. Fertil. 83 (1): 215-223
Mialon MM, Renand G, Camous S., Martal J, Menissier F, (1994): Detection of pregnancy
by radioimunoassay of a pregnancy serum protein (PSP60) in cattle; Reprod. Fertil. Dev. 34
pp 65-72
Perenyi F (2003): RIA double antibody assay: purification, isolation and application of
PAG, doktorska disertacija, Sveučilište u Liege-u
Szenci O, JF Beckers, Sulon J, Sasser RG, Taverne MAM, Varga J, Baltusen R, Schekk Gy
(1998): Comparison of ultrasonography , bovine pregnancy specific protein B and and
bovine pregnancy associated glycoprotein ! test for pregnancy detection in dairy cows,
Theriogenology, 50 (1) pp 77-88
Szenci O, Humblot P, Beckers JF, Sasser G, Sulon J, Baltusen R, Varga J, Bajszi CS,
Taverne MAM, (2000) Plasma profiles of progesterone and conceptus proteins in cows
with spontaneus embryonic/fetal mortality as diagnosed by ultrasonography, The
Veterinary Journal, 159 pp 287-290
271
EFFETTO DEL MOMENTO DEL PARTO SULLA RIPRESA DELL’ATTIVITÀ
RIPRODUTTIVA IN PECORE DI RAZZA SARDA
EFFECT OF LAMBING DATE ON RESUMPTION OF REPRODUCTIVE ACTIVITY IN
SARDA EWE
CARCANGIU V., VACCA G.M., MURA M.C., MARCHI B., FALCHI L., BINI P.P.
Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Studi di Sassari
KEY WORDS: Sheep, reproduction activity, lactation
ABSTRACT
With the aim of evaluate the effect of lambing date on the resumption of reproductive
activity, induced by male effect, 100 pluriparous Sarda ewes were examinated. The animals
were divided in 5 groups, with 20 subject each, from A to E, depending on lambing month,
from December to April. On 1st of June males were introduced, and every week for 8
consecutive weeks, a blood sample was taken for measuring progesterone levels with
ELISA method. The 80% of the ewes who lambed in December, January and February
(groups A, B and C) has shown the reproductive activity within the first month after males
introduction. The 35% of the ewe who lambed in March has shown sexual activity at 42nd
day, while the 80% has been reached only at 49 days after observations started. Among the
animals of the E group only 40% showed reproductive activity within 56th day. Confronting
all groups it has been evidenced a statistically significant difference (P<0.01) among the
animals who lambed from December to February and those who lambed in the subsequent
months.
INTRODUZIONE
L’attività riproduttiva degli ovini presenta un andamento stagionale fortemente legato
all’evoluzione del fotoperiodo (Thiéry et al., 2002). Infatti la diminuzione delle ore di luce
determina la ripresa dell’attività sessuale e questo fa si che il parto avvenga in Primavera,
momento più propizio per la crescita dell’agnello (Bittman et al., 1983; Chemineau et al.,
1988). Questo legame dell’attività riproduttiva con l’alternanza luce/buio è molto manifesto
nelle razze che vivono ad alte latitudini dove il clima è molto rigido e la durata della
stagione temperata è alquanto modesta e quindi il parto deve avvenire in un arco di tempo
abbastanza stretto per consentire la sopravvivenza della prole (Malpaux et al., 2001). Nelle
aree Mediterranee, invece, essendo il clima abbastanza temperato, il legame con il
fotoperiodo è meno stretto e perciò il periodo delle manifestazioni riproduttive è
considerevolmente più lungo. Di conseguenza l’anaestro ha una durata di circa 300 giorni
in alcune razze di ovini che vivono in vicinanza dei poli, mentre in quelle residenti alle
nostre latitudini tale periodo ha la durata di circa 50 giorni (Chemineau et al., 1995). Questo
stadio di riposo sessuale è contraddistinto nelle pecore da una diminuzione della secrezione
delle gonadotropine ipofisarie, che appunto non sono in grado di stimolare il ciclo ovarico,
e dalla mancanza del comportamento riproduttivo. Tuttavia, nelle razze ovine da latte, come
quella Sarda, il parto in Primavera non consente un lungo periodo di lattazione per
l’innalzamento estivo della temperatura ambientale. Questo fatto, oltre a determinare la
scomparsa dell’erba verde naturale, e quindi lo scadimento del pascolo, causa anche una
riduzione del metabolismo per motivi di termoregolazione, conducendo la pecora
272
all’asciutta. Quindi, il periodo migliore per poter avere i parti è l’Autunno quando appunto
le condizioni climatiche e di pascolo sono favorevoli per l’instaurarsi della lattazione.
Infatti, nell’allevamento ovino sardo, attraverso l’utilizzo del flushing in combinazione con
l’effetto maschio, si è riusciti ad ottenere un alto numero di animali che partoriscono tra
Settembre e Dicembre e perciò poco sensibili al fotoperiodo (Carcangiu e Vacca, 2005).
Tuttavia, un certo numero di animali presentano l’attività riproduttiva tra i mesi di
Settembre e Novembre con i parti in Primavera. Questo comportamento oltre che ridurre i
mesi di produzione lattea potrebbe condurre anche ad un ritardo nella ripresa dell’attività
ciclica determinato dalla fase crescente della lattazione. Pertanto, lo scopo del presente
studio è quello di verificare quanto il momento del parto può influenzare la ripresa
dell’attività riproduttiva, indotta con l’effetto maschio, in pecore di razza Sarda.
MATERIALI E METODI
La ricerca è stata condotta in un allevamento di circa 600 ovini di razza Sarda situato nel
centro Sardegna. L’azienda di tipo moderno, con diversi stabili e attrezzature di alto livello
tecnologico, aveva una estensione di circa 50 ha dei quali 10 irrigui. Gli animali venivano
alimentati con circa 400 g di mangime concentrato che conteneva il 16 % di proteine e 10,5
MJ di energia metabolizzabile per Kg di sostanza secca, suddiviso in due somministrazioni
giornaliere; il fieno e l’acqua erano ad libitum. Durante il giorno le pecore andavano al
pascolo su erbaio polifitico. Per lo studio sono state scelte 100 pecore pluripare che
venivano identificate al momento del parto con un collare numerato e attraverso il numero
tatuato sull’orecchio. Gli animali sono stati suddivisi in 5 Gruppi di 20 soggetti ciascuno in
base al mese di parto: gruppo A con parto a Dicembre, gruppo B a Gennaio; gruppo C a
Febbraio; gruppo D a Marzo e il Gruppo E ad Aprile. Gli agnelli sono stati allontanati dalle
madri dopo 20 giorni dalla nascita. Il primo di Giugno sono stati inseriti i maschi, di
provata fertilità, nel gregge e registrati gli accoppiamenti. A partire dal 1° di Giugno e fino
al 26 Luglio, a cadenza settimanale sono stati eseguiti prelievi ematici per il dosaggio del
progesterone. Inoltre, veniva registrato il BCS e le produzioni di ogni animale all’inizio
dell’osservazione. Le pecore avevano partorito regolarmente e durante il periodo della
prova si sono mantenute in ottimo stato di salute. Il progesterone è stato analizzato con
metodica ELISA (assay design, Michigan , USA). I dati ottenuti sono stati sottoposti ad
analisi statistica.
La ripresa dell’attività riproduttiva delle pecore del gruppo A, B, C, si è manifestata già dal
secondo rilievo, e perciò a 7 giorni dall’inizio della prova, raggiungendo l’80% degli
animali ciclici a 28 giorni (Tabella 1). In questi tre gruppi la totalità degli animali si è
riprodotta entro i 40 giorni dall’inizio delle osservazioni.
Il gruppo D, invece, ha presentato la ripresa dell’attività riproduttiva a 28 giorni dall’inizio
delle osservazioni e alla fine delle osservazioni il 90 % aveva manifestato il ciclo sessuale.
Il gruppo E è risultato quello che ha presentato le manifestazioni riproduttive più in ritardo,
intorno al 35° giorno dall’inizio della prova. Inoltre, al 56° giorno solo il 40% delle pecore
sono risultate cicliche.
273
Tabella 1 – Numero di animali che presentavano l’inizio dell’attività riproduttiva,
determinata attraverso il dosaggio del progesterone, per ciascun prelievo.
Animali ciclici per prelievo
Gruppi
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
A
1
6
3
3
2
3
2
B
0
6
5
3
2
2
2
C
0
5
5
4
2
3
1
D
0
0
0
0
2
2
3
9
2
E
0
0
0
0
0
1
2
2
3
C
50
B
45
40
35
G
io
rn
i
30
25
A
A
A
Gruppo A
Gruppo B
Gruppo C
20
15
10
5
0
Gruppo D
Gruppo E
Grafico 1 – Distanza media in giorni dell’inizio dell’attività riproduttiva nei cinque gruppi
in osservazione (A, B, C = P<0,01)
La distanza media in giorni dell’inizio dell’attività riproduttiva è risultata più bassa nei
gruppi A, B, C, rispetto agli altri due gruppi (P<0,01). Inoltre,il gruppo D ha mostrato una
ripresa dell’attività riproduttiva prima del gruppo E (Grafico 1) (P<0,01). Il BCS degli
animali non ha mostrato nessuna differenza tra i gruppi, invece le produzioni iniziali sono
risultate differenti tra i primi tre gruppi ( 800 g/die a capo) e i gruppi D (1100 g/die a capo)
ed E (1230 g/die capo) (P<0,01).
L’attività riproduttiva dei diversi gruppi è stata condizionata dal periodo del parto, infatti,
gli animali che avevano partorito nel mese di Aprile hanno presentato una ripresa
dell’attività sessuale più tardivamente rispetto agli altri. Tale comportamento potrebbe
essere determinato dall’intervento di diversi fattori come il fotoperiodo, l’alimentazione, il
BCS, la fase di lattazione o altre cause ambientali che possono influenzare la ripresa
dell’attività sessuale, agendo sul sistema ipotalamo-ipofisi-gonade (I’Anson et al., 1991;
Rosa e Bryant, 2003). Tuttavia, nel presente studio il fotoperiodo era identico per tutti gli
274
animali e quindi questo fattore non può essere considerato determinante non avendo
esercitato alcuna inibizione sull’attività riproduttiva. Anche nei gruppi D ed E, nonostante
la riproduzione sia iniziata dopo il solstizio estivo, è difficile attribuire un preciso effetto al
fotoperiodo, in quanto la diminuzione delle ore di luce è stata alquanto esigua e non
sufficiente a modificare la secrezione delle gonadotropine. Bisogna comunque ricordare che
il fotoperiodo estivo e pertanto il passaggio dai giorni lunghi a quelli corti, ha una
importanza notevole in quanto ha la funzione di scandire la stagionalità riproduttiva negli
ovini (Barrell et al., 2000). L’alimentazione è un altro fattore che assume una notevole
importanza nel regolare l’attività riproduttiva, infatti, animali sottoalimentati o con un
insufficiente introduzione di energia manifestano un blocco dell’attività riproduttiva
attraverso la diminuzione della secrezione di LH (I’Anson et al., 2000). Inoltre gli effetti di
un bilancio energetico negativo agiscono a livello ipotalamico-pituitario sul controllo della
riproduzione alterando la liberazione pulsatile di GnRH,l’ovulazione e l’estro (Scaramuzzi
et al. 2006). Tuttavia gli animali utilizzati nel presente studio sono stati alimentati tutti in
maniera uguale ed il tipo di alimentazione, a giudicare dal BCS rilevato, era adeguata. Di
conseguenza si può escludere questo fattore come causa del ritardo nella ripresa dell’attività
riproduttiva nei gruppi D ed E. Tra i fattori considerati rimane da prendere in esame il
periodo di lattazione: potrebbe essere stata tale fase fisiologica a modificare la risposta
all’effetto maschio delle pecore del gruppo D ed E. Infatti la lattazione è uno stadio
fisiologico che richiede una notevole quantità di energia per la sua espletazione e questo
fatto potrebbe avere causato il rallentamento nella ripresa dell’attività ciclica dei 2 gruppi di
pecore che sono risultati scarsamente stimolati dall’effetto maschio. Tale comportamento si
accorda con quanto rilevato da altri AA che osservarono che l’allattamento o l’inizio della
lattazione determinavano una inibizione sull’attività ovarica nelle pecore. Infatti, l’anestro
da lattazione assicura che la domanda energetica per la sintesi del latte non interferisca con
l’energia necessaria per la crescita embrionale o per l’attività ovarica (Abi Salloum e Claus,
2005; Boquier et al., 1993). Un possibile effetto della suzione è ancora oggetto di
controverse discussioni; in passato è stato dimostrato che questo stimolo porta ad un
aumento del livello ematico di β endorfine che agiscono inibendo la secrezione di LH ed
FSH (Gordon e Renfree et al., 1987). Inoltre, l’effetto della suzione interverrebbe sulla
secrezione della prolattina. Edgerton ha ipotizzato, infatti, che il rilascio a livello ipofisario
delle gonadotropine sia inibito, durante la lattazione, dalla desensibilizzazione agli
estrogeni della ghiandola pituitaria dovuta al picco di prolattina indotto dalla suzione.
Questa ipotesi tuttavia non risulta essere attendibile nella pecora perché diversi studi hanno
dimostrato che il trattamento con antiprolattinici non sembra agire a livello ovarico con la
riduzione dell’anestro da lattazione (Hooley,1978). Tuttavia, sebbene nella nostra
osservazione gli animali che hanno presentato il maggior ritardo nell’inizio dell’attività
riproduttiva sono stati quelli che avevano le produzioni maggiori, lo stimolo della suzione
non può aver condizionato la ripresa dell’attività ciclica, avendo allontanato gli agnelli
dopo 20 giorni dal parto. Pertanto, potrebbero essere stati diversi fattori ad influenzare
l’attività sessuale e principalmente quelli di origine metabolica. I più importanti
sicuramente sono la somatotropina, che determina un omeoresi organica in favore della
mammella, ma anche la leptina potrebbe aver condizionato la risposta riproduttiva. Infatti
in diverse esperienze si riporta che i livelli bassi di questo ormone, secreto dai lipidi, che si
275
riscontrano nelle prime fasi di lattazione possono condizionare la ripresa della attività
riproduttiva postpartum (Carcangiu et al., 2003; Chilliard et al., 2005).
In conclusione il parto nel mese di Aprile determina un ritardo nell’inizio dell’attività
riproduttiva nelle pecore presumibilmente dovuto allo stato metabolico determinato dalla
fase della lattazione. Pertanto, è preferibile che gli animali non partoriscano oltre il mese di
Marzo perché il guadagno ottenuto con i pochi mesi di lattazione primaverili vengono persi
con il ritardo del parto, che nelle migliori delle ipotesi, potrebbe avvenire a Gennaio.
BIBLIOGRAFIA
Abi Salloum B., Claus R. (2005). Interaction between lactation, photoperiodism and male
effect in German Merino ewes. Theriogenology 63, 2181-2193
Barrell G.K., Thrun L.A., Brown M.E., Viguié C., Karsch F.J., 2000. Importance of
photoperiodic signal quality to entrainment of the circannual reproductive rhythm of the
ewe. Biol. Reprod. 63, 769-774
Bittman E.L., Dempsey R.J. Karsh F.J. (1983). Pineal melatonin secretion driver the
reproductive response to day lenght in the ewe. Endocrinology, 113, 2276-2283
Boquier F., Kann G., Thimonier J., (1993). Effect of body composition on the duration of
the postpartum anovulatory period in milked ewes submitted to two photoperiods. Reprod.
Nutr. Dev. 33, 395-403
Carcangiu V., Accorsi P.A., Vacca G.M., De Ambrogi M., Marogna G., Bini P.P. Concentrazioni ematiche di leptina in pecore di razza sarda in lattazione. Atti So.Fi.Vet.,
2003, 5, 124-126
Chemineau P., Malpaux B, Thiéry J.C., Viguè C., Morello H., Zarazaga L., Pelletier J.
(1995). The control of seasonality: a challenge to small ruminant breeding. In: Enne G.,
Greppi G.F., Lauria A., (Eds), Reproduction and Animal Breeding. Advances and strategy,
Elsevier, Amsterdam, pp 225-250
Chemineau P., Pelletier J., Guérin Y., Colas G., Ravault J.P., Almedia G., Thimonier J.,
Ortavant R. (1988). Photoperiodic and melatonin treatment for the control of seasonal
reproduction in the sheep and goats. Reprod. Nutr. Dev. 28, 409-422
Chilliard Y., Delavaud C., Bonnet M. (2005). Leptin expression in ruminant: Nutritional
and Physiological regulations in relation with energy metabolism. Dom. Anim. Endocrinol.
29, 3-22
Edgerton L.A, (1980). Effect of lactation upon the postpartum interval. J Anim Sci.51
Suppl 2,40-52.
Gordon K., Renfree M.B., Short R.V., Clarke I.J. (1987). Hypothalamo-pituitary portal
blood concentration of beta endorphin during suckling in the ewe. Reprod. Fertil.;79(2),
397-408.
Hooley R.D, Campbell J.J, Findlay J.K.,(1978) The importance of prolactin for lactation in
the ewe. J. Endocrinol. 79(3),301-10.
I’Anson H., Foster D.L., Foxcroft G.R., Booth P.J. (1991). Nutrition and reproduction. Oxf.
Rev. Reprod. Biol. 13: 239-311.
I’Anson H., Manning J.M., Herbosa C.G., Pelt J., Friedman C.R., Wood R.I., Bucholtz
D.C., Foster D.L. (2000). Central inhibition of gonadotropin-releasing hormone secretion in
the growth-restricted hypogonadotropic female sheep. Endocrinology. 2000, 141, 520-527.
276
Malpaux B, Migaud M, Tricoire H, Chemineau P. (2001). Biology of mammalian
photoperiodism and the critical role of the pineal gland and melatonin J Biol Rhythms. 16,
336-47.
Rosa H.J.D., Bryant M.J., 2003. Seasonal of reproduction in sheep. Small Rum. Res. 48,
155-171
Scaramuzzi R.J., Campbell B.K, Downing J.A., Kendall N.R, Khalid M., Muñoz-Gutiérrez
M., Somchit A.(2006). A review of the effects of supplementary nutrition in the ewe, on the
concentrations of reproductive and metabolic hormones and the mechanisms that regulate
folliculogenesis and ovulation rate
Thiéry J.C., Chemineau P., Hernandez X., Migaud M., Malpaux B. (2002). Neuroendocrine
interactions and seasonality. Dom. Anim. Endocrinol. 23, 87-100
277
ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA E LEPTINA IN AGNELLE DI RAZZA SARDA
LEPTIN AND REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA EWE LAMBS
CARCANGIU V., VACCA G.M., *PARMEGGIANI A., MURA M.C., FIORI M.,
PAZZOLA M., BINI P.P.
Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Sudi di Sassari
*Dipartimento di Morfofisiologia Veterinaria e Produzioni Animali, Università degli Studi
di Bologna
KEY WORDS: Sheep, puberty, leptin
ABSTRACT
The aim of the study was to evaluate how much leptin would be involved in the onset of
reproductive activity in Sarda ewe lambs. For the study 20 ewe lambs, born by single birth
during the last 15 days of November,were used. From the 2nd to the 10th month of life each
animal was weighted and a blood sample was taken every 15 days for leptin and
progesterone dosage. Leptin and progesterone haematyc concentrations were measured
with RIA method. Animals’ body weight has kept stable until 5th sample, showing then an
increase until the end (P<0.01). Leptin blood levels had shown a constant trend from 1st to
8th sample and then they had shown an increase from 9th (P<0.01). Progesterone haematic
concentration has kept very low values until 10th sample, incresing subsequently (P<0.01).
Body weight appeared in positive correlation with leptin (P<0.05) and progesterone
(P<0.01). The high leptin blood levels in the latest samples, even if they are not in
correlation with progesterone, could indicate an involvement of leptin in the onset of
reproductive activity.
INTRODUZIONE
Gli animali attraverso la pubertà acquisiscono la piena capacità di riprodursi, pertanto
questa fase fisiologica riveste una notevole importanza in quanto segna il passaggio tra il
periodo improduttivo e quello produttivo dell’animale. Molti sono i fattori che possono
influenzare l’inizio dell’attività riproduttiva ma i più importanti senza dubbio sono l’età, lo
sviluppo corporeo e negli animali stagionali il fotoperiodo (Abecia et al., 2001). L’età,
almeno negli ovini, è un parametro molto variabile in quanto esistono diverse razze con
caratteristiche morfologiche e attitudinali molto differenti che ne condizionano l’inizio
dell’attività riproduttiva (Dyrmundsson, 1973). Tuttavia per la nostra razza Sarda ormai è
acquisito che il comportamento riproduttivo si manifesti tra il settimo e l’ottavo mese se gli
altri fattori suddetti sono favorevoli (Manunta, 1985). Infatti, nonostante le agnelle abbiano
raggiunto l’età idonea per riprodursi, ma non hanno maturato lo sviluppo corporeo o il
fotoperiodo non è favorevole, l’attività riproduttiva non si presenta (Papachristoforou et al.,
2000). Mentre l’età e il fotoperiodo sono variabili conosciute, per quanto riguarda lo
sviluppo corporeo rimane ancora da identificare come l’asse ipotalamo-ipofisi-gonade
riesca a percepire quando l’organismo è maturo per riprodursi. Tuttavia, è riconosciuta
l’esistenza di un fattore periferico che informa il cervello delle stato energetico
dell’organismo ma ancora non è stato chiaramente identificato (Friedman e Halaas, 1988).
Infatti, sono stati presi in considerazione variazioni di diversi parametri ematochimici come
le proteine, la glicemia, i lipidi, l’insulina ma nessuno di questi è stato in grado di
278
controllare la pubertà (I’Anson et al., 1991). Sicuramente, è solo alla fine
dell’accrescimento, quando l’effetto lipomobilizzante determinato dal GH viene a mancare,
che si osserva l’aumento della massa adiposa nell’organismo (Gatford et al., 1997), e
questo fatto potrebbe essere percepito dall’ipotalamo come messaggio di maturità dello
sviluppo somatico (Carcangiu et al., 1999). La recente scoperta della leptina, ormone
secreto dal tessuto adiposo, ha portato alla formulazione di nuove ipotesi considerando
appunto questa molecola come il segnale organico che determina la pubertà (Brann et al.,
2002). La leptina infatti viene secreta in modo proporzionale alla massa adiposa presente
nell’organismo e i suoi alti livelli determinano una diminuzione del feed intake inibendo il
NPY a livello ipotalamico (Zhang et al., 1994; Vernon et al., 2001). Quindi questo ormone
essendo implicato nella regolazione del bilancio energetico, è lecito pensare che possa
fungere da segnale organico della maturità somatica. Pertanto lo scopo della presente
ricerca è quella di analizzare i livelli ematici di leptina nel periodo dell’accrescimento fino
alla pubertà per individuare quanto questo ormone sia coinvolto nella regolazione della
pubertà nelle agnelle di razza Sarda.
MATERIALI E METODI
La ricerca è stata condotta in un allevamento di circa 300 capi di ovini di razza Sarda,
situato nel Nord Sardegna a circa 350 m s.l.m. Dalle agnelle nate tra Ottobre e Dicembre,
sono stati scelti 20 soggetti nati nell’ultima decade di Novembre, da parto singolo e con un
peso omogeneo. Gli animali sono stati svezzati a 35 giorni di età e tenuti separati dal resto
del gregge per tutto il tempo della prova. Le agnelle durante il giorno pascolavano su un
erbaio composto da Graminacee (Orzo, Avena) e Leguminose (Trifoglio, Veccia), la notte
venivano tenute nell’ovile dove ricevevano una quota di mangime concentrato in relazione
all’accrescimento contenente il 16 % di proteine e il 12,5 di E.M./kg di sostanza secca. Il
fieno e l’acqua erano ad libitum. Da ciascun animale a partire dal 50° fino al 260° giorno di
vita, sono stati effettuati prelievi ematici dalla vena giugulare, con cadenza quindicinale,
alle 07.00 del mattino, prima che gli animali venissero condotti al pascolo. Nella medesima
occasione veniva rilevato il peso di ciascun animale. Il sangue veniva prelevato con
l’ausilio di provette sottovuoto contenenti eparinato di litio come anticoagulante
(Vacutainer, Beckton e Dickinson) e subito centrifugato a 2000 rpm per 15 minuti e il
relativo plasma congelato a –20°C fino al momento delle analisi. La leptina (Multi Species
RIA, Limco Research Inc.) e il progesterone sono stati analizzati con metodica RIA. I dati
ottenuti sono stati sottoposti all’analisi della varianza e delle correlazioni (Minitab ® ).
RISULTATI E CONCLUSIONI
Il peso corporeo degli animali ha mostrato un continuo incremento, se si escludono i primi
due prelievi, con differenze statisticamente significative (P<0,01)(Tabella 1).
279
Tabella 1 - Valori medi (± d.s) del peso vivo, della leptina e del progesterone nelle agnelle
durante le osservazioni
Peso vivo
Leptina
Progesterone
Prelievo
(kg)
(ng/ml)
(ng/ml)
1°
10,5±2,2A
1,2±0,1A
0,02±0,02A
2°
10,9±1,8A
1,2±0,2A
0,02±0,01A
A
A
3°
13,6±2,4
1,2±0,2
0,08±0,02A
A
A
4°
15,5±2,2
1,2±0,3
0,07±0,02A
B
A
5°
16,7±2,4
1,2±0,3
0,02±0,01A
B
AB
6°
18,2±2,6
1,3±0,4
0,1±0,06B
B
AB
7°
20,1±2,5
1,3±0,4
0,1±0,05B
B
AB
8°
22,3±2,7
1,3 ±0,3
0,2±0,08B
C
B
9°
24,5±2,8
1,4±0,3
0,3±0,1B
C
B
10°
25,8±2,5
1,4±0,2
0,3±0,1B
C
B
11°
26,6±3,0
1,5±0,4
0,5±0,1C
C
B
12°
29,3±4,0
1,5±0,3
0,8±0,3C
C
B
13°
30,8±2,8
1,6±0,3
1,4±0,5D
C
B
14°
31,4±3,6
1,5±0,6
1,6±0,8D
C
B
15°
32,2±4,1
1,5±0,4
1,8±0,8C
(A, B, C = P<0,01)
Tale andamento dello sviluppo corporeo è quello che si riscontra comunemente negli ovini
di razza Sarda e il peso raggiunto e superiore al 60 % di quello da adulto richiesto per
manifestare l’attività riproduttiva (Manunta, 1985). Infatti in precedenti prove il peso
intorno ai 26 Kg era quello idoneo per le manifestazioni riproduttive nelle agnelle (Bini et
al., 2000). Il peso corporeo è risultato correlato positivamente con la leptina (P<0,01) e con
il progesterone (P<0,001) (Tabella 2).
Tabella 2 – Coefficienti delle correlazioni (r) tra i parametri esaminati
Leptina
Progesterone
Progesterone
0,124
Peso
0,281*
0,335**
(**=P<0,01; *=P<0,05)
I livelli plasmatici di leptina hanno presentato un andamento crescente (P<0,01) durante le
osservazioni (Tabella 1). Inoltre, l’ormone è risultato correlato positivamente con il peso
(P<0,05) (Tabella 2). Il comportamento della leptina è legato all’andamento
dell’accrescimento, infatti, i lipidi corporei incrementano normalmente con l’età come è
stato riscontrato nell’uomo (Westerterp., 2000) e in diversi ruminanti (McLaughlin et al.,
1994; Trenkle, 1970). Le concentrazioni plasmatiche della leptina aumentano con
l’incremento dei lipidi corporei come osservato sia nei bovini (Dalevaud et al., 2002) che
negli ovini (Ehrhardt et al., 2000; Chilliard et al., 2001; Daniel et al., 2002). Questo
comportamento è in sincronia con quanto da noi osservato, infatti, i livelli maggiori
dell’ormone sono stati registrati alla fine delle osservazioni quando gli animali avevano
280
raggiunto il peso più alto e presumibilmente il grasso di deposito era maggiore. Inoltre, in
quel momento, le agnelle avevano raggiunto uno sviluppo corporeo tale da consentire
l’utilizzo delle sostanze energetiche anche per altre funzioni fisiologiche come l’accumulo
di sostanze di riserva, in qualità di lipidi. I livelli plasmatici della leptina da noi riscontrati
risultano essere inferiori a quanto riportato da altri Autori (Narro et al., 2003; Delavaud et
al., 2000). Questa differenza dei valori di questo ormone potrebbe essere attribuita alla
razza o al sesso degli ovini o comunque alle diverse condizioni sperimentali utilizzate nelle
prove dei suddetti Autori. Ciò nonostante, non è da escludere che i tassi ematici da noi
riscontrati siano più bassi a causa della minore sensibilità del metodo di analisi utilizzato.
Infatti, Delavaud et al., (2000) effettuando dosaggi in parallelo hanno rilevato una minore
risposta da parte di questo metodo rispetto ad uno specifico per gli ovini. Tuttavia, ai fini di
studiare l’andamento della leptina durante lo sviluppo somatico e non di stabilirne i valori
assoluti, l’uso di questo metodo di misura non dovrebbe avere causato alterazioni dei
risultati. Inoltre, i livelli inferiori di leptina coincidono con il periodo nel quale si ha lo
sviluppo corporeo rapido e quindi con il momento in cui la richiesta energetica è elevata.
Infatti, la leptina, influenzando l’effetto del neuropeptide Y, regola il feed intake
(Ingvartsen et al, 2001). Quest’ultimo peptide agisce sul nucleo ipotalamico stimolando
l’appetito e la sua azione viene contrastata dagli alti livelli di leptina. Quindi, i bassi livelli
di leptina registrati nell’arco di tempo di massimo sforzo organico per la crescita possono
essere coinvolti appunto nel regolare l’assunzione volontaria del cibo. Il progesterone
manifesta un aumento a partire dal sesto prelievo (P<0.01) fino alla fine delle osservazioni.
I tassi ematici dell’ormone gonadico, superiori a 0,5 ng/ml, indicano che a partire
dall’undicesimo prelievo gli animali manifestano l’inizio dell’attività riproduttiva. Il
progesterone inoltre, risulta correlato positivamente oltre che con il peso anche con la
leptina. Pertanto l’ormone lipidico potrebbe essere il segnale di avvenuta maturazione
corporea e potrebbe fungere a livello centrale da attivatore della secrezione del GnRH.
L’aumento della leptina in prossimità della pubertà si accorda con quanto riscontrato nelle
bovine e nelle donne (Garcia et al., 2002; Spicer, 2001). Nelle giovenche infatti è stato
riscontrato un aumento dei livelli plasmatici di leptina dal 4° mese fino alla prima
ovulazione (Williams et al., 2002). Tuttavia la somministrazione di leptina ovina non ha
confermato le osservazioni precedenti in quanto non ha determinato l’anticipo della pubertà
nelle bovine (Maciel et al.,2004a). Tale esperienza conferma quanto già ottenuto negli ovini
nei quali somministrazioni croniche di leptina non hanno determinato l’anticipo della
pubertà (Morrison et al., 2002). La leptina, comunque, determina una stimolazione
dell’ipofisi alla liberazione dell’LH solamente negli animali sottoalimentati (Maciel et al.,
2004b; Zieba et al., 2005).
In conclusione si può affermare che la leptina potrebbe essere uno dei segnali di maturità
organica percepiti dall’ipotalamo, capace di determinare l’inizio dell’attività riproduttiva
nelle agnelle. Tuttavia ulteriori indagini sono necessarie con il dosaggio di altri ormoni
coinvolti nella regolazione del metabolismo e dell’attività riproduttiva al fine di meglio
chiarire l’intervento di questo ormone nella pubertà.
281
BIBLIOGRAFIA
Abecia, J.A., Forcada, F., Zùniga, O. (2001). Differences in reproductive performance,
embryo development, interferon-tau secretion by the conceptus and luteal function in ewe
lambs synchronized in oestrus before or after the spontaneous onset of luteal activity
preceding puberty. Reprod. Dom. Anim. 36: 73-77
Bini, P.P., Carcangiu, V., Parmeggiani, A., Vacca, G.M., Covoni, N., Ghibellini, A.,
Marino, G. (2000). Correlazioni tra progesterone, GH, peso vivo e parametri metabolici in
agnelle di razza Sarda in accrescimento fino al raggiungimento della pubertà. Atti
Fe.Me.S.P.Rum. 8: 93-98
Brann D.W., Wade M.F., Dhandapani K.M., Mahesh V.B., Buchanan C.D. (2002). Leptin
and reproduction. Steroids 67, 95-104
Carcangiu, V., Bini, P.P., Parmeggiani, A., Vacca, G.M., Govoni, N., Ghibellini, A. (1999).
Comportamento del GH e di alcuni parametri metabolici durante l’accrescimento nelle di
razza Sarda. Atti Fe.Me.S.P.Rum. 7, 183-187
Chilliard Y., Bonnet M., Delavaud C., Faulconnier Y., Leroux C., Dijane J., Bocquier F.,
2001. Leptin in ruminants Gene expression in adipose tissue and mammary gland, and
regulation of plasma concentration. Dom. Anim. Endocrinol. 24, 71-95
Daniel J.A., Whitlock B.K., Baker J.A., Steele B., Morrison C.D., Keisler D.H., Sartin J.L.
(2002). Effect of body fat mass and nutritional status on 24-hour leptin profiles in ewes. J.
Anim. Sci. 80, 1083-1089
Delavaud C., Bocquier F., Chilliard Y., Keisler D.H., Gertler A., Kann G. (2000). Plasma
leptin determination assessed by specific Ria sheep. J. Endocrinol. 165, 519-526
Delavaud C., Ferlay A., Faulconnier Y., Bocquier F., Kann G., Chilliard Y. (2002). Plasma
leptin concentration in adult cattle: effects of breed, adiposity, feeding level, and meal
intake. J. Anim. Sci. 80, 1317-1328
Dyrmundsson O. R. (1973). Puberty and early reproductive performance in sheep. I: ewe
lambs. Anim. Breeding Abstracts 41: 273-289
Ehrhardt R.A., Slepetis R.M., Siegal-Willott J., Van Amburgh M.E., Bell A.W., Boiscalair
Y.R. (2000). Development of specific radioimmunassay to measure physiological changes
of circulating leptin in the cattle and sheep. J. Endocrinol. 166, 519-528
Friedman J.M., Halaas J.L. (1998). Leptin and the regulation of the body weight in
mammals. Nature 395, 763-770
Garcia M.R., Amstalden M., Williams S.W., Stanko R.L., Morrison C.D., Keisler D.H.
(2002). Serum leptin and its adipose gene expression during pubertal development, the
estrous cycle, and different seasons in cattle. J. Anim. Sci. 80, 2158-2167
Gatford K.L., Quinn K.J., Walton P.E., Grant P.A., Hosking B.J., Egan A.R., Owens P.C.,
1997. Ontogrnic and nutritional changes in circulating insulin-like growth factor (IGF)-I,
IGF-II and IGF-binding proteins in growing ewe and ram lambs. J. Endocrinol. 155, 47-54
I’Anson H., Foster D.L., Foxcroft G.R., Booth P.J. (1991). Nutrition and reprodction. Oxf.
Rev. Reprod. Biol. 13: 239-311.
Ingvartsen K.L., Boisclair Y.R. (20019. Leptin and the regulation of food intake, energy
homeostasis and immunity with special focus on periparturient ruminants. Dom. Anim.
Endocrinol. 21, 215-250
282
Maciel M.N., Zieba D.A., Amstalden M., Keisler D.H., Neves J.P., Williams G.L. (2004a).
Chronic administartion of recombinant ovine leptin in growing beef heifers: Effect on
secretion of LH, metabolic hormones, and timing of puberty. J. Anim. Sci 2930-2936
Maciel M.N., Zieba D.A., Amstalden M., Keisler D.H., Neves J.P., Williams G.L. (2004b).
Recombinant oleptin prevent fasting-secretion in prepubertal heifers. Biol. Reprod. 70,
229-235
Manunta G. (1985). L’attività ovarica nella pecora. Atti S.I.S.Vet. 39, 27-46
McLaughl C.L., Hendrick H.B., Veenhuizen J.J., Hintz R.L., Munyakazi L., Kasser T.R.,
1994. Performances, clinical chemistry, and carcass responses of finishing lambs to
formulated sometribove (methiolnyl bovine somatotropin ). J. Anim. Sci. 72, 2544-2551
Morrison C.D., Wood R., McFadin E.L., Whitley N.C., Keisler D.H. (2002) Effect of
intravenous infusion of recombinant ovine leptin on feed intake and serum concentration of
GH, LH, insulin, IGF-1, cortisolo, and thyroxine in growing prepubertal ewe lambs.
Domest. Anim. Endocrinol. 22, 103-112
Narro L.A., Thomas M.G., Silver G.A., Rozeebon K.J., Keisler D.H. (2003). Body
composition, leptin, and the leptin recptor and their relationship to the growth hormone
(GH) axis in growing wethers treated with zeranol. Dom. Anim. Reprod. 24, 243-255
Papachristoforou, C., Koumas, A., Photiou, C., 2000. Seasonal effect on puberty
reproductive characteristic of female Chios sheep and Damascous goats born in autumn or
in February. Small Rum. Res. 38: 9-15
Spicer L.J. (2001). Domest Anim Endocrinol. 21, 251-70
Trekle A., 1970. Plasma level of growth hormone, insulin and plasma protein bound iodine
in finishing cattle. J. Anim. Sci. 31, 389-393
Vernon R.G., Denis R.G.P., Soresen A., 2001. Signal of adiposity. Dom. Anim.
Williams G.L., Amstalden M., Garcia M.R.,Stanko R.L., Nizielski S.E., Morrison C.D.,
Keisler D.H. (2002). Leptin and its role in the central regulation of reproduction in cattle.
Domest. Anim. Endocrinol. 23, 339-349
Westerterp K.R. (2000). Daily physical activity, aging and body composition. J. Nutr.
Health Aging 4, 239-242
Zhang Y., Proenca R., Maffei M., Barone M., Leopold L., Friedman J.M., 1994. Positional
cloning of the mouse gene and its human homologue. Nature 374, 425-432
Zieba D.A., Amstalden M., Williams G.L. (2005). Regulatory roles of leptin in
reproduction and metabolism: A comparative review. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 166185
283
ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA NELLA CAPRA DI RAZZA SARDA ED
ESPRESSIONE GENICA DEL RECETTORE MT1 DELLA MELATONINA
REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA GOAT AND GENIC EXPRESSION OF
MELATONIN MT1 RECEPTOR
MURA M.C., CARCANGIU V., LURIDIANA S., VACCA G.M., ATZENI M., FALCHI
L., BINI P.P.
Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Sudi di Sassari
KEY WORDS: Goat, melatonin receptor, seasonal reproduction
ABSTRACT
The aim of present research was to point out how seasonal reproductive activity of Sarda
goat could be influenced by genic expression of melatonin receptor. The trial was carried
out on six hundred goats, 540 females and 60 males, from 30 breeds. The goats, that were
all pluriparous, have been selected according to the month of lambing, November or March.
A blood sample by jugular vein has been taken to perform DNA extraction. PCR allowed
the isolation of a single band of 824 bp corresponding to the second exon of the gene
codifying for melatonin MT1 receptor. The obtained amplified has been submitted to an
enzymatic digestion in order to investigate the possible presence of polymorphism, as
shown in sheep. The results have pointed out that all the tested animals belonged to +/+
genotype , that ,in the sheep, is the less linked to photoperiod. Therefore, the results allow
to hypothesize that the selection performed by breeders could have supported indirectly the
spread of animals with a reproductive activity less linked to photoperiod. Besides, it could
be supposed that differences at lambing between the tested subject are more connected to
others factors, such as the number of receptors in the hypothalamus, than to their genetic
expression.
INTRODUZIONE
Molte specie animali che vivono a climi temperati usano le variazioni annuali del
fotoperiodo per regolare la loro attività riproduttiva. Queste informazioni luminose,
percepite dalla retina, attraverso una via multisinaptica raggiungono la ghiandola pineale
regolandone la sintesi della melatonina. La secrezione dell’ormone pineale segue un ritmo
circadiano con alti livelli durante le ore di buio e bassi durante le ore di luce sia nel sangue
che nel liquido cerebrospinale (Malpaux, 2001). L’andamento della secrezione notturna di
melatonina funge come un messaggero endocrino e regola, negli animali stagionali, la
secrezione pulsatile ipotalamica del GnRH. Nelle pecore i giorni corti, e di conseguenza la
lunga durata della secrezione di melatonina, stimola la secrezione di GnRH (Viguié et al.,
1995). La melatonina agisce a diversi livelli nel sistema nervoso centrale ma per quanto
riguarda l’attività riproduttiva sono stati evidenziati un numero abbastanza elevato di
recettori a livello ipotalamico e ipofisario (Stancov et al., 1991). Sebbene la pars tuberalis
presenta un alto numero di recettori per la melatonina non è coinvolta nella regolazione
dell’attività riproduttiva ma controlla le secrezione stagionale della prolattina (Lincoln e
Clarke, 1994). Invece il sito d’azione dell’indolamina pineale ormai è accertata in diversi
animali è l’ipotalamo (Bae et al., 1999). Nelle pecore, infatti, microimpianti di melatonina
posizionati in vicinanza dei nuclei premammillari dell’ipotalamo sono stati capaci di
284
stimolare la secrezione di LH (Chabot et al., 1998; Malpaux et al., 1998). Tale effetto della
melatonina viene espletato attraverso specifici recettori dei quali ne esistono tre tipi, due ad
alta affinità ed uno a bassa (Conway et al., 2000). I primi due, denominati MT1 e MT2
rispettivamente, hanno caratteristiche farmacologiche e di proteine di legame
transmebranario simili, sono quelli maggiormente candidati al controllo dell’attività
riproduttiva stagionale (Reppert et al., 1994, 1995; Dubocovich, 1995). Tuttavia, l’utilizzo
di agonisti o antagonisti dei due recettori non hanno chiarito se sono entrambi coinvolti
nella regolazione della riproduzione. Inoltre, in due razze di hamster che naturalmente non
presentano il gene che codifica per il recettore MT2 l’attività riproduttiva non ha subito
variazioni (Weaver et al., 1996). L’espressione genica del recettore MT2 a livello dei nuclei
premammillari dell’ipotalamo non è stata ancora riscontrata e per questo si ritiene che non
sia coinvolto nella regolazione della stagionalità riproduttiva (Migaud et al., 2005). Il
recettore MT1, perciò, oggi viene considerato l’unico ad avere un ruolo importante nel
sincronizzare l’attività sessuale. Tale recettore è diffuso in molte parti del corpo di parecchi
mammiferi e presenta un certo grado di polimorfismo all’esone II che risulta essere
coinvolto nella stagionalità riproduttiva delle pecore (Messer et al., 1997). Infatti Pellettier
et al., (2000) hanno evidenziato che una variante del polimorfismo del gene del recettore
risulta poco legata al fotoperiodo e pertanto gli animali possiedono tale genotipo presentano
attività sessuale in Primavera. Tuttavia nelle capre di razza Saanen, Creole e in un piccolo
numero di capre Sarde non è stato osservato il polimorfismo e perciò si considera che in
questa specie l’alternanza riproduttiva non dipenda dall’espressione polimorfica del
recettore (Migaud et al., 2002; Mura et al., 2004). Ma considerando che le capre sarde
presentano una notevole variabilità stagionale nelle manifestazioni riproduttive è lecito
estendere le osservazioni al fine di chiarire la presenza o meno di tale polimorfismo e
eventualmente correlarlo all’attività riproduttiva. Quindi lo scopo della ricerca è quello di
analizzare il gene del recettore MT1 della melatonina in capre sarde che presentino attività
sessuale in diversi periodi dell’anno.
MATERIALI E METODI
Al fine di ottenere dati il più eterogenei possibile, la ricerca è stata condotta in 30
allevamenti di capre, dislocati in vari distretti di tutte e quattro le province della Sardegna.
Nonostante le aziende fossero situate in territori anche molto distanti tra loro, le tecniche di
allevamento utilizzate in tutta l’isola sono sostanzialmente le stesse, essendo inquadrabili
nello schema dell’allevamento semibrado. Perciò per tutti gli animali si può dire che
pascolavano durante il giorno e la notte venivano condotti al caprile dove ricevevano
un’integrazione alimentare di granella di mais, fave e piselli nei periodi di maggiore sforzo
metabolico (accoppiamento e lattazione). In ciascuno di tali allevamenti gli animali sono
stati scelti dopo un periodo di osservazione durato circa due anni, durante il quale venivano
registrate la data del parto di ciascun soggetto. In totale lo studio è stato condotto su 540
capre e 60 becchi di razza Sarda di età compresa tra i 3 e i 9 anni, allevate sin dalla nascita
a fotoperiodo naturale. Le capre oggetto della prova sono state scelte in base alla data del
parto e più precisamente animali che avevano partorito in Autunno e tra il mese di Febbraio
e quello di Aprile. Da ciascun animale è stato prelevato un campione di sangue giugulare
utilizzando provette sottovuoto addizionate di EDTA come anticoagulante. Dal sangue è
stato estratto il DNA genomico e valutata la sua concentrazione con metodica
285
spettrofotometrica. 100-150 ng del DNA così ottenuto venivano poi utilizzati per
l’allestimento dell’amplificazione che prevedeva l’utilizzo degli stessi primers utilizzati da
Messer et al. (1997), corrispondenti alla posizione 285-304 (primer sense) e 1108-1089
(primer antisense) della sequenza dell’esone II del gene che codifica per il recettore MT1
della melatonina. La PCR consisteva di 35 cicli ripartiti in denaturazione a 94 °C per 1
minuto, annealing a 62 °C per 1 minuto, estensione a 72 °C per 2 minuti, al termine dei
quali veniva eseguita un’estensione finale a 72 °C per 10 minuti. Il prodotto della PCR è
stato sottoposto a digestione con l’utilizzo dell’enzima di restrizione MnlI I frammenti così
ottenuti venivano separati su un gel di agarosio al 3 %.
Il risultato della PCR di tutti gli animali non ha mostrato differenze evidenziando un unico
frammento della lunghezza di 824 paia di basi relativo all’esone secondo codificante per il
recettore MT1 della melatonina (Figura - 1). La digestione con l’enzima di restrizione MnlI
ha permesso di individuare 5 bande corrispondenti ai frammenti di 236 bp, 216 bp, 137 bp,
82 bp e 67 bp e questo risultato si accorda con quanto osservato da Messer et al., (1997).
Contrariamente a quanto riscontrato nelle pecore da Pellettier et al. (2000), le nostre capre
non hanno manifestato il polimorfismo genetico e conferma quanto riscontrato nelle razza
Alpina da Migaud et al., (2002). Nelle pecore, invece, la mancanza di tale sito di taglio
porta ad un frammento di 303 paia di basi (Messer et al., 1997). La forma allelica
contenente il sito di taglio fu nominata da Pellettier et al. (2000) “+”, mentre fu identificata
come “-“ quando tale sito non era presente. Da tale distinzione si sono ottenute le
combinazioni di “+/+”, “+/-“ e “-/-“ e gli ovini che presentano il genotipo “+/+“ hanno
mostrato attività sessuale in Primavera, come gli ovini di razza Merino d’Arlens e quelli
Dorset X Rambouillet-Finn (Notter et al., 2003).
Pertanto si può affermare che la
variabilità dell’attività riproduttiva
delle capre di razza Sarda non è
legata alla espressione del recettore
come invece ci si aspettava.
Considerando, comunque, che le
nostre capre presentano una
stagionalità riproduttiva evidente
infatti circa il 30% dei soggetti
partorisce in Marzo-Aprile e
l’effetto del fotoperiodo, anche se
debolmente, si manifesta. L’azione
dell’alternanza
luce/buio,
evidentemente viene espletata
1
2
3
4
5
6
attraverso altri meccanismi. Infatti,
Figura 1 – Elettroforesi del prodotto della PCR e della
nelle nostre capre si riscontra una
digestione. Linea 1 DNA marker; Linea 2, 3, 4 e 5
variabilità
individuale
della
risultati della digestione; Linea 6 risultato della PCR
secrezione dell’ormone epifisario
che
risulta
influenzare
la
286
stagionalità (Carcangiu et al.,
2004). Questi ultimi autori, infatti,
hanno rilevato un precoce inizio dell’attività riproduttiva nelle capre che presentavano bassi
livelli notturni di melatonina. Comunque, considerando che la capra in generale è stata
allevata nella maggioranza dei casi per la produzione del latte si può ipotizzare che la
selezione abbia favorito gli animali meno legati al fotoperiodo per poter avere nei diversi
periodi dell’anno il latte. Tale ipotesi potrebbe essere la causa della scomparsa del
polimorfismo del recettore della melatonina nella capra.
In conclusione si può affermare che la stagionalità riproduttiva della capra di razza Sarda
non è legata al polimorfismo del recettore MT1 nonostante le capre di razza Sarda
appartengano ad un ceppo diverso da quello della Alpina.
Pertanto ulteriori ricerche sono necessarie per chiarire quale sia il meccanismo esatto che
determina l’alternanza riproduttiva nelle capre.
BIBLIOGRAFIA
Bae H.H., Mangeles R.A., Cho B.S., Dark J., Yellow S.M., Zucker I. (1999), Ventromedial
hypothalamic mediation of photoperiodic gonadal response in male Syrian hamsters. J.
Biol. Rhythms 14, 391-401
Carcangiu V., Vacca G.M., Parmeggiani A., Mura M.C., Bini P.P. (2005) Blood melatonin
levels as related to reproductive activity of Sarda goat does. Small Rum. Res., 59, 7-13
Chabot V., Caldani M., de Reviers M.M., Pelletier J. (1998). Localization and
quantification of melatonin receptors in the diencephalon and posterior telencephalon of the
sheep brain. J Pineal Res. 24, 50-57
Chemineau P., Daveau A., Pelletier J., Malpaux B., Karsch F.J., Viguié C. (2003). Changes
in the 5-HT2A receptor system in the pre-mammillary hypothalamus of the ewe are related
to regulation of LH pulsatile secretion by an endogenous circannual rhythm. BMC
Neurosci. 4, 1
Conway S., Drew J.E., Mowat E.S., Barrett P., Delagrange P., Morgan P.J. (2000).
Chimeric melatonin mt1 and melatonin-related receptors. J. Biol. Chem. 27, 20602-20609
Dubocovich M.L. (1995). Melatonin receptors: are there multiple subtypes? Trends
Pharmacol. 16, 50-56
Lincol G.A, Clarke I.J. (1994). Photoperiodically-induced cycle in the secretion of prolactin
in hypothalamo-pituitary disconnected rams: evidence for translation of the melatonin
signal in the pituitary gland. J. Neuroendocrinol. 6, 251-260
Malpaux B., Daveau A., Maurice-Mandon F., Duarte G., Chemineau P. (1998). Evidence
that melatonin acts in the premammillary hypothalamic area to control reproduction in the
ewe: presence of binding sites and stimulation of luteinizing hormone secretion by situ
microimplant delivery. Endocrinology 139, 1508-1516
Malpaux B., Migaud M., Tricore H., Chemineau P. (2001). Biology of mammalian
photoperiodism and the critical role of the pineal gland and melatonin J. Biol. Rhythms 16,
336-347
Messer L.A., Wang L., Tuggle C.K. Yerle M., Chardon P., Pomp D., Womack J.E.,
Barendse W., Crawford A.M., Notter d.R., Rothschild M.F. (1997). Mapping of the
melatonin receptor 1a (MTRN1A) gene pigs, sheep and cattle. Mamm. Genome 8, 368-370
287
Migaud M., Daveau A., Malpaux B. (2005). MTNR1A melatonin receptors in the ovine
premammillary Hypothalamus : day-night variation in the expression of the transcripts.
Biol. Reprod. 72, 393-398
Migaut M., Gavet S., Pellettier J. (2002) Partial cloning and polymorphism of the melatonin
1a (Mel1a) receptor gene in two breeds of goat with different reproductive seasonality.
Reproduction 124, 59-64
Mura M.C., Vacca G.M., Dei Giudici S., Rocchigiani A.M., Bini P.P., Carcangiu V.
(2004). Melatonin receptor mel1a gene expression in two Mediterranean goats breed with
different reproductive seasonality. Proceeding II° International Meeting on Veterinary
Morpho-functional Biotechnologies 2, 52
Notter D.R., Cockett N.E., Hadfield T.S. (2003). Evaluation of melatonin receptor 1a a
candidate gene influenzing reproduction in an sutumn-lambing sheep flock. J. Anim. Sci.
81, 912-917
Reppert S.M., Godson C., Mahle C.D., Weaver D.R., Slaugenhaupt S.A., Gusella J..f.
(1995). Molecular characterization of second melatonin receptor expressed in human retina
and brain: the Mel1b melatonin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8734-8738
Reppert S.M., Weaver D.R., Ebisawa T. (1994). Cloning and characterization of a
mammalian melatonin receptors that mediates reproductive and circadian response. Neuron
13, 1177-1185
Stancov B., Cozzi B., Lucini V., FumagalliP., Scaglione F., Fraschini F. (1991)
Characterization and mapping of melatonin receptor in the brain of three mammalian
species: rabbit, horse and sheep. A comporative in vitro binding study. Neuroendocrinology
53, 214-221
Viguié C., Caraty A., Locatelly A., Malpaux B. (1995). Regulation of luteinizing hormonereleasing hormone (LHRH) secretion by melatonin in the ewe. I Simultaneous delayed
increase in LHRH and luteinizing hormone pulsatile secretion. Biol. Reprod. 52, 1114-1120
Weaver D.R., Liu C., Reppert S.M. (1996). Nature’s knockout: Mel1b receptor is not
necessary for reproductive and circadian responses to melatonin in Siberian hamster. Mol.
288
VALUTAZIONE IGIENICO-SANITARIA E CARATTERIZZAZIONE
MICROBIOLOGICA DELLA CACIOTTA CAPRINA A LATTE CRUDO
DELL’ISOLA DI CAPRAIA
CERRI D.1, INNOCENTI E.2, FRATINI F.1, EBANI V. V.1, AMPOLA M.3, ZUCCONI
C.4, ANDREANI E.1
1
Dipartimento Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti - Università di Pisa;
2
Dottore di ricerca in Patologia dei piccoli ruminanti; 3Dottorando in Produzioni Animali,
Sanità ed Igiene degli Alimenti nei Paesi a Clima Mediterraneo; 4 Libero Professionista
PAROLE CHIAVE: caciotta caprina, caratterizzazione fenotipica, batteri lattici
KEY WORds: goat caciotta, phenotypical characterization, lactic acid bacteria
ABSTRACT
The main aim of the research is to carry out the phenotypical characterization of lactic acid
bacteria isolated from goat caciotta in three cycles of caseification to prepare a native
starter.
Milk, curd and cheese samples have been analyzed to detect: total coliforms, Escherichia
coli, Staphylococcus spp., lactic acid bacteria, yeasts and moulds. Total bacterial count
(TBC) has been determined on milk as well.
Staphilococci were represented on average with values of 2000 UFC/ml; total coliforms
showes a progressively decreasing with seasoning (from 6000 UFC/ml to <50 UFC/ml); E.
coli was represented on average with values <500 UFC/ml, while yeasts and moulds
showed respectively values <100 UFC/ml e <300 UFM/ml. Medium milk TBC has been
122000 UFC/ml; lactobacillus species showed a medium increasing until 21° seasoning day
in each cycle of production with spikes of 90 millions UFC/ml in cheese at 21 days at the
first caseification; lactococcus and enterococcus species were respresented with high values
until 28° seasoning day and successively showed a slow decreasing. About phenotypical
characterization of lactic acid bacteria, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum,
Lactococcus lactis lactis, Lactococcus cremoris e Enterococcus faecalis were found to be
the main represented species.
INTRODUZIONE
L’Isola di Capraia assieme alle isole di Gorgona, Elba, Pianosa, Montecristo, Giglio e
Giannutri, appartiene al Parco Nazionale dell’Arcipelago Toscano, il più grande parco
marino d’Europa; l’isola ha una superficie di quasi 20 kmq e uno sviluppo costiero di circa
30 km ed è sicuramente l’isola più aspra e rocciosa dell’arcipelago, caratterizzata da un
terreno lavico che consente il proliferare di una vegetazione arbustiva tipica della macchia
mediterranea. Fin dai tempi della civiltà etrusca la capra è sempre stata presente sull’isola;
tutt’oggi permane un nucleo costituito da circa 120 capi, ufficialmente indenni da
brucellosi, la maggior parte dei quali è rappresentato da soggetti derivati da incroci tra
Saanen, Camosciata delle Alpi e Sarda, allevati allo stato semibrado. Questi animali
possono usufruire sostanzialmente per tutto l’anno di pascoli caratterizzati da essenze
foraggiere ed arbustive peculiari dell’isola che conferiscono al latte aromi e sapori unici. Il
latte viene interamente trasformato per produrre la caciotta caprina a latte crudo dell’Isola
di Capraia che l’ARSIA (Agenzia Regionale per lo Sviluppo e l’Innovazione nel Settore
289
Agricolo-Forestale) ha inserito nell’elenco dei prodotti tradizionali della Toscana. La
caciotta viene prodotta nel periodo Marzo-Settembre con il latte della mungitura della sera
e della mattina; tutte le operazioni del processo produttivo vengono svolte manualmente
(rottura della cagliata, pressatura e salatura). Il prodotto è caratterizzato da un colore bianco
leggermente paglierino, da una forma cilindrica del peso di circa 600-800 gr, la crosta è
abbastanza evidente anche se piuttosto sottile, la pasta si presenta compatta e priva di
occhiature con consistenza più asciutta rispetto ai caprini freschi. Il sapore è meno acido e
più pronunciato in relazione al diverso stadio di maturazione del prodotto; generalmente
viene consumata dopo 15-20 giorni di maturazione, fino ad un massimo di 30-40 giorni di
stagionatura. La maturazione avviene all’interno di apposite celle del laboratorio di
trasformazione ad una temperatura di circa 18°C. La caciotta può essere trattata
esternamente in crosta con olio d’oliva sia per migliorarne l’aspetto estetico, sia al fine di
evitare eventuali crepe della crosta stessa legate a sbalzi di temperatura e ad eccessiva
disidratazione.
Scopo del presente lavoro è stato quello di effettuare la valutazione igienico-sanitaria e la
caratterizzazione microbiologica della caciotta caprina a latte crudo dell’Isola di Capraia al
fine di individuare ceppi di batteri lattici da impiegare per la produzione di uno starter
autoctono.
MATERIALI E METODI
L’indagine ha preso in considerazione tre cicli di caseificazione eseguiti con la medesima
modalità in tre diversi periodi dell’anno (da Marzo a Settembre) nei locali del laboratorio di
trasformazione dell’allevamento. Il formaggio è stato prodotto secondo la seguente
procedura:
1) Impiego del latte della mattina e della sera precedente refrigerato ad una temperatura di
3°C. 2) Duplice filtrazione del latte con filtri monouso di cellulosa. 3) Riscaldamento a
circa 35°C in caldaia di acciaio inox. 4) Coagulazione con caglio in polvere di vitello (titolo
di 1:125000) (operazione eseguita a latte fermo). 5) Attesa del tempo di coagulazione: 2040 minuti. 6) Rottura della cagliata con rompicagliata in acciaio inox fino al
raggiungimento delle dimensioni di un chicco di riso. 7) Prelievo e deposizione della
cagliata in fuscelle di materiale plastico forato mediante accurata pressatura. 8) Salatura
superficiale con sale da cucina a circa 12 ore dalla preparazione e successivo ribaltamento
della forma. 9) Stagionatura su assi di legno di abete a partire da un minimo di 15 giorni
fino ad un massimo di 35 giorni in locali stabilmente abilitati a temperatura di circa 18°C.
Per ciascuno dei 3 cicli di caseificazione oggetto dell’indagine sono stati analizzati durante
il processo di lavorazione i seguenti campioni del prodotto: latte prelevato in caldaia
immediatamente prima del riscaldamento, cagliata appena terminata la rottura, formaggio a
2, 7, 14, 21, 28 e 35 giorni di maturazione. Per il campionamento e l’allestimento delle
diluizioni si è fatto riferimento ai relativi Standard Internazionali FIL/IDF (50C: 1995 e
122C: 1996). Il campione della cagliata, di circa 200 grammi, è stato rapidamente conferito
in contenitore sterile e refrigerato al laboratorio assieme al campione di latte di partenza; i
formaggi sono invece stati fatti pervenire come forme intere per essere sottoposti alle
analisi microbiologiche entro 6 ore dal ricevimento. La determinazione del pH è stata
eseguita mediante PHMETER GLP21 (Crison) con elettrodo ad infissione. Sui campioni di
latte sono state eseguite diluizioni scalari da 10-1 a 10-8 in Peptone Water sterile (Oxoid).
290
Dalla cagliata e da ogni forma è stato prelevato sterilmente un settore a spicchio dal quale
sono stati ricavati 30 gr di prodotto impiegati per l’allestimento della sospensione madre.
Sono state eseguite diluizioni scalari da 10-1 a 10-8 in citrato sodico sterile al 2%. Sul latte è
stata determinata la carica mesofila totale mediante semina in doppio per inclusione di 1 ml
di ciascuna diluizione in terreno PCA (Plate Count Agar) (Oxoid) ed incubazione a 30°C
per 72 ore. Su latte, cagliata e campioni di formaggio sono state eseguite le seguenti
determinazioni microbiologiche: 1) Coliformi totali mediante semina in doppio per
spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno
VRBA (Violet Red Bile Agar) (Oxoid) ed incubazione a 37°C per 24 ore. 2) Escherichia
coli mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna
diluizione su piastre contenenti terreno TBX (Tryptone Bile X-Glucose Agar) (Oxoid) ed
incubazione a 44°C per 24 ore. 3) Staphylococcus spp. mediante semina in doppio per
spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno
Baird Parker Agar (Oxoid) con aggiunta di Tellurite Yolk Emulsion (Oxoid) e su piastre
contenenti MSA (Mannitol Salt Agar) (Oxoid) e successiva incubazione a 37°C per 48 ore.
4) Enterococchi mediante semina in doppio per spatolamento superficiale su piastre
contenenti terreno Kanamicina Esculina Azide Agar Base (Oxoid) con aggiunta di
Kanamicin Selective Supplement (Oxoid) di 0,2 ml di ciascuna diluizione e incubazione a
44°C per 24-48 ore. 5) Lattobacilli mesofili mediante semina in doppio per inclusione in
terreno MRS Agar (Oxoid) acidificato a pH 5,4 con acido acetico glaciale di 1 ml di
ciascuna diluizione e incubazione a 37°C per 72 ore in giara con atmosfera modificata al
5% di CO2. 6) Lattococchi mediante semina in doppio per inclusione in terreno M17 Agar
(Oxoid) di 1 ml di ciascuna diluizione e incubazione a 30°C per 24 ore. 7) Lieviti e muffe
mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su
piastre contenenti terreno YGCA (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar) (Difco) e
incubazione a 25°C per 5 giorni. (Salvatori Del Prato O., 1998) La caratterizzazione
fenotipica dei ceppi isolati è stata eseguita mediante API 50 CH (Biomerieux) per quanto
riguarda lattobacilli e lattococchi, mediante API Strep per quanto riguarda gli enterococchi.
(Innocenti et al., 2001; Pedonese et al., 2000; Pedonese et al.(2), 2002).
RISULTATI
Nelle tabelle 1,2,3,4 sono riportati i risultati delle analisi microbiologiche dai quali emerge
che i parametri igienico-sanitari rientrano costantemente nella norma. Nel grafico 1
relativo all’andamento del pH nelle tre prove di caseificazione è possibile notare un
decremento progressivo indice di una buona acidificazione (da valori di 6,65-6,7 del latte
fino a valori di 5 nel formaggio a 32 giorni ). Il grafico 2 descrive l’andamento dei batteri
lattici nel 1° lotto di produzione; è possibile notare un picco di crescita dei lattococchi a 2
giorni di stagionatura; i lattobacilli hanno un picco di crescita a 21 giorni, mentre gli
enterococchi mostrano un picco a 7 giorni. Nel grafico 3 sono descritti gli andamenti dei
batteri lattici relativi al 2° lotto di produzione; il picco dei lattobacilli si ha al 7° giorno e i
valori si mantengono elevati fino a 32 giorni, mentre i lattococchi mostrano il loro picco a
28 giorni e gli enterococchi a 14 giorni. Il grafico 4, relativo al 3° lotto di produzione
evidenzia come i lattobacilli si attestino su valori elevati a 7 giorni fino al picco massimo
raggiunto al 32° giorno. I lattococchi raggiungono il picco massimo a 7 giorni e si
mantengono su valori più elevati rispetto ai lattobacilli dal 2° al 32° giorno; gli
291
enterococchi mostrano il loro picco a 7 giorni ed il loro andamento è pressoché
sovrapponibile a quello dei lattobacilli. Nei grafici 5, 6 e 7 vengono riportati gli andamenti
dei batteri lattici per lotto di produzione; per quanto concerne i lattobacilli si ottengono
curve simili nei 3 lotti con valori più elevati nel 2° lotto a 32 giorni. L’andamento degli
enterococchi è sovrapponibile nei 3 lotti con punte massime nel 2° lotto. Per quanto
Tabella 1
Caratteristiche Microbiologiche e pH del Latte impiegato nelle 3 prove di
caseificazione
Prova 1
Prova 2
Prova 3
CBT (ufc/ml)
1,8x105
1,5x105
3,5x104
Stafilococchi (ufc/ml)
550
100
150
Coliformi totali (ufc/ml)
450
250
200
E.Coli (ufc/ml)
<50
<50
<50
Lattococchi (ufc/ml)
1,1x104
2,6x103
1000
5
Lattobacilli (ufc/ml)
2x10
1200
1000
Enterococchi (ufc/ml)
1x 104
800
<500
Lieviti (ufc/ml)
<30
<10
<10
Muffe (ufc/ml)
<50
<10
<10
pH
6,65
6,7
6,7
riguarda i lattococchi si assiste ad un andamento analogo nel 1° e 3° lotto di produzione,
mentre il 2° lotto presenta un andamento nettamente differente con valori più bassi rispetto
agli altri due lotti.
Tabella 2
Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della prima prova di caseificazione
Cagliata
2 gg
7 gg
14 gg
21 gg
28 gg
2000
1500
4150
1300
1000
1000
600
<500
300
3500
2550
6000
1100
<100
292
32 gg
E.Coli (ufc/ml)
<50
505
<500
<50
50
<50
<50
5x105
11,8x108
8x108
6,7x108
1,5x108
3,6x107
8x106
3x105
1,15x105
1,5x107
5x107
9x107
1x107
7,5x105
2,5x104
3x106
3,8x106
1,5x105
2x106
1,8x106
9x105
Lieviti (ufc/ml)
50
100
1x104
1,5x104
6000
7500
<10
Muffe (ufc/ml)
50
50
2000
2500
1000
1200
<10
pH
6,57
5,6
5,3
5,2
5,1
5
5,05
Tabella 3
Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della seconda prova di caseificazione
Cagliata
2 gg
7 gg
14 gg
21 gg
28 gg
32 gg
<100
<100
3500
5500
1500
100
120
<50
4000
1500
200
<100
<100
<100
E.Coli (ufc/ml)
120
<100
<100
1500
1600
1,6x10
2900
2700
2x105
6
7
950
1x10
Lieviti (ufc/ml)
<10
<10
Muffe (ufc/ml)
<10
<10
pH
6,68
5,7
4x10
<50
8
9,1x10
<50
7
4x104
7
3,8x10
<50
12,5x10
4x105
12,5x10
<10
3,6x10
<50
7
7
1,8x107
6
18,5x10
7
1x108
1,6x107
1,8x107
20
<10
<10
<10
50
10
<10
<10
<10
5,35
5,25
5,2
5,1
5
Tabella 4
Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della terza prova di caseificazione
Cagliata
2 gg
7 gg
14 gg
21 gg
28 gg
32 gg
410
<500
5000
7500
3800
2200
900
100
3000
1200
1400
2000
2800
260
E.Coli (ufc/ml)
<50
775
400
270
140
400
<10
1000
1,4x108
4x108
3,5x108
22,5x107
9x107
3,7x107
1000
1,5x104
6x105
8x105
8,1x105
3.5x105
1,8x106
6
6
<500
2x10
5
6,5x10
6
1x10
1,1x10
1x10
6
6x105
Lieviti (ufc/ml)
10
10
200
350
100
<10
<10
Muffe (ufc/ml)
10
<10
100
150
80
<10
<10
pH
6,55
5,72
5,45
5,3
5,2
5,1
5,1
293
Grafico 1
Valori pH
6,7
6,55
6,7
6,68
5,72
6,65
Latte
6,57
Cagliata
5,45
5,3
5,2
5,1
5,1
5,7
5,35
5,25
5,2
5,1
5
5,6
5,3
5,2
5,1
5
5,05
14 Giorni
21 Giorni
2 Giorni
7 Giorni
1°Lotto
Grafico 2
2°Lotto
28 Giorni
32 Giorni
3°Lotto
1° Lotto
Valori Logaritmici
10
8
6
4
2
0
Latte
Cagliata 2 Giorni 7 Giorni
Lattococchi
Grafico 3
Lattobacilli
21
Giorni
28
Giorni
32
Giorni
Enterococchi
Valori Logaritmici
2° Lotto
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Latte
Cagliata 2 Giorni 7 Giorni
Lattococchi
294
14
Giorni
14
Giorni
Lattobacilli
21
Giorni
28
Giorni
Enterococchi
32
Giorni
Grafico 4
3° Lotto
10
Valori Logaritmici
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Latte
Cagliata
2 Giorni
7 Giorni 14 Giorni 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni
Lattococchi
Grafico 5
Lattobacilli
Enterococchi
Valori Logaritmici
Lattococchi
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Latte
Cagliata
2 Giorni
1° Lotto
2° Lotto
3° Lotto
Lattobacilli
Valori Logaritmici
Grafico 6
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Latte
Cagliata
2 Giorni 7 Giorni 14 Giorni 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni
1° Lotto
2° Lotto
3° Lotto
295
Enterococchi
9
Valori Logaritmici
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Latte
Cagliata
2 Giorni
1° Lotto
2° Lotto
3° Lotto
Le specie di batteri lattici identificate mediante Api System, isolate sia a partire dal latte
che dai campioni di formaggio, sono state le seguenti: Lactobacillus paracasei,
Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus cremoris ed Enterococcus
faecalis.
CONCLUSIONI
Dalla valutazione dei risultati degli esami microbiologici eseguiti sui campioni prelevati nei
tre cicli di produzione si evidenzia una buona qualità del latte di partenza in relazione alla
CBT, alla colimetria ed al numero di stafilococchi coagulasi positivi. Nei campioni di
formaggio si osserva sostanzialmente un buon andamento delle cariche batteriche
riconducibili a coliformi ed a stafilococchi coagulasi positivi, le quali subiscono
fluttuazioni durante i vari stadi di maturazione rientrando però nei valori previsti per le
produzioni lattiero casearie a latte crudo; si evidenzia come sia molto contenuta anche la
presenza di lieviti e muffe. Pertanto i risultati conseguiti ci permettono di affermare che in
questa azienda si adempie correttamente alle BPL (Buone Pratiche di Lavorazione) sia nella
fase di mungitura e stoccaggio del latte, sia all’interno del laboratorio di trasformazione,
durante tutte le fasi del processo di caseificazione.
Per quanto concerne i batteri lattici si evidenziano cariche elevate relative ai lattobacilli che
mantengono valori relativamente alti a partire dalla prima settimana fino alla quinta mentre
i lattococchi presentano un picco elevato al secondo giorno contribuendo notevolmente
all’acidificazione, fatta eccezione per il secondo lotto di produzione nel quale hanno avuto
un comportamento anomalo.
L’andamento delle cariche relative agli enterococchi è molto simile a quello dei lattobacilli
con cariche massime nella seconda e quarta settimana.
La spiccata prevalenza, sia nel latte che nel formaggio, di specie omofermentanti, quali i
lattococchi, e di specie eterofermentanti facoltative quali i lattobacilli ha sicuramente
importanza durante l’acidificazione della cagliata (Dellaglio et al.,1995). Il loro
metabolismo infatti provoca una diminuzione del pH tale da demineralizzare la caseina,
primo importante passo verso la caseificazione. Questo ha condotto ad un buon processo
globale di acidificazione del formaggio, raggiungendo a 35 giorni di stagionatura valori di
296
pH compresi tra 5 e 5,1. Non meno importante risulta il ruolo svolto dagli enterococchi, ben
rappresentati nella caciotta caprina, i quali possono avere funzione significativa durante il
periodo di maturazione del prodotto in relazione al loro potere proteolitico. Questi
microrganismi, essendo molto resistenti al sale e diffusi nell’ambiente, vengono spesso
isolati da produzioni casearie artigianali (Rossi et al., 1994; Macedo et al.,1995; Pedonese
et al,(1). 2002). Gli enterococchi non possono però essere considerati dei meri contaminanti
tanto che alcuni Autori riconoscono loro un ruolo filo-caseario e li impiegano, come starter,
per la produzione di formaggi diversi (Cenci Goga et al., 1995).
Concludendo possiamo affermare che le specie identificate in questa indagine dimostrano
tutte un ruolo ben preciso durante la caseificazione e la maturazione della caciotta prodotta
da latte crudo caprino, senza aggiunta di starter. I lattococchi mesofili, probabilmente
assieme ai lattobacilli avviano l’acidificazione della cagliata e, quindi, il processo di
caseificazione. Durante la maturazione del formaggio, gli stessi lattococchi, i lattobacilli e
in particolare gli enterococchi, manifestano la loro azione proteolitica che contribuisce a
conferire sapore al prodotto. Alcuni tra i ceppi isolati potrebbero dunque venire impiegati
per l’allestimento di uno starter autoctono da utilizzare per la caciotta a base di latte crudo
di capra dell’Isola di Capraia, al fine di ottenere una produzione con caratteristiche
igienico-sanitarie, organolettiche e merceologiche molto più costanti nel tempo.
Ovviamente per poter far questo saranno necessari step fondamentali inerenti ai ceppi dei
batteri lattici isolati, a partire dalla conferma della identificazione fenotipica mediante
identificazione genotipica (PCR specie-specifica), biotipizzazione genotipica (REP-PCR e
RAPD-PCR) ed infine gli esami relativi alle caratteristiche metaboliche dei ceppi così
identificati: il potere acidificante, la determinazione dell’attività proteolitica, aminopeptidasica, glutammato-deidrogenasica, nonché il dosaggio di acetaldeide e diacetile.
BIBLIOGRAFIA
Cenci Goga B.T, Clementi F., Di Antonio E., 1995 Behaviour of lactic e non lactic
duringthe production and ripening of farmanufactured Pecorino cheese” “Annali di
Microbiologia e Enzimologia” 45: 219-235
Dellaglio F., Torriani S., Pattarini F., Ricci C, Di Bucchiarico R., 1995 “Identificazione e
caratterizzazione tecnologica della microflora lattica naturale del formaggio Pecorino
d’Abruzzo”Scienza e tecnica lattiero casearia” 46: 82-97
Innocenti E., Pedonese F., Nuvoloni R., Gerardo B., Giraffa G., Cerri D.2001
“Identificazione fenotipica e genotipica di batteri lattici isolati da formaggio pecorino a
latte crudo.” Atti A.I.V.I. , XI 119-123
Macedo A.C, Malcata F.X, Hogg T.A., 1995 “Microbiological Profile in Serra ewes’
cheese during ripening.” Journal of Applied Bacteriology 79: 1-11
Pedonese F., Nuvoloni R., D'Ascenzi C., Innocenti E., Cerri D.,Rindi S. 2000
“Caratterizzazione microbiologica di formaggio artigianale prodotto da latte crudo di
pecore di razza massese”. Atti VIII Congresso Fe. Me. S.P.Rum. 137-145
Pedonese F., Innocenti E., Nuvoloni R., Gerardo B., Cerri D., Rindi S., 2002 “Sensibilità
agli antibiotici,attività emolitica ed attività termonucleasica di enterococchi isolati da
formaggi pecorini tradizionali a latte crudo.” Atti A.I.V.I. Vol. XII, 151-156, (1)
Pedonese F., Innocenti E., Nuvoloni R., D'Ascenzi C., Giraffa G., Neviani E., Rindi S.,
Cerri D., 2002 “Caratterizzazione delle microflore autoctone del formaggio tradizionale
297
ovino prodotto nel “Parco Regionale Migliarino, San Rossore, Massaciuccoli”, Scienza e
Tecnica Lattiero-casearia, n.. 3, vol. 53, 213-234, (2)
Rossi J., Durant C., Gobetti M., 1994 “Indagine preliminare sull’impiego di enterococchi
nella produzione di Pecorino Umbro” Industria del Latte 30: 41-53
Salvatori Del Prato O., 2001 “Trattato di tecnologia casearia” Edagricole Bologna Cap
.(3,5,9,11,18,22)
298
OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS OSEAS PARCIALMENTE
PURIFICADAS A PARTIR DE HUESO BOVINO.
EXTRACTION OF PARTIALLY PURIFIED BONE MORPHOGENETIC PROTEINS
FROM BOVINE BONE.
BUSTAMANTE CANO JJ*, RIVERA POSADA J**, FERNÁNDEZ REVUELTA J,
ALONSO ALONSO P, ALONSO DIEZ AJ, GONZÁLEZ MONTAÑA JR.
Dpto. Medicina Veterinaria. Facultad de Veterinaria. Universidad de León.24007. León.
* Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Pamplona.Colombia.
** Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Antioquia. Colombia.
SUMMARY.
Bone morphogenetic proteins (BMPs) are peptides produced locally by the osteoblasts and
regulated by endocrine mechanisms, which can influence the different processes of
proliferation and cellular differentiation, the synthesis of proteins and the production of
bone material.
The purpose of this research was to extract from bovine bone and through physical and
chemical procedures, BMPs partially purified, with high-quality osteoinduction
characteristics, low antigenicity and high bioavailability. These proteins will be utilized as
bone graft material. The procedure was performed through five basic steps: milling bovine
bone, lipid extraction, demineralization, collagen extraction, obtention of the protein
fraction. These steps were verified respectively through the following analysis: The Soxhlet
method, atomic absorption for calcium determination, Van Gieson Pycrofucsin Stain,
Polyacrilamide Gel-Electrophoresis-Sodium-Duodecyl-Sulphate (PAGE-SDS). BMPs
partially purified were obtained through Polyacrilamide Gel-Electrophoresis-SodiumDuodecyl-Sulphate (PAGE-SDS, with molecular weights among 18 - 120 KDa and mainly
bands at 18, 24, 34, 68, 72, 90 and 120 KDa.
This material was lyophilized, packed and stored in a vacuum sailed narrow naked bottle
for posterior use. BMPs obtained were used later to verify their characteristics
osteoinductives. Subcutaneous implants of this material were placed in rabbits like an
experimental model.
KEY WORDS: biomaterials, osteoregeneration, BMPs, bovine bone.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas morfogenéticas óseas (PMO) son péptidos producidos localmente por los
osteoblastos y regulados por mecanismos endocrinos, que pueden influenciar los diferentes
procesos de proliferación y diferenciación celular, la síntesis de proteínas y la producción
de material óseo. Son reguladores fundamentales en la formación de tejido óseo y en su
reparación, influenciando la proliferación y diferenciación de las células mesenquimales
indiferenciadas en cartílago o en osteoblastos.
La pérdida de gran cantidad de hueso, tras traumatismos o resección de hueso neoplásico,
lleva a rellenar ese espacio mediante materiales que funcionan como relleno del espacio
vacío. Estos materiales se denominan injertos óseos. Actualmente, la función de soporte y
estabilidad puede obtenerse mediante una fijación interna rígida, mientras que el implante o
299
injerto soporta un peso y realiza funciones clásicamente llamadas “de entramado” o “de
andamio”, para facilitar el crecimiento de hueso nuevo en el huésped. El proceso
tridimensional de crecimiento y formación de capilares, de tejido perivascular y de células
osteogénicas desde el lecho receptor al interior de la estructura del implante o injerto se
denomina osteoconducción (Cardona, 1997).
Los injertos que contienen PMO tienen una serie de ventajas sobre los injertos
convencionales, principalmente derivadas de que el proceso de formación de nuevo hueso
es más rápido. Las implicaciones de estas investigaciones son inmensas, ya que el cirujano
puede usar un implante de tipo estructural (andamio) como la hidroxiapaatita y con la
ayuda de las PMO se puede promover el crecimiento de nuevo hueso en un tiempo
considerablemente reducido. La hidroxiapatita aporta sus propiedades osteoconductivas,
mientras que las PMO están proporcionando las propiedades osteoinductivas.
El propósito de esta experiencia fue obtener Proteínas Morfogenéticas Óseas parcialmente
purificadas. Para ello, a partir de hueso bovino, y mediante sencillos procedimientos fisicoquímicos hemos obtenido una pequeña cantidad de Proteínas Morfogenéticas Óseas
parcialmente purificadas, para su posterior ensayo en animales de experimentación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se recogieron 3 Kg de hueso fresco de bovino (hueso cortical) en un matadero, siendo
refrigerados en hielo seco (-40° C). Tras eliminar los tejidos blandos, las epífisis y la
médula ósea, se lavaron con agua destilada. Los huesos, tras congelarse, se trituraron
manualmente hasta obtener partículas de aproximadamente 1 mm. Mediante un molino
Thomas-Willey se obtuvieron partículas no superiores a 150 µm. Posteriormente se
adicionó una solución de azida de sodio NaN3 (5 mmol/l) al agua desionizada y destilada
para facilitar la limpieza de sangre de los canales vasculares.
Para extraer los lípidos se tomaron 1678 g del hueso molido, y se lavaron con una mezcla
de cloroformo-metanol (1:1), durante 6 horas, con agitación permanente. Tras la filtración,
se dejaron secar a temperatura ambiente. El cloroformo y el metanol son solventes
orgánicos que disuelven los lípidos separando las moléculas y ocupando los espacios
sobrantes. El metanol convierte las grasas naturales presentes en ésteres y glicerol, siendo
estos últimos solubles en agua. El cloroformo desalcoholiza la suspensión.
Para provocar una descalcificación se utilizó una solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,6 N
durante 6 horas con agitación permanente y se filtró el material con papel Warthman n° 1.
El producto obtenido se lavó con agua destilada para eliminar el exceso de ácido y
estabilizar el pH de la solución. El ácido clorhídrico extrae los fosfatos de calcio que son
solubles en ácido, así como también los aminoácidos, péptidos y otras sustancias de bajo
peso molecular.
A fin de solubilizar el colágeno se adicionó a la muestra una solución de cloruro de calcio
(CaCl2) 2 M y ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 0,5 M manteniéndolo durante 12
horas a 4°C, con agitación permanente y filtrando posteriormente con papel Warthman n°
1. El cloruro de calcio (CaCl2) es una sal que convierte el colágeno óseo en gelatina
permitiendo una rápida separación y solubilización de las PMO, lo que facilita su
extracción.
El último paso para extraer las proteínas morfogénéticas óseas se realizó partir de la
gelatina de matriz ósea insoluble. Para ello se tomaron 504 g y se utilizaron 4 litros de una
300
solución a partes iguales de urea 6 M, CaCl2 0,5 M, NEM (N–etilmaleimida) 1 mM y
benzamidina HCl 0,1 mM a temperatura ambiente durante 24 horas. Se filtró la solución
con papel Warthman n° 1 y se dializó, mediante membranas de diálisis, contra agua
destilada durante 3 días a 4ºC (realizando 3 cambios de agua por día), calentando el
material (entre 30 y 35 ºC), siempre que fue necesario.
El material que quedó en las bolsas de diálisis se centrifugó a 10.000 rpm para obtener un
precipitado, el cual se lavó con agua a 4 °C, para posteriormente ser liofilizado.
Para la obtención de un producto de buena calidad bacteriológica fue necesario trabajar en
estrictas condiciones de esterilidad, y especialmente después de la desmineralización con el
ácido clorhídrico, ya que con este procedimiento se elimina la contaminación bacteriológica
y viral, y se obtiene un producto prácticamente estéril.
Para realizar la liofilización, se tomaron las proteínas refrigeradas y se colocaron en el
interior de una cámara de bioseguridad sobre hielo seco para mantener la baja temperatura
necesaria para impedir su activación. Posteriormente se comenzaron a envasar en ampollas
de vidrio de boca ancha y luego se colocaron en los diferentes mecanismos de aspiración
del liofilizador con capacidad para 50 unidades. Tras lograr la sublimación bajo vacío se
procedió a flamear el cuello de las ampollas de vidrio, sin quitarlas del equipo, para
asegurar su envasado al vacío y su completa esterilización. Finalmente se depositaron en un
congelador a -148 °C hasta el día en el que fueron implantadas en animales vivos.
Las pruebas realizadas para verificar la correcta extracción de PMO de hueso bovino fueron
las siguientes:
1. Prueba de verificación de grasa o prueba de Soxhlet mediante extracción con éter de
petróleo y calentamiento moderado.
2. Determinación de calcio por absorción atómica.
3. Prueba tinción de Van Gieson, con fuccsina ácida 0,05% (p/v) en solución de ácido
pícrico al 95% saturado.
4. Electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico. Se utilizaron 30 µg/ml de
proteína que fue aplicada a un gel de 12,6% con un 3% de Stacking gel a 25 mA. Los geles
fueron teñidos con 0,25% de azul brillante de Coomassie y plata. Para la determinación de
los pesos moleculares aparentes se utilizaron los siguientes estándares: miosina: 217.000, βgalactosidasa: 126.000, albúmina sérica bovina: 73.000, anhidrasa carbónica. 43.500,
inhibidor de tripsina de soja: 31.600, lisozima: 18.000 y aprotinina: 7.500.
5. Prueba BCA de Pierce. Es una formulación detergente compatible, basada en el ácido
bicinconínico (BCA) para la detección colorimétrica y cuantificación de proteínas totales.
Ello se realiza para conocer la cantidad de proteínas que se habían extraído por medio de
los procedimientos químicos anteriormente mencionados.
301
El presente estudio no pretende identificar las Proteínas Morfogenéticas parcialmente
purificadas obtenidas de hueso bovino. Únicamente pretendemos realizar una estimación de
sus pesos moleculares, ya que los equipos y materiales precisos para lograr una completa
identificación de las PMO son de costos muy elevados y difíciles de conseguir. Para ello es
preciso obtener anticuerpos específicos que reaccionen ante las proteínas conseguidas y un
equipo específico para su purificación y caracterización total.
El material final obtenido fueron 50 g de PMO, cantidad baja si pensamos que partimos de
3000 g de hueso bovino. Sin embargo es importante tener en cuenta que con cantidad
mínima (2-10 mg) son suficientes para inducir diferenciación celular hasta hueso lamelar a
las 8 semanas según los investigadores revisados (Kusumoto et al, 1988; Oksanen et al,
1988; Boyan et al, 1992; Viljanen et al, 1996; Fujimura et al, 1997). La bibliografía
consultada al respecto, en ningún caso indica los rendimientos obtenidos en cada paso, sólo
cita la cantidad de hueso utilizado en la molienda y en algunos casos la fracción final de
PMO obtenida.
La prueba BCA para determinar la cantidad de proteínas presentes en la muestra nos
proporcionó el dato de 1867 µg/ml, aún siendo una cantidad baja, se considera adecuada
para inducir osteosíntesis.
La extracción de lípidos, para determinar las grasas presentes, mediante el método de
Soxlhet, permitió obtener un contenido en grasas del 0,556%. La cantidad de lípidos
presentes en la muestra es muy baja, por lo tanto, no afectó al procedimiento químico de
obtención de las PMO. Los lípidos interfieren en la estimación precisa de la concentración
302
de proteínas en la prueba de BCA. Por lo tanto, aunque la cantidad de lípidos presentes es
baja, pudo haber interferido en la cantidad de proteína encontrada. Se obtuvieron 1867
µg/ml de proteínas lo que nos lleva a pensar que la cantidad de proteínas por ml podría ser
aún mayor.
La valoración del calcio mediante técnicas de absorción atómica determinó que la muestra
enviada poseía un 12,69 % de calcio (12,69 g/100 g). La descalcificación al no ser completa
afecta la cantidad de proteína extraída en el procedimiento químico impidiendo su
liberación (Reddi, 1972).
La determinación de los pesos moleculares realizada por electrofóresis en gel de
poliacrilamida dodecil sulfato sódico, permitió observar proteínas con rangos de peso
molecular entre 18 y 120 KDa (figura 2). A las PMO obtenidas se les realizó filtración por
medio de cromatografía encontrando 3 fracciones de PMO. La fracción I con pesos
moleculares entre 100- 700 kDa, la fracción II con pesos moleculares entre 25-55 kDa y la
fracción III entre 15-25 kDa, teniendo un componente dominante, con peso molecular de 18
kDa.
Los resultados logrados en la presente investigación concuerdan con los hallazgos
encontrados en otras investigaciones (Hanamura, 1980; Mizutani, 1982; Urist et al, 1982;
Urist et al, 1984; Boyan et al, 1992). Las PMO más importantes presentan pesos
moleculares de 12, 18 y 23 kDa. Mizutani y Marshall (1982) obtuvieron PMO de origen
bovino, mediante filtración por diferentes métodos, obteniendo
proteínas de 22 kDa y fracciones proteicas de 17,5 kDa y 24
kDa. Además de las PMO entre 20 y 40 kDa obtenidas por
Ashby et al (1996), encontraron una pequeña fracción de
polipéptido soluble en agua de 2,5 kDa, que creemos que en
nuestra experiencia pudo haberse disuelto o perdido en los
diferentes lavados del procedimiento de obtención. Entre las
proteínas encontradas por Wang et al (1988) con 16, 18 y 30
kDa, éstas últimas son las más representativas y de más
cantidad y, con las que indujeron formación de cartílago y
hueso con 50 ng ultrapurificados.
Viljanen et al (1996) y Viljanen y Lindholm (1997) extrajeron
PMO de alce y probaron su capacidad osteoinductora por
medio de la implantación intramuscular (0,5 - 20 mg) en ratas,
la posterior evaluación histológica y radiográfica concluyó que la implantación de 2 mg es
suficiente para inducir formación ósea. Si bien las fracciones con pesos moleculares entre
100- 700 kDa y las fracciones con 15-25 kDa (con un componente dominante con peso
molecular de 18 kDa) produjeron inducción ósea, en cambio la fracción con entre 25-55
kDa únicamente produjo reacción inflamatoria. Por tanto se debe tener en cuenta que
existen fracciones proteicas de menos de 18 KDa que poseen propiedades osteoinductoras.
CONCLUSIONES
1. Es posible la obtención de Proteínas Morfogenéticas Óseas (PMO) parcialmente
purificadas mediante sencillos procedimientos fisico-químicos a partir de hueso bovino.
2. El procedimiento de extracción precisa cinco etapas básicas: molienda, extracción de
lípidos, desmineralización, extracción del colágeno y obtención de la fracción proteica
303
3. Se ha obtenido un material con proteínas de peso molecular entre 18 y 120 Kda. Este
material puede ser liofilizado y almacenado en ampollas de vidrio selladas al vacío para su
conservación y posterior uso.
4. Mediante este sencillo procedimiento es posible el abaratamiento del producto. Su precio
se vería reducido al menos a la quinta parte del precio actual de mercado.
BIBLIOGRAFÍA
Ashby E, Rudkin G, Ishida K, Miller T. Evaluation of a novel osteogenic factor, bone cell
stimulating substance, in a rabbit cranial defect model. Plastic and Reconstructive Surgery.
1996; 98 (3): 420–426.
Bolander ME, Balian G. The use of demineralized bone matrix in the repair of segmental
defects. Augmentation with extracted matrix proteins and a comparison with autologus
grafts. The Journal of Bone and Joint Surgery, 1986; 68 (8): 1264-1274.
Boyan D, Schwartz Z, Swain L, Aruna G, Heckman J, Ramirez V, Peters P, Carnes D.
Initial efects of partially purified bone morphogenetic protein on the expression of
glycosaminoglican, collagen and alkaline phosphatase in nonunion cell cultures. Clinical
Orthopaedics and Related Research. 1992; 278: 289-304.
Bowman SM, Zeind J, Gibson LJ, Hayes WC, McMahon TA. The Tensile Behavior of
Demineralized Bovine cortical Bone. J. Biomchanics 1996; 29 (11): 1497-1501.
Broz JJ, Simske SJ, Greenberg AR. Material and compositional properties of selectively
demineralized cortical bone. Journal of Biomechanics. 1995; 28 (11): 1357-1368.
Cardona, JJ. Obtención y caracterización de hidroxiapatita sintética. Tesis de grado.
Universidad de Antioquia. Facultad de Ingeniería. Departamento de ingeniería metalúrgica
y materiales. Medellín 1997:
Han B, Yang Z, Nimni M. Effects of moisture and temperature on the osteoinductivity of
demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2005; 23: 855-861.
Han B, Tang B, Nimni, ME. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive
activity of demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2003; 21: 648 654.
Hanamura H. Solubilized bone morphogenetic protein (bmp) from mouse osteosarcoma and
rat demineralized bone matrix. Clinical Orthopaedics and Related Research. 1980; 148:
281-290.
Mizutani H, Marshall U. The nature of bone morphogenetic protein (BMP) fractions
derived from bovine bone matrix gelatin. Clinical Orthopaedics and Related Research.
1982; 171: 213–223.
Reddi AH, Huggins C. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts
in adolescents rats. Proc. Nat. Acad. Sci. 1972; 69 (6): 1601-1605.
Urist R Lietze A, Mizutani H, Takagi K, Triffit J, Amstutz J, Delange R, Termine J,
Finerman G. A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein (BMP) fraction.
Clinical Orthopaedics and Related Research. 1982; 162: 219–232.
Urist R, Huo K, Brownell A, Hohl M, Buyske J, Lietze A, Tempst P. Purification of bovine
bone morphogenetic protein by hydroxyapatite chromatography. Proceedings of the
National Academy of Sciences. USA 1984; 81: 371-375.
304
Viljanen VV, Lindholm TS. Comparision of native xenogenic and allogenic bone
morphogenetic proteins in the sheep skull defect assay model. Annales Chirurgiae et
Gynaecologiae 1997; 86 (3): 255-259.
Viljanen VV, Gao T, Marttinen A, Lindholm T. Partial purification and characterization of
bone morphogenetic protein from bone matrix of the premature moose (Alces alces):
degradation of bone-inducing activity during storage. European Surgical Research 1996; 28
(6): 447-460.
Walsh WR, Christiansen DL Demineralized bone matrix as a template for mineral-organic
composites. Biomaterids 1995; 16: 1363-1371.
Wang A, Rosen V, Cordes P, Hewick M, Kriz J, Luxenberg D, Sibley B, Wozney J.
Purification and characterization (biochemistry) of other distinct bone-inducing factors.
Proceedings of the National Academy of Sciences. USA 1988; 85: 9484–9488.
305
EFFECT OF THE REPEATED DOSES OF PROSTAGLANDINS ON THE
UTERINE DISCHARGES IN THE COWS WITH RETAINED FETAL
MEMBRANES
HAMALI H.,
Department of Theriogenology,Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz,
Tabriz-Iran, Tel:+989141145575,Fax: +984113357834
ABSTRACT
Long time uterine discharge in the cows with retained fetal membranes (RFM) is the most
prominent feature that causes infertility and low conception rate in the dairy cows.
For determine of the best prostaglandin injection program for treatment of uterine
discharges, a total 150 RFM cows were selected in the farms of Tabriz(north-west of Iran)
and randomly categorized in three groups of A,B and C ( n=50).
In the group of A, 25mg PGF2α(Lutalyse,Upjohn Ltd, containing 25mg dinoprost as
33.6mg of dinoprost tromethamine with 0.9% benzylalcol as preservative) were injected to
cows on 8 and 15 days postpartum. In the group of B, 25mg PGF2α were injected to cows
on 8, 15 and 22 days postpartum. In the group of C, 25mg PGF2α were injected to cows on
8, 15, 22 and 29 days postpartum. On day 35 postpartum all of cows were examined by
rectal palpation and vaginoscopy for detecting the uterine discharges and endometritis. In
the group of A, 17 cases (34%), in the group of B, 9 cases (18%) and in the group of C, no
any case (0%) of endometritis were observed. Significant statistical differences were
observed between three groups. These results indicated that injections of PGF2α on days 8,
15, 22 and 29 postpartum are necessary for treatment of uterine discharges in the RFM
cows.
KEY WORDS: cow- prostaglandin- retained fetal membranes-retained placenta
INTRODUCTION
Long time uterine discharge in the cows with retained fetal membranes (RFM) is the most
prominent feature that causes infertility and low conception rate in the dairy cows.
When the placenta is not removed completely, a prolonged vaginal discharge follows. In
the some cows, even, uterine discharge extended beyond the 50 days of postpartum (6).
This feature causes the increased days of open, increased service per conceptive indices,
increased calving interval and decreased conception rate. In a study conducted in The
Netherlands with 160,000 calving, the relative economic impact expressed in percentage
was identified in four main areas: decreased milk production (40%), increased veterinary
services (32%), increased culling rate (19%), and increased calving interval (9%)(4). Many
approaches have been used to treat or prevent of uterine infections. These include systemic
antibiotherapy, intrauterine antibiotic infusion, and intrauterine infusion of antiseptics.
None of these methods are completely effective in treating the uterine infections (1).
The preference of prestaglandins to the antibiotics in the treatment of uterine infections,
already have been proved (7). But, the frequency of the prostaglandin injections have not
been determined. The aim of this research was the determining of the best program for
prostaglandin injections in the RFM cows.
306
From January 2004 - January 2006 a total number of 150 RFM cows in the farms of Tabriz
( north – West of Iran) were selected and randomly divided to three groups of A,B and C
(n=50) . After manual removal of their placenta, prostaglandin injection to these cows was
begun on 8 days postpartum. In group of A, 25mg PGF2α ( lutalyse, Upjohn Ltd, containing
25mg dinoprost as 33.6mg of dinoprost trome thamine with 0.9% benzylalcol as
preservative) were injected to cows on 8 and 15 days postpartum. In group of B, 25mg
PGF2α were injected to cows on 8, 18 and 22 days postpartum. In group of C, the same of
PGF2α were injected to cows on 8, 15, 22 and 29 days postpartum. On 35 days postpartum
all cows in three groups were examined by rectal palpation and vaginoscopy for detecting
the uterine discharge and endometritis.
RESULTS
In the group of A, 17 cases (34%) and in the group of B, 9 cases (18%) of cows with
uterine discharges were detected. In the examination of the cows in group of C, uterine
discharge or endometritis were not detected (0%) (Fig.1).
50
Per
percent of uterine discharge
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Group A
Group B
Group C
Fig.1. Percentage of uterine discharge in three groups of A (2 injections of PGF2α ), B (3
injections of PGF2α ) and C (4 injections of PGF2α ) on 35 days of postpartum.
Collected data from three groups of cows, analyzed by statistical method of chi-square and
statistical differences were observed between three groups (P≤0.05).
307
DISCUSSION
The syndrome of retained fetal membranes (RFM) in the cows is one of the most important
problems that affect cows in the farms of Iran and other countries. Many approaches have
been used to detach RFM. These include manual removal, attachment of a weight to the
membranes to speed expulsion and administration of uterokinetic drugs, sulfonamids,
prostaglandins (6), antibiotics, antiseptics and hormones. A new approach for the treatment
of RFM is the injection of collagenase into the umbilical arteries retrieved from RFM (2, 3).
However, after the expulsion or manual removal of the RFM.(5), the long time uterine
discharge is a very serious problem in this cows. Previous researchers have been
emphasized that in treatment of uterine infection, PGF2α is more efficacious than
antibiotics (7). But the dose and frequency of prostaglndin have not been determined yet.
For this reason, in this research we focused on the frequency of the prostaglandin treatment
and our results indicted that the injections of the 25mg PGF2α on 8, 15, 22 and 29 days
postpartum are necessary for treating the uterine discharges in the RFM cows.
REFERENCES
Drillich M., Mahlstedt M., Reichert U., Tenhagen B.A., Heuwieser W.: Strategies to
improve the therapy of retained fetal membranes in dairy cows. J Dairy Sci. 2006 Feb; 89
(2): 627-35
Eiler H., Hopkins F M.: Bovine retained placenta: Effects of collagenase and hyaluronidase
on detachment of placenta. BioI Reprod 1992:46:580
Eiler H., Hopkins FM.: Successful treatment of retained placenta with umbilical cord
injections of collagenase in cows. J. Am. Vet Med Assoc 1993; 203:436
Joosten I., Stelwagen J, Dijkhuizen A.A.: Economic and reproductive consequences of
retained fetal membranes in dairy cattle. Vet Rec 1988; 123: 53.
Harnali H., Karimi H.:Comparative study on three different times for manual removal of
retained fetal membranes in the cow. (In print)
Harnali H.: The time dependency effect of prostaglandin injections on the cows with
retained placenta. Proceeding of the 13th Congress of Fe. Me.S.P Rum.1-3 September
2005, Bari, Italy.
Paisly L.G., Mickelsen W. D., Anderson P .B; Mechanisms and therapy for retained fetal
membranes and uterine infections of cows. Theriogenology Vol.25, NO.3, 1986, P: 353381.
308
ECOGRAFIA DEL CAPEZZOLO MEDIANTE IMMERSIONE IN ACQUA:
VALUTAZIONE NELLA BOVINA IN LATTAZIONE E ASCIUTTA
ULTRASONOGRAPHY OF TEAT BY WATER-FILLED CUP: EVALUATION IN
LACTATING AND DRIED COWS
DE DOMENICO A., PARISI F., LA SPISA M.*, PUGLIESE M., NIUTTA P.P., DE
MAJO M.
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie – Università di Messina (Italia) - * Med. Vet.
collaboratore esterno
KEY WORDS: Teat, ultrasonograpy, water filled cup, cows.
SUMMARY
In bovine medicine, examination of the teat is an important application. Ultrasonography
allows for the localization and demarcation of the extent of teat stenoses and other
abnormalities of the teat. The objective of this study was to evaluate various kinds of waterfilled cup ultrasonography technique on teats and the different aspects of ultrasonic images
of teats in lactation and in the dry period (measurement of teat canal length, teat diameter,
cistern diameter and teat wall thickness). Clinical and ultrasonographic teat examinations of
30 multiparous cows (all Holstein-Friesian, 15 lactating and 15 dried) were performed.
Ultrasonography was performed using Esaote-falco-100® ultrasonography units with linear
2-D transducer (6-8 MHz). The good cup was small, with thin wall and slightly flexible (7
cm diameter, 12 cm height, 0.5 mm thickness). Significant differences emerged between
lactating and dried cows. In some cows we found teat stenosis. Ultrasonography of teats by
water-filled cup is useful for appraising the different aspects of teats in dried and lactating
cows, but it is important to utilize a suitable cup. This technique could be useful to diagnose
anomalies of the teat that could lead to mastitis.
INTRODUZIONE
L’incremento produttivo e l’esigenza di avere sempre maggiori prodotti di qualità, nel
rispetto della sicurezza alimentare, hanno portato negli ultimi anni ad un innalzamento degli
standards igienico-sanitari della produzione e all’immissione di sistemi di indagine
articolati e sofisticati. In particolar modo questi sistemi operativi hanno trovato
applicazione nella produzione lattea, dove si richiede una riduzione assai marcata delle
cellule somatiche e la presenza di requisiti sempre più intransigenti per il conferimento dei
premi di qualità. Questo comporta una maggiore attenzione da una parte, ai processi
infettivi ed infiammatori della ghiandola, con particolare riguardo alla prevenzione e a tutti
quei fattori responsabili di entità nosologiche, dall’altra ai diversi distretti: cisterna
capezzoli dotti galattofori e sfinteri. Quest’ultimi oltre a rendere difficili le operazioni di
mungitura, possono rappresentare i pabula laeta per l’insediamento di processi patologici
responsabili di entità di non trascurabile interesse. Va considerato che le stesse operazioni
di mungitura sono capaci di provocare alterazioni, a volte patologiche, dei capezzoli (7, 9, 18,
19
). Quindi, se da un lato attraverso l’esame clinico dell’organo è possibile giungere ad una
diagnosi e, talvolta ad una prognosi, in molti casi si ha la necessità di ricorrere ad esami più
approfonditi, come ad esempio l’esame ecografico, strumento non invasivo di facile
309
applicazione che consente la valutazione della morfologia e della struttura dell’organo
stesso, portando all’identificazione di eventuali processi patologici.
Oltre alle già consolidate applicazioni dell’indagine ecografia nel campo della ginecologia,
l’ecografia della ghiandola mammaria e del capezzolo possiede interessanti potenzialità
nell’allevamento di vacche da latte ad alta produzione. Infatti, le informazioni che si
possono ottenere, accompagnate dai risultati dell’esame obiettivo particolare (E.O.P.)
dell’organo e degli esami di laboratorio, risultano particolarmente utili per formulare una
diagnosi, emettere una prognosi ed effettuare terapie appropriate (4, 5, 6). L’esame clinico del
capezzolo, riveste un ruolo fondamentale per lo stato sanitario della mammella in toto in
quanto, essendo di fatto la “porta dell’organo con il mondo esterno”, l’insorgenza di
processi mastitici spesso dipende dalla sua integrità (6, 16). Allo scopo di valutare l’integrità
anatomica del capezzolo, diversi Autori hanno studiato la possibilità di applicare
l’ecografia attraverso l’utilizzo di diverse metodologie (1, 10, 17). Queste applicazioni
ecografiche, attraverso alcune misurazioni (lunghezza e diametro del canale, diametro della
cisterna, spessore della parete), hanno consentito di correlare eventuali modificazioni alle
tecniche di mungitura meccanica e al prolungamento della stessa (8, 11, 12, 13, 14, 15). Obiettvi
del presente lavoro sono stati la valutazione in campo di differenti tipi di contenitori da
utilizzare per l’esame ecografico del capezzolo immerso in acqua e, ancora, la valutazione
delle modificazioni delle strutture anatomiche del capezzolo in relazione alla fase di
lattazione e di asciutta.
MATERIALI E METODI
Sono state utilizzate 35 bovine di razza Holstein-Friesian, multipare, allevate in una azienda
zootecnica sita nella provincia di Ragusa (Italia). Dei 35 animali, 20 erano in lattazione
(metà lattazione) e 15 in asciutta (da 9-30gg). Dall’anamnesi remota, risultava che alcuni
animali avevano presentato in passato episodi mastitici, trattati farmacologicamente con
successo. L’anamnesi prossima di alcune bovine in lattazione (n° 5) riportava svuotamento
difficoltoso dei quarti mammari alla mungitura meccanica, infatti nell’unità di tempo si
raccoglieva meno latte rispetto alle mungiture precedenti. Su tutti gli animali sono stati
effettuati esame obiettivo generale (E.O.G.), l’esame obiettivo particolare (E.O.P.) della
mammella in toto ed, infine, sulle bovine sane (15 in lattazione e 15 in asciutta), l’esame
ecografico del capezzolo mediante immersione in acqua. All’esame ispettivo della
mammella e del capezzolo, era possibile registrare in due bovine alterazioni a carico dei
meati esterni dei condotti papillari con ispessimento cutaneo (casi 1-2) (Fig. 9-10) e
difficoltà nello svuotamento dei quarti; alcun sintomo degno di nota nelle altre. Per
effettuare le indagini ecografiche, è stata utilizzata una macchina portatile Esaote-falco100® (Pie Medical Equipment B.V.–Philipsweg 1 6227 AJ Maastricht The Netherlands)
con sonda da 6-8 Mhz. Le video-immagini sono state registrate mediante masterizzatore
DVD+RW ed acquisite su Personal Computer. Tutte le ecografie sono state realizzate in
sala mungitura (Fig. 1) ad una temperatura ambientale di 27°C±2. Per ottenere delle buone
immagini ecografiche sono stiti valutati sperimentalmente quattro tipi di contenitori plastici
diversi per forma e consistenza:
1. bicchiere comune di plastica per uso alimentare (Fig. 2);
2. contenitore per detersivo da bucato, con impugnatura e ritagliato nella parte
inferiore (fig.3);
310
3.
4.
contenitore artigianale in plexiglass con 2 supporti (orizzontale e verticale) per la
sonda ecografica, dalle dimensioni di 15x15x15 cm e dello spessore di 3 mm nella
porzione di contatto con la superficie di lettura della sonda (Fig. 4);
contenitore per paillettes da fecondazione artificiale di dimensione 7x12x0.05 cm
rispettivamente di diametro, altezza e spessore (Fig. 5).
Per la valutazione dei contenitori sono stati considerati: qualità dell’immagine ecografica e
praticità di esecuzione dell’esame. Nella superficie di contatto tra sonda e contenitore è
stato applicato del gel ecografico. Le ecografie sono state effettuate su tutti i capezzoli delle
30 bovine, sia in scansione orizzontale che verticale, in modo da comprendere il capezzolo
dal meato esterno del condotto papillare fino alla piega anulare del seno galattifero. I
contenitori, riempiti con acqua corrente alla temperatura di 18°C, prima di passare da un
capezzolo all’altro, venivano lavati e disinfettati con clorexidina. Sui capezzoli delle 30
bovine sane sono state effettuate le seguenti misurazioni morfo-metriche: (a) lunghezza del
canale (Teat Canal Length, TCL); (b) diametro (Teat Diameter, CD); (c) diametro della
cisterna misurata a 10 mm da (b) (Cistern Diameter, CD); (d) spessore della parete (Teat
Wall Thickness, TWT) (fig. 6). Le misurazioni di (b) e (d) sono state realizzate anche in
scansione orizzontale, mentre le altre esclusivamente in verticale. Le misure dei vari
distretti considerati, sono state effettuate mediante software applicato alle immagini
acquisite su PC. Per tutte le misure sono stati calcolati valore medio e deviazione standard
sia nelle bovine in lattazione che in asciutta. I valori sono stati confrontati mediante test di
Student con significatività statistica per P < 0.001.
RISULTATI
Per quanto riguarda il contenitore n°1 (bicchiere di plastica), le immagini ecografiche
ottenute risultavano di qualità media anche se, datii i bruschi movimenti dell’animale, la
rottura del bicchiere era una evenienza frequente. Utilizzando il contenitore n° 2, comodo
da maneggiare per la presenza dell’impugnatura ergonomica, si ottenevano buone
immagini, ma l’eccessivo contenuto in acqua portava ad un esagerato affaticamento
dell’operatore dopo pochi minuti di utilizzo. Il terzo contenitore (n° 3), oltre ad essere poco
pratico per le stesse motivazioni espresse per il contenitore precedente, dava delle immagini
con presenza di artefatti di riverberazione nella porzione prossimale dell’immagine
ecografica (Fig. 7). L’ultimo contenitore (n° 4), oltre ad essere perfettamente dimensionato
per il capezzolo bovino, ha permesso di ottenere eccellenti immagini ecografiche sia in
scansione orizzontale che verticale; inoltre era possibile realizzare scansioni apicali (Fig. 8),
ponendo la sonda sulla base dello stesso. L’esame ecografico dei capezzoli degli animali
positivi all’E.O.P. (casi 1-2) ha fatto emergere allo stesso livello, un tipico aspetto
iperecogeno, riconducibile a processi infiammatori cronici (Fig. 9a-10a). Per gli altri
soggetti negativi all’E.O.P., in tre casi è stato possibile mettere in evidenza processi
patologici. In una bovina (Caso 3 - fig. 11) si osservava ecograficamente una
neoformazione ecogena (lunghezza 3,4 cm) a livello della cisterna del capezzolo, il canale
era anecogeno e quindi dilatato, edema di una porzione della mucosa della cisterna e, nello
spessore della parete, una varice di 1 cm di diametro. Nei casi 4 (Fig. 12) e 5 (Fig. 13) si
repertavano strutture ecogene, riconducibili a neoformazioni, all’interno del canale del
capezzolo che lo ostruivano a gradi differenti. Tutti i casi patologici riportati sono stati
311
riscontrati in bovine in lattazione. Nelle figure 14-15 e 16-17 vengono riportati alcuni
aspetti ecografici di capezzoli fisiologici rispettivamente in asciutta e in lattazione. I
risultati delle misurazioni, delle deviazioni standard e del confronto statistico tra le stesse
nei due gruppi vengono riportate in tabella 1. Le misurazioni (c) e (d) relative agli animali
in asciutta non sono state effettuate in quanto l’aspetto ecografico non consentiva una
misurazione precisa.
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
E’ oramai accertato che l’ecografia del capezzolo nella bovina risulta un potente strumento
diagnostico. In precedenti indagini gli stessi Autori avevano valutato la possibilità di
effettuare l’ecografia del capezzolo sia poggiando il trasduttore direttamente sulla cute, che
previa immersione del capezzolo in acqua (5), mediante l’utilizzo di un condom o di
differenti contenitori plastici così come suggerito da altri Ricercatori (1, 2, 3, 13). Riscontrata
la possibilità di ottenere buone immagini utilizzando le tecniche per immersione, è stato
ritenuto interessante approfondire le conoscenze sull’utilizzo di un contenitore
standardizzabile, di facile reperimento, dal prezzo modesto con il quale si potessero
ottenere immagini di qualità superiore ed il cui uso risultasse assolutamente pratico.
Dall’analisi delle differenti tecniche, si evince come l’utilizzo della sonda applicata
direttamente sulla cute, ma anche attraverso l’interposizione di un condom riempito di
acqua, risulti poco pratico. Difatti il sistema sonda-capezzolo, è eccessivamente mobile in
entrambi i casi e ancora per effetto della forza di gravità, il condom ripieno di acqua tende a
scivolare verso il basso e la porzione dorsale del capezzolo non è sempre ben leggibile.
Inoltre la necessità di mantenere il capezzolo in posizione corretta (interfaccia sonda
capezzolo), porta spesso alla deformazione dell’organo; sulla superficie al disotto della
sonda si esercita una compressione e su quella opposta alla sonda, una deformazione
causata dalla digito-pressione esercitata dall’operatore. In questi casi le immagini
risultavano spesso artefatte. Tra i differenti contenitori utilizzati nel presente lavoro, quello
assolutamente pratico e con il quale si ottengono le migliori immagini è risultato il n° 4:
involucro per paillettes da fecondazione artificiale. Oltre ai motivi sopra esposti, l’utilizzo
di questo contenitore ha permesso di effettuare scansioni apicali, utili soprattutto nella
valutazione della porzione distale del capezzolo, spesso interessata da processi patologici.
L’ennesima dimostrazione del potere diagnostico della tecnica ecografica per immersione
effettuata con un buon contenitore è stata dimostrata dal fatto di diagnosticare patologie del
capezzolo che non erano emerse all’ E.O.P.. Le lesioni riscontrate sui meati esterni dei
capezzoli nei casi 1 e 2, erano causate verosimilmente dall’impianto di mungitura non
perfettamente calibrato (eccessiva depressione) e da alcune tettarelle particolarmente
usurate. Relativamente all’aspetto ecografico che assume il capezzolo in asciutta, si è visto
come questo sia diffusamente ecogeno a dimostrazione di una sua significativa riduzione di
volume con conseguente collabimento delle pareti mucose della cisterna; questi aspetti sono
dimostrati dalla diminuzione della TCL (lunghezza del canale del capezzolo) e del TD
(diametro del capezzolo). L’aspetto ecografico, riscontrato in tutte le bovine in asciutta, ha
reso difficoltose le misurazioni del CD (diametro della cisterna del capezzolo) e dello TWT
(spessore della parete del capezzolo), in quanto, i limiti morfo-strutturali utilizzati per le
misurazioni non risultavano ben differenziati e le relative misurazioni sarebbero state
approssimative. Concludendo, si ritiene che la metodica ecografica mediante immersione
312
del capezzolo in acqua, realizzata in modo standardizzabile, possa permettere, oltre alla
diagnosi di patologie difficilmente rinvenibili mediante il comune E.O.P., la possibilità di
effettuare valutazioni morfo-strutturali tali, da esprimere importanti considerazioni in quei
periodi particolarmente delicati, rappresentati dalla messa in asciutta della bovina e dalla
ripresa della lattazione. Il mancato riscontro di queste modificazioni morfo-strutturali a
carattere protettivo potrebbe rappresentare un importante fattore di rischio per l’insorgenza
di processi infettivi di tipo ascendente del quarto mammario.
IMMAGINI E TABELLE
Fig 1
Fig 2
Fig 3
Fig 4
Fig 5
Fig 6
313
Fig 7
Fig 8
Fig. 9a
Fig 9
Fig 9a
314
Fig 10
Fig 10a
Fig. 11
Fig 12
Fig. 13
Fig 14
Fig 15
Fig 16
315
Fig. 17
BIBLIOGRAFIA
Ayadi M, Caja G, Such X, Knight CH. (2003). Use of ultrasonography to estimate cistern
size and milk storage at different milking intervals in the udder of dairy cows. J Dairy Res.
Feb;70(1):1-7.
Babkine M. (2004). Ecografia del capezzolo e della mammella. Esami complementari in
clinica bovina. pp.100-104. Ed. Point Veterinaire Italie s.r.l.
Beal, W.E., Perry R.C. and Corah, L.R. (1991). The use of ultrasound in monitoring
reproductive physiology in beef cattle. Journal of Animal Science 70: 924-929.
David E. Gleeson, Edmond J. O’Callaghan and Myles V. Rath (2002). Effect of milking on
bovine teat tissue as measured by ultrasonography. Irish Veterinary Journal Volume 55
(12): December.
De Majo M., Pugliese M., De Domenico A., Lo Magno G., Niutta P.P. (2004)
Ultrasonography of the udder and teat canal in cows: personal observation. The 12th
Congress of Mediterranean Federation for Health and Production of Ruminants. Istanbul
16-19 September.
Du Preez, J.H. (1985). Teat canal infections. Kieler Milchwirtschaftliche
Forschungsberichte 37: 267-273.
Francis, P.G. (1981). Teat lesions and machine milking. In: Mastitis Control and Herd
Management, National Institute for Research in Dairying Technical Bulletin No. 4: pp 237250.
Gleeson, D.E. and O'Callaghan, E. (1998). The effect of machine milking on teat tissue
reaction using ultrasonic analysis. Proceedings of the 37th Annual Meeting of the National
Mastitis Council Inc. St. Louis, Missouri, USA. pp 254-255.
Hamann, J. and Mein, G.A. (1990). Measurement of machine-induced changes in the
thickness of the bovine teat. Journal of Dairy Research 57: 495-505.
Hamann, J., Mein, G.A. and Nipp, B. (1995). Recommended method for measuring
changes in thickness of the bovine teat with springloaded calipers. Journal of Dairy
Research 63: 309-313.
Hamann, J., Mein, G.A. and Wetzel, S. (1993). Teat tissue reactions to milking: effects of
vacuum level. Journal of Dairy Science 76: 1040-1046.
316
Hamann, J., Nipp, B. and Mein, G.A. (1988). Improving milk quality by improving teat
condition: a new method of measuring teat tissue reactions to milking. Milchwissenschaft
43: 651-653.
Khol JL, Franz S, Klein D, Lexer D, Waiblinger S, Luger K, Baumgartner W.(2006)
Influence of milking technique and lactation on the bovine teat by means of
ultrasonographic examination. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. Jan-Feb;119(1-2):68-73.
Neijenhuis F, Klungel GH, Hogeveen H.(2001). Recovery of cow teats after milking as
determined by ultrasonographic scanning. J Dairy Sci. Dec;84(12):2599-606.
Neijenhuis, F. (1999). Recovery of cow teats after milking: Ultrasonic scanning. In:
Proceedings of International Conference on Mastitis and Machine Milking. Silver Springs
Hotel, Cork. pp 39-41.
O'Brien, B. (1988). Milking machine factors affecting intra-unit pathogen transfer, teat
condition and occurrence of mastitis infections in bovines. Ph.D. Thesis, National
University of Ireland.
Spencer S.B., Griel, L.C. and Goldberg J.J. (1996). Bovine teat congestion as measured by
ultrasonography. Journal of Dairy Science 79: 257.
Woolford, M.W. and Philips, D.S.M. (1978). Evaluation studies of a milking system using
an alternating vacuum level in a single chambered teatcup. In: Proceedings, Annual
Meeting, National Mastitis Council 17: 125-149.
Zecconi, A., Hamann, J., Bronzo, V. and Ruffo, G. (1992). Machine induced teat tissue
reactions and infection risk in dairy herd free of contagious mastitis pathogens. Journal of
Dairy Research 59: 265- 271.
317
ENDOPARASITES IN A FLOCK OF ZERASCA, AN ITALIAN
AUTOCHTONOUS BREED OF SHEEP
PERRUCCI S. 1, BIANCHI C. 1, BENVENUTI N. 2, GORACCI J. 2, FICHI G. 1,
GIULIOTTI L. 2
1
Dipartimento di Patologia Animale - Profilassi ed Igiene degli Alimenti - Faculty of
Veterinary Medicine, University of Pisa (Italy)
2
Dipartimento di Produzioni Animali - Faculty of Veterinary Medicine, University of Pisa
- Viale delle Piagge, 2 – 56124, Pisa (Italy); Tel: +39.050.2216893; Fax:
+39.050.2216901; E-mail: [email protected]
ABSTRACT
In this work the endo-parasites of Zerasca sheep, an autochthonous breed of Tuscany
(Italy), were investigated for the first time. The evaluation of the zootechnical risks linked
with these diseases and of the efficacy of control measures used in the examined flock
represented other important aims.
During a period of 15 months, individual faecal and blood samples were collected
monthly from 45 animals. Blood samples were used to evaluate the Packed Cell Volume
(PCV), while on faecal samples parasitological analysis were performed with flotation
tests, a modified McMaster method and with sedimentation. Quantitative data of
gastrointestinal nematodes (EPG) and coccidian (OPG) were statistically analyzed.
Results obtained show the presence in the flock of coccidia, gastrointestinal and lung
strongyles, whip-worms, cestodes (Moniezia benedeni) and flukes (Dicrocoelium
dendriticum, Fasciola hepatica and Paramphistomidae). All these parasites can be
responsible for negative effects on sheep productions. EPG number resulted highly
influenced (P<0.01) by the date of sampling, while PCV and EPG values showed a
negative correlation (P<0.01). Significant influence between OPG and data of sampling
and age of animals (p<0.001) was also found.
The use of collective pastures represents the main characteristic of the breeding of Zerasca
sheep. Thus, in our opinion the use of common management practices are fundamental for
an efficacious control of the endo-parasitic diseases in this autochthonous breed.
KEY WORDS: sheep, Zerasca breed, autochthonous breed, endoparasitic diseases,
prevalence, seasonal variability, zootechnical risk, control.
INTRODUCTION
Zerasca sheep is a native Italian breed with endangered status. Today, Zeri lamb has a
considerable economic impact on the territory, ensuring increasing profits for shepherds.
The Zeri region is located in northwest Tuscany at an altitude of 600-1200 m in the
Lunigiana countryside, where natural pastures and woods of chestnut, beech, alder, hazel
and acacia are the most important sources for animal nutrition. Moreover, the climate is
generally extremely variable, implying inconstant quantitative and qualitative grazing land
productions. This situation has considerable effects on meat production, forcing breeders
to provide nutrition for the animals in winter and in summer, requiring them to send the
flocks to high altitude territory, where there is greater availability of grass. Generally,
mothers lead their lambs to pasture all year round, except for winter periods, when they
318
are kept indoors, due to adverse climatic conditions. However, regular and frequent
rainfall assure the good fertility of the land (Verità et al., 2001).
Zeri is an example of the younger generation’s determination to keep sheep breeding
closely connected to the territory. Thus, after a period of total abandonment and serious
risk of extinction, the Zerasca breed has begun to recover, thanks to various public
interventions (Mountain Communities, Local Administration and Agencies, Pisa
University) and to the aforementioned determination of individual farmers - especially
women - organized by a Consortium (“Consortium for the Valorization and Safeguarding
of Zerasca Sheep and Lambs”) born in 2001.
Zeri lamb is a sturdy animal, medium-large in size and with a white fleece. Zeri sheep
have milk high in nutrients. Lambs are usually slaughtered at the age of 60-90 days for the
production of heavy lambs (Martini et al., 1993).
Moreover, it is important to underline that Zeri has another typical production associated
with sheep breeding: the “mezzalana”, a mixture of wool and hemp used for the
manufacture of socks, sweaters, carpets, mattresses, pillows and special long full skirts
(the traditional women’s clothing) (Verità et al., 2001).
Parasitic diseases represent one of the most important health problem of sheep in Italy
(Ambrosi, 1995). Among them, endo-parasitic diseases greatly impairs animal productivity
trough reduction in voluntary food intake and/or decrease in the efficiency of nourishments,
particularly, in the inefficient use and absorption of nutrients. Disturbance in protein
metabolism and reduced assimilation and/or retention of minerals are particularly
significant. As a consequence, growth, milk, wool production and reproductive efforts
could be reduced in parasitized animals. Pathological lesions caused by endoparasites can
lead to the exclusion from human nutrition of slaughtered and infected animals or be
responsible for severe clinical forms, particularly in young animals even till death
(Casarosa, 1985; Ambrosi, 1995; Urquhart et al. 1996; Coop and Kyriazakis, 2001;
Cringoli, 2003). For all these reasons, an efficient control of endoparasitic diseases results
extremely important in sheep breeding.
Thus, for the first time, in the present study the endo-parasitic diseases present in a flock
of Zerasca sheep were investigated. The evaluation of the zootechnical risks linked with
these diseases and of the efficacy of control measures used in the examined flock
represented other important aims of this work.
In the present study parasitological analysis were performed in order to: 1. know the
endoparasites of Zerasca sheep; 2. evaluate the prevalence and variability of each
endoparasitosis in the course of a year; 3. assess the zootechnical risks linked with the
endoparasitoses present in the flock; 4. estimate the efficacy of control measures used in
the farm.
Flock
The farm breed 90 ewes for heavy lamb production (22-35 kg of live weight in 60-90
days). It is located at an altitude of 800 m a.s.l., typified by a climate midway between
Mediterranean and Continental conditions. During the course of the study animals were
treated with Febendazol (Panacur) in April 2004.
319
Sampling
From January 2004 to March 2005, faecal and blood samples were collected monthly from
45 animals (36 sheeps and 9 lambs).
Blood samples
Blood samples were collected from the jugular vein and PCV was estimated by capillary
microhematocrit analysis using a hematocrit centrifuge (Centrifugette 4203 ALC®).
Faecal samples
Faecal samples were individually collected directly from the rectal ampoule and
individually examined quail-quantitatively as follow.
Qualitative methods (Ambrosi, 1995; Urquhart et al. 1996 ; Gibbson et al., 2005)
Flotation test by using a low specific gravity solution (s.g.: 1.200) for the search of:
coccidia, gastrointestinal nematodes (gastrointestinal strongyles, Trichuris spp.) and
cestodes.
Flotation test by using a high specific gravity solution (s.g.: 1.450) for the search of
Dicrocelium dendriticum.
Baermann method for the search of lung strongyles that were identified at the species level.
Sedimentation method for detecting Fasciola hepatica and Paramphistomidae.
Faecal cultures to obtain the infective L3 stage of gastrointestinal strongyles (Henriksen
and Horsholm, 1983) in order to identify the genera (M.A.F.F., 1986) that were expressed
in percentage.
Quantitative methods (Permin and Hansen, 1998)
Modified McMaster Method to estimate the FEC of gastrointestinal strongyles (EPG) and
Eimeria spp. (OPG).
Statistical Analysis (J.M.P., 2002)
Quantitative data were statistically analyzed by ANOVA.
The tested factors in the model were represented by data of sampling, age of animals and
physiological status (peri-parturient period: about one month before and after the
parturition).
Data regarding strongyles eggs and coccidia oocysts were logarithmic transformed [y =
log(X + 25)] to normalize variance (Baker et al., 1997).
Post-drench samples (May and June 2004) were excluded from statistical analysis.
320
RESULTS
Dicrocoelium dendriticum and Paramphistomidae prevalence was high during all the year
(mean values 97.3% and 71.2% respectively), showing that sheep grazed in extremely
contaminated pastures. Their seasonal fluctuation was in accordance with previous studies
on other italian sheep breeds, confirming a summer decrease for D. dendriticum and a
spring rise and an autumn decrease for Paramphistomidae. The prevalence found for flukes
(Fig.1) could be linked with possible productive performance losses (Ambrosi, 1995;
Urquhart et al., 1996).
Fig. 1. Monthly fluctuation of the three different species of Trematodes.
FH
PF
DD
100
%
80
60
40
20
M
ar
. '0
4
A
pr
.'0
4
M
aj
' 04
Ju
n.
' 04
A
ug
.'0
4
Se
p.
'04
O
ct
.'0
4
N
ov
. '0
4
D
ec
. '0
4
Ja
n.
' 05
M
ar
. '0
5
0
Month
If compared with the other species, the prevalence of F. hepatica resulted lower, and it was
not constant during the year.
Among cestodes, Moniezia benedeni resulted the unique species isolated. Trend showed a
spring and autumn rise, in accordance with other italian sheep breeding realities (Ambrosi,
1995).
Whip worms had a non-linear prevalence in the year, showing a trend similar to cestodes.
As reported in other Italian areas (Ambrosi, 1995), isolated lung strongyles (Cystocaulus
ocreatus, Dyctyocaulus filaria, Mullerius capillaris, Protostrongylus rufescens, e
Neostrongylus linearis) showed an autumn and winter rise, even with an inconstant
distribution along the year.
Strongyloides papillosus showed a not regular prevalence, with peaks that appeared to be
related with lambing.
Gastro-intestinal strongyles (Fig. 2) were constantly present in faecal samples (Fig. 3).
321
Fig. 2. Monthly variation of gastro-intestinal strongyles genera (%).
Month
February
March
April
May
June
July
August
September
October
November
December
February
March
Year
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2005
2005
Cooperia
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
Chabertia Haemonchus Oesophag. Bunostomum Ostertagia Trychostr.
2.5
6.4
51.3
0
20.5
19.2
0
19.1
14.2
0
3.8
4.3
18.8
8.6
21.11
0
31.7
18.4
0
50
0
0
50
0
0
0
5.3
0
87.3
1.9
2.2
18.6
4.9
0.7
34.9
38.6
19.5
11.7
24.4
1.1
22.4
19.3
5
7.7
23.6
0
46
24.8
4.3
17.3
17.4
0
26.1
34.8
1.5
8.8
8.8
0
27.9
50
0
0
0
0
46.1
46.1
3.6
0
1.9
0
15.3
78.3
16.4
6
20.1
0
10.4
43.3
Strongyloides
0
53.5
1
0
5.4
0
0
0.6
0
3
7.7
0
3
Fig. 3. Gastro-intestinal strongyles prevalence.
Marc
Dece
Octo
Augu
May
Marc
150
100
50
0
A comparable trend of FEC in the period comprised from January to April 2004 and from
May 2004 and April 2005 was observed with a decrease of FEC in April just after the time
of large infection (Fig. 4).
Figure 4. Trend of FEC and PCV.
322
March
January
November
September
July 2004
May 2004
March
January
March
Decem
Octob
Augus
May
March
Coccidia prevalence was constantly high with young animals showing a larger number of
OPG than adults (Fig. 5). An OPG reduction after the treatment with the anthelmintic drug
(April) was noticed (Fig. 6). This result seem to suggest a possible indirect action of the
anthelmintic treatment, with the enhancement of the whole physiological response of the
animals.
Fig. 5. Coccidia prevalence.
Fig. 6. Trend of OPG during the trial.
150
100
8000
50
6000
0
4000
2000
0
Statistical analysis (J.M.P., 2002) showed a non significant influence between FEC, age of
animals and their physiological status, while revealed significant influence of data of
sampling on FEC (p<0.001), negative correlation between FEC and PCV and significant
influence between OPG and data of sampling and age of animals (p<0.001).
CONCLUSIONS
Results obtained showed the presence in the flock of coccidia, gastrointestinal and lung
strongyles, whip-worms, cestodes (Moniezia benedeni) and flukes (Dicrocoelium
dendriticum, Fasciola hepatica and Paramphistomidae). All these parasites, alone or in
association, can be responsible for negative effects on sheep health and productions
(Urqhuart et al., 1996).
Seasonality of all isolated endoparasites resulted similar to other italian sheep breeds
(Ambrosi, 1995) and prevalence resulted higher in spring and autumn in most of them.
This was confirmed also by statistical analysis for coccidia and gastrointestinal strongyles.
Endoparasitic diseases control methods used in the flock were not satisfactory at all and
represented by nutrient supplementation of the diet in winter: young animals and late
pregnancy or early lactation sheeps often can’t get enough protein from pastures, especially
from low quality grazing lands (Louvandini et al., 2006). In addition, the farmer
systematically used two anthelmintic treatments, particularly against strongyles
(Albendazol, Gardal in December 2003; Febendazol, Panacur in April 2004). These
drugs are efficacious also against other nematodes, against cestodes and, only partially,
against flukes.
On the basis of data obtained in the present study, it is possible to suggest the following
other measures for a more efficacious control of endoparasitic diseases: 1. nutrient
supplementation differenced on the basis of animal age and peri-parturient period
(Kyriazakis and Houdijk, 2006); 2. treatment more targeted against flukes and coccidian,
323
according to animal age and endoparasitic infection (necessity for a continuous
parasitological monitoring in the flock); 3. use of other non-chemical worm control
methods, such as selection for resistance and grazing management.
However, the frequent utilize of collective pastures represents the main characteristic of
the breeding of Zerasca sheep. Thus, in our opinion, the use of common control measures
and management practices are fundamental for an efficacious control of the endo-parasitic
diseases in Zerasca sheep, in order also to reach a real valorization and safeguarding of
this autochthonous breed of Tuscany.
REFERENCES
Ambrosi M. (1995). Parassitologia Zootecnica. Ed. Edagricole, Bologna (Italy).
Casarosa L. (1985). Parassitologia degli animali domestici. Ed. Ambrosiana, Milano.
Coop R.L. and Kyriazakis I. (2001). Influence of host nutrition on the development and
consequences of nematodes parasitism in ruminants. Trends in Paras., 17: 325-330.
Cringoli G. (2003). Mappe parassitologiche. Ed. Litografia Vigilante s.r.l., Napoli.
Gibbons L.M., Jacobs D.E., Fox M.T., Hansen J. (2005). The RVC/FAO guide to
Veterinary Diagnostic Parasitology. Part 1 Ruminants: faecal examination for helminth
parasites. www.fao.org/ag/againfo/resources /documents/Parasitology/Index/Index.htm.
Henriksen A. and Horsholm H. (1983). A method for culture and recovery of
gastrointestinal strongyle larvae. Vet. Med., 35: 429-430.
J.M.P. (2002). J.M.P. User’s Guide ver. 5.0. S.A.S. Institute Inc., Ed. Cary (NC), USA.
Kyriazakis I. and Houdijk J. (2006). Immunonutrition: nutritional control of parasites.
Small Rum. Res., 62 (1-2): 79-82.
Louvandini H., Veloso C.F.M, Paludo G.R., Dell’Porto A., Gennari S.M., MsManus C.M.
(2006). Influence of protein supplementation on the resistance and resilience on young
hair sheep naturally infected with gastrointestinal nematodes during rainy and dry seasons.
Vet. Paras., 137 (1-2): 103-111.
Martini M., Verità P., Cecchi F., Ricci G., Giuliotti L., Colombani B. (1993). Prove di
accrescimento e rese alla macellazione della popolazione ovina Zerasca. Proc. XXVIII
Simp. Int. Zoot., Ed. Dip. Sci. Zot. Torino, 14 May 1993, Milan (Italy): 365-380.
Ministry of Agriculture Fisheries and Food (M.A.F.F.). (1986). Manual of Veterinary
Parasitological Laboratory Techniques. HMSO, London: pp. 152.
Permin A. and Hansen J. (1998). Epidemiology, diagnosis and control of poultry parasites.
FAO Animal Health Manual.
Urquhart G.M., Armour J., Duncan J.L., Dunn A.M., Jennings F.W. (1996). Parassitologia
veterinaria, Ed. UTET.
Verità P., Martini M., Cecchi F., Colombani B. (2001). La popolazione ovina Zerasca:
studi per una sua valorizzazione. Ed. Centro Tipografico Università di Pisa: pp. 91.
324
TREMATODOSIS PARASITARIAS EN BOVINOS SACRIFICADOS EN EL
NOROESTE DE ESPAÑA
PARASITIC TREMATODOSIS IN SLAUGHTERED CATTLE FROM NW SPAIN
ARIAS, M., LOMBA, C., PAINCEIRA, A., VÁZQUEZ, L., CIENFUEGOS, S.,
DACAL, V., PEDREIRA, J., SÁNCHEZ-ANDRADE, R., MORRONDO, M.P., PAZSILVA, A.
Parasitología y Enfermedades Parasitarias, Dpto. Patología Animal. Facultad de
Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 27002-Lugo (Spain).
ABSTRACT
The climatic conditions in NW Spain enhance the presence of the trematoda Fasciola
hepatica, Dicrocoelium dendriticum and Calicophoron daubneyi, and these parasites may
cause elevated economical losses. A study to know the true prevalence of these
trematodosis was conducted, and the liver, rumen and abomasum of 334 cattle slaughtered
in NW Spain were examined.
The prevalence of fasciolosis was 29%, 1.5% for dicroceliosis and 11.2% for
paramfistomosis. By considering the origin of the samples, we observed the highest
seroprevalence of fasciolosis and paramfistomosis in Ourense (80% and 100%,
respectively), and in Lugo for dicroceliosis (1.4%). The greatest seroprevalence of
fasciolosis was observed in the oldest cattle (36%), whereas that of dicroceliosis in cattle
under 2 years and that of paramfistomosis in 3-6 yr cattle. One surprisingly result was the
elevated prevalence of fasciolosis, because of the number of treatments/year has been
significantly increased. These results mark the needed for control-measures to reduce the
presence of F. hepatica and C. daubneyi especially.
INTRODUCCIÓN
Los sistemas de explotación extensivos o semi-extensivos empleados en la cría del ganado
bovino, aumentan de forma notable las posibilidades de que los animales adquieran
infecciones de etiología parasitaria. Tienen especial importancia las trematodosis, siendo
las más frecuentes las ocasionadas por Fasciola hepatica, Dicrocoelium sp., y distintos
géneros de la familia Paramphistominae. Los dos primeros en estado adulto se localizan en
el hígado y vesícula biliar, mientras que los paramfistomas adultos se localizan en el rumen
y con menor frecuencia en el retículo de sus hospedadores definitivos. Todos ellos
ocasionan importantes pérdidas económicas debido al descenso de la productividad de los
animales (Díaz et al., 2001; Padungtod et al., 2001) al decomiso de órganos en el matadero
(Rangel-Ruíz et al., 2003), e incluso a la mortalidad (Boray, 1959).
La similitud entre la fase externa del ciclo de Calicophoron daubneyi y Fasciola hepatica
es tal, que incluso comparten el mismo hospedador intermediario, caracoles acuáticos del
género Lymnaea (Szmidt-Adjide et al., 2003), por el contrario el ciclo endógeno en ambos
parásitos es muy distinto, en el caso de Calicophoron daubneyi, tras la ingestión de las
metacercarias infectivas que se encuentran fijadas en la hierba, éstas se desenquistan en el
duodeno, liberando las adolescarias que se fijan en la mucosa y a partir de las 6-8 semanas
regresan al abomaso y posteriormente al rumen, en donde se asientan definitivamente entre
las microvellosidades, para después de unas 3-4 semanas comenzar la puesta de huevos que
325
se eliminan con las heces del hospedador. La fase interna del ciclo de Fasciola hepatica
comienza también con la liberación de las adolescarias en el intestino, pero en este caso las
fasciolas juveniles emigran atravesando el parénquima hepático hasta los conductos
biliares, en donde maduran y comienzan a eliminar huevos con las heces de los animales. El
ciclo de Dicrocoelium sp. evoluciona en su fase externa en moluscos terrestres y hormigas,
y en estado adulto se localiza al igual que Fasciola hepatica en conductos biliares y
vesícula biliar.
El norte de España ofrece las condiciones apropiadas para el desarrollo de la fase externa
del ciclo vital de F. hepatica y de C. daubneyi, desde los factores climáticos con
temperaturas suaves y lluvias abundantes durante gran parte del año, hasta las edáficas ya
que son frecuentes los terrenos llanos y poco drenados que constituyen los hábitats idóneos
para el caracol Lymnaea truncatula. La presencia de Dicrocoelium sp. por el contrario está
tradicionalmente ligada a terrenos calcáreos, en pastos de montaña y asociada
fundamentalmente al ganado ovino, siendo reciente la primera denuncia de este trematodo
en ganado vacuno en Galicia (Morrondo et al., 2003).
El diagnóstico rutinario y directo de estas parasitosis consiste en la observación de huevos
de los trematodos en las heces de los animales parasitados, sin embargo, a menudo pasan
desapercibidas infecciones de baja intensidad, y además hay que esperar a que los parásitos
alcancen la madurez sexual para poder encontrar huevos en las heces. Por esta razón, se han
desarrollado diferentes técnicas inmunoenzimáticas, como el ELISA (directo e indirecto),
para detectar la presencia de antígenos parasitarios y de anticuerpos específicos (IgG), sin
embargo los datos obtenidos, son un poco discordantes al emplear las distintas técnicas. Por
todo ello, el objetivo de este trabajo es conocer de forma directa la prevalencia de las
trematodosis hepáticas y gástricas, en bovinos sacrificados en Galicia.
MATERIAL Y MÉTODOS
El estudio se llevó a cabo desde febrero de 2004 hasta junio de 2006. Una vez a la semana
se recogieron hígados, vesículas biliares y rúmenes-retículos de bovinos sacrificados en el
matadero local Novafrigsa (n=406). Cada uno de los órganos examinados se identificó
teniendo en cuenta el animal del que procedía y se tomó nota de la edad, raza y procedencia
del mismo, después de un meticuloso examen de dichos órganos, los ejemplares parásitos
recolectados se identificaron y se contaron.
Para establecer si la prevalencia de parasitación estaba relacionada con la edad, raza o zona
de procedencia de los animales, se agruparon del siguiente modo:
Así, según la edad de los animales distinguimos tres grupos: grupo 1, ≤ 2 años, (2% de los
animales); grupo 2, 3-6 años, (36% de los animales) y grupo 3, ≥7 años, (62% de los
animales). Según la raza de los animales diferenciamos entre: frisona (80% de los
animales); Rubia Gallega (10% de los animales); cruces (8%) y otras (2% de los animales).
Por último, los agrupamos teniendo en cuenta la provincia gallega de procedencia: Lugo
(39% de los animales); A Coruña (31% de los animales); Pontevedra (28%) y Ourense (2%
de los animales).
326
Grupo 1
(≤
≤2 años)
2%
Grupo 2
(3-6 años)
36%
Grupo 3
(≥
≥7 años)
62%
Rubia Cruces
8%
Gallega
10%
P o nt e v e dra
28%
Otras
2%
A C o ruña
3 1%
Frisona
80%
O ure ns e
2%
Lugo
39%
Al examinar los hígados se comprobó que el 29% tenían ejemplares de Fasciola hepatica y
el 3´5% de Dicrocoelium sp., mientras que en el 12% de los rumenes se encontraron adultos
de Calicophoron daubneyi. Estos datos coinciden con lo observado por Morrondo et al.
(2003), que establecían que las trematodosis más comunes en el ganado bovino de Galicia
son por orden decreciente fasciolosis, paranfistomosis y dicroceliosis.
Es interesante destacar que este estudio fue desarrollado con animales procedentes de zonas
con temperaturas medias y altas precipitaciones, las cuales son muy adecuadas para el
desarrollo del caracol Lymnaea truncatula, hospedador intermediario de Fasciola hepatica
y Calicophorom daubneyi (Morrondo et al., 1994).
Son escasos los estudios llevados a cabo en matadero en los países de nuestro entorno para
detectar la presencia de trematodos. Szmidt-Adjide et al. (2000), señalaron que el 20% de
los bovinos sacrificados en varios mataderos de Francia estaban parasitados por
Calicophoron daubneyi, porcentaje similar al apuntado por Scala et al. (1997) en un estudio
realizado en un matadero de Cerdeña, este mismo autor señala además que en el 31 % de
los hígados de los bovinos, encontraron adultos de Dicrocoelium sp.. Theodoropoulos et al.
(2002) en mataderos de Grecia únicamente detectaron Dicrocoelium sp. en el 2% de los
hígados examinados, porcentaje muy inferior al 21% señalado por Ansari-Lari et al. (2006)
en hígados decomisados en un matadero en el sur de Irán.
En Tanzania, Keyyu et al. (2006), destacaron que al estudiar órganos de bovinos que habían
salido al pasto, la prevalencia de anfistómidos (62´6%) era mayor que la de Fasciola
327
hepatica (46´1%). En los últimos años, son varios los autores que mediante coprología han
detectado un notable aumento de la paramfistomosis (Szmidt-Adjide el al., 2000; Mage et
al., 2002), según estos autores este hecho está relacionado con el elevado potencial
biológico del caracol que actúa como hospedador intermediario (Dinnik, 1964), las medidas
de control frente a Fasciola hepatica y nematodos gastrointestinales y la ausencia de
fármacos eficaces para el tratamiento de la paramfistomosis.
Al relacionar la edad de los animales con la presencia de C. daubneyi se comprobó mayor
prevalencia (13´4%) en los bovinos de más edad, mientras que los menos parasitados
fueron los de 3 a 6 años (8´5%). Aunque existen muy pocos trabajos que hagan referencia
al efecto que la edad tiene en la infección por paramfistomas, la mayoría de los autores
coinciden al señalar que las vacas adultas están más parasitadas que los animales jóvenes.
Scala et al (1997), en un estudio realizado en mataderos de Cerdeña, apreciaron que los
mayores porcentajes de parasitación por Paramphistomum cervi se encontraron en los
bovinos mayores de 5 años (50%) y los menores en los animales de menos de 18 meses
(12%). En mataderos de Tanzania según Keyyu et al. (2006), la prevalencia de anfistomas
fue superior en animales adultos (75’2%), que en animales de dos años (51´5%) o terneros
(47´2%). Sin embargo en Grecia, Theodoropoulos et al. (2002), después de examinar 792
rúmenes, sólo observaron Paramphistomum cervi en el rumen de dos vacas mayores de dos
años. Aunque según Szmidt-Adjide et al. (2000), la edad de los animales no está asociada
con la infección de P. daubneyi, para Schillhorn van Veen (1980) la mayor prevalencia
observada por la mayoría de los autores en animales adultos; puede relacionarse con el
mayor tiempo de exposición a la infección al llevar más tiempo los animales saliendo al
pasto, a lo que hay que añadir la menor respuesta a los fármacos usados habitualmente
contra la paramfistomosis (Keyyu et al., 2006).
Gráfico 1: Prevalencia de parasitación en función de la edad
100
80
60
40
20
0
Grupo 1
Grupo 2
Prev C.d.
Prev F.h.
Grupo 3
Prev D.d.
El porcentaje de animales infectados por F. hepatica aumentó con la edad, (grupo 1: 10%;
grupo 2: 23´4% y grupo 3: 32´6%). Al igual que ocurre con C. daubneyi la posibilidad de
reinfección por F. hepatica, se incrementa con la edad al permanecer más tiempo las vacas
328
en pastos contaminados, o porque se alimentan con hierba o ensilado que contiene
metacercarias (Sánchez-Andrade et al., 2002).
Pérez Verdugo (1992) y Díaz et al. (2001) estudiaron mediante análisis coprológicos la
prevalencia de parasitación por F. hepatica en el ganado vacuno en Galicia y encontraron
mayores porcentajes de parasitación en novillas que en vacas adultas, siendo además los
animales más jóvenes y peor alimentados los que eliminan mayor nº de hpg (Rojo-Vázquez
et al., 1989; Morrondo et al., 1994); esta falta de concordancia entre las prevalencias
detectadas mediante coprología y estudio directo puede ser debido a que los bovinos
desarrollan un cierto grado de resistencia frente a F. hepatica tras una primera exposición al
parásito, lo que hace que los animales de más edad eliminen menor cantidad de huevos que
los jóvenes (Boray et al., 1985; Hillyer et al., 1996).
Estudios realizados en mataderos de Tanzania y Zimbawe detectaron al igual que en el
presente estudio, que eran los animales de más edad los que con mayor frecuencia estaban
parasitados por F. hepatica (Keyyu et al. 2006; Phiri et al 2005)
En los animales menores de 2 años no se recolectaron ejemplares de D. dendriticum,
mientras que en los bovinos de los grupos G-2 y G-3, se observó una prevalencia similar
(en torno al 3%). Theodoropoulos et al. (2002), detectaron en un matadero de Grecia que el
2% de los hígados de bovinos estaban parasitados por D. dendriticum.
En los animales de raza frisona se detectó menor presencia de los tres trematodos, (11% C.
daubneyi; 27´9%, F. hepatica y 1´6%, D. dendriticum). Aunque para Szmidt-Adjide et al.
(2000) la raza de los animales no está significativamente asociada con la infección de P.
daubneyi en este trabajo los bovinos de otras razas y los cruces resultaron los más
parasitados por los trematodos hepáticos.
Gráfico 2: Prevalencia de parasitación en función de la raza
100
80
60
40
20
0
Frisona
Rubia Galllega
Prev C.d.
Cruces
Prev F.h.
Otras
Prev D.d.
Es de destacar que en los bovinos de Ourense no se encontraron adultos C. daubneyi,
mientras que el 16% de los rúmenes de bovinos de Pontevedra tenían adultos de este
trematodo. En un estudio llevado a cabo por Szmidt-Adjide et al. (2000), en el centro de
Francia se comprobó que la prevalencia de la infección por P. daubneyi (20 %) era mucho
más elevada que la registrada en otras zonas de Francia (5´5%) por Casset (1989), pero
329
similar (17%) a la detectada en zonas del norte de Italia (Agosti et al., 1980) y en Turquía
(15%, Tinar et al., 1992). Estos resultados podrían deberse a las diferencias climáticas de
las distintas zonas, fundamentalmente a las precipitaciones (Rolfe et al. 1991).
La prevalencia de infección por F. hepatica fue mayor en Ourense (50%) y menor en A
Coruña y Pontevedra (25%). En un estudio realizado por Phiri et al (2005) en Zambia,
apreciaron que el origen del ganado vacuno examinado tuvo una influencia significativa en
la prevalencia de infección por Fasciola gigantica.
El porcentaje más alto de animales parasitados por D. dendriticum fue del 12´5% en
Ourense, en Lugo y A Coruña del 4% y no se observaron adultos de D. dendriticum en los
hígados ni vesículas de los bovinos procedentes de Pontevedra.
Gráfico 3: Prevalencia de parasitación en función de la procedencia
100
80
60
40
20
0
A Coruña
Lugo
Prev C.d.
Ourense
Prev F.h.
Pontevedra
Prev D.d.
CONCLUSIONES
1. La prevalencia encontrada de las tres trematodosis estudiadas, pone de manifiesto que en
Galicia se dan las condiciones adecuadas para el desarrollo de la fase exógena del ciclo de
F. hepatica y C. daubneyi.
2. En el presente estudio se corrobora la elevada prevalencia de fasciolosis y la importancia
real de la paranfistomosis en los bovinos gallegos, lo que hace necesario establecer medidas
de control adecuadas.
AGRADECIMIENTOS
Al personal del matadero Novafrigsa y en especial a los inspectores veterinarios. Estudio
subvencionado por el Proyecto de Investigación PGIDIT04RAG261009PR (Xunta de
Galicia, España).
BIBLIOGRAFÍA
AGOSTI, M.; CAVALLETTI, E.; POZZA, O. (1980). Clinica ed epizootologia della
paramfistomiasi bovina in Provincia di Milano. La Clinica Veterinaria, 103: 284296.
330
ANSARI-LARI, M.; MOAZZENI, M. (2006). A retrospective survey of liver fluke disease
in livestock based on abattoir data in Shiraz, south of Iran. Preventive Veterinary
Medecine, 73: 93-6.
BORAY, J.C. (1959). Studies on intestinal paramphistomosis in cattle. Australian
Veterinary Journal, 35: 282-287.
BORAY, J.C.; JACKSON, R.; STRONG, M.B. (1985). Chemoprophylaxis of fascioliasis
with triclabendazole. New Zealand Veterinary Journal, 33: 182-188.
CASSET, I. (1989). Enquete sur la paramphistomose bovine: recherche des parasites en
abattoir. Revue Médicine Vétérinaire, 140: 925-927.
DÍAZ, P.; ARIAS, M.; PEDREIRA, J.; MOLEDO, J.A.; PAZ-SILVA, A.; SUÁREZ, C.;
PANADERO, R.; SÁNCHEZ-ANDRADE, R. (2001). Incidencia de la fasciolosis.
El Boletín De A.C.R.U.G.A., 15: 12-14.
DINNIK, J.A. (1964). Paramphistomum sukumum sp.nov. and other stomach-flukes from
cattle in the sukumaland area of the lake region, tanganyika. Parasitology, 54: 201-9.
HILLYER, G.V.; SOLER DE GALANES, M.; BUCHÓN, P.; BUORLAND, J.; (1996).
Herd evaluation by enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of
Fasciola hepatica infection in sheep and cattle from the Altiplano of Bolivia.
Veterinary Parasitology, 61: 211-220.
KEYYU, J.D.; KASSUKU, A.A.; MSALILWA, L.P.; MONRAD, J.; KYVSGAARD, N.C.
(2006). Cross-sectional prevalence of helminth infections in cattle on traditional,
small-scale and large-scale dairy farms in Iringa District, Tanzania. Veterinary
Research Communications, 30: 45-55.
MAGE, C.; BOURGNE, H.; TOULLIEU, J.M.; RONDELAUD, D.; DREYFUSS, G.
(2002). Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi: changes in prevalences
of natural infections in cattle and in Lymnaea truncatula from central France over
the past 12 years. Veterinary Research, 33: 439-447.
MORRONDO, P.; DÍAZ, P.; PEDREIRA, J.; PAZ-SILVA, A.; SÁNCHEZ-ANDRADE,
R.; SUÁREZ, J.L.; ARIAS, M.; DÍEZ-BAÑOS, P. (2003). Digestive parasitosis
affecting to the autochthonous Rubia Gallega cattle. XI Congresso Internazionale
della Federazione Mediterranea Sanità e Produzione Ruminanti (Fe.Me.S.P.Rum.),
Olbia (Sassari).
MORRONDO-PELAYO, P.; SÁNCHEZ-ANDRADE, R.; DÍEZ-BAÑOS, P.; PÉREZVERDUGO, L.; LÓPEZ-SÁNDEZ, C. (1994). Dynamics of Fasciola hepatica egg
elimination and Lymnaea Truncatula populations in cattle farms in Galicia (NorthWest Spain). Reasearch and Reviews in Parasitology, 54: 47-50.
PADUNGTOD, P.; KANEENE, J.B.; JARMAN, D.; JONES, K.; JOHNSON, R.;
DRUMMOND, A.; DUPREY, Z.; CHAICHANAPUNPOL, I. (2001). Enteric
parasitosis in Northern Thailand dairy heifers and heifer calves. Preventive
Veterinary Medicine, 48: 25-33.
PÉREZ VERDUGO, L. (1992). Epidemiología de Fasciola hepatica en ganado vacuno de
la provincia de Lugo. Memoria de Licenciatura. Universidad de Santiago de
Compostela.
PHIRI, A.M.; PHIRI, I.K.; SIZIYA, S.; SIKASUNGE, C.S.; CHEMBENSOFU, M.;
MONRAD, J. (2005). Seasonal pattern of bovine fasciolosis in the Kafue and
Zambezi catchment areas of Zambia. Veterinary Parasitology, 134: 87-92.
331
RANGEL-RUIZ, L.J., ALBORES-BRAHMS, S.T.; GAMBOA-AGUILAR. (2003).
Seasonal trends of Paramphistomum cervi in Tabasco, Mexico. Veterinary
Parasitology, 116: 217-22.
ROJO-VÁZQUEZ, F.A.; CASTAÑO-ROSADO, M.; RODRÍGUEZ-SÁNCHEZ, M.
(1989). Trematodosis hepáticas: Fasciolosis. Bovis, 31: 9-71.
ROLFE, P.F.; BORAY, J.C.; NICHOLS, P.; COLLINS, G.H. (1991). Epidemiology of
paramphistomosis in cattle. International Journal for Parasitology, 21: 813-9.
SCALA, A.; LIGIOS, C.; SATTA, G.; GAETANI, W.; SINI, T. (1997). Parassitosi bovine:
Rilevi epidemiologici in Sardegna. Praxis Veterinaria, 3: 10-13.
SCHILLHORN VAN VEEN, T.W.; WILLIAMS, J.F. (1980). Some typical parasitic
diseases of the goat. Modern Veterinary Practice, 61: 847-50.
SZMIDT-ADJIDE, V.; ABROUS, M.; ADJIDE, C.C.; DREYFUSS, G.; LECOMPTE, A.;
CABARET, J., RONDELAUD, D. (2000). Prevalence of Paramphistomum
daubneyi infection in cattle in central France. Veterinary Parasitology, 87: 133-138.
THEODOROPOULOS, G.; THEODOROPOULOU, E.; PETRAKOS, G.; KANTZOURA,
V.; KOSTOPOULOS, J. (2002). Abbatoir condemnation due to parasitic infections
and its economic implications in the region of Trikala, Greece. Journal of Veterinary
Medicine Series B, 49: 281-284.
TINAR, R.; COSKUN, S.Z.; DOGAN, H.; DEMIR, S., AKYOL, C.V. (1992). Prevalence
of Paramphistomum species in ruminantes of the Marmara region. Doga, Turk
Veterinirlik ve Hayvancilik Dergisi, 16: 187-197.
332
NUEVOS RETOS EN LA VETERINARIA DE LA GANADERÍA ECOLÓGICA EN
GALICIA
NEW CHALLENGES OF VETERINARY IN GALICIAN ORGANIC FARMING
BLANCO PENEDO, I*; LÓPEZ ALONSO, M.; MIRANDA, M.; GARCÍA VAQUERO,
M.; GUTIERREZ,B.; VELASCO, J.; HERNÁNDEZ, J.; CASTILLO, C.; BENEDITO, J.L.
Universidade de Santiago de Compostela, Departamento de Patoloxía Animal, Facultade
de Veterinaria, 27002 Lugo, España.
*Autor para correspondencia. Tel: +34982285900; Fax: +34982285940, e-mail:
[email protected]
ABSTRACT
Organic livestock farming has set the goal of establishing environmentally friendly
production, sustaining animals in a good health, realising high animal welfare standards,
and producing products of high quality. The responsibility for maintaining animal health
and welfare is an important goal in organic farming and veterinary intervention must face
potential conflicts: disregards of disease patterns on organic compared to conventional
farms (when authors found differences in the incidence of metabolic and reproductive
disorders, mastitis, parasite infections), no use of “chemical” products, antimicrobial
resistance and longer withdrawal times among others.
There has been an increasing number of organic farms in Galicia and there is a need of
solving conflicts between objectives and requirements in these farms. In this study,
guidelines of veterinarians´ organic farms are analysed: strategies of treatment, promotion
alternatives as natural medicine, management like a tool for preventing diseases, first
assessments of animal performance due to the scepticism of the effectiveness of these farms
and currently consumers’ high-demanding on safety products.
PALABRAS CLAVE
Granjas ecológicas, granja convencional, retos, prevención, gestión interdisciplinar.
INTRODUCCIÓN
Las granjas de ganado ecológico han establecido una serie de objetivos consensuados por la
Federación Internacional de Movimientos de Agricultura Orgánica (IFOAM) que trabaja a
nivel mundial y que coordina toda una red de organizaciones ecológicas que se basan en
una producción afín con el medio ambiente, optimizando la salud animal y su bienestar,
además de ofrecer productos de alta calidad.
La rápida expansión de las granjas ecológicas ha planteado numerosos desafíos dentro de
los sistemas para la producción animal. Al ir dándole importancia a la salud y bienestar
animal se han ido potenciando ciertas restricciones referidas a la salud animal que de forma
rutinaria se emplean en las granjas convencionales (Vaarst et al., 2005). Al mismo tiempo
que van en aumento las granjas ecológicas se va requiriendo mayor investigación,
asesoramiento agrícola, además de un especial conocimiento de estas granjas. Los
veterinarios en estas granjas todavía realizan servicios y programan tratamientos sin
especialización (Bennedsgaard et al.; 2003).
Ante el creciente número de explotaciones ecológicas en España, el trabajo del veterinario
es solventar los conflictos generados entre los objetivos y los distintos puntos que la
333
legislación de estas granjas abarca con el fin de aproximarse así a sus metas (Hovi et al.,
2003). Desde el momento en el que la sanidad animal se conecta con la higiene,
alimentación y producción, bienestar animal y prácticas de manejo del ganado vacuno y
que se integran en el medio ambiente se requieren muchas más investigaciones en este
campo multidisciplinar.
SANIDAD
Los programas sanitarios en las explotaciones ecológicas deben ser completos, integrados,
dinámicos respondiendo siempre a objetivos de medicina preventiva (García Romero et al.,
2003), de manera que las medidas de profilaxis sanitaria e higiene adquieren todo su valor,
son fundamentales para la lucha eficaz y rentable de las patologías, potencian el bienestar
animal, ayudan a impedir la entrada de grandes epizootías y previenen de zoonosis a la
población humana (García Romero et al., 2003), y es en este contexto donde surgen nuevas
herramientas más acordes con este sistema de producción: el manejo, control biológico,
profilaxis y terapias naturales (García Romero et al., 2003). Por lo tanto, entre sus
esfuerzos, las granjas ecológicas deben desarrollar técnicas zootécnicas que favorezcan el
equilibrio entre los animales y el ecosistema, además de fortalecer la capacidad de
respuesta defensiva del animal de manera que la prevención sea prioritaria (García Romero
et al., 2003).
Desde el punto de vista preventivo está prohibido en la ganadería ecológica la
administración rutinaria, sistemática y reiterada, en todos los ciclos productivos de
sustancias alopáticas o de síntesis química, antibióticos, coccidiostáticos, incluyendo
tratamientos coadyuvantes, estimulantes del crecimiento y/o reproducción, hormonas
(anabolizantes, progestágenos, etc.) y otros. La razón de su restricción son las repercusiones
para la salud pública y/o animal y/o medio-ambiental (García Romero et al., 2003).
En caso de llegar a aplicar un tratamiento, debe priorizarse el uso de medicinas naturales
incluyendo homeopatía, medicina ayurvédica y acupuntura (Cabaret, 2003). Basándose en
el empleo de sustancias que no sean excesivamente agresivas, se plantea entonces la terapia
curativa con productos homeopáticos, fitoterapéuticos (extractos, esencias de plantas, etc.),
oligoelementos autorizados y otros productos (se encuentran dentro del anexo II , parte C,
sección 3 del reglamento de la CE 1804/1999).
En el caso de la homeopatía, las materias primas o sustancias que se utilizan proceden de
plantas y animales, parásitos, trozos de vísceras y se manejan dosis muy pequeñas por vía
oral. En relación a la fitoterapia, que quizás sea la medicina natural más antigua, utiliza
sustancias químicas naturales. La composición de los principios activos es variada y
actualmente se emplean estratos completos de plantas al comprobarse que ofrecen mayores
beneficios que cuando se emplea el principio activo aislado (García Romero et al., 2003).
La razón por la que la ganadería ecológica está a favor de terapias naturales es que son más
efectivas al adaptarse a los ciclos naturales y productivos del animal, además regulan las
infecciones potenciando la acción del sistema inmunológico sin riesgos para la salud y para
el medio ambiente cuando su prescripción está realizada por un veterinario especializado
(García Romero et al., 2003). Las explotaciones ecológicas se convierten así en
herramientas básicas de trabajo para evitar el desarrollo de resistencias (Lund y Algers,
2003).
334
Tan sólo se permite el uso de productos químicos cuando no está disponible ningún
tratamiento alternativo quedando justificado su uso y deberán ser aplicados en los periodos
de máximo riesgo de infección para la ganadería. La consideración primaria de estas
granjas es mantener en todo momento el bienestar del animal.
Tras la administración de tratamientos convencionales, por supuesto, por prescripción
veterinaria, el ganadero debe asumir cierto riesgo de que el animal sea excluido de la
cadena de producción ecológica, con una gran repercusión económica para él, de modo que
la rutina de un tratamiento antibiótico se convierte en una gran preocupación para los
productores ecológicos. Así, se ha producido un giro hacia el uso de productos
homeopáticos y fitoterapéuticos al ser libre su uso en estas ganaderías.
En relación a la reproducción animal, el manejo de las granjas orgánicas prohíbe el uso de
técnicas como la transferencia embrionaria o el tratamiento hormonal para el tratamiento de
desórdenes reproductivos. Además se prefiere la monta natural en lugar de la inseminación
artificial (Reksen et al., 1999).
En cuanto a la prevalencia de enfermedades en granjas ecológicas, debemos señalar que son
necesarios grandes esfuerzos por parte del sector veterinario para conseguir una base de
datos de las enfermedades más frecuentes en las granjas ecológicas. Es más, para la
realización de estudios comparativos entre los distintos tipos de explotaciones es necesaria
mucha cautela y tener en cuenta ciertas consideraciones. Debe conocerse el momento de la
conversión, si existió, de las granjas convencionales, es decir, cuando se han transformado
en granjas ecológicas. La razón es que las leyes que las regulan han ido cambiando con
regularidad, por lo que se hace necesario conocer las prácticas que estaban o no permitidas
y, que deben considerarse en la salud del ganado. También es importante conocer el país de
donde procede la información ya que además de diferencias climáticas, de manejo y
económicas, también se interpretan las normas de la IFOAM de forma distinta. Por
ejemplo, mientras que en Suecia se prohíbe el uso de antihelmínticos, éste no es el caso de
Noruega; el tiempo de supresión después de un tratamiento con medicación alopática es del
doble de tiempo en Suecia (2 meses para antibióticos y 6 meses para quimioterapéuticos)
mientras que en Dinamarca el tiempo de supresión requerido se triplica por orden de la
Administración de Alimentación y Veterinaria danesas. También podrían existir diferencias
entre países en el uso de tratamientos alternativos, por ejemplo, los veterinarios suecos
tienen restringido por ley el uso de cualquier tipo de tratamiento homeopático mientras que
en Dinamarca algunos remedios homeopáticos pueden aplicarse con prescripción
veterinaria.
Hasta el momento se ha publicado muy poco acerca de las enfermedades registradas en
granjas ecológicas a partir de evaluaciones realizadas por granjeros y técnicos. En un
estudio llevado a cabo en el Reino Unido en el que se realizó una encuesta en 270 granjas
ecológicas, los problemas que se registraron fueron en vacuno de carne: parasitaciones,
infertilidad, problemas en los partos; mientras que en ganado lechero: parasitaciones,
problemas podales y mastitis entre otros en ambos casos. En Francia los problemas de salud
asociados al ganado vacuno implican parasitaciones, mamitis y problemas de reproducción,
así como toda la complejidad de su tratamiento ante la imposibilidad del uso de medios
médicos como antihelmínticos, antibióticos e inducción hormonal respectivamente.
En otras especies también criadas en sistemas ecológicos por ejemplo en el sector porcino y
aviar se plantean problemas que afectan a la adaptación de genotipos a estos “nuevos”
335
sistemas, la alimentación (adición de aminoácidos, vitaminas) y a condiciones de las
instalaciones (Cabaret, 2003).
En conclusión, a los recientes estudios de revisión se podría generalizar que en las granjas
ecológicas se observa una reducción del patrón de enfermedades metabólicas que podría ser
debida a la menor producción de los sistemas ecológicos (Sundrum , 2001).
ALIMENTACIÓN
La mayor dificultad con la que se encuentran los veterinarios en el campo de la
alimentación, es asegurar una ración compuesta íntegramente por materias primas
ecológicas, cultivadas sin fertilizantes, ni plaguicidas de síntesis artificial, no sometidas a
transformaciones con productos químicos, ni derivados de organismos transgénicos
(Caballero Luna et al., 2003).
En la formulación de las raciones es imprescindible que las necesidades nutricionales estén
perfectamente cubiertas y se debe respetar al máximo sus comportamientos nutricionales,
siendo esencial para preservar su salud. Cualquier desajuste en la formulación de la ración
podría traducirse en enfermedades de forma más o menos inmediata al tener una fuerte
influencia en el funcionamiento del sistema inmunitario. Por ejemplo, dietas bajas en
proteína inducen la aparición de parasitosis más intensas y raciones con menos fibra pueden
bloquear las funciones inmunológicas; también pueden aparecer acidosis y meteorismos
inducidos por desequilibrios nutricionales. Destacar también que los desórdenes
vitamínicos y minerales suelen pasar inadvertidos al originar procesos subclínicos pero que
están en el origen de muchas enfermedades de base infecciosa, disminución de la fertilidad,
tetanias, parasitismo y alteraciones en el comportamiento (Caballero Luna et al., 2003).
La base de la dieta, aunque no de forma exclusiva, lo constituye el pasto, el forraje y el silo
(en función de su disponibilidad en las distintas épocas del año) ofreciendo una dieta de
calidad, variada, rica en vitaminas y minerales. La proporción de concentrado se restringe
al 40% y se prohíbe el uso de promotores de crecimiento aunque sí se autorizan ciertos
alimentos complementarios y prebióticos (Caballero Luna et al., 2003).
Cuidando la alimentación se pretende asegurar la calidad de la producción más que una
producción máxima, para ello es necesario conocer los requerimientos del ganado en cada
una de las fases del desarrollo, empleando productos de la propia granja (Hermansen,
2003).
En la fase de cría-lactación es necesario respetar un tiempo mínimo de lactación de tres
meses, siendo el calostro y la leche materna insustituibles. Es deseable prolongar todo lo
posible la lactación ya que desarrollan menos enfermedades y favorecen altas velocidades
de crecimiento. Si además cuentan con alimentos complementarios alcanzarán un buen
peso al destete y su flora digestiva se irá desarrollando con el uso de prebióticos que estén
autorizados (Caballero Luna et al., 2003)
En la fase de recría-cebo es necesario disponer de un forraje de alta calidad. Teniendo muy
en cuenta en esta fase la incidencia de parasitosis. (Caballero Luna et al., 2003)
Para el ganado adulto, en cuanto a los reproductores es imprescindible una buena
adaptación a la disponibilidad de pastos y forrajes de la granja, completando la dieta con un
mínimo porcentaje de concentrado (Caballero Luna et al., 2003). Se ha demostrado que la
eficacia reproductiva de las granjas ecológicas se descompensa en la época de invierno de
forma significativa, situación de desequilibrio que podría producirse por la falta de
336
conocimiento de las necesidades energéticas de las vacas en comparación con las granjas
convencionales (Sundrum, 2001).
Es importante también destacar la necesidad de planificar la alimentación para adecuar la
carga ganadera a la disponibilidad de producción de alimentos ecológicos de la propia
explotación para conseguir el máximo grado de autoabastecimiento (Caballero Luna et al.,
2003). Así, en el caso del pasto y teniendo en cuenta que al menos un 60% de la ración
diaria debe está formada por silo, heno o hierba, debe maximizarse su uso en función de su
disponibilidad en las diferentes épocas del año (Hermansen, 2003). Por último, comentar
que un punto innovador en la alimentación de la ganadería ecológica es la inclusión de
plantas aromáticas y medicinales para su alimentación; al tener factores antimicrobianos y
reguladores del metabolismo, mejoran la transformación de alimentos vegetales en
productos pecuarios. En este sentido existen sustancias fitoterapéuticas y homeopáticas que
pueden administrarse con el alimento y/o agua de bebida para regular las funciones,
digestiva, pulmonar, hepática, del sistema inmune, etc., por su efecto amortiguador.
(Caballero Luna et al., 2003)
PRODUCCIÓN ANIMAL
En los últimos tiempos se ha producido un crecimiento considerable en Europa en el
número de granjas ecológicas, de menos de 20.000 en 1992 a más de 120.000 en 1999
(Padel, 2000), y que incluyen el ganado ecológico como uno de los 5 productos más
importantes de los sistemas ecológicos (Michelsen et al., 1999).
Este desarrollo ha generado importantes cambios en la sociedad con respecto a ciertos
aspectos de la agricultura, y puede ser atribuido a un aumento en el interés de los
consumidores por los productos ecológicos al mismo tiempo que los granjeros se han
interesado por la conversión de sus granjas a sistemas ecológicos, a menudo estimulados
por las ayudas o subvenciones del gobierno.
La producción ecológica se enfrenta a grandes desafíos con la búsqueda de un equilibrio e
integración exitosa en el sistema de producción ecológico (Vaarst et al., 2005). En el
momento en el que las granjas ecológicas asumen su papel como sistema de producción
surgen numerosas dificultades, ya que por ejemplo para la producción láctea bajo las
condiciones ecológicas existe muy poca información acerca de la producción lechera del
ganado vacuno en relación al efecto que desencadena la suplementación con productos
ecológicos (Khalili et al.; 2002). Es más, en ganado vacuno de alto potencial genético, la
reducción del nivel de ingesta podría causar una movilización de las reservas y un balance
energético negativo (Khalili et al., 2002). La alimentación del ganado vacuno lechero está
supeditada a la misma normativa que se ha establecido en estas granjas y tan sólo una
proporción muy baja de los productos convencionales comerciales de alimentación se
ajustan a esta normativa. En relación con la alimentación del ganado de carne ésta afecta a
la calidad del producto que llega al mercado: sabor, color, nivel de infiltración y perfil
graso (Mata Moreno et al., 2003).
De los 17 objetivos que se plantea la IFOAM sólo 3 se refieren a la producción de ganado.
El primero de ellos se basa en el mantenimiento de la biodiversidad que viene a ser el
principal desafío. En segundo lugar, ofrecer al ganado libertad para que alcance su
comportamiento natural. Y por último, los sistemas ecológicos deberían equilibrar cultivos
y ganado construyéndose así ciclos cerrados y sostenibles de nutrientes (Hovi et al., 2003).
337
Las granjas ecológicas, debido a la competencia que sufren por parte de las granjas
convencionales, intentan maximizar la producción con un manejo lo menos intensivo
posible (Mata Moreno et al., 2003). La ganadería ecológica conoce y asume la exigencia de
un creciente número de consumidores que están siendo muy críticos con los productos de
las granjas convencionales (Sundrum, 2001) de manera que las granjas ecológicas para
hacer frente a esta competencia deben ofrecer la calidad como punto fuerte de sus
productos. Hoy en día se está desarrollando un mercado creciente debido a las profundas
crisis que han sensibilizado a los consumidores de forma irreversible y sobre todo en la
carne de vacuno (Caballero Luna et al., 2003). Los consumidores de carne ecológica se
preocupan por su salud y consecuentemente por su alimentación, buscan que los productos
sean más sanos y que se obtengan protegiendo el medio ambiente y el bienestar animal
(Caballero Luna et al., 2003). La carne ecológica debe ofrecer además de calidad
cualidades organolépticas diferenciadas: recuperación del sabor, aroma, textura y aspecto
de la “auténtica carne” siendo muy importante para su consecución una buena alimentación
del ganado (Mata Moreno et al., 2003).
Para compensar esta situación desequilibrada entre los dos sistemas de producción algunos
autores recomiendan el uso de razas adaptadas a este tipo de nutrición, renunciando a una
mayor ganancia diaria de peso del ganado pero obteniendo un sabor óptimo generado por la
grasa infiltrada, mucho más apreciado por los consumidores tanto en ganado vacuno como
en porcino (Sundrum et al., 2000).
MANEJO
En relación a las instalaciones, la normativa (reglamentación No. 1984/1999 con un
suplemento No. 2092/91) se centra en las características del área de locomoción que debe
ser al menos un 75% de la zona cubierta, exige ciertas condiciones del suelo con
almacenamiento adecuado de los efluentes (Hermansen, 2003), estado seco de las camas,
determinadas prácticas ganaderas (Sumdrum, 2001) y además exige la agrupación de los
animales en rebaños quedando prohibida terminantemente su sujeción (Hermansen, 2003).
Las infraestructuras que deben poseer las granjas ecológicas pueden ser muy sencillas en el
caso de adaptarse para el ganado vacuno. Es necesario proporcionar al ganado vacuno el
máximo espacio para facilitar su movimiento, alimentación y abrevado y proporcionándole
el máximo confort posible (Caballero Luna et al., 2003).
La importancia del manejo en las explotaciones ecológicas radica en que en función al que
se someten las granjas de forma individual (independientemente del tipo de explotación al
que pertenezca) se explican las diferencias obtenidas en salud animal y calidad de los
productos obtenidos que son destinados al mercado. La calidad de producción depende por
tanto del manejo intra-granja, mostrándose así una gran variabilidad en la producción
ecológica e intensiva (Sundrum, 2001).
Algunas pautas para el tratamiento de enfermedades importantes en las que se hace
necesario prevenir el uso de medicamentos como es el caso de la mamitis son construir
sistemas de estabulación abiertos, siendo un factor importante para un ambiente con bajo
riesgo de enfermedad mantener limpias las camas (con un ritmo de limpieza de 2 o 3 veces
al día) y tener constancia en la rutina de ordeño (Vaarst et al., 2006).
Para la prevención de enfermedades parasitarias, desde el momento que los tratamientos
médicos profilácticos no se emplean, se podrían aplicar una serie de medidas cuyo uso se
338
potencia por los parasitólogos para evitar así el desarrollo de resistencias: mover el ganado
a zonas no infectadas, intentar suavizar el grado de infestación al alternar o mezclar (vacas
y ovejas) en los mismos pastos, etc. Al no poder aplicarse en todos los casos este tipo de
estrategia, el ganado se encuentra en riesgo de sufrir enfermedades. Existe por tanto la
necesidad de buscar otras alternativas para generar resistencias como por ejemplo introducir
nuevas especies en los pastos que podrían mejorar la resistencia conjunta de los animales
(Hermansen, 2003).
Por último comentar que el manejo del animal al aire libre también es criticado al estar
relacionado con algunos riesgos para la salud y bienestar del animal. Existen ciertas
enfermedades que ven facilitadas su propagación en esta situación, como por ejemplo las
zoonosis que podrían afectar a la salud humana fracturándose la barrera de seguridad y
reduciendo la calidad que los productos ecológicos ofrecen al consumidor (Vaarst et al.,
2005).
BIENESTAR ANIMAL
Desde los orígenes de las granjas ecológicas éstas mostraban sus preocupaciones sobre el
cuidado del bienestar animal que de forma negativa presentaban las granjas industriales. El
bienestar animal desde el enfoque que tratan de abordar las granjas ecológicas incluye la
posibilidad de mejora del comportamiento animal, consiguiendo alimento adaptado a su
fisiología, y viviendo en un ambiente similar a su biotipo al cual por medio de su evolución
se ha adaptado (Lund, 2006).
Las granjas ecológicas disponen de potencial suficiente para ofrecer a los animales todas las
condiciones para alcanzar su bienestar, y las investigaciones más recientes no lo
contradicen. Aunque si bien se puede interpretar que la importancia del bienestar animal es
básico en este tipo de granjas, la creación de sistemas de producción sostenibles y mantener
el bienestar animal encierra sin duda la mayor preocupación para los granjeros (Lund,
2006).
FUTURAS IMPLICACIONES
Los objetivos de las granjas ecológicas junto con las bases en las que se fundamenta, no
deben considerarse como fines en sí mismo sino como un medio, de manera que podrían
verse modificadas con los años si aparecen nuevos conocimientos que optimizan estos
valores (Sundrum, 2001). Los veterinarios de las granjas ecológicas preocupados por
solventar los problemas de carácter agudo han dedicado su estudio a necesidades urgentes
(Lund y Algers, 2003)siendo necesaria mucha más investigación en todos las áreas
integrantes de esta unidad: la ganadería ecológica.
BIBLIOGRAFÍA
Bennedsgaard, T.W.; Thamsborg, S.M.; Vaarst, M.; Enevoldsen, C. (2003). Eleven years of
organic dairy production in Denmark: herd health and production related to time of
conversion and compared to conventional production. Livestock Production Science
80:121-131.
Caballero Luna, I.; Mata Moreno, C.; García Romero, C.; Díaz Gaona, C.; Arroyo
Valverde, F.C.; Fernández Ortiz, E. (2003). Aspectos clave para la planificación y
manejo ecológico. Bovis 110: 53-77.
339
Cabaret, J. (2003). Animal health in organic farming: subjective and objective assessments
and farmers´ actions. Livestock Production Science 80:99-108.
García Romero, C.; Vidarte Iturre, A.; Caballero Luna, I.; Arroyo Valverde, F. C.; Díaz
Gaona, C.; Fernández Ortiz, E.; Mata Moreno, C. (2003). Sanidad y Bienestar en las
explotaciones bovinas ecológicas. Bovis, 110: 79-101.
Hermansen, J.E. (2003) Organic livestock production systems and appropriate development
in relation to public expectations. Livestock Production Science 80:3-15.
Hovi, M.; Sundrum, A.; Thamsborg, S. M. (2003). Animal Health and welfare in organic
livestock production in Europe: current state and future challenges. Livestock
Production Science 80: 41-53.
Khalili, H.; Kuusela, E.; Suvitie, M.; Huhtanen, P. (2002). Effect of protein and energy
supplements on milk production in organic farming. Animal Feed Science and
Technology 98: 103-119.
Lund, V. (2006). Natural living- a precondition for animal welfare in organic farming.
Livestock Production Science 100:71-83.
Lund, V. y Algers, B. (2003). Research on animal health and welfare in organic farming- a
literature review. Livestock Production Science 80:55-68.
Mata Moreno, C.; Caballero Luna, I.; Fernández Ortiz, E.; Díaz Gaona, C.; Arroyo
Valverde, F. C.; García Romero, C. (2003). La Ganadería Ecológica en España.
Situación Actual, Productiva y Comercial. Perspectivas Futuras. Bovis 110: 11-23.
Padel, S. (2000). Strategies of organic milk production. 3rd NAHWOA Workshop, 21-24.
October 2000.
Reksen, O., Tverdal, A.; Ropstad, E. (1999). A comparative study of reproductive perfonce
in organic and conventional dairy husbandry. Journal of Dairy Science 82:2605-2610.
Sundrum, A. (2001) Organic livestock farming. A critical review. Livestock Production
Science 67:207-215.
Vaarst, M.; Bennedsgaard, T.W., Klaas, I.; Nissen, T.B.; Thamsborg, S.M.; Ostergaard, S.
(2006). Development and Daily Manegement of an Explicit Strategy of Nonuse of
Antimicrobial Drugs in Twelve Danish Organic Herds. Journal of Dairy Science 89:
1842-1853.
Vaarst, M.; Padel, S.; Hovi, M.; Younie, D.; Sundrum, A. (2005). Sustaining animal Health
and Food safety in European organic livestock farming. Livestock Production Science
94: 61-69.
340
HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ ÓSEA DESMINERALIZADA
BOVINE BONE LIKE SOURCE OF DEMINERALIZED BONE MATRIX
BUSTAMANTE CANO JJ*, RIVERA POSADA J**, CANO QUINTERO W***,
ROBLES ROBLES R, GONZÁLEZ MONTAÑA JR, PRIETO MONTAÑA F.
Universidad de León.24007. León. E-mail: [email protected]
* Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Pamplona.Colombia.
** Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Antioquia. Colombia.
*** Interkim SA. Girardota, Antioquia, Colombia.
RESUMEN
La matriz de hueso desmineralizado ha mostrado la capacidad de inducir la formación de
hueso en lugares ectópicos y como material de injerto óseo osteoinductivo. Igualmente ha
sido mezclado con diferentes transportadores de forma que permita su manipulación
durante el implante en aplicaciones que requieran recuperación ósea. La desmineralización
del hueso, disminuye la respuesta inmune y expone los diversos factores de crecimiento de
la matriz, los cuales tienen participación directa en las funciones de osteogénesis,
osteoconducción, remodelación, realización y homeostasis en el microambiente celular
óseo.
Este estudio explora un método práctico que permita obtener una matriz orgánica después
de remover la fase mineral del hueso, de tal manera que aquella promueva una efectiva
osteoinducción en modelos vivos. La operación inicial de desmineralización comenzó con
la recolección en matadero de huesos frescos de bovino. Posteriormente el hueso es
pulverizado hasta el tamaño deseado de partícula, seguido por desengrasado/desinfección y
tratamientos de desmineralización con ácido. Finalmente la muestra es liofilizada. La
caracterización se realizó mediante un análisis de espectroscopia de infrarrojos.
PALABRAS CLAVE: Matriz ósea, bovino, osteoinducción.
SUMMARY
Demineralized bone matrix has shown the capacity to induce bone formation in ectopic
places and as material of osteoinductive bone graft. It has been mixed with a carrier’s
variety like allow different forms of manipulation for a variety of carriers that need osseous
recovery. Bone demineralization diminishes the immune response and exposes the diverse
factors of growth of the bone matrix, which have direct participation in the functions of
osteogenesis, osteoconduction, remodelling and homeostasis in the cellular osseous
microatmosphere.
This study explores a method that allows to obtain an organic matrix after removing the
mineral phase of the bone like it promotes an effective osteoinduction in animal models.
The initial bone demineralization operation began with fresh bovine bones taked from
slaughterhouse. First, bone is pulverized to the desired average particle size, followed by
deffating/disinfecting and acid demineralization treatments. After the sample is liophilized
and then is realized its characterization with an infrared analysis.
Key words: bone matrix, bovine, osteoinduction.
341
INTRODUCCIÓN
En los últimos años se ha prolongado la vida humana y han mejorado las perspectivas de
vida animal. La síntesis de materiales biocompatibles, ha permitido reemplazar alguna parte
del cuerpo cuando ésta está deteriorada. La regeneración ósea es la técnica de elección para
reparar defectos de pequeño y mediano tamaño en maxilares y huesos largos, empleándose
como tratamiento complementario para la colocación de implantes oseointegrados.
Aún no existe un sustituto de hueso ideal, y por ello continuamente se están realizando
investigaciones. En la mayoría de los casos son productos caros, lo que no permite que
estén al alcance de todas las personas y menos aún en la práctica veterinaria.
La matriz de hueso desmineralizada es un material de injerto que promueve la formación
ósea y que ha sido ampliamente usado en aplicaciones ortopédicas y odontológicas en todo
el mundo. Se ha obtenido de hueso humano, rumiante, roedor y de otras especies.
Para la obtención del hueso desmineralizado pueden seguirse varios procedimientos
(Reddie et al, 1972; Concannon et al, 1997; Rabie et al, 2000; Han et al, 2005). Aunque el
descrito por Concannon, resulta ser el más práctico.
El presente estudio explora un método de síntesis de dicha matriz orgánica, la cual después
de verificar sus características será utilizada para producir una pasta ósea maleable (en
combinación con proteinas morfogenéticas óseas, colágeno e hidroxiapatita), con el fin de
comprobar sus propiedades osteoinductivas en un modelo in vivo y así contribuir en la
satisfacción de las necesidades del cirujano en el campo de la cirugía plástica y ortopédica.
MATERIAL Y MÉTODOS
Como hemos indicado el método propuesto
por Concannon,es el más usado para la
obtención de hueso desmineralizado. El
hueso molido se desmineraliza en ácido
clorhídrico 0,6 N (25 meq de HCl/g de hueso)
durante un periodo de tres horas realizando el
cambio de la solución cuando ésta se satura.
El hueso desmineralizado es entonces
deshidratado en etanol al 70% durante un
periodo de 10 minutos, luego se decanta, se
liofiliza y se guarda a temperatura ambiente.
Proponemos un método similar con ligeras
modificaciones que permite una mejor
extracción
de
los
lípidos,
una
desalcoholización más eficiente de la solución
y que además puede ser realizado en sencillos
laboratorios.
A partir de huesos bovinos recogidos
directamente en el matadero, se hierve el
hueso para eliminar lípidos y fluidos
sanguíneos y posteriormente se pone a secar
hasta que presente un porcentaje bajo de
342
humedad. Tras tener el hueso bien seco, se realiza una pretrituración con un martillo para
poder dejar el tamaño adecuado para el siguiente paso. Se introduce la muestra en un
molino Thomas-Willey, con intención de lograr un tamaño de partícula adecuado (no
superiores a 150 µm) para el siguiente paso teniendo al final un total de 80 gramos de
muestra.
Este tamaño de partícula se define tamizando en mallas finas (micras)- (ROTAP DE
MALLAS 270-240-200-150-120-80-70-40-20-10 PLATO DE RESIDUO FINAL), ya que
a menor tamaño de la partícula se obtiene mayor superficie de contacto con los reactivos.
Luego de tener la muestra en polvo se adiciona en una solución de ácido clorhídrico 0,6 N,
y se toman 3,3 litros que corresponden a la cantidad de muestra de hueso molido (80
gramos). Se dejan en homogenización por espacio de tres horas, iniciando con 1 litro y cada
hora cambiando la solución ya que esta se satura. En total se obtuvieron tres muestras de 1
litro respectivamente. Posteriormente se procede a deshidratar con etanol cada una de las
muestras obtenidas, para más tarde proceder a la liofilización a temperatura ambiente.
La muestra líquida se filtra con papel filtro (Schleicher & Schuell, 125 mm 5893) y se
obtiene la muestra para liofilización.
La prueba de Soxhlet o de verificación de grasa permite mediante extracción con éter de
petróleo y calentamiento moderado la cuantificación de los lípidos presentes en la muestra.
La cantidad de calcio presente se valoró mediante absorción atómica.
El análisis de la muestra por medio de un espectrofotómetro permite determinar las
absorbancia de dicha muestra, y es realizada a 512 nm que es el adecuado para muestras
sólidas según la normas. La medición del tamaño de la partícula se realizó, como hemos
indicado mediante las mallas ROTAP.
Los lípidos presentes en la muestra son 0,556%, cantidad muy baja, por lo que no afectó al
procedimiento químico de obtención del hueso desmineralizado.
La absorbancia a 512 nm fue de 1.518 mg/g (mg de Ca(PO3)2/g de HCl 0,6 N). El calcio
presentó valores de 2,58%. Según Reddi (1972) la descalcificación preferiblemente debe
dar resultados menores del 10%, siendo el ideal 0,5%. No se logró descalcificación
completa, lo que a su vez puede provocar una posible interferencia en extracción de
proteínas, pero está dentro del rango aceptado para su utilización como material
osteoinductor.
El tamaño de las partículas se situó en 150 µm. Bolander y Balian (1986) trabajaron con
100-300 µm, mientras que Reddi et al (1972) con tamaños entre 74-420 µm. Es preferible
menor tamaño de partícula (100-150 µ), puesto que ello aumenta la superficie de contacto
(Le Geros, 1991).
Por todo lo expuesto podemos afirmar que el producto obtenido es adecuado para la
producción de pasta ósea, que tras combinarse con proteínas morfogenéticas óseas,
colágeno e hidroxiapatita, pueda ser usado en osteoinducción. La pasta así formada debe,
posteriormente, ser utilizada en implantes óseos in vivo.
343
BIBLIOGRAFÍA
Bolander ME, Balian G. The use of demineralized bone matrix in the repair of segmental
defects. Augmentation with extracted matrix proteins and a comparison with autologus
grafts. The Journal of Bone and Joint Surgery, 1986; 68 (8): 1264-1274.
Bowman SM, Zeind J, Gibson LJ, Hayes WC, McMahon TA. The Tensile Behavior of
Demineralized Bovine cortical Bone. J. Biomechanics 1996; 29 (11): 1497-1501.
Broz JJ, Simske SJ, Greenberg AR. Material and compositional properties of selectively
demineralized cortical bone. Journal of Biomechanics. 1995; 28 (11): 1357-1368.
Concannon MJ, Boschert MT, Puckett CL. Bone induction using demineralized bone in the
rabbit femur: A long term study. Plastic and Reconstructive Surgery. 1997; 99 (7): 1983–
1988.
Han B, Tang B, Nimni, ME. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive
activity of demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2003; 21: 648 654.
Han B, Yang Z, Nimni M. Effects of moisture and temperature on the osteoinductivity of
demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2005; 23: 855-861.
Le Geros R: Calcium phosphate biomaterials in preventive and restorative dentistry, in
calcium phosphates, in RZ Legeros (ed): Oral Biology and Medicine. Basel, Switzerland,
Karger, 1991: 154-192.
Rabie AB, Wong R, Hägg U. Composite autogenous bone and demineralized bone matrices
used to repair defects in the parietal bone of rabbits. British Journal of Oral and
Maxillofacial Surgery. 2000; 38: 565–570.
Reddi AH, Huggins C. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts
in adolescents rats. Proc. Nat. Acad. Sci. 1972; 69 (6): 1601-1605.
Walsh WR, Christiansen DL Demineralized bone matrix as a template for mineral-organic
composites. Biomaterials 1995; 16: 1363-1371.
344
LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS DE BVD EN TANQUE DE LECHE
COMO HERRAMIENTA PARA LA DETECCIÓN DE EXPLOTACIONES CON
ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS
BVDV BULK MILK ANTIBODY TESTING: AN ASSISTANCE FOR THE DETECTION OF
FARMS WITH PERSISTENTLY INFECTED ANIMALS
CARNERO, I.; EIRAS, C.; ARNAIZ, I.
Laboratorio de Sanidade e Producción Animal de Galicia. Consellería do Medio Rural.
Avda.de Madrid 77. 27002 Lugo. Tfn: 982-221750
[email protected]
PALABRAS CLAVE: Anticuerpos
persistentemente infectados.
BVD,
BVD,
tanque
de
leche,
animales
RESUMEN
La diarrea vírica bovina (BVD) es una enfermedad de amplia difusión que produce
elevadas pérdidas económicas. La causa principal de la diseminación de la infección se
debe a la presencia de animales portadores permanentes del virus. En este sentido, cualquier
actuación encaminada a la lucha frente a la enfermedad, debería centrarse en la localización
de los rebaños con alta probabilidad de tener animales persistentemente infectados (PI),
para poder posteriormente identificarlos.
La detección de los niveles de anticuerpos (Ac) en la muestra de tanque de leche es una
herramienta muy útil para establecer el riesgo de infección que existe en un rebaño. Se
analizaron, con un ELISA de competición para anticuerpos anti-p80, un total de 285
muestras de tanque de explotaciones con prevalencia y situación vacunal conocidas, con el
fin de establecer los puntos de corte y los intervalos que permitan agrupar a los rebaños en
uno de los 4 grupos de seroprevalencia establecidos:
> 65%: alta probabilidad de presencia de PI.
25-65%: alto riesgo de infección activa.
5-25%: bajo riesgo de infección activa.
< 5%: rebaños negativos.
Durante los años 2005 y 2006 se realizó el seguimiento de explotaciones en las que los
valores de Ac indicaban una alta prevalencia de la enfermedad con el fin de seleccionar
aquellas con alto riesgo de presentar animales PI. El objetivo del estudio es determinar los
valores de Ac que puedan indicar la presencia activa de animales PI.
El empleo de la muestra de tanque de leche para la localización de rebaños con presencia de
animales PI, podría ser una herramienta de gran utilidad debido a su eficacia, rapidez y bajo
coste.
ABSTRACT
The bovine viral diarrhoea (BVD) is a highly difussion disease that causes considerables
economics losses. The main cause of the infection dissemination is the presence of
persistently infected animals (PI).
So, to prevent the development of infection or its diffusion, it would be necessary the
establishment of a control program based on localization of farms with PI animals .
345
Bulk milk antibodies levels are an useful assistance to determine the risk of infection in a
herd.
Then, 285 tank samples from herds with prevalence and vaccinated status known were
analysed with a BVDV anti-p80 competition ELISA, so we determine the cutt-off for these
four groups of seroprevalence:
- > 65%: high probability of presence of PI animals.
- 25-65%: high risk of active infection.
- 5-25%: low risk of active infection.
- < 5%: negative herds.
During years 2005 and 2006,the herds were selected according to antibody values that
indicated high disease prevalence. The aim of this study is to determine the antibody levels
that can indicate the real presence of PI animals.
The employment of tank milk samples of herds with PI animals could be an important
assistance for its efficacy , speed and low cost.
INTRODUCCIÓN
La muestra de tanque de leche se está revelando como una herramienta eficaz, barata y
fiable para el estudio de la presencia de DVB en los rebaños de vacuno lechero. En un
estudio previo realizado en el Laboratorio de Sanidade e Producción Animal de Galicia se
pudieron establecer los intervalos de confianza que permiten clasificar a las explotaciones
según el riesgo de infección (tabla 1).
% prevalencia
<5%
5-25%
25-65%
>65%
Intervalo
> 87,5
(87,5-57,45)
(57,45-21,15)
< 21,15
Riesgo de infección
Explotación negativa.
Bajo riesgode infección.
Alto riesgo de infección.
Alta probabilidad de tener PI.
Tabla 1: valores de DO de ELISA Ac (% inhibición). Intervalos.
Una vez seleccionadas las explotaciones con alta probabilidad de tener circulación viral
(gráfica 1 y 2), el objetivo de este trabajo es la identificación de explotaciones que puedan
tener animales persistentemente infectados.
Gráficas 1 y 2: ejemplos de perfiles serológicos de rebaños con circulación viral.
EXPLOTACIÓN CON CIRCULACIÓN VÍRICA
Nº de animales
8
6
4
2
0
N
P+
P++
P+++
P++++
P+++++
Positividad
9-12 meses
346
12-24 meses
25-36 meses
> 36 meses
EXPLOTACIÓN CON PI
Nº de animales
12
10
8
6
4
2
0
N
P+
P++
P+++
P++++
P+++++
Positividad
9-12 meses
12-24 meses
25-36 meses
> 36 meses
Resultados tanque
R
e
b
a
ñ
o
s
25
Eliminados antes
20
Eliminados después
15
10
5
0
< 11 %
11-22%
22-40%
40-57,5% 57,5-72,5% 72,5-87,5%
> 87,5%
% inhibición
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestras
A partir de las muestras de tanques recibidas en el Laboratorio de Sanidade e Producción
Animal en el período 2004-2006 (tabla 2), se escogieron para el estudio 83 rebaños en los
que se tenía historial de identificación de animales PI (33 posteriores a la toma de muestra
de tanque y 50 anteriores). 57 de estos rebaños tenían una prevalencia mayor del 65%, 16
entre el 25-65%, 5 entre e 5-25% y 5 con menos de un 5% de seroprevalencia.
Intervalo de % inh
% prev.
Nº Tanques
> 87,5
< 5%
5
(87,5-57,45)
5-25%
5
(57,45-21,15)
25-65%
16
< 21,15
> 65%
57
Tabla 2: nº de tanques.
347
Técnicas analíticas
- ELISA de competición para detección de anticuerpos p80 en muestras de
tanque de leche.
- ELISA de detección de antígeno en muestras de suero o muesca de oreja.
En 24 (42,1%) de los 57 rebaños con un porcentaje de inhibición correspondiente a una
prevalencia mayor del 65% se identificó al menos 1 animal PI (43 animales en total)
posteriormente a la recogida de la muestra del tanque y en los 33 restantes (57,9%) en algún
momento en el pasado fueron eliminados animales PI (52). En 9 (34,6%) de los establos
con menos de 65% de prevalencia se identificaron 19 PI con posterioridad y en los 17
(65,4%) restantes ya habían sido eliminados con anterioridad 21 PI (gráfico 3).
Gráfico 3: Resultados de las muestras de tanque de leche.
A tenor de estos resultados podemos decir que la muestra de tanque de leche permite
establecer una clasificación de los rebaños según su riesgo de infección, siendo una
herramienta eficaz en el control de esta enfermedad. También se puede concluir que la
búsqueda de animales PI debería realizarse en todos los rebaños con más de un 25% de
seroprevalencia, ya que son los que tienen riesgo de circulación vírica (infección activa).
Para poder detectar rebaños con infección muy reciente (que aún pueden presentar
prevalencia menor del 5%), lo ideal es la monitorización de la explotación mediante
recogidas periódicas de muestras de tanque de leche para poder detectar seroconversión.
BIBLIOGRAFÍA
Alenius, S.; Lindberg, A.; Larsson, B.(1996). A nacional approach to the control of bovine viral
diarrhoea virus. 3rd ESVV Symposium pestivirus infections: 162-169.
Bitsch, V.; Ronsholt, L. (1995). Control of bovine viral diarrhea virus infection without
vaccines. Vet. Clinic. Of North Am.: Food An. Practice. 11 (3): 627-640.
Corrales, J.C.; Sanjuán, M.L.; García, C. (2001). Epidemiología e importancia económica
de la Diarrea vírica bovina. Información veterinaria: 41-46.
De la fuente, R.; Orden, J.A.; Peñaranda, M.A.; Vega, S. (1996). Diarrea vírica bovina II:
Prevención y control. Revista bovis. 74: 55-82.
Eiras, C.; Mora, A.; Barros, M.; Yus, E.; Arnaiz, I. (2004). Bovine viral diarrhoea (BVD)
infection in Galicia: bases for the devolopment of a control program. Second European
Symposium on BVDV control. Porto, 22 de octubre de 2004.
Eiras, C.; Carnero, M.I.; Diéguez, F.J.; Martínez, S.; Fernández, D.; Barros, M.; Sanjuán,
M.L.; Arnaiz, I. (2005). Control de la Diarrea vírica bovina (BVD) en las ADSG de Galicia.
IV Jornadas de epidemiología y medicina preventiva veterinaria: 60-65.
Greiser-Wilke, I.; Grummer, B.; Moennig, V. (2003). Bovine viral diarrhoea eradication
and control programmes in Europe. Biologicals, 31: 113-118.
Lindberg, A.L.E.; Alenius, S. (1999). Principles of eradication of bovine viral diarrhoea virus
(BVDV) infections in cattle populations. Veterinary Microbiology, 64: 197-222.
Pritchard, G. (1990). Milk antibodies testing in cattle. Veterinary in practice: 542-549.
Trabajo subvencionado por el programa general de investigación de la Xunta de Galicia
(PGIDIT02RAG50701PR).
348
ADULT SHEEP MAY NOT BE AN IMPORTANT ZOONOTIC RESERVOIR FOR
GIARDIA
CASTRO-HERMIDA, J.A.1 *; ALMEIDA, A.2; GONZÁLEZ-WARLETA, M.1; CORREIA
DA COSTA, J.M.2; MEZO, M.1
1Laboratorio de Parasitología, Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo-Xunta
de Galicia. Carretera C-542 de Betanzos a Mesón do Vento, Km 7,5. CP 15318. Abegondo
(A Coruña), Galicia, España.
2 Centro de Imunologia e Biologia Parasitária – INSA. Rua de S. Luís, 16. CP 4000-509.
Porto, Portugal.
*Corresponding autor: phone: 34981647902; fax: 34 981673656. e-mail:
[email protected]
PALABRAS CLAVE/ KEWORDS: Giardia duodenalis; Protozoa; Sheep; Prevalence;
Zoonoses.
ABSTRACT
Giardia duodenalis (synonym G. lamblia, G. intestinalis) infects numerous
mammals, including man. Although specimens of G. duodenalis isolated from humans and
other animals are morphologically similar, there exist different genotypes. The most
commonly detected are: A-I (humans, domestic ruminants, dogs, cats, beavers, rats and
other animals); A-II (responsible for anthroponotic transmission); B (humans, beavers,
dogs, rats and other animals); C and D (canine species); E, F and G (domestic ruminants,
cats and rats). The purpose of this study was to determine the prevalence and intensity of
infection of G. duodenalis in adult sheep and to identify which genotypes are present.
Faecal samples were collected from 575 adult sheep selected at random from 68 herds in
Galicia (NW Spain) and were concentrated and processed by a direct immunofluorescence
technique using monoclonal antibodies (IFAT) and PCR. G. duodenalis cysts were
detected in 188 sheep (32.7%) from 67 (98.5%) of herds and the rate of cyst shedding
ranged between 10 and 4319 cysts/g of faeces (mean 177 ± 598 cysts/g of faeces). In these
preliminary assays on genetic analysis, it was used PCR-based procedures in order to
genotype with amplification and sequencing of the beta-giardin gene. Assemblage E was
detected. All adult animals sampled were asymptomatic indicating a real source of
environmental contamination by G. duodenalis. Nevertheless, the preliminary results of
molecular biology showed that the sheep may not be an important zoonotic reservoir for
this parasite.
INTRODUCCIÓN
Giardia duodenalis (sinónimo G. lamblia, G. intestinalis) es la especie que infecta
a numerosos mamíferos incluido el hombre (Adam, 2001). Aunque aislados de G.
duodenalis procedentes del hombre y animales son morfológicamente similares, existen
distintos genotipos. Los más frecuentemente detectados son: A-I (hombre, rumiantes
domésticos, perros, gatos, castores y otros animales); A-II (responsable de la transmisión
antroponótica); B (hombre, castores, perros, ratas y otros animales); C y D (cánidos); E, F y
G (rumiantes domésticos, gatos y ratas) (Fayer y col., 2004). La giardiosis ha sido detectada
prácticamente en todos los países en los que se ha investigado. A pesar de que la
349
información sobre giardiosis en rumiantes domésticos es escasa, los estudios realizados en
estos animales, han puesto de manifiesto la alta prevalencia observada, en las ganaderías
bovina, ovina y caprina (Olson y col., 1995; Bomfim y col., 2005, Trout y col., 2005;
Castro-Hermida y col., 2005, 2006). En los rumiantes domésticos, el período de prepatencia
oscila entorno a 4 días. La infección se produce durante los primeros días de vida, con
persistencia a lo largo de más de 10 semanas, eliminando una gran cantidad de quistes en
las heces entre las semanas 5-10 de vida (Xiao, 1994). Así, un ternero puede eliminar 109
quistes/día, mientras que una vaca adulta la cifra, aunque menor (7,6 × 105 – 7,2 × 108
quistes/día), sigue siendo significativa. El origen de la infección son los animales enfermos
y los portadores asintomáticos eliminadores de quistes, generalmente adultos. Las hembras
gestantes constituyen, como en otras protozoosis, la principal fuente de infección, ya que
eliminan abundantes quistes al final de la gestación y durante los primeros días de lactancia
(Xiao y col., 1994). Esta parasitosis en muchas ocasiones es asintomática, pero se han
descrito casos clínicos en rumiantes domésticos con síndromes de malabsorción y diarrea
persistente, con heces mucosas, deshidratación, fiebre, apatía, alteración del apetito,
distensión abdominal y dolor a la palpación, lo cual conduce a un retraso en el crecimiento
e incluso la muerte (Olson y col., 1995; Thompson, 2000). Respecto al tratamiento tanto el
metronidazol como el tinidazol han proporcionado buenos resultados. El objetivo del
presente estudio fue determinar la prevalencia, la intensidad de infección y los genotipos
presentes de G. duodenalis en ovejas adultas.
MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Área geográfica de estudio y explotaciones ganaderasEl estudio se llevó a cabo en
Galicia, región situada en el Noroeste de España. Durante el período comprendido entre
Enero y Junio de 2005, se recogieron muestras fecales de 575 ovejas adultas seleccionadas
al azar en 68 rebaños. Las heces se recogieron directamente del recto usando guantes
estériles de plástico. Para cada animal, se cumplimentó una ficha en la que se indicó la
fecha de recogida de las muestra, lugar de la explotación, número de crotal del animal y
observaciones (diarrea, enfermedades, etc...). Todas las muestras se transportaron en una
nevera portátil al Laboratorio, se conservaron a 4ºC y se procesaron en un período máximo
de 24 horas después de su recogida.
2.2. Procesado de las muestras
Las heces fueron diluidas en agua destilada y filtradas a través de mallas (45 µm). El
líquido filtrado se recogió en tubos de centrífuga de fondo cónico. Se adicionó en
proporción 2:1 éter dietílico y se centrífugo a 1.000 g durante 5 minutos a 4ºC,
eliminándose las tres capas por decantación. Una parte del sedimento se utilizó para el
examen microscópico y otra para realizar estudios de biología molecular.
2.3. Inmunofluorescencia Directa (IFD)
Una alícuota del sedimento se depositó sobre un portaobjetos y los quistes de G. duodenalis
se identificaron al microscopio de fluorescencia con el objetivo 40x, empleando un
anticuerpo monoclonal comercial (Aqua-Glo G/C Direct, FL, Comprehensive Kit.
Waterborne, Inc. New Orleans, USA), y siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.
La intensidad de infección se determinó como el número de quistes/g de heces aplicando la
siguiente ecuación: número de quistes presentes en la muestra/volumen de muestra
examinada (ml) x peso de las heces (g) .
350
2.4. Obtención del ADN, amplificación del gen ß-giardina y secuenciación
Los quistes de G. duodenalis se aislaron a partir del sedimento fecal empleando un kit
comercial Dynabeads® GC-Combo (Dynal, Biotech ASA, Noruega) basado en una técnica
de Separación Inmunomagnética (IMS). A continuación, la extracción de ADN genómico
se realizó mediante el kit comercial QIAamp® DNA Minikit (QIAGEN, CA) siguiendo el
protocolo específico para tejidos descrito por el fabricante. La amplificación del gel ßgiardina se realizó por Hemi-Nested PCR usando los siguientes cebadores G7:
5’AAGCCCGACGACCTCAC
CCGCAGTGC-3’;
G376:
5’CATAACGACGCCATCGCGGCTCTCAGCAA-3’; G759:
5’GAGGCCGCCCTGGA
TCTTCGAGACGAC-3’. En la primera reacción de PCR se amplificó un fragmento de 753
pb usando los cebadores G7 y G759, de acuerdo con el protocolo descrito por Cacció y col.
(2002). En la segunda reacción, se amplificó un fragmento de 384 pb usando los cebadores
G376 y G759. Para las reacciones de PCR se mezclaron, en un volumen final de 50 µl, los
siguientes reactivos: 5 µl de tampón 10x (BioLabs, New England); 1,5 mM de MgCl2; 200
µM de cada dNTP; 10 pM de cada cebador; 2,5 unidades de ExTaq DNA polimerasa
(BioLabs, New England), 10 µl de ADN purificado (primera reacción) o 2 µl (segunda
reacción) y agua (c.s.p. 50 µl). Para la reacción se emplearon 35 ciclos cada uno de ellos
integrado por: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y un minuto a 72ºC, con una fase
inicial de desnaturalización (5 minutos a 94ºC) y una extensión final (7 minutos a 72ºC).
Los productos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa del 1,4% con
bromuro de etidio (0,5 µg/ml). Tras purificar el fragmento de ADN se procede a su
clonación en el plásmido TOPO TA Cloning® (Invitrogen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los insertos de ADN se secuenciaron en un laboratorio externo
(MWG Biotech, Alemania) utilizando los cebadores G376 y G759. Las secuencias se
compararon con los existentes en la base de datos del GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Los alineamientos y análisis de polimorfismos se
llevaron a cabo usando los programas informáticos ChromasPro® 1.2. y Proseq® 2.91.
RESULTADOSSe identificaron quistes de G. duodenalis en 188 ovejas (32,7%)
pertenecientes a 67 (98,5%) rebaños. La eliminación quística osciló entre 10-4.319
quistes/g de heces (media 177 ± 598 quistes/g de heces). Mediante el análisis de secuencias
del fragmento amplificado únicamente se detectó el genotipo E.
DISCUSIÓN
En Galicia apenas se ha estudiado la epidemiología de la giardiosis ovina y no
existe información sobre la importancia del ganado ovino adulto como fuente de infección
para los animales y el hombre. La elevada prevalencia obtenida en el presente estudio
(32,7%), así como el hecho de que en el 98,5% de los rebaños existiesen ovejas adultas
eliminadoras de quistes, pone de manifiesto que la infección por G. duodenalis en la
ganadería ovina está ampliamente distribuida en Galicia.
Los datos de prevalencia obtenidos por diversos autores son difíciles de comparar
al variar – entre otros – parámetros como la edad del animal en el momento del muestreo, el
número de muestras analizadas, la metodología aplicada o la presencia / ausencia de
sintomatología. No obstante, opinamos que nuestros resultados son representativos ya que
el presente estudio no se llevó a cabo en animales con edades incluidas en el período de
351
máximo riesgo para el padecimiento de la infección, ni en corderos con sintomatología sino
que fueron ovejas adultas seleccionadas al azar y en 68 rebaños distribuidos por toda la
geografía de Galicia. Incluso, la actual prevalencia podría estar subestimada porque sólo se
recogió una única muestra fecal por animal. La excreción quística se puede presentar de
manera intermitente, principalmente hacia el final del período de patencia, si la muestra fue
negativa durante este período el animal se consideró negativo. Estudios realizados por
diferentes autores muestran prevalencias de giardiosis ovina entre un 6,2% y un 68,6%
(Buret y col., 1990; Taylor y col., 1993; Diaz y col., 1996; Olson y col., 1995; Ryan y col.,
2005), aunque la mayoría de estos trabajos se realizaron con animales jóvenes.
El examen microscópico de las heces es uno de los mejores métodos para
determinar la prevalencia e intensidad de la infección de esta parasitosis, sin embargo, para
conocer las rutas de transmisión es preciso recurrir a técnicas moleculares que permitan la
caracterización de los quistes proporcionando datos objetivos sobre su potencial zoonótico
(Lalle y col., 2005). En el presente estudio, los resultados obtenidos tras la aplicación de
técnicas moleculares son preliminares debido al escaso número de muestras analizadas. La
detección de quistes de G. duodenalis en heces de ovejas adultas por IFD fue más sensible
que la técnica de PCR. Así, en muestras con una intensidad de parasitación baja (< 100
quistes/g de heces), tras el proceso de extracción de ADN, la técnica de PCR fue negativa,
esto podría ser debido a la presencia de inhibidores en las heces, a los pequeños volúmenes
utilizados en los procedimientos moleculares o que los quistes sólo estaban concentrados y
no purificados. En nuestra opinión, la técnica de PCR es altamente sensible y útil en
muestras fecales que, por su elevada carga parasitaria, permitan purificar los quistes
presentes en las mismas. Sin embargo, presenta serias limitaciones cuando se aplica sobre
heces con baja intensidad de infección.
La intensidad de infección de G. duodenalis en ovejas adultas osciló entre 104.319 quistes/g de heces. Estos valores son similares a los obtenidos en estudios previos
realizados en ovejas (Giangaspero y col., 2005). En términos de contaminación ambiental,
el número medio de quistes de G. duodenalis que puede eliminar una oveja adulta puede
estimarse entre 2×104 quistes/día y 8638×103 quistes/día, considerando que la cantidad de
heces producida por animal/día es aproximadamente 2 kg.
Los estudios genéticos realizados en el presente trabajo y basados en la
amplificación del gel ß-giardina mostraron que únicamente se detectó el genotipo E. Este
genotipo es común en la ganadería bovina y en otros rumiantes domésticos incluyendo el
ganado ovino (Becher y col., 2004; Hunter y Thompson, 2005; Itagaki y col., 2005; Ryan y
col., 2005; Trout y col., 2005). No existen datos epidemiológicos ni genéticos que
confirmen que el genotipo E infecta al hombre, por tanto, no está considerado su carácter
zoonótico (Thompson y col., 2000; Thompson, 2003). Estudios realizados en Australia y
Norte América en el ganado bovino, indicaron que el riesgo que representan para la salud
pública terneros infectados con G. duodenalis puede ser mínimo (O’Handley y col., 2000;
Hoar y col., 2001). Aunque, está ampliamente demostrado que los rumiantes domésticos,
principalmente las ganaderías bovina, ovina y caprina, son susceptibles a la infección con
genotipos zoonóticos de G. duodenalis y que el genotipo A es geográficamente el más
ampliamente detectado en el hombre y rumiantes domésticos (Thompson y col., 2000),
estudios longitudinales llevados a cabo en Australia sugieren que los genotipos zoonóticos
pueden estar presentes sólo de forma transitoria y podría existir un mecanismo competitivo
352
cuando la frecuencia de transmisión del genotipo E es alta (Becher y col., 2004). Incluso,
Trout y col. (2005) sugieren que el genotipo A (zoonótico) y el genotipo E (no zoonótico)
podría tener períodos de patencia distintos.
Todos los animales examinados fueron asintomáticos. Sin embargo, en un estudio
realizado por Ryan y col. (2005) observaron una asociación significativa entre ovejas
adultas parasitadas y la presencia de diarrea. Son necesarios estudios posteriores para
analizar un mayor número de muestras con el fin de confirmar si el genotipo E es el
predominante en las ovejas adultas en Galicia, lo que pondría de manifiesto la importancia
del ganado ovino adulto en la transmisión de la giardiosis dentro de la explotación y el
escaso riesgo que representarían estos animales para la salud pública.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio ha sido financiado por la Consellería de Innovación e Industria de la
Xunta de Galicia (PGIDIT05RAG50306PR).
BIBLIOGRAFÍA
Adam, R.D. 2001. Biology of Giardia lamblia. Clinical Microbiology Review, 14: 447-475.
Becher, K.A.; Robertson, I.D.; Fraser, D.M.; Palmer, D.G. y Thompson, R.C.A. 2004.
Molecular epidemiology of Giardia and Cryptosporidium infections in dairy calves
originating from three sources in Western Australia. Veterinary Parasitology, 123: 1-9.
Bomfim, T.C.B.; Huber, F.; Gomes, R.S. y Alves, L.L. 2005. Natural infection by Giardia
sp. and Cryptosporidium sp. in dairy goats, associated with possible risk factors of the
studied properties. Veterinary Parasitology, 134: 9-13.
Buret, A.; denHollander, N.; Wallis, P.M.; Befus, D. y Olson, M. E. 1990. Zoonotic
potential of giardiasis in domestic ruminants. Journal of Infections Disease, 162: 231-237.
Cacciò, S.M.; de Giacomo, M. y Pozio, E. 2002. Sequence analysis of the β-giardin gene
and development of a PCR-RFLP assay to genotype Giardia duodenalis cysts from human
faecal samples. International Journal for Parasitology, 32: 1023-1030.
zález-Warleta, M. y Mezo, M. 2006. Prevalence and intensity of infection of
Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis in dairy cattle in Galicia (NW Spain).
Journal of Veterinary Medicine Serie B, 53: 244-246.
Diaz, V.; Campos, M.; Lozano, J.; Manas, I. y González, J. 1996. Aspects of animal
giardiasis in Granada province (southern SpainCastro-Hermida, J.A.; Pors, I.; Poupin, B.;
Ares-Mazás, E. y Chartier, C. 2005. Prevalence of Giardia duodenalis and
Cryptosporidium parvum in goat kids in western France. Small Ruminant Research, 56:
259-264.
Castro-Hermida, J.A.; Carro-Corral, C; Gon). Veterinary parasitology, 64: 171-176.
Fayer, R.; Dubey, J.P. y Lindsay, D.S. 2004. Zoonotic protozoa: from land to sea. Trends in
Giangaspero, A.; Paoletti, B.; Iorio, R. y Traversa, D. 2005. Prevalence and molecular
characterization of Giardia duodenalis from sheep in central Italy. Parasitology
Research,96: 32-37.
Hoar, B.R.; Atwill, E.R.; Elmi,C.; Farver, T.B. 2001. An examination of risk factors
associated with beef cattle shedding pathogens of potential zoonotic concern. Epidemiology
and Infection,127: 147-155.
353
Hunter, P.R. y Thompson, R.C.A. 2005. The zoonotic transmission of Giardia and
Cryptosporidium. International Journal for Parasitology, 35: 1181-1190.
Itagaki, T.; Kinoshita, S.; Aoki, M.; Itoh, N.; Saeki, H.; Sato, N.; Uetsuki, J.; Izumiyama,
S.; Yagita, K. y Endo, T. Genotyping of Giardia intestinalis from domestic and wild
animals in Japan using glutamate dehydrogenase gene sequencing. Veterinary Parasitology,
133: 283-287.
Lalle, M.; Pozio, E.; Capelli, G.; Bruschi, F.; Crotti, D. y Cacciò, M. 2005. Genetic
heterogeneity at the β-giardin locus among human and animal isolates of Giardia
duodenalis and identification of potentially zoonotic subgenotypes. International Journal
for Parasitology, 35: 207-213.
O’Handley, R.M.; Olson, M.E.; Fraser, D.; Adams, P y Thompson, R.C.A. 2000.
Prevalence and genotypic characterization of Giardia in dairy calves from western
Australia and western Canada. Veterinary Parasitology, 90: 193-200.
Olson, M.E.; McAllister, T.A.; Deselliers, L.; Morck, D.W.; Cheng, K. J.; Buret, A.G. y
Ceri, H. 1995. Effects of giardiasis on production in a domestic ruminant (lamb) model.
American Journal Veterinary Research, 56: 1470-1474.
Ryan, U.M.; Bath, C.; Robertson, I.; Read, C.; Elliot, A.; Mcinnes, L.; Traub, R. y Besier,
B. 2005. Sheep may not be an important zoonotic reservoir for Cryptosporidium and
Giardia parasites. Applied and Environmental Microbiology, 71: 4992-4997.
Taylor, M.A.; Catchpole, J.; Marshall, R.N.; y Green, J. 1993. Giardiasis in lambs at
pasture. Veterinary Record, 133: 131-133.
Thompson, R.C.A. 2000. Giardiasis as a re-emerging infectious disease and its zoonotic
potential. International Journal for Parasitology, 30: 1259-1267.
Thompson, R.C.A. 2003. Molecular epidemiology of Giardia and Cryptosporidium
infections. Journal of Parasitology, 89: S134-S140.
Thompson, R.C.A.; Hopkins, R.M. y Homan, W.L. 2000. Nomenclature and genetic
groupings of Giardia infecting mammals. Parasitology Today, 16: 210-213.
Trout, J.M.; Santín, M.; Greiner, E. y Fayer, R. 2005. Prevalence and genotypes of Giardia
duodenalis in post-weaned dairy calves. Veterinary Parasitology, 130: 177-183.
Xiao, L., 1994. Giardia infection in farm animals. Parasitology Today,10: 436-438.
Xiao, L.; Herd, R.P. y Mcclure, K.E. 1994. Periparturient rise in the excretion of Giardia sp
cysts and Cryptosporidium parvum oocysts as a source of infection for lambs. Journal of
354
EVALUATION OF BOBEL-24 FOR TREATMENT OF EXPERIMENTAL
CRYPTOSPORIDIOSIS
CASTRO-HERMIDA, J.A.1 *; GARCÍA-PRESEDO, I.1; GONZÁLEZ-WARLETA, M.1;
MEZO, M.1; FENOY, S.2; RUEDA, C.2; DEL ÁGUILA, C.2
1Laboratorio de Parasitología, Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo-Xunta
de Galicia. Carretera C-542 de Betanzos a Mesón do Vento, Km 7,5. CP 15318. Abegondo
(A Coruña), Galicia, España.
2Sección de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad San Pablo-CEU,
Urbanización Montepríncipe, 28668, Boadilla del Monte, Madrid, España.
*Corresponding autor: phone: 34981647902; fax: 34 981673656. e-mail:
[email protected]
PALABRAS CLAVE/ KEYWORDS: Cryptosporidium parvum; Bobel-24; In vivo
infectivity; Control methods; Protozoa.
ABSTRACT
Cryptosporidiosis is a universally-distributed parasitic disease, diarrhoea being the
main clinical symptom in neonatal domestic ruminants. The disease is caused by
protozoans included in the genus Cryptosporidium, which comprises organisms that
develop and multiply in the epithelial cells of the digestive and respiratory tract of
vertebrates. Although this parasitic infection is important in domestic ruminants in terms of
animal health and production, the zoonotic nature of the infection and the possibility that
livestock may act as sources of infection - thereby transmitting the parasite to the human
population via food and water, must also be considered. At present, there is no effective
treatment available for cryptosporidiosis in man or animals. The aim of the present study
was to evaluate the efficacy of Bobel-24 (2,4,6-triiodophenol) against experimental
cryptosporidiosis in neonatal mice model. C. parvum oocysts were collected from naturally
infected calves. Concentration, purification and quantification of oocysts were as described
previously. Neonatal mice (2,5-3,0 g/body weight) were inoculated intragastrically (2,5x104
oocysts/0,1 ml). Preventive and curative efficacies at different doses (50, 100 y 125 mg/kg
body weight) and regimens of Bobel-24 against cryptosporidial infection were evaluated.
Prevalence and intensity of infection were determined 7 days after infection by examination
of intestinal homogenates. No apparent toxic effects were observed. Although we were
unable to eliminate infectivity in the mice, our study revealed that the intensity of infection
for the preventive litters and preventive/curative was significantly lower (P < 0.001) than in
the control litters.
INTRODUCCIÓN
Cryptosporidium parvum (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) es un protozoo parásito que
infecta a un amplio rango de mamíferos, entre los que se incluye el hombre. Las infecciones
en individuos inmunocompetentes son de corta duración y el compromiso intestinal puede
originar procesos diarreicos de intensidad variable con pérdidas de peso. Sin embargo, en
individuos inmunocomprometidos, la infección puede ser persistente e incluso mortal.
Desde el punto de vista de la sanidad y la producción animal, C. parvum es uno de los
principales agentes etiológicos del síndrome de diarrea neonatal en rumiantes domésticos,
355
ocasionando importantes pérdidas económicas, especialmente en las ganaderías bovina,
ovina y caprina, debido a que puede ocasionar fuerte deshidratación que conlleva un
importante retraso en el crecimiento de los animales. Incluso en ausencia de otros
enteropatógenos, la infección por Cryptosporidium puede ocasionar elevadas tasas de
mortalidad y la morbilidad puede llegar a alcanzar el 100% (Fayer y col., 2004). Sin
embargo, la cryptosporidiosis no debe considerarse únicamente bajo la perspectiva de la
sanidad humana y animal, sino que es necesario tener en cuenta su carácter zoonótico y la
posibilidad de que los animales de renta actúen como fuente de contagio, vehiculando el
parásito a la población humana a través de los alimentos y el agua. Lo anteriormente
expuesto se agrava por dos circunstancias: la extraordinaria resistencia de las formas
infectantes a los antisépticos y desinfectantes habitualmente empleados y por la ausencia de
un tratamiento eficaz. Aunque una gran diversidad de moléculas han sido evaluadas frente a
la cryptosporidiosis humana y animal, en la actualidad, no existe ningún tratamiento
totalmente eficaz tanto para la profilaxis como para el tratamiento (Coombs y Müller,
2002). Sin embargo, entre las moléculas que han mostrado una eficacia parcial frente a la
cryptosporidiosis animal destacan: el lactato de halofuginona (Villacorta y col., 1991; Lefay
y col., 2001), paromomicina (Chartier y col., 1996; Viu y col., 2000; Grinberg y col., 2002)
y los excipientes α-, β-ciclodextrina (Castro-Hermida y col., 2001a, 2002, 2004). Frente a la
cryptosporidiosis humana, la nitazoxanida ha mostrado resultados esperanzadores (Amadi y
col., 2002; Gilles y Hoffman, 2002). El Bobel-24 o AM-24 (2,4,6-triyodofenol) es un antiinflamatorio de síntesis que presenta una acción superior a los anti-inflamatorios no
esteroídicos. Este principio activo está indicado para problemas asociados con las formas
inflamatorias y degenerativas de reumatismo; cualquier condición inflamatoria de origen
traumático; enfermedades del colon (colitis ulcerosa y síndrome de Crohn); enfermedades
respiratorias (asma, fibrosis pulmonar y Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda
(SDRA) y dermatosis (soriasis, dermatitis atópica, irritación, acné, dermatitis seborreica,
etc...) (García-Capdevila y col., 1998). El objetivo del presente estudio es evaluar la
eficacia del Bobel-24 en el tratamiento de la cryptosporidiosis experimental.
MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Parásito
Los ooquistes de C. parvum procedieron de un ternero de raza Frisona naturalmente
infectado. Las heces, sobre las que se aplicó inicialmente un examen directo con Fucsina
básica fenicada (Heine, 1982), fueron sometidas a procesos de concentración, purificación
y cuantificación de acuerdo con el protolo descrito por Lorenzo y col. (1993).
El material fecal fue recogido directamente del recto y una vez confirmada la infección de
intensidad grave (>10 ooquistes/campo microscópico 100 Х) se conservó en dicromato
potásico al 5% (1:1) a 4 ºC hasta su posterior utilización en un tiempo máximo de 48 horas.
Las heces fueron filtradas a través de mallas (45 µm) y el líquido filtrado se centrífugo,
repetidas veces, a 1.000 g durante 5 minutos a 4 ºC hasta eliminar el exceso de dicromato
potásico. El sedimento fue suspendido en tampón fosfato salino (PBS) 0,04M, pH 7,2 y
dietil éter (2:1) y centrifugado a 800 g durante 5 minutos a 4 ºC, eliminándose las tres capas
por decantación. Este paso se repitió las veces necesarias hasta la total extracción de restos
lipídicos. Después de varios lavados, el sedimento se resuspendió en agua destilada estéril y
1 ml de la suspensión resultante fue procesado mediante un gradiente discontinuo de Percol
356
(Sigma P-1644) constituido por cuatro capas de 2,5 ml de densidades 1,13; 1,09; 1,05; 1,01
g/ml y centrifugado a 650 g durante 15 minutos a 4 ºC. La banda conteniendo los ooquistes
purificados se lavó repetidas veces con agua destilada estéril a 1.000 g durante 5 minutos a
4 ºC para eliminar los restos de Percol.
El número de ooquistes presentes en 1 ml de la suspensión se cuantificó en una cámara de
Neubauer utilizando verde malaquita (0,16%) como contracolorante. Para evitar la
contaminación bacteriana se adicionaron a la suspensión ooquística purificada 2.000 UI/ml
de penicilina y 10 mg/ml de gentamicina conservándose a 4 ºC hasta su utilización.
2.2. Ensayos de infectividad in vivo
Se evaluó la eficacia preventiva, preventiva/curativa y curativa de suspensiones de Bobel24 (50 y 125 mg/kg peso vivo) elaboradas con el excipiente carboximetilcelulosa sódica
(CMC) en el tratamiento de la cryptosporidiosis experimental. Para ello, se utilizaron un
total de 18 camadas de ratones Swiss CD-1 (6-18 ratones/camada). En todos los ensayos se
emplearon animales con un peso corporal comprendido entre 2,5-3 g (3-4 días de edad).
Todas las camadas con sus respectivas madres se mantuvieron separadas en jaulas de
plástico, recibieron un pienso comercial adecuado y agua ad libitum, manteniéndose bajo
unas condiciones higiénicas buenas y con las características del animalario existente en
nuestro Laboratorio de Parasitología, es decir, una sala blanca ISO-7 con un nivel de
bioseguridad P-3. En todo momento, se cumplió con la legislación vigente sobre protección
de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (Real Decreto
1201/2005 de 10 de octubre de 2005) (BOE nº 252 de 21 de octubre de 2005).
En todos los ensayos la dosis administrada en las infecciones experimentales fue de 2,5 x
104 ooquistes/0,1 ml/ratón, dosis establecida en estudios previos como superior a la
necesaria para conseguir implantar la infección en la totalidad de los animales (Villacorta,
1989). Cada ensayo se realizó por duplicado y se utilizaron camadas control de infección y
del excipiente.
A los siete días post-inoculación, día de máxima producción ooquística (Villacorta, 1989),
se sacrificaron los animales y los intestinos se recogieron individualmente sobre 5 ml agua
destilada estéril. A continuación, fueron triturados utilizando un homogenizador de barras
(Ultra-Turrax® T-25, IKA®-WERKE). La producción ooquística, se cuantificó en cámara
de Neubauer como se describe anteriormente. El resultado se expresó como el número de
ooquistes x 105 / totalidad de intestino homogenizado.
Las camadas recibieron cuatro horas antes de ser inoculadas 100 µl de la suspensión del
Bobel-24 y los días uno y dos post-inoculación (ensayos de eficacia preventiva) y desde el
día uno hasta el día seis post-inoculación (ensayos de eficacia preventiva/curativa). En los
estudios de eficacia curativa la suspensión de Bobel-24 se administró los días tres, cuatro,
cinco y seis post-inoculación.
2.3. Tratamiento estadístico de los datos
El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante el análisis de la varianza
(ANOVA) de una sóla vía y el test de comparación múltiple SNK (Student-NewmanKeuls), GraphPad InStat® (Version 3.05).
357
RESULTADOS
Los porcentajes de parasitación obtenidos tanto en las camadas control de infección como
del excipiente CMC fueron del 100%. La intensidad de infección detectada entre ambos
controles fue similar y no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre
ellos (Tabla 1). La administración del principio activo a las dos dosis ensayadas no
permitió, en ningún caso, disminuir el número de animales infectados. Sin embargo, se
consiguió reducir significativamente las intensidades de infección (P < 0,001) en los
ensayos de eficacia preventiva y preventiva/curativa respecto a las observadas en las
camadas control. Además, la intensidad de parasitación en las camadas tratadas
curativamente fue significativamente menor (P < 0,05) que la obtenida para ambos
controles. A pesar de estas reducciones significativas en las intensidades de infección para
los diferentes tratamientos, en ningún caso, existió una relación directa entre la dosis
administrada y el descenso de intensidad de parasitación determinado (Tabla 1).
Tabla 1. Eficacias preventiva, preventiva/curativa y curativa de la suspensión de Bobel-24
en carboximetilcelulosa sódica, evaluadas en ratones lactantes infectados con 2,5 x 104
ooquistes de C. parvum.
TRATAMIENTOS
Preventivo
Preventivo / Curativo Curativo
Intensidad
Intensidad
Intensidad
Nº ratones de
Nº ratones de
Nº ratones de
inoculados infección
a
a
a
61,7
±
61,7
±
61,7
±
Control
20
20
20
36,8 ■
36,8 ■
36,8 ■
infección
51,7
±
58,6
±
Control
25
23
32,6 ■
36,2 ■
CMC
15,1 ± 9,8
20,9
±
40,9
±
Bobel (50
28
22
23
•
11,4 •
26,2 *
mg/kg)
Bobel
13,0
±
21,0 ± 9,1
35,8 ± 7,7
24
26
19
(125
10,1•
•
*
mg/kg)
a
: media ± desviación estándar de ooquistes × 105 / totalidad del intestino homogenizado; ■,
• y * : No existen diferencias estadísticamente significativas entre los pares.
DISCUSIÓN
En estos últimos años y como consecuencia de las importantes repercusiones de la
cryptosporidiosis tanto en sanidad humana como animal, se ha incrementado la
investigación de medidas terapéuticas y preventivas frente a esta parasitosis. Sin duda, los
resultados obtenidos en bioensayos utilizando distintos modelos animales son más fiables
que los alcanzados en estudios in vitro. La mayoría de los ensayos in vivo utilizan roedores
de laboratorio consiguiendo, en algunas especies, incrementar la susceptibilidad al parásito
mediante la administración de agentes inmunosupresores. Por otra parte, el empleo de
animales con inmunodeficiencias congénitas proporciona un modelo aplicable a
hospedadores naturales inmunodeficientes (Rehg, 1996; Bjorneby y col., 1991).
358
El modelo murino lactante utilizado en el presente estudio presenta varias ventajas.
Los ratones lactantes se pesan diariamente, lo que permite ajustar la dosis del Bobel-24 para
mantenerla constante durante todo el experimento. Es posible la extracción de todo el tracto
gastrointestinal, lo que permite cuantificar la totalidad de ooquistes presentes en el mismo.
Al no interferir el sistema inmune simulamos una situación semejante a la que se presenta
en condiciones naturales cuando se trata de hospedadores inmunocompetentes. Sin
embargo, la cryptosporidiosis en estos animales no cursa con sintomatología por lo que no
permite evaluar la eficacia frente a las manifestaciones clínicas que ocasiona esta
parasitosis en otros animales. Finalmente, su fácil manejo, bajo coste y rápida procreación
hacen que este modelo sea el más aceptado con sus ventajas e inconvenientes (Blagburn y
col., 1998). No obstante, la creciente preocupación de la sociedad por la protección de los
animales y la calidad de la investigación, en la que la observación, el control, el bienestar,
el mantenimiento y el cuidado de los animales que se utilizan en experimentación es un
pilar básico, así como los cambios en la legislación y los continuos avances científicos,
hacen que sea necesario el estricto cumplimiento de la normativa vigente (Real Decreto
1201/2005 de 10 de octubre de 2005, BOE nº 252 de 21 de octubre de 2005).
La elección de las pautas de administración tanto preventiva, preventiva/curativa como
curativa, se realizó teniendo en cuenta el tiempo necesario para que se complete el ciclo
biológico en un hospedador y establecido, por Current y Haynes (1984), en torno a 72
horas.
Los resultados obtenidos en el presente estudio demuestran que el Bobel-24 aunque no
permite erradicar la infección reduce significativamente la intensidad de la misma en todos
los ensayos, si bien, este efecto fue más importante en las camadas inoculadas
preventivamente. De igual forma, al evaluar in vivo la actividad de este anti-inflamatorio no
esteroídico a las dosis establecidas, comprobamos que independientemente del régimen de
administración empleado, se produce un descenso en la intensidad de infección con
respecto a las camadas control, aunque no se observó una relación efecto dosisdependiente, quizá debido a las propiedades físico-químicas del principio activo. Un
problema bastante común entre los principios activos ensayados frente a la
cryptosporidiosis es su baja solubilidad, la disolución de un principio activo es el paso
previo para su absorción. Al mejorar la solubilidad del principio activo, se aumenta la
fracción absorbida del mismo, con lo cual se puede disminuir la dosis a administrar para
lograr el mismo efecto terapéutico, lo que implica una ventaja adicional de una disminución
de los efectos secundarios obtenidos a consecuencia de las elevadas dosis administradas.
Por tanto, la formulación correcta de un compuesto posee una importancia decisiva a la
hora de garantizar su adecuada biodisponibilidad y por tanto, su eficacia terapéutica.
La intensidad de infección observada con el excipiente carboximetilcelulosa sódica
(CMC) ha sido similar a la obtenida en las camadas control. Algunos excipientes han
mostrado una cierta actividad frente a la cryptosporidiosis, incluso se ha observado un
posible efecto sinérgico entre el excipiente y el principio activo (Harp, 1999; CastroHermida y col., 2000; 2001). Las dosis utilizadas en el modelo murino lactante no
presentaron toxicidad aparente como lo demuestran la ganancia de peso observada a lo
largo de todos los ensayos y la ausencia de mortalidad respecto a las camadas control.
A pesar de que no se ha conseguido erradicar la infección por C. parvum, se ha
observado una actividad anti-cryptosporidial de Bobel-24 en los ensayos de eficacia
359
preventiva y preventiva/curativa que permite abrir nuevas vías en los estudios de
tratamiento de esta parasitosis.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio ha sido financiado por la Consellería de Innovación e Industria de la Xunta de
Galicia (PGIDIT05RAG50306PR) y por la Fundación Universitaria S. Pablo-CEU
BIBLIOGRAFÍA
Amadi, B.; Mwiya, M.; Musuku, J.; Watuka, A.; Sianongo, S.; Ayoub, A. y Kelly, P. 2002.
Effect of nitazoxanide on morbidity and mortality in Zambian children with
cryptosporidiosis: a randomised controlled trial. Lancet, 360: 1375-1380.
Bjorneby, J.M.; Hunsaker, B.D.; Rigg, M.W. y Perryman, L.E. 1991. Monoclonal antibody
immunotherapy in nude mice persistently infected with Cryptosporidium parvum. Infection
and Immunity, 59: 1172-1176.
Blagburn, B.L.; Drain, K.L.; Land, T.M.; Moore, P.H.; Kinard, R.G.; Lindsay, D.S.;
Kumar, A.; Shi, J.; Boykin, D.W. y Tidwell, R.R. 1998. Dicationic furans inhibit
development of Cryptosporidium parvum in HSD/ICR suckling Swiss mice. Journal of
Boletín Oficial del Estado (BOE) (núm 252) de 21 de Octubre de 2005. Real Decreto
1201/2005, de 10 de octubre, sobre protección de los animales utilizados para
experimentación y otros fines científicos.
Castro-Hermida, J.A.; Freire-Santos, F.; Oteiza-López, A.M. y Ares-Mazás, M.E. 2000.
Unexpected activity of β-cyclodextrin against experimental infection by Cryptosporidium
parvum. Journal of Parasitology, 86: 1118-1120.
Castro-Hermida, J.A.; Ares-Mazás, M.E.; Nieto-Reyes, L.; Otero-Espinar, F. y BlancoMéndez, J. 2001. Inhibition of Cryptosporidium infection in mice treated with a
cyclodextrin inclusion complex with diloxanide furoate. Parasitology Research, 87: 449452.
Castro-Hermida, J.A; Quílez-Cinca, J.; López-Bernad, F.; Sánchez-Acedo, C.; FreireSantos, F. y Ares-Mazás, M.E. 2001a. Treatment with β-cyclodextrin of natural
Cryptosporidium parvum infections in lambs under field conditions. International Journal
for Parasitology, 31: 1134-1137.
Castro-Hermida, J.A.; González-Losada, Y.; Freire-Santos, F.; González-Warleta, M.;
Mezo-Menéndez, M. y Ares-Mazás, M.E. 2002. Efficacy of β-cyclodextrin against
experimental cryptosporidiosis in neonatal lambs. Journal of Parasitology, 88: 185-187.
Castro-Hermida, J.A.; Pors, I.; Otero-Espinar, F.; Luzardo-Álvarez, A.; Ares-Mazás, E. y
Chartier, C. 2004. Efficacy of α-cyclodextrin against experimental cryptosporidiosis in
neonatal goats. Veterinary Parasitology, 120: 35-41.
Chartier, C.; Mallereau, M.P. y Naciri, M. 1996. Prophylaxis using paromomycin of natural
cryptosporidial infection in neonatal kids. Preventive Veterinary Medicine, 25: 357-361.
Coombs, G.H. y Muller, S. 2002. Recent advances in the search for new anti-coccidial
drugs. International Journal for Parasitology, 32: 497-508.
Current, W.L. y Haynes, T.B. 1984. Complete development of Cryptosporidium in cell
cultures. Science, 224: 603-605.
360
Fayer, R.; Dubey, J.P. y Lindsay, D.S. 2004. Zoonotic protozoa: from land to sea. Trends in
Garcia-Capdevila, L.; Lopez-Calull, C.; Pompermayer, S.; Arroyo, C.; Molins-Pujol, A.M.
y Bonal, J. 1998. High-performance liquid chromatography analysis of Bobel-24 in
biological samples for pharmacokinetic, metabolic and tissue distribution studies. Journal
of ChromatographyB: 708: 169-175.
Gilles, H.M. y Hoffman, P.S. 2002. Treatment of intestinal parasitic infections: a review of
nitazoxanida. Trends in Parasitology, 18: 95-97.
Grinberg, A.; Markovics; A.; Galindez, J.; López-Villalobos, N.; Nosak, A. y Tranquillo,
V.M. 2002. Controlling the onset of natural cryptosporidiosis in calves with paromomycin
sulphate. Veterinary Record, 151: 606-608.
Harp, J.A. 1999. Oral dosing of neonatal mice with sucrose reduces infection with
Cryptosporidium parvum. Journal of Parasitology, 85: 952-955.
Heine, J. 1982. An easy technique for the demonstration of Cryptosporidia in faeces.
Zentralblatt fürVeterinärmedizin B, 29: 324-327.
Lefay, D.; Naciri, M.; Poirier, P. y Chermette, R. 2001. Efficacy of halofuginone lactate in
the prevention of cryptosporidiosis in suckling calves. Veterinary Record, 148: 108-112.
Lorenzo-Lorenzo, M.J.; Ares-Mazás, M.E.; Villacorta Martínez de Maturana, I. y Durán, D.
1993. Effect of ultraviolet disinfection of drinking water on the viability of
Cryptosporidium parvum oocysts. Journal of Parasitology, 79: 67-70.
Rehg, J.E. 1996. Effect of diethyldithiocarbamate on Cryptosporidium parvum infection in
immunosuppressed rats. Journal of Parasitology, 82: 158-162.
Villacorta Martínez de Maturana, M.I. 1989. Diagnóstico, incidencia y profilaxis de la
cryptosporidiosis. Infecciones experimentales. Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de
Compostela. 119 pp.
Villacorta, I.; Peeters, J.E.; Vanopdenbosch, E.; Ares-Mazás, E. y Heys, H. 1991. Efficacy
of halofuginona lactate against Cryptosporidium parvum in calves. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, 35: 283-287.
Viu, M.; Quílez, J.; Sánchez-Acedo, C.; del Cacho, E. y López-Bernad, F. 2000. Field trial
on the therapeutic efficacy of paromomycin on natural Cryptosporidium parvum infections
in lambs. Veterinary Parasitology, 90: 163-170.
361
INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN GANMA (IFN-γγ) EN
CULTIVOS DE LINFOCITOS T DE BOVINOS CON HIPODERMOSIS
MODULATORY EFFECT OF THE HIPODERMIN A ON THE SECRETION OF GAMMA
INTERFERON (IFN-γ) IN CULTURES OF LYMPHOCITES FROM CATTLE WITH
HIPODERMOSIS
DACAL V., PANADERO R., LÓPEZ C., VÁZQUEZ L., MORRONDO P., DÍEZ P.
Parasitología y Enfermedades Parasitarias. Dpto. Patología Animal. Facultad de
Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela. 27002. Lugo.
ABSTRACT
The effect of the antigen hipodermin A (HA) on the secretion of gamma interferon (IFN-γ)
by lymphocytes of cattle infested and non infested by Hypoderma lineatum and its effect on
the activity of the mitogens concanavalin A (Con A) and phytohemaglutinin (PHA) were
studied. Cows that presented warbles on their back were used as positive animals and
calves 6 months old as negative. The lymphocytes was isolated from those animals and they
were cultivated for 24, 48 and 72h with 11µg of HA and different concentrations of both
mitogens (Con A and PHA).
The stimulation of lymphocytes with HA without mitogen, did not induce the secretion of
INF-γ. The coincubation with Con A increased considerably the secretion of IFN-γ in the
infested animals, with a maximum at 48 h. On the contrary, in cultures from negative
animals the presence of HA diminished notably the effects of Con A. Something similar
happened to PHA, so the negative animals showed basal levels. In cultures of positive
animals incubated with 20 µg/ml of PHA, IFN-γ levels raised when increasing the culture
time. In conclusion, differences between negative and positive animals showed an
inhibition on the secretion of IFN-γ in the first ones, which could be interpreted as an
evasion strategy that would explain the survival of larvae in primo infected animals.
INTRODUCCIÓN
La hipodermosis es una miasis cutánea del ganado vacuno que guarda mucha relación con la
edad y el estado inmunitario de los animales. Está comprobado, que el ganado vacuno
desarrolla cierta resistencia tras repetidas exposiciones a las larvas de Hypoderma spp.,
como lo demuestra el hecho repetido de que los animales más jóvenes presenten, por lo
general, un número de nódulos larvarios significativamente superior a los de más edad
(GINGRICH, 1982). Esta resistencia constituye un factor importante en el control de las
poblaciones del parásito, comprobándose que es dependiente del número de exposiciones
previas y del número de larvas que infesten al hospedador (COLWELL, 1985).
La respuesta humoral se ha estudiado ampliamente, permitiendo el desarrollo de
técnicas de diagnóstico precoces, encaminadas a detectar anticuerpos y antígenos
parasitarios (PANADERO y col., 2002; COLWELL y col., 2003). No obstante, es
manifiesta la ausencia de relación directa entre los niveles de inmunoglobulinas séricas y el
grado de resistencia alcanzado por los animales (PRUETT y BARRETT, 1985;
PANADERO, 1996), por lo que se sospecha que la respuesta celular, que ha sido menos
investigada hasta el momento, desempeña un papel muy importante en la respuesta
protectora frente a esta parasitosis.
362
NELSON y WEINTRAUB (1972) denunciaron que la respuesta celular estaba
implicada en la inmunidad frente a Hypoderma, como lo demostraba la fuerte reacción
celular producida tras la penetración de las larvas, en especial en los animales reinfestados.
Tras esta primera aproximación, BARON y WEINTRAUB (1986) estudiaron la respuesta
linfoproliferativa en animales primo y reinfestados tras la activación con distintos
mitógenos. Estos autores sugierieron que la resistencia adquirida frente a la hipodermosis
era de base celular y en ella participaban células T y B.
Sin embargo, todavía se desconoce el patrón exacto de secreción de distintas
citoquinas por parte de los linfocitos activados, de modo que es importante conocer si la
protección se debe al predominio de la respuesta linfocitaria tipo I (Th1), y a la
consiguiente liberación de citoquinas que tienen un efecto estimulador de la inmunidad
celular, o bien se trata de la respuesta tipo II (Th2), donde predomina la liberación de
citoquinas cuyo efecto principal es la regulación de la producción de anticuerpos. Dentro de
la respuesta celular Th1 destaca el IFN-γ, que es una citoquina producida por linfocitos T y
células NK (ROMAGNANI, 1997). A parte de su clara actividad antiviral y reguladora del
crecimiento celular, sus propiedades inmunomoduladoras son con toda probabilidad las más
importantes. El IFN-γ es el principal activador de la función de los macrófagos y también
regula el proceso de diferenciación de las células mieloides (BOEHM y col., 1997).
Además, juega un papel importante en el crecimiento y diferenciación de los linfocitos
citotóxicos, activa las células NK y actúa como un factor de maduración de los linfocitos B.
Su papel exacto en el desarrollo de ciertas enfermedades y en la terapia todavía no está muy
claro; se sabe que está implicado en la defensa frente a parásitos, patógenos intracelulares y
posiblemente también ante células tumorales (STARK y col., 1998).
El presente trabajo se realizó con objeto de estudiar el efecto de la hipodermina A
(HA), sobre la secreción de IFN-γ, por los linfocitos de bovinos infestados y no infestados
por Hypoderma lineatum observando la acción moduladora de esta sobre la actividad de los
mitógenos concanavalina A y fitohemaglutinina.
MATERIAL Y MÉTODOS
La obtención del antígeno de Hypoderma se llevó a cabo a partir de larvas 1 de H. lineatum
recogidas de la submucosa esofágica de bovinos sacrificados en matadero. Las L1
permanecieron congeladas a -20ºC hasta el momento de obtener el antígeno. La hipodermina A
(HA) se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico empleando DEAE
(diethylaminoetil) ligado a celulosa (DEAE-celulosa, Whatman) como intercambiador
aniónico. Posteriormente, se determinó la concentración proteica de esta mediante la técnica
del BCA de Pierce. La concentración observada fue de 0,11 mg/ml.
Para obtener sangre de animales infestados se emplearon como animales positivos
3 vacas de 4 a 8 años, las cuales presentaban nódulos larvarios de Hypoderma en el dorso
durante el periodo de la toma de muestras. Ante la dificultad de encontrar ganado vacuno
adulto que no hubiera estado nunca en contacto con las larvas parásitas (negativos) ,
tomamos la sangre de terneros procedentes de una explotación de ganado vacuno de la
provincia de Lugo. La edad de los terneros escogidos fue de aproximadamente 6 meses.
Las muestras sanguíneas se tomaron por punción de la vena caudal en tubos de
vidrio heparinizados. En ambos casos (infestados y no infestados), la sangre procedente de
distintos animales se mezcló para evitar posibles variaciones individuales. Posteriormente
363
se aislaron los linfocitos depositando en tubos de vidrio 6 ml de una solución comercial
(Biocoll δ 1,077) a la que se le añadió cuidadosamente 4 ml de sangre heparinizada y a
continuación se centrifugó a 400 g durante 30 minutos (Esquema 1).
Esquema 1: Protocolo de aislamiento linfocitario
LINFOCITOS
S
Después del aislamiento se realizó un análisis de la viabilidad celular con azul
tripán, y a continuación se ajustó la concentración a 5 x 106 linfocitos/ml usando para ello
medio de cultivo completo que contenía RPMI-1640®, suero fetal bovino (SFB)
descomplementado, 100 UI/ml de penicilina, 20 µg/ml de estreptomicina y 1 µl/ml de
anfotericina B. Posteriormente se añadieron los mitógenos concanavalina A (Con A,
Biochrom) y fitohemaglutinina (PHA-L, Biochrom) a razón de 5, 10 y 20 µg/ml, dejando
un pocillo sin estimular al que se le añadieron 100 µl de PBS. Al mismo tiempo se
sensibilizaron los linfocitos con 11µg de HA. De esta forma se cultivaron los linfocitos de
los animales positivos y negativos a Hypoderma. Después de 24, 48 y 72 horas de
incubación, a una temperatura de 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 5% y con un 95 % de
humedad, se recogió el sobrenadante de cada pocillo centrifugándolo a 800 g durante 10
minutos y se congeló a -80ºC. La cuantificación del interferón-γ se llevó a cabo mediante el
ensayo comercial IFN-γ-Bovine EASIA (BIOSOURCE).
La estimulación de los linfocitos con la hipodermina A en ausencia de mitógenos, no
induce la secreción de INF-γ. Estos resultados coinciden con los de MOIRÉ y col. (1997)
quienes demostraron que esta proteasa de la familia de las tripsinas degrada los marcadores
de superficie implicados en la activación de los linfocitos, inhibiendo por tanto la secreción
de determinadas citoquinas, entre las que se encuentra el INF-γ. De acuerdo con estos
autores, el efecto de la HA sobre los linfocitos comenzaría en las fases tempranas de la
estimulación y los efectos pueden revertirse retirando la HA. Esta actividad enzimática
también podría estar implicada en la inhibición de la proliferación linfocitaria. FISHER y
col. (1991) y CHABAUDIE y BOULARD (1992) fueron los primeros en sugerir el papel
de esta enzima en la inmunosupresión observada en los animales infestados. Así, la HA
actúa degradando el componente C3 del complemento implicado en la respuesta antígeno364
específica y en el control de la linfoproliferación (BOULARD, 1989; BARON, 1990;
ERDEI y col., 1991).
Abs (450 nm)
Abs (450 nm)
Abs (450 nm)
Al cultivar en presencia del mitógeno concanavalina observamos el siguiente
comportamiento:
En la figura 1A se aprecia que la
4
co-incubación
de la HA con 5 µg/ml
Testigo (+)
Testigo (-)
A
de
Con
A
produjo,
en los cultivos de
Negativo
Positivo
3
animales
no
infestados,
una
disminución de la respuesta al
2
mitógeno. Así, la presencia de Con A
1
provocó un aumento en los niveles
de INF-γ que alcanzó niveles
0
máximos
(D.O. 1,70) tras 48h de
24h
48h
72h
incubación; mientras que la adición
de HA disminuyó los niveles de esta
4
citoquina. Por el contrario, en los
B
3
cultivos de animales infestados la
exposición a la HA no redujo la
2
respuesta a la Con A, excepto en los
incubados durante 24h.
1
Al aumentar la concentración
de
mitógeno
a 10 µg/ml observamos
0
24h
48h
72h
de nuevo que en los cultivos
procedentes de animales negativos la
4
presencia
de
HA
disminuyó
notablemente los efectos de la Con A.
C
3
En cambio, en los cultivos de
animales infestados la secreción de
2
INF-γ aumentó notablemente con
1
respecto a sus testigos, con valores
máximos (D.O. 3.90) alcanzados tras
0
48h de cultivo.
24h
48h
72h
Finalmente, al añadir 20 µg/ml de
Horas de cultivo
mitógeno
vemos
que
el
Fig 1.- Niveles de IFN-γ en linfocitos
comportamiento de los linfocitos de
estimulados con HA y en presencia de 5 (A),
terneros sin infestar fue similar a los
10 (B) y 20 µg/ml de Con A
casos anteriores. Los cultivos de
vacas infestadas reprodujeron el mismo comportamiento que

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