Gli oli essenziali nella difesa in post

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CENTRO DI COMPETENZA PER L’INNOVAZIONE IN CAMPO AGROAMBIENTALE
Gli oli essenziali nella difesa in post‐raccolta dei prodotti frutticoli
Davide Spadaro, Jorge Giovanny Lopez‐Reyes, Maria Lodovica Gullino, Angelo Garibaldi
AGROINNOVA
Università di Torino
Torino, 8 marzo 2012
Malattie del post-raccolta
Patogeni latenti:
aperture naturali o direttamente.
Patogeni per ferita:
soluzioni di continuità accidentali.
Mucor,
Rhizopus
Alternaria,
Aspergillus,
Botrytis,
Penicillium
Botrytis,
Colletotrichum,
Monilia
I fungicidi in post-raccolta
In pre-raccolta efficaci contro infezioni latenti.
Se lunga conservazione: non efficaci contro patogeni da ferita.
In post-raccolta impiego limitato:
 ad alcuni patogeni,
 ad alcuni frutti,
 pochi prodotti autorizzati.
Fungicidi di sintesi
Salute umana (residui)
Inquinamento ambientale (reflui)
Ceppi di patogeni resistenti
Mancanza di riregistrazione
…o soluzioni alternative
Mezzi fisici:
Atmosfere controllate
Termoterapia
Raggi UV
Mezzi biologici:
Antagonisti
Prodotti naturali
Resistenza indotta
Prodotti di origine naturale
Le piante offrono numerosi prodotti antimicrobici:
 composti organici volatili,
 glucosinolati,
 oli essenziali.
Composti organici volatili (VOCs)
(non molto solubili in acqua, facilmente assorbiti nei prodotti vegetali)
 acetaldeide,
 etil acetato,
 benzaldeide,
 trans-2-esanale,
impiegati mediante fumigazione contro Botrytis, Rhizopus, Monilinia,
Penicillium e Colletotrichum spp.
(Archbold et al., 1999; Utama et al., 2002; Neri et al., 2006)
Acido acetico
Sterilizzazione superficiale mediante prodotti chimici
adatti può portare a estensione della durata
commerciale.
Fumigazione
con
acido
acetico,
metabolita
naturalmente presente su albicocche, prugne, mele,
uva e ciliegie (Liu et al., 2002).
L’impiego dell’aceto sembra essere ancora più sicuro
e comunque ancora efficace (Sholberg et al., 2000).
Meccanismo d’azione
• attivo nei confronti dei patogeni grazie al suo pH 2,4
• si pensa che agisca disgregando la membrana cellulare.
Glucosinolati
Più di 130 composti distribuiti nell’ordine delle Capparales.
Attività antimicrobica: idrolisi da parte delle mirosinasi di
alcuni glucosinolati con liberazione di isotiocianati
Su pomacee e drupacee (Mari et al., 2002):
B.cinerea, M.laxa, P.expansum, M.piriformis e R.stolonifer
Oli essenziali o oli eterici
DITRIBUZIONE
Presenti in circa 50 famiglie botaniche
(Lamiales, Asterales, Rutales)
LOCALIZZAZIONE
Fiori, foglie, radici, legno, rizomi, frutti, corteccia, semi
QUANTITA’
Generalmente inferiore all’1% (mediamente dallo 0,01% al 2%). OE: estratto fitochimico selettivo, isola una componente minoritaria della pianta.
Ottenuti per estrazione a partire da materiale vegetale aromatico, ricco cioè in "essenze". CENTRO DI COMPETENZA PER L’INNOVAZIONE IN CAMPO AGROAMBIENTALE
Essenze
funzione allelopatica, antibiotica, di attrazione degli impollinatori, o da intermediari di reazioni energetiche, conferiscono resistenza alle malattie. Proprietà antimicrobiche: Tossicità per contatto e per fumigazione.
natura apparentemente sicura, ampia accettazione da parte dei consumatori,
molteplici potenzialità di impiego, assenza di fitotossicità a basse dosi
Composizione degli OE
Miscele di sostanze aromatiche volatili.
•
•
•
•
•
•
•
Terpeni
Aldeidi
Chetoni
Acidi grassi
Fenoli
Esteri
Alcoli
I terpeni
I terpeni sono biomolecole costituite da multipli dell'unità isoprenica (sono chiamati anche isoprenoidi), e possono essere lineari, ciclici o entrambi.
Terpeni
isoprene
Essenze, OE, acque aromatiche
Essenze: fonte degli OE, non sovrapponibili chimicamente
Oli essenziali: contengono solo le molecole volatili e idrofobiche
Acque aromatiche: molecole volatili ed idrofiliche
Metodologie di estrazione
 distillazione in corrente di vapore (distillazione nella quale il materiale è immerso in acqua / distillazione nella quale il materiale è sospeso sopra alla fonte di vapore),  spremitura a freddo (es. bucce o epicarpo dei frutti del genere Citrus),  distillazione a secco o distruttiva.
Fattori chiave nella composizione degli OE
Presenza di chemotipi
Influenza delle pratiche di coltivazione
Influenza di fattori ambientali
Influenza del ciclo vegetativo
Conservazione del materiale vegetale
Metodo di estrazione
Conservazione degli oli
Caratterizzazione degli OE
gas cromatografo accoppiato a spettrometro di massa a singolo quadrupolo e ionizzazione elettronica (EI)
Principali componenti con attività antimicrobica
Attività antimicotiche spesso fortemente associate ai fenoli monoterpenici
 timolo (timo)
 carvacrolo (origano, timo, santoreggia, maggiorana)
 eugenolo (chiodi di garofano, noce moscata, cannella)  p‐anisaldeide (anice)
 carvone (cumino, aneto)
Impiego in post-raccolta
Maggior parte OE segnalati come inibitori in vitro di funghi patogeni in post‐raccolta In vivo solo pochi OE studiati. Su pere, agrumi, fragole, pomodori, ciliegie e uva. Timolo (OE timo): B. cinerea e M. fructicola (Chu et al., 2001; Liu et al., 2002)
Carvone (OE cumino): marciumi post‐raccolta su patata
OE cannella e chiodi di garofano: Colletotrichum musae, Lasiodiplodia theobromae e Fusarium proliferatum su banana
OE basilico e zenzero: B. cinerea su uva da tavola
Attività fungistatica e fungicida
L’attività biologica di OE e loro costituenti può avere attività fungistatica e/o fungicida, a seconda della concentrazione impiegata. Spesso fungistatici piuttosto che fungicidi: possono bloccare la crescita dei funghi
quando esposti a OE, ma, se OE rimosso, i funghi possono ricominciare a crescere.
Minima concentrazione inibente (MIC): quella a cui si manifesta azione
fungistatica.
MIC dipende da:
‐ specie microbiche;
‐ prodotti ortofrutticoli;
‐ specie/ chemotipo da cui estratto OE (diversa composizione chimica);
‐ solvente impiegato in fase di estrazione.
Cinetica di inibizione
la cinetica antifungina dell’OE di Silene armenia valutata contro B. cinerea correlava
positivamente con il tempo di esposizione e la concentrazione dell’olio. A concentrazioni di
62,5 e 125 mg/l, l’attività fungicida era molto rapida (rispettivamente, 120 e 150 min).
Bajpai et al., 2008
Impiego su mele in conservazione
Mele cv Golden delicious, Granny smith, Royala gala e Red Chief
OE estratti da piante mediterranee
attività antifungina nei confronti di B. cinerea e P. expansum
Più efficaci: OE di santoreggia e di timo all’1%,
soprattutto su mele cv Granny Smith e cv Red Chief
(Lopez‐Reyes et al., 2010)
Ocimum basilicum (BAS), Foeniculum sativum (FEN), Lavandula officinalis (LAV),
Origanum majorana (MAR), Origanum vulgare (ORE), Mentha piperita (PEP),
Rosmarinus officinalis (ROS), Salvia officinalis (SAG), Satureja montana (SAV),
Thymus vulgaris (THY) and Mentha arvensis (MIN)
Efficacia di OE contro marciume verde-azzurro su mele cv Royal Gala
conservate 30 giorni a 4.0±1°C
45
40
jk
jk
jk
35
jk
ij
hij
Rot diameter (mm)
k
After 15 days of storage
After 30 days of storage
ghi
30
g
ij
efg
25
i
i
gh
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j
ij
fg
def
ij
bcd
20
de
h
h
15
cd
abc
g
fg
def
10
bcd
bcd
efg cde
abc
abcd
defg
cd
ab
bc
ab
5
ab
ab
ab
a
ab
ab
a
ab
Inoculated CK
Chemical CK
THY 10%
SAV 10%
SAG 10%
ROS 10%
ORE 10%
PEP 10%
MIN 10%
MAR 10%
LAV 10%
FEN 10%
BAS 10%
THY 1%
SAV 1%
SAG 1%
ROS 1%
ORE 1%
PEP 1%
MIN 1%
MAR 1%
LAV 1%
FEN 1%
BAS 1%
0
Ocimum basilicum (BAS), Foeniculum sativum (FEN), Lavandula officinalis (LAV), Origanum majorana (MAR), Origanum
vulgare (ORE), Mentha piperita (PEP), Rosmarinus officinalis (ROS), Salvia officinalis (SAG), Satureja montana (SAV), Thymus
vulgaris (THY) and Mentha arvensis (MIN)
Impiego su drupacee in conservazione
Svircev et al. (2007): timolo, uno dei principali componenti dell’OE di timo, riduce
lo sviluppo di M. fructicola su susine inoculate artificialmente.
L’uso di concentrazioni relativamente basse (da 2 a 4 mg L‐1) di timolo può ridurre
significativamente l’incidenza del marciume bruno, causato da Monilina spp. su
albicocche e pesche, senza presentare fitotossicità.
Lopez‐Reyes et al. (2011): su susine, diversi OE utilizzati in post‐raccolta nel
contenimento di M. laxa e M. fructigena a due diverse concentrazioni (10% e 1%).
OE di timo e santoreggia hanno fornito risultati interessanti, per la loro efficacia e
perché a basse concentrazioni i frutti non hanno mostrato fitotossicità.
Prove su drupacee
Effetto dei trattamenti con OE sul marciume causato da
Monilinia laxa su susine cv. TC Sun conservate 30 giorni a 4.0±1°C
Prove su drupacee
Effetto dei trattamenti con OE sulmarciume causato da
M. fructigena su susine cv. TC Sun conservate 30 giorni a 4.0±1°C
30,00
m
Dopo 30 gg di conservazione
l
kl
ijk
Dopo 15 gg di conservazione
jkl
jkl
20,00
ij
ij
hi
gh
15,00
fg
fg
fg
ef
10,00
cde cde cde
cde de
cde
bcd
bc
b
5,00
a
Test. Inoculato
Test. Chimico
Timo 10%
Santoreggia 10%
Salvia 10%
Rosmarino 10%
Origano 10%
Menta piperita 10%
Menta comune 10%
Maggiorana 10%
Lavanda 10%
Finocchio 10%
Basilico 10%
Timo 1%
Santoreggia 1%
Salvia 1%
Rosmarino 1%
Origano 1%
Menta piperita 1%
Menta comune 1%
Maggiorana 1%
Lavanda 1%
Finocchio 1%
0,00
Basilico 1%
Diametro marciume (mm)
25,00
Diffusione in agar
Valutazione mediante la tecnica agar diffusion
dell’attività antifungina di OE di basilico a diverse
concentrazioni sulla crescita di
Penicillium
expansum
a. Olio essenziale di basilico all’1%
b. Olio essenziale di basilico al 10%
c. Olio essenziale di basilico al 100%
Diffusione in agar
Valutazione dell'inibizione della crescita di Alternaria alternata dovuta all’applicazione di OE di origano all'1% (1), 10% (2) e 100% (3) mediante la tecnica della diffusione in agar.
a
a
a
a
Menta comune 1%
Menta piperita 1%
a
Salvia 1%
Timo 1%
cd
Santoreggia 1%
a
Rosmarino 1%
d
Origano 1%
a
Maggiorana 1%
0%
a
Lavanda 1%
a
Finocchio 1%
i
Basilico 1%
h
Timo 10%
50%
Santoreggia 10%
d
Salvia 10%
10%
Rosmarino 10%
h
Origano 10%
f
Menta piperita 10%
30%
Menta comune 10%
e
Maggiorana 10%
20%
Lavanda 10%
Finocchio 10%
Basilico 10%
l
Timo 100%
l
Santoreggia 100%
l
Salvia 100%
40%
Rosmarino 100%
l
Origano 100%
l
Menta piperita 100%
l
Menta comune 100%
l
Maggiorana 100%
l
Lavanda 100%
l
Finocchio 100%
Basilico 100%
% Inibizione
Diffusione in agar
Inibizione della crescita (%) in vitro di Alternaria alternata dovuta all’applicazione di OE a diverse concentrazioni mediante “agar diffusion”.
100%
l
90%
80%
70%
60%
k
j
g
f
b bc
Analisi della composizione tramite GC-MS
Olio essenziale di timo
Analisi della composizione tramite GC-MS
Olio essenziale di santoreggia
Attività dei componenti degli OE
Composti
pinene <alfa>
camphene
pinene <beta>
myrcene
carene <delta 2>
cymene <para>
Limonene
Eucalyptol
Terpinene <gamma>
Linalool
Camphor
bornylacetate
thymol
carvacrol
copaene <alfa>
Caryophyllene <Z>
Caryophyllene <E>
selinene <alfa>
caryophyllene oxide
Totale composti identificati (%)
Santoreggia
(%)
9.35
0.48
0.59
0.7
0.31
16.05
1.48
3.2
‐
3.51
0.2
0.64
14.2
45.14
0.1
1.43
‐
1.4
‐
98.78
Timo
(%)
19.78
0.42
0.52
0.04
0.32
3.62
0.92
1.03
0.63
8.33
‐
‐
53.7
3.1
‐
2.11
0.2
‐
0.41
95.13
OE: la loro efficacia nel contenimento dei
funghi patogeni può essere dovuta a una
sinergia tra i loro componenti.
Per valutare l’attività antimicrobica dei
componenti principali di OE di santoreggia e
timo, sono state realizzate in vitro alcune
prove
di
inibizione
dell’accrescimento
microbico.
Tesi santoreggia
100% Olio essenziale di Santoreggia
100% Carvacrol
75% Carvacrol
25% p‐cymene
50% Carvacrol
50% p‐cymene
25% Carvacrol
75% p‐cymene
100% p‐cymene
Testimone (Acqua distillata)
Tesi timo
100% Olio essenziale di Timo
100% Thymol
75% Thymol
25% α‐pinene
50% Thymol
50% α‐pinene
25% Thymol
75% α‐pinene
100% α‐pinene
Testimone (Acqua distillata)
OE di timo: attività dei componenti
80,0
70,0
c
Inibizione (%)
60,0
e d c b a a
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
di
st
illa
ta
)
Th
ym
ol
on
e
(A
cq
ua
10
0%
Te
st
im
10
0%
O
li o
es
se
nz
i
al
e
di
Ti
m
o
0,0
OE: di santoreggia: attività dei componenti
60,0
Inibizione (%)
50,0
40,0
c
f e d b a a
30,0
20,0
10,0
10
0%
O
lio
es
se
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e
di
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or
eg
gi
a
10
75
0%
%
Ca
Ca
rv
rv
ac
ac
ro
ro
l2
50
l
5%
%
Ca
pcy
rv
m
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en
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25
0
%
%
Ca
pcy
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5%
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Te
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m
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e
cq
ua
di
st
illa
ta
)
0,0
Effetto sulla shelf life
OE non dannosi sui prodotti alimentari,
in alcuni casi hanno mostrato di prolungare la shelf life dei prodotti.
Tripathi et al., 2008: grappoli di vite fumigati con OE di Ocimum sanctum, Prunus
persica e Zingiber officinale hanno incrementato la durata commerciale di 5, 4 e 6
giorni rispettivamente.
Gli OE non hanno dato segni di fitotossicità sulla buccia degli acini di uva.
Gli OE devono essere applicati alla loro MIC.
Spesso gli OE presentano alla loro MIC un’azione fungistatica e non presentano
effetti biocidi sui tessuti ospiti.
L’azione fungicida compare a concentrazioni superiori, a cui compare anche
fitotossicità.
Fitotossicità
Sono stati rilevati, in alcuni casi,
sintomi di fitotossicità provocati
dai trattamenti più concentrati,
evidenti maggiormente su mele cv
Granny Smith e cv Golden
Delicious.
Fitotossicità causata dal trattamento
con olio essenziale di timo al 10% su
mele cv Granny Smith.
Tossicità
Tossicità nei confronti dei mammiferi relativamente bassa.
Un certo livello di tossicità nei confronti di linee cellulari umane e animali in vitro è stato riportato per alcuni OE quando impiegati ad elevate concentrazioni. (Isman, 2000)
Ulteriori studi risultano necessari per stabilire la sicurezza e i livelli di tossicità degli OE provenienti da diverse specie vegetali.
Modo di applicazione: irrorazione
Il modo di applicazione degli oli essenziali e dei
loro composti influisce sulla loro efficacia finale.
Ad esempio, l’irrorazione con un’emulsione di OE
di basilico (Ocimum basilicum) era in grado di
contenere marciumi post‐raccolta su banane
incrementando la durata commerciale.
(Anthony et al., 2003)
Irrorazione di un’emulsione di olio
essenziale di pompelmo allo 0,1% su
pesche cv. Cresthaven
Modo di applicazione: fumigazione
L’attività in fase di vapore rende gli OE possibili
fumiganti sui prodotti ortofrutticoli all’interno
delle strutture di conservazione.
I vapori di OE di eucalipto e cannella applicati a
50 mg/l per 8 h a 20°C riducevano i marciumi
ed erano in grado di migliorare la qualità di
pomodori e fragole conservati per lunghi
periodi (Tzortzakis, 2007).
Il timolo e il carvacrolo erano efficaci nel
contenimento del marciume bruno causato da
M. fructicola su ciliegie, sia per immersione sia
per fumigazione (Tsao e Zhou, 2000).
Modo di applicazione: fumigazione
Diametro del marciume (mm) prodotto da Monilinia laxa su susine
cv Big Egg conservate per 14 giorni a 1°C.
10,00
b
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
a
a
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
O
G
T
Frutti inoculati affiancati all’emulsione di olio essenziale (O); Frutti inoculati affiancati all’emulsione
di olio essenziale gelificata (G); Testimone inoculato conservato in atmosfera normale (T)
Formulazione
sviluppare formulazioni in grado di mantenere l’attività fungicida, eliminando effetti indesiderati sui prodotti ortofrutticoli. Timolo e carvacrolo:
efficaci (fumigazione) vs. marciume bruno su ciliegie, ma…
imbrunimento del peduncolo delle ciliegie. Effetto collaterale ridotto se metil giasmonato impiegato come co‐fumigante. CENTRO DI COMPETENZA PER L’INNOVAZIONE IN CAMPO AGROAMBIENTALE
Integrazione con antagonisti
Su pesche cv Redhaven, l’efficacia dei trattamenti con lieviti antagonisti
(Pseudozyma fusiformata, Metschnikowia sp. ed Aureobasidium pullulans) è stata
valutata insieme all’applicazione di OE di pompelmo a bassa concentrazione, ed è
stata evidenziata la sinergia tra l’applicazione dei ceppi microbici e l’OE di
pompelmo nel contenimento di M. laxa.
Effetto dei trattamenti con lieviti antagonisti* e
irrorazione con emulsione di olio essenziale di
pompelmo allo 0,1% contro il marciume
causato da Monilinia laxa su pesche cv.
Redhaven conservate 30 giorni a 4.0±1°C
AP6 (Pseudozyma fusiformata);
AP47 (Metschnikowia sp.);
PL5 (Aureobasidium pullulans)
Integrazione con termoterapia
OE di timo e santoreggia a basse concentrazioni (0,1% e 0,5%) integrati all’immersione
dei frutti in acqua calda a 48‐50°C per tre minuti hanno permesso il contenimento di P.
expansum su mele e di M. laxa su pesche in post‐raccolta, dimostrando una buona
efficacia senza presentare fitotossicità.
25,00
df df bf bf be ef ab ac be be bd be be be bf cf fg df df bd g a 20,00
15,00
Marciume verde‐azzurro (mm) su mele cv Golden delicious conservate 30 giorni a 1°C.
10,00
5,00
T. sano
T. inoculato
T. chimico
Tim 0,5
Tim 0,1
San 0,5
San 0,1
52X3 + Tim 0,5
52X3 + Tim 0,1
52X3 + San 0,5
52X3 + San 0,1
52X3
50X3 + Tim 0,5
50X3 + Tim 0,1
50X3 + San 0,5
50X3 + San 0,1
50X3
48X3 + Tim 0,5
48X3 + Tim 0,1
48X3 + San 0,5
48X3 + San 0,1
0,00
48X3
30,00
Conclusioni
 azione fungistatica o fungicida nei confronti dei patogeni post‐raccolta
 bassa MIC (minima concentrazione inibente)
 natura termostabile
 tossicità nei confronti dei mammiferi relativamente bassa
 volatilità ne permette un impiego nelle celle di conservazione della frutta e per sistemi di packaging attivo
Approfondire
 Tossicità per uomo e animali
 Effetto sulle caratteristiche organolettiche
 Attività biologica e dispersione nei tessuti vegetali
 Formulazioni in grado di inibire la crescita dei patogeni a concentrazioni non fitotossiche
 formulazioni / concentrazioni applicate / tempi di esposizione: fattori chiave  mezzo ideale a base di sostanze naturali contro le malattie
Progetti finanziati dalla regione Piemonte
Progetto Stonesafe - 2007-2009 (24 mesi)
CIPE 2006 «Produzione di drupacee in Piemonte: monitoraggio,
prevenzione e controllo dei funghi patogeni e micotossigeni per garantire la
sicurezza alimentare»
Progetto Drump - 2008-2009 (24 mesi)
Bando per Linee «Drupacee minori in Piemonte: problemi fitopatologici e
difesa post-raccolta»
Progetto Safefoodcontrol - 2010-2013 (36 mesi)
Piattaforma «Sviluppo di sistemi e tecnologie innovative per la produzione, conservazione, trasformazione e valorizzazione dell’orto‐frutticoltura piemontese di qualità»
Coordinamento: AGROINNOVA
Partner: CRESO, Lagnasco Frutta, Albifrutta

Gli oli essenziali nella difesa in post

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