RNA Polimerasi I

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Trascrizione
Un sistema enzimatico converte l’informazione genetica di un segmento di
DNA a doppia elica in una catena di RNA che avrà una sequenza di basi
complementare a una delle due eliche di DNA.
Vengono prodotti tre tipi principali di RNA:
RNA messaggero (mRNA)
RNA transfer (tRNA)
RNA ribosomale (rRNA)
L’RNA è sintetizzato dalle RNA polimerasi
(Thermus aquaticus)
(Saccharomyces cerevisiae)
La somiglianza tra le strutture rivela che gli enzimi hanno una comune
origine evolutiva e hanno in comune molte caratteristiche del loro
meccanismo d’azione.
La RNA polimerasi
La RNA polimerasi DNA
dipendente necessita di:
stampo di DNA
i quattro ribonucleosidi 5’ trifosfato
(ATP, GTP, UTP e CTP)
Mg2+
La reazione complessiva è:
(NMP)n + NTP
RNA
RNA polimerasi
(NMP)n+1+ PPi
RNA allungato
La RNA polimerasi allunga la catena aggiungendo unità ribonucleotidiche al
terminale 3’-ossidrilico della catena di RNA (sintesi in direzione 5’Æ3’)
Il gruppo ossidrilico in 3’ agisce da nucleofilo, attaccando il fosfato α del
ribonucleoside trifosfato successivo.
La RNA polimerasi (b)
Ogni nucleotide dell’RNA neosintetizzato viene scelto secondo le regole di Watson
e Crick di appaiamento delle basi; residui di uridilato (U) vengono inseriti
nell’RNA in posizione opposta ai residui di adenilato del DNA stampo.
La RNA polimerasi non ha bisogno di un primer per iniziare la sintesi.
L’inizio avviene solo quando l’RNA polimerasi si lega in corrispondenza di
specifiche sequenze di DNA chiamate promotori.
Il gruppo trifosfato in 5’ del primo residuo di una catena nascente non viene
scisso per liberare pirofosfato, ma resta intatto durante la trascrizione.
Bolla di trascrizione
(circa 17 coppie di basi)
Catena
Non-stampo
RNA
polimerasi
Avvolgimento
Disavvolgimento
Catena
stampo
Ibrido RNA-DNA
(8 coppie di basi)
Sito attivo
Direzione della trascrizione
Trascrizione da parte della RNA polimerasi di E. coli
Superavvolgimenti
negativi
Superavvolgimenti
positivi
Direzione della trascrizione
I problemi topologici determinati dalla trascrizione sono risolti grazie
all’azione delle topoisomerasi.
Catena non-stampo (codificante) di DNA
Catena stampo di DNA
Trascritto di RNA
Genoma dell’adenovirus
La catena codificante di un determinato gene può essere situata su entrambi
i filamenti di un cromosoma.
L’RNA polimerasi di E. coli.
La RNA polimerasi diretta da DNA di E. coli è un enzima grande e complesso costituito da
un nucleo di 5 subunità (α2ββ’ω; Mr = 390.000), e da una sesta subunità, chiamata σ .
La subunità σ funziona solo per il riconoscimento del promotore e non è presente durante
la fase di allungamento della trascrizione.
Differenti tipi di σ riconoscono diverse sequenze regolatorie.
Il sito attivo per la sintesi dell’RNA è probabilmente costituito dalle subunità β e β’.
Non è nota la funzione della subunità ω; almeno in vitro non è necessaria per l’attività
dell’enzima
Le RNA polimerasi non possiedono un’attività di proofreading esonucleasica 3’Æ5’
(1 errore ogni 104-105 ribonucleotidi incorporati nell’RNA).
La RNA polimerasi si lega a specifiche sequenze del DNA chiamate promotori
Sequenze di cinque promotori riconosciute dall’oloenzima della RNA polimerasi
contenente σ 70.
L’elemento UP, legato dalla subunità α dell’RNA polimerasi, è presente solo in alcuni
promotori e stimola fortemente la trascrizione del gene.
Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i siti promotori
La subunità σ contribuisce a determinare la specificità dell’inizio della
trascrizione:
a) La subunità σ diminuisce di 104 volte l’affinità della RNA
polimerasi per regioni aspecifiche del DNA;
b) La subunità σ permette alla RNA polimerasi di riconoscere la
sequenza 5’-TATAAT della regione -10 dei siti promotori.
L’oloenzima si lega al DNA a doppia catena e si sposta lungo la doppia elica in
cerca di un promotore, formando legami idrogeno transitori. La ricerca è più
veloce perché l’enzima scivola lungo il DNA invece di legarsi e separarsi
ripetutamente.
Il sito promotore viene incontrato mediante uno scorrimento casuale in una singola
dimensione, invece che in un sistema tridimensionale.
La subunità σ si stacca quando la catena di RNA in formazione raggiunge una
lunghezza di 9-10 nucleotidi.
E. Coli contiene numerosi fattori σ, diversi tra loro, in grado di
riconoscere vari tipi di sequenze di promotori presenti nel suo DNA
σ70
σ32
σ54
La subunità σ ha un ruolo fondamentale nella determinazione del punto dove
la RNA polimerasi deve iniziare la trascrizione
Struttura della subunità σ70 di E. coli.
La subunità σ presenta sulla sua superficie una struttura ad α-elica, coinvolta
nel riconoscimento della sequenza 5’-TATAAT della regione -10
Reazioni dell’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi di E. coli.
Termine della trascrizione ρ-indipendente in E. coli.
Segnale di terminazione
La trascrizione di alcuni geni termina in corrispondenza di un ripiegamento a
forcina dell’RNA, seguito da alcuni residui di uracile.
Termine della trascrizione ρ-indipendente in E. coli.
Pausa
UUUUUUUU
Superamento
Isomerizzazione
UUUUUUUU
Dissociazione
Termine
Termine della trascrizione ρ-dipendente in E. coli.
In alcuni geni la terminazione della
trascrizione richiede la proteina Rho
(ρ ).
I terminatori ρ-dipendenti non
possiedono la sequenza di adenilati
ripetuti nello stampo, ma di solito
hanno una breve sequenza che porta
alla formazione della forcina.
La proteina ρ si associa all’RNA in corrispondenza di un sito
di legame specifico (sequenza ricca in G-C) e migra in
direzione 5’Æ3’ finchè non raggiunge il complesso di
trascrizione fermo al terminatore, e quindi contribuisce al
rilascio del trascritto di RNA
L’attività ATPasica di ρ permette alla proteina di “tirare” la catena di RNA in formazione,
mentre insegue la RNA polimerasi.
Quando ρ raggiunge la RNA polimerasi a livello della bolla di trascrizione, si ha la
separazione dell’elica ibrida RNA-DNA; la proteina si comporta come una RNA-DNA
elicasi.
Differenze tra l’inizio della trascrizione nei procarioti e negli
eucarioti:
1) Nei batteri vi è 1 RNA polimerasi; negli eucarioti 3.
2) l’RNA polimerasi batterica è in grado di iniziare la
trascrizione senza l’aiuto di altre proteine; le RNA
polimerasiche eucariotiche richiedono l’aiuto di altre proteine
dette Fattori trascrizionali generali (GTF).
3) Le proteine che regolano la trascrizione negli eucarioti
(repressori e attivatori) possono influenzare l’inizio della
trascrizione anche quando legate al DNA a grande distanza.
Le sequenze regolative dei batteri sono vicine all’inizio della
trascrizione.
4) Il DNA di una cellula eucariotica è organizzato nella
cromatina.
Differenze tra la trascrizione nei procarioti e negli eucarioti:
Procarioti
Eucarioti
1
3
Si
No
Presenza dei nucleosomi:
No
Si
Azione a distanza delle proteine
che regolano la trascrizione:
No
Si
Numero di Polimerasi:
Capacità della Polimerasi di iniziare
la trascrizione senza l’aiuto di altre
proteine:
Polimerasi presenti in una cellula
eucariotica:
RNA Polimerasi I:
RNA ribosomali (5.8S, 18S, 28S); 50-70%
dell’attività RNA-polimerasica della cellula;
localizzata nel nucleolo.
RNA Polimerasi II:
RNA che codificano per le proteine (mRNA) e
alcuni piccoli RNA nucleari;(20-40%
dell’attività RNA-polimerasica della cellula);
localizzata nel nucleoplasma.
-
Le 3 subunità più grandi di Pol II presentano
omologia con le subunità β’, β e α dei batteri.
-
La subunità maggiore di Pol II presenta alla
propria estremità C-terminale una serie di
ripetizioni in tandem della sequenza
YSPTSPS (52 nell’uomo, 43 in Drosophila, 26
nel lievito), nota come sequenza CTD.
RNA Polimerasi III:
tRNA, RNA 5S e piccoli RNA nucleari (10%
dell’attività RNA-polimerasica della cellula);
localizzata nel nucleoplasma.
* Le 3 polimerasi eucariotiche hanno più
subunità (8-14), 5 delle quali sono comuni a tutti
gli enzimi.
RNA polimerasi II
L’RNA polimerasi II eucariotica è un enzima costituito da 12 subunità e
richiede altre proteine, chiamate fattori di trascrizione, per poter formare il
complesso attivo della trascrizione.
Fattori di trascrizione di base o generali (GTF), richiesti da qualsiasi promotore
della RNA polimerasi II (comunemente indicati con TFII e con una lettera)
Attivatori
Repressori
Co-attivatori
Co-repressori
L’RNA polimerasi II richiede per la sua attività molti altri fattori proteici
La struttura di un gene eucariotico
Sequenze regolative
Promotore
Gene
(enhancer/silencer)
+1
Distanza
100bp
200bp
1-30kb
-40
+10
+1
TATAa/tAa/t
-30
TATA box
Py2CAPy5
-3/+5
Initiator
Sequenze comuni di promotori riconosciute dalla RNA polimerasi II degli
eucarioti
Varie
sequenze
regolarorie
Il complesso di pre-inizio della trascrizione (PIC)
F
E
B
A
Pol II
TFIID
CTD
TATA
H
I fattori trascrizionali generali (GTF) (o basali)
TFIID.
Primo fattore a legare il promotore in corrispondenza della sequenza TATA (TATA box), e unico
tra i GTF in grado di legare in maniera specifica il DNA. Composto da “TATA binding protein”
(TBP) e da 8-12 “TBP associated factors” (TAFs).
TFIIA
Importante per stabilizzare il legame di TBP al DNA.
TFIIB
Interagisce con TFIID, TFIIF e PolII, questi contatti sono importanti per il corretto
posizionamento dellla Pol II nel sito di inizio della trasrizione.
TFIIF
Associato a Pol II è importante per il corretto posizionamento di Pol II nel complesso di inizio
(anche per interazione con TFIIB); è dotato di attività elicasica ATP-dipendente che separa
inizialmente la doppia elica di DNA per consentire alla polimerasi di operare; 2 subunità.
Perché il complesso di inizio possa iniziare a trascrivere con successo è necessaria l’associazione
di almeno altri due GTF: TFIIH e TFIIE.
TFIIH
Presenta un’attività chinasica in grado di fosforilare CTD e un’attività di DNA elicasi ATP
dipendente (2 subunità ERCC2 e ERCC3); 8 subunità.
TFIIE
Stimola la reazione di fosforilazione di CTD da parte di TFIIH e ne regola l’attività di
ATPasi/elicasi; 2 subunità
La fosforilazione di CTD è il segnale del passaggio dall’ inizio della trascrizione alla fase di
elongazione.
Il primo passaggio nella formazione del complesso di pre-inizio è il reclutamento di TFIID
I R
TATA
TFIID
TFIID
TATA
I R
Struttura di TBP legata al DNA
Struttura di TBP legata al DNA
La proteina TBP legata alla sequenza TATA box rappresenta il cuore del complesso di
inizio
Il legame di TBP induce notevoli cambiamenti conformazionali nel DNA
La superficie a forma di sella della TBP contiene i siti di legame per altri componenti del
complesso di inizio della trascrizione.
TBP associated factors (TAF)
- Servono come siti di legame per gli attivatori (co-attivatori)
-Mediano il riconoscimento della regione “core” del promotore.
es.: dTAFII150 e dTAFII250 interagiscono con la sequenza initiator
-Sono provviste di attività catalitiche:
es.: hTAFII150 e yTAFII145 hanno attività di acetiltransferasi che
riconoscono gli istoni
I R
TATA
TFIID
TFIID
TATA
A
B
A
TFIID
B
TATA
La TBP viene legata dal fattore TFIIA e poi dal TFIIB.
Il fattore TFIIA stabilizza il complesso TFIIB-TBP sul DNA.
Complesso ternario costituito da TBP , da TFIIA e dal DNA
A
TFIID
Promotore
B
Pol II/F
E
H
PIC
La fosforilazione del CTD di Pol II è importante per l’inizio della trascrizione
F
E
H
B
A
Pol II
TFIID
CTD
TATA
ATP
E
H
B
F
A
Pol II
TFIID
CTD
TATA
L’ipotesi dell’oloenzima.
Mediator
(SRBs)
F
E
H
B
Pol II
CTD
A
TFIID
TATA
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L’allungamento delle catene di
RNA da parte della RNA
polimerasi sia nei batteri che negli
eucarioti
viene
inibito
dall’antibiotico actinomicina D e
dall’acridina.
La porzione planare dell’actinomicina D
si inserisce nel DNA a doppia elica tra
appaiamenti G≡C consecutivi e deforma
il DNA.
La rifampicina è un antibiotico che inibisce la sintesi di RNA legandosi
specificamente alla subunità β delle RNA polimerasi batteriche e impedendo così la
fase di distacco dal promotore.
L’α-amanitina, un componente tossico
del fungo velenoso Amanita phalloides,
blocca la sintesi di RNA da parte della
RNA polimerasi II, e, a concentrazioni
più alte, della RNA polimerasi III;
non ha invece alcun effetto sulla
trascrizione nei batteri.
Fattori trascrizionali:
Proteine necessarie per l’inizio della
trascrizione che non sono parte integrante
dell’enzima RNA polimerasi.
?Y
-200
X
?
CTF
POLII +
GTF
SP1
GC box
-90
CAAT box
-75
TATA
-30
Inr
+1
Livelli di
Trascrizione
F
E
H
B
A
Pol II
TFIID
CTD
+
TATA
F
E
H
B
A
Pol II
TFIID
CTD
TATA
Attivatore
++++
Dominio di attivazione
Dominio di interazione
con il DNA
CAP
La proteina CAP, una proteina che regola l’espressione genica
nei batteri, ha due domini:
- Il dominio più piccolo lega il DNA;
- Il dominio più grande lega l’AMP ciclico
LexA
GAL4
(aa 147-881)
(aa 1-147)
(aa 1-87)
Domini di interazione con il DNA
Sequenza DNA bersaglio
UASG
LexAOP
Proteina chimerica
LexA-GAL4
LexA
(aa 1-87)
ON
LexAP
Promotore Gene Reporter
OFF
NO
UASG
Promotore
Gene Reporter
I domini di interazione con il DNA dei Fattori trascrizionali eucariotici
1) Helix-turn helix
Omeodominio
2) I domini che legano lo zinco
Domini zinc finger classici o 2 cisteine/2 istidine
Domini zinc finger del tipo 4 cisteine (proteine GATA)
Gal4
I recettori degli ormoni steroidei
3) I domini leucine zipper
Jun/fos
Gruppi funzionali nel DNA per legare le proteine
Il motivo strutturale elica ripiegamento elica
Il motivo che lega il DNA del repressore LAC
Zinc finger
I tre zinc finger presenti nella proteina zif 268
Omeodominio
Omeodominio della proteina Ultrabitorax
Leucina zipper
Leucina zipper della proteina di lievito GCN4
Elica-ansa-elica
Il fattore di trascrizione umano Max
Come funzionano gli attivatori trascrizionali?
A) Gli attivatori possono interagire con il complesso di inizio della trascrizione
facilitandone la formazione ( “recruitment” ).
Pol II+ GTF
Trascrizione
TBP
+ Pol II + TAFs + GTF
AD
DBD
TBP
+ + + +
Attivatore
I R
TATA
TBP
+ Pol II + TaFs + GTF
DBD
TBP
+
I R
TATA
TBP
DBD
DBD
+ Pol II + TAFs + GTF
TBP
TATA
I R
+ + + +
TBP associated factors (TAF)
- Servono come siti di legame per gli attivatori (co-attivatori)
-Mediano il riconoscimento della regione “core” del promotore.
es.: dTAFII150 e dTAFII250 interagiscono con la sequenza initiator
-Sono provviste di attività catalitiche:
es.: hTAFII150 e yTAFII145 hanno attività di acetiltransferasi che
riconoscono gli istoni
La funzione dei TBP associated factors (TAFs)
Livelli di
trascrizione
TFIID
Pol II + GTF
++++
Attivatore
TATA
Pol II + GTF
TBP
+
Attivatore
TATA
TAFs
Pol II + GTF
TBP
++++
Attivatore
TATA
Co-attivatore
Attivatore
Pol II+ GTF
Attivatore
TAFs
Target:
TBP
TFIID
Risultato
interazione:
Facilita il
reclutamento nel
complesso di inizio
A
B
TFIIA
TFIIB
Facilita il reclutamento
nel complesso di inizio e
quindi stabilizza il
legame TBP/DNA
Facilita il reclutamento
nel complesso di inizio;
questo favorisce il
legame di PolII
Attivazione
H
TFIIH
Stimola l’attività chinasica;
quindi favorisce l’inizio della
trascrizione.
I nucleosomi inibiscono il legame di TFIID al DNA
TFIID
X
TATA box
B) Gli attivatori trascrizionali possono alterare la struttura della cromatina per favorire il legame
di TFIID e dell’intero complesso di inizio della trascrizione (anti-repressione) reclutando un
complesso che modifica la cromatina.
Complesso che
modifica la cromatina
ATP
ADP + Pi
TFIID
Attivatore
Nucleosom
a
ATP
AP + Pi
ATP
TFIID
AP + Pi
Attivatore
Dominio basico
Histone fold
NH2
COOH
+ +
+ + + + + +
SGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQ - [25-129]
5
H2A
+
++ ++
+ + + +++++
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKTQKKGDKKRKK - [32-125] H2B
12 15
20
24
+ +
++
+ ++
+
++
++
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTGGVKKPH - [40-135] H3
14
23
9
18
+ +
+
+
++ ++ +
+
SGRGKGGKGLLKGGAKRHRKVLRDNIQGITK - [32-105] H4
5
8
16
12
L’acetilazione degli Istoni
CH3
C=O
H
S
S
CoenzimaA
NH3+
CoenzimaA
CH3
C=O
NH
HAT
CH2
CH2
(CH2)3
(CH2)3
-X-Lys-X-Istone
CH3
C=O
OH
HDAC
H2 O
-X-Lys-X-Istone
Ac.
Ac.
Acetilazione
Ac.
Ac.
Ac.
Ac.
Deacetilazione
C) Gli attivatori trascrizionali possono alterare la struttura della cromatina mediante il
reclutamento
di una o più acetiltransferasi
Complesso che
acetila gli istoni
Ac.
Ac.
Attivatore
Ac.
Ac.
TFIID
Acetiltransferasi che acetilano gli Istoni:
Fattori trascrizionali basali:
TAFII250
Co-attivatori:
1) GCN5
2) P300/CBP
3) P/CAF
Acetiltransferasi (HAT) tipo A
Nucleari
Substrati potenziali
Gcn5
p300/CBP
PCAF
SRC-1/NCoA-1
pCIP
ACTR
TAFII250
Coattivatori
Istoni
Fattori trascrizionali
Possibile effetto
Alterazioni della struttura
della cromatina
Legame al DNA
(Es.: p53, GATA-1, TFIIE,TFIIF)
Fattore associato a TBP
Acetiltransferasi (HAT) tipo B
Citoplasmatiche
HAT1p
Istoni
neosintetizzati
Assemblaggio
della cromatina
Modificazioni degli Istoni
Acetilazione
Metilazione
Fosforilazione
ADP-ribosilazione
Ubiquitinazione (solo H2A e H2b)
Ogni fattore può avere più di un target e funzionare in modi
diversi
Più fattori con targets diversi hanno effetto cooperativo
1) Alcuni fattori solo recruitment
2) Altri fattori sia recruitment che anti-repressione
3)Altri ancora specializzati come antirepressori (GAGA)
Stato di attivazione di un gene
Attivazione genica
Stato attivato
Struttura del gene
Legame dei Fattori trascrizionali e del PIC
Attivazione
Stato derepresso
(attivabile)
Cromatina in parte decondensata;
DNA accessibile ai Fattori Trascrizionali
Antirepressione
Stato basale inattivo
Filamento di cromatina di 30nm;
inaccessibile alla Polimerasi
Meccanismo d’azione dei repressori
attivatore
Gene
ON
a)
repressore
OFF
b)
X
OFF
Meccanismo d’azione dei repressori
c)
OFF
repressore
d)
OFF
Alcuni repressori trascrizionali possono funzionare reclutando
un complesso che deacetila gli istoni
Complesso che
deacetila gli istoni
TATA box
TFIID
X
TATA box
Deacet ilasi istoniche (HDAC) negli eucar ioti superiori
Class e I
HDAC 1
HDAC 2
Omolog he a Rpd3
HDAC 3
Class e II
HDAC 4
HDAC 5
HDAC 6
Omolog he a Hda1
La struttura di un gene eucariotico
Sequenze regolative
Promotore
Gene
(enhancer/silencer)
+1
Distanza
100bp
200bp
1-30kb
-40
+10
+1
TATAa/tAa/t
-30
TATA box
Py2CAPy5
-3/+5
Initiator
?
PIC
Enhancer
1-30 kb
Promotore
En
r
e
c
han
Loop
PIC
Promotore
Il locus delle β-globine
Insulator
Enhancer
(LCR)
Insulator
ε
Gγ
Aγ
δ
β
CTCF e l’attività di enhancer-blocking insulator (1)
Il locus delle β-globine
Sito FII sia necessario
che sufficiente per
l’attività di enhancer-blocking
X
Promotore 2
non attivato
Enhancer
Promotore 1
Attivato
Insulator
I
X
OFF
Enhancer
Insulator
Promotore
I
ON
Insulator
Enhancer
Promotore
Enhancer-blocking insulator
E
PROMOTORE 2
I
PROMOTORE 1
CTCF e l’attività di enhancer-blocking insulator (2)
Il locus imprinted Igf2/H19
CTCF
Mat
H19
Igf2
ICR
CH3 CH3 CH3 CH3
CH3
Pat
Igf2
Enh
CH3
H19
ICR
Enh
L’attività dei fattori trascrizionali può essere controllata
Forma Inattiva
A)
Sintesi proteica
NO
Forma attiva
Esempio
Omeoproteine
B)
Fosforilazione
HSTF
C)
Attacco del ligando
Recettori
degli steroidi
D)
Nucleo
Rilascio dell’inibitore
NF-kB
Citoplasma
E)
Cambio di partner
HLH
(MyoD/ID)
Citoplasma
Nucleo
DNA
1
Controllo
della
trascrizione
hnRNA
2
mRNA
mRNA
4
Proteine
Controllo
della
traduzione
Controllo
della maturazione
dell’hnRNA
Poro nucleare
3
Controllo
del trasporto
nel citoplasma
5
Proteine
attive o
inattive
Controllo
post-traduzionale
FINE