indagine sull`ecologia dei ceppi di saccharomyces

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D. SCHULLER – INDAGINE SULL’ECOLOGIA DEI CEPPI DI SACCHAROMYCES CEREVISIAE NEI VIGNETI DELLA REGIONE
DEL VINHO VERDE IN PORTOGALLO, PAG. 1
INDAGINE SULL’ECOLOGIA DEI CEPPI DI SACCHAROMYCES CEREVISIAE NEI
VIGNETI DELLA REGIONE DEL VINHO VERDE IN PORTOGALLO
Dorit Schuller a, Hugo Alves a, Sylvie Dequin b, Margarida Casal a,
a Departamento de Biologia, Centro de Biologia, Universidade do Minho, Braga, Portugal
b Institut National de la Recherche Agronomique, UMR Sciences pour l’Oenologie, Montpellier, France
NDLR : per non appesantire il testo, la tabella 1 e la figura 3 sono alla fine dell’articolo; i numeri tra parentesi [xx]
fanno riferimento alla bibliografia, in fondo all’articolo.
1. INTRODUZIONE
Tradizionalmente, la fermentazione del vino viene svolta spontaneamente dai lieviti indigeni
presenti sull’uva alla raccolta oppure derivano dalle attrezzature di cantina. Tutte le ricerche
recenti concordano nell’affermare che le specie predominanti sulle uve sane sono i lieviti
apiculati come Hanseniaspora uvarum (e la sua forma imperfetta Kloeckera apiculata) e specie
ossidative come Candida, Pichia, Kluyveromyces e Rhodotorula [1]. Al contrario, le specie
fermentative del genere Saccharomyces, soprattutto Saccharomyces cerevisiae, sono
scarsamente presenti sugli acini sani o nel suolo [2–4], ma lo sono in gran numero sugli acini
danneggiati [5]. La prevalenza dei ceppi appartenenti a tale specie è documentata dalla flora
tipica delle cantine [6–10]. Il tipo di lieviti dell’uva dipende da molti fattori, quali le condizioni
climatiche, ovvero temperature e pioggia, la localizzazione geografica del vigneto [4,9], i
trattamenti antifungini [11], la varietà di vite e l’età del vigneto [12–14] e il tipo di terreno [15].
Numerosi studi ecologici, che si avvalgono di metodi molecolari di identificazione, mostrano
un’estrema diversità di corredi genetici nella flora fermentativa enologica. I ceppi di S. cerevisiae
sembrano essere diffusi in determinate regioni viticole [16–19]], in anni consecutivi [20,21] e vi
sono ceppi che sono predominanti nella flora fermentativa [2,22] e ciò convalida il legame tra
uno specifico ceppo ed un terroir.
Le colture starter selezionate sono attualmente largamente utilizzate, poiché presentano ottime
caratteristiche fermentative ed enologiche, che contribuiscono all’ottenimento di un vino di
qualità e alla standardizzazione del processo fermentativo. Negli anni seguenti alla
pubblicazione della sequenza dei geni di S. cerevisiae [23], divennero evidenti le differenze
genetiche tra i diversi ceppi di lieviti [24–26]. Quindi, lo studio della biodiversità dei ceppi
fermentativi indigeni può essere di aiuto per la comprensione e la selezione di ceppi con
determinati fenotipi.
La differenza genetica dei ceppi di S. cerevisiae è stata analizzata con molti metodi, come lo
studio del cariotipo con analisi elettroforetica [27], l’analisi di restrizione del DNA mitocondriale
(mtDNA RFLP) [28–31], fingerprinting sulle sequenze delta ripetute [32,33] e lo studio del
genotipo attraverso lo studio di microsatelliti [34–36]. Schuller et al. [37] hanno mostrato di
recente che la determinazione con i microsatelliti, usando 6 differenti loci [36], l’analisi
ottimizzata della sequenza interdelta [33] e l’RFLP del DNA mitocondriale con l’utilizzo
dell’enzima HinfI avevano lo stessa capacità di discriminazione. Nel presente lavoro l’analisi
mtDNA RFLP con Hinfl venne usata come marker genetico per distinguere i ceppi di S.
cerevisiae. L’obbiettivo del presente lavoro era di dimostrare la biodiversità della flora
fermentativa trovata nei vigneti della regione del Vinho Verde per poter definire delle strategie
per i programmi futuri di selezione di ceppi enologici. Un altro scopo era quello di ottenere una
collezione di ceppi per la conservazione delle risorse genetiche di S. cerevisiae.
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2. MATERIALI E METODI
2.1 Campionamento
Il piano di campionamento prevedeva un totale di 18 siti in tre vigneti intorno ad una cantina, nel
nordovest del Portogallo (Regiaõ Demarcada dos Vinhos Verdes). In ogni vigneto, vennero
definiti sei punti di campionamento in base alla geografia del vigneto e la distanza tra la cantina
e i punti del campionamento era compresa tra 20 e 400 metri, come illustrato in fig. 1. I
campionamenti vennero eseguiti in due momenti diversi: prima della vendemmia (stadio
precoce) e dopo la vendemmia (stadio tardivo), nell’arco di due settimane, per verificare la
diversità tra i lieviti fermentativi durante le ultime fasi di maturazione dell’uva e alla vendemmia.
Questo esperimento venne ripetuto in tre anni consecutivi (2001–2003). I campioni non
venivano prelevati sempre dalla stessa pianta, ma dalla stessa area (±1–2 m). Le varietà
campionate erano Loureiro (vigneto A), Alvarinho (vigneto P) e Avesso (vigneto C), tutte varietà
di uva bianca tipiche della regione del Vinho Verde.
2.2 Fermentazione e isolamento dei ceppi
In ogni campionamento, venivano prelevati in modo asettico 2 Kg di uva e il succo veniva
fermentato a 20°C in piccoli volumi (500 ml), con agitazione meccanica (20 giri/min).
L’andamento della fermentazione veniva monitorato quotidianamente mediante determinazione
del calo della massa del mosto. Quando si osservava una diminuzione di 70 g/l, che
corrispondeva ad una diminuzione di circa 2/3 del contenuto zuccherino, i campioni diluiti (10-4
and 10-5) venivano messi su piastre YPD (estratto di lievito 1% peso/v, peptone 1% peso/v,
glucosio 2% peso/v, agar 2%, peso/v), e 30 colonie prese casualmente venivano prelevate dopo
incubazione (2 giorni, 28°C). Le colture isolate nelle diverse fermentazioni venivano conservate
in glicerolo (30% v/v) a -80°C.
2.3 Isolamento del DNA
Le cellule dei lieviti venivano coltivate su 1 ml di substrato YPD (36 h, 28 °C, 160 giri/m) e
l’isolamento del DNA veniva effettuato come descritto in precedenza [28] con una procedura
modificata di lisi cellulare, utilizzando 25 U di Zimolasi (SIGMA). La lisi delle cellule dipendeva
dal ceppo e durava circa da 20 minuti ad 1 ora (37°C). Il DNA veniva usato per l’analisi RFLP
mitocondriale.
2.4 Analisi di restrizione con DNA mitocondriale
Le reazioni di restrizione vennero effettuate come descritto in precedenza [37]. Le
denominazioni attribuite per caratteristiche osservate erano A1–A93, C1–C62 e P1–P135,
corrispondenti ad isolamenti provenienti rispettivamente dai vigneti A, C e P. La denominazione
ACP10 si riferisce ad un ceppo comune a tutti i vigneti e C69P77 e C42P80 erano attribuiti a
ceppi comuni ai vigneti C e P. I profili dei lieviti che sono identici a quelli di lieviti starter utilizzati
dalle cantine vennero denominati S1–S6. Un ceppo rappresentativo di ognuno dei 297 tipi
veniva testato e controllata la crescita in un mezzo contenente lisina come unica fonte di azoto
[38].
2.5 Metodi analitici
La concentrazione degli zuccheri veniva analizzata con il metodo dinitrosalicilico [39].
Fig. 1. Localizzazione geografica dei tre vigneti A, C e P nella regione del Vinho Verde con
indicazione delle cantine e dei siti di campionamento PI–PVI, AI–AVI e CI–CVI.
3. RISULTATI
Nel presente lavoro, vennero campionati tre vigneti nella regione del Vinho Verde, nel nordovest
del Portogallo, nelle stagioni vendemmiali 2001-2003 (Fig. 1). Per ottenere una
rappresentazione più dettagliata della distribuzione temporale dei lieviti fermentativi, vennero
fatte due campagne di campionamenti, una prima della vendemmia e l’altra dopo, nell’arco di
due settimane. Si programmò di prelevare un totale di 108 campioni di uva (6 punti di
campionamento, 2 campagne di campionamento, 3 vigneti, 3 anni), di cui 54 iniziarono una
fermentazione spontanea, 36 non iniziarono a fermentare neanche dopo 30 giorni di
incubazione, mentre 18 campioni non vennero prelevati a causa di cattive condizioni
meteorologiche e ad un cattivo stato sanitario dell’uva nel 2002. Dalle 54 fermentazioni si
isolarono 1620 lieviti. Tutti vennero analizzati mediante analisi di restrizione del DNA
mitocondriale (HinfI) e si attribuì un profilo ad ogni isolamento, ottenendo 297 differenti profili.
La conta dei lieviti (cfu in un mezzo YPD) era compresa tra 1.0 x 106 e 8.0 x 107 cfu/ml mosto,
corrispondenti ai valori generalmente descritti per le fermentazioni dei mosti. Tutti gli isolamenti
appartenevano alla specie S. cerevisiae per la loro incapacità di crescere in un mezzo
contenente lisina come unica fonte di azoto e per la loro capacità di amplificare sei loci
microsatelliti specifici di S. cerevisiae. Nessun loco o soltanto uno venne amplificato in altre
specie di Saccharomyces che si trovano nel vino come S. paradoxus e S. bayanus. Non venne
osservata alcuna amplificazione per le specie che sono presenti generalmente ai primi stadi
della fermentazione, come Candida stellata, Pichia membranifaciens e Kloeckera apiculata (dati
non riportati).
I risultati dell’analisi di restrizione del DNA mitocondriale per i 1620 isolamenti sono riassunti in
Tabella 1. Tra i 450 isolamenti del vigneto A, 93 erano dei profili unici, mentre in C e P vennero
isolati un totale di 450 e 690 ceppi, corrispondenti rispettivamente a 62 e 135 profili.
Per 11 profili comuni, trovati in più di una fermentazione (Tabella 1 e Fig. 2), e anche per sei
ceppi starter commerciali (S1–S6), si notò un’ampia distribuzione geografica e temporale.
Fig. 2. Esempi di profili comuni dell’analisi di restrizione con DNA mitocondriale (HinfI),riportati
nella tabella 1, trovati in ceppi isolati da fermentazioni spontanee di mosti ottenuti secondo
quanto descritto nella sezione 2.
I profili S1–S6 corrispondevano ai lieviti starter che erano stati usati nelle cantine negli ultimi
anni. I ceppi perenni erano associati a più siti di un singolo vigneto (profili A06 e S6, P136, P50),
ma mostrarono una distribuzione più ampia in diversi siti in due o tre vigneti (profili S3, S4, e
ACP10). I profili S1, S2, C63, A11, A13, P03 e P24 vennero trovati solo in un annata, ma in
diversi siti di campionamento di un unico vigneto, mentre il ceppo S5 venne trovato in molti siti di
campionamento nei vigneti C e P. I profili C42P80 e C69P77 vennero trovati solo in un punto di
campionamento nel 2003 dei vigneti C e P. Il profilo ACP10 è l’unico isolamento ‘‘regionale’’
con un’ampia diffusione geografica, mentre A06, A11, A13, C63, P03, P27, P50 e P136 possono
essere considerati ‘‘ceppi del vigneto’’ perché ricorrevano in molti siti di campionamento e/o in
diversi anni.
Il clima piovoso nell’estate del 2002 determinò una notevole diffusione di attacchi fungini, con
conseguenti trattamenti chimici. Probabilmente per questa ragione vennero trovati solo 12 profili
tra i 150 ceppi raccolti nel corso della campagna di campionamento tardiva del 2002 nel vigneto
P. Nel 2003, si osservò un comportamento paragonabile a quello del 2001 (47 e 62 profili unici
tra i 180 isolamenti delle campagne di campionamento tardive del vigneto P).
Come mostrato in Fig. 3, la fermentazione spontanea si avviò in quasi tutti i campioni prelevati
nel corso della campagna di campionamento tardiva.
Ciò non si verificò nella quasi totalità dei campioni prelevati alcuni giorni prima della vendemmia.
I mosti derivanti dai campioni prelevati nella prima campagna nel vigneto A non iniziavano mai la
fermentazione spontaneamente. Nel 2001 si verificò un sovradosaggio accidentale di prodotti
antifungini, determinando un ritardo dell’avvio delle fermentazioni spontanee in tre dei quattro
campioni di post-raccolta (II, III e VI). Nei due anni seguenti, i profili delle fermentazioni dei
campioni dei vigneti C e P erano paragonabili, suggerendo quindi che la flora si era ristabilita.
Le fermentazioni iniziarono dopo 6 - 12 giorni e venivano svolte da uno fino a venti diversi ceppi.
Non si trovò alcuna correlazione tra il numero di ceppi coinvolti nella fermentazione e il sito del
campionamento, l’anno o il vigneto. Il ceppo più diffuso (ACP10) era dominante in sei
fermentazioni (AII-2002, AI-2003, AII-2003, CIII-2003, PIII-2002, PVI-2002) costituendo il 77–
100% (23–30 ceppi) della flora totale, ma era meno importante in cinque fermentazioni (AI-2002,
PII-2001, PII-2002, PI-2003, PVI-2003), costituendo solo il 3–10% (da uno a tre ceppi) ed era
accompagnato da uno a sedici ceppi diversi. La distribuzione di questo ceppo non è associata
con la capacità di predominare nella fermentazione e la competitività sembra essere un fattore
chiave.
I campioni “specifici del vigneto” raccolti nel corso della prima campagna non erano presenti
dopo due settimane nello stesso sito (P, 2001 e 2003, C, 2001) con l’eccezione dei profili più
diffusi S1, S2, S3, S4, S5, ACP10 e P136, dimostrando la varietà della flora di S. cerevisiae.
4. DISCUSSIONE
Le indagini e gli studi biogeografici su larga scala della diversità genetica dei ceppi di S.
cerevisiae isolati da fermentazioni spontanee hanno documentato la natura dinamica di tali
popolazioni. Nel presente studio, sono stati osservati 297 diversi profili genetici tra i 1620
isolamenti ottenuti da 54 fermentazioni derivanti da uve di tre vigneti situati nella regione del
Vinho Verde, nel corso di tre anni. La maggior parte dei profili era unica, dimostrando quindi una
grande biodiversità dei ceppi di S. cerevisiae nella regione del Vinho Verde. Considerando il
rapporto tra il numero degli isolamenti e il numero dei profili come stima approssimativa della
biodiversità, i nostri risultati erano paragonabili ai valori già pubblicati di indagini sulla diversità
genetica di ceppi autoctoni enologici di ceppi di S. cerevisiae in altre regioni con tradizione
viticola come Bordeaux [2], Charentes [17,45], Campagne e la Valle della Loira [21], in Francia;
El Penedéz [46], Tarragona [7], Priorato [20,22] e La Rioja [47] in Spagna; Germania e Svizzera
[41]; Toscana, Sicilia [48] e il Collio [49] in Italia; Amyndeon e Santorini [42] in Grecia; Western
Cape [16,18,43] in Sud Africa; Patagonia [19] in Argentina.
Il presente studio è stato condotto in una regione viticola non ancora caratterizzata ed include
aspetti che non sono stati considerati in lavori precedenti, come la comparsa di numerosi ceppi
commerciali e il paragone delle popolazioni dei lieviti presenti sull’uva prima e dopo la
vendemmia.
La maggior parte dei ceppi non ha mostrato un comportamento perenne, in quanto la flora di
ogni anno era caratterizzata dalla comparsa di nuovi profili. Ciò potrebbe essere attribuito al
campionamento di solo 12 x 2 Kg di uva in ogni vigneto e anno, che è insufficiente per
rappresentare l’intera biodiversità di una certa area. Un’altra ragione per la comparsa di nuovi
profili potrebbe essere la ricombinazione e le pressioni evolutive, ma non è verosimile che tali
cambiamenti avvengano un anno con l’altro. I profili con analisi di restrizione del DNA
mitocondriale sono stabili nel corso delle cinque/sette divisioni delle cellule di S. cerevisiae
durante la fermentazione alcolica (nostri dati non pubblicati).
Tra tutti i profili, solo il ACP10 mostrò un’ampia diffusione regionale con in comportamento
perenne, dimostrandosi quindi un ceppo tipico di un ‘‘terroir’’ [17,21]. Comunque, una
distribuzione più ampia di un ceppo non è necessariamente correlata con migliori caratteristiche
tecnologiche. Ciò ha senso da un punto di vista ecologico, in quanto le forze selettive in un
vigneto sono completamente diverse da quelle presenti in un mosto in fermentazione. Ulteriori
caratterizzazioni fisiologiche effettuate nelle condizioni che si verificano durante la vinificazione
sono necessarie per valutare la potenzialità del ceppo. La presenza di questo ceppo seguiva le
fluttuazioni della popolazione naturale. Il carattere perenne del profilo ACP10 è una
conseguenza delle prevalenza sulla microflora locale. In diverse fermentazioni, l’ACP10 era
dominante in alcune ma non in altre, dimostrando che il risultato della fermentazione dipendeva
dalla composizione specifica della popolazione dei lieviti di un mosto, che dipende da molti
fattori, come l’effetto killer che dipende dal rapporto di cellule killer e cellule sensibili all’inizio
della fermentazione [50].
Loureiro era la cultivar del vigneto A, mentre Alvarinho e Avesso erano le cultivar dei vigneti P e
C, e ciò indica che la varietà di uva può contribuire nel determinare così tanti tipi di profili. Le
procedure di vinificazione sono paragonabili per i vigneti A,C e P e le differenze climatiche
sembrano non essere rilevanti, perché i vigneti sono geograficamente vicini. Comunque, non si
possono escludere le influenze climatiche, perché non sono state considerate in tale ricerca.
Una prima campagna di campionamenti venne effettuata alcuni giorni prima della vendemmia,
mentre una seconda campagna venne effettuata alcuni giorni dopo la fine della raccolta. Il tutto
venne compiuto nell’arco di circa due settimane, per ottenere un’immagine più dettagliata della
distribuzione temporale delle popolazioni dei lieviti nel corso della vendemmia. Al
raggiungimento della maturazione dell’uva, i lieviti diventano più abbondanti. Le ultime fasi della
maturazione dell’uva favoriscono la proliferazione dei lieviti sulla superficie dell’uva, a causa
della diminuzione dell’integrità della buccia, con conseguente colamento di mosto. Gli insetti
sono probabilmente portatori di lieviti sugli acini danneggiati. I lieviti possono raggiungere i 105–
106 cfu/acino [51]. Prima della vendemmia, solo il 5% dell’uva è colonizzato dai lieviti, mentre
diventa il 60% nel corso della vendemmia [52]. Come immaginato, solo 11 dei 42 campioni di
pre-vendemmia (26%) riuscirono a fermentare spontaneamente, mentre 43 su 48 campioni di
post-vendemmia avviarono spontaneamente la fermentazione (90%). I ceppi erano anche molto
più diversificati nei campioni dell’ultima campagna (267 profili su 1260 isolamenti) rispetto a
quelli del campionamento precoce (30 profili su 360 isolamenti). Salvo un’unica eccezione
(P136), i profili dei ceppi autoctoni della prima campagna non comparivano nella seconda
campagna di campionamento e ciò fa pensare ad una successione dei ceppi di S. cerevisiae .
Oppure, tali differenze possono essere attribuite al fatto che i grappoli raccolti erano differenti e
che potevano avere una flora diversa, anche se molto vicini tra di loro. Sembra improbabile che
l’aumento della variabilità dei ceppi in vendemmia sia dovuto ad una diffusione della flora di
cantina ad opera delle attrezzature di raccolta.
Le fermentazioni spontanee vennero svolte da uno o più ceppi dominanti accompagnati da
nessuno, pochi o numerosi ceppi secondari oppure vennero svolte da un insieme eterogeneo di
ceppi di cui nessuno era dominante. Ciò concorda con altri studi che indicano o la presenza di
uno o due ceppi dominanti, che costituiscono più del 50% della biomassa totale, accompagnati
da un numero variabile di ceppi secondari [7,17,19,29,40,41], o la presenza di molti ceppi di cui
nessuno è prevalente [22,42]. Entrambe le situazioni sono state osservate [16,18,43].
Considerando che l’origine dei lieviti del vino è ancora controversa [3,5,8,44], i nostri risultati
indicano chiaramente che S. cerevisiae si trova nell’ecosistema vigneto della regione Vinho
Verde in quantità tale da poter avviare fermentazioni spontanee nei mosti derivanti da circa 2 kg
di uva. Comunque, occorre fare delle osservazioni sull’approccio sperimentale. Il mosto crea
condizioni di stress e selettive per i lieviti, che sono completamente diverse dalle influenze
dell’ambiente naturale. E’ chiaro che i nostri dati si riferiscono solo a quei ceppi di S. cerevisiae
in grado di sopravvivere alle condizioni imposte dalla fermentazione, alle condizioni sperimentali,
dando quindi un’indicazione distorta (sottostima) del tipo di ceppi che realmente sono presenti
nel vigneto. Poiché il limite di rilevamento del nostro metodo sperimentale è pari al 3.3% (un
ceppo su 30 isolamenti), i ceppi rari, benché capaci di sopravvivere durante la fermentazione
potrebbero non essere stati rilevati. La ricerca di S. cerevisiae in 18 siti, in due campagne e
nell’arco di tre anni utilizzando un metodo diretto di semina su piastre a partire dai singoli acini,
come descritto [3] sarebbe veramente difficile. Noi consideriamo il nostro lavoro un buon
compromesso, in quanto consente di fare una buona stima della composizione della
popolazione, senza però avere una descrizione accurata della quantità relativa dei ceppi in
natura.
Il presente lavoro è il primo studio su larga scala riguardante i ceppi di lieviti associati al vigneto
nella regione del Vinho Verde in Portogallo ed è un approccio valido per avere una descrizione
più accurata dell’ecologia e biogeografia dei ceppi di S. cerevisiae , anche in regioni vicine
geograficamente. Riteniamo che questi studi siano indispensabili per lo sviluppo di strategie che
puntino alla conservazione della biodiversità e delle risorse genetiche per un ulteriore sviluppo
di diversi ceppi.
Ringraziamenti
Questo studio venne sostenuto dal progetto ENOSAFE (No. 762, Programa AGRO, medida 8) e dalla
borsa di studio no. 657 C2 derivante dall’accordo di cooperazione tra il Portuguese Institute for
International Scientific and Technological Cooperation (ICCTI) e l’ambasciata francese in Lisbona. Gli
autori ringraziano per l’assistenza data dagli enologi Rui Cunha, Anselmo Mendes, Euclides Rodrigues e
José Domingues per aver contribuito alle campagne di campionamento nei tre vigneti. Si ringraziano
anche Ana Rodrigues, Luis Quintas e Carlos Rocha per il lavoro svolto durante i campionamenti di uva.
E – stadio di campionamento precoce; L – stadio di campionamento tardivi; NF – non avviene la fermentazione spontanea; NC –
campioni non raccolti.
Tabella 1 Analisi di restrizione del DNA mitocondriale di 1620 lieviti isolati dal mosto fermentato
derivante da uve raccolte nei vigneti A, C e P nella regione del Vinho Verde, riportati in Fig.
1,negli anni 2001, 2002 and 2003
Fig. 3. Profili di fermentazione (linee) e contenuto di zucchero (segmenti) dei campioni di mosto
raccolti nella prima (cerchi vuoti e segmenti) e nella seconda campagna di campionamento
(cerchi pieni e segmenti) . In ogni grafico, vengono inseriti anche le denominazioni dei profili
dell’analisi di restrizione del DNA mitocondriale. I ceppi dominanti vengono sottolineati due volte
(P50%) o una volta (20–50%). Le denominazioni dei profili delle fermentazioni post-raccolta
sono in neretto. I profili comuni vengono evidenziati con riquadri grigi.
Fig.3 (continuazione)
Fig.3 (continuazione)
BIBLIOGRAFIA
[1] Fleet, G.H. and Heard, G.M. (1993) Yeasts: growth during fermentation In: Wine Microbiology and Biotechnology (Fleet, G.H.,
Ed.), pp. 27–55. Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland.
[2] Frezier, V. and Dubourdieu, D. (1992) Ecology of yeast strain Saccharomyces cerevisiae during spontaneous fermentation in a
Bordeaux winery. Am. J. Enol. Vitic. 43, 375–380.
[3] Martini, A., Ciani, M. and Scorzetti, G. (1996) Direct enumeration and isolation of wine yeasts from grape surfaces. Am. J. Enol.
Vitic. 47, 435–440.
[4] Parish, M.E. and Carroll, D.E. (1985) Indigenous yeasts associated with muscadine (Vitis rotundifolia) grapes and musts. Am. J.
Enol. Vitic. 36, 165–169.
[5] Mortimer, R. and Polsinelli, M. (1999) On the origins of wine yeast. Res. Microbiol. 150, 199–204.
[6] Sabate, J., Cano, J., Esteve-Zarzoso, B. and Guillamon, J.M. (2002) Isolation and identification of yeasts associated with
vineyard and winery by RFLP analysis of ribosomal genes and mitochondrial DNA. Microbiol. Res. 157, 267–274.
[7] Constanti, M., Poblet, M., Arola, L., Mas, A. and Guillamon, J.M. (1997) Analysis of yeast populations during alcoholic
fermentation in a newly established winery. Am. J. Enol. Vitic. 48, 339–344.
[8] Vaughan-Martini, A. and Martini, A. (1995) Facts, myths and legends on the prime industrial microorganism. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol. 14, 514–522.
[9] Longo, E., Cansado, J., Agrelo, D. and Villa, T.G. (1991) Effect of climatic conditions on yeast diversity in grape musts from
northwest Spain. Am. J. Enol. Vitic. 42, 141–144.
[10] Beltran, G., Torija, M.J., Novo, M., Ferrer, N., Poblet, M., Guillamon, J.M., Rozes, N. and Mas, A. (2002) Analysis of yeast
populations during alcoholic fermentation: a six year follow-up study. Syst. Appl. Microbiol. 25, 287–293.
[11] Monteil, H., Blazy-Mangen, F. and Michel, G. (1986) Influence des pesticides sur la croissance des levures des raisins et des
vins. Science des Aliments 6, 349–360.
[12] Rosini, G. (1982) Influenza della microflora saccaromicetico della cantina sulla fermentazione del mosto d’uva. Vigne Vini 9, 43–
46.
[13] Pretorius, I.S., van der Westhuizen, T.J. and Augustyn, O.H.P. (1999) Yeast biodiversity in vineyards and wineries and its
importance to the South African wine industry. S. Afr. J. Enol. Vitic. 20, 61–74.
[14] Martini, A., Frederichi, F. and Rosini, G. (1980) A new approach to the study of yeast ecology on natural substrates. Can. J.
Microbiol. 26, 856–859.
[15] Farris, G.A., Budroni, M., Vodret, T. and Deiana, P. (1990) Sull’originr dei lieviti vinari i lieviti dei terreni, delle foglie e degli acini
di alcun vigneti sardi. L’Enotecnico 6, 99–108.
[16] van der Westhuizen, T.J., Augustyn, O.H.P., Khan, W. and Pretorius, I.S. (2000) Seasonal variation of indigenous
Saccharomyces cerevisiae strains isolated from vineyards of the Western Cape in South Africa. S. Afr. J. Enol. Vitic. 21, 10–16.
[17] Versavaud, A., Courcoux, P., Roulland, C., Dulau, L. and Hallet, J.-N. (1995) Genetic diversity and geographical distribution of
wild Saccharomyces cerevisiae strains from the wine-producing area of Charentes, France. Appl. Environ. Microbiol. 61, 3521–3529.
[18] van der Westhuizen, T.J., Augustyn, O.H.P. and Pretorius, I.S. (2000) Geographical distribution of indigenous Saccharomyces
cerevisiae strains isolated from vineyards in the coastal regions of the western Cape in South Africa. S. Afr. J. Enol. Vitic. 21, 3–9.
[19] Lopes, C.A., van Broock, M., Querol, A. and Caballero, A.C. (2002) Saccharomyces cerevisiae wine yeast populations in a cold
region in Argentinean Patagonia. A study at different fermentation scales. J. Appl. Microbiol. 93, 608–615.
[20] Torija, M.J., Rozes, N., Poblet, M., Guillamon, J.M. and Mas, A. (2001) Yeast population dynamics in spontaneous
fermentations: comparison between two different wine-producing areas over a period of three years. Antonie Van Leeuwenhoek 79,
345–352.
[21] Vezinhet, F., Hallet, J.-N., Valade, M. and Poulard, A. (1992) Ecological survey of wine yeast strains by molecular methods of
identification. Am. J. Enol. Vitic. 43, 83–86.
[22] Sabate, J., Cano, J., Querol, A. and Guillamon, J.M. (1998) Diversity of Saccharomyces strains in wine fermentations: analysis
for two consecutive years. Lett. Appl. Microbiol. 26, 452–455.
[23] Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R.W., Dujon, B.,Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J.D., Jacq, C., Johnston, M.,
Louis, E.J., Mewes, H.W., Murakami, Y., Philippsen, P.,Tettelin, H. and Oliver, S.G. (1996) Life with 6000 genes. Science 274, 546.
[24] Carro, D., Garcia-Martinez, J., Pe´rez-Ortin, J.E. and Pina, B. (2003) Structural characterization of chromosome I size variants
from a natural yeast strain. Yeast 20, 171–183.
[25] Pe´rez-Ortin, J.E., Garcia-Martinez, J. and Alberola, T.M. (2002) DNA chips for yeast biotechnology. The case of wine yeasts. J.
Biotechnol. 98, 227–241.
[26] Pe´rez-Ortin, J.E., Querol, A., Puig, S. and Barrio, E. (2002) Molecular characterization of a chromosomal rearrangement
involved in the adaptive evolution of yeast strains. Genome Res. 12, 1533–1539.
[27] Blondin, B. and Vezinhet, F. (1988) Identification de souches de levures oenologiques par leurs caryotypes obtenus en
e´lectrophore`se en champs pulseé. Rev. Fr. Oenol. 28, 7–11.
[28] Lopez, V., Querol, A., Ramon, D. and Fernandez-Espinar, M.T. (2001) A simplified procedure to analyse mitochondrial DNA
from industrial yeasts. Int. J. Food Microbiol. 68, 75–81.
[29] Querol, A., Barrio, E., Huerta, T. and Ramon, D. (1992) Molecular monitoring of wine fermentations conducted by active dry
yeast strains. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2948–2953.
[30] Fernandez-Espinar, M.T., Querol, A. and Ramon, D. (2000) Molecular characterization of yeast strains by mitochondrial DNA
restriction analysis In: Methods in Biotechnology (Spencer, J.F.T. and Ragout de Spencer, A.L., Eds.), pp. 329–333. Humana Press,
Totawa.
[31] Querol, A., Barrio, E. and Ramon, D. (1992) A comparative study of different methods of yeast strain characterization. Syst Appl.
Microbiol. 15, 439–446.
[32] Ness, F., Lavalleé, F., Dubourdieu, D., Aigle, M. and Dulau, L.(1993) Identification of yeast strains using the polymerase chain
reaction. J. Sci. Food Agric. 62, 89–94.
[33] Legras, J.L. and Karst, F. (2003) Optimisation of interdelta analysis for Saccharomyces cerevisiae strain characterisation.
FEMS Microbiol. Lett. 221, 249–255.
[34] Gallego, F.J., Perez, M.A., Martinez, I. and Hidalgo, P. (1998) Microsatellites obtained from database sequences are useful to
characterize Saccharomyces cerevisiae strains. Am. J. Enol. Vitic. 49, 350–351.
[35] Hennequin, C., Thierry, A., Richard, G.F., Lecointre, G.,Nguyen, H.V., Gaillardin, C. and Dujon, B. (2001) Microsatellite typing as
a new tool for identification of Saccharomyces cerevisiae strains. J. Clin. Microbiol. 39, 551–559.
[36] Pe´rez, M.A., Gallego, F.J., Martinez, I. and Hidalgo, P. (2001) Detection, distribution and selection of microsatellites (SSRs) in
the genome of the yeast Saccharomyces cerevisiae as molecular markers. Lett. Appl. Microbiol. 33, 461–466.
[37] Schuller, D., Valero, E., Dequin, S. and Casal, M. (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains.
FEMS Microbiol. Lett. 231, 19–26.
[38] Barnett, J.A., Payne, R.W. and Yarrow, D. (1990) Yeast. Characteristics and Identification. Cambridge University Press, New
York.
[39] Miller, G.L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31, 426–428.
[40] Querol, A., Huerta, T., Barrio, E. and Ramon, D. (1992) Dry yeast strain for use in fermentation of Alicante Wines – selection
and DNA patterns. J. Food Sci. 57, 183.
[41] Schu¨ tz, M. and Gafner, J. (1993) Analysis of yeast diversity during spontaneous and induced alcoholic fermentations. J. Appl.
Bacteriol. 75, 551–558.
[42] Pramateftaki, P.V., Lanaridis, P. and Typas, M.A. (2000) Molecular identification of wine yeasts at species or strain level: a case
study with strains from two vine-growing areas of Greece. J. Appl. Microbiol. 89, 236–248.
[43] Khan, W., Augustyn, O.H.P., van der Westhuizen, T.J., Lambrechts, M.G. and Pretorius, I.S. (2000) Geographic distribution and
evaluation of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from vineyards in the warmer, inland regions of the Western Cape in South
Africa. S. Afr. J. Enol. Vitic. 21, 17–31.
[44] Martini, A. (2003) Biotechnology of natural and winery-associated strains of Saccharomyces cerevisiae. Int. Microbiol. 6, 207–
209.
[45] Versavaud, A., Dulau, L. and Hallet, J.-N. (1993) Etude écologique de la microflore levurienne spontaneé du vignoble des
Charentes et approche molećulaire de la diversite´ infraspécifique chez Saccharomyces cerevisiae. Rev. Fr. Oenol. 142, 20–
29.
[46] Esteve-Zarzoso, B., Gostincar, A., Bobet, R., Uruburu, F. and Querol, A. (2000) Selection and molecular characterization of wine
yeasts isolated from the «El Penedes» area (Spain). Food Microbiol. 17, 553–562. 176 D. Schuller et al. / FEMS Microbiology
Ecology 51 (2005) 167–177
[47] Gutierrez, A.R., Santamaria, P., Epifanio, S., Garijo, P. and Lopez, R. (1999) Ecology of spontaneous fermentation in one winery
during 5 consecutive years. Lett. Appl. Microbiol. 29, 411–415.
[48] Cavalieri, D., Barberio, C., Casalone, E., Pinzauti, F., Sebastiani, F., Mortimer, R. and Polsinelli, M. (1998) Genetic and
molecular diversity in Saccharomyces cerevisiae natural populations. Food Technol. Biotechnol. 36, 45–50.
[49] Comi, G., Maifreni, M., Manzano, M., Lagazio, C. and Cocolin, L. (2000) Mitochondrial DNA restriction enzyme analysis and
evaluation of the enological characteristics of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from grapes of the wine-producing area of
Collio (Italy). Int. J. Food Microbiol. 58, 117–121.
[50] Heard, G.M. and Fleet, G.H. (1986) Occurence and growth of yeast species during the fermentation of some Australian wines.
Food Technol. Austral. 38, 22–25.
[51] Fleet, G.H. (2002) The yeast ecology of wine grapes In: Biodiversity and Biotechnology of wine yeasts (Ciani, M., Ed.), pp. 1–19.
Research Signpost, Trivandrum, India.
[52] Rosini, G., Frederichi, F. and Martini, A. (1982) Yeast flora of grape berries during ripening. Microbiol. Ecol. 8, 83–89.

indagine sull`ecologia dei ceppi di saccharomyces

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