For in-vitro diagnostic use Product code: FK014.1, FK014.2, FS014._

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For in-vitro diagnostic use Product code: FK014.1, FK014.2, FS014._
5
CAUTION
All donors of human serum supplied (kits only) have been serum tested and found to be negative for
Hepatitis B surface antigen and antibodies to Hepatitis C virus and Human Immunodeficiency Virus
(HIV 1 & 2). However, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling
and disposal methods should be established as for all potentially infective material and only personnel
adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures.
RAT KIDNEY, STOMACH IFA KIT/SLIDES
The Evans Blue and the kit controls contain 0.099% sodium azide as a preservative and must be
handled with caution – do not ingest or allow contact with the skin or mucous membranes. If contact
does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive metal azides may
by formed with the lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of
water to prevent azide build up.
This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated. Adherence to the
given procedure is recommended.
For in-vitro diagnostic use
Product code:
FK014.1,
FK014.2,
FS014._
Product manufactured by:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
FDA (USA) Information
Analyte ID Code:
AMA: 0439
ANA: 0441
AGPCA: 0442
ASMA: 0451
Complexity Cat: High
INTENDED USE
This product is intended for use in the screening and titration of circulating autoantibodies in human
serum as an aid in the diagnosis and treatment of various autoimmune diseases. The four major
autoantibodies detected are antinuclear antibodies (ANA), antimitochondrial antibodies (AMA),
antismooth muscle antibodies (ASMA) and antigastric parietal cell antibodies (AGPCA).
2
SUMMARY AND EXPLANATION
Indirect immunofluorescence is the reference method for screening and titration of circulating
autoantibodies in serum. Animal tissue sections, e.g. from rat, are generally preferred over other
commonly-used substrates including human tissue sections and cell preparations; this is primarily due
to the lack of interference from HLA and/or other blood group antibodies. Using two different tissues
(kidney and stomach) enables autoantibodies to be more easily identified by comparing the results
obtained with each tissue.
Particular autoantibodies are associated with a number of different diseases. ANA almost always occur
with systemic lupus erythematosus (SLE) but are also commonly found in patients with connective
tissue and rheumatoid diseases. AMA are frequently present in primary biliary cirrhosis but may also
be detected in patients with other liver diseases. ASMA are frequently associated with chronic active
hepatitis and primary biliary cirrhosis, but are also detectable in low concentrations in various other
conditions. AGPCA occur in the serum of most patients with pernicious anaemia. A more detailed
description of which autoantibodies are associated with which disease is given in section 9 (refs. 1-9).
3
PRINCIPLE
An indirect immunofluorescence technique is utilised where patient samples and appropriate controls
are incubated with the substrate slides. The unreacted antibodies are washed off and an appropriate
fluorescein labelled conjugate is applied. Unbound conjugate is washed off, and slides are viewed with
a fluorescence microscope. Positive samples produce apple-green fluorescence with corresponds to
areas of the section where autoantibody has bound.
4
4.1
7
SPECIMEN COLLECTION
Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated
as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to
assay (ref. 10), or for prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or below. DO NOT freeze and
thaw sera more than once. Avoid using lipaemic, haemolysed or microbially contaminated sera as
decreased titres or unclear staining patterns may occur.
METHODOLOGY
8.1
Materials provided
8.1.1
50T kit FK014.1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat Kidney, Stomach Slide – (5-well).
1 x 1mL ANA Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Negative Control (prediluted).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (prediluted).
1 x 6.2mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC.
1 x 3mL 1% Evans Blue.
2 x 60mL PBS concentrate (x20).
1 x 3mL Mounting Medium.
20 x Blotters.
10 x Coverslips (22 x 70mm).
1 x instruction leaflet.
8.1.2
250T Kit FK014.2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat kidney, Stomach Slide - (10-well).
1 x 1mL ANA Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Negative Control (prediluted).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (prediluted).
1 x 15.5mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC.
1 x 3mL 1% Evans Blue.
2 x 60mL PBS concentrate (x20).
1 x 10mL Mounting Medium.
50 x Blotters.
25 x Coverslips (22 x 70mm).
1 x instruction leaflet.
8.1.3
FS014.1, FS014.2
1.
2.
10 x 5-well slides, 25 x 10-well slides respectively.
1 x instruction leaflet.
8.2
Additional materials required
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
8.2.5
8.2.6
8.2.7
Distilled water to dilute PBS concentrate.
Container for PBS buffer.
Micropipettes and disposable tips to apply patient samples.
Humid chamber for incubation steps (e.g. Magnetic Staining Chamber, Code BD010).
Fluorescence microscope with 495nm exciter filter and 515nm barrier filter.
Plastic squeeze bottle for initial wash in PBS.
If slides only are being used, additional components may be obtained from The Binding
Site: PBS (CON 3.3), negative control (CON 92), ANA homogeneous control (FA105),
Mitochondrial positive control (FA128), smooth muscle positive control (FA134), anti
Human IgG (H+L) AFF FITC (FA003), mounting medium (CON 195) and 1% Evans
Blue (CON 93).
REAGENTS
8.3
Rat kidney, stomach sections on 5- or 10-well slides.
STORAGE AND STABILITY
Unopened kits/slides should be stored at 2-8°C and can be used until the given expiry date. DO NOT
FREEZE. Once slides are removed from their foil bag, they should be used immediately. Diluted PBS
buffer can be stored for up to one month at 2-8°C. The FITC conjugate should be kept out of sunlight,
fluorescent or U.V. light whenever possible. All reagents should be stored at 2-8°C.
8
Telephone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
1
6
Test procedure
Quality control
Positive and negative controls should be used every time a batch of samples is tested.
Kits only.
4.2
ANA homogeneous control serum, containing 0.099% sodium azide. Prediluted, ready
for use.
8.3.1
Mounting medium: Remove the mounting medium from the fridge to allow it to reach
room temperature (18-28°C) before it is needed.
4.3
Negative control serum, universally negative for all autoantibodies, containing 0.099%
sodium azide. Prediluted, ready for use.
8.3.2
4.4
Affinity purified sheep anti-human IgG (H+L) fluorescein isothiocyanate, containing
0.099% sodium azide. Prediluted, ready for use.
Dilute PBS concentrate Dilute PBS concentrate with distilled water (1 part PBS
concentrate + 19 parts distilled water) and mix. The PBS is used for diluting patient
samples and as a wash buffer.
8.3.3
4.5
Mitochondrial positive control serum, containing 0.099% sodium azide. Prediluted,
ready for use.
4.6
Smooth muscle positive control serum, containing 0.099% sodium azide. Prediluted,
ready for use.
Dilute patient samples
Screening: Dilute patient samples 1/20 by adding 10µL of serum to 190µL of PBS
buffer.
Titration: Make serial dilutions of positive samples with PBS buffer (e.g. 1/20, 1/40,
1/80, 1/160 and 1/320 etc.). For example: Take 100µL of the 1/20 dilution, mix with
100µL of PBS to give a 1/40 dilution. Repeat for further dilutions.
8.3.4
Substrate slides Allow substrate slide(s) to reach room temperature (18-28°C) prior to
removal from pouch(es). Label slides appropriately, place in the humid chamber and
add one drop of each positive and negative control to appropriate wells. Add 50µL of
diluted patient samples to the remaining wells.
8.3.5
Slide incubation Incubate slides for 20 minutes in a humid chamber at room temperature
(18-28°C).
8.3.6
PBS wash Remove slides from humid chamber and rinse briefly with PBS squeeze
bottle. Do not squirt directly on to the wells. Place slides in a rack and immerse in PBS
and agitate or stir for 5-10 minutes.
8.3.7
Addition of fluorescent conjugate Shake off excess PBS and blot around wells using
blotters provided. Return slides to humid chamber and immediately cover each well with
a drop of fluorescent conjugate. DO NOT LEAVE WELLS UNCOVERED FOR LONGER
THAN 15 SECONDS. Drying out of the substrate seriously affects the results.
4.7
1% Evans Blue, as an optional counterstain.
4.8
Phosphate buffered saline (PBS), provided as a 20-fold concentrate in liquid form.
4.9
Blotters, to blot the slides after washing.
4.10
Mounting medium, containing an anti-fading agent (DABCO 1, 4 diazabicylo [2.2.2]
octane.
4.11
Coverslips.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 1 of 10
8.3.8
Slide incubation Incubate slides for 20 minutes in humid chamber at room temperature
(18-28°C) in the dark.
8.3.9
PBS wash Wash again as described in step 8.3.6. Optional counterstain: Add 2-3 drops
of 1% Evans Blue per 100mL of PBS prior to slide immersion.
Mounting with coverslip Remove one slide at a time from PBS wash. Quickly dry around
the wells and add a drop of mounting medium to each well. Carefully lower the slide
onto the coverslip, avoiding air bubbles, but if present do not attempt to remove. Wipe
excess medium from around edge of coverslip.
8.3.10
OCCURRENCE PERCENTAGE
0-2
0-8
3
5
10-15 (in elderly)
REFERENCE
2
7
2
8
9
ABNORMALS:
Quality control
CLINICAL DIAGNOSIS
The ANA positive control should give a bright apple-green homogeneous pattern in cell nuclei. The
mitochondrial positive control should give bright apple-green staining of renal tubules and gastric
parietal cells. The smooth muscle positive control should give bright apple-green staining of the
muscularis layer of the stomach. The negative control should show dull green staining in all tissues,
with no discernible fluorescence.
If the controls do not appear as described, the test is invalid and should be repeated.
9.2
Expected results
ANTIBODY
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
RESULTS
9.1
EXPECTED VALUES AND SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
NORMALS:
View slides under fluorescence microscope Slides may be stored for up to 3 days at
2-8°C, in the dark, without significant loss of fluorescence.
8.3.11
9
11
11.1
ANA
AMA
ASMA
Interpretation of results
NEGATIVE
ARA
These are seen as dull green staining in all sections, with no discernible fluorescence. Suspected weak
reactions should be repeated but at a higher dilution (e.g. 1/40). If the repeated result appears the
same as the original, the test is regarded as negative.
AGPCA
SLE
Mixed connective tissue disease
Other autoimmune diseases (RA,
scleroderma, Sjögren’s syndrome,
dermatomyositis)
Primary biliary cirrhosis
Chronic hepatitis
Primary biliary cirrhosis
Crohn’s disease
Coeliac disease
Dermatitis herpetiformis
Pernicious anaemia
OCCURRENCE
PERCENTAGE
99
90
15-20
REFERENCE
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
4
3
3, 5
POSITIVE
11.2
These are seen as significant fluorescence in specific tissue areas giving one or more of the following
patterns:
A comparison study was performed on 96 clinical samples using this kit and a commercially-available
reference method. 93 out of the 96 samples tested gave identical results by the two methods. For the
patterns described in section 9.2, the relative sensitivity ranged from 89-100%, the relative specificity
was 100%. For the samples that differed, weak ANA or SMA positive staining was obtained in each
case by the reference method only, suggesting that these samples were borderline for the particular
pattern, and/or there are slight differences in sensitivity between the two methods.
Antinuclear Antibodies ANA
ANA stain the nuclei of the following: distal and proximal kidney tubules, gastric parietal and chief cells.
Almost all SLE patients have ANA in the serum, but ANA can also be found in various connective
tissue diseases including rheumatoid arthritis. ANA can also occur with chronic active hepatitis and
primary biliary cirrhosis, and in response to certain drug treatments.
Additional information can be obtained by interpreting the ANA nuclear patterns obtained (see below).
It is recommended that all positive ANA samples are titred to endpoint to ensure that possible mixed
reactions are detected that may otherwise have been missed. Further analysis of such samples for
autoantibodies to double stranded DNA and extractable nuclear antigens (ENA) is also advised.
PATTERN
Homogeneous
Peripheral
(Rim)
Speckled
COMMON ANTIGENS
INVOLVED
ds DNA, histones
Native/ds DNA
Extractable nuclear antigens,
Ribonucleoprotein,
Scl-70,
SSB
4-6S RNA
Nucleolar
Antismooth muscle
antibodies (ASMA)
Antigastric parietal
cell antibodies
(AGPCA)
Antireticulin
antibodies (ARA)
TISSUE ASSOCIATED
Kidney distal tubules
cytoplasm and the proximal
tubules (to a lesser extent)
Muscularis layers (stomach)
Arteriole muscle layers (other
tissues)
Parietal cells (stomach)
Peritubular fibres and
Bowman’s capsules (kidney)
2
DISEASE ASSOCIATION
3
SLE
Rheumatoid arthritis (RA)
Mixed connective tissue disease
Drug induced lupus
SLE
5
Scleroderma
Sjögren’s Syndrome
Mixed connective tissue disease
SLE
Scleroderma
Sjögren’s syndrome
SLE, RA and progressive systemic
sclerosis
4
6
7
8
9
10
13
Tissue Specific autoantibody staining patterns include:
ANTIBODY
Antimitochondrial
antibodies (AMA)
12
1
MAIN DISEASE ASSOCIATION
Primary biliary cirrhosis & other liver
diseases
Chronic active hepatitis
Pernicious anaemia
Crohn’s disease
Coeliac disease
Dermatitis hepetiformis
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
Comparison study
REFERENCES
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases
and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
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(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical
implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed.
Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
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Imunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut
14, 311-315.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human sera
by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel,
H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pg175-194.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward,
GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
SUMMARY OF PROCEDURE
Equilibrate mounting medium to room temperature.
Dilute PBS with distilled water.
Dilute patient sera 1/20 with PBS.
Equilibrate substrate slides to room temperature (18-28°C).
Apply 50µL positive and negative controls and diluted patient sera to appropriate wells.
Incubate in a humid chamber for 20 minutes.
Wash for 5-10 minutes in PBS.
Blot around each well and immediately cover each well with a drop of conjugate.
Incubate as in step 13.6.
Wash as step 13.7.
Mount.
View slide under fluorescence microscope.
NB: Each laboratory should establish at which point a positive result is considered clinically significant.
10
LIMITATIONS OF PROCEDURE
10.1
This test alone should not be considered diagnostic. All other factors including the
clinical history of the patients and other serological or biopsy results must also be taken
into account.
10.2
Staining patterns often change as a sample is titred out to end point. This is usually due
to the presence of more than one autoantibody, especially for ANAs.
10.3
A negative result with this kit can be due to disease remission or to the presence of
autoantibodies not detectable by this technique.
10.4
The light source, filters and optics of different makes of fluorescence microscopes will
influence the sensitivity of the assay. The performance of the microscope is significantly
influenced by correct maintenance especially centring of the mercury vapour lamp and
changing of the lamp after the recommended period of time.
10.5
Autoantibodies can be activated or induced by a wide range of drugs including oral
contraceptives and antibiotics.
10.6
Due to the short distance between wells on the 10-well slides it is possible for cross
contamination of samples and controls to occur. Care must be taken, especially at the
washing stages, to ensure that this does not happen.
10.7
Suitability for use with other manufacturers' IFA reagents has not been assessed but
use with such reagents should not necessarily be excluded.
FDA information - see front page.
Slides sold separately are classified as Analyte Specific Reagents. Except as a component of the kit,
analytical and performance characteristics are not established.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 2 of 10
Das Evans Blue und die Kitkontrollen enthalten 0,099% Natriumazid als Konservierungsmittel. Deshalb
sollten die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Verschlucken sowie Kontakt mit
Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen
Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der
Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.
RATTE-NIERE, MAGEN-KITS/
OBJEKTTRÄGER FÜR DIE IFT
Dieses Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal für den angegebenen
Verwendungszweck verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen.
6
Zur in-vitro Diagnostik
Bestell-Nr.: FK014.1,
FK014.2,
FS014._
In England hergestellt von:
The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
e-mail: [email protected]
1
Diese Kits/Objektträger dienen zum Screening und zur Titration von zirkulierenden Autoantikörpern im
Serum, zur Unterstützung der Diagnose und Therapie von verschiedenen Autoimmun-Erkrankungen.
Die vier häufigsten Autoantikörper sind antinukleäre Antikörper (ANA), antimitokondriale Antikörper
(AMA), Antikörper gegen die glatte Muskulatur (ASMA / GMA), sowie Magenparietalzellen (AGPCA).
2
EINFÜHRUNG
Die indirekte Immunfluoreszenz ist die Referenzmethode für das Screening und die Titration von
zirkulierenden Autoantikörpern im Serum. Tierische Gewebeschnitte, wie z. B. von der Ratte, werden
allgemein gegenüber anderen Gewebeschnitten einschließlich menschlichem Gewebe oder
Zellkulturen bevorzugt, da bei ihnen keine Störungen durch HLA und/oder anderen Blutgruppen-Antikörpern auftreten. Die gleichzeitige Verwendung von zwei unterschiedlichen Geweben (Niere und
Magen) erleichtert die Interpretation der Ergebnisse.
Einzelne Autoantikörper sind mit einer Anzahl von verschiedenen Erkrankungen assoziiert. ANAs
werden in der Regel bei systemischem Lupus erythematodes (SLE), aber auch bei Patienten mit
Bindegewebs- und rheumatischen Erkrankungen gefunden. AMAs werden häufig bei Patienten mit
primärer biliärer Zirrhose gefunden, sie können aber auch bei anderen Lebererkrankungen auftreten.
ASMA sind mit der chronischen aktiven Hepatitis und der primären biliären Zirrhose assoziiert, aber
auch in niedrigen Konzentrationen bei anderen Erkankungen nachweisbar. AGPCA werden bei
Patienten mit perniziöser Anämie gefunden. Eine detaillierte Auflistung, welche Autoantikörper mit
welcher Krankheit assoziiert werden, ist in Abschnitt 9 aufgelistet (Ref. 1-9).
3
7
8
TESTDURCHFÜHRUNG
8.1
Gelieferte Materialien
8.1.1
50 Test-Kit FK014.1
1.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat Kidney, Stomach Slide – (5-well) (Ratte-Nieren-Magen-Objektträger, 5
Auftragstellen).
1 x 1mL ANA Positive Control (vorverdünnte ANA-Positivkontrolle).
1 x 1mL Negative Control (vorverdünnte Negativkontrolle).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (vorverdünnte Mitochondrial-Positivkontrolle).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (vorverdünnte Glatte-MuskulaturPositivkontrolle).
1 x 6,2mL Anti human IgG (H&L) AFF FITC (anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat).
1 x 3mL 1% Evans Blue (1%ige Evans-Blue-Lösung).
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS-Konzentrat, 20-fach).
1 x 3mL Mounting Medium (Eindeckmedium).
20 x Blotters (Blotter).
10 x Coverslips (Deckgläschen, 22 x 70mm).
1 x Arbeitsanleitung.
8.1.2
250 Test-Kit FK014.2
1.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat Kidney, Stomach Slide – (10-well) (Ratte-Nieren-Magen-Objektträger, 10
Auftragsstellen).
1 x 1mL ANA Positive Control (vorverdünnte ANA-Positivkontrolle).
1 x 1mL Negative Control (vorverdünnte Negativkontrolle).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (vorverdünnte Mitochondrial-Positivkontrolle).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (vorverdünnte Glatte-MuskulaturPositivkontrolle).
1 x 15,5mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC (anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat).
1 x 3mL 1% Evans Blue (1%ige Evans-Blue-Lösung).
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS-Konzentrat, 20-fach).
1 x 10mL Mounting Medium (Eindeckmedium).
50 x Blotters (Blotter).
25 x Coverslips (Deckgläschen, 22 x 70mm).
1 x Arbeitsanleitung.
8.1.3
Objektträger:
2.
3.
4.
5.
FS014.1 - Rat kidney, stomach 5-well slides (10 x 5 Auftragsstellen),
FS014.2 - Rat kidney, stomach 10-well slides (25 x 10 Auftragsstellen)
REAGENZIEN
4.1
Objektträger mit Ratte-Niere-Magen-Gefrierschnitte mit je 5 oder 10 Auftragsstellen.
4.2
ANA-Homogen-Positivkontrolle. Enthaltenes Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.3
Die Negativkontrolle ist für alle Autoantikörper negativ. Enthaltenes Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.4
Das Anti-human-IgG-(H+L)FITC-Konjugat ist affinitätsgereinigt und optimal mit
Fluorescein-Isothiocyanat markiert. Enthaltenes Konservierungsmittel: 0,099%
Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.5
Mitochondriale Positivkontrolle. Enthaltenes Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid.
Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.6
Positivkontrolle für glatte Muskulatur (ASMA). Enthaltenes Konservierungsmittel:
0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
8.2
Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
Destilliertes Wsser zum Verdünnen des PBS-Puffferkonzentrats.
Gefäß für PBS-Puffer.
Mikropipetten und Einmal-Spitzen zum Pipettieren der Patientenseren.
Feuchte Kammer für die Inkubationen (z.B. Magnetische Färbekammer, Bestell-Nr.:
BD010).
Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter.
Spritzflasche für 1. Waschschritt.
Bei Verwendung von Einzelobjektträgern können die zusätzlich benötigten
Komponenten bei The Binding Site bestellt werden: PBS-Puffer (Bestell-Nr.: CON3.3),
Negativkontrolle (Bestell-Nr.: CON92), ANA-homogen Positivkontrolle (Bestell-Nr.:
FA105), Mitochondriale Positivkontrolle (Bestell-Nr.: FA128), Glatte Muskulatur
Positivkontrolle (Bestell-Nr.: FA134), anti-Hu-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat (BestellNr.:FA003), Eindeckmedium (Bestell-Nr.: CON195) und 1%ige Evans-Blue-Lösung
(Bestell-Nr.: CON93).
8.2.5
8.2.6
8.2.7
Nur Kits:
4.7
1%ige Evans-Blue-Lösung: zur optionalen Gegenfärbung.
4.8
Der PBS-Puffer liegt als 20-fach Konzentrat vor und muss vor Gebrauch entsprechend
verdünnt werden.
4.9
Blot-Papier. Saugfähige Papierblotter um nach den Waschschritten die Objektträger zu
trocknen.
4.10
Das Eindeckmedium ist speziell für die Immunfluoreszenz und enthält DABCO (1,4
diazobicyclo [2.2.2] Octan) als Ausbleich-Schutzfaktor.
4.11
Deckgläschen.
5
PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum so
schnell wie möglich vom Gerinnsel abtrennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei
2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden (Ref. 10). Für eine längere Lagerung empfiehlt es
sich, die Seren aliquotiert bei mindestens -20°C einzufrieren. Serum nur einmal einfrieren und
auftauen. Keine stark lipämische, hämolytische oder mikrobiell verunreinigte Seren verwenden, da
dadurch erniedrigte Titer oder unklare Muster auftreten können.
TESTPRINZIP
Der Test beruht auf der indirekten Immunfluoreszenz-Technik. Die Patientenproben und
entsprechenden Kontrollen werden auf den Gefrierschnitten inkubiert. In einem Waschschritt werden
die nicht reagierenden Antikörper entfernt und dann das Fluoreszein-Konjugat zugegeben.
Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Die Untersuchung der Objektträger erfolgt
unter dem Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen in den Bereichen der Gefrierschnitte, in
denen die Autoantikörper an entsprechende Strukturen gebunden haben, eine apfelgrüne Fluoreszenz.
4
Ungeöffnete Kits bei 2-8°C lagern, sie sind so bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar.
NICHT EINFRIEREN! Ist der Folienbeutel eines Objektträgers einmal geöffnet, muss er sofort
verwendet werden. Der verdünnte PBS-Puffer ist bis zu einem Monat bei 2-8°C haltbar. Das FITCKonjugat nicht unnötig Sonnen-, fluoreszierendem oder UV-Licht aussetzen. Alle anderen Reagenzien
nach Anbruch bei 2-8°C aufbewahren.
2.
3.
4.
5.
VERWENDUNGSZWECK
LAGERUNG UND STABILITÄT
8.3
8.3.1
Eindeckmedium: Das Eindeckmedium aus dem Kühlschrank nehmen und vor Gebrauch
auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
8.3.2
PBS-Konzentrat verdünnen. PBS-Konzentrat mit destilliertem Wasser 1/20 (1 Teil PBSKonzentrat + 19 Teile destilliertes Wasser) verdünnen und mischen. Der PBS-Puffer in
Arbeitskonzentration wird zum verdünnen der Patientenproben und als Waschpuffer
verwendet.
8.3.3
Patientenseren verdünnen
Screening: Patientenseren im Verhältnis 1/20 verdünnen. (z.B. 10µL Serum + 190µL
PBS-Puffer).
Titration: Von im Screening positiven Proben eine serielle Verdünnungsreihe erstellen
(z.B. 1/20, 1/40; 1/80; 1/160; 1/320; 1/640 usw.) z.B. 100µL eines 1/20 verdünnten
Patientenserums mit 100µL PBS-Puffer versetzen - ergibt eine 1/40 Verdünnung.
8.3.4
Objektträger vorbereiten. Die Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen
lassen. Folientasche erst direkt vor dem Gebrauch öffnen! Die Objekträger aus dem
Folienbeutel nehmen, entsprechend beschriften und in eine feuchte Kammer geben. Je
1 Tropfen der Kontrollen und 50µL Patientenseren auf die jeweiligen Auftragsstellen
pipettieren.
8.3.5
Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20 min bei Raumtemperatur (18-28°C) in
der feuchten Kammer inkubieren.
8.3.6
Waschen mit PBS-Puffer. Die Objektträger aus der feuchten Kammer nehmen und
rasch mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen, dabei nicht direkt in die Auftragsfelder
spritzen. Die Objektträger in eine Halterung geben und in ein PBS-Pufferbad
eintauchen. Die Objektträger 5-10 min im PBS-Puffer belassen, dabei rühren oder leicht
schütteln.
WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kontrollen stammt aus menschlichem Blut. Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV) 1 und 2, Antikörpern
gegen Hepatitis C Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ
befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von HIV,
Hepatitis B-Virus oder anderen Infektionsträgern.
Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und
Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen.
Testdurchführung
Qualitätskontrolle
Die Negativ- und Positivkontrollen sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 3 of 10
8.3.7
Zugabe von Fluoreszenz-Konjugat. Überschüssigen PBS-Puffer abschütteln und die
Objektträger mit dem mitgelieferten Blotpapier (nur Kits!) oder Filterpapier abtrocknen.
Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und sofort, d. h. innerhalb von 15
sec, auf jede Auftragsstelle je einen Tropfen Fluoreszenz-Konjugat geben. Das
Austrocknen des Substrats kann das Ergebnis beträchtlich beeinrächtigen.
8.3.8
Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20 min bei Raumtemperatur (18-28°C) in
der feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren.
8.3.9
Waschen mit PBS-Puffer. Erneut waschen wie unter Punkt 8.3.6 beschrieben. Wenn
eine Gegenfärbung gewünscht wird, können bei diesem Waschschritt bis zu 2-3 Tropfen
1%ige Evans-Blue-Lösung pro 100mL PBS-Puffer zugegeben werden.
8.3.10
Deckgläschen aufsetzen. Jeweils nur einen Objektträger aus dem PBS-Pufferbad
nehmen. Um die Auftragsstellen herum rasch abtrocknen und jeweils 1 Tropfen
Eindeckmedium auf jede Auftragsstelle geben. Das Deckgläschen sorgfältig auf den
Objektträger legen, wobei Luftbläschen zu vemeiden sind. Eventuell vorhandene
Luftblasen nicht versuchen zu enfernen. Überschüssiges Eindeckmedium mit
Filterpapier entfernen.
8.3.11
Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Sie können im Dunkeln bei
2-8°C bis zu drei Tage ohne signifikaten Fluoreszenzverlust aufbewahrt werden.
9
10.7
FDA (USA) Informationen: siehe englische Packungsbeilage.
11
Erwartete Ergebnisse
GESUNDE
Autoantikörper
ANA
AMA
ASMA
ARA
(AG)PCA
Häufigkeit in %
0-2
0-8
3
5
10 - 15 (Ältere)
Literatur
2
7
2
8
9
KRANKE:
Antikörper
Diagnose
Häufigkeit in %
99
Literatur
4
Mischkollagenosen
Andere Autoimmun-Erkrankungen
(z.B.
RA,
Sklerodermie,
Sjögren’s
Syndrom, Dermatomyositis)
Primäre biliäre Zirrhose
Chronische Hepatitis
Primäre biliäre Zirrhose
Morbus Crohn
Zöliakie
Dermatitis herpetiformis
Pernizöse Anämie
90
3
15-20
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
SLE
ANA
Qualitätskontrolle
Die ANA-Positivkontrolle erzeugt eine kräftige, apfelgrüne, homogene Fluoreszenzfärbung in den
Zellkernen. Die Mitochondriale-Positivkontrolle erzeugt eine kräftige, apfelgrüne Fluoreszenfärbung der
Nieren-Tubuli und der Magen-Parietalzellen. Die ASMA-Positivkontrolle erzeugt eine kräftige,
apfelgrüne Fluoreszenzfärbung in der Magen-Muskelschicht. Die Negativkontrolle zeigt eine mattgrüne Anfärbung des Gewebes ohne erkennbare Fluoreszenz.
Erscheint eine der Kontrollen nicht wie beschrieben, sollte der Testansatz verworfen und ein neuer
Ansatz gemacht werden.
9.2
ERWARTETE ERGEBNISSE UND LEISTUNGSDATEN
11.1
ERGEBNISSE
9.1
Die Verwendung dieser Produkte mit IFT-Reagenzien anderer Hersteller wurde nicht
überprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen.
AMA
ASMA
ARA
(AG)PCA
Interpretation der Ergebnisse
NEGATIV
11.2
Bei einem negativen Ergebnis zeigen alle Teile des Gewebes eine matt-grüne Färbung ohne
erkennbare Fluoreszenz. Proben, die lediglich eine sehr schwache Fluoreszenz zeigen, sollten erneut
mit einer Verdünnung von 1/40 getestet werden. Ist das Ergebnis wie zuvor, so wird die Probe als
negativ angesehen.
In einer Vergleichsstudie wurde dieser Kit mit einer kommerziell erhältlichen Referenzmethode
verglichen. Es wurden 96 Patientenproben getestet und folgende Ergebnisse erhalten: 93 der 96
getesteten Proben ergaben mit beiden Methoden ein identisches Ergebnis. Es wurde für die in
Abschnitt 9.2 beschriebenen Muster eine relative Sensitivität von 89-100%, und eine relative Spezifität
von 100% gefunden. Die Proben mit abweichendem Ergebnis wurden mit der Referenzmethode als
schwach ANA-positiv befunden. Dies bedeutet, dass die Proben grenzwertig sind und/oder die zwei
Methoden geringfügige Unterschiede in der Sensitivität aufweisen.
POSITIV
Bei einer positiven Probe wird eine signifikante Fluoreszenz in spezifischen Gewebe-Strukturen
gefunden. Folgende Fluoreszenz-Muster können auftreten:
Antinukleäre Antikörper (ANA)
1
Durch ANA’s werden folgende Zellkerne angefärbt: Distale und proximale Nieren-Tubuli, MagenParietal- und Hauptzellen. Bei fast allen SLE-Patienten werden ANA’s im Serum gefunden, aber sie
können ebenfalls bei verschiedenen Erkrankungen des Bindegewebes, inkl. Rheumatischer Arthritis
auftreten. ANA können auch bei der chronischen aktiven Hepatitis und primären biliären Zirrhosen und
als Folge von verschiedenen Medikamenten auftreten.
Zusätzliche Informationen können durch die Interpretation des ANA-Musters gewonnen werden (siehe
Tabelle unten). Es wird empfohlen, dass alle positiven ANA-Seren bis zum Endpunkt austitriert
werden, um sicherzustellen, dass keine gemischten Muster übersehen werden. Weiterhin sollten diese
Proben auch auf Autoantikörper gegen Doppelstrang-DNA (dsDNA) und extrahierbare nukleäre
Antigene (ENA) untersucht werden.
Muster
Homogen
Peripher
Gesprenkelt
Beteiligte Antigene
dsDNA, Histone
Native / dsDNA
Extrahierbare nukleoläre Antigene,
Ribonukleoproteine,
Scl-70,
SSB
4-6S RNA
Nukleolär
Assoziierte Erkrankungen
SLE
Rheumatische Arthritis (RA)
Mischkollagenosen
Medikamenten-induzierter
Lupus
SLE
Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
Mischkollagenosen
SLE
Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
SLE, RA und progressive
systemische Sklerodermie
Fluoreszenzmuster von gewebespezifischen Autoantikörpern:
Muster
Antimitochondriale
Antikörper (AMA)
Antikörper gegen glatte
Muskulatur (ASMA)
Antikörper gegen
Magenparietalzellen (PCA)
Anti-Retikulin Antikörper
(ARA)
12
Gewebe
Niere: distales, tubuläres Zytoplasma und proximale Tubuli
(seltener)
Magen: Muskelschicht
Andere Gewebe: arterielle
Muskelschicht
Magen: Parietalzellen
Niere: Peritubuläre Fibern und
Bowman’sche Kapsel
Assoziierte Erkrankungen
Primäre biliäre Zirrhose
andere Lebererkrankungen
Chronisch aktive Hepatitis
2
3
4
5
6
7
8
9
10
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
Vergleichsstudie
REFERENZEN
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases
and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical
implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed.
Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases,
Imunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut
14, 311-315.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human sera
by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel,
H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pp175-194.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward,
GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
KURZARBEITSANLEITUNG
Eindeckmedium auf Raumtemperatur erwärmen lassen.
PBS-Pufferkonzentrat mit destilliertem Wasser verdünnen.
Patientenseren 1/20 mit PBS-Puffer verdünnen.
Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
Je 50µL Kontrollen und Patientenseren auftragen.
20 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren.
Objektträger 5-10 min. mit PBS-Puffer waschen.
Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum gut abtrocknen,
wieder in die feuchte Kammer legen und sofort FITC-Konjugat auftropfen.
Wie unter Punkt 13.6 beschrieben inkubieren.
Wie unter Punkt 13.7 beschrieben waschen.
Objektträger Eindecken und Deckgläschen aufsetzen.
Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten.
Perniziöse Anämie
Morbus Crohn
Zöliakie
Dermatitis hepetiformis
Hinweis: Jedes Labor sollte eigene Richtlinien erstellen und festlegen wann ein positives Ergebnis
klinisch relevant ist.
10
GRENZEN DES TESTS
10.1
Der Test allein ist nicht als diagnostischer Beweis ausreichend. Alle Ergebnisse sollten
immer nur im Zusammenhang mit anderen Laborbefunden und dem klinischen Bild des
Patienten betrachtet werden.
10.2
Bei der Titration einer Probe bis zum Endpunkt kann sich das Fluoreszenzmuster
ändern. Diese Änderung wird durch das Vorkommen von mehreren Autoantikörpern
(speziell bei ANAs) verursacht.
10.3
Ein negatives Ergebnis kann auch auf eine Remission der Krankheit zurückgeführt
werden, oder die Autoantikörper sind mit dieser Methode nicht nachweisbar.
10.4
Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die
Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte
Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach
der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst.
10.5
Es ist zu beachten, dass Autoantikörper durch verschiedene Medikamente,
einschließlich Antibiotika und Orale Kontrazeptiva, aktiviert oder induziert werden
können.
10.6
Aufgrund der nur kleinen Abstände zwischen den Auftragsstellen bei den Objekträgern
mit 10 Auftragstellen besteht eine gewisse Verschleppungsgefahr. Deshalb muss
besonders sorgfältig gearbeitet werden, speziell beim Waschen, um dies zu vermeiden.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 4 of 10
médecin. Des azides de métaux explosifs peuvent se former avec le cuivre et le plomb. Laver à grande
eau les récipients ayant contenu ces réactifs afin d’empêcher la formation des azides de métaux.
LAMES/COFFRET
D’IMMUNOFLUORESCENCE COUPES DE
REIN ET ESTOMAC DE RAT
Ce réactif doit être utilisé par un personnel formé à de telles techniques. Il est recommandé de suivre
scrupuleusement la procédure.
6
Les coffrets et les lames non ouverts doivent être stockés à 2-8°C et peuvent être utilisés jusqu’à la
date de péremption indiquée. Ne pas congeler. Lorsque les lames sont sorties de leur étui, les utiliser
immédiatement. Le tampon PBS dilué peut être stocké plus d’un mois à 2-8°C. Le conjugué FITC doit
être conservé à l’obscurité. Tous les réactifs doivent être stockés à 2-8°C.
7
Pour usage diagnostic in vitro
Code produit : FK014.1,
FK014.2,
FS014._
Produits fabriqués en Angleterre par la société :
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, United Kingdom.
www.bindingsite.co.uk
Distribués en France par la société :
The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex.
Téléphone : 04.38.02.19.19
Fax : 04.38.02.19.20
e-mail : [email protected]
1
INDICATIONS
Ces coffrets sont destinés au dépistage et au titrage des auto-anticorps circulants dans le sérum
humain. Ils apportent une aide au diagnostic et au traitement de plusieurs maladies auto-immunes. Les
quatre principaux auto-anticorps détectés sont les anti-nucléaires (ANA), les anti-mitochondries (AMA),
les anti-muscle lisse (ASMA) et les anti- cellules pariétales gastriques (AGPCA).
2
PRESENTATION GENERALE
L’immunofluorescence indirecte est la méthode de choix pour le dépistage et le titrage des autoanticorps circulants dans le sérum. Les coupes de tissu d’origine animale, comme le rat, sont
généralement préférées aux autres substrats habituellement utilisés comme les tissus humains et les
préparations de cellules; ceci est dû à l’absence d’interférence avec le système HLA et/ou les autres
anticorps dirigés contre les groupes sanguins. L’utilisation de deux tissus différents (rein et estomac)
permet d’identifier plus facilement les auto-anticorps en comparant les résultats obtenus avec chaque
tissu.
Des auto-anticorps particuliers sont associés à différentes maladies. Les ANA sont presque toujours
présents dans le lupus érythémateux disséminé (LED) mais sont aussi communément trouvés chez
des patients atteints de maladies rhumatoïdes et de connectivites. Les AMA sont fréquemment
retrouvés dans les cirrhoses biliaires primitives mais peuvent aussi être détectés chez des patients
atteints d’autres maladies du foie. Les ASMA sont fréquemment associés aux hépatites chroniques en
phase active et aux cirrhoses biliaires primitives mais ils sont également présents en faibles
concentrations dans d’autres conditions. Les AGPCA sont présents dans le sérum de la plupart des
patients atteints d’anémie pernicieuse. Une description plus détaillée de l’association des autoanticorps avec certaines maladies est donnée dans la section 9 (réfs 1-9).
3
PRINCIPE
Ce coffret fait appel à une technique d’immunofluorescence indirecte. Les sérums de patients et les
contrôles appropriés sont incubés sur les coupes de tissus. Les anticorps non spécifiques sont
éliminés par lavage. Un conjugué approprié marqué à la fluorescéine est appliqué. Le conjugué non lié
est éliminé par lavage et la lecture des lames s’effectue à l’aide d’un microscope à fluorescence. La
positivité des échantillons se traduit par un marquage fluorescent de certaines régions de la coupe de
tissus sur lesquelles sont accrochés les auto-anticorps.
4
4.1
ECHANTILLONS
Prélever de façon stérile et par ponction veineuse de sang. Laisser le sang coaguler à température
ambiante, puis séparer le sérum du caillot dès que possible pour éviter l’hémolyse. Les sérums
peuvent être conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests (réf. 10) ou aliquotés et congelés à
-20°C minimum pour une conservation plus longue. Les congélations et décongélations successives
doivent être évitées. Ramener le sérum à température ambiante avant les tests. Il est recommandé
d’utiliser des sérums non lipidiques, non hémolysés et non contaminés par des bactéries car les titres
peuvent être moins élevés ou les aspects peuvent être difficilement identifiables.
8
METHODOLOGIE
8.1
Matériel fourni
8.1.1
Coffret pour 50 tests (réf. : FK014.1)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat Kidney, Stomach Slide – (5-well) (lames de 5 puits recouverts de rein et
estomac de rat).
1 x 1mL ANA Positive Control (contrôle positif ANA pré-dilué).
1 x 1mL Negative Control (contrôle négatif pré-dilué).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (contrôle positif anti-mitochondrie pré-dilué).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (contrôle positif anti-muscle lisse pré-dilué).
1 x 6,2mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC (conjugué FITC anti-IgG (H+L) humaines).
1 x 3mL 1% Evans Blue (solution de Bleu d’Evans à 1%).
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (solution de PBS concentrée 20 fois).
1 x 3mL Mounting Medium (milieu de montage).
20 x Blotters (buvards).
10 x Coverslips (lamelles, 22 x 70mm).
1 x fiche technique.
8.1.2
Coffret pour 250 tests (réf. : FK014.2)
1.
25 x Rat Kidney, Stomach Slide – (10-well) (lames de 10 puits recouverts de rein et
estomac de rat).
1 x 1mL ANA Positive Control (contrôle positif ANA pré-dilué).
1 x 1mL Negative Control (contrôle négatif pré-dilué).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (contrôle positif anti-mitochondrie pré-dilué).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (contrôle positif anti-muscle lisse pré-dilué).
1 x 15,5mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC (conjugué FITC anti-IgG (H+L) humaines).
1 x 3mL 1% Evans Blue (1% solution de Bleu d’Evans).
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (solution de PBS concentrée 20 fois).
1 x 10mL Mounting Medium (milieu de montage).
50 x Blotters (buvards).
25 x Coverslips (lamelles, 22 x 70mm).
1 x fiche technique.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.3
FS014.1, FS014.2
1.
1.
10 lames de 5 puits, 25 lames de 10 puits respectivement.
1 x fiche technique.
8.2
Matériel nécessaire et non fourni
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
Eau distillée pour diluer le PBS concentré.
Un flacon pour contenir le PBS dilué.
Micro-pipettes et cônes pour le dépôt des échantillons.
Chambre humide pour les étapes d’incubation (ex : chambre humide The Binding Site :
réf. BD010).
Microscope à fluorescence avec un filtre d’excitation à 495nm et un filtre d’émission à
515nm.
Pissette plastique pour les lavages au PBS.
Si seules les lames sont utilisées, les réactifs complémentaires peuvent être obtenus
auprès de la société The Binding Site : PBS (CON 3.3), contrôle négatif (CON 92),
contrôle ANA homogène (FA105), contrôle positif mitochondrie (FA128), contrôle positif
muscle lisse (FA134), conjugué anti-IgG (H+L) humaines FITC (FA003), milieu de
montage (CON195) et bleu d’Evans 1% (CON 93).
8.2.5
8.2.6
8.2.7
REACTIFS
Lames de 5 ou 10 puits recouverts de coupes de rein et estomac de rat.
STOCKAGE ET STABILITE
8.3
Coffrets seulement.
Procédure
Contrôle de qualité
Les contrôles positifs et négatifs doivent être testés lors de chaque série.
4.2
Un sérum de contrôle positif donnant un aspect homogène ANA. Il est fourni pré-dilué
et prêt à l’emploi. Il contient de l’azide de sodium à 0,099%.
8.3.1
4.3
Un sérum de contrôle négatif, universellement négatif pour tous les auto-anticorps. Il
est fourni pré-dilué et prêt à l’emploi. Il contient de l’azide de sodium à 0,099%.
Milieu de montage. Ramener le milieu de montage à température ambiante (18-28°C)
avant utilisation.
8.3.2
4.4
Un conjugué de mouton anti-IgG (H+L) humaines, purifié par affinité et couplé à
l’isothiocyanate de fluorescéine. Il est fourni pré-dilué et prêt à l’emploi. Il contient de
l’azide de sodium à 0,099%.
Diluer le PBS concentré. Diluer le PBS concentré dans de l’eau distillée (1 volume de
PBS concentré pour 19 volumes d’eau) et mélanger. Le PBS est utilisé pour diluer les
échantillons et comme tampon de lavage.
8.3.3
4.5
Un sérum de contrôle positif anti-mitochondrie. Il est fourni pré-dilué et prêt à
l’emploi. Il contient de l’azide de sodium à 0,099%.
4.6
Un sérum de contrôle positif anti-muscle lisse. Il est fourni pré-dilué et prêt à
l’emploi. Il contient de l’azide de sodium à 0,099%.
Dilution des échantillons
Pour le dépistage : diluer les échantillons au 1/20 (mettre 10µL de sérum dans 190µL
de PBS dilué).
Pour la titration : faire une gamme de dilution du sérum en PBS (1/20, 1/40, 1/80,
1/160, 1/320,...) ex : prendre 100µL de la dilution au 1/20 et ajouter 100µL de PBS pour
obtenir une dilution au 1/40. Continuer les dilutions en cascade pour obtenir les dilutions
suivantes.
8.3.4
Lames. Les ramener à température ambiante (18-28°C) avant de les sortir de leur
emballage. Les marquer puis les déposer dans la chambre humide avant le dépôt des
contrôles positifs et négatifs (1 goutte) dans les puits appropriés. Déposer 50µL des
échantillons dilués dans les autres puits.
8.3.5
Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre humide à
température ambiante (18-28°C).
8.3.6
Lavage en PBS. Sortir les lames de la chambre humide et les rincer rapidement à l’aide
d’une pissette contenant le tampon PBS. Ne pas diriger le jet directement sur les puits.
Mettre les lames sur un portoir et les immerger en PBS sous agitation lente pendant 5 à
10 minutes.
8.3.7
Conjugué fluorescent. Eliminer l’excès de PBS et sécher le pourtour des puits à l’aide
des buvards fournis ou de papier absorbant. Remettre les lames en chambre humide et
couvrir immédiatement chaque puits avec une goutte de conjugué fluorescent
approprié. NE PAS LAISSER LES PUITS A L’AIR PLUS DE 15 SECONDES. Le
dessèchement des puits affecte le résultat.
8.3.8
Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre humide à
température ambiante (18-28°C) dans l’obscurité.
4.7
Bleu d’Evans à 1%. Contre-colorant optionnel.
4.8
Tampon PBS. Solution liquide concentrée 20 fois.
4.9
Buvards pour sécher les lames.
4.10
Milieu de montage, contenant un agent « anti-fading » (DABCO 1,4 diazabicyclo (2.2.2)
octane).
4.11
Lamelles.
5
PRECAUTIONS
Tous les sérums des donneurs humains (seulement coffrets) ont été soumis aux tests des hépatites B
et C, de l’HIV1 et HIV2 et se sont avérés négatifs. Toutefois ces tests ne peuvent garantir l’absence
totale d’agents infectieux. Tous les échantillons doivent donc être considérés comme potentiellement
infectieux et manipulés par un personnel averti.
Le bleu d’Evans et les contrôles du coffret contiennent 0,099% d’azide de sodium comme
conservateur. Il est donc nécessaire de les manipuler avec précaution. Ne pas ingérer ou mettre en
contact avec la peau ou les muqueuses. En cas de contact, laver à grande eau et consulter un
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 5 of 10
8.3.9
Lavage en PBS. Procéder comme à la section 8.3.6. Il est possible d’ajouter 2 à 3
gouttes de bleu d’Evans à 1% pour 100mL de PBS avant l’immersion des lames. Ceci
permettra une contre-coloration.
Montage des lames. Sortir les lames une à une du PBS. Sécher rapidement le pourtour
des puits puis déposer une goutte de milieu de montage dans chaque puits. Déposer la
lamelle en évitant la formation de bulles d’air. Ne pas essayer d’éliminer les bulles d’air
éventuellement apparues. Essuyer l’excès de milieu de montage.
8.3.10
11.1
Contrôle de qualité
ANA
9.2
AMA
ASMA
Interprétation des résultats
DIAGNOSTIC CLINIQUE
RESULTATS NEGATIFS
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissu,
mais en aucun cas une fluorescence franche. Les réactions faibles doivent être répétées mais à une
concentration plus élevée (ex : 1/40). Si le nouveau test paraît identique au précédent, il est considéré
comme négatif.
Un échantillon est considéré positif lorsqu’une fluorescence significative apparaît dans les organelles
des tissus spécifiques donnant un des aspects suivants :
Anticorps anti-nucléaires (ANA)
Les ANA reconnaissent les noyaux des cellules du foie, les tubules distaux et proximaux du rein et les
cellules gastriques pariétales et cellules principales. Presque tous les patients atteints de LED ont des
ANA dans leur sérum mais les ANA peuvent aussi être trouvés dans différentes connectivites
comprenant l’arthrite rhumatoïde. Les ANA peuvent être détectés également chez des patients atteints
d’hépatite chronique en phase active et de cirrhose biliaire primitive ou en réponse à certains
médicaments.
Des informations supplémentaires peuvent être obtenues par l’interprétation des aspects nucléaires
des ANA (voir au-dessous). Il est recommandé de titrer en point final tous les échantillons positifs afin
de s’assurer que toutes les réactions soient détectées. Il est également conseillé de rechercher les
auto-anticorps contre l’ADN double brin et les antigènes nucléaires solubles.
ASPECT
Homogène
ANTIGENE IMPLIQUE
ADN double brin, histones
Périphérique
(Anneau)
Moucheté
ADN double brin, natif
Antigènes nucléaires solubles,
Ribonucléoprotéine,
Scl-70,
SSB
RNA 4-6S
MALADIE ASSOCIEE
LED
L’arthrite rhumatoïde (RA)
Connectivites mixtes
Lupus médicalement induit
LED
Sclérodermie
Syndrome de Sjögren
Connectivites mixtes
LED
Sclérodermie
Syndrome de Sjögren
LED, AR et Sclérose
systémique progressive
Aspect du marquage pour les auto-anticorps spécifiques des tissus :
Autoanticorps antimitochondries (AMA)
Autoanticorps antimuscle lisse (ASMA)
Autoanticorps anticellules gastriques
pariétales (AGPCA)
Autoanticorps antiréticuline (ARA)
ARA
AGPCA
11.2
RESULTATS POSITIFS
AUTO-ANTICORPS
TISSUS ASSOCIES
Tubules distaux des reins et
tubules proximaux (moins)
Cytoplasme
Couche musculaire (estomac)
Couche musculaire des artérioles
(autres tissus)
Cellules pariétales (estomac)
Fibres péri-tubulaires
Capsules de Bowman (rein)
PRINCIPALES MALADIES
ASSOCIEES
Cirrhoses biliaires
primitives et autres
pathologies du foie
Hépatites chroniques
actives
Anémie pernicieuse
Maladie de Crohn
Maladie coeliaque
Dermatoses herpétiques
LED
Connectivites mixtes
Autre maladies auto-immunes
(RA, sclérodermie, syndrome de
Sjögren, dermatomyosite)
Cirrhose biliaire primitive
Hépatite chronique
Cirrhose biliaire primitive
Maladie de Crohn
Maladie coeliaque
Dermatose herpétique
Anémie pernicieuse
REFERENCES
2
7
2
8
9
Ce test ne constitue pas un diagnostic en soi. Les résultats du test doivent tenir compte
des autres résultats du laboratoire et de l’histoire clinique du patient.
10.2
Les aspects du marquage changent souvent lorsqu’un échantillon est titré jusqu’à son
point final. Ceci est dû à la présence de plusieurs auto-anticorps, spécialement pour les
ANA.
10.3
Un résultat négatif avec ce coffret peut être dû à une rémission ou à la présence d’autoanticorps non détectables avec cette technique.
10.4
La qualité des filtres, des optiques et de la source lumineuse peut influencer la
sensibilité du test. Il est important de réaliser une maintenance correcte (centrage de la
lampe à vapeur de mercure et changement de la lampe après la période
recommandée).
10.5
Les auto-anticorps peuvent être activés ou induits par un grand nombre de
médicaments tels contraceptifs oraux ou antibiotiques.
10.6
A cause de la faible distance entre les puits sur les lames de 10 puits, il est possible
d’observer des contaminations croisées d’échantillons et de contrôles. Réaliser les
étapes de lavage avec précaution.
10.7
L’utilisation de ces réactifs avec des réactifs d’autres fournisseurs n’a pas été testée
mais cette utilisation ne doit pas être nécessairement exclue.
>95
70
50
24
38-50
22
90
REFERENCES
4
3
3, 5
3
3
3
6
3, 6
6
9
Une étude comparative a été faite sur 96 échantillons cliniques en utilisant ce coffret et une méthode
de référence commercialement disponible. 93 échantillons sur 96 ont donné des résultats identiques
par les deux méthodes. Pour les aspects décrits dans le paragraphe 9.2, la sensibilité relative était de
89-100%, la spécificité relative était de 100%. Pour les cas qui diffèrent, un marquage positif faible
ANA ou ASMA ont été obtenu dans chaque cas avec la méthode de référence seulement, suggérant
que ces échantillons sont limites pour cet aspect particulier et/ou qu’il y a de petites différences de
sensibilité entre les deux méthodes.
12
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
BIBLIOGRAPHIE
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases
and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical
implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed.
Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases,
Imunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut
14, 311-315.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human sera by
immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H.
Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pp175-194.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward,
GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
RESUME
Ramener à température ambiante le milieu de montage.
Diluer le PBS en eau distillée.
Diluer le sérum des patients au 1/20 en PBS.
Ramener les lames à température ambiante (18-28°C).
Déposer 50µL des contrôles positifs et négatifs et des sérums de patients correctement
dilués dans les puits appropriés.
Incuber dans une chambre humide pendant 20 minutes.
Laver pendant 5 à 10 minutes en PBS.
Sécher le pourtour des puits et recouvrir immédiatement chaque puits d’une goutte de
conjugué.
Incuber comme en 13.6.
Laver comme en 13.7.
Monter les lames.
Observation sous microscope à fluorescence.
LIMITES DE LA PROCEDURE
10.1
POURCENTAGE
D’APPARITION
99
90
15-20
Etude comparative
Note : Chaque laboratoire doit établir à quel point un résultat positif est considéré comme significatif
cliniquement.
10
POURCENTAGE D’APPARITION
0-2
0-8
3
5
10-15 (chez les personnes âgées)
VALEURS PATHOLOGIQUES :
Le contrôle ANA homogène doit présenter une fluorescence verte dans les noyaux des cellules. Le
contrôle positif anti-mitochondrie doit présenter une fluorescence verte des tubules rénaux et des
cellules pariétales gastriques. Le contrôle positif muscle lisse doit présenter une fluorescence verte
dans la couche musculaire de l’estomac. Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond
vert pâle sur toutes les coupes de tissu, mais en aucun cas une fluorescence franche.
Si les puits de contrôle ne correspondent pas à la description ci-dessus, le test doit être considéré
comme invalide et il est conseillé de le répéter.
Nucléolaire
Valeurs attendues
AUTOANTICORPS
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
RESULTATS
9.1
VALEURS ATTENDUES ET PERFORMANCES
VALEURS NORMALES :
Lecture des lames. Les lames peuvent être stockées 3 jours à 2-8°C dans l’obscurité
sans perte significative de fluorescence.
8.3.11
9
11
Informations FDA – Voir première page de la version anglaise.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 6 of 10
material potencialmente infeccioso. Sólo personal debidamente formado puede llevar a cabo estos
procedimientos.
PORTAOBJETOS/KIT IFA DE RIÑÓN Y
ESTÓMAGO DE RATA
Spanish
El azul de Evans y los controles del kit contienen azida sódica al 0,099% como conservante, por lo
que deben manipularse con precaución. No ingerir ni poner en contacto con la piel o las membranas
mucosas. En caso de contacto, lavar la zona con agua abundante y consultar a un médico. Pueden
formarse azidas metálicas explosivas con el cobre o el plomo de las tuberías. Al eliminar el reactivo,
lavar los recipientes con agua abundante para evitar la acumulación de azida en los desagües.
Este producto sólo debe ser utilizado por personal debidamente formado para los fines mencionados.
Se recomienda seguir el procedimiento descrito a continuación.
6
Para uso diagnóstico in vitro
Código de producto: FK014.1,
FK014.2,
FS014._
Fabricante:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, Reino Unido.
www.bindingsite.co.uk
The Binding Site sucursal en España,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
e-mail: [email protected]
web: www.bindingsite.es
7
8
USO PREVISTO
Este producto se utiliza para el cribado y la titulación de autoanticuerpos circulantes en suero humano
a modo de ayuda en el diagnóstico y tratamiento de varias enfermedades autoinmunes. Los cuatro
principales autoanticuerpos detectados son: anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos
antimitocondriales (AMA), anticuerpos antimúsculo liso (ASMA) y anticuerpos anticélulas parietales
gástricas (AGPCA).
2
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para el cribado y la titulación de
autoanticuerpos circulantes en suero. En general, se prefieren las secciones de tejido animal, por
ejemplo de rata, a otros substratos utilizados habitualmente, incluidos los preparados de células y las
secciones de tejido humano; esto se debe principalmente a la ausencia de interferencias de
anticuerpos anti-HLA y/u otros grupos sanguíneos. El uso de dos tejidos diferentes (riñón y estómago)
permite identificar más fácilmente los autoanticuerpos comparando los resultados obtenidos con cada
tejido.
Determinados autoanticuerpos se asocian con varias enfermedades distintas. Los ANA casi siempre
están presentes en el lupus eritematoso sistémico (LES) pero también se encuentran con frecuencia
en pacientes con enfermedades reumatoides y del tejido conjuntivo. Los AMA normalmente están
presentes en la cirrosis biliar primaria, pero también pueden detectarse en pacientes con otras
enfermedades hepáticas. Los ASMA se asocian frecuentemente con la hepatitis crónica activa y la
cirrosis biliar primaria, pero también se detectan a concentraciones bajas en muchas otras
enfermedades. Los AGPCA están presentes en el suero de la mayoría de pacientes con anemia
perniciosa. En el apartado 9, se proporciona una descripción más detallada sobre las enfermedades
con las que se asocian los autoanticuerpos (ref. 1-9).
3
PRINCIPIO
Se utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta en la que las muestras de paciente y los
controles correspondientes se incuban con los portaobjetos de substrato. Los anticuerpos no reactivos
se eliminan mediante lavado y, a continuación, se aplica un conjugado adecuado marcado con
fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediante lavado y los portaobjetos se examinan con
un microscopio de fluorescencia. Las muestras positivas producen una fluorescencia de color verde
claro que corresponde a las áreas de la sección a las que se ha unido el autoanticuerpo.
4
4.1
METODOLOGÍA
8.1
Materiales suministrados
8.1.1
Kit para 50 ensayos, FK014.1
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat Kidney, Stomach Slide – (5-well) (portaobjetos con riñón y estómago de rata, 5
pocillos)
1 x 1mL ANA Positive Control (control positivo ANA, prediluido)
1 x 1mL Negative Control (control negativo, prediluido)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (control positivo mitocondrial, prediluido)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (control positivo de músculo liso, prediluido)
1 x 6,2mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC (conjugado FITC AFF anti-IgG humana
(H+L))
1 x 3mL 1% Evans Blue (azul de Evans al 1%)
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (concentrado PBS x 20)
1 x 3mL Mounting Medium (medio de montaje)
20 x Blotters (material absorbente)
10 x Coverslips (cubreobjetos, 22 x 70mm)
1 x folleto de instrucciones
8.1.2
Kit para 250 ensayos, FK014.2
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat Kidney, Stomach Slide – (10-well) (portaobjetos con riñón y estómago de rata,
10 pocillos)
1 x 1mL ANA Positive Control (control positivo ANA, prediluido)
1 x 1mL Negative Control (control negativo, prediluido)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (control positivo mitocondrial, prediluido)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (control positivo de músculo liso, prediluido)
1 x 15,5mL Anti human IgG (H+L) AFF FITC (conjugado FITC AFF anti-IgG humana
(H+L))
1 x 3mL 1% Evans Blue (azul de Evans al 1%)
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (concentrado PBS x 20)
1 x 10mL Mounting Medium (medio de montaje)
50 x Blotters (material absorbente)
25 x Coverslips (cubreobjetos, 22 x 70mm)
1 x folleto de instrucciones
8.1.3
FS014.1, FS014.2
1.
2.
10 x portaobjetos de 5 pocillos y 25 x portaobjetos de 10 pocillos, respectivamente
1 x folleto de instrucciones
8.2
Materiales adicionales necesarios
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
Agua destilada para diluir el concentrado de PBS.
Envase para el tampón PBS.
Micropipetas y puntas desechables para aplicar las muestras de paciente.
Cámara húmeda para las fases de incubación (p.ej. Cámara de Coloración Magnética,
Código BD010).
Microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación de 495nm y un filtro barrera de
515nm.
Frasco comprimible de plástico para lavado inicial en PBS.
Si sólo se utilizan portaobjetos, pueden adquirirse los siguientes componentes
adicionales a The Binding Site: PBS (CON 3.3), control negativo (CON 92), control
homogéneo ANA (FA105), control positivo mitocondrial (FA128), control positivo de
músculo liso (FA134), FITC AFF anti-IgG humana (H+L) (FA003), medio de montaje
(CON 195) y azul de Evans al 1% (CON 93).
2.
3.
4.
5.
6.
8.2.5
8.2.6
8.2.7
REACTIVOS
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Las muestras de sangre deben obtenerse mediante venipunción, dejando que se coagulen de forma
natural, y el suero debe separarse lo antes posible para evitar hemólisis. El suero puede conservarse
a 2-8°C durante un máximo de 7 días antes del ensayo (ref. 10), o para periodos más largos, distribuir
el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. NO congelar y descongelar el
suero más de una vez. Evitar el uso de sueros lipémicos, hemolizados o contaminados con microbios,
puesto que puede dar lugar a títulos reducidos o patrones de tinción poco claros.
2.
3.
4.
5.
6.
1
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los portaobjetos y kits no abiertos deben almacenarse a una temperatura de 2-8°C y pueden utilizarse
hasta la fecha de caducidad indicada. NO CONGELAR. Tras extraer los portaobjetos de la bolsa de
aluminio, deben utilizarse inmediatamente. El tampón PBS diluido puede almacenarse como máximo
durante 1 mes a una temperatura de 2-8°C. El conjugado FITC debe protegerse de la luz solar,
fluorescente o ultravioleta siempre que sea posible. Todos los reactivos deben almacenarse a una
temperatura de 2-8°C.
Secciones de riñón y estómago de rata en portaobjetos de 5 ó 10 pocillos.
Sólo kits.
4.2
Suero de control homogéneo ANA con azida sódica al 0,099%. Prediluido y listo para
su uso.
4.3
Suero de control negativo, universalmente negativo para todos los autoanticuerpos.
Contiene azida sódica al 0,099%. Prediluido y listo para su uso.
4.4
Anti-IgG humana en oveja purificada por afinidad (H+L) con isotiocianato de
fluoresceína. Contiene azida sódica al 0,099%. Prediluido y listo para su uso.
8.3.1
Medio de montaje: Retirar el medio de montaje del refrigerador para que alcance la
temperatura ambiente (18-28°C) antes de su uso.
4.5
Suero de control positivo mitocondrial con azida sódica al 0,099%. Prediluido y listo
para su uso.
8.3.2
4.6
Suero de control positivo de músculo liso con azida sódica al 0,099%. Prediluido y
listo para su uso.
Dilución de concentrado de PBS. Diluir el concentrado de PBS con agua destilada (1
volumen de concentrado de PBS + 19 volúmenes de agua destilada) y mezclar. La
solución PBS se utiliza para diluir las muestras de paciente y como tampón de lavado.
8.3.3
4.7
Azul de Evans al 1%, como contratinción opcional.
4.8
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), proporcionada a una concentración x20
en forma líquida.
Dilución de muestras de paciente
Screening: Diluir las muestras de paciente en 1/20 añadiendo 10µL de suero a 190µL
de tampón PBS.
Titulación: Realizar diluciones seriadas de las muestras positivas con el tampón PBS
(p.ej. 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, etc.). Por ejemplo, tomar 100µL de la dilución 1/20,
mezclar con 100µL de PBS para obtener una dilución 1/40. Repetir la operación para
otras diluciones.
8.3.4
Portaobjetos de substrato. Dejar que los portaobjetos de substrato alcancen la
temperatura ambiente (18-28°C) antes de retirarlos de las bolsas. Etiquetar los
portaobjetos adecuadamente, colocarlos en la cámara húmeda y añadir una gota de
cada control positivo y negativo a los pocillos correspondientes. Añadir 50µL de
muestras de paciente diluidas a los pocillos restantes.
8.3.5
Incubación de portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 20 minutos en una cámara
húmeda a temperatura ambiente (18-28°C).
8.3.6
Lavado con PBS. Retirar los portaobjetos de la cámara húmeda y aclararlos
brevemente con un frasco comprimible de PBS. No dirigir directamente el chorro a los
4.9
Material absorbente, para secar los portaobjetos tras el lavado.
4.10
Medio de montaje, con un agente antidecoloración (DABCO 1,4 diazabiciclo [2.2.2]
octano).
4.11
Cubreobjetos.
5
PRECAUCIÓN
El suero de donantes humanos suministrado (sólo kits) ha dado negativo en los análisis de antígeno
de superficie de la hepatitis B, anticuerpos del virus de la hepatitis C y virus de inmunodeficiencia
humana (VIH 1 y 2). Sin embargo, estos análisis no pueden garantizar la ausencia de agentes
infecciosos. Deben establecerse métodos de manipulación y eliminación adecuados para todo el
8.3
Procedimiento de ensayo
Control de calidad
Deben utilizarse controles positivos y negativos cada vez que se analice un lote de
muestras.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 7 of 10
pocillos. Colocar los portaobjetos en una bandeja, sumergirlos en PBS y agitar durante
5-10 minutos.
Adición de conjugado fluorescente. Eliminar el exceso de PBS y secar el contorno de
los pocillos con el material absorbente proporcionado. Volver a colocar los portaobjetos
en la cámara húmeda y cubrir inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado
fluorescente. NO DEJAR LOS POCILLOS DESCUBIERTOS DURANTE MÁS DE 15
SEGUNDOS. El secado del substrato afecta negativamente a los resultados.
8.3.7
8.3.8
Incubación de portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 20 minutos en una cámara
húmeda a oscuras y a temperatura ambiente (18-28°C).
8.3.9
Lavado con PBS. Volver a lavar, tal como se describe en el paso 8.3.6. Contratinción
opcional: añadir 2-3 gotas de azul de Evans al 1% por cada 100mL de PBS antes de
proceder a la inmersión de los portaobjetos.
8.3.10
Montaje con cubreobjetos. Retirar uno a uno los portaobjetos de la solución PBS de
lavado. Secar rápidamente el contorno de los pocillos y añadir una gota de medio de
montaje a cada pocillo. Colocar con cuidado el portaobjetos en el cubreobjetos,
evitando que se formen burbujas de aire. No intentar eliminar las burbujas que se
hayan podido formar. Eliminar el exceso de medio de montaje del borde del
cubreobjetos.
Examen de portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos pueden
almacenarse un máximo de 3 días a 2-8°C, en un lugar oscuro, sin que se produzca
una pérdida de fluorescencia significativa.
8.3.11
9
10.4
La calidad de la fuente de luz, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia
influirá en la sensibilidad del ensayo. El funcionamiento del microscopio depende de un
correcto mantenimiento, especialmente del enfoque de la lámpara de vapor de mercurio
y el reemplazo de la misma una vez transcurrido el período de tiempo recomendado.
10.5
Los autoanticuerpos pueden ser activados o inducidos por un gran número de
fármacos, incluidos los anticonceptivos y antibióticos orales.
10.6
Debido a la reducida distancia entre pocillos de los portaobjetos de 10 pocillos, puede
que se produzca contaminación cruzada de muestras y controles. Deben tomarse
precauciones especiales, sobre todo en las etapas de lavado, para evitar que esto
ocurra.
10.7
No se ha evaluado la idoneidad del uso con reactivos IFA de otros fabricantes, sin
embargo, no debe excluirse su empleo.
FDA (USA) Advertencia: ver la primera página de la metódica en inglés.
11
11.1
ANTICUERPO
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Control de calidad
El control positivo ANA debe presentar un patrón homogéneo de color verde claro fluorescente en los
núcleos de las células. El control positivo mitocondrial debe presentar una tinción de color verde claro
fluorescente de los túbulos renales y las células parietales gástricas. El control positivo de músculo
liso debe presentar una tinción de color verde claro fluorescente de la capa muscular del estómago. El
control negativo debe mostrar una tinción de color verde pálido en todos los tejidos, pero sin
fluorescencia perceptible.
Si el aspecto de los controles no es el que se describe, el ensayo debe considerarse inválido y, por
consiguiente, deberá repetirse.
9.2
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
ANA
AMA
ASMA
NEGATIVOS
Los resultados negativos muestran una tinción de color verde pálido en todas las secciones, sin
fluorescencia perceptible. Las reacciones leves sospechadas deben repetirse pero con una dilución
superior (por ejemplo, 1/40). Si el resultado del ensayo repetido es igual al anterior, el ensayo debe
considerarse negativo.
ARA
AGPCA
POSTITIVOS
Anticuerpos antinucleares (ANA)
Los ANA tiñen los núcleos de los siguientes elementos: túbulos distales y proximales del riñón, células
gástricas y parietales y células principales. Casi todos los pacientes con LES presentan ANA en el
suero, pero los ANA también pueden encontrarse en varias enfermedades del tejido conjuntivo,
incluida la artritis reumatoide. Los ANA también pueden estar presentes en la hepatitis crónica activa y
la cirrosis biliar primaria, así como en respuesta a determinados tratamientos farmacológicos.
Puede obtenerse información adicional mediante la interpretación de los patrones nucleares de ANA
obtenidos (véase a continuación). Se recomienda titular todas las muestras ANA positivas hasta el
punto final para garantizar la detección de las posibles reacciones mixtas que puedan haberse pasado
por alto anteriormente. También se recomienda efectuar otro análisis de dichas muestras para
detectar los autoanticuerpos contra el ADN bicatenario y los antígenos nucleares extraíbles (ENA).
PATRÓN
Homogéneo
Periférico
(Borde)
Moteado
ANTÍGENOS COMUNES
IMPLICADOS
ADN bicatenario, histonas
ADN bicatenario y nativo
Antígenos nucleares
extraíbles
Ribonucleoproteína
Scl-70
SSB
4-6S RNA
Nucleolar
11.2
REFERENCIAS
2
7
2
8
9
LES
Enfermedad mixta del tejido
conjuntivo
Otras enfermedades autoinmunes
(AR, esclerodermia, síndrome de
Sjögren, dermatomiositis)
Cirrosis biliar primaria
Hepatitis crónica
Cirrosis biliar primaria
Enfermedad de Crohn
Enfermedad celíaca
Dermatitis herpetiforme
Anemia perniciosa
PORCENTAJE DE
APARICIÓN
99
90
REFERENCIAS
15-20
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
4
3
Estudio comparativo
Se llevó a cabo un estudio comparativo en 96 muestras clínicas con el uso de este kit y un método de
referencia comercialmente disponible. Noventa y tres de las 96 muestras analizadas obtuvieron
resultados idénticos con los dos métodos. Para los patrones descritos en el apartado 9.2, la
sensibilidad relativa osciló entre el 89% y el 100%, y la especificidad relativa fue del 100%. Para las
muestras que difirieron, se obtuvo una tinción positiva reducida ANA o SMA en cada caso sólo con el
método de referencia, lo que sugiere que estas muestras estuvieron en el límite respecto al patrón
específico y/o que existen ligeras diferencias de sensibilidad entre los dos métodos.
12
1.
2.
ENFERMEDADES ASOCIADAS
3.
LES
Artritis reumatoide (AR)
Enfermedad mixta del tejido conjuntivo
Lupus inducido por fármacos
LES
5.
Esclerodermia
Síndrome de Sjögren
Enfermedad mixta del tejido conjuntivo
LES
8.
Esclerodermia
Síndrome de Sjögren
LES, AR y esclerosis sistémica
progresiva
PORCENTAJE DE APARICIÓN
0-2
0-8
3
5
10-15 (en ancianos)
ANÓMALOS:
Interpretación de los resultados
Los resultados positivos muestran una fluorescencia significativa en áreas específicas de tejido y
proporcionan uno o varios de los patrones siguientes:
Resultados previstos
NORMALES:
RESULTADOS
9.1
VALORES PREVISTOS Y CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ESPECÍFICO
4.
6.
7.
9.
10.
13
REFERENCIAS
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases
and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical
implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed.
Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases,
Imunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut
14, 311-315.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human sera
by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
Bird, A G (1990). Clnical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H.
Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pp175-194.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward,
GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
Los patrones de tinción de los autoanticuerpos específicos de tejido incluyen:
ANTICUERPO
TEJIDO ASOCIADO
Anticuerpos
antimitocondriales
(AMA)
Citoplasma de los túbulos
distales y los túbulos
proximales del riñón (en
menor medida)
Capas musculares
(estómago)
Anticuerpos
antimúsculo liso
(ASMA)
Anticuerpos
anticélulas parietales
gástricas (AGPCA)
Anticuerpos
antirreticulina (ARA)
Capas musculares de las
arteriolas (otros tejidos)
Células parietales (estómago)
Fibras peritubulares y
cápsulas de Bowman (riñón)
PRINCIPALES ENFERMEDADES
ASOCIADAS
Cirrosis biliar primaria y otras
hepatopatías
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
Hepatitis crónica activa
13.6
13.7
13.8
Anemia perniciosa
13.9
13.10
13.11
13.12
Dejar que el medio de montaje alcance la temperatura ambiente.
Diluir PBS con agua destilada.
Diluir el suero de paciente en 1/20 con PBS.
Dejar que los portaobjetos de substrato alcancen la temperatura ambiente (18-28°C).
Aplicar 50µL de controles positivos y negativos y suero de paciente diluido a los pocillos
correspondientes.
Incubar en una cámara húmeda durante 20 minutos.
Lavar durante 5-10 minutos en PBS.
Secar con material absorbente el contorno de los pocillos y cubrirlos inmediatamente
con una gota de conjugado.
Incubar tal como se describe en el paso 13.6.
Lavar tal como se describe en el paso 13.7.
Montar.
Examinar el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.
Enfermedad de Crohn
Enfermedad celíaca
Dermatitis herpetiforme
Nota: cada laboratorio debe establecer el valor límite en el que se considera que un resultado positivo
es clínicamente significativo.
10
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
10.1
Este ensayo por sí solo no es válido para el diagnóstico. También deben tenerse en
cuenta los demás factores, incluidos la historia clínica de los pacientes y otros
resultados serológicos o biópsicos.
10.2
A menudo, los patrones de tinción cambian cuando la muestra se titula hasta el punto
final. Esto normalmente se debe a la presencia de más de un autoanticuerpo, sobre
todo en el caso de los ANA.
10.3
Un resultado negativo con este kit puede deberse a una remisión de la enfermedad o a
la presencia de autoanticuerpos no detectables mediante esta técnica.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 8 of 10
6
KIT/VETRINI PER IMMUNOFLUORESCENZA
- SEZIONI DI RENE, STOMACO DI RATTO
I kit o i vetrini non aperti devono essere conservati a 2-8°C e possono essere usati fino alla data
di scadenza indicata. NON CONGELARE. Una volta estratti dal loro involucro, i vetrini devono
essere usati immediatamente. Il tampone PBS diluito può essere conservato fino ad un mese a
2-8°C. Il coniugato FITC dovrebbe essere mantenuto al riparo dalla luce solare, fluorescente o
ultravioletta per quanto possibile. Tutti i reagenti devono essere conservati a 2-8°C.
Italian
Per uso diagnostico in vitro
Codice Prodotto: FK014.1
FK014.2
FS014._
Prodotto da:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
7
8
Materiali forniti
8.1.1
Kit per 50 test FK014.1
1.
2.
10 x Rat kidney, stomach slide (5-well) (Vetrini da 5 pozzetti con rene, stomaco di ratto)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA omogeneo. Prediluito, pronto
all’uso)
1 x 1mL Negative Control (Controllo negativo. Prediluito, pronto all’uso)
1x1mL Mitochondrial Positive Control (Controllo positivo anti mitocondrio. Prediluito,
pronto all’uso)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controllo positivo anti muscolatura liscia.
Prediluito, pronto all’uso)
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Coniugato anti-IgG (H+L) umane FITC
purificato per affinità)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans all’1%)
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS concentrato x20)
1 x 3mL Mounting Medium (Soluzione di montaggio)
20 x Blotters (Carte assorbenti)
10 x Coverslips (Vetrini coprioggetti, 22 x 70mm)
1 scheda tecnica
5.
INDICAZIONI
Questo prodotto è utilizzato per lo screening e la titolazione degli autoanticorpi circolanti nel
siero umano come supporto nella diagnosi e nel trattamento di varie malattie autoimmuni. I
quattro autoanticorpi principali individuati sono gli antinucleo (ANA), gli antimitocondrio
(AMA), gli anti-muscolatura liscia (ASMA) e gli anti-cellule parietali gastriche (AGPCA).
METODOLOGIA
8.1
6.
1
PRELIEVO CAMPIONI
I prelievi di sangue devono essere effettuati per via venosa. Lasciare che il sangue si coaguli in
modo naturale. Separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l’emolisi. Il siero può
essere conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio (rif. 10), oppure per
periodi più lunghi, aliquotare e conservare a -20°C o temperature inferiori. NON congelare e
scongelare più di una volta. Evitare l’uso di sieri lipemici, emolizzati o contaminati da batteri in
quanto si potrebbero avere titoli più bassi o pattern di colorazione non chiari.
3.
4.
Telefono: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
CONSERVAZIONE E STABILITA’
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.2
Kit per 250 test FK014.2
1.
L’immunofluorescenza indiretta è il metodo di riferimento per lo screening e la titolazione degli
autoanticorpi circolanti nel siero. Le sezioni di tessuto di origine animale, come il ratto, generalmente
sono preferibili ad altri substrati comunemente usati come le sezioni di tessuto umano e i preparati
cellulari; ciò è dovuto principalmente all’assenza d’interferenza con il sistema HLA e/o con gli altri
anticopri diretti contro i gruppi sanguigni. L’utilizzo di due diversi tessuti (rene e stomaco) permette
d’identificare più facilmente gli autoanticorpi confrontando i risultati ottenuti con ciascun tessuto.
3.
4.
Determinati autoanticorpi sono associati a diverse patologie. Gli ANA sono quasi sempre presenti nel
lupus erimatoso sistemico (LES), ma si osservano anche comunemente nei pazienti affetti da malattie
reumatoidi e del tessuto connettivo. Gli AMA si osservano con frequenza nelle cirrosi biliari primitive
ma si possono anche individuare nei pazienti con altre malattie epatiche. Gli ASMA sono
frequentemente associati all’epatite cronica attiva e alla cirrosi biliare primitiva, ma sono anche
identificabili a basse concentrazioni in diverse altre condizioni. Gli AGPCA sono presenti nel siero della
maggior parte dei pazienti affetti da anemia perniciosa. Una descrizione più particolareggiata
dell’associazione degli autoanticorpi con certe patologie è riportata al punto 9 (rif. 1-9).
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat kidney, stomach slide (10-well) (Vetrini da 10 pozzetti con rene, stomaco di
ratto)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA omogeneo. Prediluto, pronto
all’uso)
1 x 1mL Negative Control (Controllo negativo. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Controllo positivo anti mitocondrio, Prediluito,
pronto all’uso)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controllo positivo anti muscolatura liscia.
Prediluito, pronto all’uso)
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Coniugato anti-IgG (H+L) umane FITC
purificato per affinità)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans all’1%)
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS concentrato x20)
1 x 10mL Mounting Medium (Soluzione di montaggio)
50 x Blotters (Carte assorbenti)
25 x Coverslips (Vetrini coprioggetti, 22 x 70mm)
1 scheda tecnica
8.1.3
FS014.1, FS014.2
1.
FS014.1 - 10 vetrini da 5 pozzetti con rene, stomaco di ratto
FS014.2 - 25 vetrini da 10 pozzetti con rene, stomaco di ratto
1 scheda tecnica
2
3
2.
RIASSUNTO E DESCRIZIONE
PRINCIPIO
Il kit usa una tecnica di immunofluorescenza indiretta in cui i campioni dei pazienti e i relativi controlli
sono incubati sui vetrini con substrato. Gli anticorpi non specifici sono eliminati con il lavaggio, quindi
viene applicato un coniugato fluorescente specifico. Il coniugato non legato viene eliminato con il
lavaggio. Per la lettura dei vetrini si usa un microscopio a fluorescenza. I campioni positivi presentano
una fluorescenza di colore verde che corrisponde alle aree della sezione dove l’autoanticorpo si è
legato.
4
4.1
REAGENTI
4.2
Siero di controllo positivo ANA omogeneo contenente lo 0,099% di sodio azide.
Prediluito, pronto all’uso.
4.3
Siero di controllo negativo universalmente negativo per tutti gli autoanticorpi, contenente
lo 0,099% di sodio azide. Prediluito, pronto all’uso.
4.4
Antisiero di pecora anti-IgG umane purificato per affinità (H+L) coniugato con FITC
(isotiocianato di fluoresceina) contenente lo 0,099% di sodio azide. Prediluito, pronto
all’uso.
4.5
Siero di controllo positivo anti mitocondrio, contenente lo 0,099% di sodio azide.
Prediluito, pronto all’uso.
4.6
Siero di controllo positivo anti muscolatura liscia, contenente lo 0,099% di sodio azide.
Prediluito, pronto all’uso.
4.7
Blu di Evans all’1% come colorazione di contrasto opzionale.
4.8
Tampone PBS, soluzione liquida concentrata (x20).
4.9
Carte assorbenti, per asciugare il vetrino dopo il lavaggio.
4.10
Soluzione di montaggio, contenente un agente ‘anti-affievolimento’ (DABCO) 1, 4
diazodiciclo [2.2.2] ottano.
5
6.
2.
8.2
Materiale necessario ma non fornito
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
Acqua distillata per diluire il PBS.
Recipiente per contenere il PBS.
Micropipette e puntali monouso per dispensare i campioni dei pazienti.
Camera umida per le fasi d’incubazione (p.e. Camera di Colorazione Magnetica, Codice
BD010).
Microscopio a fluorescenza con filtro a 495nm (filtro di eccitazione) e filtro a 515nm
(filtro di barriera).
Bottiglia di plastica a pressione per lavaggio iniziale in PBS.
Se si usano solo i vetrini, è possibile ottenere da The Binding Site alcuni componenti
aggiuntivi: il PBS (CON 3.3), il controllo negativo (CON 92), il controllo positivo
omogeneo ANA (FA105), il controllo positivo anti mitocondrio (FA128), il controllo
positivo anti muscolatura liscia (FA134), il coniugato FITC (FA003), la soluzione di
montaggio (CON 195), la soluzione Blu di Evans all’1% (CON 93).
8.2.5
Sezioni di rene, stomaco di ratto su vetrini da 5 o 10 pozzetti.
I kit contengono:
4.11
5.
8.2.6
8.2.7
8.3
8.3.1
Soluzione di montaggio: Togliere la soluzione di montaggio dal frigorifero per portarla a
temperatura ambiente (18-28°C) prima dell’uso.
8.3.2
Diluire il PBS concentrato. Diluire il PBS con acqua distillata (1 parte di PBS + 19 parti
di acqua distillata) e miscelare. Il PBS viene usato per diluire i campioni dei pazienti e
come tampone di lavaggio.
8.3.3
Diluire i campioni dei pazienti.
Screening: Diluire i campioni 1/20 aggiungendo 10µL di siero in 190µL di PBS.
Titolazione: Effettuare diluizioni seriali dei campioni positivi con PBS (p.e. 1/20, 1/40,
1/80, 1/160 e 1/320 ecc.). Per esempio: Prendere 100µL della diluizione 1/20 e diluire
con 100µL di PBS per ottenere una diluizione 1/40. Ripetere questa procedura per
ulteriori diluizioni.
8.3.4
Vetrini con substrato. I vetrini devono raggiungere la temperatura ambiente (18-28°C)
prima di essere tolti dalla confezione. Etichettare correttamente i vetrini, metterli nella
camera umida e aggiungere una goccia di ciascun controllo positivo e negativo nei
rispettivi pozzetti. Aggiungere 50µL dei campioni diluiti nei pozzetti rimanenti.
8.3.5
Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 20 minuti in una camera umida a temperatura
ambiente (18-28°C).
8.3.6
Lavaggio PBS. Togliere i vetrini dalla camera umida e risciacquarli brevemente con il
PBS in una bottiglia di plastica a pressione. Non spruzzare direttamente nei pozzetti.
Posizionare i vetrini in un rack e immergerli nel PBS, poi agitare per 5-10 minuti.
8.3.7
Aggiunta del coniugato fluorescente. Eliminare l’eccesso di PBS e asciugare intorno ai
pozzetti con le carte assorbenti fornite. Riportare i vetrini nella camera umida e coprire
immediatamente ogni pozzetto con una goccia di coniugato fluorescente. NON
LASCIARE I POZZETTI SCOPERTI PER OLTRE 15 SECONDI. L’essicatura del
substrato compromette seriamente i risultati.
8.3.8
Incubazione dei vetrini. Incubare i vetrini per 20 minuti in una camera umida a
temperatura ambiente (18-28°C) al buio.
Vetrini coprioggetti.
PRECAUZIONI
Tutti i sieri umani forniti nel kit sono stati sottoposti a screening per donatori, risultando negativi per
l’antigene di superficie dell’epatite B e per gli anticorpi verso i virus HIV1, HIV2 e HCV. Ciò nonostante,
questi test non possono garantire l’assenza di agenti infettivi. Devono essere stabiliti metodi di
trattamento e di eliminazione adeguati come per tutti i materiali potenzialmente infettivi e le procedure
devono essere eseguite soltanto da personale esperto ed autorizzato.
Il Blu di Evans e i controlli del kit contengono lo 0,099% di sodio azide come conservante e
devono essere trattati con cautela – non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le
mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici
esplosivi si possono formare con il rame e il piombo. Quando si procede all’eliminazione del
reagente, lavare con molta acqua i recipienti allo scopo di evitare l’accumulo di azide.
Il prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente formato. Si
raccomanda di attenersi rigorosamente alla procedura indicata.
Procedura
Controllo qualità
I controlli negativi e positivi devono essere usati ogni volta che sono dosati i campioni.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 9 of 10
8.3.9
Lavaggio con PBS. Lavare nuovamente come descritto nella fase 8.3.6. Colorazione di
contrasto opzionale. Aggiungere fino a 2 - 3 gocce di Blu di Evans all’1% per 100mL di
PBS prima di immergere i vetrini.
Montaggio con il vetrino coprioggetti. Rimuovere un vetrino alla volta dal lavaggio PBS.
Asciugare rapidamente intorno ai pozzetti e aggiungere una goccia di soluzione di
montaggio in ciascun pozzetto. Mettere con cura il vetrino sul vetrino coprioggetti,
evitando le bolle d’aria, ma se ci sono non tentare di rimuoverle. Rimuovere la soluzione
di montaggio in eccesso intorno al bordo del vetrino coprioggetti.
8.3.10
ANTICORPO
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Il controllo positivo ANA omogeneo deve presentare una fluorescenza color verde brillante nei
nuclei delle cellule. Il controllo positivo anti mitocondrio deve presentare una fluorescenza
verde brillante dei tubuli renali e delle cellule parietali gastriche. Il controllo positivo anti
muscolatura liscia deve presentare una fluorescenza verde brillante nello strato muscolare
dello stomaco. Il controllo negativo deve presentare una colorazione verde scura in tutti i
tessuti, senza fluorescenza visibile.
Se i controlli non risultano come sopra descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto.
DIAGNOSI CLINICA
ANA
LES
Connettiviti miste
Interpretazione dei risultati
AMA
ASMA
RISULTATO NEGATIVO
Si osserva una colorazione verde scuro in tutte le sezioni, senza fluorescenza visibile. Reazioni deboli
sospette devono essere ripetute ma aumentando il fattore di diluizione (p.e. 1/40). Se dopo avere
ripetuto il test, il risultato sembra uguale a quello iniziale, il test viene considerato negativo.
ARA
AGPCA
RISULTATO POSITIVO
Si osserva una fluorescenza significativa nelle zone tissutali specifiche che presentano uno o più dei
seguenti pattern:
Anticorpi Antinucleari (ANA)
Gli ANA colorano i nuclei delle seguenti cellule: cellule dei tubuli renali distali e prossimali, cellule
principali e parietali gastriche. Quasi tutti i pazienti affetti da LES hanno degli ANA nel loro siero, ma gli
ANA possono anche essere presenti in varie patologie del tessuto connettivo compresa l’artrite
reumatoide. Inoltre gli ANA si possono osservare nei casi di epatite cronica attiva, di cirrosi biliare
primitiva e in risposta a determinate terapie farmacologiche.
E’ possibile ottenere ulteriori informazioni interpretando i pattern dei nuclei degli ANA osservati nei test
(vedere qui di seguito). Si raccomanda di titolare tutti i campioni ANA positivi fino all’end-point per
garantire l’individuazione di eventuali reazioni miste che altrimenti potrebbero andare perse. Si
consiglia inoltre un’analisi supplementare di questi campioni per ricercare gli autoanticorpi diretti contro
il DNA a doppio filamento e gli antigenti nucleari estraibili (ENA).
PATTERN
Omogeneo
ANTIGENI COMUNI
COINVOLTI
dsDNA, istoni
Periferico (Bordo)
dsDNA/Nativo
Granulare
Antigeni nucleari estraibili
Ribonucleoproteina,
Scl-70,
SSB
4-6S RNA
Nucleolare
TESSUTO ASSOCIATO
12
1
2
LES
Artrite reumatoide (AR)
Connettiviti miste
Lupus farmaco-indotto
LES
4
Sclerodermia
Sindrome di Sjögren
Connnettiviti miste
LES
Sclerodermia
Sindrome di Sjögren
LES, AR e sclerosi sistemica
progressiva
5
6
7
8
9
10.
13
PRINCIPALI PATOLOGIE
ASSOCIATE
Cirrosi biliare primitiva
e altre patologie epatiche
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
Citoplasma dei tubuli distali
renali e dei tubuli prossimali
(in minor misura)
Anticorpi anti muscolatura
liscia (ASMA)
Strati muscolari (stomaco)
Strati muscolari arteriole (altri
tessuti)
Cellule parietali (stomaco)
Epatite cronica attiva
Fibre peritubulari e capsule
di Bowman (rene)
Morbo di Crohn
Morbo celiaco
Dermatite erpetiforme
Anemia perniciosa
Altre malattie autoimmuni
(AR, sclerodermia,
Sindrome di Sjögren,
dermatomiosite)
Cirrosi epatica primitiva
Epatite cronica
Cirrosi epatica primitiva
Morbo di Crohn
Morbo celiaco
Dermatite erpetiforme
Anemia perniciosa
Questo test da solo non permette la formulazione di una diagnosi. E’ necessario
prendere in considerazione tutti gli altri fattori compresa l’anamnesi clinica dei pazienti e
altri risultati sierologici o della biopsia.
10.2
I pattern di colorazione spesso variano quando un campione è titolato fino al suo endpoint. Ciò è dovuto di solito alla presenza di più di un autoanticorpo, soprattutto per gli
ANA.
10.3
Un risultato negativo con questo kit può essere dovuto ad una remissione della
patologia o alla presenza di autoanticorpi non identificabili con questa tecnica.
10.4
La fonte luminosa, i filtri e l’ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche
influiranno sulla sensibilità del test. La performance del microscopio è influenzata
notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla
sostituzione della lampada a vapori di mercurio dopo il periodo di tempo consigliato.
10.5
Gli autoanticorpi possono essere attivati o indotti da un’ampia varietà di farmaci
compresi contraccettivi orali e antibiotici.
10.6
Poiché sui vetrini con 10 pozzetti, questi ultimi sono a breve distanza l’uno dall’altro, è
possibile una contaminazione incrociata dei campioni e dei controlli. Bisogna fare
attenzione affinché ciò non si verifichi soprattutto nelle fasi di lavaggio.
10.7
L’idoneità all’uso del kit con reagenti IFA di altri fabbricanti non è stata valutata ma l’uso
con tali reagenti non deve essere necessariamente escluso.
RIFERIMENTO
4
3
15-20
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
13.9
13.10
13.11
13.12
BIBLIOGRAFIA
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and
probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid)
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& Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
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Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformis
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Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD
Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
SINTESI DELLA PROCEDURA
Portare il mezzo di montaggio a temperatura ambiente.
Diluire PBS con acqua distillata.
Diluire i sieri dei pazienti 1/20 con PBS.
Portare i vetrini a temperatura ambiente (18-28°C).
Applicare 50µL dei controlli positivi e negativi e dei sieri dei pazienti diluiti nei rispettivi
pozzetti.
Incubare in camera umida per 20 minuti.
Lavare per 5-10 minuti in PBS.
Asciugare bene intorno ad ogni pozzetto e coprire immediatamente ogni pozzetto con
una goccia di coniugato.
Incubare come nella fase 13.6 buio.
Lavare come nella fase 13.7.
Montare.
Leggere il vetrino con il microscopio a fluorescenza.
LIMITI DELLA PROCEDURA
10.1
PERCENTUALE
D’INSORGENZA
99
90
Studio comparativo
NB: Ogni laboratorio deve stabilire a che punto un risultato positivo è considerato clinicamente
significativo.
10
RIFERIMENTO
2
7
2
8
9
E’ stato eseguito uno studio comparativo su 96 campioni clinici utilizzando questo kit e un metodo di
riferimento disponibile sul mercato. 93 su 96 campioni dosati hanno fornito risultati identici con i due
metodi. Per i pattern descritti al punto 9.2, la sensibilità relativa variava dall’89 al 100%, la specificità
relativa era del 100%. Per i campioni che hanno dato risultati diversi, è stata ottenuta una debole
colorazione ANA o SMA positiva in ciascun caso soltanto con il metodo di riferimento, suggerendo così
che tali campioni erano borderline per il determinato pattern e/o che esistevano delle leggere
differenze di sensibilità tra i due metodi.
3
Anticorpi
anti mitocondrio (AMA)
Anticorpi anti cellule parietali
gastriche (AGPCA)
Anticorpi anti reticolina
(ARA)
11.2
PATOLOGIA ASSOCIATA
I pattern di colorazione degli autoanticorpi specifici dei tessuti comprendono:
ANTICORPO
PERCENTUALE DI INSORGENZA
0-2
0-8
3
5
10-15 (in pazienti anziani)
VALORI ANORMALI
Controllo qualità
9.2
Risultati attesi
VALORI NORMALI
RISULTATI
9.1
VALORI ATTESI E PRESTAZIONI
11.1
Lettura dei vetrini con il microscopio a fluorescenza. I vetrini possono essere conservati
a 2-8°C al buio fino a 3 giorni, senza una significativa perdita di fluorescenza.
8.3.11
9
11
FDA (USA) Avvertenze: vedere la pagina iniziale delle instruzioni per l’uso in Inglese.
Insert code: CIN019, Version: 17th September 2007, Page 10 of 10

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