Diapositiva 1 - Dipartimento di Biotecnologie, chimica e farmacia

Elementi di Micologia
I° anno - Laurea Magistrale Farmacia - 2012-2013
Jean-Denis Docquier
Laboratorio di Fisiologia e Biotecnologia dei Microrganismi
Dipartimento di Biologia Molecolare
Policlinico "Le Scotte", Viale Bracci, II piano, V lotto
Tel. 0577 23 3134
[email protected]
Recupero lezioni Prof. Zazzi:
3 giugno, 9-11, aula 9
4 giugno, 9-11, aula 12
Appelli di esame (aula informatica):
19 giugno, 9-14.
4 luglio, 9-14.
19 luglio, 9-14.
5 settembre, 9-14.
23 settembre, 9-14.
 Completa mancanza di tessuti differenziati e elementi
conduttori
 Sistema riproduttivo attraverso elementi detti spore e non
attraverso uno stadio embrionale come avviene per piante e
animali
 eucarioti
 immobili
 chemiosintetici
 eterotrofi (mancano di clorofilla
e sono dipendenti dei composti
organici per la nutrizione)
 parete cellulare rigida
 uni o pluricellulari
 si riproducono per mezzo di
spore
 aerobi (facoltativi)
 parassiti, saprofiti e simbionti
Ubiquitari in natura:
• negli strati superficiali del suolo
• come commensali di animali e piante
TALLO: corpo vegetativo di un fungo
Penicillium italicum: muffa verde-blu che fa marcire le arance
Penicillum notatum e Penicillium chrysogenum, ed un suo metabolita, la
penicillina, hanno consentito a Fleming nel 1928 di anticipare l’era
antibiotica
Un lievito, Saccharmyces cerevisiae, è stato utilizzato fin dai
tempi più remoti per processi alimentari come la lievitazione
del pane, la fermentazione del vino e della birra
Penicillium camemberti e P. rocqueforti giocano un ruolo fondamentale
nella manufattura dei formaggi di tipo Camembert, Brie e Roquefort
Il Tolypocladium niveum produce clicloserina, un immunosoppressore
utilizzato nella terapia della sclerosi e nei trapianti e alcuni lieviti
vengono utilizzati in ingegneria genetica per la produzione di insulina
Aggregati
PLURICELLULARI
Funghi filamentosi
o
MUFFE
Ife settate
Ife non settate
IFE
L’insieme delle IFE viene detto
MICELIO
Micelio AEREO:
Strutture specializzate alla
riproduzione
Conferisce l’aspetto tipico
della colonia
Micelio VEGETATIVO:
Assorbimento di materiale nutritizio dal terreno
UNICELLULARI
Miceti lievitiformi
o
LIEVITI
Dimensioni
> cellula batterica
< cellula animale
LA CELLULA FUNGINA
reticolo endoplasmico
complesso di Golgi
membrana plasmatica
contenente ERGOSTEROLO
mitocondri
Capsula
polisaccaridica
(in alcuni casi)
PARETE CELLULARE
RIGIDA
nucleo compartimentato
con cromosomi lineari
Mannoproteine
b–(1,6)-glucano
b–(1,3)-glucano
Chitina
(poli-NAG)
Membrana
plasmatica
Citoplasma
ergosterolo
 Contiene ergosterolo
 Caratterizza la forma del micete
Struttura pluristratificata
in livelli di
conmetaboliti con l’ambiente esterno
 Controlla lo scambio
 Proprietà antigeniche
particolari composizioni chimiche
 Coinvolta nella sintesi della
parete
cellulare
Media
interazioni con la cellula ospite
I miceti si riproducono per mezzo di strutture specializzate: SPORE o CONIDI
Due modalità di riproduzione:
 sessuata
 asessuata
Le due forme possono essere presenti, escludersi o
alternarsi nel ciclo vitale di un fungo con ritmi e frequenze
diversi nelle varie specie
Riproduzione per
GEMMAZIONE
(budding yeasts):
BLASTOGONIA
Sistema in cui le cellule figlie
compaiono come protuberanze
dalla cellula madre dalla quale poi
si distaccano diventando
autonome, diversa dalla scissione
perché avviene una ripartizione
diseguale del citoplasma
Attraverso un processo mitotico vengono
prodotte strutture specializzate
denominate spore o conidi in grado di
generare un nuovo individuo
I conidi hanno il vantaggio di essere
molto leggeri, altamente resistenti,
facile disseminazione ambientale
Accrescimento longitudinale delle ife
POTENZIALITA’ DI ESPANSIONE INFINITA
Le spore asessuate possono essere:
 Conidiospore: i conidi
si distaccano da un
conidioforo posto su
una ifa aerea
 Sporangiospore: le
spore vengono
prodotte all’interno di
un organo detto
sporangioforo
 Artrospore: le spore
sono prodotte per
frammentazione delle
ife vegetative
La diversa morfologia dei conidi
permette il riconoscimento delle
varie specie di funghi filamentosi
Subordinata alla produzione di milioni di spore
diffuse attraverso vento, acqua o insetti
La spora sessuale di un determinato sesso nelle condizioni più
favorevoli germina formando un filamento di cellule detto
micelio primario
Per poter completare il ciclo biologico e creare il micelio
secondario l’ifa primaria generata da una spora con carica
“maschile” si unisce una a carica sessuale opposta per formare il
micelio secondario che genererà i corpi fruttiferi
Spore sessuali:
Zigospore
Basidiospore
Ascospore
Caratteristica peculiare di alcuni miceti patogeni
Capacità, reversibile, di presentarsi morfologicamente distinti
nella forma parassitaria o tessutale, in genere lievitiforme, e nella
forma colturale o vegetativa, in genere filamentosa
La conformazione è riferibile a:
 scarso adattamento dei miceti alle condizioni ambientali (es.
temperatura)
 meccanismi di regolazione genica esercitati da temperatura,
concentrazione ioni, variazioni pH
Abituali saprofiti, l’infezione rappresenta un evento accidentale
Molti prodotti considerati fattori di virulenza sono
funzionali a scopi metabolici e riproduttivi
Nelle muffe il meccanismo principale è l’alta capacità di penetrazione nei
tessuti e la capacità di adattarsi alle condizioni avverse dei tessuti parassitati
Resistenza alla fagocitosi:
 dimensioni del tallo fungino
 capacità di interferire con l’attività fagacitaria per presenza di
strutture cellulari antifagocitarie: mannani (C. albicans), a 1-3
glucano (Blastomyces dermatitidis, H. capsulatum, P. brasiliensis),
capsula (Cryptococcus neoformans), recettori del complemento che
inibiscono l’opsonizzazione
Adesività:
 meccanismi non specifici: forza idrofobiche, cariche elttrostatiche
 meccanismi specifici: interazione tra adesine e recettori (chitina,
glucani, mannani: possibili adesine)
Pleomorfismo: pluralità di forme (dimorfismo)
Produzione di enzimi idrolitici: proteasi (C. albicans), fosfolipasi,
lipasi, serinproteasi (Aspergillus spp.), cheratinasi (dermatofiti),
fenolo-ossidasi (Cryptococcus neoformans)
Produzione di tossine: alcune interferiscono con la risposta
immunitaria
 Candida albicans: canditossina, tossine a basso pm
 Aspergillus spp.: aflatossina, gliotossina, fumigatossina,
restrictocina
Barriere meccaniche
Sostanze antimicrobiche non specifiche
Fagocitosi e killing intracellulare
Immunità umorale e cellulo-mediata
Un numero limitato di funghi (generalmente dimorfici) possono
causare malattia in soggetti altrimenti sani
La maggior parte delle infezioni da funghi sono lievi ed autolimitanti
Le specie fungine esplicano la patogenicità attraverso:
 Parassitismo diretto (micosi)
 Produzione di micotossine (intossicazioni  micotossicosi)
 Intossicazioni alimentari da ingestione di funghi macroscopici
velenosi (micetismo)
 Reazioni allergiche
Le micotossine possono esercitare effetti tossici acuti o cronici
MICOTOSSINE DI INTERESSE UMANO
Micotossine
Effetto biologico
Microrganismo
Aflatossina
Carcinogenesi epatica
A. parasiticus, A. flavus
Tricoteceni
Tossicità dermatologica;
indebolimento del sistema
immunitario; inibizione della
sintesi proteica; effetto
teratogeno
Fusarium, Acremonium,
Stachyobotris, Trichoderma,
Trichothecium,
Verticimonosporium
Antrachinoni
Epatotossico, carcinogenesi
epatica
Penicillium, Aspergillus
Citreoviridine
Neurotossica
Penicillium
Naftochinoni
Epatotossico
Trychophyton, Penicillium
viridicatum
Ocratossine
Inibizione della tRNA sintetasi
Aspergillus, Penicillium
Zearalenone
Estrogenico, teratogeno
Fusarium graminearum
Cloropeptide
Epatotossico, diminuisce la
sintesi del glicogeno epatico
Penicillium islandicum
Ne esistono numerosi tipi (B1, B2, G1, G2 e i loro
derivati metabolici M1 ed M2).
Sono fortemente sospettate di esplicare un’azione
tossica, mutagena e cancerogena a carico del fegato
e tossica per il sistema immunitario
Difficili da eliminare perché sono organismi
estremamente termoresistenti
Gli alimenti più esposti alla contaminazione sono i
cereali (mais, frumento, riso, orzo, segale, ecc.) e
derivati (farina e prodotti da forno, polenta ecc.),
semi oleaginosi (arachidi,girasole, ecc.), frutta
secca ed essiccata, legumi, spezie, caffé e cacao
Le condizioni ideali per lo sviluppo dell’aflatossina sono:
1. temperatura compresa tra 15 e 40 °C (optimum 20-25 °C)
2. umidità relativamente elevata superire al 70%
3. pH i cui valori siano compresi tra 4 e 8
4. presenza di ossigeno
 Candida spp.
 Cryptococcus neoformans
 Malassezia spp.
 Dermatofiti
 Aspergillus spp.
 Pneumocystis jirovecii (Pneumocystis carinii sp. f. hominis )
 Miceti con dimorfismo temperatura-dipendente
Specie
Candida albicans
Candida
Candida
Candida
Candida
Specie clinicamente più rilevante
tropicalis
parapsilosis
glabrata
krusei
Altre specie clinicamente rilevanti
Habitat:
C. albicans: commensale umano
distretti colonizzati:
- cavo orale
- intestino
- vagina
Altre specie: più frequentemente ambientali
(acque, suolo, vegetali)
Nei terreni di coltura in genere cresce come LIEVITO
Nei tessuti infetti sono possibili PSEUDOIFE e FORME FILAMENTOSE
Candida albicans
può essere considerata
un micete dimorfo
Micete lievitiforme
(cresce bene a 25 - 37°C)
Habitat:
saprofita molto diffuso nell’ambiente
abbonda negli escrementi di piccione
Provvisto di abbondante CAPSULA POLISACCARIDICA
- fattore di virulenza
- colonie di aspetto mucoide
- evidenziabile con inchiostro di china
Miceti filamentosi ad ampia diffusione ambientale
Caratteristica morfologia delle strutture conidiali
Il genere Aspergillus comprende varie specie:
Aspergillus fumigatus (la specie clinicamente più importante)



Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Distinguibili per caratteri macro- e microscopici
SPECIE
SUPERFICIE
VERSO
A. clavatus
Blu-verde
Bianco, marrone con il tempo
A. flavus
Giallo-verde
Dorato, marrone-rosso
A. fumigatus
Blu-verde al grigio
Bianco fino al marrone
A. glaucus
Verde con aree gialle
Giallo fino al marrone
A. nidulans
Verde, camoscio o giallo
Rosso porpora fino a verde
oliva
A. niger
Nero
Bianco al giallo
A. terreus
Cannella fino al marrone
Bianco al marrone
A. versicolor
Inizialmente bianco, vira poi al giallo,
marrone-rosso, verde pallido o rosa
Bianco al giallo o rosso
porpora
A. flavus
Aspergillus niger
Aspergillus fumigatus
VANTAGGI:
- rapidità
- semplicità
 esame microscopico a fresco
 esame microscopico dopo colorazione di Gram
 esame microscopico dopo colorazione con lattofenolo
 esame microscopico dopo colorazione con inchiostro di china
 esame microscopico dopo colorazione con calcofluor
TERRENI DI COLTURA
Non selettivi
Sabouraud dextrose agar: pH
5.6 favorisce la crescita dei
miceti invece che dei batteri
SAB Heart infusion (SABHI):
arricchito di nutrienti, adatto
per Blastomyces e Histoplasma
Potato dextrose
Selettivi
Mycosel (SAB con antibiotici):
cloramfenicolo; cyclohexamide
inibiscono la crescita dei saprofiti
Chromagar: terreno cromogenico
per lieviti
Czapek agar: usato nella
coltivazione dei microrganismi capaci
di utilizzare nitrogeno inorganico;
raccomandato per l’isolamento di
Aspergillus e Penicillium
Corn meal agar
Sabauraud
dextrose agar
Czapek
Terreno
cromogeno per
lieviti
LIEVITI
 mediante terreni cromogenici
 mediante test biochimici
MUFFE
Identificazione microscopica in base
ai conidi e conidiofori
Sensititre: MIC in microdiluizione
E-test: MIC in agar diffusione
Caratteristiche di un antifungino ideale:
 Bersaglio selettivo
 Attività fungicida
 Elevata potenza
 Ampio spettro
 Bassa tossicità
 Scarse o assenti interazioni farmacologiche
Disponibili in numero molto minore degli antibatterici
- più difficile trovarne data la natura eucariotica della cellula
fungina
- l’impatto delle infezioni fungine è minore di quello delle infezioni
batteriche
•
•
•
•
•
•
Antibiotici POLIENICI
Chemioterapici AZOLICI
Allilamine
Griseofulvina
5'-Fluorocitosina
Echinocandine
Amfotericina B
(uso sistemico)
Nistatina
(uso topico)
Il numero di doppi legami coniugati è direttamente proporzionale
all’attività antifungina e inversamente proporzionale alla tossicità in cellule
di mammifero. I comporti con 7 doppi legami, come l’amfotericina B, non
solo sono circa 10 volte più tossici per la cellula fungina, ma sono gli unici
che possono essere impiegati per terapie sistemiche nell’uomo
Meccanismo di azione:
legame a membrane contenenti ergosterolo
formazione di canali transmembranari
(effetto permeabilizzante)
Relativa nefrotossicità (Amfotericina B)
(migliorata dalle formulazioni liposomiali)
Amfotericina B è pochissimo solubile in acqua.
Complessata con acido desossicolico per somministrarla ev.
Più recentemente formulazioni complessate con lipidi e incapsulate in liposomi ne
hanno diminuito la tossicità e permettono di avere livelli plasmatici più elevati del
farmaco
SQUALENE
Squalene epossidasi
Squalene epoxide
LANOSTEROL
Lanosterolo 14-alpha demetilasi
14-alpha-demethyl lanosterol
Zymosterol
Fecosterol
ERGOSTEROL
ALLILAMINE:
Naftifina
Terbinafina
AZOLI:
Ketoconazolo
Fluconazolo
Itraconazolo
Voriconazolo
Caratterizzate dalla presenza di un gruppo allilaminico (naftifina e terbinafina)
Butenafina e tolnaftato vengono annoverati in questa classe anche se hanno
struttura diversa perché accomunati dallo stesso meccanismo d’azione
Meccanismo di azione:
inibizione sintesi ergosterolo
bersaglio: SQUALENE EPOSSIDASI
Indicazioni: micosi cutanee e degli annessi (Dermatofizie)
(il farmaco si concentra nella cute e negli annessi)
Gli azoli sono classificati come:
1. imidazoli se possiedono due atomi di azoto nell’anello azolico (ketoconazolo)
2. triazoli se contengono tre atomi di azoto (fluconazolo, itraconazolo e voriconazolo,
posaconazolo e ravuconazolo)
Meccanismo di azione:
inibizione sintesi ergosterolo
bersaglio: LANOSTEROLO DEMETILASI
I triazoli hanno tossicità minore degli imidazoli a causa della loro maggiore
specificità per i citocromi P450 fungini rispetto a quelli delle cellule di mammiferi
 Ridotta permeabilità che impedisce l’ingresso del
farmaco nella cellula
 Aumentata produzione enzima bersaglio Erg11p per
incrementata espressione del gene codificante ERG11
 Alterazioni enzima bersaglio per mutazioni che ne
diminuiscono l’affinità con gli azoli
 Pompe da efflusso che estrudono il farmaco e non ne
permettono l’accumulo, sono pompe do tipo “ABC
trasporter”
Meccanismo di azione:
Inibizione della sintesi degli acidi nucleici
Inibizione della sintesi proteica
Trasportato all’interno della cellula ad
opera dell’enzima citosina permeasi
5-FLUOROCITOSINA
Citosina deaminasi
5-FLUOROURACILE
Uridina monofosfato fosforilasi
5-FLUORODESOSSIURIDINA
MONOFOSFATO
Inibitore della timidilato
sintetasi, enzima chiave nella
sintesi del DNA
5-FLUOROURIDINA
TRIFOSFATO
incorporato nel RNA
della cellula fungina e
determina inibizione
della sintesi proteica
> Bassa tossicità
> Frequente l’insorgenza di resistenza a causa di mutazioni a carico
dei tre enzimi chiave
Meccanismo di azione:
Si pensa che si leghi con la proteina tubulina,
interferendo con il corretto funzionamento
del fuso mitotico e quindi interferisca con la
divisione cellulare
Indicazioni: micosi superficiali delle unghie
Ergosterolo
Meccanismo di azione:
inibisce specificatamente la sintesi del b-1-3-Dglucano, componente essenziale per l’integrità della
parete; provoca un’aumentata permeabilità della
parete e la conseguente lisi della cellula
Cryptococcus neoformans non risulta sensibile
Zygomycetes sono naturalmente resistenti