Istruzioni per l`uso di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit

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Istruzioni per l'uso di
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SURVEYOR Scan KRAS
Mutation
Detection Kit Exon 2 CE IVD con il
sistema
WAVE® MCE
Leggere attentamente il manuale prima di utilizzare il prodotto.
Conservare il manuale a titolo di riferimento per il futuro.
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Istruzioni per l’uso di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con il sistema
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WAVE MCE
Sommario
Produttore ........................................................................................................................................... 2
SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con il sistema WAVE MCE .......... 2
Uso previsto .................................................................................................................................... 2
Indicazioni per l'uso ........................................................................................................................ 2
Principi di funzionamento del kit SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection ................................ 3
KRAS .............................................................................................................................................. 3
SURVEYOR Nuclease ................................................................................................................... 3
Tracciabilità dei controlli del kit ........................................................................................................... 5
Componenti del kit .............................................................................................................................. 5
Numero di campioni analizzabili con un kit .................................................................................... 6
Sequenziamento del DNA .............................................................................................................. 6
Apparecchiature e reagenti aggiuntivi richiesti ................................................................................... 6
Preparazione del reagente ................................................................................................................. 7
Conservazione e durata ...................................................................................................................... 7
Avvertenze e precauzioni ................................................................................................................... 7
Raccolta, gestione e conservazione del campione primario .............................................................. 7
Procedura analitica ............................................................................................................................. 8
Rilevamento di una mutazione somatica con i kit SURVEYOR Scan – Considerazioni generali .. 8
Calibrazione iniziale di WAVE MCE System .................................................................................. 9
Considerazioni prima dell'analisi del campione KRAS ................................................................... 9
Considerazioni sul template ........................................................................................................... 9
Considerazioni sui primer ............................................................................................................... 9
Considerazioni sul flusso di lavoro ............................................................................................... 10
Protocollo di amplificazione .......................................................................................................... 12
Programma del termociclatore per il protocollo di amplificazione ................................................ 13
Controllo di qualità dei prodotti da PCR ....................................................................................... 14
Digestione con SURVEYOR Nuclease ........................................................................................ 14
Procedure di controllo ....................................................................................................................... 16
Controllo qualità di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD ................ 16
Uso di DNA plasmidici di controllo del gene KRAS ...................................................................... 16
Interpretazione dei risultati ................................................................................................................ 17
Analisi dell'exon 2 del gene KRAS Exon 2 utilizzando SURVEYOR Nuclease ........................... 17
Esempi di risultati ......................................................................................................................... 18
Procedura di richiamo di SURVEYOR Scan ................................................................................ 18
Revisione manuale delle immagini gel e degli elettroferogrammi di WAVE MCE ............................ 29
Revisione manuale del punteggio MCE = risultati 1. ................................................................... 30
Revisione manuale codice di errore W-01 ................................................................................... 32
Caratteristiche e sensibilità del metodo ............................................................................................ 33
Livello di sensibilità di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD............ 33
Gene KRAS Exon 2 Mutazione G12S ; livello di sensibilità nelle serie di diluizione ................... 33
Conferma mediante sequenziamento .......................................................................................... 35
Limitazioni del test ........................................................................................................................ 35
Bibliografia di riferimento .................................................................................................................. 36
Appendice ......................................................................................................................................... 37
Guida alla risoluzione dei problemi .............................................................................................. 37
Dettagli per gli ordini ......................................................................................................................... 42
Contatti .............................................................................................................................................. 43
Licenze, marchi e copyright .............................................................................................................. 43
Nota: per accedere rapidamente ai titoli di capitoli e paragrafi nel Sommario, tenere premuto il tasto
Ctrl e fare clic sul titolo.
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WAVE MCE
Produttore
Produttore
Rappresentante
CE
M
P
Transgenomic, Inc.
Il distributore autorizzato CE è Transgenomic Limited,
40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY,
Tel 1-402-452-5400.
Transgenomic Limited
40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK.
Tel +44-141-892-8800.
SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE
IVD con il sistema WAVE MCE
Uso previsto
Solo per impiego professionale. Il kit SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Exon 2 CE IVD
con sistema WAVE MCE di Transgenomic è un test diagnostico in vitro che rileva le mutazioni
nell'exon 2 del gene KRAS. Tali mutazioni sono indicate dai picchi dei frammenti di taglio di
SURVEYOR Nuclease e comprendono le mutazioni con importanza clinica potenziale nota. Questo
kit è progettato per l’uso in laboratori clinici diagnostici, da parte di operatori addestrati, per analizzare
DNA estratto da tessuti fissati con formalina e inclusi in paraffina (formalin-fixed paraffin embedded,
FFPE).
Il presente kit, numero di catalogo 710105-CEIVD, viene fornito in una confezione unica contenente i
componenti elencati di seguito. I manuali di istruzioni sono disponibili per il download dal sito
http://www.Transgenomic.com/pd/surveyor/SURVEYORKRAS_MCE_CEIVD.asp.
Indicazioni per l'uso
SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE può essere
utilizzato come ausilio nella valutazione della risposta o della mancata risposta, nei pazienti con
tumori colorettali, a trattamenti terapeutici con anti-EGFR (epidermal growth factor receptor) (quali
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Vectibix o Erbitux .
ilSURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE non deve essere
utilizzato per la diagnosi del tumore colorettale o di qualsiasi altra forma tumorale.
SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE è un test che indica
la presenza di potenziali mutazioni somatiche nell'exon 2 del gene KRAS ma non conferma l'identità
della mutazione. Per confermare l'esatta mutazione rilevata è necessario svolgere ulteriori analisi
quali il sequenziamento del DNA.
Sebbene i risultati di questa analisi indichino lo stato di mutazione del paziente, è necessario tenere
in considerazione altri fattori clinici e i risultati ottenuti con SURVEYOR Scan KRAS Mutation
Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE System non devono essere l'unico metodo utilizzato
per prendere decisioni in merito ad un potenziale trattamento a cui sottoporre pazienti affetti
da tumore colorettale. Nello specifico, si consiglia di utilizzare il software WAVE MCE per identificare
i campioni positivi a una mutazione KRAS solo a scopo indicativo e di verificare tutte le mutazioni
mediante ulteriori analisi, ad esempio il sequenziamento del DNA.
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WAVE MCE
Principi di funzionamento del kit SURVEYOR Scan KRAS
Mutation Detection
KRAS
Agenti terapeutici di recente sviluppo in grado di interagire con l'epidermal growth factor receptor
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(EGFR), quali il cetuximab (Erbitux ) e il panitumumab (Vectibix ), si sono dimostrati efficaci nel
trattamento del tumore colorettale. Le ricerche indicano che circa il 40% dei tumori colorettali
evidenzia mutazioni del gene KRAS e queste mutazioni sono state associate a una scarsa risposta
agli antagonisti dell'EGFR. La presenza di mutazioni sul gene KRAS può essere pertanto utilizzata
per stabilire se un tumore risponderà o meno alla terapia anti-EGFR. Questo kit è studiato per l'analisi
diagnostica delle mutazioni somatiche KRAS dell'exon 2 che influiscono sull'efficacia dei farmaci.
Il kit SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Exon 2 CE IVD per il sistema WAVE MCE MicroChip
Electrophoresis è un test per rilevare ogni possibile mutazione e inserzione/delezione nell'exon 2 del
gene KRAS. Vengono forniti controlli positivi per mutazioni dell'exon 2 nei codoni 12 e 13 che sono
state associate alla scarsa efficacia degli agenti anti-EGFR.
Il kit utilizza la tecnologia SURVEYOR Nuclease, esclusiva di Transgenomic, che abbinata al
sistema WAVE MCE , garantisce una rilevazione semplice e sensibile di potenziali mutazioni, con
sensibilità pari al 2-5% di DNA mutante a fronte del DNA non mutante. Studi di validazione hanno
dimostrato una concordanza estremamente elevata con il sequenziamento in campioni di tumore
colorettale ben caratterizzati. L'uso di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD
riduce il ricorso al sequenziamento e al contempo agevola l'individuazione della mutazione anche
laddove il software per il sequenziamento automatizzato non riesce a rilevare la presenza di una
mutazione di basso livello.
SURVEYOR Nuclease
La SURVEYOR Nuclease di Transgenomic è una endonucleasi di DNA vegetale specifica del
mismatch in grado di individuare mutazioni e polimorfismi noti e ignoti nel DNA eteroduplice. L'enzima
taglia il DNA con la sua elevata specificità in corrispondenza di un mismatch di sostituzione di una
base o altre anomalie. Questa endonucleasi di DNA taglia entrambi i filamenti di un DNA eteroduplice
sul lato 3' della sede di mismatch. Vengono riconosciuti tutti i mismatch di inserzione/delezione
nonché i mismatch di sostituzione delle basi, ma l'efficacia di taglio varia a seconda della sequenza
del mismatch.
Posizione del mismatch.
SURVEYOR Nuclease
Frammenti risultanti
Figura A. Schema di
azione della SURVEYOR
Nuclease. L'endonucleasi
riconosce il punto di
mismatch e taglia dal lato
3’ di ciascuna base del
mismatch. In questo modo
taglia il doppio filamento
del DNA, lasciando
sospesa una singola base
3’.
La SURVEYOR Nuclease è stata impiegata in un'ampia gamma di contesti per rilevare con la
massima precisione diverse mutazioni e polimorfismi nei geni. In particolare SURVEYOR Nuclease è
stata anche utilizzata per verificare la presenza di mutazioni note in diversi geni associati al tumore ai
reni, ai polmoni, alla testa-collo, alla leucemia, al tumore dell'endometrio e nella selezione dei soggetti da
sottoporre a radioterapia.
Il kit SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD è stato studiato per tagliare i
mismatch nell'exon 2 del gene KRAS per la successiva analisi mediante elettroforesi capillare su
microchip con il sistema WAVE MCE..
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WAVE MCE
Nota: per questo test si consiglia l'uso della sola polimerasi fornita con il kit.
Nota: Seguire le istruzioni nel Manuale rapido e il Manuale di istruzioni del sistema WAVE MCE
MCE .
Al fine di utilizzare al meglio il kit, consigliamo vivamente di leggere con attenzione il presente
manuale e di seguire in modo rigoroso le istruzioni e le linee guida fornite. Chi si appresta per
la prima volta all'utilizzo di questo kit è tenuto ad eseguire gli esperimenti di controllo illustrati
nella sezione Uso di DNA plasmidici di controllo del gene KRAS.
Per qualsiasi domanda o richiesta di assistenza chiamare il numero (888) 233-9283 (solo Nord
America), +1(402) 452-5400 oppure +44 (0) 141 892 8800 (Europa) e richiedere "KRAS SUPPORT".
Oppure inviare un'e-mail all'indirizzo:
[email protected]
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WAVE MCE
Tracciabilità dei controlli del kit
I controlli in dotazione al kit sono cloni plasmidici di sequenze dell'exon2 del gene KRAS. Tutti i cloni
sono stati sequenziati onde verificarne la fedeltà della sequenza mediante confronto con la sequenza
di riferimento NCBI: NG_007524.1.
Il “KRAS Control: Wild-Type Exon 2” è stato realizzato mediante PCR dell'exon 2 del gene KRAS
da una preparazione di DNA genomico wild-type e clonato.
Il “KRAS Positive Control Codon 12” è stato realizzato mediante mutagenesi site-directed del
controllo KRAS: Clone Wild-Type Exon 2. Il sequenziamento del DNA ha confermato che l'unica
modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 12 con un'alterazione GGT>AGT. Si
esegue quindi una miscela 50:50 con il DNA del controllo KRAS : Wild-Type Exon 2 per creare una
miscela eterozigote.
Il “KRAS Positive Control Codon 13” è stato realizzato mediante mutagenesi site-directed del
controllo KRAS : Clone Wild-Type Exon 2. Il sequenziamento del DNA ha confermato che l'unica
modifica alla sequenza si ha in corrispondenza del codone 13 con un'alterazione GGC>GAC. Si
esegue quindi una miscela 50:50 con il DNA del controllo KRAS: Wild-Type Exon 2 per creare una
miscela eterozigote.
Vedere Uso di DNA plasmidici di controllo del gene KRAS, per maggiori dettagli sulle sequenze di
DNA dei controlli.
Componenti del kit
SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE System è costituito
da una confezione di 18 provette di reagente; vi sono 7 fori vuoti in ciascuna confezione.
Codice di
catalogo
Componente
703310
703315
703065
710155F
710155R
710153F
710153R
710160
710161
708049
708027
708030
710141
710143
710144
DNA Polymerase (2.5 U/µL)
DNA Polymerase 10X PCR Buffer
dNTPs (10 mM)
KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM)
KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µM)
Universal Seq Primer 1 (10 µM)
Universal Seq Primer 2 (10 µM)
SURVEYOR Nuclease W
SURVEYOR Enhancer W2
SURVEYOR Enhancer Cofactor
0.15 M MgCl2 Solution
Stop Solution
KRAS Control: Wild-Type Exon 2
KRAS Ex 2 Positive Control Codon 12
482356
Colore
tappo
provetta
Rosso
Bianco
Trasparente
Blu
Blu
Arancione
Arancione
Viola
Nero
Rosa
Marrone
Rosso
Giallo
Verde
Verde
Istruzioni per l'uso
Kit da 100
reazioni
Volume fornito
100 µL
1000 µL
500 µL
2 x 125 µL
2 x 125 µL
125 µL
125 µL
2 x 105 µL
105 µL
105 µL
105 µL
250 µL
40 µL
40 µL
40 µL
Scaricabile dal sito web*
http://www.Transgenomic.com/pd/surveyor/SURVEYORKRAS_MCE_CEIVD.asp
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WAVE MCE
Numero di campioni analizzabili con un kit
Il SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE System
consente l'esecuzione di 100 reazioni. Il numero totale di campioni analizzabili dipende dalle
dimensioni medie del lotto di campioni da testare simultaneamente, poiché per ciascun lotto di
campioni occorre testare anche un set di controlli.
La tabella seguente riporta il numero di campioni che possono essere analizzati con il kit KRAS a
seconda delle dimensioni medie del lotto. Il calcolo tiene conto del fatto che (a) per ogni analisi sono
necessari 4 controlli e che (b) ciascun kit ha un limite di 100 reazioni.
Aumentando le dimensioni del lotto aumenta anche il numero di campioni analizzabili con un unico
kit, con conseguente riduzione del costo di analisi.
Dimensio
ni del
lotto
Numero di
controlli +
ampliconi
campione
Test per
analisi
Analisi totali
per kit
Campioni
analizzabili
per kit
1
4+1
5
20
20
2
4+2
6
16
32
3
4+3
7
14
42
4
4+4
8
12
48
5
4+5
9
11
55
6
4+6
10
10
60
11
4 + 11
15
6
66
21
4 + 21
25
4
84
29
4 + 29
33
3
87
46
4 + 46
50
2
92
96
4 + 96
100
1
96
Sequenziamento del DNA
Sono forniti primer di sequenziamento (N° di catalogo 710153F e 710153R) da utilizzare, se richiesto,
per il sequenziamento del DNA di tutti i campioni testati. Per il sequenziamento si consiglia di
utilizzare gli ampliconi PCR creati prima della digestione con SURVEYOR Nuclease.
Apparecchiature e reagenti aggiuntivi richiesti
Per l'utilizzo del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE
MCE System sono richieste le seguenti apparecchiature e componenti aggiuntivi:
WAVE MCE System (PN MCE-99-2020B)
WAVE MCE Optimized Microchip, (PN MCE-99-3600)
WAVE MCE Optimized Separation Buffer Kit (PN MCE-99-5000)
WAVE MCE Optimized Marker Kit (PN MCE-99-5500)
Acqua per uso in biologia molecolare
Provette da 0.2 mL-PCR, strisce o piastra da 96 pozzetti
Micropipettatori
Puntali delle pipette
Bagno di ghiaccio
Miscelatore vortex
Microcentrifuga
Termociclatore
Gel di agarosio e apparecchiature per elettroforesi in gel di agarosio.
Candeggina al 10% o detergente simile
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WAVE MCE
Preparazione del reagente
Tutti i reagenti forniti in dotazione con questo kit sono pronti per l'uso. Alcuni componenti devono
essere scongelati, agitati con il vortex o centrifugati in una microcentrifuga prima dell'uso; verificare i
dettagli nella sezione Procedura analitica più avanti. I reagenti devono essere mescolati per
ottenere la Master Mix e le miscele di reazione; tutti i dettagli sono forniti nella sezione Procedura
analiticadi seguito.
Conservazione e durata
Prima dell'uso conservare il kit ad una temperatura compresa tra -18 °C e -25 °C in un congelatore a
temperatura costante. Prendere nota della data di scadenza di ciascun kit ricevuto. Non utilizzare il kit
oltre la data di scadenza indicata.
La miscela SURVEYOR Nuclease, preparata come descritto al punto 7 della Digestione con
SURVEYOR Nuclease, deve essere utilizzata subito in quanto la SURVEYOR Nuclease W nel
tempo si inattiva per la presenza degli altri componenti della miscela di reazione.
Avvertenze e precauzioni
Nessuno dei reagenti presenti nel kit rappresenta un pericolo per la salute nelle quantità fornite.
Scaricare la scheda di sicurezza Transgenomic MSD-710105 dal sito
http://www.transgenomic.com/lib/msds/WAVEMCEMSD.asp
Il presente kit non contiene sostanze di origine animale o umana che costituiscano un potenziale
rischio d’infezione.
L'uso del presente kit è riservato a persone adeguatamente preparate nell'applicazione delle tecniche
di laboratorio richieste. Quando si utilizzano i componenti del kit, indossare sempre un apposito
camice da laboratorio, guanti monouso e una protezione per gli occhi. Dopo l'uso smaltire i
componenti del kit come rifiuti clinici nel rispetto delle regole e delle vigenti normative locali.
Le aliquote di reagenti pipettate dalle provette del kit sono solo monouso. È stato verificato che i
componenti del kit restano stabilii per 25 cicli di congelamento/scongelamento. Non utilizzare il kit
qualora si sia superato questo numero di cicli di congelamento/scongelamento.
Raccolta, gestione e conservazione del campione primario
Il SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE System è stato
convalidato per l'uso con campioni bioptici di tumore colorettale inclusi in paraffina (FFPE) e fissati in
formalina. Affinché l'estrazione del DNA sia ottimale, il tessuto deve essere fissato in formalina per
14–24 prima dell'inclusione in paraffina.
I campioni bioptici di tumore sono una miscela eterogenea di cellule tumorali e non tumorali. Inoltre, il
tumore stesso è costituito da un mix eterogeneo di cellule tumorali con mutazioni e cellule tumorali
senza mutazioni. Poiché queste mutazioni somatiche possono non essere uniformemente distribuite
all'interno del tumore, la risultante analisi mutazionale di differenti sezioni dello stesso tumore può
essere diversa. Per aumentare la probabilità di rilevare una mutazione, il DNA della regione tumorale
del tessuto deve essere isolata raschiando solo l'area tumorale dal vetrino usando un nuovo scalpello
sterile per ogni nuovo vetrino.
Per un utilizzo efficace del kit, il DNA estratto deve soddisfare i criteri elencati al paragrafo
Considerazioni sul template.
NOTA: I campioni di DNA estratto non destinati all'analisi immediata con il kit devono essere conservati
da -20 ºC a -80 °C.
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WAVE MCE
Procedura analitica
Rilevamento di una mutazione somatica con i kit SURVEYOR Scan –
Considerazioni generali
Il rilevamento di una mutazione e la successiva conferma con SURVEYOR Nuclease si articola in tre
fasi:
Panoramica di SURVEYOR Scan
in tre fasi elementari
Fase 1. Amplificazione del campione di
DNA con PCR, riscaldamento/
raffreddamento per formare eteroduplici
2. Taglio con SURVEYOR Nuclease.
Fase 3. Analisi del frammento sulla base
delle dimensioni nel sistema WAVE MCE
Fase 1 - Preparazione degli ampliconi per PCR da DNA mutante (test) e normale
(riferimento). Dopo il ciclo di amplificazione PCR finale la reazione viene riscaldata per
denaturare ed aprire tutti i doppi filamenti e poi raffreddata lentamente in modo da garantire
una formazione ottimale di etero- e omoduplici (gli eteroduplici si formano quando un
filamento di sequenza wild-type si accoppia con un filamento di sequenza mutante).
Fase 2 - Trattamento della miscela eteroduplice/omoduplice così ottenuta con SURVEYOR
Nuclease. SURVEYOR Nuclease taglia il DNA eteroduplice dando origine a frammenti di
DNA. Il DNA di riferimento wild-type, trattato in modo simile, funge da controllo.
Fase 3 - Analisi dei frammenti di DNA con WAVE MCE. La formazione dei nuovi prodotti,
dovuti alla presenza di uno o più mismatch, è indicata dalla presenza di altri picchi
nell'elettroferogramma. I tempi di migrazione dei prodotti di taglio sono correlati alle
dimensioni dei frammenti e pertanto indicano la posizione del/dei mismatch.
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WAVE MCE
Istruzioni dettagliate
Calibrazione iniziale di WAVE MCE System
Per l'impostazione della piastra di SURVEYOR Nuclease per l'analisi nel sistema WAVE MCE ,
consultare il Manuale di istruzioni di WAVE MCE System .
NOTA: Il setup della piastra con i controlli è richiesto per l'impiego del software di analisi.
Considerazioni prima dell'analisi del campione KRAS
Prima dell'analisi dei campioni su WAVE MCE System, deve essere eseguito WAVE MCE Optimized
DNA Size Standard usando ogni microchip caricato nel sistema per assicurare che WAVE MCE
System funzioni correttamente. Il personale di laboratorio incaricato dell'uso dello strumento deve
verificare la qualità di WAVE MCE Optimized DNA Size Standard (vedere il Manuale di istruzioni di
WAVE MCE System ).
Considerazioni sul template
1. Per il DNA template ottenuto mediante FFPE, utilizzare le normali procedure di laboratorio
per valutare la qualità e la quantità di DNA estratto accertandosi che vi sia una quantità di
DNA amplificabile per la PCR.
2. Il rapporto di assorbanza 260/280 deve essere maggiore di 1.80.
3. Per velocizzare la messa a punto della PCR è necessario che la concentrazione del template
di lavoro sia di circa 12.5 ng/µL. Se necessario, diluire il DNA template con acqua per uso in
biologia molecolare.
Considerazioni sui primer
1. Le sequenze dei primer in dotazione con il presente kit sono le seguenti:
Amplicone
KRAS
Primer:
Exon 2
Sequenza
Forward
aggaaacagctatgaccatTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA
Reverse
tgtaaaacgacggccagtTGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTG
Universal Seq Primer 1
aggaaacagctatgaccat
Universal Seq Primer 2
tgtaaaacgacggccagt
NOTA: I primer KRAS Exon 2 hanno code Universal Sequencing, come indicato in lettera
minuscola.
2. Le sequenze degli ampliconi sono le seguenti:
a. Il sito di legame del Forward Primer è evidenziato in verde. Il complemento inverso
del sito di legame del Reverse Primer è evidenziato in rosso. Le regioni di codifica
sono maiuscole e sottolineate. Le regioni di mutazione più comuni sono evidenziate
in viola. Le lettere maiuscole non sottolineate indicano regioni di DNA esonico noncodificante.
Sequenza di riferimento NCBI: NG_007524 Exon 2 loci: 10.428–10,706
dimensione amplicone: 190 bp (con code), 153 bp (senza code)
cgggtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaa
tatagtcacattttcattatttttattataagGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT
TGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATA
TGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgataca
gataaacccg
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WAVE MCE
Considerazioni sul flusso di lavoro
Il kit è stato concepito per consentire l'analisi su 100 reazioni. È possibile eseguire lotti più piccoli, ma
per ciascun lotto è necessario includere i controlli del kit e un controllo NTC (“no template control”,
controllo privo di DNA. Il kit contiene un quantitativo sufficiente di materiali di controllo per 100
reazioni per tutte le combinazioni di lotti di campione di differente entità.
In linea generale, l'elaborazione dei campioni deve essere eseguita dall'inizio alla fine come descritto
nel presente Manuale di istruzioni Se l'elaborazione di un campione viene interrotta prima del
completamento di tutte le fasi, è necessario conservare il DNA a -20 °C nei punti indicati. Tuttavia, si
consiglia di evitare l'esposizione di qualsivoglia campione congelato a più cicli di
congelamento/scongelamento e la conservazione (da -18 a -25 °C) di campioni di DNA amplificato
mediante PCR o prodotti della digestione con SURVEYOR Nuclease per periodi di tempo prolungati
(>1 settimana).
L'analisi dei campioni deve seguire la sequenza illustrata di seguito:
Raschiatur
a tessuto
2
PCR
1
Elettroforesi in gel.
3
9b
9a
Punteggio PCR solida/debole
4
Scansione
SURVEYOR
Non superata
Analisi SURVEYOR Nuclease
& WAVE MCE
SURVEYOR Scan
positiva
SURVEYOR Scan
negativa
6
5
punteggio MCE = 1
rapporto≤ 5% analisi
manuale
punteggio come
KRAS Exon 2
positiva
7
Nessun
punteggio MCE
& rapporto
indicato
Conferma
mediante
sequenziamento
9
8
Qualità
sequenziamento
non superata
NVD
Qualità
sequenziament
o superata
Mutante:
G12X or G13X
Figura 1: Flusso di lavoro del kit di analisi SURVEYOR Scan KRAS
Note alla figura 1
1. Isolare il DNA da FFPE utilizzando procedure di laboratorio standard.
2. Eseguire PCR e controllare la qualità del DNA con elettroforesi in gel.
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WAVE MCE
3. Registrare se la banda PCR è solida (≥20 ng/µL) o debole (<20 ng/µL).
Se sono presenti bande PCR multiple preparare DNA genomico fresco da FFPE.
4. Con i campioni classificati come PCR solida o PCR debole in seguito ad amplificazione
PCR, procedere al trattamento SURVEYOR Nuclease e all'analisi WAVE MCE .
Si noti che con un risultato debole per PCR, il DNA potrebbe essere insufficiente per la
produzione di risultati affidabili sulla piattaforma WAVE MCE, sebbene possa essere
sufficiente per il sequenziamento.
5. Tutti i campioni con risultato SURVEYOR Scan positivo devono essere:
a. classificati come KRAS Exon 2 positivo; oppure
b. inviati alla conferma mediante sequenziamento del DNA se è richiesta l'identità
precisa della mutazione.
6. Esistono due categorie di campioni con risultato SURVEYOR Scan negativo:
a. I campioni per i quali non è indicato un punteggio MCE né un rapporto sono
classificati come "Nessuna variante individuata" (No Variant Detected, NVD).
b. Campioni con punteggio MCE = 1 e rapporto di picco di ≤ 5% sono casi borderline.
Tali risultati devono essere analizzati manualmente. Ad esempio, vedere Revisione
manuale del punteggio MCE = risultati 1 .
7. Dopo l'analisi manuale dei campioni con un punteggio MCE =1, rapporto ≤ 5%, tutti i
campioni che evidenziano la presenza di prodotti di taglio SURVEYOR Nuclease devono
essere inviati alla conferma mediante sequenziamento. I campioni senza bande visibili sono
classificati come "Nessuna variante individuata" (No Variant Detected, NVD).
8. Se l'analisi con conferma mediante sequenziamento è accettabile, i risultati devono indicare
uno dei seguenti:
a. Sequenza wild-type, ovvero, Nessuna variante individuata (NVD); oppure
b. Variante individuata. Se la conferma mediante sequenziamento indica un'alterazione
di una base nelle posizioni 1 o 2 per il codone 12 o 13, può essere segnalata una
mutazione (modifica negli aminoacidi), con attivazione del gene KRAS.
c.
Se la conferma tramite sequenziamento indica una modifica nella posizione 3 del
codone 12 o 13, è presente una mutazione silente. Per definizione, una mutazione
silente non modifica l'aminoacido della proteina KRAS e pertanto opera come
proteina “wild-type”.
9. Se l'analisi di conferma mediante sequenziamento fallisce e non è possibile produrre un
risultato valido;
a. Ripetere la PCR se rimane sufficiente DNA genomico
b. Riestrarre il DNA dalla FFPE; questa è da considerarsi come opzione di seconda
scelta in quanto è di norma poco auspicabile tagliare un altro blocco FFPE.
Nota: è possibile avere un risultato SURVEYOR Scan Positivo, che porti anch'esso a un valore
"Nessuna variante identificata" dalla conferma mediante sequenziamento. Il livello di rilevamento
(Level of detection, LOD) di SURVEYOR Nuclease su WAVE MCE è del 2% di mutazione a fronte di
un wild-type del 98% per alcune mutazioni, mentre l'LOD del sequenziamento è di circa il 10-25% di
mutazione a fronte di un wild-type del 90-75%.
Nota: Risultati SURVEYOR Scan positivi possono essere dovuti ad alterazioni di basi diverse da
quelle KRAS attivanti, ad es. (a) mutazioni silenti del codone 12 [GGT (wild-type) in GGC, GGA o
GGG] o del codone 13 [GGC (wild type) in GGA, GGT o GGG] oppure (b) una mutazione in codone
diverso da 12 o 13. Sebbene queste mutazioni siano rare, se l'identità di sequenziamento delle
mutazioni exon 2 è richiesta dall'utilizzatore del kit, sarà necessaria la conferma con un altro metodo,
con il sequenziamento del DNA, prima di registrare un risultato SURVEYOR Scan positivo come
mutazione KRAS attivante.
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®
WAVE MCE
Nota: il processo di fissazione in formalina usato per preparare i campioni bioptici tumorali FFPE può
provocare la deaminazione delle citosine, che converte la citosina in uracile. La polimerasi “interpreta”
questo uracile come timina e integra un'adenina nei filamenti copiati. Quindi, ciò apparirà come una
mutazione in cui la normale G è sostituita da una A provocando una mutazione da GC in AT, che
costituisce una mutazione artefatta dovuta al processo di fissazione e non una reale mutazione
somatica. Si tratta di eventi rari, ma se la copia avviene in una fase precoce del ciclo PCR, possono
"assomigliare" a mutazioni. Non si ripetono alla rianalisi.
Le mutazioni KRAS che possono derivare dalla deaminazione della citosina includono:
-
Codone 12: AGT (G12S) e GAT (G12D)
-
Codone 13: AGC (G13S), GAC (G13D) e GGT (G13G, una mutazione silente)
Pertanto, si consiglia di confermare tali mutazioni mediante la doppia analisi dello stesso DNA
genomico o sottoponendo tutti i campioni a doppia analisi sin dall'inizio.
Protocollo di amplificazione
1. La soluzione di dNTP premiscelata Transgenomic (PN 703065) ha una concentrazione
operativa totale in deossinucleotidi di 10 mM (2,5 mM di ciascuno dei quattro
deossinucleotidi).
2. I primer PCR Exon 2 forward e reverse (PN 710155F e 710155R) sono forniti a 10 µM.
3. Prelevare dal congelatore 10 µM di primer, 10 mM di soluzione dNTP premiscelata e il DNA
Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) e scongelare su ghiaccio.
4. Dopo lo scongelamento, agitare nel vortex tutti i componenti del kit (~10 secondi) per
miscelare accuratamente, centrifugare per qualche istante (~10 secondi) per assicurarsi che
sui coperchi delle provette non rimanga liquido, quindi collocare su ghiaccio.
5. Preparare la Master Mix su ghiaccio.
6. Utilizzare la seguente tabella come guida per la preparazione della Master Mix per l'exon 2
del gene KRAS:
Numero di reazioni:
Calcolo del volume:
Volume di acqua (µL)
DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL)
dNTPs (µL)
KRAS Primer: Exon 2 Forward (µL)
KRAS Primer: Exon 2 Reverse (µL)
DNA Polymerase (µL)
Volume totale della Master Mix:
1.00
33.0**
5.0
4.0
2.5
2.5
1.0
48.0
Volume di DNA estratto da aggiungere (µL a 12.5
Volume totale della reazioneng/µL)
PCR:
2.0**
50.0
**Nota: L'operatore deve prefiggersi di avere minimo 25 ng di DNA per 50 µL di
reazione. Se le concentrazioni di DNA estratto sono inferiori a 12.5 ng/µL, aumentare
proporzionalmente il volume di DNA estratto per assicurare 25 ng per reazione. Ridurre
inoltre il volume di acqua nella Master Mix in uguale quantità per produrre 50 µL per
reazione. In tutti i campioni preparati con questa master mix sarà necessario diluire il
DNA estratto fino a circa lo stesso livello di concentrazione minima. Si sconsiglia l'uso di
concentrazioni di DNA estratto inferiori a 5 ng/µL.
7. Calcolare i volumi richiesti per la Master Mix moltiplicando i volumi mostrati nel grafico
precedente per il numero totale di campioni da analizzare più 4 altre reazioni per i controlli.
Si tenga presente che, per compensare le perdite durante la pipettatura, sarà richiesto un
volume della Master Mix leggermente superiore di quello risultante da questo calcolo.
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WAVE MCE
8. Etichettare le provette per PCR da 0,2 mL (o i pozzetti della piastra da 96 pozzetti ) con
adeguate informazioni sui campioni.
9. Etichettare una provetta per centrifuga da 2,0 mL per la preparazione della Master Mix.
10. Aggiungere il volume richiesto di acqua per uso in biologia molecolare nella provetta da 2,0
mL destinata alla "Master Mix".
11. Aggiungere il quantitativo richiesto di DNA Polymerase 10X PCR Buffer nella provetta della
Master Mix.
12. Aggiungere il volume richiesto di 10,0 mM dNTPs premiscelata nella provetta della Master
Mix.
13. Aggiungere il volume richiesto di KRAS Primer: Exon 2 Forward nella provetta della Master
Mix.
14. Aggiungere il volume richiesto di KRAS Primer: Exon 2 Reverse nella provetta della Master
Mix.
15. Prelevare la DNA Polymerase (P/N 703310) dal congelatore.
16. Centrifugare la DNA Polymerase per ~10 secondi.
17. Agitare nel DNA Polymerase per ~10 secondi.
18. Aggiungere il volume richiesto di DNA Polymerase nella provetta della Master Mix.
19. Chiudere la provetta della Master Mix.
20. Prima dell'uso, agitare nel vortex la provetta della Master Mix per ~30 e quindi centrifugare
brevemente per ~10 secondi.
21. Conservare su ghiaccio fino al momento dell’utilizzo.
22. Pipettare 48,0 µL (vedere nota al punto 6) di Master Mix negli appositi pozzetti, sostituendo i
puntali in caso di utilizzo di una pipetta a singolo canale. In caso di utilizzo di una pipetta a
ripetizione, accertarsi che non vi siano fuoriuscite/spruzzi da un pozzetto all'altro. Conservare
la piastra sul ghiaccio.
23. Aggiungere negli appositi pozzetti 2,0 µL (vedere nota al punto 6) di ciascun DNA template o
acqua (no template control, NTC). Usare puntali delle pipette separati per ciascun campione
per evitare la contaminazione incrociata a causa di schizzi. Coprire i pozzetti contenenti i
DNA campione e il NTC con strip da 8 tappi (nel caso si utilizzi una piastra da 96 pozzetti)
oppure chiudere con il tappo le provette per PCR da 0,2 mL. Accertarsi che i tappi siano
ermeticamente chiusi.
24. Solo a questo punto aprire il DNA template di controllo del kit (PN 710141, 710143, 710144).
Pipettare per ultimi questi template di controllo al fine di ridurre le probabilità di
contaminazione di qualsivoglia DNA campione. Nuovamente, coprire ciascun pozzetto con
strip da 8 tappi (nel caso si utilizzi una piastra da 96 pozzetti) oppure chiudere con il tappo le
provette per PCR da 0,2 mL. Accertarsi che i tappi siano ermeticamente chiusi.
NOTA: Se si usa il template piastra predefinito di WAVE MCE , i controlli del kit vanno nei
pozzetti A1, B1 e C1. Inserire il controllo NTC nel pozzetto H12.
25. Agitare in vortex (a circa 1/2 velocità) per 10 sec.
26. Centrifugare per 1-2 minuti per assicurare che tutte le soluzioni si raccolgano alla base dei
pozzetti o delle provette. Verificare che tutte le soluzioni si trovino sul fondo di ciascun
pozzetto o di ciascuna provetta. In caso contrario, ripetere la centrifugazione.
Programma del termociclatore per il protocollo di amplificazione
1. Per l'amplificazione PCR e la formazione di eteroduplici utilizzare il seguente protocollo del
termociclatore:
Denaturazione
iniziale
15 cicli touchdown
95 C
5 minuti
95 C
30 secondi
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®
WAVE MCE
30 cicli di
amplificazione
Estensione finale
Formazione di
eteroduplici
62 C, -0.5 C/ciclo
30 secondi
72 C
25 secondi
95 C
30 secondi
55 C
30 secondi
72 C
25 secondi
72 C
2 minuti
95 C
2 minuti
minore o uguale a 12 C
In attesa
Controllo di qualità dei prodotti da PCR
1. Si consiglia di controllare la qualità e la quantità degli ampliconi mediante elettroforesi su gel
(o metodi equivalenti) prima di passare alla digestione con SURVEYOR Nuclease.
2. Analizzare un'aliquota del prodotto PCR e confrontarla rispetto ad altre diverse concentrazioni di
un marcatore (DNA mass ladder da 100 coppie di basi).
3. Utilizzare il ladder per determinare la concentrazione del DNA amplificato.
4. Si dovrebbe ottenere un'unica banda con concentrazione maggiore di 20 ng/µL
corrispondente al prodotto di PCR principale.
5. In presenza di più bande, verificare che la qualità del DNA template inserito sia sufficiente
(vedere Appendice A–Guida alla risoluzione dei problemi).
6. In assenza di amplificato, verificare che la qualità del DNA template utilizzato fosse sufficiente
(vedere Appendice A–Guida alla risoluzione dei problemi). Se la qualità era
soddisfacente, aumentare il volume di template a 4,0 µL per 50 µL di reazione (ridurre l'acqua
per reazione a 31,0 µL).
7. Nel campione NTC non devono essere visibili prodotti PCR. In presenza di prodotti di DNA in
questo controllo, è probabile una contaminazione; vedere la Appendice - Guida alla
risoluzione dei problemi .
8. Classificare la PCR come solida o debole .
a. Una PCR solida deve avere una banda singola maggiore o uguale a 20 ng/µL.
b. Una PCR debole deve avere una banda singola inferiore a 20 ng/µL.
c.
Passare alla digestione SURVEYOR Nuclease con i risultati PCR sia "solidi" che
"deboli".
SUGGERIMENTO: in questa fase i prodotti PCR possono essere conservati a
temperature non superiori a -20 ºC per una settimana al massimo.
Digestione con SURVEYOR Nuclease
1. Una volta ritenute sufficienti la qualità e la quantità del campione ottenuto per PCR,
procedere alla reazione di digestione con SURVEYOR Nuclease come descritto di seguito.
2. Scongelare su ghiaccio le provette contenenti la soluzione 0,15 M MgCl 2 e il SURVEYOR
Enhancer Cofactor.
3. Aggiungere 10,0 µL di ciascun campione amplificato con PCR di cui sopra in una nuova
provetta da 0.2 mL PCR o in un pozzetto della piastra da 96 pozzetti.
4. Preparare una miscela di soluzione 0.15 M MgCl 2 , SURVEYOR Enhancer Cofactor,
SURVEYOR Enhancer W2 e SURVEYOR Nuclease W (miscela SURVEYOR Nuclease).
Utilizzare la seguente tabella come guida per la preparazione di una Digest Master Mix SURVEYOR
Nuclease per l'analisi di più campioni. L'esempio seguente prevede i volumi per una Master Mix da 10
campioni.
Si tenga presente che, per compensare le perdite durante la pipettatura, sarà richiesto un volume
della Master Mix leggermente superiore di quello risultante da questo calcolo.
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®
WAVE MCE
Numero di reazioni SURVEYOR Nuclease Digest:
Calcolo del volume:
Soluzione 0,15 M MgCl2 (µL)
SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL)
SURVEYOR Enhancer W2 (µL)
SURVEYOR Nuclease W (µL)
Volume totale della Master Mix:
10
10.0
10.0
10.0
20.0
50.0
Aggiungere a ciascuno 5 µL di SURVEYOR Nuclease
Master Mixamplificato PCR (µL)
Campione
Volume totale reazione SURVEYOR Nuclease Digest:
10.0
15.0
a. Centrifugare ciascun reagente prima dell'uso.
b. Agitare delicatamente nel vortex ciascun reagente prima della pipettatura; centrifugare
brevemente per ~10 secondi dopo ciascuna fase di vortex.
c.
Per ciascuna reazione di digestione aggiungere i seguenti componenti in una provetta per
microcentrifuga da 0,2 mL PCR(o più grande).
1.0 µL 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027)
1.0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049)
1.0 µL SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161)
2.0 µL SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)
oppure, aggiungere 5 µL della Master Mix preparata come indicato nella tabella
precedente.
5. Agitare delicatamente nel vortex la Master Mix di SURVEYOR Nuclease per 10 sec. a bassa
velocità.
6. Centrifugare la Master Mix di SURVEYOR Nuclease per 10 sec. a bassa velocità.
7. Porre la Master Mix di SURVEYOR Nuclease su ghiaccio fino al momento dell'uso.
Nota: La Digest Master Mix di SURVEYOR Nuclease preparata come descritto al punto 7
deve essere utilizzata subito in quanto la SURVEYOR Nuclease W nel tempo si inattiva per
la presenza degli altri componenti della miscela.
8. Pipettare l'aliquota da 5.0 µLdi Master Mix di SURVEYOR Nuclease in ciascuna provetta o
pozzetto contenente l'aliquota da 10,0 µL di prodotto PCR amplificato (punto 3 di cui sopra).
9. Al termine della pipettatura, centrifugare le provette per PCR da 0,2 mL o la piastra da 96
pozzetti, per 10 sec.
10. Agitare delicatamente nel vortex le provette per PCR da 0,2 mL o la piastra da 96 pozzetti,
per 10 sec.
11. Centrifugare per 10 secondi a bassa velocità (questo passaggio è particolarmente importante
se la digestione è eseguita su uno strumento privo di coperchio riscaldato).
12. Incubare a 42 °C per 30 minuti.
13. Aggiungere 1,0 µ di Stop Solution (708030P/N) in ciascuna provetta o pozzetto e agitare
delicatamente nel vortex (il volume di reazione totale di SURVEYOR Nuclease è di 16,0 µL).
SUGGERIMENTO: I prodotti di digestione di SURVEYOR possono essere conservati a
temperature non superiori a -20 ºC per una settimana al massimo.
14. Caricare le digestioni campione in WAVE MCE System.
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WAVE MCE
Procedure di controllo
Controllo qualità di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD
Il kit contiene campioni di DNA plasmidico di controllo che consentono di eseguire i controlli di qualità
in fasi specifiche della procedura di dosaggio. Nel caso del protocollo di amplificazione questi
controlli consentono di verificare la corretta preparazione delle Master Mix nonché l'adeguato
funzionamento dell'amplificazione. È consigliato anche l'uso di controlli NTC (si aggiunge acqua
anziché DNA template) per la verifica di una possibile contaminazione con DNA dei componenti del
kit.
In fase di digestione con SURVEYOR Nuclease, gli ampliconi di questi tre DNA plasmidici di controllo
consentono di verificare in modo affidabile che le condizioni della reazione di taglio (preparazione
della Digest Master Mix di SURVEYOR Nuclease e condizioni di incubazione) siano state
soddisfacenti. In fase di analisi, gli elettroferogrammi di WAVE MCE System degli ampliconi di
controllo digeriti con SURVEYOR Nuclease indicano dove verranno eluti i picchi dei prodotti di taglio
corrispondenti a mutazioni del codone 12 e 13, anche a bassi livelli (vedere Figura 2).
Se gli ampliconi PCR non corrispondono ai risultati previsti dal Controllo qualità dei prodotti da
PCR, consultare l'Appendice- Guida alla risoluzione dei problemi o rivolgersi al servizio di
assistenza tecnica di Transgenomic prima di procedere ulteriormente con l'analisi dei campioni.
Se l'analisi SURVEYOR Scan KRAS all'interno del software di visualizzazione WAVE MCE Viewer
non identifica correttamente i risultati di digestione di KRAS Control Plasmid SURVEYOR Nuclease,
si attiva un codice di errore. Consultare le rispettive sezione dell'Appendice- Guida alla risoluzione
dei problemi o rivolgersi al servizio di assistenza tecnica Transgenomic prima di procedere
ulteriormente con l'analisi dei campioni.
Uso di DNA plasmidici di controllo del gene KRAS
Il kit contiene tre DNA di controllo:
KRAS Control: Wild-Type Exon 2; PN 710141
KRAS Positive Control Codon 12; PN 710143
KRAS Positive Control Codon 13; PN 710144
Questi DNA di controllo sono plasmidi con inserti. Ciascun controllo positivo contiene due plasmidi:
una miscela 50:50 di KRAS Control: Wild-Type Exon 2 e un clone di mutazione che differisce dal wildtype per un'unica coppia di basi. I controlli sono contenuti in fiale separate, ciascuna a una
concentrazione di 2,5 ng/µL.
I primer PCR KRASExon 2 Forward e Reverse necessari per l'amplificazione PCR sono forniti
separatamente all'interno del kit. Di seguito è illustrata la sequenza del controllo wild-type e del
controllo positivo.
Il sito di legame del Forward Primer è evidenziato in verde. Il complemento inverso del sito di legame
del Reverse Primer è evidenziato in rosso. Le regioni di codifica sono maiuscole e sottolineate. Le
regioni di mutazione più comuni sono evidenziate in viola. Le lettere maiuscole non sottolineate
indicano regioni di DNA esonico non-codificante.
Le sequenze degli ampliconi sono le seguenti:
TGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATA
TGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgataca
gataaacccg
KRAS Positive Control Codon 12
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WAVE MCE
TGGAGCT[G/A]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACG
AATATGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttga
tacagataaacccg
KRAS Positive Control Codon 13
TGGAGCTGGTG[G/A]CGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACG
AATATGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttga
tacagataaacccg
Per l'uso di questi controlli attenersi alle istruzioni riportate nelle sezioni Protocollo di amplificazione,
Digestione di SURVEYOR Nuclease e analisi dell'exon 2 CE IVD del gene KRAS utilizzando
SURVEYOR Nuclease.
RACCOMANDIAMO GLI UTILIZZATORI DI ACQUISIRE, PRIMA DELL'ANALISI DI VERI
CAMPIONI GENOMICI, LA NECESSARIA PRATICA ED EFFETTUARE ESPERIMENTI CON
I SOLI CONTROLLI.
Interpretazione dei risultati
Analisi dell'exon 2 del gene KRAS Exon 2 utilizzando SURVEYOR Nuclease
-
A scopo di confronto/controllo, eseguire SEMPRE la digestione con SURVEYOR
Nuclease su entrambi i controlli (controllo wild-type e controllo positivo), su un controllo
NTC e sui DNA campione, ed eseguire la procedura sulla stessa piastra di WAVE MCE
System.
-
In fase di digestione con SURVEYOR Nuclease, gli ampliconi di questi tre DNA plasmidici
di controllo consentono di verificare in modo affidabile che le condizioni della reazione di
taglio (preparazione della miscela di SURVEYOR Nuclease e condizioni di incubazione)
siano state soddisfacenti. In fase di analisi, le tracce di WAVE MCE System di questi
ampliconi di controllo digeriti con SURVEYOR Nuclease indicano dove verranno eluti i
frammenti di DNA derivanti dal taglio in corrispondenza delle mutazioni del codone 12 e
13, anche a bassi livelli (vedere Figure 19-20).
-
Se gli ampliconi PCR o i frammenti di taglio della SURVEYOR Nuclease derivanti dai
DNA plasmidici di controllo non corrispondono ai risultati previsti, consultare l'AppendiceGuida alla risoluzione dei problemi o rivolgersi al servizio di assistenza tecnica di
Transgenomic prima di procedere ulteriormente con l'analisi dei campioni.
-
Gli esempi forniti di seguito hanno solo scopo illustrativo e NON DEVONO essere usati
per determinare l'identità di qualsivoglia mutazione. La conferma dell'identità di una
mutazione è necessaria al file di determinare in modo inequivocabile la presenza di
un'alterazione in una base specifica nei codoni 12 o 13 del gene KRAS.
-
SURVEYOR Nuclease taglia tutti i mismatch derivanti dalla formazione di
eteroduplici tra i DNA wild-type e mutante e nono solo le mutazioni nei codoni 12 e
13. SURVEYOR Nuclease conferma la presenza di un mismatch. Se è richiesta l'identità
specifica dell'alterazione di base, deve essere confermata con un altro metodo, ad
esempio il sequenziamento.
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®
WAVE MCE
Esempi di risultati
Esempi di risultati ottenuti con il SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD e il
WAVE MCE System sono mostrati nella Figure 2 di seguito. In questi esempi il processo illustrato
nella sezione Considerazioni generali è stato seguito alla lettera.
G13D produce
frammenti
77 e 113-bp
1
2
3
Amplicone
da 190
coppie di
basi
, intonso
Mutazione 50% KRAS G13D
Mutazione 50% KRAS G12S
Controllo wild type
Marker
inferior
e
Marker
superio
re
G12S produce
frammenti
73 e 117-bp
Figura 2: I prodotti di digestione di SURVEYOR Nuclease degli eteroduplici dell'amplicone dei
codoni 190-bp Exon 2 12 13 analizzati su WAVE MCE System. I template utilizzati in questa analisi
erano (1) una miscela di KRAS Control: Wild-Type Exon 2 e KRAS Exon 2 Positive Control Codon 12,
(2) una miscela di KRAS Control: Wild-Type Exon 2 e KRAS Exon 2 Positive Control Codon 13 e (3)
the KRAS Control: Wild–Type Exon 2. La mutazione G12S produce G-T ed eteroduplici A-C che
sviluppano frammenti 73 & 117-bp dopo la digestione SURVEYOR Nuclease. La mutazione G13D
produce G-T ed eteroduplici A-C che sviluppano frammenti 77 & 113-bp dopo la digestione
SURVEYOR Nuclease. I picchi risultanti da questi particolari frammenti sono ben separati.
Utilizzo di WAVE MCE Viewer per il richiamo di SURVEYOR Scan
WAVE MCE System è dotato del software WAVE MCE e del software WAVE MCE Viewer. Il Control
Software è usato per impostare ed effettuare campioni nel WAVE MCE System. Il Viewer Software è
utilizzato per ricontrollare i dati, elaborare gli elettroferogrammi e generare rapporti. All'interno del
Viewer Software, una funzione di analisi del gene KRAS è utilizzata per aiutare i ricercatori ad
identificare la presenza di una mutazione. Tali informazioni sono fornite nei rapporti di SURVEYOR
Scan dell'analisi del gene KRAS unitamente allo stato di revisione dei dati.
Si noti che un risultato positivo di SURVEYOR SCAN ricavato dallo strumento software WAVE
MCE Viewer NON CONFERMA l'identità della mutazione. Qualità del campione, condizioni di
esecuzione non standard e stato del chip possono influire sulla precisione del risultato.
Inoltre, mutazioni molto rare in codoni diversi da 12 e 13, ad es. nei codoni 11 e 14 possono
essere classificate come SURVEYOR SCAN positivo. Se è richiesto il sequenziamento di
qualsivoglia mutazione KRAS Exon 2 , sarà necessaria la conferma di tutti i risultati positivi
mediante sequenziamento del DNA o metodo paragonabile.
Procedura di richiamo di SURVEYOR Scan
1. Eseguire campione KRAS su WAVE MCE System usando il layout a 96 pozzetti illustrato di
seguito.
a. Nel Control Software selezionare Inserimento campione -> Nuovo
b. Nella finestra Inserimento campione - Nuovo, selezionare il progetto SURVEYOR_Scan e
fare clic su OK .
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®
WAVE MCE
c.
Per impostazione predefinita, nella finestra Inserimento campione viene caricato il layout
della piastra campione KRAS Exon 2. Vengono riempiti automaticamente un ladder ogni
quattro chip e i controlli exon 2. Se non sono utilizzati tutti i chip, rimuovere i ladder
associati. Inserire i campioni desiderati nei rimanenti pozzetti aperti.
d. Dopo avere riempito il modulo Inserimento campione, fare clic sul tasto Invio per creare la
piastra. Eseguire i campioni sullo strumento. Per maggiori dettagli sull'utilizzo dello
strumento, consultare il Manuale di istruzioni di WAVE MCE System .
Figura 3: Configurazione del vassoio campione
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WAVE MCE
2. Dopo avere eseguito tutti i campioni su WAVE MCE System, aprire l'applicazione WAVE MCE
con uno dei due metodi seguenti.
a. Fare clic sull'icona WAVE MCE Viewer sul desktop.
b. Selezionare -> WAVE MCE -> WAVE MCE Viewer
Il software WAVE MCE Viewer è accessibile anche da WAVE MCE Control durante
l'acquisizione dei dati facendo clic su Visualizza  File dati.
Figura 4: Accesso al software WAVE MCE Viewer Software
L'applicazione WAVE MCE Viewer si apre, come illustrato nella Figura 5.
Figura 5: WAVE MCE Viewer
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WAVE MCE
3
Aprire il file di iniezione (MLT) in WAVE MCE Viewer. Selezionare File -> Apri... quindi selezionare
il file desiderato e premere il tasto Apri.
Figura 6: Apertura della finestra di dialogo del file MLT
Figura 7: Esempio di finestra di dialogo del file MLT caricata
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WAVE MCE
4
I campioni vengono caricati nel software Viewer. La prima volta che si caricano i campioni,
compare un messaggio che spiega all'utente come eseguire l'analisi. Vedere Figura 8.
Figura 8: Esegui analisi
5
Per eseguire l'analisi del picco, selezionare Ripeti analisi → Automatico…. Eseguire l'analisi
standard (Figura 9) selezionando l'opzione [Standard]. Fare clic su [Ripeti analisi ] e
[Automatico]. In questo modo si identificano i picchi in ciascun elettroferogramma rispetto al
ladder usato (WAVE MCE Optimized DNA Size Standard) in preparazione del test SURVEYOR
Scan KRAS.
Figura 9: Analisi dei picchi
6. Eseguire l'analisi specifica del KRAS selezionando SURVEYOR Scan → Analisi KRAS.
a. Nella finestra di dialogo Analisi KRAS le posizioni predefinite dei pozzetti per i
controlli sono :
A1 = KRAS Control: Wild-Type Exon 2
B1 = KRAS Exon 2 Positive Control Codon 12
C1 = KRAS Exon 2 Positive Control Codon 13
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WAVE MCE
b. Se l'utente colloca questi controlli in pozzetti diversi da quelli sopra indicati,
selezionare le nuove posizioni dal menu a discesa
c.
Inserire il nome del Revisore. Questo nome sarà inserito in tutti i rapporti unitamente
ai rapporti Chiamata SURVEYOR. Infine, fare clic sul tasto [Ripeti analisi].
Figura 10: Analisi KRAS
7
I risultati compaiono quindi nella scheda Chiamata SURVEYOR (un esempio nella Figura 11). I
possibili campi sono descritti nella tabella seguente.
Campo
Contenuti
Pozzetto
Posizione del campione nel pozzetto.
Nome campione
Il nome del campione.
Chiamata SURVEYOR
l
Il richiamo determinato dal software confrontando i
campioni sconosciuti con i controlli. I possibili risultati
della Chiamata SURVEYOR sono:
SURVEYOR scan positivo
genetica
– Individuata variazione
SURVEYOR scan negativo – Variazione genetica non
individuata
Sconosciuta – Troppi picchi presenti nella regione di
interesse; il software non è in grado di determinare un
risultato per SURVEYOR Scan .
I valori della chiamata del campione sono inoltre
codificati tramite colore in base al risultato SURVEYOR
Scan . Rosso indica una variante genetica individuata e
verde indica che non è stata individuata alcuna
mutazione (da Wild-Type) .
Punteggio MCE
Il Punteggio MCE è ricavato sulla base delle
caratteristiche di picco di ciascun risultato SURVEYOR
Scan. Questo Punteggio si basa sull'intensità del
segnale e sul livello di rumore di fondo. Il punteggio può
variare nell'intervallo 0-100. Maggiore è il punteggio,
tanto più il campione sconosciuto si avvicina allo
schema previsto per una variazione mutante.
Rapporto
Rapporto tra l'altezza di picco del frammento di taglio
della variante genetica rispetto all'altezza di picco wildtype (frammento intonso).
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®
WAVE MCE
Figura 11: Risultati Chiamata SURVEYOR
8
Revisione dati: Risultati Chiamata SURVEYOR del gene KRAS
a
Esaminare ogni risultato presentato nella tabella dei campioni correlando il nome del
campione con Chiamata SURVEYOR. Per ciascun risultato SURVEYOR Scan , per il
campione sono calcolati un Punteggio MCE e un Rapporto.
b
Innanzitutto, selezionare il pozzetto nella tabella dei campioni sotto la scheda Chiamata
SURVEYOR, come mostrato nella Figura 11 precedente. Sono visualizzati
l'elettroferogramma e l'immagine gel del campione. Analizzare l'elettroferogramma
avvalendosi delle funzioni grafiche fornite dal software. Se richiesto, effettuare lo zoom sulla
regione di interesse e sovrapporre l'elettroferogramma del campione con l'Exon 2 Wild-Type
Control.
c
Osservare eventuali differenze fra il controllo wild-type e il campione analizzato.
d
Quindi, sovrapporre l'Exon 2 Codon 12 Positive Control e l'Exon 2 Codon 13 Positive Control
con il campione. Osservare eventuali differenze.
e
Servendosi di questi strumenti, il revisore dei dati può quindi valutare la presenza o l'assenza
di una variazione genetica, confrontando il Punteggio MCE e il rispettivo Rapporto per
ciascun campione con quello dei controlli Exon 2. Il Rapporto è definito come la somma delle
altezze del picco mutante diviso per l'altezza del picco wild-type dell'Exon 2 intonso. Il
Rapporto è calcolato e visualizzato solo per i campioni che hanno una Chiamata
SURVEYOR. I campioni definiti come "Sconosciuti" non avranno né un Punteggio MCE né un
Rapporto.
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WAVE MCE
Figura 12: Esempi di risultati di Chiamata SURVEYOR
f
Importante! Vedere Revisione manuale del punteggio MCE = risultati 1 per avere
esempio di ricontrollo manuale di campioni con un punteggio MCE =1 e rapporto ≤ 5%.
g
Importante! Dopo un'attenta revisione di ciascun campione, il revisore dei dati deve
esaminare se i campioni adiacenti nella piastra di analisi hanno risultati identici positivi per il
SURVEYOR Scan . Se sono presenti risultati positivi identici, questi possono derivare da
contaminazione del campione o contaminazione incrociata. L'analisi deve essere ripetuta.
h
Importante!Dopo un'attenta revisione di ciascun campione, il revisore dei dati ha la
possibilità di modificare il risultato del SURVEYOR Scan mediante il menu a discesa
Chiamata SURVEYOR. Eventuali modifiche manuali al software di analisi Chiamata
SURVEYOR non sono registrate nei rapporti relativi al campione. Il punteggio MCE viene
aggiornato su “Manual” per indicare che il revisore ha apportato manualmente una modifica
(vedere esempio seguente per il campione 4553/11nel pozzetto C2)
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®
WAVE MCE
Figura 13: Il revisore apporta una modifica a Chiamata SURVEYOR
Figura 14: Modifica apportata a Chiamata SURVEYOR
9
Il valore di Chiamata SURVEYOR e il Punteggio MCE compaiono nei seguenti rapporti:
a
120 campioni/pagina
Foglio campioni
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®
WAVE MCE
b
24 campioni/pagina
Foglio campioni
c
12 campione/pagina
Elettroferogramma, Immagine gel
d
12 campione/pagina
Tabella risultati, Immagine gel
e
1 campione/pagina
f
Sovrapponi
Elettroferogramma, Tabella risultati
Elettroferogramma
Per generare un rapporto, selezionare File → Stampa… Compare la finestra di dialogo
Stampa (Figura 15). Selezionare il rapporto desiderato e fare clic su [Anteprima] per
visualizzare il rapporto prima della stampa. Fare clic su [Stampa…] per inviare il rapporto alla
stampante.
Figura 15: Finestra di dialogo Stampa
Figura 16 Esempio di rapporto Elettroferogramma con sovrapposizione, con riepilogo dei
risultati dell'analisi SURVEYOR Scan.
Figura 16: Rapporto Elettroferogramma con sovrapposizione
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WAVE MCE
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WAVE MCE
Revisione manuale delle immagini gel e degli
elettroferogrammi di WAVE MCE
campioni sconosciuti #4
KRAS Ex2 Positive Control Codon 12
[bp]
WAVE MCE Size Standard
Il revisore deve controllare a vista le immagini gel e gli elettroferogrammi di tutti i campioni come
verifica aggiuntiva dopo l'uso dell'analisi software di KRAS . Ciò è particolarmente importante se:
 a Il risultato SURVEYOR Scan negativo ha un punteggio MCE =1 e rapporto ≤ 5%. Tali
punteggi possono indicare una mutazione di livello molto basso, dovuta a rumore di fondo; il
software non è in grado di segnalare un SURVEYOR Scan positivo.
 si decide di modificare manualmente un risultato SURVEYOR Scan . Confrontando le
digestioni di SURVEYOR Nuclease di campioni sconosciuti con le digestioni dei controlli
positivi e wild-type si aggiunge un'ulteriore verifica dei campioni che devono essere
sottoposti a sequenziamento. Se i campioni hanno picchi di digestione di basso livello,
devono essere confermati mediante sequenziamento del DNA.
Marker Superiore
Frammento PCR
intonso
frammenti di
digestione di
SURVEYOR
Nuclease nella
regione del codone
12 e 13 del gene
KRAS
Marker Inferior
Figura 17: Immagine gel di WAVE MCE di frammenti di digestione di SURVEYOR Nuclease in
seguito ad amplificazione PCR dell'exon 2 di KRAS. Il controllo a vista mostra due bande di taglio
nei campioni sconosciuti #3 e #4 che corrispondono ai pattern di banda osservati per i controllo
positivi. Il campione sconosciuto #1 mostra solo bande deboli e non specifiche. Il campione
sconosciuto #2 potrebbe avere due bande a bassa concentrazione corrispondenti ai controlli positivi.
Pertanto, i campioni sconosciuti #2, #3 e #4 devono essere sottoposti a conferma mediante
sequenziamento del DNA.
Testo nella figura: Frammento PCR intonso; frammenti di digestione di SURVEYOR Nuclease nella
regione del codone 12 e 13 del gene KRAS, campione sconosciuto.
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WAVE MCE
Congiuntamente al controllo a vista delle immagini gel, può essere utile confrontare gli
elettroferogrammi dei campioni con i controlli positivi e wild type in dotazione al kit. Si consiglia di
usare la funzione "sovrapponi" degli elettroferogrammi. Per i parametri dell'asse X usare "Indice
migrazione" o "Formato". La Figura 18 di seguito mostra gli elettroferogrammi per i medesimi
campioni visualizzati in precedenza in modalità immagine gel (Figura 17).
Prodotto PCR intonso
Lower
Marker
SURVEYOR
Digestie piekens
Lower
Marker
picchi di digestione
SURVEYOR
campione sconosciuto#4
campione sconosciuto #3
migrazioni indice (%)
dimensione (bp)
Figura 18: Gli elettroferogrammi con lo stesso set di campioni visualizzato sull'immagine gel
nella Figura 17 sono visualizzati mediante sia Indice di migrazione sia etichettatura della
dimensione per l'asse X. In questo caso è evidente che i pattern dei picchi nei campioni sconosciuti
#3 e #4 corrispondono ai pattern di banda osservati per i controllo positivi in dotazione al kit. È
richiesta la conferma mediante sequenziamento del DNA per identificare la modifica della base
specifica. Il controllo a vista dell'elettroferogramma per il campione sconosciuto #1 mostra un valore
basale relativamente uniforme e pertanto non richiede la conferma mediante sequenziamento del
DNA. Il controllo a vista dell'elettroferogramma per il campione sconosciuto #2 mostra due aree con
possibili segnali di picco di taglio e poiché tali aree corrispondono alla posizione dei picchi di
digestione del controllo positivo, il campione deve essere sottoposto a conferma mediante
sequenziamento del DNA.
Testo nella figura: Prodotto PCR intonso, picchi di digestione SURVEYOR, campione sconosciuto.
Revisione manuale del punteggio MCE = risultati 1.
I campioni con risultato SURVEYOR Scan negativo ma con punteggio MCE =1 (e rapporto ≤ 5%)
devono essere analizzati manualmente, poiché tali risultati borderline possono essere interpretati
come falsi negativi.
L'esempio del campione #7 nella figura 19 (di seguito) illustra tale scenario. All'analisi manuale, il
campione ha due picchi appena sopra il rumore di fondo in posizioni simili rispetto ai controlli.
È importante notare che i campioni #3-6 e #8-9 non hanno due picchi di ampiezza simile nelle stesse
posizioni dei controlli.
La figura 20 mostra lo stesso set campione analizzato in modalità gel virtuale e analogamente
suggerisce la presenza di una mutazione nel campione #7. Dove tali campioni sono stati definiti
dall'analisi KRAS con SURVEYOR Scan negativi, ma l'analisi manuale suggerisce la presenza di
picchi simili a mutazioni, è necessaria un'ulteriore analisi per la conferma mediante sequenziamento.
Nota: l'analisi mediante sequenziamento del campione #7 ha confermato la presenza di una
mutazione G13D (i risultati del sequenziamento sono mostrati nella figura 21). .
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WAVE MCE
Figura 19: Analisi manuale di campioni con SURVEYOR Scan negativo, punteggio MCE = 1,
rapporto ≤ 5% . Il campione 7 mostra possibili prodotti di taglio SURVEYOR Nuclease sopra il
rumore di fondo.
G12S G13D
Figura 20: Analisi in modalità gel virtuale dei campioni nella figura 19. Il campione #7 mostra
deboli bande in posizione simile ai controlli; campioni #2 e #3, suggerendo la presenza di una
mutazione di basso livello.
T05-10656
T05-14328
Figura 21: Analisi mediante sequenziamento dei campioni #6e #7 dalla figura 19. I campioni #6
e #7 della figura 19 sono stati ulteriormente analizzate mediante sequenziamento del DNA. Come
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WAVE MCE
suggerito dall'analisi manuale delle tracce WAVE MCE e dai gel virtuali, #6 è un campione del tutto
wild-type, mentre il campione #7 contiene una mutazione KRAS G13D .
Revisione manuale codice di errore W-01
Se il valore Chiamata SURVEYOR Scan segnala un codice di errore W-01 l'utente deve ricontrollare
l'elettroferogramma e l'immagine gel di WAVE MCE del campione per verificare l'allineamento dei
picchi/delle bande dei marker superiori e inferiori e del picco/della banda della PCR omoduplice
intonsa nei controlli positivi e nei campioni.
Se questi picchi/queste bande sono correttamente allineati e le immagini gel e gli elettroferogrammi
dei controlli positivi mostrano che i picchi hanno almeno un segnale 0.6 mV sopra il livello di fondo dei
picchi circostanti, l'operatore può confrontare a vista i pattern di digestione di SURVEYOR Nuclease
dei campioni con quelli dei controlli positivi, I campioni con pattern di digestione simili ai controlli
positivi (vedere Figura 18) devono essere considerati “Positivi” e sottoposti a conferma mediante
sequenziamento. Se l'operatore ritiene che un campione "potrebbe" avere pattern di digestione simili
ai controlli positivi, tale campione deve essere considerato “Sconosciuto” e altresì sottoposto a
conferma mediante sequenziamento.
Per informazioni su qualsivoglia aspetto della Revisione manuale rivolgersi al servizio di assistenza
tecnica di Transgenomic. Vedere Contatti.
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WAVE MCE
Caratteristiche e sensibilità del metodo
Livello di sensibilità di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD
La convalida di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE MCE
System con cloni plasmidici di tutte le più comuni mutazioni dell'exon 2 del gene KRAS ha dimostrato
che è possibile rilevare picchi di SURVEYOR Nuclease in una miscela di DNA mutante all'2-5% su un
fondo wild-type.
I risultati illustrati di seguito mostrano le tracce delle serie di diluizioni su WAVE MCE System in
mutazioni esemplificative in ciascuno dei codoni 12 and 13 e gli elettroferogrammi di sequenziamento
delle diluizioni selezionate.
Si noti che i profili di picco di mutazioni specifiche possono variare in base al numero di
campioni eseguiti su un singolo chip.
Gene KRAS Exon 2 Mutazione G12S ; livello di sensibilità nelle serie di
diluizione
Amplicone da 190
Copplie di basi, intonso
Prodotti di taglio
73-bp e 117-bp di
SURVEYOR Nuclease
Marker
Superiore
50%
mutante
Marker
Inferior
25%
Mutante
50% G12S controllo positivo
10%
Mutante
5%
Mutante
2%
Mutante
Exon 2 Wild-Type Control
100%
WT
indice di migrazione (%)
Figura 22: SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD. Titolazione della
mutazione G12S dell'exon 2 del gene KRAS
Sono stati preparati livelli variabili di mutante miscelando il controllo KRAS: Wild-Type Exon 2 (P/N
710141) e KRAS Positive Control Codon 12 (P/N 710143);la miscela è stata poi riscaldata e lasciata
raffreddare per formare gli eteroduplici. Queste miscele sono state poi trattate con SURVEYOR
Nuclease e analizzate con WAVE MCE System. NOTA: per ottenere un wild type al 90%, 10%
mutante, si prepara una miscela all' 80% PN 710141 e al 20% PN 710143. Si noti anche che la gran
parte della miscela di ampliconi è costituita da omoduplici wild-type non tagliati da SURVEYOR
Nuclease. Il limite di rilevamento dell’amplicone mutante G12S è del 2% con SURVEYOR Scan +
WAVE MCE System.
Limite di sensibilità dei risultati di sequenziamento per la mutazione G12S dell'exon 2 del gene
KRAS
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WAVE MCE
Gli elettroferogrammi mostrano i risultati di sequenziamento del DNA dei prodotti PCR analizzati
mediante SURVEYOR Nuclease. L'uso del sequenziamento automatizzato dei filamenti forward e
reverse spesso non è in grado di rilevare la mutazione in miscele wild-type G12S se inferiore al 10%.
Unitamente ai risultati di SURVEYOR Nuclease è possibile interpretare con maggiore affidabilità gli
elettroferogrammi di sequenziamento di mutazioni, relative al codone 12, fino al 5-10%.
Se l'analisi di un campione mostra un risultato positivo per SURVEYOR Scan , ma non sono
presenti mutazioni KRAS individuabili mediante sequenziamento del DNA, si consiglia di
registrare il risultato come "Nessuna variante identificata". Per maggiori informazioni si veda
la sezione "Considerazioni sul flusso di lavoro".
Gene KRAS Exon 2 Mutazione G13D; livello di sensibilità nelle serie di diluizione
Amplicone da 190bp
Coppie di basi, intonso
Prodotti di taglio
77-bp e 113-bp
SURVEYOR Nuclease
Marker Superiore
Marker
Inferior
50%
Mutante
25%
Mutante
50% G13D Controllo Positivo
10%
Mutante
5%
Mutanet
Wild-Type Control: Exon 2
2%
Mutante
100%
WT
Figura 23: SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD. Titolazione della
mutazione G13D dell'exon 2 del gene KRAS
Sono stati preparati livelli variabili di mutante miscelando il controllo KRAS: Wild-Type Exon 2 (P/N
710141) e KRAS Controllo Positivo Codon 13 (P/N 710144);la miscela è stata poi riscaldata e lasciata
raffreddare per formare gli eteroduplici. Queste miscele sono state poi trattate con SURVEYOR
Nuclease e analizzate con WAVE MCE System. NOTA: per ottenere un wild type al 90%, 10%
mutante, si prepara una miscela all' 80% PN 710141 e al 20% PN 710144. Si noti anche che la
maggior parte della miscela di ampliconi è costituita da omoduplici wild-type non tagliati da
SURVEYOR Nuclease. Il limite di rilevamento dell’amplicone mutante G13D è del 5% con
SURVEYOR Scan+ WAVE MCE System.
Limite di sensibilità dei risultati di sequenziamento per la mutazione KRAS Exon 2 G13D
A scopo di confronto vengono mostrati gli elettroferogrammi con i risultati di sequenziamento Sanger
di prodotti PCR a livelli di mutante variabili. L'uso del sequenziamento automatizzato dei filamenti
forward e reverse spesso non è in grado di rilevare la mutazione G13D se inferiore al 10% in miscele
wild-type. Unitamente ai risultati di SURVEYOR Nuclease è possibile interpretare con maggiore
affidabilità gli elettroferogrammi di sequenziamento di mutazioni 90:10 mutante wild-type (mutazione
10%) per il codone 13 come contenenti una mutazione.
Se l'analisi di un campione mostra un risultato positivo per SURVEYOR Scan , ma non sono
presenti mutazioni individuabili mediante sequenziamento del DNA, si consiglia di registrare il
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WAVE MCE
risultato come "Nessuna variante identificata". Per maggiori informazioni si veda la sezione
"Considerazioni sul flusso di lavoro".
Conferma mediante sequenziamento
Procedere alla conferma mediante sequenziamento se:
1. È richiesta l'identità di sequenziamento della mutazione KRAS Exon 2.
2. Il campione ha un valore SURVEYOR Scan negativo, con un punteggio MCE = 1; l'analisi
manuale suggerisce la presenza di prodotti di taglio SURVEYOR Nuclease.
3. Il campione ha un risultato Error Code W-01 e l'analisi manuale suggerisce la presenza di
prodotti di taglio SURVEYOR Nuclease.
Non procedere alla conferma mediante sequenziamento se:
1. Non è richiesta l'identità di sequenziamento della mutazione e il risultato della "mutazione
KRAS Exon 2" è sufficiente.
2. Il campione è definito SURVEYOR Scan negativo con punteggio MCE Score = 0, rapporto =
0.
I primer Universal Sequencing inclusi nel kit devono essere utilizzati per la conferma mediante
sequenziamento. Il primer forward è PN 710153F (Universal Seq Primer 1) e il primer reverse è PN
710153R (Universal Seq Primer 2).
Limitazioni del test
È possibile che la presenza di sostanze contaminanti derivate dall'estrazione di campioni inclusi in
paraffina e fissati in formalina interferisca con l'amplificazione PCR e con le procedure di digestione
tramite SURVEYOR Nuclease. Il rispetto delle procedure di qualità illustrate nella sezione Controllo
qualità di prodotti PCR farà sì che il DNA estratto sia idoneo all'uso con il presente kit.
Il presente kit è stato convalidato per l'analisi con campioni bioptici di tumore colorettale inclusi in
paraffina e fissati in formalina. Non è invece stato convalidato per l'uso diagnostico né con altri tipi di
tumore né con campioni bioptici freschi o congelati.
Per la risoluzione di problemi relativi a risultati non standard e per maggiori dettagli su fattori che
possono compromettere questo dosaggio vedere la sezione Appendice - Guida alla risoluzione dei
problemi di seguito.
Evitare il carryover e la cross-contaminazione. L'estrema sensibilità di questo metodo di dosaggio
richiede l'adozione delle seguenti precauzioni:

Accertarsi che tutti i campioni vengano gestiti in modo tale da evitare la cross-contaminazione
tra i campioni

Operare in una workstation PCR o in altre postazioni idonee dove l'area di lavoro possa
essere esposta ai raggi UV prima di preparare le reazioni di amplificazione PCR.

Usare una workstation PCR separata o una stanza diversa per aprire i campioni dopo
l'amplificazione PCR per il controllo qualità mediante elettroforesi in gel.

Eseguire la preparazione della digestione SURVEYOR Nuclease in una stanza separata o in
una workstation PCR differente rispetto a quella utilizzata per la preparazione della PCR
iniziale.

Accertarsi che i controlli plasmidici del kit vengano manipolati separatamente dai campioni
utilizzati per il test in tutte le fasi del dosaggio
o
Assicurarsi che tutte le soluzioni, i controlli NTC e i pozzetti del DNA campione siano
coperti prima di aprire le provette contenenti il DNA plasmidico di controllo.
o
MANIPOLARE I CONTROLLI PER ULTIMI. Aggiungere Il DNA plasmidico di
controllo alle provette appropriate solo DOPO AVERE COPERTO TUTTI i NTC e i
pozzetti campione.
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®
WAVE MCE
o

Dopo avere coperto tutte le provette del DNA di controllo, pulire TUTTE le provette e
TUTTI i coperchi con un prodotto in grado di distruggere il DNA (ad esempio,
candeggina al 10%) prima del trasferimento in un'altra area.
Accertarsi che l'operazione di pipettaggio del campione nelle piastre da 96 pozzetti non
provochi la contaminazione di pozzetti contigui dovuti a schizzi formatisi durante la
miscelazione o alla mancata sostituzione dei puntali.
Bibliografia di riferimento
Vedere http://www.Transgenomic.com/lib/PL/482146.pdf per i riferimenti circa SURVEYOR Nuclease
e le sue applicazioni.
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WAVE MCE
Appendice
Guida alla risoluzione dei problemi
Per un uso efficace di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con WAVE
MCE System è necessario eseguire correttamente le diverse fasi. Una delle più critiche è
l'amplificazione tramite PCR che deve dare come risultato la produzione di una quantità di molecole di
DNA specifiche e di dimensioni uniformi tali da essere rilevate in seguito a ibridizzazione e digestione.
Ciò dipende a sua volta dalla qualità del campione iniziale. Si sconsiglia di eseguire il dosaggio con
un DNA che non soddisfi i criteri di qualità e quantità.
Nota: Raccomandiamo gli utilizzatori non esperti di SURVEYOR Nuclease di eseguire gli esperimenti
illustrati nella sezione Uso di DNA plasmidici di controllo del gene KRAS dopo aver letto e
compreso quanto riportato nella sezione
Istruzioni dettagliate . Attendere i risultati dei DNA
plasmidici di controllo del gene KRAS prima di rivolgersi all'assistenza tecnica Transgenomic.
La presente Guida alla risoluzione dei problemi tratta una serie di problematiche che possono
presentarsi durante l'uso di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con
WAVE MCE System e fornisce una serie di suggerimenti su come risolverle.
Per maggiori dettagli sull'utilizzo dello strumento, consultare il Manuale di istruzioni di WAVE MCE
System. Il manuale comprende procedure specifiche per il controllo e la manutenzione delle
prestazioni del chip e fornisce informazioni dettagliate per la risoluzione dei problemi.
Problema 1 – PCR bassa o nessun prodotto di PCR quando analizzato su gel
di agarosio
Bassa resa PCR
Buona
PCR
resa
Scarsa
PCR
resa
POSSIBILE CAUSA
Scarsa qualità del
template DNA
Troppo RNA nel
campione provoca una
sovrastima della
concentrazione del
DNA
Termociclatore non
calibrato
Template non
sufficiente
SOLUZIONE
Verificare il metodo di purificazione utilizzato.
Ripetere la purificazione del DNA. Se il DNA
estratto da FFPE è troppo frammentato,
potrebbero essere necessari blocchi di FFPE
alternativi.
Ripetere il trattamento RNase del campione di
DNA e ripurificare il DNA
Verificare la calibrazione del termociclatore.
Aumentare il quantitativo di template.
RNA
banda
Nota: utilizzare DNA estratto da FFPE di alta qualità. Il DNA deve avere una concentrazione di 25
ng/µL come stabilito per assorbanza a 260 nm, deve presentare un rapporto di assorbanza a 260/280
nm superiore a 1,8 ed essere DNA >90% (ovvero senza contaminazione di tRNA ed rRNA
come verificato dal suo aspetto su un gel di agarosio). Conservare i campioni di DNA da -20 °C e -80
°C.
L'analisi di template DNA estratto da un tessuto incluso in paraffina richiede l'adozione di alcune
precauzioni. Il DNA estratto può essere trattato con uracil-DNA glicosilasi al fine di prevenire
l'amplificazione di frammenti di DNA contenenti residui C deaminati. Spesso un'elevata percentuale
del materiale assorbente A260 estratto da tessuto incluso in paraffina non viene ben amplificata
durante la PCR. Utilizzando un abbondante quantitativo di DNA iniziale spesso si ottiene un prodotto di
amplificazione adeguato.
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®
WAVE MCE
Problema 2 – Prodotti PCR multipli quando analizzato su gel di agarosio
Prodotti PCR multipli
Buona
PCR
resa
POSSIBILE CAUSA
Temperatura di annealing
troppo bassa
SOLUZIONE
Verificare la calibrazione del
termociclatore.
Multipla
banda
PCR
Nota: la PCR deve dare come risultato un prodotto in quantità sufficiente (maggiore di 20 ng/µL) di
un'UNICA specie amplificata di dimensioni corrette. Utilizzare per la PCR la DNA Polymerase e
DNA Polymerase 10X PCR Buffer in dotazione con il kit. Gli ampliconi dei controlli devono essere
digeriti con SURVEYOR Nuclease quindi analizzati al fine di escludere un eventuale rumore di fondo
spurio mediante confronto visivo dei profili dell'elettroferogramma (vedere Esempi di risultati,
(Figure 2). Esaminare ciascun prodotto di DNA amplificato prima della digestione mediante
elettroforesi su gel (con analisi di WAVE MCE System ) per verificare la presenza di un'unica specie
delle dimensioni previste.
Problema 3 – Nessun prodotto di taglio riscontrato al momento dell'analisi
dopo il trattamento di eteroduplici con SURVEYOR Nuclease
Nessun prodotto di taglio
POSSIBILE CAUSA
Proporzione di
bersaglio mismatch
troppo bassa
Formazione
inefficace di
eteroduplici
Posizione
degli
eteroduplici
mancanti
SURVEYOR
Nuclease inattivo
Marker
Inferiore
Marker
Superior
Picco
omoduplice
intonso
SOLUZIONE
Verificare il dosaggio
utilizzando i controlli.
Attenersi alla procedura
PCR e di ibridizzazione
corretta. Utilizzare DNA
appena ibridizzato nella
digestione con
SURVEYOR Nuclease.
Eseguire la reazione di
controllo e verificare le
prestazioni dell'enzima.
Utilizzare esclusivamente
una Master Mix per
SURVEYOR Nuclease
appena preparata.
Nota: SURVEYOR Nuclease attua il taglio prevalentemente in corrispondenza dei mismatch negli
eteroduplici. Il rapporto tra eteroduplici e omoduplici nel campione ibridizzato determinerà la
dimensione del segnale di digestione con SURVEYOR Nuclease. In presenza di una mutazione del
gene KRAS ad una bassissima concentrazione nel campione di DNA genomico, il segnale potrebbe
essere troppo basso per fornire un risultato positivo.
È importante far sì che la fase di ibridizzazione venga inclusa nel programma del termociclatore
(vedere Protocollo di amplificazione) per massimizzare l'efficacia della formazione di eteroduplici.
Gli eteroduplici si formano in modo particolarmente inefficace durante reazioni PCR standard.
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®
WAVE MCE
Nota: il rapporto segnale/rumore è generalmente sufficientemente alto da consentire la rivelazione di
mutazioni anche a basse percentuali sul totale del template DNA; è possibile infatti rilevare la
presenza del 2% di DNA mutante. Le figure 19-20 mostrano il rilevamento di mutazioni dei codoni 12
e 13 del gene KRAS Exon 2 (4-10% eteroduplici) con un WAVE MCE System. La Figura 2 mostra i
prodotti della digestione ottenuti da DNA di controllo positivo del gene KRAS omoduplici ed
eteroduplici (in dotazione con il kit) con un WAVE MCE System. Sono chiaramente visibili i prodotti di
taglio specifici della mutazione, per la presenza di due nuovi picchi aventi le dimensioni previste che
possono essere valutati in base al size marker del DNA.
Attenzione: I tamponi per PCR disponibili sul mercato variano significativamente per contenuto e
spesso i fornitori non ne specificano le formulazioni. Molti tamponi NON sono compatibili con
SURVEYOR Nuclease a causa del pH o della presenza di additivi, tensioattivi o altri ingredienti
brevettati o ignoti. NON utilizzare altre polimerasi o tamponi per polimerasi 10X diversi da quelli
in dotazione con il kit.
Problema 4 – Sfondo elevato in seguito a trattamento con SURVEYOR
Nuclease
Sfondo elevato
Sfondo
elevato
Marker
Inferiore
Marker
Superior
Picco
omoduplice
intonso
POSSIBILE CAUSA
Fase di ibridizzazione non
ottimale
Quantitativo di DNA
troppo basso
Prodotti PCR non specifici
SOLUZIONE
Procedere come segue:
1. Accertarsi che la
concentrazione di DNA
sia >25 ng/µL.
2. Ripetere la fase di
ibridizzazione
attenendosi
scrupolosamente alla
relativa procedura.
Verificare il prodotto e la qualità
del DNA da amplificare
Verificare la resa e la qualità del
D
N
A
d
a
a
m
p
l
i
f
i
c
a
r
e
.
SURVEYOR Enhancer
W2 e/o SURVEYOR
Enhancer Cofactor hanno
perso la loro efficacia
Controllare la data di scadenza
del kit.
Nota: talvolta SURVEYOR Nuclease interagisce con il doppio filamento di DNA in punti a caso; per
questo motivo si potrebbe generare un rumore di fondo al termine della digestione. Questa attività è
soppressa dal SURVEYOR Enhancer W2 e dal suo cofattore, senza interferire negativamente in altro
modo sulla principale reazione di taglio dei mismatch. SURVEYOR Enhancer W2 e il relativo cofattore
sono in dotazione al kit e vanno sempre utilizzati.
Pagina 39 di 40
®
®
WAVE MCE
Laddove ha luogo questa interazione si generano picchi di ridotte dimensioni su WAVE MCE System.
Il confronto delle digestioni di controllo degli omoduplici con le digestioni del campione consente di
riconoscerli e normalizzarli con il software WAVE MCE System.
Problema 5 – Picchi di digestione con SURVEYOR Nuclease in controlli
negativi
Picchi di digestione in controlli negativi
Picchi
digestione
Marker
Inferiore
POSSIBILE
CAUSA
Contaminazione
del contenuto del
kit con ampliconi
o controlli
plasmidici del
gene KRAS
SOLUZIONE
Smaltire tutti i
componenti del kit e
utilizzarne uno nuovo.
Rivolgersi all'assistenza
tecnica Transgenomic e
chiedere spiegazioni sulle
potenziali cause e fonti di
contaminazione.
Marker
Superior
Picco
omoduplice
intonso
Problema 6 - marker superiore (UM) suddiviso durante l'analisi del ladder o dei
campioni
Il marker superiore (UM) inizia a
trasformarsi un secondo picco o a
suddividersi in un picco doppio
Picchi
singoli
Picchi
suddivis
i
POSSIBILE CAUSA
SOLUZIONE
Di solito è dovuto
all'utilizzo di un
mezzo di
separazione vecchio
(o deteriorato) o di
reagenti scaduti.
Interrompere la
processazione, preparare
mezzo di separazione
fresco e riavviare la
processazione.
Picco suddiviso di standard di dimensione
WAVE MCE a fronte di un normale standard
di dimensione
Picchi
suddivis
i
Analisi del campione che evidenzia la
suddivisione del picco del marker superiore
Pagina 40 di 40
Preparare sempre reagenti
freschi prima dell'analisi.
Per risultati ottimali, usare
la miscela di mezzo di
separazione/colorante
entro 4 ore dalla
preparazione.
Nota: i picchi suddivisi
possono causare un errore
di stima del formato del
frammento per lo standard
di formato e quindi
richiedere l'impostazione
manuale del marker
superiore.
®
®
WAVE MCE
Problema 7 – Codici di errore in WAVE MCE Viewer per il software SURVEYOR
Call
I codici di errore come quelli indicati nella Figura 24 possono verificarsi durante l'uso di WAVE MCE
Viewer per il software Chiamata SURVEYOR. Vedere la tabella seguente per la spiegazione degli
errori e dei rimedi.
Figura 24: Esempio di messaggio per il codice di errore W-01
Tabella: Codici di errore del software WAVE MCE
Codice
Messaggio
Spiegazione del messaggio
I picchi marker per il controllo <nome>
hanno dimensione e/o indice migrazione
non corretti. L'analisi su questo campione
non può essere eseguita.
Rimedi per la risoluzione dei
problemi
Verificare WAVE MCE System,
eseguendo lo strumento
"Controllo esecuzione analisi".
Consultare anche la sezione
“Revisione manuale delle
immagini gel e degli
elettroferogrammi WAVE MCE ”
per valutare i risultati
manualmente e quindi il punto 8g
della "Procedura di richiamo
SURVEYOR Scan ” per
modificare un richiamo se uno dei
marker non soddisfa i criteri di
richiamo di SURVEYOR Scan
mediante il confronto con i
controlli.
W-01
Marker non valido
W-02
Ladder non valido
Lo standard di dimensione usato come
Ladder non è conforme ai parametri
operativi. Impossibile eseguire l'analisi.
Controllare che lo standard di
dimensione ottimizzato di WAVE
MCE rispetti una diluizione 10x.
Controllo WT non
valido
Uno o più picchi per il controllo wild type
dell'exon 2 non sono analizzabili. Il
problema è correlato all' altezza del picco o
all' indice migrazione atipici. L'analisi
KRAS dei campioni non può essere
eseguita.
Controllare lo strumento e altri
controlli. Se questi sono
soddisfacenti ripetere la PCR e la
digestione SURVEYOR Nuclease.
Controllo positivo
non valido
I picchi del controllo positivo nel codone
12 non sono separabili o presentano
altezza picchi o indice di migrazione non
corretti. L'analisi KRAS dell'exon 2 dei
campioni non può essere eseguita.
Controllo positivo
non valido
I picchi del controllo positivo nel codone
13 non sono separabili o presentano
altezza picchi o indice di migrazione non
corretti. L'analisi KRAS non può essere
eseguita.
W-03
W-04
W-05
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®
®
WAVE MCE
Messaggio
Spiegazione del messaggio
Rimedi per la risoluzione dei
problemi
W-08
Campione non
valido
Il picco intonso per il campione presenta
altezza picco o indice migrazione atipici.
L'analisi KRAS non risponde ai criteri per
Nessuna variante individuata.
Controllare lo strumento e i
soddisfacenti ripetere la PCR per
template adeguati. Se possibile,
ripetere la PCR e la digestione
SURVEYOR Nuclease.
W-09
Controllo
mancante - Exon
2 Wild-Type
Il controllo wild type dell'esone 2 non è
presente sulla piastra del campione.
L'analisi KRAS non può essere eseguita.
Includere un controllo wild-type
per l'exon 2 e ripetere l'analisi.
W-10
Controllo
mancante- Codon 12
Il controllo positivo per il codone 12
dell'exon 2 non è presente sulla piastra
del campione. L'analisi KRAS non può
essere eseguita.
Includere un controllo wild-type
per il codone 12 dell'exon 2e
ripetere l'analisi.
W-11
Controllo
mancante- Codone 13
Il controllo positivo per il codone 13
dell'exon 2 non è presente sulla piastra
del campione. L'analisi KRAS non può
essere eseguita.
Includere un controllo positivo per
il codone 13 dell'exon 2e ripetere
l'analisi.
Ladder mancante
Nessun ladder (standard di dimensione)
L'analisi KRAS non può essere eseguita.
Includere un WAVE MCE
Optimized DNA Size Standard
adeguatamente diluito per il
ladder e ripetere l'analisi.
Codice
W-14
Dettagli per gli ordini
Numero di
catalogo
Nome del prodotto
Formato
710105-CEIVD
SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit
Exon 2 CE IVD
100 analisi
MCE-99-2020B
WAVE MCE MicroChip Electrophoresis System
Ciascuno
MCE-99-3600
WAVE MCE Optimized Microchip
Ciascuno
MCE-99-5000
Kit del mezzo di separazione WAVE MCE
ottimizzato
circa1.000
analisi
MCE-99-5500
WAVE MCE Optimized Marker Kit
MCE-99-5600
WAVE MCE Optimized Cleaning Reagents Kit
circa1.000
analisi
1 Kit
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®
®
WAVE MCE
Contatti
Sede centrale Europa
M Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street
Omaha,
Nebraska 68164
Stati Uniti
Regno Unito
EC Authorized Representative
P Transgenomic Limited
40 Watt Road, Hillington Park, Hillington
Glasgow G52 4RY
Telefono: +1 (402) 452-5400
Fax: +1 (402) 452-5401
Telefono: +44 141 892 8800
Fax: +44 141 883 5967
E-mail: [email protected] E-mail: [email protected]
Certificazione ISO 9001:2008
Transgenomic, Inc. utilizza un sistema di gestione della qualità conforme ai requisiti ISO 9001:2008
come attestato da BSI, certificato # FM 538914.
www.Transgenomic.com
Licenze, marchi e copyright
SURVEYOR Nuclease. Il presente prodotto è realizzato sotto licenza esclusiva dei brevetti US Patents 6,699,980, 6,391,557,
5,869,245, i corrispondenti brevetti per l'estero e altri brevetti in attesa di autorizzazione. L'uso di SURVEYOR Nuclease
necessita di una licenza rilasciata da Transgenomic. L'acquisto del presente prodotto da parte di organizzazioni accademiche,
no-profit e for-profit concede loro diritti limitati all'uso di SURVEYOR Nuclease a scopi di ricerca. È severamente vietato
rivendere il presente prodotto o utilizzarlo per altri scopi. Per maggiori informazioni rivolgersi a Transgenomic.
DNA polimerasi: l'uso del presente prodotto è coperto da uno o più dei seguenti brevetti US e dalle corrispondenti
rivendicazioni di brevetto al di fuori dagli Stati Uniti:, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155nonché rivendicazioni al di fuori dagli
Stati Uniti corrispondenti al brevetto US n° 4,889,818. L'acquisto del presente prodotto implica una garanzia limitata e non
trasferibile contro azioni legali in virtù delle suddette rivendicazioni di brevetto in merito all'utilizzo del solo quantitativo di
prodotto che l'acquirente ha a disposizione per le proprie ricerche interne. Non viene concesso, né espressamente, né
implicitamente o per preclusione, alcun altro diritto in virtù di altre rivendicazioni di brevetto (quali le rivendicazioni che coprono
il processo brevettato della 5' nucleasi con brevetti US n. 5,210,015 e 5,487,972), nessun diritto ad applicare qualsivoglia
metodo brevettato né nessun diritto ad eseguire servizi commerciali di alcun tipo, compresi, senza alcuna limitazione, la
divulgazione a scopo di lucro dei risultati delle attività svolte dall'acquirente o altre considerazioni commerciali. Questo prodotto
ha solo scopo di ricerca. Gli utilizzi diagnostici in virtù dei brevetti Roche necessitano di una licenza a parte rilasciata da Roche.
Per maggiori informazioni sull'acquisto di licenze rivolgersi a Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre
Drive, Foster City, California 94404, USA.
Transgenomic, SURVEYOR e WAVE sono marchi registrati, mentre il logo con l'elica e Advancing Personalized Medicine sono
marchi di Transgenomic, Inc. Tutti gli altri marchi appartengono ai rispettivi proprietari.
© 2012 Transgenomic, Inc. Tutti i diritti riservati. Stampato negli Stati Uniti.
Documento n° 482356-03(IT)
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WAVE MCE
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Istruzioni per l`uso di SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit

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