SLIDE - microbiologia bargiggia

Diagnostica sierologica
delle malattie infettive
in età pediatrica
G. Bargiggia
Bergamo 22 novembre 2014
La diagnosi microbiologica è finalizzata alla ricerca
ed alla identificazione dell'agente eziologico
Adenomegalie virali
Interessamento linfonodale loco-regionale o generalizzato
Segni e sintomi vanno accuratamente valutati (anamnesi clinica ed esame obiettivo)
- Eruzione cutanea
generalizzata (EBV, CMV, VZV, Morbillo, Rosolia, HIV)
localizzata (HSV 1 e 2, Adenovirus, Enterovirus, West Nile, Dengue)
- Febbre, esantema, astenia, cefalea, mialgie, faringodinia, ipertrofia tonsillare,
splenomegalia, epatomegalia di grado lieve (EBV, CMV)
- Contatti a rischio, soggiorno in zone endemiche, punture d’insetto
Altri esami di laboratorio non virologici:
- linfocitosi, inversione della formula leucocitari, presenza di linfociti attivati,
ipertransaminasemia, piastrinopenia
Epstein Barr Virus (EBV)
La trasmissione si manifesta già prima dei 3 anni, prevalentemente asintomatica.
Nei paesi sviluppati l’infezione primaria spesso si manifesta durante l’adolescenza
presentandosi come infezione mononucleosica (MI)
A 10 anni la sieroprevalenza è del 50% e negli adulti del 95%
Qual è la differenza fra l’EBV e l’amore?
EBV è eterno!
L’IM si presenta con quadri clinici diversi, da malattia mite a grave
- Linfadenopatia (presente nel 94% dei casi)
Prime due settimane
Linfocitosi atipica (↑↑CD8)
> 20% “cellule atipiche” attivate
Prevalentemente cervicale
Febbre (80%)
Esantema (5%)
Ittero (9%)
80-90% ↑ enzimi epatici
- Malessere generale (anche per settimane/mesi) e faringite (84%)
- Risoluzione spontanea (2-3 settimane)
EBV
- Anemia emolitica autoimmune (~2%) - moderata trombocitopenia
- Sintomi neurologici (< 1%) forma acuta a guarigione spontanea
- Ampicillina e Amoxicillina prurito ed esantema maculopapulare (95%)
- Rottura della milza (infrequente ma a rischio di vita) → astensione attività sportive
per 3-4 settimane
- Immunodeficienza malattia linfoproliferativa o linfoma
(linfoma endemico di Burkitt - 100%)
(linfoma Hodgkin e carcinoma nasofaringei - 25%)
EBV
Diagnosi di Laboratorio
Anticorpi Eterofili
Compaiono precocemente nel siero
EBV
- Prove di Paul-Bunnell
Titolazione del siero per diluizione a raddoppio con globuli rossi di pecora
(↑ sensibilità
con globuli rossi di cavallo)
- adsorbimento con rene di cavia (↑ specificità eliminando anticorpo di Forssman)
- adsorbimento con stromi di cellule bovine (↑↑ specificità)
- Monospot
Particelle di lattice (agglutinazione su vetrino)
Sensibilità 84 - 100%
Specificità 89 - 100%
Risultati falsi negativi in < 14 anni
- Immunocromatografia
Possono rimanere positivi per molti mesi dopo la risoluzione dei sintomi e nelle
infezioni asintomatiche
Anticorpi anti-Envelope
EBV
- IgG, IgM e IgA anti-VCA
Tipicamente presenti all'insorgenza dei sintomi
All’esordio le IgG raggiungono spesso titoli elevati
Durante la convalescenza
non rilevabili
(entro 3-6 mesi dall’esordio)
le IgA e le IgM diminuiscono a livelli
EBV
- IgM con immunofluorescenza indiretta (IFA)
Elevata sensibilità (complessi IgG anti EBV e le IgM del fattore reumatoide possono determinare falsi
risultati positivi → pretrattamento)
Fluorescenza aspecifica anti-cellule
- IgM (ELISA - CLIA - ELFA)
Affidabili e più usate
Falsi positivi in corso d’infezione primaria da CMV
Anticorpi anti EBNA-1
EBV
IgG anti-EBNA 1 (ELISA - CLIA - ELFA)
Non sono di solito rilevabili prima del periodo della convalescenza
Se presenti escludono una MI recente o in atto
EBV DNA
PCR quantitativa
Monitoraggio pazienti immunocompromessi a rischio di EBV associato
linfoproliferativa ed in corso di MI complicata
Mancanza di standard internazionali
a
malattia
Citomegalovirus (CMV)
Infezione a diffusione ubiquitaria e di solito asintomatica.
Prevalenza negli adulti è di circa il 40% e aumenta ovunque dell’1% l’anno
(variazioni 40 -100% in funzione dell’etnia, della classe sociale e dei fattori di rischio
sessuali)
Infezione congenita (0.5% dei nati vivi)
Trasmissione perinatale (alla nascita o con l’allattamento al seno)
Infezione nei primi anni d’infanzia (trasmissione negli asili nido - rilascio virale per molti
mesi con le secrezioni respiratorie e con le urine)
Trasmissione a soggetti sieronegativi con l’inizio dell’attività sessuale o con
emoderivati
L’età media dei pazienti con mononucleosi da CMV è maggiore di quella da MI
sostenuta da EBV
Clinicamente difficile da differenziare da quella da EBV
- Ingrossamento dei linfonodi e della milza
(non frequente)
- Tonsillite e faringite (rare)
- Epatite grave o ittero (infrequenti sebbene compaia spesso innalzamento degli enzimi epatici)
- Malessere (67%), febbre (46%), sudorazione (46%)
Risoluzione spontanea nei soggetti immunocompetenti
CMV
Paziente immunocompromesso
- polmonite
- retinite
- epatite
- malattia gastrointestinale
CMV
Elevata morbilità e mortalità in assenza di terapia
Malattia congenita grave
> frequenza in caso di infezione materna primaria
L'infezione nell’adulto immunocompetente può determinare la sindrome di GuillainBarré
L’infezione attiva nella donna in età fertile dovrebbe consigliare l'immmediato
accertamento per confermare o escludere la condizione di gravidanza
Diagnosi di Laboratorio
- ELISA IgM
CMV
Metodo più diffusamente utilizzato
Frequenti reazioni crociate in corso di infezione primaria (44% dei pazienti inizialmente reattvi
anche per EBV IgM)
- Avidity IgG
Conferma di infezione recente
- PCR (sangue e urine)
Riservata come monitoraggio, diagnosi e gestione dei pazienti immonocompromessi, in
gravidanza e per l’infezione congenita
CMV può essere confermato con la PCR in circa il 60% dei pazienti perché i soggetti
immunocompetenti possono essere viremici solo nei primi giorni della malattia
CMV
Rosolia (Rub)
Rub
L’epidemiologia della rosolia è cambiata in modo consistente dopo l’adozione nel
1988 della vaccinazione con MMR (Measles, Mumps, Rubella)
Dalla metà degli anni ’90, la diminuzione della vaccinazione dei bambini in tenera età
a seguito di segnalazioni di possibili complicanze dovute all’utilizzo del vaccino MMR
ha condizionato la possibilità di epidemie da rosolia che sono ancora una volta
possibili
La popolazione che arriva da paesi in via di sviluppo,
privi di programmi di vaccinazione, può essere
suscettibile al rischio d’infezione
Rub
Rub
Malattia lieve, moderatamente febbrile, con eritema fugace e linfoadenopatia
retroauricolare, sub-occipitale e alle ghiandole cervicali posteriori
Occasionalmente negli adulti si manifestano artralgie e artrite
Spesso i bambini presentano moderata sintomatologia che si risolve spontaneamente
Diagnosi differenziale con infezioni da CMV e Parvovirus B19
Rosolia congenita (da infezione primaria in gravidanza)
Gravi danni del feto se si manifesta nelle prime 16 settimane
La reinfezione è di solito a carattere sub-clinico e l’indice di rischio per il feto è
ridotto, ma comunque presente se insorge nelle prime 16 settimane di
gestazione
Rub
Diagnosi di Laboratorio
Rub
- HAI (emoagglutinazione)
- LA (agglutinazione al lattice)
- ELISA IgM
IgM specifiche rilevabili nei primi 4 giorni dalla comparsa dell’esantema e nelle 4 - 8
settimane successive
Elevata sensibilità ma (causa bassa prevalenza) ridotto indice predittivo
- IgG avidity
Per confermare la rosolia acuta è importante prelevare campioni multipli per definire
l’aumento del titolo delle IgG (> 4 volte dopo 10-15 gg) o la loro bassa avidità
- PCR
(a trascrizione inversa)
Sospensione
cellulare/antigene
Diluizioni scalari
del siero
Pozzetti di reazione
Lettura
HIV
Retrovirus (virus a RNA) - inserisce
(provirus) della cellula ospite
il suo genoma (grazie all’enzima trascrittasi inversa)
nel DNA
T CD4 principale bersaglio (deplezione alla base dell’immunodeficienza progressiva)
- Infezione primaria (poche settimane)
Asintomatica (spesso)
Malattia acuta simil-influenzale
(linfoadenopatia, eruzione cutanea, febbre,
artralgie,
mialgie, malessere)
- Fase di latenza (mesi/anni)
Assenza di segni clinici ma attiva replicazione virale
↓↓ CD4
- Fase clinica manifesta (AIDS)
Infezioni opportunistiche, neoplasie
Trasmissione
- Sessuale
- Ematica (scambio di siringhe, lesioni cutanee o delle mucose…)
- Verticale (gravidanza, parto, allattamento)
HIV
Diagnosi di Laboratorio
Test sierologici di screening e di conferma
HIV
- EIA/CLIA
ab anti HIV-1 e HIV-2 eAg p24 (quarta generazione)
- Western Blot / Immuno Blot
distinzione tra HIV-1 e HIV-2
Combinazione dei due test → valore predditivo positivo prossimo al 100%
- HIV RNA quantitativo
- test fenotipici e genotipici
Neonato
Gli anticorpi rilevati potrebbero essere dovuti a trasmissione passiva materna
(persistenza anche oltre i 18 mesi)
- HIV DNA provirale
- isolamento virale nei linfo-monociti del sangue periferico (PBMC)
- ricerca specifica di p24 serica
HIV
West Nile Virus
Arbovirus diffuso in Africa, Asia occidentale, Europa, Australia e America
Serbatoi naturali
- uccelli selvatici e zanzare (Culex)
↓
> equini
< cani, gatti, conigli ecc.
No trasmissione da persona a persona per contatto con soggetto infetto
Raramente per trapianto d’organo, trasfusione, da madre a feto in gravidanza
Infezione asintomatica nella maggior parte dei soggetti infetti
~ 20% lievemente sintomatica (febbre, mal di testa, nausea, vomito,
linfonodi
ingrossati, sfoghi cutanei)
< 1% sintomi più gravi (febbre alta, forti mal di testa, disorientamento,
tremori, disturbi
encefalite letale)
della vista, torpore, convulsioni, fino alla paralisi ed al coma - 1/1000
WNV
Diagnosi di Laboratorio
WNV
IgM/IgG
ELISA - IFA
siero, urine, liquor
PCR
(WNV RNA < 8 giorni)
Coltura virale
Linfoadenopatie batteriche e parassitarie
Generalmente di natura
benigna a decorso autolimitante
Bartonella spp.
Maggior rappresentante di febbre di origine sconosciuta
B. henselae (malattia da graffio di gatto) - pulci
Cat scratch disease
B. bacilliformis (malattia di Carrion) - pappataci- Endemica in Sud America
B. quintana (febbre delle trincee) - pidocchi
Replicazione intraeritrocitaria
Mancata risoluzione dell’infezione nell’immunodepresso
Diagnosi di Laboratorio
- IgG & IgM immunofluorescenza
- Western Blot
- PCR
Torino
112 casi sospetti → 14 PCR +
Chlamydia trachomatis
Infezione batterica, sessualmente trasmessa, più diffusa
Prevalenza
C. trachomatis 3,2%
< 25 anni)
(~ 76.000 campioni età media 35 anni)
(8%
Trichomonas vaginalis 0,7%
Neisseria
gonorroheae 0,2%
Trend di positività in aumento (stretta correlazione con infezione da HIV)
Infertilità
20% maschio
75% femmina
1^ causa di malattia infiammatoria pelvica (25-70% dolore pelvico)
> 70% asintomatica o non riconosciuta → cronicizzazione
Gravidanza
25-60% trasmissione verticale
↓
- congiuntivite (spesso a risoluzione spontanea)
- polmonite interstiziale (tosse secca simil pertosse)
IgA ≥ 1:320 diagnostico (escludere RSV)
Titolo
Diagnosi di Laboratorio
C. trachomatis
- IgG, IgA, (IgM) immunoperossidasi
Bassa sensibilità e
specificità
Utilità: PID, pneumopatie
neonatali, LGV (dal 2000 in
significativo aumento nei maschi omosex HIV +),
epidemiologia
- NAT (test di amplificazione genica)
Sensibilità > 90%
Specificità > 99%
maschi:
1° getto di urina
femmine: prel.vo vaginale* o 1° getto di urina
Treponema pallidum (Sifilide)
Il numero di casi di sifilide primaria, secondaria e latente precoce diagnosticati è in
significativa crescita
Europa ~ 20.000 casi (stima CDC 2011)
Italia ~ 20% degli stranieri
Gli omosessuali esprimono il 73% dei casi di sifilide infettiva e la co-infezione con
HIV è frequente nei pazienti con diagnosi di sifilide (27%)
L'aumento del numero di casi di sifilide nelle donne in età riproduttiva ha portato a un
aumento dei casi d’infezione congenita
Vecchie infezioni: titolo RPR cala molto lentamente
Infezioni recenti: in corso di terapia il titolo RPR si negativizza entro i sei mesi
T. pallidum
Sifilide secondaria
- esantema, linfadenopatia
meno frequentemente febbre,
persistenza di ulcera primaria,
condilomi, piastre mucose e alopecia
percettiva,
peritonite, artrite, iridociclite
- epatite, meningite, neuropatia periferica, sordità
splenomegalia,
Nessuna di queste manifestazioni è presente in più del 2%
dei pazienti
Diagnosi di Laboratorio
Test reaginici
T. pallidum
- VDRL*
- RPR
* unico test validato per il liquor
Test treponemici
- TPHA/TPPA
- ELISA/CLIA
- FTA IgM (IFA)
- Western Blot
- PCR
T. pallidum
Sifilide - Microscopia in campo scuro
Sifilide - Immunofluorescenza (FTA-IgM)
Madre con sierologia positiva per sifilide e trattamento penicillinico documentato →
sottoporre neonato a procedure di screening clinico e sierologico alla nascita (a maggior
ragione per follow up neonati da madri sieropositive non trattate)
- Neonato certamente infetto
Presenza di IgM o identificazione di T. pallidum nelle
lesioni
- Neonato ad alta probabilità di infezione
Segni/sintomi clinici compatibili e sierologia positiva o
titolo anticorpale ≥ 4 volte quello materno alla nascita
- Neonato a bassa probabilità di infezione
Asintomatico con titolo sierologico non superiore a
quello materno
- Raccomandato lo studio del LCR nel neonato certamente infetto o ad elevata
probabilità di infezione
sifilide
neurologico (VDRL
Le alterazioni del liquor sono molto frequenti nei neonati con
congenita anche in assenza di segni di coinvolgimento
positiva, leucocitosi, proteine elevate)
- Raccomandata ripetizione della puntura lombare ogni sei mesi sino alla
normalizzazione di tutti i parametri
- Valutazione attenta della crescita e dello sviluppo intellettivo, vista e udito sino ai
tre anni di età
L’esclusione definitiva della sifilide congenita si basa sulla negativizzazione della
sierologia (test treponemici) nel bambino
Tubercolosi
Micobacterium tuberculosis
Italia
< 10 casi/100.000 abitanti (Romania 100/100.000 - India >)
~ 40% forme extrapolmonari
Spesso paucisintomatica (tranne HIV+); spesso interessamento laterocervicale
Diagnosi di Laboratorio
- Microscopia
- Coltura
- PCR
- Test cutaneo (tubercolina)
- Test IGRA
Borrelia spp.
Borrelia spp.* viene trasmessa all'uomo con il morso di zecche del genere Ixodes
* B. burgdorferi “sensu stricto” (Stati Uniti e, in < misura, Europa e Asia), B..afzelii e B. guarinii (Europa e Asia)
Il serbatoio in natura è rappresentato dall'animale con spirochetemia
Incubazione: 3-14 gg (talvolta ≥ 1 mese)
- 1^ fase: precoce
Borrelia spp.
a) localizzata - 1° stadio (eritema cronico migrante)
Papula
corrispondenza del morso che si
estende ad anello
b) sistemica - 2° stadio (infezione disseminata)
eritematosa
in
Diffusione delle
borrelie al cuore, SNC*, muscolo
scheletrico e nuovamente alla cute
* Nei bambini
interessamento del nervo ottico
- 2^ fase: tardiva (infezione persistente)
- 3° stadio
Artriti recidivanti
o croniche
(60% dei soggetti non trattati)
Diagnosi di Laboratorio
Borrelia spp.
- ELISA
- IFA
- Western Blot*
- PCR*
*siero e liquor
Rickettsia spp.
Genere di microorganismi (gram-negativi) parassiti intracellulari obbligati trasmessi da
artropodi (> zecche, < pulci e pidocchi)
2 Biotipi
- Febbre maculosa (Spotted Fever Group)
Febbre bottonosa (R. conorii)
Febbre
maculosa
delle
Montagne Rocciose (R. rickettsii)
Tifo da zecche (R. australis, R.
sibirica)
Rickettsiosi
vescicolare
(R.
akari)
Febbre bottonosa orientale (R.
japonica) - acari del topo
- Dermotifo (Typhus Fever)
Tifo murino o endemico (R.
typhi) - pulci del ratto e animali domestici
Tifo epidemico (R. prowazekii) -
Rickettsia conorii sub. Conorii (Mediterranean spotted fever - Febbre bottonosa)
- febbre (> 39° C)
- sintomatologia simil-influenzale
- escara scura (tache noire)
- rash maculopapulare diffuso
- manifestazioni neurologiche
- interessamento multiorgano
In Francia
< 10 > 50 anni
fattori di rischio
tasso di mortalità ∼ 2,5%
età avanzata, immunocompromissione,
alcolismo, deficienza di G6PD, trattamento
inadeguato o ritardato
Rickettsia
Diagnosi di Laboratorio
Rickettsia
- Weil-Felix
P. vulgaris OX2, P. vulgaris OX 19, P. mirabilis OXK
- MIF (microimmunofluorescenza)
- IgM / IgG
ELISA
- Western Blot
- Isolamento (inoculazione in animale)
- Immunologico (ab monoclonali coattati su biglie magnetiche)
- PCR
Toxoplasma gondii
Zoonosi a diffusione ubiquitaria
(varia incidenza nei diversi paesi)
Interessa numerose specie di mammiferi
I gatti sono importanti vettori di trasmissione
L’infezione si manifesta di solito dopo ingestione di oocisti presenti nella carne cruda o
parzialmente cotta e sulle verdure contaminate con escrementi animali
Toxoplasma gondii
Solo il 10 - 20% delle infezioni dell'adulto sono
sintomatiche
Manifestazioni cliniche non patognomoniche
Se presenti:
- linfoadenopatia cervicale (ingrossamento di alcuni o tutti i linfonodi)
- febbre, malessere, mialgie, faringodinia, esantema maculopapulare ed
epatosplenomegalia
T. gondii è causa del 3 - 7% di tutte le linfoadenopatie clinicamente significative e
dell'1% delle sindromi mononucleosiche
Infezione solitamente ad andamento benigno ed autolimitante
Sintomatologia (se presente) in risoluzione in pochi mesi (raramente persistono per più di12)
Toxoplasma gondii
Paziente immunocompromesso
Malattia di solito grave
(conseguente alla riattivazione dell’infezione latente)
- encefalite
- polmonite
- corioretinite
In gravidanza l’infezione primaria può causare infezione congenita con possibile
danneggiamento grave del feto quando acquisita, in particolare, nel primo trimestre di
gestazione
Toxoplasma gondii
Diagnosi di Laboratorio
- Ig totali
- IgG, IgM, IgA
- IgG avidity
- Western Blot
- PCR
- IGRA
La toxoplasmosi acuta nei soggetti immunocompetenti può essere effettivamente
esclusa con la negatività dei test di screening
L’utilizzo di saggi a elevata sensibilità e specificità quali ISAGA, ELFA e avidità delle
IgG è raccomandato per confermare l’infezione acuta (specialmente in gravidanza)
Toxoplasma gondii
Tripanosoma cruzi
A poeira de Curvelo não az mal para ninguém não
Do pulmão lá ninguém morre
O que mata é o coração
(From the poem “O galo cantou na serra”
by Luiz Claudio and Guimarães Rosa)
“La polvere di Curvelo non fa male a nessuno
Nessuno muore lì di malattia polmonare.
Quello che uccide è il cuore”
Tripanosoma cruzi
La tripanosomiasi americana (malattia di Chagas) è una zoonosi diffusa in ambienti rurali
dell’America Latina (stima 16 -18 milioni di persone, ~ 20% della popolazione boliviana, 1,3 - 4% in
Brasile)
45.000 - 50.000 morti all’anno (morte cardiaca improvvisa per fibrillazione ventricolare nel 60% dei
casi) tra pazienti affetti principalmente dalla forma cardiaca cronica
- Forma acuta classica
Spesso inapparente o paucisintomatica
(specie nei bambini) - Segno di Romaňa
- Cardiopatia chagasica acuta
Miocardite (< 5% dei casi, spesso pediatrici
nelle aree endemiche)
Tripanosoma cruzi
- Forme congenite
Infezione intrauterina: aborto spontaneo
o prematuro
Neonato: basso peso, epato-splenomegalia, ittero, anemia, febbre,
meningoencefalite con convulsioni - coinvolgimento cardiaco raro
- Forma indeterminata
fase asintomatica (dopo 3 - 8 w di fase acuta) - nel 50 - 70% dei casi dura tutta la
vita
ogni anno ~ 3% di essi sviluppano patologia chagasica
- Cardiopatia chagasica cronica
30% degli individui infetti (> maschi) con progressivo deterioramento del
tessuto miocardico → insufficienza di pompa → aritmia fatale
Diagnosi di Laboratorio
- Xenodiagnosi
- Emoagglutinazione
- Agglutinazione al lattice
- ELISA/CLIA
- IFA
- Western Blot
- PCR
(sensibilità 96 - 100%)
Tripanosoma cruzi