BD CHROMagar Orientation Medium

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BD CHROMagar Orientation Medium
ISTRUZIONI PER L'USO
TERRENI SU PIASTRA
PRONTI ALL'USO
PA-257481.03
Rev.: Sep 2011
BD CHROMagar Orientation Medium
USO PREVISTO
BD CHROMagar Orientation Medium (terreno di coltura di orientamento BD CHROMagar) è
un terreno di coltura non selettivo per l'isolamento, l'identificazione diretta, la differenziazione e
la conta di agenti patogeni del tratto urinario. BD CHROMagar Orientation Medium consente di
differenziare e identificare l'Escherichia coli e l'enterococco senza test di conferma.
PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA
Metodo microbiologico.
I gruppi di Escherichia coli, enterococchi, Klebsiella-Enterobacter-Serratia e Proteus-MorganellaProvidencia sono gli organismi che più frequentemente causano infezioni del tratto urinario. Il
60-70% delle infezioni urinarie sono causate da E. coli in coltura pura o unitamente ad
enterococchi. Lo Staphylococcus saprophyticus e lo Streptococcus agalactiae si riscontrano,
anche se con minor frequenza, nelle infezioni del tratto urinario di pazienti donne.
Data la diversa sensibilità antimicrobica degli agenti patogeni, per instaurare una terapia efficace
è necessario procedere all'identificazione delle specie con batterie di test biochimici. Si tratta di
una delle attività che richiedono più tempo per i laboratori che trattano campioni di urine. Le
specie o gruppi di organismi isolati con maggiore frequenza producono enzimi caratteristici.
Pertanto è possibile identificare tali organismi a livello di specie, con un numero limitato di test di
utilizzo o fermentazione del substrato.1,2
Alcuni degli organismi in questione producono enzimi per il metabolismo del lattosio o glucosidi,
oppure entrambi, mentre altri non producono nessuno di questi enzimi. Ad esempio, l'E. coli
produce enzimi del metabolismo del lattosio ma è negativa per quanto riguarda la ß-glucosidasi.
Altri membri della famiglia delle Enterobacteriaceae sono positivi alla ß-glucosidasi ma non
contengono gli enzimi necessari per la fermentazione del lattosio, mentre altri possono
contenere entrambi i tipi di enzimi o nessuno di essi. Le beta-glucosidasi si trovano anche nei
cocchi Gram-positivi ad esempio enterococco spp. e Streptococcus agalactiae. La triptofano
deaminasi (TDA) è un enzima che di solito si trova negli organismi del gruppo ProteusMorganella-Providencia.
Dalle valutazioni delle prestazioni è emerso che BD CHROMagar Orientation Medium è
migliore dei terreni di coltura differenziali, come l'agar CLED o una combinazione degli agar
Blood e MacConkey, comunemente utilizzati per l'isolamento, la differenziazione e la conta degli
agenti patogeni che causano infezioni del tratto urinario.3-5 BD CHROMagar Orientation
Medium consente l'identificazione dell'E. coli e degli enterococchi direttamente sulla piastra di
isolamento; inoltre permette di identificare in via presuntiva gran parte dei ceppi di
Staphylococcus saprophyticus e S. agalactiae, oltre che i gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia
(=KES) e Proteus-Morganella-Providencia (=PMP) per mezzo della colorazione della colonia e
del terreno di coltura. Dato che BD CHROMagar Orientation Medium non è selettivo, può
verificarsi la crescita di altri agenti patogeni del tratto urinario, ma sono necessari test biochimici
per identificarli.
CHROMagar Orientation Medium è stato sviluppato da A. Rambach e viene venduto da BD
Diagnostic Systems su licenza di CHROMagar, Parigi, Francia.
In BD CHROMagar Candida Medium i nutrienti sono forniti da peptoni appositamente
selezionati. La miscela cromogena è costituita da substrati artificiali (cromogeni) che rilasciano
composti di colore diverso a seconda della degradazione di enzimi microbici specifici,
assicurando in tal modo la differenziazione diretta di alcune specie o la rilevazione di determinati
gruppi di organismi, mediante semplici test di conferma.
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REAGENTI
BD CHROMagar Orientation Medium
Formula* per litro di acqua purificata
Cromopeptone
16,1 g
Miscela cromogena
1,3
Agar
15,0
pH 6,9 ± 0,2
*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento.
PRECAUZIONI
. Solo per uso professionale.
Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni cromatiche,
essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento.
Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i
prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO.
CONSERVAZIONE E VITA UTILE
Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 – 8 °C nella confezione originaria fino a
immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono
essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i
tempi di incubazione raccomandati.
Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana
se conservate in luogo pulito a 2 – 8 °C.
CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE
Inoculare i campioni rappresentativi con i seguenti ceppi (per informazioni più dettagliate, v.
ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Incubare le piastre in posizione invertita a 35 – 37 °C in
aerobiosi per 20 – 24 h.
Ceppi
Risultati della crescita
Crescita da buona a eccellente, colonie medio-grandi, dal rosa
Escherichia coli
ATCC 25922
scuro al rosa acceso, trasparenti
Crescita da buona a eccellente, colonie medie, blu scuro con
Enterobacter cloacae
ATCC 13047
o senza aloni violetti
Crescita da buona a eccellente; colonie medie, dal bianco al
Proteus mirabilis
ATCC 14153
beige, circondante da un alone ambra-marrone; nelle zone
caratterizzate da densa crescita, il terreno di coltura può
presentarsi completamente da ambra a marrone. La
sciamatura è da parzialmente a completamente inibita.
Crescita da buona a eccellente, piccole colonie dal
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
verdazzurro al blu
Crescita da discreta a buona; le colonie tendono ad essere
Streptococcus agalactiae
ATCC 12386
piccole, dal verdazzurro chiaro all'azzurro, con o senza aloni
Crescita da buona a eccellente, colonie medio-piccole, del
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
loro colore naturale (bianco o panna)
Staphylococcus saprophyticus Crescita da discreta a buona; colonie piccole, opache, rosa
ATCC 15305 (=NCTC 10516) chiaro-rosa
Non inoculate
Da incolori ad ambra molto chiaro, trasparenti
PROCEDURA
Materiali forniti
BD CHROMagar Orientation Medium (piastre impilate Stacker da 90 mm).
Microbiologicamente controllate.
Materiali non forniti
Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie.
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Tipi di campioni
Il terreno è utilizzato esclusivamente per la conta e la differenziazione dei batteri nelle urine. Si
può utilizzare l'urina della minzione o del catetere, o quella raccolta mediante puntura vescicale
ipogastrica (v. anche PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA
PROCEDURA). Osservare le tecniche asettiche per il prelievo dei campioni urinari. Strisciare
l'urina direttamente sul terreno non più tardi di 2 h dopo il prelievo o conservarla in frigorifero
(non oltre 24 h) per evitare l'eccessiva crescita di agenti infettivi o contaminanti prima
dell'inoculazione del terreno.
Procedura del test
È obbligatorio l'uso di anse calibrate o altre tecniche comunemente utilizzate per il
posizionamento sulla piastra dei campioni di urina al fine di ottenere colonie isolate, con le
tipiche forme e colori.
Prelevare un campione di urina ben miscelata e non diluita usando un'ansa calibrata (0,01 o
0,001 mL). Verificare che l'ansa sia caricata correttamente con il campione. Inoculare il
campione a metà della piastra con una sola strisciata da cui espandere ulteriormente l'inoculo.6,7
Incubare le piastre in posizione invertita a 35 – 37 °C in aerobiosi per 20 – 24 h. Evitare
l'esposizione alla luce durante l'incubazione, in quanto la luce distrugge i cromogeni. Una
volta che i colori delle colonie si sono sviluppati l'esposizione alla luce è consentita.
Risultati
Dopo l'incubazione le piastre dovrebbero presentare colonie isolate nelle aree in cui l'inoculo è
stato correttamente diluito. Per l'identificazione o la differenziazione utilizzare la Tabella 1 e lo
Schema 1 oppure servirsene come linee guida per ulteriori test di conferma. Per la verifica dei
risultati possono essere utilizzati una colorazione di Gram o l'indagine microscopica.
Tabella 1 Linee guida per l'identificazione in base ai diversi colori delle colonie
Organismo
Aspetto in BD CHROMagar
Orientation Medium
E. coli a
Colonie medio-grandi, dal rosa scuro
al rosa acceso, trasparenti, con o
senza aloni sul terreno circostante
Colonie medie, dall'azzurro al blu
scuro, con o senza aloni violetti
Gruppo KES b
Gruppo PMP c
Colonie dal bianco al beige
circondate da aloni marronid
Enterococco
S. agalactiae
Piccole colonie verdazzurre
Le colonie tendono ad essere
piccole, dal verdazzurro chiaro al blu,
con o senza aloni
Piccole colonie opache dal rosa
chiaro al rosa acceso, con o senza
aloni
Pigmentazione naturale (panna)
S. saprophyticus (la maggior
parte dei ceppi)
Altro (compresi i lieviti)
Test di conferma
(Necessari per un'ulteriore
differenziazione)
BBL CRYSTAL E/NF per la
differenziazione all'interno dei
generi
Indolo, H 2 S e, ODC f, BBL
CRYSTAL E/NF per la
differenziazione all'interno dei
generi
PYR g
Disco alla novobiocina da 5 µg h
Test di identificazione biochimici
o sierologici adatti
Per le note a piè di pagina a-h, vedere lo schema 1
Test di conferma
Eseguire i test di conferma come richiesto (Tabella 1, Schema 1). Non applicare reagenti di
rilevazione direttamente sulle colonie in BD CHROMagar Orientation Medium. I test devono
invece essere eseguiti su filtri di carta con crescita proveniente dalle rispettive colonie.
Per le colonie di E. coli di colore dal rosa scuro al rosa acceso, ma tendenti ad essere di piccole
dimensioni, non utilizzare il reagente Kovac per l'indolo, in quanto il colore di queste colonie può
interferire con il colore rosso indice di positività dei test per l'indolo; utilizzare in sostituzione
reagente per l'indolo alla dimetilaminocinnamaldeide (DMACA) (verde = positivo).
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Se si utilizzano altri test di conferma o sistemi di identificazione biochimici, seguire le relative
istruzioni accompagnatorie.
Eseguire un test di conferma per l'enterococco solo se è necessario risalire alla specie oltre il
livello del genere.
Schema 1: linee guida per le prestazioni dei test di identificazione su organismi
selezionati
Aspetto della
colonia
Piccola, rosa, opaca
 Disco alla
novobiocina da
5 µg
 sensibile
S. intermedius,
S. simulans
 resistente  S. saprophyticus, S. xylosus
Colonie da incolori a  Gruppo PMP
beige, terreno da
arancione a marrone
 Test
 verde (positivo)
dell'indolo

alla DMACA i
H 2 S positivo e
H 2 S negativo e
 Da incolore a
rosa (negativo)
ODC positivo f
ODC negativo f
BBL CRYSTAL GP per la
differenziazione all'interno
dei generi
 P. vulgaris
Providencia spp.,
Morganella spp.
 P. mirabilis
 P. penneri
a
Vedere Limitazioni della procedura
KES = gruppo Klebsiella-Enterobacter-Serratia
c
PMP = gruppo Proteus-Morganella-Providencia
d
Il colore dall'ambra al marrone è dovuto alla positività alla triptofano deaminasi (TDA) comune a tutti gli
organismi che fanno parte del gruppo PMP. Circa il 50% dei ceppi di P. vulgaris producono colonie blu su
terreno da ambra a marrone.
e
Test convenzionale per l'acido solfidrico.
f
Test convenzionale per la ornitina decarbossilasi.
g
Test del piroglutamato per la pirrolidonil arilamidasi.
h
Inoculare per strisciamento una piastra Mueller Hinton II Agar con l'isolato. Posizionare un disco alla
novobiocina (da 5 µg) sulla piastra inoculata. Incubare per 18 – 24 h a 35 – 37 °C e determinare le
dimensioni della zona di inibizione. (resistente:  16 mm, suscettibile: > 16 mm).
i
DMACA= Reagente alla dimetilaminocinnamaldeide per la produzione di indolo. Applicare il reagente su
filtro di carta e strofinare una colonia con l'area contenente il reagente sul filtro di carta. Attendere 10 – 20
sec. Il colore verde è indice della produzione di indolo (rosso o incolore = negativo).
b
Calcolo e interpretazione dei risultati6,7
Contare il numero di colonie (UFC) sulla piastra. Se è stata usata un'ansa da 0,01 mL, ogni
colonia rappresenta 100 UFC/mL; se è stata usata un'ansa da 0,001 mL, ogni colonia
corrisponde a 1000 UFC/mL di urina.7
Urina della minzione e del catetere: le direttive vigenti stabiliscono che se un singolo isolato ha
una densità di 105 UFC/mL è presente infezione, se la densità è <105 UFC/mL si ha
contaminazione uretrale o vaginale, mentre una densità tra 104 e 105 UFC/mL rende necessario
un riesame alla luce dei dati clinici.7
I batteri contaminanti in genere appaiono in numero ridotto e in colonie di differenti forme.
Urina prelevata mediante puntura vescicale ipogastrica: poiché la vescica è sterile nei soggetti
non infetti, le UFC eventualmente osservate indicano la presenza di un'infezione.
Gli agenti patogeni del tratto urinario di solito danno luogo a conte elevate, con colore e
morfologia delle colonie uniformi in questo terreno di coltura.
PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
BD CHROMagar Orientation Medium è un terreno di coltura cromogeno per l'identificazione
diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni comuni del tratto urinario. Il terreno di
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coltura è usato per l'isolamento di numerosi microrganismi a crescita aerobica, ad es.
Enterobacteriaceae, Pseudomonas e altri bacilli Gram-negativi non fermentanti, enterococchi,
stafilococchi e molti altri presenti nei campioni urinari. Dalle valutazioni delle prestazioni è
emerso che BD CHROMagar Orientation Medium presenta vantaggi rispetto ad altri terreni di
coltura utilizzati per l'isolamento, la differenziazione e la conta degli agenti patogeni del tratto
urinario, quali l'agar CLED o una combinazione di agar Blood e MacConkey.3-5
BD CHROMagar Orientation Medium consente la differenziazione e l'identificazione della E.
coli e degli enterococchi senza test di conferma, in base ai criteri di identificazione stabiliti dallo
standard M35-A dell'CLSI “Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast; Approved Guideline”
(Linee guida approvate per l'identificazione abbreviata di batteri e lieviti).8 L'identificazione
presuntiva di S. saprophyticus, S. agalactiae e dei gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES)
e Proteus-Morganella-Providencia (PMP) è possibile mediante la morfologia della colonia, la
pigmentazione e l'alterazione cromatica del terreno di coltura.
Dato che la maggior parte delle infezioni del tratto urinario sono causate da E. coli e/o
enterococchi, l'uso di questo terreno di coltura riduce significativamente il carico di lavoro e il
tempo necessari per inoculare e leggere i sistemi di identificazione necessari quando si
utilizzano terreni di coltura convenzionali.
Risultati delle prestazioni4,9,10
Le prestazioni microbiologiche di BD CHROMagar Orientation Medium e di un terreno di
coltura cromogeno antagonista sono state confrontate con quelle dell'agar Columbia con il 5% di
sangue di montone e dell'agar MacConkey senza cristalvioletto per la conta e l'identificazione
presuntiva di batteri responsabili di infezioni del tratto urinario.4 Su un totale di 658 campioni
clinici di urina, 118 non hanno mostrato alcuna crescita, 402 campioni hanno evidenziato una
crescita con conta cellulare 105 UFC/mL e 138 campioni hanno mostrato una crescita con
conte cellulari <105 UFC/mL. Dei campioni con conta cellulare 105 UFC/mL, 163 si sono
dimostrati colture pure e 239 colture miste. È stato ottenuto un totale di 266 isolati di Escherichia
coli su entrambi i terreni di coltura cromogeni, 260 sono stati isolati sull'agar contenente sangue
e 248 sull'agar MacConkey. Uno dei ceppi (0,4%) non ha sviluppato il colore rosa acceso
previsto su BD CHROMagar Orientation Medium e 23 ceppi (8,7%) non hanno sviluppato il
colore rosa acceso previsto sul terreno di coltura antagonista. Gli enterococchi (BD
CHROMagar Orientation Medium, n = 266; terreno di coltura antagonista, n = 265) hanno
prodotto piccole colonie di colore verdazzurro su entrambi i terreni cromogeni. Cinquanta delle
colture miste contenevano enterococchi che sono stati rilevati solo sui terreni cromogeni. È stato
possibile identificare i gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES) e Proteus-MorganellaProvidencia (PMP) su entrambi i terreni cromogeni. Dei 66 isolati del gruppo KES, 63 hanno
presentato una crescita del colore previsto su BD CHROMagar Orientation Medium e 58 dei
64 isolati hanno presentato una crescita del colore previsto sul terreno antagonista. Per gli altri
microorganismi sono stati necessari ulteriori test di identificazione.
In una seconda valutazione delle prestazioni condotta su un totale di 421 campioni clinici di
urina, 286 hanno evidenziato la crescita di batteri o lieviti, BD CHROMagar Orientation
Medium è stato confrontato con BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood.9 Sul terreno
cromogeno sono stati ottenuti 483 isolati e sul terreno dell'agar contenente sangue sono stati
isolati 447 ceppi. I ceppi sono stati identificati biochimicamente. Dei ceppi di E. coli, il 95% è
stato identificato correttamente in base al colore dal rosa chiaro al rosa acceso delle colonie,
mentre il resto dei ceppi di E. coli non era pigmentato. Tutti gli isolati di Enterococcus spp.
hanno mostrato il tipico colore azzurro-verdazzurro delle colonie. Gli isolati di Streptococcus
agalactiae hanno dato luogo a piccole colonie dall'azzurro al verdazzurro e sono stati
differenziati dagli enterococchi mediante la negatività al test PYR. Tutti gli isolati di
Staphylococcus saprophyticus e S. simulans hanno prodotto piccole colonie rosa opache e sono
stati differenziati con il test alla novobiocina e identificati a livello delle specie con test biochimici.
In uno studio interno, condotto in cieco, che ha compreso l'analisi di oltre 900 ceppi batterici
sviluppatisi nelle urine, la sensibilità e la specificità di identificazione di BD CHROMagar
Orientation Medium per l'E. coli, esclusivamente in base al colore e alla morfologia della
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colonia, è stata rispettivamente del 97% e 99%; per l'enterococco la sensibilità e la specificità di
identificazione sono state rispettivamente del 99% e del 97%, (vedere la tabella).10
Organismo
E. coli
Enterococco
Sensibilità
% (Intervallo di attendibilità
95%)
277/286
96,9% (94,1 – 98,6%)
319/324
98,5% (96,4 – 99,5%)
Specificità
% (Intervallo di attendibilità
95%)
638/645
98,9% (97,8 – 99,6%)
603/622
97% (95,3 – 98,2%)
Limitazioni della procedura
Dato che questo terreno di coltura non è selettivo, la crescita riguarderà anche altri agenti
patogeni del tratto urinario. Le colonie che si presentano del loro colore naturale e non
reagiscono con i substrati cromogeni su BD CHROMagar Orientation Medium devono essere
ulteriormente differenziate con test biochimici o sierologici adeguati. Consultare la bibliografia.1,2
Per le colonie di E. coli di colore dal rosa scuro al rosa accesso ma tendenti ad essere di
dimensioni piccole, sono necessari altri test di conferma quali il test dell'indolo in diversi punti
(reagente per l'indolo alla DMACA).
I bacilli Gram-negativi diversi da quelli appartenenti al gruppo KES possono dare luogo a grandi
colonie di colore blu
su BD CHROMagar Orientation Medium e quindi per la loro identificazione potrebbero essere
necessari ulteriori test biochimici.11
In casi molto rari nell'urina potrebbero essere presenti Listeria monocytogenes o altre specie di
Listeria (ad es., in conseguenza di aborto dovuto a questi agenti). La Listeria produce piccole
colonie dal blu al verdazzurro
PYR-negative, somiglianti allo Streptococcus agalactiae. Pertanto potrebbe essere utile
preparare una colorazione di Gram di tutti i ceppi che, su questo terreno di coltura, danno luogo
a piccole colonie di colore dal blu al verdazzurro PYR-negative. La presenza di bacilli Grampositivi può essere indice di Listeria, ma sono necessari ulteriori test biochimici per confermarne
l'identificazione.
Molto raramente, gli isolati di Aeromonas hydrophila possono produrre colonie dal rosa al rosa
acceso. È possibile differenziarle dall'E. coli mediante un test per l'ossidasi (Aeromonas =
positivo; E. coli = negativo).
Occasionalmente, gli stafilococchi coagulasi-negativi diversi dallo S. saprophyticus, ad es.,
S. simulans, S. xylosus e S. intermedius, producono piccole colonie rosa opache. È pertanto
necessario eseguire ulteriori test (vedere lo Schema 1) su questi isolati.
BD CHROMagar Orientation Medium non supporta la crescita di organismi esigenti, quali la
Neisseria, l'Haemophilus o Mycoplasma spp.
L'uso di questo terreno di coltura per campioni clinici e non clinici diversi dall'urina non è stato
documentato.
Prima di utilizzare per la prima volta BD CHROMagar Orientation Medium, si consiglia di far
pratica con l'aspetto di una colonia tipica utilizzando ceppi definiti, ad es. i ceppi citati in
CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE.
BIBLIOGRAFIA
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Society for Microbiology. Washington, DC.
2. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 1998. Bailey & Scott’s diagnostic
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Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of
gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: 1788-1793.
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Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens.
J. Clin. Microbiol. 35: 2773-2777.
5. Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar. 1998. Evaluation of use of a new
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Washington, D.C.
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microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved Guideline
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version at www.clsi.org
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10. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA.
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Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H.
Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology,
Washington, D.C.
CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ
BD CHROMagar Orientation Medium
N. di cat. 257481
Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20
N. di cat. 254107
Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 120
ULTERIORI INFORMAZIONI
Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona.
Becton Dickinson GmbH
Tullastrasse 8 – 12
D-69126 Heidelberg/Germany
Phone: +49-62 21-30 50
Fax: +49-62 21-30 52 16
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CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach.
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection
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