docAcidi nucleici - sciunisannio.it
download 
Reclamo Transcript
Acidi nucleici - sciunisannio.it
CORSO BIOLOGIA MOLECOLARE I Dott. Massimo Pancione e.mail [email protected] Obiettivo del corso: Comprendere i meccanismi molecolari dei processi biologici fondamentali, descrivere le tecniche sperimentali più comuni e le recenti acquisizioni in Biologia Molecolare. Testi consigliati Concetti di Base 1) Studio delle molecole biologiche 2) Loro interazioni per lo svolgimento delle funzioni vitali della cellula. Struttura e funzione degli acidi nucleici IL DNA e concetto di eredità 1. Conservazione del Materiale genetico 2. Decodificazione e trasmissione dell’informazione genetica 1. Mendel 1800 2. Teoria cromosomica dell’ereditarietà 1903 3. Geni e cromosomi 1908-1930 4. Ipotesi sulla natura dei geni 1930 Scoperta del principio trasformante Scoperta del principio trasformante •Avery: anni 40 •(dimostra che il DNA è il principio trasformante) GENI VIRALI e DNA • Batteriofago o fago (Hershey 1952) • Dopo il ciclo di replicazione (infettivo) ricompare nella progenie principalmente il DNA “marcato con isotopi radioattivi” parentale di partenza La doppia elica La doppia elica La doppia elica La doppia elica La doppia elica La doppia elica La doppia elica Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici • • • • • 4 nucleotidi non in egual misura Rapporto varia tra le specie Ordine preciso tra loro; specificità genetica Rapporto non casuale (A/T=1; G/C=1) Purine/pirimidine=1 Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Basi azotate Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici polinucleotidi polinucleotidi Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura degli acidi nucleici Strutture tridimensionali del DNA La struttura tridimensionale del DNA descritta da Watson e Crick è definita forma B del DNA. Sono state trovate altre possibili strutture che il DNA può assumere: la forma A e la forma Z (in figura). La forma A è favorita in soluzione povere di acqua. Il DNA si organizza in una doppia elica destrorsa più larga, che contiene 11 residui per ogni giro. La forma Z è una doppia elica sinistrorsa che consta di 12 residui per ogni giro d’elica. Strutture tridimensionali del DNA Il confronto tra le strutture tridimensionali del DNA mostra che la forma A è più larga mentre la forma Z più stretta rispetto alla forma B. Composizione e struttura degli acidi nucleici Composizione e struttura RNA Composizione e struttura RNA Composizione e struttura RNA Composizione e struttura RNA Composizione e struttura RNA forcina Stelo-ansa Composizione e struttura RNA pseudonodi Composizione e struttura RNA Coppie di basi non canoniche Favorita la forma A Composizione e struttura RNA Può formare strutture terziarie complesse Forze deboli e dissociazione del DNA Forze deboli e dissociazione del DNA Forze deboli e dissociazione del DNA Forze deboli e dissociazione del DNA Forze deboli e dissociazione del DNA Forze deboli e dissociazione del DNA Curve di rinaturazione La rinaturazione può essere seguita allo stesso modo mediante valutazione di assorbanza in funzione del tempo. Poichè la reazione è bimolecolare, bisogna tenere conto anche della concentrazione. Tipicamente i risultati sono rappresentati in funzione di Cot, cioè il prodotto della concentrazione per il tempo. Il Cot 1/2 è definito come il valore di Cot per cui metà del DNA è rinaturato Rinaturazione genoma umano puo’ essere approssimata dalla combinazione di tre curve di rinaturazione 1) una lenta, 2) intermedia e 3) veloce. Le tre curve corrispondono ai profili di rinaturazione rispettivamente del DNA a copia singola, delle sequenze ripetitive di tipo ALU e del DNA satellite. Topologia del DNA La maggior parte dei cromosomi batterici (plasmidi) ed anche virus (SV40) sono circolari Topologia del DNA •Durante i vari processi replicazione, trascrizione i due filamenti che sono avvolti l’uno sull’altro debbono Separarsi, perciò la cellula deve rispettare dei vincoli topologici. Topologia del DNA •Il DNA è flessibile •La molecola chiusa alle •Estremità viene indicata come topologicamente •definita Topologia del DNA a) Rilassata b) Superavvolta c) Numero di legame topologico d) LN nuumero di volte che un filamento deve passare attraverso l’altro Affinchè le due catene possano separarsi l’una dall’altra Topologia del DNA Lk= Twist + Writhe Twist = numero di volte che Un filamento gira attorno All’altro Write = il modo in cui si incrociano I due filamenti Positivo elica destrorsa Negativo Topologia del DNA LN= Twist + Writhe 40 Lk 40 Tw 0 Wr 36 Lk 40Tw -4 Wr Topologia del DNA I super avvolgimenti possono essere rimossi Dalle Dnasi. Con il taglio (idrolisi del legame fosfodiesterico) Il dna non è più topologicamente costretto La quantità di super avvolgimenti Viene chiamata delta Lk. Se molto diversa da zero il DNA È sottoposto a forte torsione Può avere segno negativo o positivo Topologia del DNA Topologia del DNA I batteri termofili hanno il DNA superavvolto + Meccanismo che preserva il DNA dalla denaturazione Topoisomerasi Lk può essere cambiato Da enzimi specifici Topo. Introducono un taglio Uno o due filamenti Temporaneo dove viene Fatta passare l’elica integra prima che venga Rinsaldata. Oppure possono concatenare o decatenare Molecole circolari di DNA DNA 1) Lineare eucarioti 2) Circolare batteri, virus cromatina Differenze procarioti ed eucarioti •Dimensione e complessità del genoma (1kb =10000 b) •Compartimentazione del genoma •Organizzazione strutturale del genoma 1) Aploide unica copia cromosoma 2) Diploide due copie di ciascun cromosoma DNA aploide e diploide Grandezza del Genoma e ed evoluzione The idea was that the more complex the species the more genes it needed. Preliminary data seemed to confirm this idea. The C-value is the amount of DNA in the haploid genome of an organism It varies over a very wide range, with a general increase in C-value with complexity of organism from prokaryotes to invertebrates, vertebrates, plants. Genoma e ed evoluzione Genoma e ed evoluzione Genoma e ed evoluzione Genoma e ed evoluzione •Misura del genoma (1kb =1000 bp) •bp = base pair(s) = circa 3.4 Å 108 coppie di basi = 100.000 kb Mb = mega base pairs = 1,000,000 bp Gb = giga base pairs = 1,000,000,000 bp 1) E. Coli circa 5 Mb 2) Uomo 3200 Mb; 3,2 Gb Densità genica Numero di geni Contenuto in una megabase Di DNA genomico 5000 geni/50Mb 100 geni per megabase Tendenzialmente all’aumentare della complessità di un organismo, decresce la densità genica ed aumentano le sequenze ripetute. 1) E. Coli cromosoma Prevalentemente Proteine ed RNA strutturali 2) Sequenze non codificanti regolazione Dei geni Genoma e ed evoluzione Grandezza media di un gene umano è di 27kb Grandezza media delle proteine è 1,3kb Solo 5% del materiale genetico codifica per proteine Genoma e ed evoluzione Genoma e ed evoluzione Genoma Genoma Genoma e ed evoluzione Genoma e ed evoluzione Sequenze regolative Regioni intergeniche uniche Pseudogeni Relitti? Non espressi? DNA microsatellite 3% Regioni intergeniche ripetute DNA altamente ripetuto 45% Genoma e ed evoluzione Genoma e ed evoluzione Sequenze semplici molto corte ripetute in tandem microsatellite DNA ripetuto Sequenze molto grandi (100bp-1kb) ripetuto singole copie o cluster trasposoni proteoma
