helena

BioSciences
helena Europe
www.helena-biosciences.com
Instructions For Use
HB-Gene Factor V (Leiden) and Factor II (G/A
20210) Multiplex Mutation Detection
Cat. No. FFT10, FFT50
HB-Gene Détection de mutation multiple: facteur V (Leiden) et facteur II
(G/A 20210)
Fiche technique
Réf. FFT10, FFT50
HB-Gen Faktor V (Leiden) und Faktor II (G/A 20210) Multiplex
Mutations-Nachweis
Anleitung
Kat. Nr. FFT10, FFT50
Rilevamento della mutazione multipla del gene HB del fattore V (Leiden)
e del fattore II (G/A 20210)
Istruzioni per l’uso
Cod. N. FFT10, FFT50
Factor V (Leiden) y Factor II (G/A 20210) del gen HB Detección de la
mutación multiplex
Instrucciones de uso
Nº de catálogo FFT10, FFT50
(en) HB-Gene Factor V (Leiden) and Factor II (G/A 20210) Multiplex Mutation Detection
INTENDED PURPOSE
This product provides all reagents with the exception of Taq
polymerase required for the simultaneous detection of the
human Factor V (Leiden) mutation and Factor II G/A 20210
mutation. NOTE: Taq Polymerase obtained from a licensed
manufacturer should be used when performing this assay.
This kit is based on the co-amplification of a 147bp product from
the Factor V gene, a 266bp product from the Factor II gene and
an internal control product of 650bp.
WARNINGS AND PRECAUTIONS
All reagents are for in-vitro diagnostic use only. Do not ingest or
pipette by mouth any kit component. Refer to the product
safety data sheet for risk and safety phrases and disposal
information.
COMPOSITION
1. Cat. No. FFT10 10 reactions
FII&V
Hind Internal Hind III/Mnl I
Master Mix Control* (HIC)
Volume:
Lid Colour:
250µl
Blue
10µl
Orange
10µl
Yellow
2. Cat. No. FFT50 50 reactions
FII&V
Hind Internal Hind III/Mnl I
Master Mix Control* (HIC)
Volume:
Lid Colour:
5 x 250µl
Blue
50µl
Orange
50µl
Yellow
Control DNA Control DNA
Wild Type
Heterozygous
(FV/FII -+/-+)
10µl
Green
10µl
Red
Control DNA Control DNA
Wild Type
Heterozygous
(FV/FII -+/-+)
10µl
Green
10µl
Red
Other Helena BioSciences Europe offices:
Helena BioSciences Europe
6 Rue Charles Cros-ZAE
95320 Saint Leu La Foret
France
tel: +33 13 995 9292
fax: +33 13 995 6891
email: [email protected]
10/1 TE
1ml
Clear
10/1 TE
1ml
Clear
100 bp
DNA Ladder
(ready to use)
50µl
Black
100 bp
DNA Ladder
(ready to use)
100µl
Black
* Lambda DNA
FII&V Master Mix contains: (dNTP’s, Taq buffer, Factor II specific primers, IC specific primers, Factor V specific primers, Blue dye
and stabilizer).
3. Other Kit Components
Each kit contains Instructions For Use.
Figure 1 below, is an 1.7% HB-DNA Agarose gel showing
results of Factor V Leiden and Factor II (G/A 20210)
Multiplex Mutation detection protocol, from left to right.
STORAGE AND SHELF-LIFE
Store the kit at -20°C. Prior to use thaw reagents at 15...30°C.
Mix each stock thoroughly and whenever possible keep on ice
during use. Refreeze unused reagents. NOTE: Do not warm in
a waterbath.
350bp (HIC)
300bp (HIC)
STEP-BY-STEP PROCEDURE
PCR Method
1. Add 2µl of Taq polymerase (5 units/µl) to 250µl FII&V
MasterMix (tube 1) = Blue MasterMix (BMM). Mix by
pipetting. BMM can now used in step 2 or it can be stored
at -20°C for up to 12 months.
2. Pipette 23µl of BMM into reaction tube. Add 1µl of HIC.
Add 1µl of control DNA or genomic DNA (50-100 ng). Mix
by pipetting. NOTE: Dilute DNA with 10/1 TE if necessary.
3. Overlay with mineral oil if using a thermal cycler without a
heated lid.
4. Place tubes in the thermal cycler.
Cycle as follows: Initial denaturation at 95°C for 3 mins
followed by 30 cycles of:
95°C for 30 secs
63°C for 60 secs
72°C for 60 secs
Restriction Digestion
5. Add 1µl of Hind III/Mnl I mixture. Mix by pipetting and
incubate at 37°C for 3 hrs.
Helena BioSciences Europe
Colima Avenue
Sunderland Enterprise Park
Sunderland
SR5 3XB
tel: +44 (0) 191 549 6064
fax: +44 (0) 191 549 6271
email: [email protected]
Helena BioSciences Europe
Via Enrico Fermi, 24
20090 Assago (Milano)
Italy
tel: +39 02 488 1951
or +39 02 488 2141
fax: +39 02 488 2677
Electrophoresis
6. Load 10µl of the digested sample onto 1.7% agarose gel
(containing ethidium bromide) and electrophorese next to
10µl of 100 bp DNA ladder. There is no need to add loading
buffer. In order to separate the 266 and 238 bp fragments it
is necessary to run the samples until the blue dye front has
migrated at least 6 cm.
266bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
1
2
Lane 1. Molecular weight
marker.
Lane 2. Wild type DNA after
digestion with Mnl I
and Hind III.
Lane 3. Double heterozygous
DNA after digestion
with Mnl I and Hind
III.
3
REFERENCES
1. Beauchamp N.J., Martina D.E., Hampton K.K., Cooper P.C.,
Preston F.E., and Peake I.R. “High Prevalence of a Mutation
in Factor V Gene within the UK Population: Relationship to
Activated Protein C Resistance and Familial Thrombosis”.
British Journal of Haematology 1994, 88: 219-222.
2. Bertina R.M., Koeleman B.P.C., Koster T., Roseendaal F.R.,
Dirven R.J., deRonde H., van der Velden P.A., and Reitisma
P.H. “Mutation in Blood Coagulation; Factor V Associated
Resistance to Protein C”. Nature 1994, 369, May: 64-67.
3. Poort et al 1996. Blood Vol 88, 10 pp 3698-3703.
DISCLAIMER
This product is for use in the Polymerase Chain Reaction
(“PCR”) Process which is covered by patents owned by Roche
Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche, Ltd. No
license under these patents to use the PCR Process is conveyed
expressly or by implication to the purchaser by the purchase of
this product. Further information on purchasing licenses to
practice PCR may be obtained by contacting the Licensing
Department, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Grenzacher Str. 124,
CH-4070 Basel, Switzerland.
INTERPRETATION OF RESULTS
The restriction patterns obtained are shown below:
FV/FII -+/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII ++/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -/++
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -+/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
(fr) HB-Gene Détection de mutation multiple: facteur V (Leiden) et facteur II (G/A 20210)
UTILISATION
Ce produit fournit tous les réactifs, à l’exception de la Taq
polymérase, nécessaires pour la recherche simultanée de la
mutation du facteur V (Leiden) et de la mutation G/A en position
20210 du facteur II chez l’être humain. REMARQUE : Utiliser
de la Taq polymérase provenant d’un fabricant autorisé lorsque
vous réalisez cette analyse.
Le kit se base sur la co-amplification d’un fragment de 147pb du
gène du facteur V, d’un fragment de 266 pb du gène du facteur
II et d’un fragment de 650 pb du contrôle interne.
PRÉCAUTIONS
Tous les réactifs sont à usage diagnostic in vitro uniquement.
Ne pas ingérer ou pipeter à la bouche aucun composant.
Se reporter aux fiches de sécurité des composants du kit pour la
manipulation et l’élimination.
COMPOSITION
1. Réf. FFT10 10 réactions
F II et V Contrôle interne Hind III/Mnl I Contrôle ADN Contrôle ADN
MasterMix Hind* (CIH)
Phénot. sauvage Hétérozygote
(FV/FII -+/-+)
10 µl
Vert
Volume: 250 µl
Couleur: Bleu
10 µl
Orange
10 µl
Jaune
10 µl
Rouge
2. Réf. FFT50 50 réactions
F II et V Contrôle interne Hind III/Mnl I Contrôle ADN Contrôle ADN
MasterMix Hind* (CIH)
Phénot. sauvage Hétérozygote
(FV/FII -+/-+)
10 µl
Vert
Volume: 5 x 250 µl
Couleur: Bleu
50 µl
Orange
50 µl
Jaune
10 µl
Rouge
10/1 TE
1 ml
Transparent
10/1 TE
1 ml
Transparent
100 pb
Échelle ADN
(prêt à l’emploi)
50 µl
Noir
100 pb
Échelle ADN
(prêt à l’emploi)
100 µl
Noir
*ADN lambda
Le mélange MasterMix F II et F V contient : dNTP, tampon Taq, amorces spécifiques du facteur II, amorces spécifiques du
contrôle interne CIH, amorces spécifiques du facteur V, colorant bleu et stabilisant.
3. Autres composants du kit
Chaque kit contient également 1 fiche technique.
STOCKAGE ET CONSERVATION
Conserver le kit à -20°C. Décongeler les réactifs entre 15...30°C
avant utilisation. Bien mélanger chaque produit et maintenir,
si possible, sur la de la glace pendant l’utilisation. Recongeler les
réactifs non utilisés. REMARQUE : Ne pas chauffer dans un
bain-marie.
La figure 1, ci-dessous, représente les résultats du
protocole de détection de mutation multiple du facteur V
de Leiden et du facteur II (G>A 20210) sur un gel
d’agarose HB-ADN à 1,7% ; de gauche à droite.
350bp (CIH)
300bp (CIH)
MÉTHODOLOGIE
Méthode PCR
1. Ajouter 2 µl de Taq polymérase (5 unités/µl) à 250 µl de
MasterMix F II et F V (tube 1) = MasterMix bleu (MMB).
Mélanger à la pipette. Il est alors possible d’utiliser le MMB
pour l’étape 2 ou de le conserver à -20°C pendant 12 mois.
2. Pipeter 23 µl de MMB dans un tube à essai. Ajouter 1 µl de
CIH. Ajouter 1 µl d’ADN de contrôle ou d’ADN génomique
(50 – 100ng). Mélanger à la pipette. REMARQUE : Diluer
l’ADN avec du 10/1 TE si nécessaire.
3. Couvrir d’une couche d’huile minérale si vous utilisez un
thermocycleur sans couvercle chauffant.
4. Placer les tubes dans le thermocycleur.
Programmer de la façon suivante : dénaturation initiale à
95°C pendant 3 minutes, suivie de 30 cycles de :
30 secondes à 95°C
60 secondes à 63°C
60 secondes à 72°C
Digestion par des enzymes de restriction
5. Ajouter 1µl de mélange Hind III/Mnl I. Mélanger à la pipette
et incuber à 37°C pendant 3 heures.
Électrophorèse
6. Charger 10µl d’échantillon digéré sur un gel d’agarose à 1,7%
(contenant du bromure d’éthidium) et faire migrer à côté de
10µl d’échelle d’ADN 100pb. Il n’est pas nécessaire d’ajouter
un tampon de charge. Afin de séparer les fragments de 266 et
de 238pb, il est nécessaire de traiter les échantillons jusqu’à
ce que le colorant bleu ait migré d’au moins 6cm.
266bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
Piste 1. Marqueur de poids
moléculaire.
Piste 2. ADN de phénotype
sauvage après digestion
avec Mnl I et Hind III.
Piste 3. ADN hétérozygote
double après digestion
avec Mnl I et Hind III.
85bp (FV)
1
2
3
BIBLIOGRAPHIE
1. Beauchamp N. J., Martina D. E., Hampton K. K., Cooper P.
C., Preston F. E. et Peake I. R. “High Prevalence of a
Mutation in Factor V Gene within the UK Population:
Relationship to Activated Protein C Resistance and Familial
Thrombosis.” British Journal of Haematology 1994, 88 :
219-222.
2. Bertina R. M., Koeleman B. P. C., Koster T., Roseendaal F. R.,
Dirven R. J., de Ronde H., van der Velden P. A. et Reitisma P.
H. “Mutation in Blood Coagulation; Factor V Associated
Resistance to Protein C”.Nature 1994, 369, mai : 64-67.
3. Poort et al 1996. Blood Vol 88, 10 pp 3698-3703.
AVERTISSEMENT LÉGAL
Le produit est utilisé dans le processus de réaction en chaîne de
la polymérase (PCR, Polymerase Chain Reaction), qui est protégé
par des brevets appartenant à Roche Molecular Systems, Inc. et à
F. Hoffmann-La Roche, Ltd. L’achat du produit n’implique pour
l’acheteur aucune concession, implicite ou explicite, de licence
autorisant l’utilisation de la méthode PCR. Il est possible d’obtenir
des renseignements supplémentaires à propos de l’achat de
licences pour mettre en œuvre la PCR en contactant le
département des licences, F. Hoffmann-La Roche Ltd.,
Grenzacher Str. 124, CH-4070 Basel, Suisse.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Voici les profils de migration électrophorétique obtenus :
FV/FII -/350bp (CIH)
300bp (CIH)
266bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -+/350bp (CIH)
300bp (CIH)
266bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII ++/350bp (CIH)
300bp (CIH)
266bp (FII)
122bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -/-+
350bp (CIH)
300bp (CIH)
266bp (FII)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -+/-+
350bp (CIH)
300bp (CIH)
238bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -/++
350bp (CIH)
300bp (CIH)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
HL-2-1099P 2003/12 (5)
(de) HB-Gen Faktor V (Leiden) und Faktor II (G/A 20210) Multiplex Mutations-Nachweis
Rilevamento della mutazione multipla del gene HB del fattore V (Leiden) e del fattore
(it) II
(G/A 20210)
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Tutti i reagenti sono destinati esclusivamente alla diagnostica in
vitro. Non ingerire né pipettare con la bocca i componenti del
kit. Per le indicazioni relative ai rischi e alla sicurezza e per le
informazioni sullo smaltimento, fare riferimento alle schede
tecniche dei prodotti.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
Alle Reagenzien sind nur zur in-vitro Diagnostik bestimmt. Nicht
einnehmen oder mit dem Mund pipettieren.
Siehe
Sicherheitsdatenblatt mit den Gefahrenhinweisen und
Sicherheitsvorschlägen sowie Informationen zur Entsorgung.
Questo kit si basa sulla coamplificazione di un prodotto di 147 bp
dal gene del fattore V, di un prodotto di 266 bp dal gene del
fattore II e di un prodotto di controllo interno di 650 bp.
Dieses Kit basiert auf der Ko-Amplifikation eines 147 bp
Produkts des Faktor V-Gens, eines 266 bp Produkts des Faktor
II-Gens und eines internen Kontroll-Produkts aus 650 bp.
PRINCIPIO
Questo prodotto fornisce tutti i reagenti ad eccezione della Taq
polimerasi richiesta per il rilevamento simultaneo della mutazione
del fattore V (Leiden) umano e della mutazione G/A 20210 del
fattore II. NOTA: Per l’esecuzione di questo dosaggio è
necessario utilizzare la Taq polimerasi ottenuta da un produttore
autorizzato.
ANWENDUNGSBEREICH
Dieses Produkt enthält mit Ausnahme der Taq-Polymerase alle
Reagenzien, die zum gleichzeitigen Nachweis einer Mutation der
humanen Faktoren V (Leiden) und II G/A 20210 erforderlich sind.
BITTE BEACHTEN: Zur Durchführung dieses Tests sollte eine
von einem lizenzierten Hersteller bezogene Taq-Polymerase
verwendet werden.
INHALT
1. Kat. Nr. FFT10 10 Reaktionen
FII&V
Master Mix
Hind Intern
Hind III/Mnl I
Kontrolle* (HIC)
Kontroll-DNA
Wildtyp
Kontroll-DNA
Heterozygot
10/1 TE
(FV/FII -+/-+)
Volumen:
250 µl
Deckelfarbe: Blau
10 µl
Orange
10 µl
Gelb
10 µl
Rot
10 µl
Grün
1 ml
Farblos
100 bp
DNA Längenstandard
(gebrauchsfertig)
50 µl
Schwarz
2. Kat. Nr. FFT50 50 Reaktionen
FII&V
Master Mix
Hind Intern
Hind III/Mnl I
Kontrolle* (HIC)
Kontroll-DNA
Wildtyp
Kontroll-DNA
Heterozygot
10/1 TE
(FV/FII -+/-+)
Volumen:
5 x 250 µl
Deckelfarbe: Blau
50 µl
Orange
50 µl
Gelb
10 µl
Rot
10 µl
Grün
1 ml
Farblos
100 bp
DNA Längenstandard
(gebrauchsfertig)
100 µl
Schwarz
(es) Factor V (Leiden) y Factor II (G/A 20210) del gen HB Detección de la mutación
multiplex
USO PREVISTO
Este producto proporciona todos los reactivos, a excepción de la
Taq polimerasa, necesarios para la detección simultánea de la
mutación del factor V humano (Leiden) y de la mutación del
Factor II G/A 20210. NOTA: Debe usarse la Taq polimerasa de
un fabricante autorizado cuando se realiza este ensayo.
Este kit se basa en la coamplificación de un producto de 147 pb
del gen del factor V, un producto de 266 pb del gen del factor II
y un producto de control interno de 650 pb.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Todos los reactivos son exclusivamente para uso diagnóstico invitro. No ingerir ni chupar con la boca ningún componente del
kit. Consultar la hoja con los datos de seguridad del producto
acerca de los riesgos de los componentes, avisos de seguridad y
consejos para su eliminación.
COMPOSICIÓN
COMPOSIZIONE
1. Cod. N. FFT10 - 10 Reazioni
FII&V
Hind interno
Hind III/Mnl I
Master Mix Controllo* (HIC)
Volume:
250µl
Colore tappo: Blu
10µl
Arancione
10µl
Giallo
2. Cod. N. FFT50 - 50 Reazioni
FII&V
Hind interno
Hind III/Mnl I
Master Mix Controllo* (HIC)
Volume:
5 x 250µl
Colore tappo: Blu
50µl
Arancione
50µl
Giallo
DNA di controllo
Wild-type
10µl
Rosso
DNA di controllo
Wild-type
10µl
Rosso
DNA di controllo 10/1 TE 100 bp
Eterozigote
DNA ladder
(FV/FII -+/-+)
(pronto per l’uso)
10µl
1ml
50µl
Verde
TrasparenteNero
DNA di controllo 10/1 TE 100 bp
Eterozigote
DNA ladder
(FV/FII -+/-+)
(pronto per l’uso)
10µl
1ml
100µl
Verde
TrasparenteNero
1. Nº Cat. FTM10 10 reacciones
FII&V
Hind interno
Hind III/Mnl I
Master Mix
Control* (HIC) Tipo natural
Volumen:
250 µl
Color de la tapa: Azul
10 µl
Naranja
10 µl
Amarillo
2. Nº Cat. FTM50 50 reacciones
FII&V
Hind interno
Hind III/Mnl I
Master Mix
Control* (HIC) Tipo natural
Volumen:
5 x 250 µl
Color de la tapa: Azul
50 µl
Naranja
50 µl
Amarillo
ADN Control
10 µl
Rojo
ADN Control
10 µl
Rojo
ADN Control
Heterocigótico
(FV/FII -+/-+)
10 µl
Verde
ADN Control
Heterocigótico
(FV/FII -+/-+)
10 µl
Verde
10/1 TE
100 pb
Escalera de ADN
(listo para usar)
1 ml
50 µl
Transparente Negro
10/1 TE
100 pb
Escalera de ADN
(listo para usar)
1 ml
100 µl
Transparente Negro
*ADN lambda
* DNA lambda
* Lambda-DNA
FII&V Master Mix enthält: (dNTP, Taq-Puffer, spezifische Faktor II Primer, spezifische IC Primer, spezifische Faktor V Primer,
blauen Farbstoff und Stabilisator).
3. Weitere Kit-Komponenten
Jeder Kit enthält eine Methodenbeschreibung.
LAGERUNG UND STABILITÄT
Das Kit bei -20°C lagern. Vor Gebrauch bei 15...30°C die
Reagenzien auftauen lassen. Jede Stammlösung gut mischen und
während des Gebrauchs möglichst immer wieder auf Eis lagern.
Nicht gebrauchte Reagenzien wieder einfrieren. BITTE
BEACHTEN: Nicht im Wasserbad auftauen.
Die Abbildung 1 unten zeigt von links nach rechts auf
einem 1,7 % HB-DNA Agarose-Gel mit den Ergebnissen
eines Faktor V Leiden und Faktor II (G/A 20210) MultiplexTestansatzes.
350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
Spur 1. MolekulargewichtMarker.
Spur 2. Wildtyp-DNA nach
Behandlung mit Mnl I
und Hind III.
Spur 3. Doppelte heterozygote
DNA nach Behandlung
mit Mnl I und Hind III.
HAFTUNGSAUSSCHLUSS
Dieses Produkt ist für den Gebrauch mit dem Verfahren der
„Polymerase Chain Reaction“ (PCR) bestimmt, das durch
Patente, deren Eigentümer die Firmen Roche Molecular Systems,
Inc. und F. Hoffmann-La Roche, Ltd. sind, geschützt ist. Mit dem
Kauf dieses Produkts wird dem Käufer nicht, weder ausdrücklich
noch stillschweigend, das Nutzungsrecht unter diesem Patent
übertragen, das PCR-Verfahren anzuwenden.
Weitere
Informationen über den Erwerb des Nutzungsrechts zur
Durchführung der PCR sind zu erhalten über: F. Hoffmann-La
Roche Ltd., Lizenzabteilung, Grenzacher Str. 124, CH-4070
Basel, Schweiz.
Elektrophorese
6. 10 µl der mit Restriktionsenzym behandelten Probe auf ein
1,7% Agarose-Gel (mit Ethidiumbromid) neben 10 µl eines
100 bp DNA Längenstandards auftragen und Elektrophorese
durchführen. Zufügen eines Auftragspuffers ist nicht
erforderlich. Zum Trennen der 266 und 238 bp Fragmente
müssen die Proben solange laufen, bis die blaue Farbe
mindestens 6 cm in das Gel diffundiert ist.
Literaturnachweis
1. Beauchamp N.J., Martina D.E., Hampton K.K., Cooper P.C.,
Preston F.E., and Peake I.R. “High Prevalence of a Mutation in
Factor V Gene within the UK Population: Relationship to
Activated Protein C Resistance and Familial Thrombosis”.British
Journal of Haematology 1994, 88: 219-222.
2. Bertina R.M., Koeleman B.P.C., Koster T., Roseendaal F.R.,
Dirven R.J., deRonde H., van der Velden P.A., and Reitisma
P.H. “Mutation in Blood Coagulation; Factor V Associated
Resistance to Protein C”.Nature 1994, 369, May: 64-67.
3. Poort et al 1996. Blood Vol 88, 10 pp 3698-3703.
SCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODE
PCR-Methode
1. 2 µl Taq-Polymerase (5 Units/µl) zu 250 µl FII&V MasterMix
(Gefäß 1) geben = Blauer MasterMix (BMM). Mit der Pipette
mischen. BMM kann jetzt für Schritt 2 verwendet oder bei 20°C bis zu 12 Monaten aufbewahrt werden.
2. 23 µl BMM in ein Reaktionsgefäß pipettieren. 1 µl HIC
zufügen. 1 µl Kontroll-DNA oder genomische DNA (50 -100
ng) hinzufügen.
Mit der Pipette mischen.
BITTE
BEACHTEN: Falls notwendig DNA mit 10/1 TE verdünnen.
3. Bei Verwendung eines Thermocyclers ohne beheizbaren
Deckel mit Öl überziehen.
4. Gefäße in den Thermocycler geben.
Thermocycler wie folgt programmieren:
Anfangsdenaturierung für 3 Min. bei 95°C gefolgt von 30
Zyklen für:
30 Sek. bei 95°C
60 Sek. bei 63°C
60 Sek. bei 72°C
Restriktionsenzym-Ansatz
5. 1 µl der Mischung Hind III/Mnl I zugeben. Mit der Pipette
mischen und 3 Stunden bei 37°C inkubieren.
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
1
2
3
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Die erhaltenen Restriktionsmuster sind unten abgebildet:
FV/FII -/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -+/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII ++/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -+/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -/++
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
L’FII&V Master Mix contiene: (dNTP, tampone Taq, primer specifici del fattore II, primer specifici dell’IC, primer specifici del fattore V,
colorante Blu e stabilizzatore).
3. Altri componenti del Kit
Ogni kit contiene inoltre un foglio procedurale.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Conservare il kit a -20°C. Prima dell’uso, scongelare i reagenti a
15...30°C. Miscelare accuratamente ogni riserva e, se possibile,
conservare su ghiaccio durante l’uso. Ricongelare i reagenti non
utilizzati. NOTA: non riscaldare a bagnomaria.
La figura 1 seguente rappresenta un gel di agarosio HBDNA all’1,7%, che mostra i risultati del protocollo di
rilevamento della mutazione multipla del fattore V Leiden
e del fattore II (G/A 20210), da sinistra verso destra.
Fila 1:
Fila 2:
350bp (HIC)
PROCEDURA
Metodo PCR
1. Aggiungere 2µl di Taq polimerasi (5 unità/µl) a 250µl di FII&V
MasterMix (provetta 1) = Blue MasterMix (BMM). Miscelare
pipettando. Ora il BMM può essere utilizzato nella fase 2
oppure può essere conservato a -20°C fino a 12 mesi.
2. Pipettare 23µl di BMM nella provetta di reazione. Aggiungere
1µl di HIC. Aggiungere 1µl di DNA di controllo o di DNA
genomico (50-100 ng). Miscelare pipettando. NOTA: Se
necessario, diluire il DNA con 10/1 TE.
3. Se si utilizza un ciclatore termico senza coperchio riscaldato,
coprire con olio minerale.
4. Posizionare le provette nel ciclatore termico.
Eseguire i cicli seguenti: Denaturazione iniziale a 95°C per 3
minuti, seguiti da 30 cicli di:
95°C per 30 secondi
63°C per 60 secondi
72°C per 60 secondi
Digestione di restrizione
5. Aggiungere 1µl di miscela Hind III/Mnl I. Miscelare pipettando
e incubare a 37°C per 3 ore.
Elettroforesi
6. Caricare 10µl di campione digerito su un gel di agarosio
all’1,7% (contenente bromuro di etidio) e sottoporre ad
elettroforesi accanto a 10µl di DNA ladder 100 bp. Non è
necessario aggiungere tampone di caricamento. Per separare
i frammenti 266 e 238 bp, è necessario analizzare i campioni
sino a quando il fronte del colorante blu non sarà migrato di
almeno 6 cm.
300bp (HIC)
266bp (FII)
Fila 3:
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
1
2
Marcatore peso
molecolare
DNA wild-type in
seguito a digestione
con Mnl I e Hind III
DNA doppio
eterozigote in seguito a
digestione con Mnl I e
Hind III
3
Riferimenti
1. Beauchamp N.J., Martina D.E., Hampton K.K., Cooper P.C.,
Preston F.E., and Peake I.R. “High Prevalence of a Mutation in
Factor V Gene within the UK Population: Relationship to
Activated Protein C Resistance and Familial Thrombosis”.British
Journal of Haematology 1994, 88: 219-222.
2. Bertina, R.M., Koeleman B.P.C., Koster T., Roseendaal F.R.,
Dirven R.J., deRonde H., van der Velden P.A., and Reitisma
P.H. “Mutation in Blood Coagulation; Factor V Associated
Resistance to Protein C”.Nature 1994, 369, May: 64-67.
3. Poort et al 1996. Blood Vol 88, 10 pp 3698-3703.
DISCLAIMER
Questo prodotto è destinato ad essere utilizzato nel processo di
reazione a catena della polimerasi (“PCR”), coperto dai brevetti
detenuti da Roche Molecular Systems, Inc. e F. Hoffmann-La
Roche, Ltd. Con l’acquisto di questo prodotto, all’acquirente non
viene trasferita, né esplicitamente né implicitamente, alcuna
licenza prevista nell’ambito di tali brevetti per l’utilizzo del
processo PCR. Per ottenere ulteriori informazioni sull’acquisto
delle licenze all’esecuzione della PCR, è possibile rivolgersi a:
Licensing Department, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Grenzacher
Str. 124, CH-4070 Basilea, Svizzera.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I pattern di restrizione ottenuti sono mostrati di seguito:
FV/FII -/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -+/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII ++/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -+/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -/++
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FII&V Master Mix contiene: (dNTP, Tampón Taq, cebadores específicos del factor II, cebadores específicos de IC, cebadores específicos del
factor V, colorante azul y estabilizador).
3. Altri componenti del Kit
Ogni kit contiene inoltre un foglio procedurale.
ALMACENAMIENTO Y PERÍODO DE VALIDEZ
Conservar el kit a -20°C. Antes de su uso, descongelar los
reactivos a 15...30°C. Mezclar cada reserva cuidadosamente y
siempre que sea posible, conservar en hielo durante su uso.
Volver a congelar los reactivos no utilizados. NOTA: No
calentar al baño maría.
La figura 1 siguiente muestra un gel de agarosa de HBADN a l 1,7% que muestra los resultados del protocolo de
detección de mutación multiplex del Factor V Leiden y el
Factor II (G/A 20210), de izquierda a derecha.
Vía 1.
Vía 2.
350bp (HIC)
300bp (HIC)
PROCEDIMIENTO PASO A PASO
Método PCR
1. Añadir 2 µl de Taq polimerasa (5 unidades/µl) a 250 µl de
FII&V MasterMix (tubo 1) = Blue MasterMix (BMM). Mezclar
por pipeteado. Ahora puede usarse el BMM en el paso 2 o
puede conservarse a –20°C durante hasta 12 meses.
2. Pipetear 23 µl de BMM en un tubo de reacción. Añadir 1 ml
de HIC. Añadir 1 µl de ADN control o ADN genómico (50 100 ng). Mezclar por pipeteado. NOTA: Diluir el ADN con
10/1 TE si es necesario.
3. Cubrir con aceite mineral si usa un ciclador térmico sin una
tapa calentada.
4. Colocar los tubos en el ciclador térmico.
Ciclar como sigue: Desnaturalización inicial a 95°C durante 3
minutos, seguido de 30 ciclos de:
95°C durante 30 segundos
63°C durante 60 segundos
72°C durante 60 segundos
Digestión de restricción
5. Añadir 1µl de mezcla Hind III/Mnl I. Mezclar por pipeteado e
incubar a 37°C durante 3 horas.
Electroforesis
6. Cargar 10 µl de la muestra digerida en gel de agarosa al 1,7%
(con bromuro de etidio) y realizar la electroforesis junto con
10 µl de cadena de ADN de 100 pb. No es necesario añadir
tampón de carga. Para separar los fragmentos de 266 y 238
pb, es necesario estudiar las muestras hasta que el frente de
coloración azul haya migrado al menos 6 cm.
266bp (FII)
Vía 3.
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
1
2
Marcador de peso
molecular.
ADN natural después
de la digestión con Mnl
I y Hind III.
ADN heterocigótico
doble después de la
digestión con Mnl I y
Hind III.
3
Referencias
1. Beauchamp N.J., Martina D.E., Hampton K.K., Cooper P.C.,
Preston F.E., and Peake I.R. “High Prevalence of a Mutation in
Factor V Gene within the UK Population: Relationship to
Activated Protein C Resistance and Familial Thrombosis”.British
Journal of Haematology 1994, 88: 219-222.
2. Bertina R.M., Koeleman B.P.C., Koster T., Roseendaal F.R.,
Dirven R.J., deRonde H., van der Velden P.A., and Reitisma
P.H. “Mutation in Blood Coagulation; Factor V Associated
Resistance to Protein C”.Nature 1994, 369, May: 64-67.
3. Poort et al 1996. Blood Vol 88, 10 pp 3698-3703.
RENUNCIA
Este producto está diseñado para su uso en el proceso de
reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”) que está cubierto
por patentes propiedad de Roche Molecular Systems, Inc. y F.
Hoffmann-La Roche, Ltd. Con la compra de este producto, no
se le otorga al comprador expresa o implícitamente ninguna
licencia bajo estas patentes para usar el proceso PCR. Se puede
obtener más información sobre la adquisición de licencias para
practicar la PCR, poniéndose en contacto con el Departamento
de Licencias, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Grenzacher Str. 124,
CH-4070 Basilea, Suiza.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
A continuación se indican los patrones de restricción obtenidos:
FV/FII -/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -+/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII ++/350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
122bp (FV)
25bp (FV)
FV/FII -/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
266bp (FII)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -+/-+
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
238bp (FII)
122bp (FV)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)
FV/FII -/++
350bp (HIC)
300bp (HIC)
238bp (FII)
85bp (FV)
37bp (FV)
28bp (FII)
25bp (FV)