LA TRASCRIZIONE

LA TRASCRIZIONE
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4
La velocità della reazione è di
~40 nt/sec a 37°C (per la
RNA pol batterica); molto più
lenta di quella di replicazione
del DNA (800 bp/sec)
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4
Nomenclatura
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la coding strand (Sense strand) del DNA ha la stessa sequenza del
mRNA
la antisense strand (Template strand) è quella che funge da
template per la sintesi del mRNA.
RNA polymerases sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA
come template.
Un promoter è una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per
iniziare la trascrizione.
Startpoint (Startsite) si riferisce alla posizione sul DNA che
corrisponde alla prima base incorporata nel RNA
A terminator è una sequenza di DNA fa terminare la trascrizione alla
RNA polymerase.
A transcription unit è la distanza tra i siti di iniziazione e di
terminazione della RNA polymerase; può includere più di un gene.
Upstream = a monte.
Downstream = a valle.
A primary transcript è il prodotto di RNA non modificato che
corrisponde ad una unità di trascrizione.
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Trascrizione
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La trascrizione produce un filamento di RNA
complementare ad un filamento di DNA
Esistono vari tipi di RNA
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la sequenza “codificante” del DNA è uguale a quella
del messaggero
Promotore batterico I
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Un promotore è definito dalla presenza di
una corta sequenza consenso in una
localizzazione specifica.
La sequenza consenso del promotore
consiste in una purina al punto di inizio,
l’esamero TATAAT a –10, ed un altro
esamero a–35.
I diversi promotori di solito differiscono dal
consenso in una o più posizioni.
Un promotore è una sequenza particolare di
DNA che è riconosciuta dalla RNA
polimerasi. Ogni promotore deve
includere questa sequenza e nel genoma
batterico la sequenza minima che da un
segnale adeguato è di 12 bp.
Consenso e spaziatura
Promotore batterico II
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Un putativo sito di riconoscimento del DNA può essere
definito come una sequenza ideale che rappresenta
la basi più spesso trovate in ogni posizione. Una
sequenza consenso è definita dall’allineamento di
tutti gli esempi noti così da massimizzare la loro
omologia.
� Ci sono quattro caratteristiche conservate in un
promotore batterico:
� Il punto di inizio (startpoint)
�
�
�
�
La sequenza –10;
La sequenza–35;
La distanza tra le sequenze–10 e –35;
L’elemento UP (qualche volta)
Leo - Fasano - Ginelli
– Biologiaae Genetica,
Ed. tutti
– Capitolo
4
promotore: De
sequenza
presente
monteII di
i geni,
riconosciuta dal fattore sigma dell’RNA polimerasi, necessaria
per l’inizio della trascrizione.
La sequenza è conservata
promotori riconosciuti dal fattore sigma-70 di E. coli
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mutazioni “down”:
diminuisce
l’efficienza del
promotore
TTGACa
TAtAaT
lettera maiuscola = basi più conservate (presenti in quella posizione
rispetto al +1 in quasi tutti i casi
lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre
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Startpoint
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Lo startpoint è di solito (>90% delle volte)
una purina. Spesso è la base centrale della
sequenza CAT.
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La sequenza -10
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la regione di 6 bp è riconoscibile in quasi tutti i
promotori. Il centro dell’esamero è generalmente
circa 10 bp a monte dello startpoint, ma la distanza
varia da -18 a -9. L’esamero è spesso chiamato la
sequenza -10 sequence.
Il consenso è TATAAT, e può essere indicato nella forma
T80A95T45A60A50T96 dove il pedice indica la percentuale
dell’occorrenza della base più comune, che varia 4596%. (dove non c’è evidente preferenza si usa una N).
La basi più importanti sembrano essere le più
conservate: la TA iniziale e la T finale.
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La sequenza -35
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Un altro esamero conservato è centrato ~35
bp a monte dello startpoint. È chiamata la
sequenza -35.
Il consenso è TTGACA;
in forma più dettagliata T82T84G78A65C54A45
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Distanza –10 / -35
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La distanza che separa i siti–35 e
–10 è tra 16-18 bp nel 90% dei
promotori; ma può essere fino a
15 o 20 bp.
La sequenza nella regione non è
importante, ma la distanza è
critica per tenere i due siti nella
geometria corretta per il legame
al promotore.
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Elemento UP
�
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Alcuni promotori hanno una
sequenza ricca di A-T
localizzata ancora più a
monte. E’ denominata
elemento UP. Interagisce con
la subunità della RNA
polimerasi. La si trova
tipicamente nei promotori che
sono molto espressi, quali
quelli dei geni per rRNA.
E’ riconosciuto dal dominio Cterminale della subunità alfa
(�CTD)
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regolazione dell’espressione genica mediante
l’intervento di fattori sigma alternativi
geni “heat-shock”: CCCCCC
- 15/17 basi - CCCC
promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in
caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo
promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA
DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA
geni “spo” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo
durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma
specificamente attivati in sporulazione
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La RNA
polimerasi batterica è fatta da
subunità multiple
�
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L’oloenzyme (enzima
completo) è un complesso di 5
subunità che comprende il “core
enzyme” ( 2
e il factor
che è competente per l’inizio
della trascrizione batterica.
RNA core polimerasi batteriche
sono ~500 kD complessi
multisubunità con la struttura
generale �2 ������.
Negli eubatteri un solo tipo di RNA
polimerasi è responsabile della
sintesi di tutti i RNA (mRNA, rRNA
e tRNA)
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RNA polimerasi batterica
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Le subunità and
insieme fanno il centro
catalitico.
La subunità è
necessaria per
assemblaggio del
core enzyme.
La subunità è
interessata
specificamente con il
riconoscimento del
promotore
Mg
�=blue
�’ = viola
� = giallo e verde
regolazione dell’espressione
genica mediante l’intervento
di fattori sigma alternativi
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geni “heat-shock”: CCCCCC
15/17 basi - CCCC
-
promotore riconosciuto dal fattore
sigma32 attivato solo in caso di
aumento della temperatura. I geni che
hanno questo promotore vengono
espressi (trascritti) SOLO IN
PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO
FATTORE SIGMA
geni “spo” in B. subtilis sono silenti e
vengono trascritti solo durante la
sporulazione per la presenza di fattori
sigma specificamente attivati in
sporulazione
Fattori sigma
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E. coli ha diversi
sigma factors,
ognuno dei quali fa sì
che la RNA polimerasi
inizi a dei promotori
definiti da specifiche
sequenze–35 e –10.
I promotori per ogni
enzima hanno tutti la
stessa dimensione e
localizzazione relativa
allo startpoint, ed
hanno sequenze
conservate solo intorno
ai siti –35 e –10.
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Legame al DNA
Il DNA binding domain del fattore sigma è
helix-turn-helix che riconosce il sito –35
Il sito –10 è riconosciuto dalla subunità
alfa. Ha amino acidi aromatici che aiutano
l’apertura del DNA
La forza di un promotore è collegata alla
affinità di legame ed alla capacità di
evadere dal promotore
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La RNA pol
�
La distanza tra i siti
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La trascrizione avviene con
l’appaiamento di basi in una
“bolla" di DNA
RNA pol separa i due filamenti di
DNA in una “bolla”
transiente ed usa un
filamento come template per la
sintesi di una sequenza di RNA
complementare.
La bolla è lunga ~12-14 bp, e la
lunghezza dell’ibrido RNA-DNA
è di ~8-9 bp.
La velocità della reazione è di ~40
nt/sec a 37°C (per la RNA pol
batterica); che è simile alla
velocità di traduzione (15
amino acidi/sec), ma molto più
lenta di quella di replicazione
del DNA (800 bp/sec)
La reazione di trascrizione
ha tre passaggi
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Iniziazione descrive il passaggio fino alla
sintesi del primo legame del RNA. Include
il legame della RNA polimerasi al
promotore ed il “melting” di una corta
regione di DNA in singolo filamento.
Elongazione è il passaggio nella reazione
di sintesi della macromolecola (per la
replicazione, trascrizione, o traduzione)
quando la catena nucleotidica o peptidica si
allunga per l’aggiunta della subunità.
Terminazione è il passaggio che termina
la sintesi della macromolecola bloccando
l’addizione delle subunità, e generalmente
causando la dissoluzione dell’apparato di
sintesi
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Tensione superelica- DNA
supercoiling
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La terminazione nei batteri
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La terminazione è sempre letta sulla
sequenza di DNA trascritta, non su
DNA
Ci sono due tipi di terminatori:
Rho-indipendenti: una sequenza
�
invertita (palindromica) di 20 nt
seguita da circa 8 nt A-T
�
Rho-dipendenti: reclutano la
proteina rho, una ATPasi ad anello
che separa il RNA dallo stampo. Circa
40 nt ricchi di C.
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Terminatore forte o rhoindipendente:
-struttura secondaria stabile e forte
per la presenza di
molte G e C nello “stem”
- sequenza di tante U al 3’ della
struttura secondaria
(che facilita la separazione dell’ibrido
DNA/RNA)
Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Piccin Nuova Libraria S.p.A.
Rho-indipendenti
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La responsabilità della
terminazione sta nella
sequenza già trascritta
dalla RNA polimerasi
I terminatori rhoindipendenti richiedono
la formazione di una
forcina nella struttura
secondaria seguita da
una sequenza di A
(>8)
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Rho factor
�
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Il fattore Rho è una proteina terminatore
che si lega al RNA nascente si muove fino a
una sequenza che è ricca in C e povera
di G che precede il sito di terminazione.
È ~275 kD esamero di Rho subunità
identiche, della famiglia delle elicasi ATPdipendenti che funzionano passando l’acido
nucleico nel foro dell’esamero.
I terminatori Rho-dipendenti sono la metà
dei terminatori di E. coli.
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Terminatore debole o rho-dipendente
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Le RNA polimerasi eucariotiche sono composte da piu’di 10 subunità
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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Piccin Nuova Libraria S.p.A.
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TATA BOX BINDING PROTEIN
TBP
Saddle-like
domain
DNA
BINDING
TATA BOX
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TAF5 stabilizes
TAFs interaction,
specially histonelike ones (TAF6,
TAF9)
TAF1: Acetyl
transferase activity
Interaction with
TFIIF
TAF12
TAF8
TAF7
TAF4 TAF10 TBP
TAF6 TAF11
TAF5
TAF5
TAF8 TAF3
TAF11
TAF9 TAF13TAF12
TATA BOX
TAF6 TAF9TAF10
TAF13
TAF4
TAF3
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DNA BENDING
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TFIID
HETEROTETRAMER
(RAP30)2 (RAP74) 2
(RAP30)2 BINDS RNA POL II AND
TFIIB. RAP74 INTERACTS WITH
DNA. TFIIF STABILIZES THE
INTERACTION OF
RNA POLII WITH
PROMOTER AND STIMULATES
ELONGATION RATE
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DAB
TWO DOMAIN:
HETEROTRIMER
N-TERMINAL
(A, B, C SUBUNITS)
BINDS PROMOTER
REGION WITH TFIID
Zn-RIBBON AND
TFIIA
TFIIF
TFIID
CORE DOMAIN
TFIIE
TFIIB
TFIIH
TFIIE MODULATES THE
HELICASE AND KINASE
ACTIVITIESOF TFIIH
BY STIMULATING CTD
TFIIB INTERACTS WITH
SADDLE-LIKE DOMAIN OF TBP
AND WITH BENDED DNA ON
SIDES OF TATA BOX.
TBP/TFIIB COMPLEX
RECRUITS RNA POLII AND
OTHER GTF
P
DOMAIN RNA POLII
PHOSPHORYLATION
TFIIH STIMULATES
PROMOTER
OF RNA
MELTING ANDPHOSPHORYLATION
IT
HAS KINASE POLII CTD STIMULATES
ACTIVITY AGAINST
PROMOTER MELTING AND
RNA POL II
TRANSCRIPTION START
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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Piccin Nuova Libraria S.p.A.
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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Piccin Nuova Libraria S.p.A.
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Dal Volume: La Cellula,
un approccio
molecolare
Piccin
Nuova
Libraria S.p.A.
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Dal Volume:
La Cellula,
un approccio
molecolare
Piccin
Nuova
Libraria
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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare
Piccin Nuova Libraria S.p.A.
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The carboxy-terminal domain (CTD) of the
polymerase comprises repeats of a seven-aminoacid motif and undergoes reversible modification
by phosphorylation.
In particular, phosphorylation of a serine amino
acid at position 2 in each repeat increases as the
polymerase moves along the mRNA.
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b, Kim et al. have found that the Rtt103 protein
binds a CTD peptide carrying the serine 2
phosphorylation, and also associates with the
exonuclease Rat1 (Xrn2 in humans) and its
cofactor Rai1.
Thus, Rat1 may be recruited to the nascent mRNA
via Rtt103 bound to the polymerase CTD, and by
an independent system that involves Rai1.
Following cleavage of the poly(A) site, Rat1 binds
and eats away at the free end of the RNA,
halting transcription when it catches the
polymerase (c).
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The newly synthesized human -globin
mRNA will be cut at two positions: at the
normal site of poly(A) addition and within
the co-transcriptional cleavage (CoTC)
site, showed to be self-cleaving.
This allows the entry of Xrn2 (the
human Rat1 counterpart), which again eats
away at the mRNA until it catches up with
the RNA polymerase.
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Cappuccio
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Ed. – Capitolo
4
MetilIItransferasi
aggunge
CH3 al 7’ di
Funzioni: protezione al 5’; esportazione;
G; anche i primi 2 nt sono metilati
traduzione
Struttura del
Aggiunta di guanina al 1° nt trascritto dopo la
cappuccio
trascrizione di 20-30 nt.; legame 5’-5’ trifosfato
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I cleavage factors (CF) e i cleavage and
polyadenilation factors (CPF) consentono
alla poli(A) polimerasi (PAP) di
riconoscere il sito di taglio.
La PAP aggiunge solo una decina di A.
Questa corta coda viene riconosciuta
dalla polyA binding protein (PABII) che la
allunga fino ad arrivare a 200 A.
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Piccin Nuova Libraria S.p.A.
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Splicing
Rimozione di un introne attraverso
due reazioni sequenziali di
trasferimento di fosfato, note come
transesterificazioni.
Queste uniscono due esoni
rimuovendo l’introne come un
“cappio”
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Trasporto dell’mRNA dal nucleo al
citoplasma
Complesso di
carico: Proteina
cargo, Ran+GTP,
Esportina1,
Procarioti
trascrizione e traduzione avvengono
contemporaneamente nel citoplasma
NLS
Eucarioti
NES
Ran+GD
P
Ran+GT
P
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Structure of eukaryotic mRNA
5’
Cap
7mGppp
initiation
5’ untranslated region
AUG
translated region
UGA
termination
3’ untranslated region
polyadenylation signal
AAUAAA
(A)~200
3’
poly(A) tail
• all mRNAs have a 5’ cap and all mRNAs (with the exception
of the histone mRNAs) contain a poly(A) tail
• the 5’ cap and 3’ poly(A) tail prevent mRNA degradation
• loss of the cap and poly(A) tail results in mRNA degradation
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Gli snRNA creano assieme alla coilina uno scaffold proteico (corpi di Cajal).
Questi RNA vengono da introni di mRNA (non codificanti per proteine; e.g., UHG).
Si legano nel nucleolo alla fibrillarina.
Hanno regioni complementari agli rRNA 18s e 28s.
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La modificazione dell’uracile in pseudouracile è ad opera della Ψ-sintasi
De LeoModificazioni
- Fasano - Ginelli – post-trascrizionali
Biologia e Genetica, II Ed. –tRNA
Capitolo 4
3’CCA trascritto
in E.C.
Nei tRNA precursori vengono eliminati gli spaziatori, delle
sequenze al 5’ e 3’, ed in alcune specie, un introne (splicing
canonico).
Modificazione delle basi: ipoxantina, pseudouracile
Aggiunta al 3’ della sequenza CCA, comune a tutti i tRNA,
grazie all’azione dell’enzima tRNA nucleotidil transferasi
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