S. Grande

1H
MRS STUDY OF IONIZING
RADIATION EFFECTS
ON TUMOR CELLS
Sveva Grande1, Claudio
Giovannini2, Laura Guidoni1,
Anna Maria Luciani1,
Alessandra Palma1, Antonella
Rosi1, Orazio Sapora3,
Vincenza Viti1
1Dipartimento
di Tecnologie e Salute
e INFN Gr.coll. Sanità
2Centro Nazionale per la Qualità degli
Alimenti e per i Rischi Alimentari
3Dipartimento di Ambiente e Connessa
Prevenzione Primaria
Istituto Superiore di Sanità, Roma
Acta Biophysica Romana 2006
22 - 24 Febbraio 2006
INTRODUZIONE
La radioterapia è una metodologia clinica che fa uso di radiazioni
ionizzanti per la cura delle patologie tumorali. La ricerca volta a
migliorare le conoscenze di radiobiologia cellulare è fondamentale sia
per ottimizzare il trattamento che per mettere a punto “test”
predittivi della risposta al trattamento stesso.
La Spettroscopia di RM (Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS)
MRS
è una tecnologia che consente di indagare in maniera non invasiva
sistemi biologici di diversa complessità, dalle colture cellulari (“in
vitro”), alle biopsie (“ex vivo”) fino all’uomo (“in vivo”).
L’MRS del protone (1H MRS) ad alta risoluzione di cellule tumorali
o modelli di tumori può essere applicata all’individuazione di “marker”
spettroscopici,
ovvero di segnali di componenti cellulari che
spettroscopici
subiscono delle modificazioni in seguito ad irraggiamento.
SCOPO DEL LAVORO
Studio 1H MRS di due sistemi cellulari tumorali:
cellule HeLa (carcinoma della cervice)
cellule MCF-7 (carcinoma della mammella)
a selezionati intervalli di tempo dall’irraggiamento, per individuare
indicatori spettroscopici di radiosensibilità, svolgendo in parallelo
esperimenti biologici per avere informazioni sul tipo di danno
cellulare subito.
E’ stato analizzato in particolare il segnale del glutatione (GSH)
γ-Glu-Cys-Gly
|
SH
Il glutatione ridotto è un tripeptide presente in
tutte le cellule in natura, che agisce come antiossidante
proteggendole dagli effetti nocivi dei radicali liberi
prodotti dalle radiazioni ionizzanti; è inoltre in grado di
inibire il processo di morte cellulare per apoptosi.
apoptosi
L’apoptosi svolge un ruolo chiave nella biologia delle
cellule tumorali, e la sua induzione è alla base di molte
terapie antitumorali.
Relazione fra segnale MRS del GSH e apoptosi
MATERIALI e METODI
L’irraggiamento delle cellule è stato effettuato con una sorgente
60Co “Gammacell” a temperatura ambiente. Le cellule sono state
irraggiate direttamente nelle fiasche di coltura a dosi comprese
nell’intervallo (5-20) Gy.
Le cellule MCF-7 sono state trattate con 0.1 mM BSO per 18
ore prima dell’irraggiamento e degli esperimenti MRS.
Gli spettri 1D e 2D COSY di MR del protone (1H) sono stati
acquisiti a 400.14 MHz su di uno spettrometro Bruker AVANCE. Le
cellule per la misura sono state inserite in un sistema di tubi
coassiali e osservate 2,24,48,72 ore dopo l’irraggiamento.
Le cellule adese apoptotiche sono state rivelate mediante test
dell’Annessina V (citofluorimetria)
ESPERIMENTI BIOLOGICI
50
40
30
20
10
0
HeLa c
HeLa ir
24
48
time (hr)
% of apoptotic cells
% of apoptotic
cells
TEST DELL’ANNESSINA V
72
D=20 Gy
50
MCF-7 c
MCF-7 ir
40
30
20
10
0
24
48
time (hr)
72
La percentuale di cellule HeLa apoptotiche 24 ore dopo
l’irraggiamento è pari al 33% rispetto al 12% di cellule MCF-7.
MCF-7 più resistenti all’apoptosi
La maggior radiosensibilità delle HeLa è stata confermata da
misure di “cell killing” e di ciclo cellulare
SEGNALI DEL GSH NEGLI SPETTRI 1H MRS
M
cys= cisteina
in GSH
MCF-7
(ppm)
M= macromolecole
(riferimento)
HeLa
2 .0
1 .2
0 .8
(p p m )
in vivo
Il segnale G è più intenso nelle MCF-7
che nelle HeLa; il segnale g è invece
meno intenso nelle MCF-7 che nelle
HeLa.
Le differenze fra HeLa ed MCF-7 sono
statisticamente significative (media su
12 esperimenti).
1 .6
HeLa
MCF-7
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
G/g 2D
2 .4
G/g 1D
2 .8
glutot/M
Segnali MRS
visibili anche
in spettri
cys G
g/M
G= acido
glutammico in
GSH (2.55 ppm)
g=acido
glutammico libero
(2.35 ppm)
g
G/M
γ-Glu-Cys-Gly
|
SH
RISULTATO: le cellule MCF-7, più resistenti all’apoptosi, mostrano un
elevato livello di GSH nei loro spettri MRS; al contrario, le cellule HeLa,
caratterizzate da bassi livelli di GSH, risultano più sensibili alle radiazioni
ionizzanti e sono prone all’apoptosi
SEGNALE 1H MRS DEL GSH DOPO L’IRRAGGIAMENTO
MCF-7
HeLa
3
2,5
2
Control
1,5
Irr
1
0,5
0
0
D=20 Gy
Control
Irr
G/g
G/g
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
20
60
40
time (hr)
80
HeLa: il segnale del GSH, poco
intenso nei campioni di controllo si
mantiene pressoché costante in
seguito ad irraggiamento Æ
apoptosi
20
40
60
80
time (hr)
MCF-7: il segnale del GSH, intenso
nei campioni di controllo, diminuisce
in seguito ad irraggiamento Æ
deplezione del GSH Æ protezione
TRATTAMENTO DELLE CELLULE MCF-7 CON BSO
Le cellule MCF-7 sono state trattate
con butionina sulfossimina (BSO), che
inibisce la produzione del GSH
IL TEST DELL’ANNESSINA
effettuato su cellule MCF-7 trattate con
BSO ha mostrato un incremento della
percentuale di cellule apoptotiche 24 ore
dopo l’irraggiamento con D=20 Gy dal
(12±4)% (barra verde) relativo a MCF-7
non trattate al (36±6)% (barra gialla).
L’effetto non è più statisticamente
significativo 48 ore dopo l’irr.
G
Controllo
Tr.BSO
2.8
% of apoptotic cells
NEGLI SPETTRI 1H MR
si osserva una forte diminuzione del
segnale del GSH in seguito a
trattamento con BSO 0.1 mM per 18 ore
ed una aumento del segnale del
gluÆinibizione dell’enzima γ glutammilcisteina sintetasi
g
2.4
2.0 1.6
(ppm)
1.2
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0.8
MCF-7 c
MCF-7 ir
MCF-7 BSO tr
MCF-7 BSO tr +ir
24
time (hr)
48
BSO E DEPLEZIONE DEL GSH IN
SEGUITO AD IRRAGGIAMENTO
2,5
MCF-7 c
G/g
2
1,5
MCF-7 ir
1
0,5
0
0
20
40
60
MCF-7
BSO tr
MCF-7
BSO tr ir
time (h)
La diminuzione del rapporto fra intensità di segnali G/g nei campioni
irraggiati rispetto a quelli di controllo (simboli arancioni) scompare
trattando le cellule MCF-7 con BSO, nei campioni misurati 24 dopo
l’irraggiamento ed è appena evidente in quelli misurati 48 ore dopo
l’irraggiamento (simboli blu).
La deplezione del GSH indotta da radiazioni è
fortemente inibita nelle cellule trattate con BSO
CONCLUSIONI
Il segnale MRS del GSH è piu’ intenso nelle MCF-7 che nelle
HeLa;
Le MCF-7 sono più radioresistenti delle HeLa; non si osserva
apoptosi significativa;
Dopo il trattamento delle MCF-7 con BSO il livello di GSH è
meno intenso Æ minore attività della γ-glutammil-cisteina sintetasi
Æ MCF-7 più radiosensibili, apoptosi significativa
GSH dopo l’irraggiamento osservato con 1H MRS
HeLa: non si osservano variazioni significative del livello di GSH
MCF-7: deplezione del livello di GSH
MCF-7 trattate con BSO: deplezione del GSH di entità ridotta
Il livello iniziale di GSH protegge dall’apoptosi (?)
I segnali MRS del glutatione e dell’acido glutammico
libero sono in grado di fornire informazioni su processi
legati alla sensibilità delle cellule all’irraggiamento