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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA
SCUOLA DI DOTTRATO DI RICERCA IN SCIENZE MOLECOLARI
INDIRIZZO IN SCIENZE FARMACEUTICHE
XXVII CICLO
Dottorando:
Supervisore:
Dott.ssa Antonella Grigoletto
Dott. Gianfranco Pasut
Dipartimeto di Scienze del Farmaco
Dipartimento di Scienze del Farmaco
Via F. Marzolo, 5 - 35121, Padova
Via F. Marzolo, 5 - 35121, Padova
e-mail:
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[email protected]
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Influenza delle cariche negative sul miglioramento dei profili farmacocinetici
di proteine PEGhilate.
Le proteine bioattive sono soggette a modificazioni post-trasduzionali (PTM) che possono
alterarne struttura, stabilità e potenza. Oltre alle PTM che avvengono in vivo, le proteine
possono essere volutamente modificate in vitro. Una delle tecnologie più largamente utilizzata è
la coniugazione di catene di polietilene glicole (PEG), in un processo noto come PEGhilazione.
Questa tecnica di drug delivery permette di migliorare le proprietà chimico/fisiche delle
proteine modificate e di prolungarne il tempo di ritenzione nel flusso sanguigno, ottenendo così
un aumento della loro efficacia e sicurezza in vivo.
Il PEG, grazie alle sue eccezionali proprietà, come la non-tossicità, la non-immunogenicità,
l’elevata solubilità in acqua e in molti solventi organici, l’elevata flessibilità e
l'approvazione da parte della FDA e dell'EMEA per uso umano, è oggi il polimero più utilizzato
per coniugazioni polimero-proteina. Sono vari, infatti, i prodotti proteici PEGhilati presenti
in commercio: Adagen®, Oncaspar®, PEG-INTRON®, PEGASYS®, Neulasta®, Somavert®, Mircera®,
Cimzia®. Il principale vantaggio dell'utilizzo di PEG per le proteine è un miglioramento delle
prestazioni del prodotto finale, soprattutto per quanto riguarda l'estensione dell'emivita in
vivo. Infatti il PEG, grazie al suo elevato volume idrodinamico, aumenta notevolmente le
dimensioni del prodotto proteico che subisce così una riduzione della clearance renale. Per
raggiungere questo scopo vengono utilizzati PEG con peso molecolare tra 20-40kDa. Come tutti i
polimeri, anche il PEG ha una distribuzione gaussiana di pesi molecolari, indicata come indice
di polidispersità (PDI), ovvero il rapporto di massa molare media ponderale su massa molare
media numerica (Mw/Mn). I valori tipici sono compresi tra 1.01 e 1.1 ed aumentano all’aumentare
del peso molecolare del PEG. Per PEG inferiori a 10 kDa, la polidispersità è circa 1,01 e
aumenta a 1,1 o oltre per polimeri vicini ai 40 kDa. Il controllo dell’indice di polidispersità
è molto importante, poiché una proteina PEGhilata avrà un’indice di polidispersità relativa al
polimero di partenza. Inoltre la polidispersità finale del coniugato potrà presentare problemi
nella purificazione, caratterizzazione e bioattività in vivo dei coniugati. Di conseguenza, una
stretta distribuzione dei pesi molecolari od uso di PEG a basso peso molecolare semplificherà la
purificazione del materiale e la caratterizzazione dei prodotti coniugati. Tuttavia, l'uso di
PEG ad alto peso molecolare riduce drasticamente l'attività biologica delle proteine modificate,
per cui ad un aumento della farmacocinetica (PK) non corrisponde un incremento proporzionale
della farmacodinamica (PD). Il caso più famoso è l’interferone peghilato alfa-2a (Pegasys ®)
che conserva solo il 7% dell'attività antivirale della proteina nativa, anche se la sua
straordinaria emivita dà una prestazione eccellente.
Uno dei principali obiettivi nello sviluppo dei bioterapeutici è quello di migliorare i profili
PK delle molecole candidate, conservandone allo stesso tempo le sue proprietà PD.
In questo progetto si studierà un nuovo metodo per promuovere l'equilibrio PK/PD di proteine
PEGhilate. Oltre alla PEGhilazione, dati di letteratura riportano altri PTM che possono
influenzare la biodistribuzione e la clearance proteica. È già noto che proteine anionizzate o
cationizzate, rispetto a quelle native, mostrano una diversa distribuzione tissutale e
clearance. È stato anche dimostrato che l'anionizzazione di polimeri ne prolunga l'emivita nel
sangue, mentre la cationizzazione la riduce. Tuttavia questi fenomeni sono relativi anche al
peso molecolare ed alle dimensioni delle proteine o dei polimeri e diversi fattori devono essere
presi in considerazione. Si ipotizza che un nuovo approccio di PEGhilazione dove venga aumentato
sia il volume idrodinamico che le cariche nette negative può portare ad un miglioramento dei
risultati nella PTM delle proteine.
Durante il periodo di dottorato si testerà la possibilità di impiegare dei nuovi PEG portanti
delle cariche nette negative sulla superficie per la coniugazione di proteine farmaceutiche allo
scopo di modificare i profili farmacocinetici e la distribuzione nell'organismo di questi nuovi
derivati proteina-PEG in confronto con quelli standard. La ragione di questo lavoro è duplice:
per consentire uno studio preclinico preliminare dell'equilibrio in vivo PK/PD e dell'influenza
delle cariche sui coniugati e per poter utilizzare potenzialmente PEG a basso peso molecolare
che avranno un indice più basso di polidispersità rispetto a PEG ad alto peso molecolare, in
modo da ottenere prodotti più omogenei.
Il progetto verrà sviluppato in tre fasi:
1. Sintesi di nuovi agenti PEGhilanti.
Lo studio prevede l'utilizzo di PEG eterobifunzionali di 5 kDa che da un lato presentano
un gruppo protetto all’N-terminale e dall'altro lato un gruppo carbossilico. Tale gruppo
è inizialmente attivato mediante HOBt/DCCI e coniugato con catene di diversa lunghezza di
acido poliglutammico (PLE). Questo passaggio permetterà di creare una struttura
contenente da 8 a 10 gruppi carbossilici (NH2-PEG-(PLE)n). I prodotti saranno
caratterizzati mediante 1H-NMR, massa MALDI-TOF, titolazione e gel filtrazione. Sarà
inoltre effettuato uno studio della biocompatibilità. In uno studio preliminare, il PEG
portante cariche negative sarà coniugato a fluorescina isotiocianato (FITC), colorante
fluorescente, e, l'emivita di questi coniugati sarà valutata nei topi mediante analisi di
fluorescenza. Per la presenza di cariche negative è infatti previsto un incremento del
tempo di emivita di queste strutture. Al tempo stesso, anche PEG 5, 10 e 20 kDa coniugati
a FITC saranno analizzati come controllo.
2. Coniugazione dei PEG dendroni a proteine.
Diverse ed importanti proteine farmaceutiche come l’insulina, l’eritropoietina e
l’ormone della crescita umano (hGH) saranno prese in considerazione in questo progetto.
Tutte queste molecole sono farmaci molto utili, ma soffrono di una veloce escrezione
renale. A differenza dei classici metodi chimici utilizzati per PEGhilare proteine sarà
utilizzato un nuovo metodo enzimatico. Questa tecnica è altamente selettiva e si avvale
di un enzima espresso ubiquitariamente: transglutaminasi (TGasi). TGasi è in grado di
catalizzare un’acil trasferimento tra due proteine che coinvolge il gruppo glutamminico
di una glutammina (acil donatore) e una ammina primaria (acil accettore), di solito il
gruppo ε-amminico di una lisina. La PEGhilazione mediata da TGasi presenta due
importanti vantaggi: i) la modifica di un residuo glutamminico, che altrimenti non può
essere modificato con metodi chimici, ii) l’ottenimento di prodotti omogenei poiché solo
una o poche glutammine sono substrato dell’enzima e vengono modificate.
NH2-PEG-(PLE)n verrà coniugato con le proteine di interesse sfruttando questo metodo. I
derivati PEGhilati saranno purificati e caratterizzati utilizzando le tecniche più
appropriate. Al fine di non alterare le strutture proteiche, scambio ionico, gel
filtrazione e dialisi verranno utilizzati come tecniche di purificazione. Le
conformazioni spaziali dei coniugati saranno valutate mediante dicroismo circolare,
fluorescenza, spettrometria di massa e dynamic light scattering. Verranno inoltre
applicate tecniche di isoelettrofocalizzazione per valutare i cambiamenti attesi in pI
della proteina dopo la modifica con NH2-PEG-(PLE)n. Quest’ultima tecnica verrà utilizzata
per la determinazione della carica totale dei coniugati.
3. Studi in vivo
I profili farmacocinetici delle proteine PEGhilate saranno determinati in topi e ratti.
Se i prodotti dimostreranno una maggiore emivita rispetto alla proteina nativa e
comparabile con i derivati coniugati con PEG ad alto peso molecolare (20kDa), la loro
attività sarà valutata in vivo.
L'effetto biologico in vivo dei derivati d’insulina sarà valutato misurando la curva
glicemica in animali diabetici. L'attività biologica dei coniugati hGH sarà testata in
ratti ipofisectomizzati valutando l'aumento di peso degli animali durante una settimana.