Report riassuntivo del progetto BIO.WI.STA

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Report riassuntivo del progetto BIO.WI.STA
Report riassuntivo del progetto BIO.WI.STA
Abstract
Versione in italiano
TITOLO DEL PROGETTO: Sviluppo di un sensore “label-free" per il controllo in tempo reale della stabilità
microbiologica dei vini imbottigliati
Il progetto BIO.WI.STA è nato con lo scopo di sviluppare un sensore plasmonico label-free capace di
valutare la stabilità microbiologica del vino imbottigliato, basato sulla tecnologia SPR (risonanza plasmonica
di superficie) e capace di garantire elevati livelli di sensibilità e specificità, con costi compatibili per un
‘analisi di screening’. Tra le problematiche che il settore enologico si trova ad affrontare vi è quella inerente
l’instabilità microbiologica dei prodotti, che potrebbe portare a rischi igienici, qualitativi e di immagine. La
stabilità microbiologica è ambito ritenuto essenziale per garantire il rispetto delle specifiche di prodotto, ed
è disciplinato nei protocolli analitici che la stessa Grande Distribuzione adotta per verificare, con prelievi “a
scaffale” la qualità dei prodotti. In conseguenza di questa politica di controlli le aziende sono costrette ad
adottare procedure di quarantena che le obbligano a tenere stoccata la marce in magazzino senza che ciò
abbia una finalità o causale legata al processo produttivo, ma semplicemente per l’assenza di strumenti di
analisi che siano in grado di valutare questi aspetti in tempo reale. Tali limitazioni potrebbero essere
superate con metodologie innovative capaci di offrire rapidamente risposte sulla stabilità microbiologica
del vino imbottigliato mediante lo sviluppo di un dispositivo portatile, utilizzabile direttamente in cantina di
stoccaggio. Il progetto BIO.WI.STA è nato allo scopo di soddisfare questa esigenza, in modo da monitorare
direttamente in fase di imbottigliamento eventuali contaminazioni del vino.
L’attività progettuale è composta da diverse fasi, tra cui:
- La selezione dei ceppi dei microorganismi del vino
- L’identificazione e l’ottimizzazione del protocollo di riconoscimento dei ceppi individuati
- La realizzazione e la caratterizzazione del sensore plasmonico
- L’integrazione del sistema
Una volta ottenuto il sistema integrato, erano previste campagne di misura su campioni reali per
l’elaborazione di un indice di rischio.
In una prima fase si sono portate avanti parallelamente la fase di sviluppo e caratterizzazione dei dispositivi
plasmonici e la fase di messa a punto del protocollo di funzionalizzazione, che sono stati poi integrati per la
realizzazione del biosensore. Sono stati testati due tipi di dispositivi plasmonici, flat e grating, con tecniche
di analisi differenti. Questo ha permesso di identificare la tecnica più appropriata per l’applicazione in
esame, che è risultata essere quella basata su prisma ossia quella con i dispositivi flat. Questi infatti hanno
rilevato in tutti i test effettuati uno shift significativo della risonanza plasmonica, a differenza dei grating
che probabilmente soffrono di problemi di scattering della luce dovuti alla presenza dei microorganismi da
rilevare.
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Tel. 340 3201129
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Grazie ai diversi sistemi di bioriconoscimento, si sono realizzati dei sensori plasmonici che hanno
dimostrato riuscire a rilevare sia batteri, in particolare gram negativi, sia lieviti, con tempi di analisi di circa
un’ora, dovuti ai tempi di incubazione cellulare. Tali tempi sono molto inferiori rispetto a quelli delle
tecniche tradizionali di coltura microbiologia, dimostrando come questo tipo di analisi possa venire
incontro alle esigenze dei produttori vinicoli. Tuttavia il limite di detection è ancora superiore rispetto a
quello richiesto, il ché comporta ad una necessaria fase di pre-trattamento del campione e di
ottimizzazione del sensore.
English version
TITLE OF THE PROJECT: Development of a “label-free” sensor for the real-time control of the
microbiological stability of bottled wines
BIO.WI.STA. project aims to develop a label-free plasmonic sensor capable to evaluate the microbiological
stability of bottled wines, based on SPR (Surface Plasmon Resonance) technique and capable to assure a
very high sensitivity and selectivity, with costs compatible to a screening analysis.
Among the issues that the wine industry is facing, there is the problem of the products microbiological
instability, that could imply hygienic and qualitative risks as well as reputation ones. The microbiological
stability is a fundamental aspect for assuring the product specifications and it is regulated by analytical
protocols that also the mass distribution adopts to check the products quality.
As a consequence of these controls, the companies are forced to adopt quarantine procedures which oblige
them by keeping stored the merchandize in stock. This has no a purpose or a cause related to the
production process, but it is due to the absence of analysis instruments capable to monitor these aspects in
real time. These limitations could be overcome with innovative methods that offer quick answers on
microbiological stability of bottled wine by developing a portable device that can be used directly in the
storage cellar. BIO.WI.STA. project aims to satisfy this need, in order to monitor possible wine
contaminations directly in bottling phase.
The project activity consists of different phases, including:
-
The selection of strains of the wine microorganisms
Identification and optimization of the protocol for the biorecognition of the identified
strains
-
Development and characterization of plasmonic sensor
System integration
After the system integration, measurements on real samples was planned in order to develop a risk index.
Initially the phase of plasmonic sensors development and characterization had been carried out in parallel
with the phase of identification of the functionalization protocol, and then they had been integrated for the
biosensor realization.
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Two different plasmonic sensors have been tested: flat, for the prism configuration, and grating, in conical
mount configuration. This allowed to identify the most appropriate technique for the specific application,
that is the prism configuration based on the flat chips. These devices have been able to detect a relevant
plasmonic resonance shift in all the tests, unlike the gratings that probably suffer of light scattering issues
due to the presence of the microorganisms that should be detected.
Thanks to the different developed biorecognition systems, plasmonic sensors capable to detect both
bacteria and yeasts have been realized, with analysis time of about one hour due to the cells incubation
time. The analysis times are much lower than those of traditional techniques of microbiology culture,
demonstrating that this type of analysis can meet the needs of wine producers. However, the limit of
detection is still higher than that required, and this leads to a necessary pre-treatment of the sample and
the sensor optimization.
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1. Introduzione ai plasmoni di superficie
I plasmoni di superficie sono onde elettromagnetiche che si propagano all’interfaccia tra un mezzo
metallico ed un dielettrico ed hanno la caratteristica di essere molto sensibili alle variazioni fisiche che
avvengono all’interfaccia stessa.
L’eccitazione dei plasmoni di superficie avviene solo in particolari configurazioni. Le più famose sono:
-
Accoppiamento tramite prisma: la luce raggiunge l’interfaccia metallo/dielettrico
passando attraverso un prisma ad elevato indice di rifrazione (fig. 1)
Accoppiamento tramite grating: la luce incide direttamente dal mezzo dielettrico su un
reticolo nano-strutturato unidimensionale (fig. 2)
Figura 1 Configurazione di accoppiamento tramite prisma
Figura 2 Configurazione di accoppiamento tramite reticolo
Nel corso di questo progetto entrambe le tipologie di superfici, sia piatte che nano-strutturate, sono state
utilizzate per lo sviluppo dei sensori esplorando quindi entrambe le configurazioni, per valutare quale delle
due tecniche sia più adatta al tipo di applicazione.
2. Materiali e metodi per lo sviluppo del sensore
Lo sviluppo del sensore plasmonico prevede diverse fasi tra cui: l’individuazione degli anticorpi necessari
per il riconoscimento dei microorganismi target e la messa a punto di un protocollo di funzionalizzazione, la
realizzazione dei dispositivi e la loro caratterizzazione e lo sviluppo di un sistema di misura per la rilevazione
della risonanza plasmonica di superficie. Vi è inoltre una fase di pre-trattamento del campione dove è stato
studiato un sistema di filtraggio che permette di concentrare la carica batterica presente nel campione
stesso.
Di seguito verranno descritte le diverse attività che hanno visto coinvolti diversi enti, tra cui Veneto
Nanotech e l’Università degli Studi di Padova.
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2.1.
Individuazione degli anticorpi per il riconoscimento dei microorganismi
Per un’efficace selezione di anticorpi in grado di riconoscere tutti i microorganismi potenzialmente presenti
durante il processo di imbottigliamento del vino, si è resa necessaria un’approfondita analisi della
letteratura di settore, nonché una revisione dei prodotti attualmente sul mercato in grado di riconoscere i
singoli microorganismi. Tali anticorpi infatti sono impiegati per la funzionalizzazione della superficie di
rivelazione e devono avere caratteristiche tali da poter garantire un efficiente riconoscimento
immunomediato di tutti i microorganismi d’interesse.
I seguenti anticorpi anti batteri gram -, gram+ e lieviti sono stati selezionati per i test di riconoscimento
anticorpale:
2.2.
Dispositivi
Per effettuare le varie prove sperimentali sono stati utilizzati due dispositivi:
•
•
Flat: substrato in policarbonato con superficie planare e un layer
metallico
Grating: substrato in policarbonato e superficie nano strutturata con
un layer metallico
I dispositivi sono rettangolari di dimensioni 25 mm x 32 mm, ed hanno l’intera
superficie metallizzata.
Inizialmente il layer metallico era di argento, ma poi per questioni di compatibilità con il materiale biologico
si è scelto di utilizzare l’oro. In tabella 1 sono riportate le caratteristiche del layer metallico dei dispositivi
utilizzati.
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Spessore d’argento
nm
Densità Ottica
FLAT
40 nm 1500
GRATING 55 nm 2000
Spessore d’oro
nm
50
65
Tabella 1 Riassunto dei dispositivi utilizzati e relativi spessori metallici
2.3.
Banchi sperimentali
Sono stati utilizzati due banchi di misura, uno per l’analisi dei dispositivi flat e uno per i dispositivi grating.
Nella configurazione di accoppiamento tramite reticolo la superficie nanostrutturata viene montata in
configurazione conica. Il segnale plasmonico può essere registrato sia leggendo l’intensità della luce riflessa
(riflettanza) o trasmessa (trasmittanza) dall’interfaccia. Per effettuare questi test è stato utilizzato il banco
sperimentale riportato in Fig. 3.
Figura 3 Banco ottico per l’analisi plasmonica del reticolo nano-strutturato in configurazione conica. La foto principale mostra il
set-up in grado di leggere la riflettanza; la foto in alto a destra mostra il set up in grado di leggere la trasmittanza, mentre in
basso a destra è mostrata la superficie nano-strutturata con una cella micro-fluidica
Il parametro di sensing scelto in questa configurazione è la variazione di angolo azimutale φ, ossia l’angolo
compreso tra il piano di scattering della luce ed il vettore di periodicità del reticolo, quindi l’intensità della
luce riflessa viene misurata al variare di φ, con
teoriche.
fissato opportunamente sulla base di conoscenze
In Fig. 4 è riportato lo schema della configurazione con prisma. La peculiarità di questa configurazione è che
la luce non incide direttamente la superficie da analizzare, bensì il substrato del dispositivo accoppiato col
prisma, evitando così problemi di scattering dovuti ad esempio da canali microfluidici o da molecole di
grosse dimensioni che possono alterare il cammino ottico della luce.
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Figura 4 Schema del banco ottico usato per l’eccitazione nella configurazione con prisma; a destra una foto del banco ottico
2.4.
Funzionalizzazione dei dispositivi
La modifica superficiale dei dispositivi, detta anche funzionalizzazione, ricopre un ruolo fondamentale per
lo sviluppo di un sensore. Essa infatti permette di creare uno strato di molecole sull’area attiva in grado di
legarsi selettivamente alla molecola target, che in questo caso rappresenta il battere o il lievito.
La funzionalizzazione di dispositivi per rilevazioni immunomediate prevedono 2 layer di funzionalizzazione
(fig. 5):
1- Strato di spacer, ossia molecole in grado di immobilizzarsi sul metallo in maniera uniforme ed
esporre i siti di legame per l’anticorpo
2- Strato di anticorpi, in grado di legarsi selettivamente alla molecola di interesse
Figura 5 Strati utilizzati per rendere la superficie funzionale alla cattura di micro organismi
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In generale, come si vede dalla Fig. 5 la superficie metallica deve essere funzionalizzata con uno strato
molecolare che sia in grado di aderire alla superficie metallica e che esponga un gruppo carbossilico -COOH
oppure un gruppo amminico NH2. Il gruppo esposto viene poi utilizzato per immobilizzare sulla superficie
uno strato di anticorpi che riescano a legare selettivamente i microorganismi di interesse attraverso le
proteine di membrana.
Sono state studiate quattro configurazioni per l’immobilizzazione degli anticorpi:
Metallizzazione
Argento
Strato molecolare:
PEG
Oro
PEG
Cisteamina
MUA/MCH
anticorpi
policlonale di ratto anti
escherichia coli
Anti LPS
Anti LPS
Anti LPS
Microorganismi target
-Batteri Gram Batteri Gram Lieviti
Il protocollo prevedeva:
-
Lavaggio dei dispositivi con piranha basica NH3OH:H2O2:H2O 1:1:5.
Immobilizzazione dello spacer, il cui processo era diverso a seconda dello spacer:
-
Attivazione gruppo -COOH dello spacer (cross linker eterobifunzionale)
Incubazione anticorpi anti-microorganismi target (1mg/ml) in buffer fosfato o/n in camera umida:
o Scongelamento e risospensione cellule batteriche/lievito in buffer
o Valutazione O.D. (densità ottica) 600nm.
o Marcatura con fluoroforo Alexa Fluor (AF) 555 o 647
o Lavaggi (3X) in TBS/FBS 1X
o Risospensione in TBS BSA 1% per l’incubazione sui vetrini depositati con gli anticorpi 1h
@RT @300 rpm
o Deposizione di 100 μl di soluzione con ≈104 c.f.u. nelle aree di sensing
2.5.
Sistema di filtraggio per il pre-trattamento del campione
Il sensore label-free prevede un sistema di microfluidica che convoglia il campione di vino nella specifica
sede di interesse. Al fine di velocizzare ed ottimizzare il processo di riconoscimento dei batteri e lieviti si è
mirato ad ottenere una carica batterica (o dei lieviti) concentrata, diminuendo il volume di distribuzione
della soluzione. Diversi sistemi di filtraggio sono stati testati.
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Le soluzioni ottenute al 40% e 50% rispettivamente rispetto al volume iniziale, mostrano crescite batteriche
e di lieviti visivamente compatibili con la quota di concentrazione data dalla riduzione in volume. I risultati
suggeriscono la possibilità di spingersi molto oltre con la quota di riduzione.
Escludendo una minimale quota di deposito sulle membrane, la totale assenza di crescita batterica e di
lieviti nel liquido rimosso, di per sé conferma la validità del processo di concentrazione.
3. Risultati sperimentali
Di seguito verranno riportate esclusivamente le diverse prove di integrazione del biosensore della
componente biologica e il dispositivo plasmonico, ovvero i risultati delle prove di rilevazione della carica
microbiologica. Saranno omessi i risultati relativi alle prove di resistenza dei sensori e le prove in
fluorescenza per la messa a punto del protocollo di funzionalizzazione, per i quali si rimanda al report
complessivo.
3.1.1. Prove di detection effettuate sui dispositivi in oro
Per queste prove si sono utilizzati dispositivi in oro per le sue caratteristiche di biocompatibilità e resistenza
alle diverse soluzioni.
Sono state effettuate prove di rilevazione sia di batteri gram negativi che di Lieviti (S. Cervisae). Per i gram
negativi si è utilizzato PEG o cisteamina come substrato per l’immobilizzazione degli anticorpi mentre per i
lieviti è stata utilizzata la combinazione Mercaptoundecanoicacid e Mercaptohexanol (MUA+MCH). Per
ogni tipologia di funzionalizzazione si sono considerati due dispositivi.
Per tutte le prove i dispositivi sono stati suddivisi in 6 aree di rilevazione che rappresentano una diversa
condizione della superficie come rappresentato in Fig.6. La suddivisione delle aree è resa possibile grazie
all’utilizzo di un’apposita maschera di funzionalizzazione a 16 pozzetti.
Figura 6 Schema di deposizione utilizzato per le prove effettuate sui dispositivi in oro.
Le zone 1 e 2 e le zone 3 e 4 verranno utilizzate per registrare il segnale plasmonico mentre gli ultimi
pozzetti sono stati utilizzati per delle prove di controllo in fluorescenza. Il confronto tra le varie condizioni
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della superficie è effettuato per righe. Tra le zone 1 e 2 è stata registrata la variazione plasmonica
introdotta dall’adesione dell’anticorpo rispetto alla condizione avente solamente lo strato molecolare
assorbito. Mentre tra le zone 3 e 4 è stata registrata la variazione introdotta dalla presenza di batteri gramo lieviti rispetto allo strato con il solo anticorpo.
Di seguito riportiamo i risultati ottenuti per le varie prove effettuate.
3.1.1.1. Strato molecolare di PEG e rilevazione di batteri gram negativi
Di seguito sono riportati i risultati di un dispositivo flat e di un dispositivo grating, presi ad esempio, in cui lo
strato di spacer utilizzato era PEG3400. La rilevazione era di batteri gram negativi.
FLAT
GRATING
-4
0.7
10.5
PEG
PEG+Probe
0.65
x 10
PEG φ = 23.2°
10
0.55
0.5
0.45
9
8.5
8
0.4
7.5
0.35
7
44
Peg + Probe φ =15.6°
9.5
reflectance [a.u.]
Reflectance [a.u.]
0.6
44.5
45
45.5
46
46.5
Incident angle [°]
47
47.5
6.5
-60
48
-40
-20
0
20
40
60
azimuthal angle [deg]
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto funzionalizzato con PEG (blu)
e nel pozzetto con gli anticorpi (rossa)
Δθ=0.416° ± 0.01°
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto funzionalizzato con PEG (blu)
e nel pozzetto con gli anticorpi (rossa)
Δφ=-6.7° ± 1.2°
-4
10
0.7
x 10
Peg + Probe φ = 18.9°
PEG+Probe
Target
0.65
Target φ =17.6°
reflectance [a.u.]
Reflectance [a.u.]
0.6
0.55
0.5
0.45
9
0.4
0.35
44
44.5
45
45.5
46
46.5
Incident angle [°]
47
47.5
48
8
-60
-40
-20
0
20
40
60
azimuthal angle [deg]
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto con gli anticorpi (blu) e nel
pozzetto esposto ai batteri Gram-(rossa)
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto con gli anticorpi (blu) e nel
pozzetto esposto ai batteri Gram-(rossa)
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Δθ=0.195° ± 0.041
Δφ=-1.8° ± 0.6°
Controllo in fluorescenza effettuato nella zona 5
immobilizzando batteri gram- marcati con fluoroforo
AF647
Controllo in fluorescenza effettuato nella zona 5
immobilizzando batteri gram- marcati con
fluoroforo AF647
Queste prove di funzionalizzazione con PEG3400 hanno dato un buon segnale plasmonico sia per il
dispositivo flat che per il grating per quanto riguarda l’immobilizzazione dell’anticorpo.
La presenza di batteri gram negativi ha dato un segnale significativo, ossia superiore al rumore di misura, e
riproducibile con i dispositivi flat, invece con i grating ha dato un segnale significativo ma non coerente
nelle varie repliche.
Il problema emerso con entrambi i dispositivi è che, pur avendo ottenuto un segnale significativo, la
sensibilità del sensore è molto bassa, e gli shift ottenuti sono troppo piccoli rispetto alla concentrazione di
batteri utilizzata.
Per poter aumentare la sensibilità, si è scelto di testare altri spacer, in modo da ridurre lo spessore del layer
di funzionalizzazione ed avere la zona sensibile là dove il campo plasmonico è più elevato.
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3.1.1.2. Strato molecolare di ciste amina e rilevazione di batteri gram negativi
Di seguito sono riportati i risultati di un dispositivo flat e di un dispositivo grating, presi ad esempio, in cui lo
strato di spacer utilizzato era cisteamina. La rilevazione era di batteri gram negativi.
FLAT
GRATING
-4
9.4
0.65
Cis
Cis+Probe
0.6
cis + Probe φ =25.2°
9
reflectance [a.u.]
0.5
Reflectance [a.u.]
cis φ = 24.7°
9.2
0.55
0.45
0.4
0.35
0.3
8.8
8.6
8.4
8.2
8
7.8
0.25
0.2
44.5
x 10
7.6
45
45.5
46
46.5
47
Incident angle [°]
47.5
48
7.4
-60
48.5
-40
-20
0
20
40
60
azimuthal angle [deg]
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto funzionalizzato con
cisteamina (blu) e nel pozzetto con gli anticorpi
(rossa)
Δθ=0.595± 0.063°
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto funzionalizzato con
cisteamina (blu) e nel pozzetto con gli anticorpi
(rossa)
Δφ=-1.0° ± 1.1°
-4
9.4
0.65
x 10
Cis + Probe φ = 26.8°
Cis+Probe
Target
0.6
Target φ =29.0°
9.2
reflectance [a.u.]
0.55
Reflectance [a.u.]
0.5
0.45
0.4
0.35
9
8.8
8.6
0.3
8.4
0.25
0.2
44.5
45
45.5
46
46.5
47
Incident angle [°]
47.5
48
48.5
8.2
-60
-40
-20
0
20
40
60
azimuthal angle [deg]
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto con gli anticorpi (blu) e nel
pozzetto esposto ai batteri Gram-(rossa)
Δθ=0.155°± 0.031°
Riflettanza in funzione dell’angolo azimutale
registrate nel pozzetto con gli anticorpi (blu) e nel
pozzetto esposto ai batteri Gram-(rossa)
Δφ=0.9° ± 0.6°
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Controllo in fluorescenza effettuato nella zona 5
immobilizzando batteri gram- marcati con
fluoroforo AF647
Controllo in fluorescenza effettuato nella zona 5
immobilizzando batteri gram- marcati con
fluoroforo AF647
Queste prove di funzionalizzazione con cisteamina hanno dato uno shift molto evidente sia per il dispositivo
flat che per il grating per quanto riguarda la presenza della cisteamina stessa rispetto al dispositivo non
funzionalizzato.
I flat hanno dato uno shift simile a quello trovato con l’uso di PEG sia per l’immobilizzazione dell’anticorpo
sia per la rilevazione dei batteri. L’utilizzo di cisteamina quindi non ha portato ad un miglioramento della
sensibilità del sensore. I grating invece non hanno dato alcun risultato significativo dato dalla presenza di
batteri.
3.1.1.3. Strato molecolare di MUA+MCH e rilevazione di lieviti
Di seguito sono riportati i risultati di un dispositivo flat e di un dispositivo grating, presi ad esempio, in cui lo
strato di spacer utilizzato era MUA+MCH. La rilevazione era di lieviti.
FLAT
GRATING
-4
0.9
10.5
mua φ = 36.4671°
ctrl
ctrl+Probe
0.8
9.5
reflectance [a.u.]
Reflectance [a.u.]
mua + Probe φ =34.6438°
10
0.7
0.6
0.5
0.4
9
8.5
8
0.3
7.5
0.2
7
0.1
45
x 10
45.5
46
46.5
47
47.5
48
Incident angle [°]
48.5
49
49.5
50
6.5
-60
-40
-20
0
20
40
60
azimuthal angle [deg]
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto funzionalizzato con MUA+
MCH (blu) e nel pozzetto con gli anticorpi (rossa)
Δθ=0.833° ± 0.285°
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto funzionalizzato con MUA+
MCH (blu) e nel pozzetto con gli anticorpi (rossa)
Δφ=-2.3° ± 0.7°
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-4
0.9
9.8
mua + Probe φ = 41.0255°
ctrl+Probe
Target
0.8
9.4
reflectance [a.u.]
Reflectance [a.u.]
Target φ =41.0255°
9.6
0.7
0.6
0.5
0.4
9.2
9
8.8
0.3
8.6
0.2
8.4
0.1
44
x 10
45
46
47
Incident angle [°]
48
49
50
8.2
-60
-40
-20
0
20
40
60
azimuthal angle [deg]
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto con gli anticorpi (blu) e nel
pozzetto esposto ai lieviti (rossa)
Δθ=0.476° ± 0.040°
Riflettanza in funzione dell’angolo di incidenza
registrate nel pozzetto con gli anticorpi (blu) e nel
pozzetto esposto ai lieviti (rossa)
Δφ=-0.4° ± 0.6°
Controllo in fluorescenza effettuato nella zona 5
immobilizzando lieviti marcati con fluoroforo AF647
Controllo in fluorescenza effettuato nella zona 5
immobilizzando lieviti marcati con fluoroforo AF647
Queste prove di funzionalizzazione con MUA/MCH hanno dato esiti diversi per i due tipi di dispositivi.
I flat hanno dato uno shift significativo e riproducibile sia per l’immobilizzazione dell’anticorpo che per la
rilevazione dei lieviti.
La sensibilità dei flat è maggiore con questo tipo di funzionalizzazione rispetto agli altri considerati.
I grating non hanno dato alcun shift significativo dato dalla presenza di lieviti.
In tabella 2 sono riportati i valori di shift angolare ottenuti nelle varie prove effettuate.
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PEG 3400
Cisteamina
MUA+MCH
Superficie piatta
Variazione tra
strato molecolare e
anticorpo
0.655° ± 0.067°
0.416° ± 0.01°
0.594° ± 0.098°
0.595° ± 0.063°
0.833° ± 0.285°
0.684° ± 0.035°
Variazione tra
anticorpo e microorganismo target
0.173° ± 0.044°
0.195° ± 0.041
0.063° ± 0.126°
0.155° ± 0.031°
0.476° ± 0.040°
0.51° ± 0.063°
Superficie nano-strutturata
Variazione tra
Variazione tra
strato molecolare e anticorpo e microanticorpo
organismo target
-6.7° ± 1.2°
-1.8° ± 0.6°
-6.7° ± 0.1°
0.7° ± 0.1°
0.1° ± 0.5°
1.8° ± 0.6°
-1.0° ± 1.1°
0.9° ± 0.6°
0.4° ± 0.1°
-0.4° ± 0.6°
-2.3° ± 0.7°
6.1° ± 0.9°
Tabella 2 Variazioni angolari registrate nelle due configurazioni di misura per le varie condizioni della superficie e per i due
dispositivi misurati in ciascuna prova. L’errore si riferisce a due misure consecutive effettuate per ciascun pozzetto.
Dalla tabella 2 possiamo vedere che la variazione di angolo di risonanza plasmonica introdotta dai batteri
gram negativi o dai lieviti rispetto alla situazione con i soli anticorpi immobilizzati, misurata sui dispositivi
flat in accoppiamento tramite prisma, è sempre positiva anche se molto variabile.
Nel caso della nano-struttura la variazione è molto instabile e passa da negativa, come dovrebbe essere, a
positiva. La maggior variabilità che si registra in questa condizione potrebbe essere dovuta al fatto che la
superficie viene illuminata attraversando il mezzo contenente i microorganismi che conseguentemente
modificano l’angolo di incidenza della luce riflettendola sottoforma di onde sferiche. Di fatto questa elevata
variazione impedisce la discriminazione tra la condizione con i soli anticorpi immobilizzati e la condizione
avente i micro organismi immobilizzati.
Per quanto riguarda le prove di fluorescenza si può vedere come il miglior segnale venga prodotto nelle
prove aventi cisteamina e MUA+MCH come strato molecolare. Mentre nella prova tramite PEG il segnale è
pressoché assente sia nel caso della superficie piatta che per quella nano-strutturata.
Dalle prove di fluorescenza e considerando le elevate variazioni introdotte dai lieviti rispetto allo strato con
anticorpo si è deciso di utilizzare MUA ed MCH come substrato per legare gli anticorpi alla superficie.
4. Upgrade del banco di accoppiamento tramite reticolo
Come anticipato in precedenza la difficoltà della rilevazione della presenza di microorganismi nella
condizione di illuminazione della superficie del grating dipende dal fatto che la luce prima di incidere sulla
superficie ed eccitare la risonanza plasmonica viene diffratta dai microorganismi stessi impedendone la
rilevazione.
Per ovviare a questo fatto si è deciso di effettuare un upgrade del banco in modo da riuscire ad identificare
le singole zone del dispositivo ed identificare puntualmente la risposta dovuta all’immobilizzazione di
microorganismi. Questo grazie all’introduzione di un filtro spaziale che permette di rendere omogeneo il
fascio laser e l’utilizzo di una CCD ad alta risoluzione che permette di analizzare aree di 1 μm per pixel.
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Per capire l’effetto della presenza dei microorganismi sulla superficie del dispositivo sono stati
immobilizzati dei lieviti direttamente sulla superficie. Come si vede da Fig.7 i lieviti che vengono deposti
sulla superficie creano delle zone scure che diffrangono la luce. L’intensità di luce riflessa dalle zone del
grating occupate dai lieviti non è così elevata da essere rilevata dalla CCD che pertanto manifesta delle zone
nere.
In fig.8 vengono confrontate le immagini acquisite tramite banco plasmonico e microscopio ottico che
confermano la corrispondenza tra zone scure registrate e presenza di lieviti. Inoltre le due frecce verdi
indicano agglomerati di lieviti e la freccia rossa mostra l’effetto prodotto sull’immagine dal singolo lievito.
Figura 3 effetto della presenza dei lieviti sulla superficie del dispositivo.
Figura 8 confronto tra l’immagine della superficie raccolta tramite banco ottico plasmonico (sinistra) e tramite microscopio
ottico (destra). Le due frecce in verde mostrano la corrispondenza tra due agglomerati di lieviti mentre la freccia rossa indica
l’immagine fornita dal singolo lievito
Per testare la capacità di rilevare zone sottoposte a diverse funzionalizzazioni si sono effettuati dei test di
deposizione di MCH su dispositivi in argento. Come si vede dalla Fig. 9 presa ad un determinato angolo
azimutale, l’immagine della superficie mostra che le zone del dispositivo trattate con MCH risaltano rispetto
al fondo scuro. Questo indica chiaramente che la posizione del minimo di riflettanza è diversa a seconda
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delle zone della superficie come è evidenziato in fig. 9 a destra. Si vede che nelle zone trattate con MCH la
risonanza plasmonica avviene ad una posizione angolare più elevata rispetto alle zone non trattate.
Figura 9 A sinistra immagine della superficie trattata con gocce di MCH nei pressi della risonanza plasmonica. A destra posizione
angolare della risonanza plasmonica; le gocce di MCH hanno aumentato l’angolo azimutale rispetto al fondo che rappresenta la
superficie non trattata
Purtroppo i test di funzionalizzazione con anticorpo su dispositivi in oro non hanno dato risultati rilevabili
attraverso il banco modificato. Saranno necessarie ulteriori prove per approfondire il problema.
5. Campionamento
Veneto Nanotech ha provveduto ad analizzare alcuni campioni derivanti da vini in fluorescenza su substrati
in vetro per array LifeLine.
Campioni ignoti, siglati sia come “batteri” che come “lieviti”, sono stati analizzati su piattaforma array in
fluorescenza. Le cellule sono state incubate sia tali e quali, che dopo trattamento di sonicazione per
ottenerne dei frammenti più piccoli, in grado di interagire più agevolmente con gli anticorpi immobilizzati
sulla superficie.
I campioni forniti sono stati cresciuti su piastra WL non selettiva; a partire dalle colonie ottenute, si è
proceduto con la crescita il liquido su WL, lavaggio delle cellule, lettura OD dei brodi e marcatura delle
cellule con fluoroforo AF 647. L’incubazione su vetrino array è avvenuta su celle con spot di un “pool” dei 4
anticorpi di interesse (anti gram+, anti gram– e anti lievito) o su celle contenenti gli spot dei singoli
anticorpi separati. Lo schema degli anticorpi singoli è il seguente:
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Le cellule derivanti da campioni reali sono in grado di legare gli anticorpi sulla superficie, con risultati
migliorativi previa sonicazione di 10 minuti. Le cellule di lievito riescono a legare in maniera significativa gli
anticorpi solo previa sonicazione, probabilmente a causa delle loro grandi dimensioni.
Le cellule di batteri riescono a legare efficientemente la piattaforma sia se sonicate che se non sonicate: la
sonicazione tuttavia è in grado di aumentare il rapporto segnale/rumore e quindi verrà utilizzata per
l’analisi dei campioni derivanti dalle fasi di campionamento.
La piattaforma è in grado di fornire un risultato positivo anche se le cellule vengono incubate su celle
funzionalizzate a spot con un “pool” di anticorpi, contenente tutti e quattro gli anticorpi di interesse nel
medesimo spot.
La piattaforma è in grado di riconoscere le cellule esaminate.
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6. Conclusioni
Una volta identificati i protocolli di funzionalizzazione attraverso misure in fluorescenza, si sono effettuate
prove di rilevazione di batteri gram– e lieviti attraverso i dispositivi plasmonici sviluppati. Sono state testate
principalmente due configurazioni di rilevazione, la configurazione tramite prisma e la configurazione
tramite reticolo. I risultati più promettenti sono stati ottenuti nella configurazione tramite prisma dove la
variazione della risonanza plasmonica dovuta alla presenza dei microorganismi è sempre stata registrata.
Questo probabilmente perché la tecnica con grating soffre di problemi di diffrazione e scattering della luce
dovuti dalla presenza dei microorganismi, che compromettono il fenomeno di risonanza plasmonica.
Tra i vari protocolli testati si è visto come lo strato molecolare di MUA+ MCH favorisce il controllo in
fluorescenza e migliora le prestazioni del sensore.
La tecnologia ha dimostrato di funzionare con tempi di analisi molto ridotti rispetto a quelli delle tecniche
tradizionali di coltura microbiologica andando incontro alle esigenze dei produttori.
L’aggiornamento tecnologico del banco per i grating si è dimostrato in grado di distinguere la presenza dei
singoli microorganismi assorbiti sulla superficie il che permette di effettuare una conta batteriologica in
linea andando a funzionalizzare zone diverse con anticorpi diversi. Inoltre si è testato come questo banco
riesca a distinguere variazioni localizzate dell’angolo di risonanza. I primi test su dispositivi in oro
funzionalizzati con anticorpi però non hanno dato i risultati attesi.
Le prove su campioni reali effettuate in fluorescenza secondo i protocolli di funzionalizzazione selezionati
hanno dato esito positivo, dimostrando l’efficacia del layer di cattura.
Le prossime attività di ricerca riguarderanno i test prima sulla rilevazione di batteri gram+ e poi sui
campioni reali utilizzando il biosensore sviluppato, al fine di ottenere un indice di rischio. L’ulteriore pretrattamento del campione e l’ottimizzazione del sistema di misura mireranno al raggiungimento del limite
di rilevazione desiderato, ossia 10 UFC/l.
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