Enzimi di restrizione

Appunti di microbiologia – ITC Primo Levi di Bollate
Enzimi di restrizione
Scoperti negli anni ’50 a seguito dell’osservazione per cui se veniva inserito DNA estraneo
da un ceppo di E.coli ad un altro, questo veniva rapidamente frammentato in piccoli pezzi,
ossia ristretto.
L’analisi di un DNA virale capace di resistere alla frammentazione dimostrò, una decina di
anni dopo, che la presenza di basi metilate rendeva il DNA non frammentabile.
Successivamente si scoprirono enzimi capaci di metilare e contemporaneamente
frammentare il DNA batterico quando non metilato.
Gli enzimi di restrizione
Chiamati anche endonucleasi di restrizione, sono di origine batterica e sono capaci di
tagliare il DNA in punti specifici, dove riconoscono una sequenza particolare di basi.
In pratica servono al batterio per eliminare l’aggressione dei batteriofagi, per cui hanno il
compito di metilare le sequenze endogene da salvaguardare per poter successivamente
eliminare l’eventuale DNA virale, non metilato, importato dai batteriofagi.
Fu Hamilton Smith a isolare il primo enzima in grado di tagliare il DNA a livello di una
specifica sequenza.
Le sequenze palindromiche
Gli enzimi di restrizione riconoscono sequenze palindromiche, normalmente di 4-8 basi
azotate, ossia una serie di basi che lette in direzione 5’ - 3’ sono uguali se lette nel senso
opposto (anna – ai lati di Italia – i topi non avevano nipoti: sono esempi di palindromi della
lingua italiana).
Un enzima di restrizione ottenuto da E.coli può lavorare su qualsiasi cromosoma con cui
venga a contatto, generando quelli che vengono chiamati frammenti di restrizione.
Oggi si usano soprattutto enzimi di restrizione di classe II, ossia che metilano e tagliano in
momenti differenti perché le due azioni sono svolte da molecole distinte. Oggi si trovano in
commercio centinaia di tali enzimi.
La nomenclatura di tali enzimi segue una logica precisa: gli enzimi estratti da Escherichia
coli verranno denominati tutti Eco …., da Haemophylus influenzae Hin …..
Sono stati isolati oltre 1.200 enzimi di restrizione da diversi procarioti, in grado di
riconoscere circa 130 sequenze palindromiche.
La maggior parte di questi enzimi funziona con pH vicini al 7 e temperature intorno ai 37.
In condizioni non ottimali gli enzimi di restrizione funzionano ma in modo errato, dividendo
il DNA in punti casuali, anche se simili.
Le estremità possono essere
Piatte (blunt ends)
Coesive (sticky ends) che a sua volta possono
Sporgere con il terminale 5’
Sporgere con il terminale 3’
Statisticamente un enzima di restrizione che riconosce sequenze palindromiche di 4
nucleotidi, genererà pezzetti di DNA di 256 nucleotidi (4 4), mentre per un enzima che
riconosce palindromi di 6 basi avremo un taglio ogni 4.096 basi (46).
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prof. Michele Segreto
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Batteri diversi generano enzimi diversi per tagliare le stesse sequenze: si parla di enzimi
isoschizomeri, anche se la sequenza tagliata è la medesima ma con tagli differenti (punti
diversi della stessa sequenza, metilazione delle basi limitrofe, ….).
Grazie all’uso dell’enzima DNA ligasi si possono unire pezzetti di DNA tagliato dagli enzimi
di restrizione. Con le estremità blunt possono unirsi anche pezzi di DNA di differenti
microrganismi, dando origine a cromosomi ibridi.
Enzimi usati nella biologia molecolare per manipolare il DNA
DNA ligasi
DNA polimerasi
Nucleasi
Metilasi
Chinasi
Fosfatasi
Come può avvenire l’inserimento di un DNA estraneo in un cromosoma batterico
Si taglia il DNA batterico con un enzima di restrizione;
resterà un filamento di DNA con le estremità aperte, molto adesive;
si inserisce un plasmide nella cellula batterica;
DNA ligasi unisce le estremità e chiude il DNA batterico in un anello più grosso.
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