4a lezione terreni di coltura

Coltivazione dei batteri
Fattori influenzanti la crescita
Identificazione dei microrganismi
Giovanni Di Bonaventura
B.Sc., Ph.D.
Terreni di coltura
Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul
quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in
vitro di un microrganismo
Caratteristiche:
concentrazione adatta di sostanze nutritive per la
crescita batterica
adeguato grado di umidità
reazione (pH) adatta
sterili e protetti da qualsiasi inquinamento
Terreni di coltura
Contenuto qualitativo
(1 di 2)
Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti
per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine
(caseina, soja, ecc.)
NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le
necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni
microrganismi parassiti
Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti
per scopi specifici in terreni particolari
Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori
di crescita e sali inorganici
Terreni di coltura
Contenuto qualitativo
(2 di 2)
Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte
disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la
crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista
nutrizionale
Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a
spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto,
sodio-azide)
Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo
fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.)
permettono di seguire il metabolismo fermentativo
del batterio in esame, determinando il viraggio di
colore del terreno a valori critici di pH
Terreni di coltura
Classificazione
(1 di 3)
In base allo stato fisico:
Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e
sterilizzati.
Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali
(terreno alla patata) o vengono solidificati per
aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina,
silica-gel)
Terreni di coltura
Classificazione
(2 di 3)
In base alla costituzione chimica:
Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri
autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono
presenti come sali inorganici in composizione e
quantità note.
Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione
chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui
il batterio necessita sono presenti in quantità note.
Terreni COMPLESSI: ignota l’esatta composizione
chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di
bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior
parte dei terreni usati in laboratorio.
Terreni di coltura
Classificazione
(3 di 3)
In base alla funzione:
 Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie
microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più
breve rispetto ad altre specie microbiche.
 Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche
(sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide,
cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o
rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non
di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici
microrganismi da campioni altamente contaminati.
 Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici
di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel
terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.
Terreni di coltura
Tecniche di semina per isolamento
Semina per isolamento
Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (1 di 3)
Cetrimide Agar:
Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di
Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per
stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide, verso cui P.
aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei
microrganismi.
Columbia Blood Agar Base:
Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S.
aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori,
Gardnerella).
Hektoen Enteric Agar:
Terreno differenziale e selettivo per l’isolamento di Salmonella e
Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali
biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di
tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per
evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)
Cetrimide Agar
Columbia Blood Agar Base
Hektoen Enteric Agar
Salmonella: colonie lac-
Klebsiella: colonie lac+
Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (2 di 3)
MacConkey agar:
 evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli
Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La
presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di
Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità
fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli,
Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori
quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia,
P. aeruginosa).
Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar:
 non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi.
Urea broth base (terreno di Christensen):
 evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae
mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).
MacConkey agar
A
B
A: colonie lac- di P. aeruginosa; B: colonie lac+ di E. coli
Urea broth base
Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (3 di 3)
Mannitol Salt Agar:
Terreno selettivo per l’isolamento di stafilococchi presunti
patogeni. Azione selettiva dell’elevata [NaCl]. S. aureus
produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi
coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.
Mueller-Hinton agar:
 per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilità.
Saboraud Dextrose Agar:
 terreno acido indicato per l’isolamento di diversi funghi e
lieviti. Candida albicans (colonie incolori/rosa); Candida nonalbicans (colonie rosa scuro/rosse).
Salmonella-Shigella Agar (Agar SS):
 terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di
Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.
Mannitol Salt Agar
Sabouraud Agar
Salmonella Shigella Agar
(SS-agar)
Salmonella typhimurium
Salmonella dublin
Fattori influenzanti la crescita
(1 di 6)
Crescita vs Tolleranza
 “Crescita” generalmente indica l’acquisizione di
biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione).
 Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni
non permissive per la loro crescita.
 Il suffisso “-fili” viene spesso usato per descrivere le
condizioni permissive per la crescita, mentre il termine
“tollerante” descrive le condizioni in cui il microrganismo
sopravvive, ma non necessariamente cresce.
Ad esempio, un “batterio termofilo” cresce in presenza di
elevate temperature, mentre un “batterio
termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma
cresce a temperature inferiori.
Fattori influenzanti la crescita
(2 di 6)
 Obbligato (stretto) vs facoltativo
 “Obbligato” (o “stretto”) indica che una data condizione
è necessaria per la crescita batterica.
 “Facoltativo” indica che il microrganismo può crescere
in quella condizione, sebbene non necessaria.
 Il termine “facoltativo” viene spesso usato in presenza
di condizioni sub-ottimali. Ad esempio, un “termofilo
obbligato” necessita di elevate temperature per la sua
crescita, mentre un “termofilo facoltativo” può crescere
ad alte temperature ma anche a temperature più
basse.
Fattori influenzanti la crescita
(3 di 6)
 Temperatura
 La maggior parte dei batteri cresce in un
intervallo termico di circa 20°C, esibendo la
massima velocità di crescita ad un certo
“optimum termico”
 Psicrofili: ~0 – 20ºC
 Mesofili: ~10 – 50ºC
 Termofili: ~40 – 75 ºC
 Ipertermofili: ~70 – 110 ºC
Fattori influenzanti la crescita
Temperatura
Fattori influenzanti la crescita
(4 di 6)
 pH
 Acidofili:
 crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)
 funghi e lieviti (pH 5 - 6)
 Neutrofili:
 crescono tra pH 6 – 8
 maggior parte dei batteri
 Alcalofili:
 crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)
Fattori influenzanti la crescita
(5 di 6)
 Concentrazione salina (pressione osmotica)
 Alofili:
 Crescono ad elevate concentrazioni saline
(generalmente 1 M), sopportando elevate
pressioni osmotiche;
 Stafilococchi
 Batteri AEROBI OBBLIGATI
Fattoriinfluenzanti
la FACOLTATIVI
crescita
Batteri AEROBI-ANAEROBI
 vivono solo in presenza di O2
 vivono in presenza/assenza di O2
(6 di 6)
 Batteri ANAEROBI OBBLIGATI
Ossigeno (O
2) vivono in assenza di O2
 Batteri MICROAEROFILI
 vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)
Aerobi
obbligati
Aerobi
facoltativi
Anaerobi
obbligati
Anaerobi
facoltativi
Microaerofili
Terreni particolari per l’isolamento
di agenti eziologici poco frequenti
Origine
prelievo
Diagnosi
presuntiva
Batteri patogeni
Terreni per
l'isolamento
Feci
Colera
Vibrio cholerae
Vibrio
parahaemolyticus
Faringe
Infiammazione
ostruttiva
epiglottide e
faringe
Haemophilus
influenzae
Acqua
peptonata
alcalina
TCBS
Agar sangue
cioccolato o
agar Casman
Faringite
membranosa
Corynebacterium
diphteriae
Agar Loeffler
Agar Tinsdale
Terreno al
tellurito di
sodio
Terreni particolari per l’isolamento
di agenti eziologici poco frequenti
Origine prelievo
Diagnosi
presuntiva
Pertosse
Batteri patogeni
Tubercolosi
Mycobacterium
tuberculosis
Micosi polmonare
Blastomyces
dermatitidis
Urina
Leptospirosi
Leptospira spp.
Sangue, midollo
osseo o biopsia
Brucellosi
Brucella spp.
Tampone
rinofaringeo
Escreato
Bordetella
pertussis
Terreni per
l'isolamento
Bordet-Gengou
alla patata
LowensteinJensen
Middlebrook 7H11
Brain-heart
Infusion agar
Semisolido di
Fletcher
Agar brucella
Terreni per l’isolamento degli
anaerobi da campioni patologici (1 di 2)
Terreno
Scopo
Agar sangue (AS)
Terreno in piastra non selettivo di uso
generale
Agar cioccolato (AC)
Utilizzato principalmente per
l'isolamento di Haemophilus e
Neisseria; usato anche per l'isolamento
di anaerobi esigenti
Agar MacConkey (MAC)
Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed
anaerobi facoltativi
Agar sangue feniletil
alcool (PEA)
Isolamento cocchi Gram+ anerobi
facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+
e Gram-
Terreni per l’isolamento degli
anaerobi da campioni patologici (2 di 2)
Terreno
Scopo
Agar sangue kanamicinavancomicina (KV)
Isolamento selettivo di bacilli anaerobi
Gram-
Terreno al tioglicolato
(BBL-0135C) + emina +
vitamina K1 (THIO)
Brodo di arricchimento utilizzato per
arricchire i terreni in piastra
particolarmente se il campione è scarso
Terreno di Thayer-Martin
modificato (MT)
Impiegato per arricchire i terreni per
anaerobi quando si sopetta nel
campione la presenza di Neisseria
gonorrhoeae o N. meningitidis
Anaerobiosi
 Giara per anaerobiosi
 Cappa (camera) per
anaerobiosi
Figure 6.5
Carbossifilia
(5% O2, 10% CO2, 85% N2)
 Giara con “candela”
Sistemi per generazione di
carbossifilia (CO2-packet)
Figure 6.7
Identificazione dei
microrganismi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)





Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Caratteristiche macroscopiche (colturali)
tipo (aspetto) coloniale
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
Caratteristiche biochimiche
Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
Tipizzazione fagica
Identificazione genotipica
ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
(1 di 2)
Forma
puntiforme
Rilievo
d < 1 mm
circolare
filamentosa
rizoide
irregolare
effuso
piatto
irregolare, a filo
intrecciato
irregolare, ramificata
sopraelevato
convesso
umbonato
sottile, allungato
ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
(2 di 2)
Superficie
Margine
intero
liscia
rilevata
ondulata
radiata
concentrica
rugosa
ondulato
eroso
anelli concentrici
raggrinzita
filamentos
o
arricciato
ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (emolisi)
Streptococcus spp
Staphylococcus spp
ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (fermentazione)
Staphylococcus spp
ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (sciamaggio)
Proteus mirabilis
ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche
Enterobacteriaceae, in particolare:
 capacità di utilizzare determinati substrati come
unica fonte di carbonio
 acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) +
indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)
 presenza di particolari enzimi
 ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi,
beta-galattosidasi, ureasi
 produzione di specifici prodotti metabolici terminali
 H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)
 capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test)
 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan
(produzione di gas)
ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche
API (bioMérieux) Identification System
ID dei microrganismi
Caratteristiche antigeniche
Produzione di antisieri (Ab specifici) mediante
inoculazione di microrganismi nella cavia
Utilizzo di antisieri per reazione di agglutinazione
 colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico
 reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi
Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica
(tipi sierologici o sierotipi)
Agglutinazione
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
Ab
ID dei microrganismi
Tipizzazione fagica
 Una singola specie può comprendere ceppi
diversi (sottospecie o tipi)
 Impiego di batteriofagi a fini identificativi
 esempio: tipizzazione di S. aureus
 estremamente sensibile a numerosi (20) batteriofagi
virulenti (litici)
 sensibilità non uniforme (stipite-specifica)
 individuazione di “tipi fagici”
 Utile ai fini epidemiologici (studio delle
modalità di diffusione dell’infezione)
Tipizzazione fagica
ID dei microrganismi
Identificazione molecolare
 Polymerase Chain Reaction
 amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie od il tipo batterico
 elevata sensibilità (necessità di poche copie del target di partenza) e specificità.
 sequenziamento genico (genotipizzazione)
 RNA ribosomale
 grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti;
 presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. L’amplitudo della differenza
nell’rRNA di due batteri rivela quanto filogeneticamente “vicini” essi siano: piccole differenze in
rRNA sono suggestive per una vicinanaza tra le specie, mentre grandi differenze indicano che
le specie sono più distanti tra loro.
 L’individuazione di un pattern in rRNA che non trova riscontro in nessun altra sequenza nota,
indica la scoperta di una nuova specie.
ID dei microrganismi
Identificazione molecolare