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Diapositiva 1 - CRA Centro Riproduzione Assistita
19-21 Giugno 2012 Analisi e Crioconservazione del Liquido Seminale Dott.ssa Alice Bruno Dott.ssa Giovanna Tomasi CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania Introduzione Struttura dello spermatozoo Introduzione 2010 Liquido Seminale È una sospensione concentrata di spermatozoi, immagazzinata negli epididimi, che, al momento dell’eiaculazione, viene diluita con le secrezioni delle ghiandole accessorie del tratto genitale. Prostata Vescichette seminali (Ghiandole di Cowper) Epididimi Spermatozoi Volume dell’eiaculato: Riflette il buon funzionamento dell’attività secretoria delle ghiandole Numero totale di spermatozoi: Riflette la produzione nemaspermica da parte dei testicoli e la pervietà delle vie spermatiche SPERMIOGRAMMA: Valutare la composizione e le caratteristiche del liquido seminale, la vitalità, la motilità, la morfologia, il numero degli spermatozoi Introduzione 1. 2. 3. 4. 4 Frazioni pre-eiaculatoria iniziale principale terminale 1. prodotta dalle ghiandole di Cowper e Littre, di consistenza mucosa; 2. di produzione prostatica, fluida, contiene spermatozoi. Ha pH acido, è ricca di fosfatasi acida e acido citrico; 3. costituita da una parte liquida e una parte gelatinosa, ricca di spermatozoi proviene dall’epididimo, dal deferente e dall’ampolla deferenziale 4. è la più abbondante, è gelatinosa, è prodotta dalle vescichette seminali, ricca in fruttosio, ha reazione alcalina. Introduzione Esame del Liquido Seminale analisi qualitativa e quantitativa per fornire al medico una diagnosi, indirizzare la coppia alla ricerca consapevole di una gravidanza indagine mirata alla preservazione della fertilità in relazione a tutte quelle condizioni patologiche (neoplasie o altro) e fisiologiche che potrebbero alterarla. Perché eseguire lo spermiogramma Diagnosi PMA Preservare la fertilità L’esame del liquido seminale, evidenziando le varie caratteristiche e componenti di questo fluido corporeo, rappresenta ancora oggi la prima ed irrinunciabile indagine diagnostica nello studio dell’infertilità maschile. Pertanto l’obiettivo dell’analisi seminale è da un lato ottenere una risposta rapida attraverso un esame minimamente invasivo sulle possibilità maschili di procreare, dall’altro fornire una diagnosi eziologica accurata per inquadrare l’infertilità nell’ambito di una patologia uro-andrologica e quindi istaurare il corretto approccio terapeutico. Deve essere eseguito da personale qualificato Raccolta del campione INFORMAZIONI PRELIMINARI: Il campione deve essere prodotto tramite ipsazione nella sede in cui si svolgerà l’esame: analizzato entro 30 minuti dalla eiaculazione per limitare gli effetti delle fluttuazioni della temperatura È bene eseguire l’esame su tutto l’eiaculato Opportuno periodo di astinenza (3 giorni) Assunzione farmaci / febbre / malessere Fornire al paziente il maggior numero di informazioni possibili, istruzioni chiare, a voce o scritte Storia clinica e anamnesi del paziente Anamnesi Risalire all’età puberale, in quanto un suo ritardo potrebbe indicare alterazioni dello sviluppo endocrino genitale; Malattie veneree o altre patologie come la parotite e la brucellosi, la fibrosi cistica e il diabete. Terapie chemioterapiche Precedenti interventi Indagine sulle abitudini sessuali della coppia. Assunzione di farmaci, fumo, droghe, alcol e sull’esposizione a sostanze tossiche (pesticidi), radiazioni e temperature elevate. Le abitudini di vita (utilizzo di motocicli, equitazione, …), eventuali traumi meccanici all’apparato genitale, la libido, l’erezione e l’eiaculazione. Fumo, alcol, steroidi e cannabis: effetti Fumo: − Impotenza: 120.000 uomini/anno − ↓ Conta Spermatica − ↓ Motilità Spermatica − ↓ Morfologia − Mutazioni trasmesse alla progenie − ↑ rischio di cancro nella progenie British Medical Association 12 February 2004 Alcohol: − ↓ Testosterone − ↓ Volume del seme compromesso − ↓ Conta Spermatica − ↓ Motilità Spermatica − ↓ Morfologia è reversibile! Donnelly, Lewis et al, Andrologia 1 43-47 1999 Vicari et al, J Endo Invest 25 473-476 2002 Muthusami et al, Fertility and Sterility 84 919-924 2005 Oliva et al, Rep Tox 22 599-605, 2006 Cannabis (uso ripetuto o cronico): − Disfunzione erettile − ↓ Testosterone − ↓ Motilità Spermatica − ↓ Conta Spermatica − ↓ Libido Sheena E. M. Lewis, ESHRE 2011 Steroidi: − Atrofia testicolare − Infertilità − Neoplasie testicolari − Neoplasie del fegato − Danni cardiaci − Perdita dei capelli − Rotture muscolari tendinee − Disfunzioni sessuali Mauro Silvani Raccolta del campione INFORMAZIONI PRELIMINARI: Il campione prodotto al di fuori del laboratorio deve giungere in sede non oltre un’ora dopo la sua produzione durante il trasporto il campione dovrebbe essere mantenuto tra 20°C e 37°C. Se il paziente non riesce a produrre il campione per masturbazione, è assolutamente sconsigliato l’utilizzo di condom in lattice a vantaggio di condom non tossici prodotti specificatamente per la raccolta del liquido seminale. Il “coitus interruptus” è altamente sconsigliato perché andrà persa la prima parte dell’eiaculato che contiene spermatozoi, senza considerare la contaminazione batterica del campione e l’influenza del pH vaginale che potrebbe alterare la motilità degli spermatozoi. Il campione seminale deve essere raccolto in un contenitore sterile di materiale inerte. Cosa & quando? 2010 Entro 5 minuti dalla produzione del campione riporre il liquido seminale in stufa o in incubatore a 37°C perché avvenga la liquefazione Tra 30 e 60 minuti dalla produzione del campione liquefazione, aspetto e volume del liquido seminale; pH, N° di spermatozoi, motilità, valutazione della vitalità. Programmare, quando richieste, altre indagini aggiuntive Entro 3 ore dalla produzione del campione inviare il campione al laboratorio di microbiologia per la ricerca di batteri o miceti. Entro 24 ore dalla produzione del campione saggiare quando richiesti i markers accessorie e l’immunobead test. delle ghiandole In Laboratorio Esame del liquido seminale Analisi Macroscopica Analisi Microscopica Analisi qualitativa e quantitativa del liquido seminale per conoscere le sue caratteristiche in termini di volume, concentrazione e motilità nemaspermiche, caratteristiche morfologiche, vitalità nemaspermica, ricerca di anticorpi anti-spermatozoo. Analisi macroscopica del liquido seminale Aspetto Un “normale” campione di liquido seminale ha aspetto omogeneo e opalescente. Se la concentrazione di spermatozoi è molto bassa a volte ha aspetto quasi trasparente. Il colore varia dal grigio/bianco, al giallo al rosso se sono presenti tracce di sangue. Analisi macroscopica del liquido seminale Liquefazione La liquefazione è il naturale cambiamento nella consistenza del liquido seminale da semiliquido a liquido. Normalmente entro 15-20 minuti a 37°C in stufa. Raramente 60 minuti o più. Il caratteristico coagulo del liquido seminale appena prodotto è il risultato di un enzima di origine prostatica su una proteina coagulabile proveniente dalla secrezione delle vescicole seminali, la sua liquefazione è determinata da un enzima di origine prostatica definito “seminina”. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Analisi macroscopica del liquido seminale Viscosità Tendenza del liquido seminale liquefatto a formare gocce dalla punta della pipetta. Si valuta lasciando cadere lentamente per gravità alcune gocce di seme da una pipetta monouso di plastica con apertura di diametro 1.5 mm. L’aumentata viscosità, se non opportunamente trattata, interferisce con la determinazione della motilità e della concentrazione degli spermatozoi, con la ricerca di anticorpi e la determinazione di altri parametri biochimici. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Analisi macroscopica del liquido seminale Riflette il bilancio tra la secrezione alcalina delle vescichette seminali e la secrezione acida della prostata - V.n. 7.2 - 8.0 pH È misurato utilizzando cartine tornasole con range tra 6.0 e 10.0, la misurazione dovrebbe essere effettuata dopo 30 minuti dalla produzione, a liquefazione avvenuta e comunque entro un’ora dall’eiaculazione poiché esso è influenzato dalla perdita di CO2 che avviene dopo la produzione. Valori normali ≥7.2 2010 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Analisi macroscopica del liquido seminale Consente di calcolare il N° totale spermatozoi presenti nell’eiaculato – (N° sp / ml x Volume) Volume Il limite di inferiore è 2 ml riferimento Il limite di riferimento inferiore è 1.5 ml 2001 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen 2010 di Analisi Microscopica ben miscelato prima di procedere all’esecuzione dell’esame microscopico Esame del liquido seminale microscopio a contrasto di fase a ingrandimento 100x filamenti di muco zone di spermio agglutinazione presenza di cellule non nemaspermiche Il referto Conta degli spermatozoi Motilità Vitalità Morfologia Ricerca di anticorpiantispermatozoo Prova di trattamento Contare gli spermatozoi: la concentrazione Microscopio a contrasto di fase obiettivo 10x o per i campioni più ricchi l’obiettivo 20x Conta degli spermatozoi Camera di Makler la quale ha il pregio di evitare la diluizione del campione e permettere così un esame più rapido Contemporaneamente si valuta la cinetica nemaspermica, valutando sia la percentuale di forme mobili che la qualità della motilità. Contare gli spermatozoi: la concentrazione I termini “numero totale di spermatozoi” e “concentrazione” di spermatozoi non sono quindi sinonimi La concentrazione degli spermatozoi non è una misura diretta della produzione testicolare La produzione testicolare è invece indicata dalla concentrazione totale di spermatozoi eiaculati, cioè la concentrazione di spermatozoi per ml moltiplicato il volume del campione Limiti inferiori di riferimento: 2001 concentrazione 20 x 106 sp/ml numero totale spermatozoi 40 x 106 Limiti inferiori di riferimento: 2010 concentrazione 15 x 106 sp/ml numero totale spermatozoi 39 x 106 Concentrazione numero di spermatozoi per unità di volume del liquido seminale È funzione del numero di spermatozoi emessi e del volume del fluido in cui sono diluiti Numero totale di spermatozoi nell’intero eiaculato Si ottiene moltiplicando la concentrazione nemaspermica per il volume del liquido seminale WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Agglutinazione degli spermatozoi Agglutinazione non specifica di spermatozoi di medie o grandi dimensioni, formate da spermatozoi agglutinati intorno a cellule rotonde o a cellule di sfaldamento, a filamenti di muco. Agglutinazioni specifiche in cui gli spermatozoi aderiscono tra di loro: testa-testa, coda-coda o in forma mista. • Grado 1 o isolata: <10 spermatozoi coinvolti in ogni agglutinazione e molti spermatozoi liberi • Grado 2 o moderata: tra 10 e 50 spermatozoi coinvolti in ogni agglutinazione • Grado 3 o ampia: agglutinazioni con >50 spermatozoi • Grado 4 tutti gli spermatozoi sono agglutinati e le agglutinazioni sono interconnesse WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Dott.ssa G. Tomasi Determinazione qualitativa e quantitativa della motilità Si effettua la conta del numero di spermatozoi presenti in una fila di 10 quadratini orizzontali per stabilirne la concentrazione per ml. Si calcola la motilità in percentuale contando gli spermatozoi per ogni categoria considerata. Dott.ssa G. Tomasi Determinazione qualitativa e quantitativa della motilità Al microscopio ottico a contrasto di fase con ingrandimento 100x Motilità (<’60) tipo Rapidamente progressiva rettilinea a Progressiva rettilinea b In situ Immobili Motilità PR Motilità progressiva c NP Motilità non progressiva d IM Immobilità WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Dott.ssa G. Tomasi Determinazione qualitativa e quantitativa della motilità Motilità (<’60) tipo Rapidamente progressiva rettilinea a Progressiva rettilinea b In situ Immobili Limiti inferiori di riferimento: a=25% o (a+b)=50% Motilità PR Motilità progressiva c NP Motilità non progressiva d IM Immobilità Limiti inferiori di riferimento: (PR+NP)=40% o PR=32% 2001 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen 2010 Valutazione della vitalità nemaspermica spermatozoi vivi ma di tipo immobile Test eosina-nigrosina integrità della membrana cellulare Swelling test Il limite di inferiore è 75% riferimento 2001 Il limite di riferimento inferiore è 58% 2010 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Valutazione della vitalità nemaspermica Test eosina-nigrosina le cellule non vitali hanno la membrana danneggiata e quindi hanno la capacità di far passare coloranti che normalmente non permeano la membrana. Valutazione della vitalità nemaspermica Hyposmotic Swelling Test Sfrutta il rigonfiamento iposmotico della membrana per discriminare tra gli spermatozoi vitali e non vitali: gli spermatozoi con membrane cellulari intatte si rigonfiano in cinque minuti in un mezzo iposmotico. Pictures courtesy of Dr. N. Minniti Valutazione della vitalità nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Valutazione della Morfologia Nemaspermica testa contorno liscio e ovale Kruger Strict Criteria acrosoma ben definito occupa dal 40% al 70% della testa Non devono essere presenti difetti del collo, del pezzo intermedio o della coda Valutazione della Morfologia Nemaspermica Testa & Acrosoma La regione acrosomiale non dovrebbe contenere grandi vacuoli e non più di due piccoli vacuoli che non dovrebbero occupare più del 20% della testa. La regione post acrosomiale non dovrebbe contenere vacuoli. Sottile, regolare e della stessa lunghezza della testa. Tratto Intermedio L’asse maggiore dovrebbe essere allineato con l’asse maggiore della testa. Il residuo citoplasmatico viene considerato un’atipia solo se eccede un terzo della dimensione della testa Calibro uniforme lungo tutta la sua lunghezza Tratto principale Più sottile rispetto al tratto intermedio Lungo circa 10 volte la lunghezza della testa Può essere avvolto su se stesso senza però formare un angolo acuto che sarebbe indicativo di una rottura flagellare Valutazione della Morfologia Nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Valutazione della Morfologia Nemaspermica Kruger Strict Criteria < 4% sub fertile 5-14% sub-fertile / fertile >14% normal / fertile La classificazione della morfologia secondo i criteri del WHO è una semplice classificazione normale/atipico con il conteggio opzionale della localizzazione delle atipie degli spermatozoi, sempre espressa in percentuale Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Difetti della testa: grande o piccola, a punta o piriforme, rotonda, amorfa, vacuolata, teste doppie Difetti del collo e del tratto intermedio: inserzione asimmetrica Gli spermatozoi anomali generalmente del tratto intermedio nella testa, hanno un più basso potenziale di tratto intermedio ispessito o fecondazione e possono contenere irregolare, arrotolato anche DNA alterato. I difetti della morfologia sono stati associati ad un aumento di frammentazione del DNA e a un incremento di incidenza di alterazioni strutturali dei cromosomi o cromatina immatura. Difetti del tratto principale: corto, multiplo, rotto, liscio piegato a forcina, fortemente angolato di spessore irregolare Residui citoplasmatici in eccesso poiché associati ad un processo spermatogenetico alterato WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen Ricerca Anticorpi Antispermatozoo Mixed Antiglobulin Reaction Test Viene effettuato miscelando liquido seminale in toto con particelle di latex (beads), alle sospensioni è addizionato un siero monospecifico anti IgG o IgA. La formazione di agglutinazioni miste fra beads e spermatozoi mobili indica la presenza di anticorpi sullo spermatozoo. La prova di trattamento La prova di trattamento è un test funzionale che valuta le capacità cinetiche degli spermatozoi. Lo scopo di questi trattamenti è quello di selezionare le sottopopolazioni nemaspermiche dotate di migliore motilità, morfologia e probabilmente capacità fecondante. Conta e motilità Prova di trattamento Gradiente Swim-up PMA Lavaggio e separazione La prova di trattamento: Tecnica dello SWIM-UP Normospermia Prevede la centrifugazione del seme (750 rpm) per separare la parte liquida da quella cellulare con la formazione di un pellet e la migrazione - swim up - degli spermatozoi in un piccolo volume di terreno di coltura. Stratifica 100-250µl Due lavaggi Incubazione 30 minuti sp sp La prova di trattamento: Gradienti di densità Oligospermia Il Percoll è una sostanza costituita da particelle di silice colloidale rivestite da PVP, polivinilpirrolidone, con cui si realizzano delle soluzioni a diversa concentrazione (90%, 70%, 40%). Percoll I (90%): <1x106/ml concentrazione spermatozoi Percoll II (90% - 40%): concentrazione spermatozoi compresa tra 1 e 5x106/ml Percoll III (90% - 70% - 40%): concentrazione spermatozoi >5x106/ml o con eccessivi detriti sp sp sp Centrifugare a 3160 rpm La prova di trattamento: lavaggio e separazione Oligospermia grave 0.5 x 106 - Azoospermia Alcuni campioni presentano una concentrazione talmente bassa di spermatozoi che si preferisce procedere con un’unica centrifugazione ad elevata gravità (2500 g). Una volta centrifugato dal campione viene allontanato il sopranatante ed il campione viene risospeso in un piccolo volume (300µl) di terreno di coltura. Quindi da esso si prelevano 10 microlitri per effettuare l’analisi. sp Crioconservazione degli spermatozoi Crioconservazione del liquido seminale o degli spermatozoi epididimali o testicolari per preservare la fertilità patologie patologie neoplastiche autoimmuni patologie patologie neurologiche urologiche Banca del seme Crioconservazione legata alla PMA, finalizzata alla realizzazione di una gravidanza Crioconservazione per finalità conservative, indipendenti dalla PMA In Italia la crioconservazione può essere solo «omologa» cioè il paziente può crioconservare il proprio seme; l’utilizzo del seme di un donatore non è effettuabile per quanto previsto dall’art. 4, comma 3, della L.40/2004. Indicazioni alla crioconservazione Patologie che necessitano di terapie inducenti danni alla spermatogenesi (neoplastiche, autoimmuni, …) Interventi chirurgici all’apparato uro-genitale che possono ledere la funzione eiaculatoria Pazienti con Oligoastenoteratospermia (OAT) che presentano transitori miglioramenti Pazienti che mostrano un severo e progressivo peggioramento della qualità del seme Pazienti criptozoospermici Difficoltà a produrre liquido seminale per PMA Soggetti sottoposti a vasectomia In previsione di trattamenti antiblastici o radioterapici, eseguire crioconservazione prima dell’inizio del trattamento. Per farmaci che non agiscono sul ciclo cellulare è possibile crioconservare dopo 3 mesi dalla sospensione. Esami sierologici da effettuare prima della crioconservazione L’azoto liquido può essere veicolo di trasmissione!!! Anti HIV 1 e 2 HBsAg Anti-HBc Anti-HCV Ab VDRL/TPHA D.lgs N.16 del 25\01\2010 Cosa accade in laboratorio? Percorso identificativo del paziente Contrassegnare con nome o codice: - contenitore sterile per la raccolta - provetta sterile in cui viene trasferito il campione - provette per criogenia Registrare su supporto cartaceo, PC e backup: - tipo di provetta - tipo di terreno e il lotto - numero provette crioconservate per singolo paziente e loro localizzazione Marcatura e Stoccaggio MARCATURA Successo della crioconservazione È valutabile dal numero di spermatozoi mobili recuperati allo scongelamento, sebbene non siano da sottovalutare i danni ultrastrutturli alla membrana plasmatica e alla perdita del contenuto acrosomiale. Banca del Seme Banca Seme CRA 2% 6% 4% 8% 31% 49% Sperm epididimali Sperm testicolari Infertilità Oncologici Problemi psicologici Altro Banca del Seme Pazienti oncologici Altro 43% Seminoma 48% Linfoma 9% Dati CRA Dati FIVET/ICSI liquido seminale fresco Età media Fertilizzazione Gravidanze cliniche FIVET/ICSI 1998-2004 (prima Legge 40/2004) 34,4 61,2% 40,7% FIVET/ICSI 2004-2009 (dopo Legge 40/2004) 34,5 76,9% 29,9% FIVET/ICSI 2009-2010 (dopo Sentenza 151/2009) 35,5 68,5% 33,8% Dati ICSI cicli scongelamento Fertilizzazione Gravidanze cliniche ICSI LS-MESA CONG 63% 36,6% ICSI TESA CONG 67% 33,3% Grazie per l’attenzione!
