imaging mass spectrometry - University of Milano
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IMAGING MASS SPECTROMETRY m/z 4940 m/z 4554 Veronica Mainini PhD Biomedical Technologies Post-DOC researcher Clinical Proteomics Unit Dept. Of Health Science Università degli studi di Milano-Bicocca m/z 10165 Mainini V., Angel PM, Magni F., Caprioli RM. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2011 25(1):199-204 IMAGING MASS SPECTROMETRY (IMS) • Tecnologia che permette di analizzare componenti sia endogeni che esogeni presenti nei tessuti, mantenendo nel contempo la loro orientazione spaziale . IMS • • • • Rileva analiti di varia natura Analisi condotta direttamente sul campione nativo Non necessita di marcatori, purificazioni, etc… Fornisce informazioni relative alla distribuzione spaziale • Combina le informazioni molecolari ottenute mediante MS con informazioni derivanti dalla microscopia ottica. IMS: quale spettrometro??? • Spettrometro (TOF, TOF-TOF, orbitrap, synapt, FT-ICR, Q-TOF...) • Ionizzazione MALDI Proteine, peptidi, lipidi, farmaci SIMS Piccole molecole, elementi DESI Piccole molecole, lipidi • Risoluzione Spaziale Ø area colpita • Range di Massa MALDI 10 µm -200 µm SIMS 100 nm – 10 µm DESI 300 µm - 500 µm MALDI 0-30 K m/z– fino 150 K m/z SIMS < 1000 m/z DESI < 3000 m/z • Velocità dell’acquisizione Frequenza del laser 200Hz – 2kHz Ec = ½ mv2 Ec = zeV zeV = ½ mv2 t = L √ m/2zeV v = √ 2zeV/m m/z 4940 m/z 4554 INTENSITY SCALE 0% 100% MALDI-TOF Imaging/Profiling MATRIX Large Droplets (µL) Uniform Coating (spray) Small Droplets (pL) LOW SPATIAL RESOLUTION PROFILING HIGH IMAGING A B C Find discriminatory patterns Proteins/peptides spatial distribution Manuscript in press Wild Type IRF6 -/- 3 mm PROFILING IMAGING PROFILING RESULTS…. IMAGING RESULTS! IMS_Tecnologia • Spessore della sezione: 5-20 µm ↑spessore = ↓ conduttività • Tipologia di campione: -qualsiasi tipo di cellula o tessuto (cellule da coltura, colonie batteriche, tessuti, biopsie…) -tessuti freschi o FFPE •Degradazione del campione Campione: •Inclusione in polimero OCT (Optimal Cutting Temperature, polyvinyl alcohol + polyethylene glycol ) o altre resine. no OCT con OCT •Lavaggi per eliminare interferenti •tipo di matrice: Matrice: 4. Ferulic acid [(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)prop-2-enoic acid] has been recently reported for the detection of high molecular weight proteins on thin tissue sections. •Preparazione della matrice ! •Deposito: automatizzato/manuale Matrice: Kaletas KB, et al Proteomics 2009; 9 (10):2622-33 AUTOMATED SPOTTING VANTAGGI - riproducibilità - buona qualità spettri SVANTAGGI - cristallizzazione della mx - costo elevato - ris. spaziale limitata - tempistiche lunghe SHIMADZU ChIP Chemical Inkjet Printer LABCYTE PORTRAIT 630 Spotter Acustico TLC Sprayer SPRAY MANUALE Ris. Spaziale: 50-150 µm VANTAGGI - Basso costo - Elevata risoluzione spaziale SVANTAGGI: Scarsa riproducibilità Airbrush SPRAY AUTOMATIZZATO Ris. Spaziale: 50µm VANTAGGI: Riproducibile Buona risoluzione spaziale SVANTAGGI: Costo elevato SUBLIMAZIONE IMS e PROTEOMICA CLINICA IMS si focalizza sul fenotipo della patologia Tecnica veloce ed efficace capace di valutare una finestra di centinaia di segnali proteici in un range di massa molto ampio Firme proteiche legate alla malattia primaria Ricerca di firme molecolari: vantaggio combinatoriale 1 3 2 il 1_Informazione clinica 2_Dati sperimentali 3_Analisi biocomputazionale Imaging Mass Spectrometry (IMS) Distribuzione spaziale e caratterizzazione in situ di biomarcatori proteici Marcatori diagnostici e target terapeutici Risposta al trattamento terapeutico Studio del microambiente della lesione Biologia dello sviluppo Distribuzione spaziale di piccole molecole (<1KDa) nel tessuto Xenobiotici (composti farmaceutici e loro metaboliti, droghe, tossine,..) Farmacocinetica Farmacodinamica IMS = alternativa all’autoradiografia! No molecole radioattive Metaboliti Tissues comparison: normal vs disease Tissue protein profiling by MS Intensity (arb. u.) MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma) 32 30 * Normale RCC Spettri Normale : 23 Spettri RCC : 20 28 26 * 24 22 20 18 Differenze statisticamente significative * 16 Spettro medio del normale 14 Spettro medio RCC 12 10 * 8 6 4 * 2 0 4000 6000 8000 10000 m/z 12000 14000 16000 18000 20000 –RCC (Renal Cell Carcinoma)_II 7.5 7.0 Spettro medio del normale Spettro medio RCC 6.5 6.0 RCC Normale 5.5 AREA DEL PICCO Intensity (arb. u.) MALDI-TOF Profiling 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 P-Value = 0.00335 Normale 2.0 RCC 1.5 1.0 0.5 0.0 9800 10000 10200 10400 10600 m/z 10800 11000 11200 11400 –RCC (Renal Cell Carcinoma)_III Spettro medio del normale 47.5 45.0 Spettro medio RCC 42.5 Normale 40.0 RCC 37.5 35.0 32.5 Normale 30.0 RCC 27.5 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 AREA DEL PICCO 25.0 AREA DEL PICCO Intensity (arb. u.) MALDI-TOF Profiling P-Value = 6.24e-005 P-Value = 6.24e-005 RCC Normale RCC Normale 2.5 0.0 2900 3000 3100 3200 3300 m/z 3400 3500 3600 3700 3800 3900 Applicazioni TUMORE: definizione margini istologici e margini molecolari Molecular Tumor Margin! TUMORE ALLO STOMACO • Non esistono Biomarker diagnostici affidabili • CEA e CA19-9 non sono sufficientemente sensibili né specifici • Difficile interpretazione istologica delle lesioni precancerose da quelle di stadio più avanzato. Controls n=43 Patients n=63 Histology driven approach !!! CTRL vs DISEASE PCA Sensitivity 94% Specificity 96% SUMMARY • Histology driven approach allowed to apply profiling analysis in order to: - detect diagnostic pattern characterizing gastric cancer - define molecular patterns discriminating intestinal and diffuse histological lesions - differentiate stage Ia lesions to more advanced lesions (support to prognosis/aid in resolving ambiguous ultrasonography/TAC MALDI IMS: Applications Tissue Imaging by MS Terapia adiuvante preoperatoria condotta con Paclitaxel + radioterapia: - Pazienti con risposta completa (pCR) - Pazienti che non rispondono alla terapia (NR) α-defensine: peptidi ad effetto citotossico coinvolti nel processo di difesa mediato dai neutrofili POTENZIALI MARKER PROGNOSTICI – RISPOSTA AL TRATTAMENTO OLANZAPINA: 2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-tieno[2,3-b][1,5] benzodiazepina, utilizzata per il trattamento di schizofrenia e disturbi bipolari. 2h OLANZAPINE m/z 256 N-desmethyl m/z 256 2-hydroximethyl m/z 272 6h OLANZAPINE m/z 256 N-desmethyl m/z 256 2-hydroximethyl m/z 272 PDZ = primary decidual zone M= mesometrial pole SDZ = secondary decidual zone AM= antimesometrial pole Distribuzione di sfingomieline e fosfatidilcoline durante lo sviluppo embrionale Distribuzione di lisofosfatidilinositolo, fosfatidilinositolo, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerolo e fosfatidilserina durante lo sviluppo embrionale SUMMARY OF APPLICATIONS PROFILING • Normale vs Tumorale • Definizione dei margini tumorali • Diagnosi e prognosi di lesioni tumorali: presenza/assenza della lesione, grado della lesione, caratterizzazione istotipo IMAGING • Risposta al trattamento • Farmacocinetica e farmacodinamica • Lipidomica e proteomica per la definizione di pathways cellulari rilevanti in specifici processi patologici LIMITI e PROSPETTIVE Sensibilità: aumentare il numero e la varietà dei composti osservabili Risoluzione spaziale: laser; ionizzazione (SIMS, DESI) Identificazione: metodi più semplici, veloci ed efficaci ad elevata risoluzione/ proteomica top down Integrazione dati: correlazione con altre tecniche di imaging (es:PET, MRI) e complementazione con metodologie tradizionali (es:shotgun, 2DE) Validazione: nuovi software biostatistici Quantificazione MALDI IMS: IMPROVING SENSITIVITY LIVER 0.05% TRITON X-100 matrix 0.05% SDS matrix No detergent BRAIN 0.05% TRITON X-100 matrix 0.05% SDS matrix No detergent HEART 0.05% TRITON X-100 matrix 0.05% SDS matrix No detergent NO DETERGENT MATRIX SDS MATRIX m/z 4554 m/z 4940 m/z 8956 INTENSITY SCALE 0% 100% NO DETERGENT MATRIX m/z 10165 TRITON X-100 MATRIX m/z 11083 m/z 14004 INTENSITY SCALE 0% 100% Imaging Mass Spectrometry: NEW TECHNOLOGIES & ADVANCED APPROACHES MALDI imaging_ visualizzazione 3D MBP 8 Unident. Prot. MBP 5 Anna C. Crecelius et Al. Three-Dimensional Visualization of Protein Expression in Mouse Brain Structures Using Imaging Mass Spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry, Volume 16, Issue 7, 2005, 1093-1099 Andersson M, Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat Methods. 2008 Jan;5(1):101-8. MALDI imaging: visualizzazione 3D e RMI TUMOR Immagini 2D - Localizzazione di proteine in specifiche regioni istologiche es: HISTONE H4 TUMORE GB protein γ7 STRIATUM Cyt c OXase polypeptide VIIc NORMALE Immagini 3D - Ricostruzione 3D (IMS + imm. Ottiche) - Correlazione immagini in 3D (MRI + IMS + imm. Ottiche) Piano colorato MRI Piano nero IMS proteine NORMALE STRIATUM IDENTIFICAZIONE PROTEINE – sequenziamento su sezioni tissutali 1. Molecular Scanner Approach Tatiana C. Rohner, Dieter Staab, Markus Stoeckli. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mechanisms of Ageing and Development 126 (2005) 177–185 2. Digestione proteolitica in situ M. Reid Groseclose, Malin Andersson, William M. Hardesty and Richard M. Caprioli. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 2007; 42: 254– 262 IMS di materiale archiviato: tessuti FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) Spettro MS * Peptidi di siero amiloide A Principale metodo di conservazione e stoccaggio rimozione della paraffina e digestione triptica in situ MALDI-IMS 1550 m/z Vaste librerie correlate a dati clinici accurati Spettro MS/MS del peptide a 1550 m/z diagnosi prognosi progressione della malattia trattamento terapeutico IMS con digestione triptica in situ su sezione conservata in formaldeide del 1899 di milza di paziente malato di amiloidosi ΔMW=0.061Da LIPIDI in RENE murino LIPIDOMICA: FT-ICR e Ion Mobility Specie molecolari isobare Strumenti ad elevata risoluzione (FT-ICR: R=1 x 106) Separazione per mobilità ionica oltre che per tempo di volo IMAGING LIPIDI Nello stesso campione lipidi distinti da altre piccole molecole con stessa massa nominale PROFILING LIPIDI Specie difficilmente frazionabili BIBLIOGRAFIA – REVIEWS & BOOKS • Mass Spectrometry Imaging Principles and Protocols Rubakhin SS, Sweedler JV .Methods in Molecular Biology 656 Humana Press • Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chughtai K, Heeren RM. Chem Rev. 2010 May 12;110(5):3237-77. Review. • Imaging of intact tissue sections: moving beyond the microscope. Seeley EH, Schwamborn K, Caprioli RM. J Biol Chem. 2011 Jul 22;286(29):2545966. • MALDI imaging mass spectrometry of human tissue: method challenges and clinical perspectives. Seeley EH, Caprioli RM. Trends Biotechnol. 2011 Mar;29(3):136-43 • MALDI imaging mass spectrometry--painting molecular pictures. Schwamborn K, Caprioli RM. Mol Oncol. 2010 Dec;4(6):529-38. • Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Schwamborn K, Caprioli RM. Nat Rev Cancer. 2010 Sep;10(9):639-46. • Imaging mass spectrometry: viewing the future. Schwartz SA, Caprioli RM. Methods Mol Biol. 2010;656:3-19. BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 1 • Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. Oppenheimer SR, Mi D, Sanders ME, Caprioli RM. 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Burnum KE, Cornett DS, Puolitaival SM, Milne SB, Myers DS, Tranguch S, Brown HA, Dey SK, Caprioli RM. J Lipid Res. 2009 Nov;50(11):2290-8. • 3D Imaging by Mass Spectrometry: a new frontier Seeley EH, Caprioli RM Anal Chem 2012 Mar 6;84(5):2105-10. BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 2 •Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume proteomics Andersson M. Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM Nat Meth vol 5, n.1 Jan2008; 101-108 • MALDI Imaging and Profiling Mass Spectrometry in Neuroproteomics. Andersson M, Andren P, Caprioli RM. In: Alzate O, editor. europroteomics. Boca Raton (FL): CRC Press; 2010. Chapter 7. • Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Casadonte R, Caprioli RM. Nat Protoc. 2011 Oct 13;6(11):1695-709. •Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections Seeley EH, Oppenheimer SR, Deming M, Chaurand P, Caprioli RM J Am Soc Mass Spec 2008; 19(8): 1069-1077. • Detergent enhancement of on-tissue protein analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry Mainini V, Angel PM, Magni F, Caprioli RM Rapid Comm Mass Spec 2011; 25: 199-204. • Detection of high molecular weight proteins by MALDI imaging mass spectrometry Mainini V, Bovo G, Chinello C, Gianazza E, Grasso M, Cattoretti G, Magni F. • Multiplex target protein imaging in tissue sections by mass spectrometry – TAMSIM Thiery G, Schepinov MS, Southern EM, et al RCM 2007; 21:823-829. • Tag-Mass: specific molecular imaging of transcriptome and proteome by mass spectrometry based on photocleavable tag. Lemaire R et al. 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