Polimeri Multivision anti-coniglio/ HRP + anti-topo/ AP

Distributore per l'Italia: Bio Optica Milano
www.bio-optica.it
Istruzioni per l’uso
TL-012-MARH
Rev 050707A
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Sistema di rilevazione dei polimeri MultiVision:
Polimeri Multivision anti-coniglio/ HRP + anti-topo/ AP
USO PREVISTO:
Per uso diagnostico in vitro.
DISPONIBILITÀ:
Codice catalogo
Quantità vetrini
TL-012-MARH
60-120 vetrini
SPECIFICITÀ:
IgG anti-topo (H+L) e IgG anti-coniglio (H+L)
ENZIMI:
Perossidasi e fosfatasi
CROMOGENO/SUBSTRATO:
LVBlue/LVRed
REAGENTI:
Q.tà
Componente
TL-012-MARH
1
Polimeri (cocktail) Multivision anti-coniglio/ HRP + anti-topo/ AP
TL-012-MAM
1
Ultra V block
TA-012-UB
1
Bloccante alla perossidasi di idrogeno
TA-012-HP
1
Tampone AP LVBlue
TA-075-TMM
1
Fiala 1 del cromogeno LVBlue
TA-001-AB1
1
Fiala 2 del cromogeno LVBlue
TA-001-AB2
1
Fiala 3 del cromogeno LVBlue
TA-001-AB3
1
Fiala 1 del cromogeno LVRed
TA-004-HR1
1
Fiala 2 del cromogeno LVRed
TA-002-HR2
1
Fiala 3 del cromogeno LVRed
TA-002-HR3
1
Fiala 4 del cromogeno LVRed
TA-002-HR4
1
Mezzo di montaggio
TA-005-UA
FORNITURA:
Cocktail di polimero pronto per l'uso composto da polimeri Multivision anti-coniglio/HRP + anti topo/AP.
LVBlue per attività di fosfatasi alcalina e LVRed per attività di perossidasi di rafano.
DESCRIZIONE
MultiVision Polymer Detection System è un sistema di rilevazione del polimero semplice ed affidabile per la
visualizzazione di due antigeni contemporaneamente in blu e in rosso. Insieme al cocktail di polimeri
Multivision pronto per l'uso composto da fosfatasi anti-topo/alcalina (AP) + perossidasi anti-coniglio/rafano
(HRP), può essere utilizzato un cocktail di anticorpi primari di alta qualità. Questo cocktail è formulato nello
specifico da polimeri MultiVision che forniscono una migliore sensibilità, più risparmio in termini di tempo e
maggiore semplicità nel rilevamento. L'AP Multivision e i polimeri HRP sono tecnologie innovative e
brevettate composte da subunità di polimeri di aminoacidi più piccole che minimizzano i conflitti nei legami
con la proteina target. Il polimero più piccolo consente di avere minori conflitti di legame, ottenendo una
colorazione più uniforme e una migliore amplificazione del segnale. Infine, fornisce all’utente una maggiore
sensibilità ed efficienza dell’anticorpo, nonché un miglior rapporto segnale-rumore. Inoltre, UltraVision LP è
privo di biotina, eliminando così la colorazione di fondo riscontrata con i metodi tradizionali di rilevazione a
base di tale sostanza chimica. Il sistema di rilevazione del polimero MultiVision ottiene una colorazione
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doppia di alta qualità in meno di due ore su sezioni tissutali fissate in formalina e incluse in paraffina. Per
una interpretazione ottimale dei risultati, devono essere inclusi controlli positivi e negativi.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA:
Questo sistema di rilevazione di polimeri MultiVision può essere impiegato con qualsiasi cocktail di anticorpi
primario per visualizzare contemporaneamente la presenza di due proteine.
Una volta legati gli anticorpi
specifici ai loro rispettivi antigeni nelle sezioni tissutali, gli anticorpi primari del coniglio e del topo vengono
localizzati mediante un cocktail formulato nello specifico da polimeri di anticorpi secondari: polimeri
Multivision anti-coniglio/ HRP + MultiVision anti-topo/ AP. In genere, il polimero dell'aminoacido è legato
agli enzimi AP o HRP e ai frammenti Fab di immunoglobuline anti-coniglio di capra o anti-topo di capra.
Quindi il polimero complesso viene visualizzato con, prima, il cromogeno LVBlue per attività dell'AP e poi,
dopo il lavaggio, con il cromogeno LVRed per l'attività dell'HRP. Non è consigliata una controcolorazone
nucleare con ematossilina
AVVERTENZE E PRECAUZIONI:
I casi clinici devono essere valutati nel contesto della prestazione di controlli adeguati. L'inclusione di un
controllo negativo fissato ed elaborato nella stessa maniera del campione del paziente, posto su ogni
vetrino oltre al tessuto del caso, è fortemente consigliata. Affinché il test possa essere considerato valido, il
controllo negativo deve essere pulito. In alcuni casi, può essere osservata, e ritenuta accettabile, una
colorazione molto debole. Inoltre, si consiglia di includere un controllo negativo del tessuto per ogni lotto di
campioni processati eseguito su Lab Vision Autostainer. Questo controllo negativo del tessuto deve essere
incluso per garantire che le altre procedure di trattamento non creino una colorazione falsa positiva.
Fare riferimento alle schede tecniche di sicurezza per le istruzioni di sicurezza del materiale.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ:
Tutti i componenti sono stabili fino a 12 mesi se conservati tra i 2 e gli 8 °C. Conservare i cromogeni lontani
dalla luce, se possibile.
STATO MICROBIOLOGICO:
Prodotto(i) non sterile(i)
I MATERIALI NECESSARI NON SONO FORNITI:
Reagenti di pretrattamento dei tessuti.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI:
Consultare la procedura
PROCEDURA (USO MANUALE):
PROTOCOLLO DI COLORAZIONE (componenti del kit in grassetto)
NOTA: I controlli appropriati, in particolare i controlli negativi, devono essere inclusi con tutte le
elaborazioni dei vetrini manuali o automatizzate. L'inclusione di controlli negativi aiuteranno ad
interpretare con precisione i risultati della colorazione e aiuteranno a determinare i falsi positivi. Fare
riferimento alla sezione sugli avvisi e sulle precauzioni per i dettagli.
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1.
Sezioni tissutali in paraffina: deparaffinizzare nel sostituto dello xilene e reidratare in alcoli graduati
2.
Lavare in tampone TBST per 2 volte: (TBS + 0,1% Tween20).
3.
Effettuare il pretrattamento del tessuto: recupero dell'epitopo mediante induzione di calore per 90
4.
Lavare 4 volte in acqua distillata.
5.
Applicare la soluzione bloccante alla perossidasi di idrogeno e incubare per 10 minuti a
minuti a 98°C, quindi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti.
temperatura ambiente.
6.
Lavare in TBST 4 volte
7.
Applicare Ultra V Block e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per bloccare la colorazione
di fondo aspecifica Nota: non superare 10 minuti, altrimenti può verificarsi una riduzione dell'intensità
della colorazione.
8.
Non lavare dopo Ultra V Block, ma togliere la soluzione bloccante in eccesso e continuare con il
9.
Applicare il cocktail di anticorpi primari e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
10.
Lavare in TBST 4 volte
11.
Incubare con il cocktail di polimeri MultiVision: anti-coniglio/HRP + anti-topo/AP per 30 minuti a
passo successivo..
temperatura ambiente.
12.
Lavare in TBST 4 volte
13.
Preparare una soluzione operative LVBlue immediatamente prima dell'uso e usare entro 15 minuti
dalla preparazione, altrimenti la sua sensibilità può diminuire.
14.
Aggiungere una goccia di fiala 1 LVBlue a 2,5 ml di tampone AP e miscelare con cura.
15.
Aggiungere una goccia di fiala 2 LVBlue al tampone AP e miscelare con cura.
16.
Aggiungere una goccia di fiala 3 LVBlue al tampone AP e miscelare con cura.
17.
Applicare la soluzione alla sezione tissutale e incubare per 10 minuti.
18.
Lavare in TBST 4 volte
19.
Preparare una soluzione operativaLVRed immediatamente prima dell'uso e usare entro 15 minuti
dalla preparazione, altrimenti la sua sensibilità può diminuire.
20.
Aggiungere tre gocce di fiala 1 LVRed a 5 ml di acqua distillata e miscelare con cura.
21.
Aggiungere due gocce di fiala 2LVRed e miscelare con cura.
22.
Aggiungere due gocce di fiala 3LVRed e miscelare con cura.
23.
Aggiungere due gocce di fiala 4LVRed e miscelare con cura.
24.
Applicare la soluzione alla sezione tissutale e incubare per 10 minuti.
25.
Lavare 4 volte in acqua distillata.
26.
Asciugare completamente la sezione tissutale, preferibilmente su piastra calda a 60°C per 1 ora.
27.
Montare con un sostituto dello xilene contenente il mezzo fornito nel kit. NOTA 1:L'utilizzo di mezzi di
montaggio acquosi farà sparire il prodotto della reazione LVRed nel giro di pochi giorni. NOTA 2:
L'utilizzo di un mezzo di montaggio contenente xilene, può parzialmente sciogliere il prodotto di
reazione LVBlue.
PROCEDURA (PER AUTOSTAINER):
NOTA: I controlli appropriati, in particolare i controlli negativi, devono essere inclusi con tutte le
elaborazioni dei vetrini manuali o automatizzate. L'inclusione di controlli negativi aiuterà ad
interpretare con precisione i risultati della colorazione, così come a determinare i falsi positivi. Fare
riferimento alla sezione sugli avvisi e sulle precauzioni per i dettagli.
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1.
Sezioni tissutali in paraffina: deparaffinizzare nel sostituto dello xilene e reidratare in alcoli graduati
2.
Lavare in tampone TBST per 2 volte.
3.
Effettuare il pretrattamento del tessuto: recupero dell'epitopo mediante induzione di calore per 90
4.
Lavare 4 volte in acqua distillata.
5.
Applicare la soluzione bloccante alla perossidasi di idrogeno e incubare per 10 minuti a
minuti a 98°C, quindi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti.
temperatura ambiente.
6.
Sciacquare con TBST.
7.
Applicare Ultra V Block e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per bloccare la colorazione
di fondo aspecifica. Nota: non superare 10 minuti, altrimenti può verificarsi una riduzione
dell'intensità della colorazione.
8.
Applicare il cocktail di anticorpi primari e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
9.
Sciacquare con TBST.
10.
Incubare con il cocktail di polimeri MultiVision: anti-coniglio/HRP + anti-topo/AP per 30 minuti a
temperatura ambiente.
11.
Sciacquare con TBST.
12.
Preparare una soluzione operativa nuova di LVBlue immediatamente prima dell'uso (seguire le
istruzioni 14 –16, in alto). Applicare e incubare per 10 minuti usando la funzione "Substrate-Batch".
13.
Sciacquare tre volte; una volta con TBST, poi con acqua distillata e di nuovo con TBST,
rispettivamente.
14.
Preparare una soluzione operativa nuova di LVRed immediatamente prima dell'uso (seguire le
istruzioni 20 –23). Applicare e incubare per 10 minuti usando la funzione "Substrate-Batch".
15.
Lavare 4 volte in acqua distillata.
16.
Asciugare completamente la sezione tissutale, preferibilmente su piastra calda a 60°C per 1 ora.
17.
Montare con il mezzo di montaggio sostituto dello xilene fornito nel kit. NOTA 1: L'utilizzo di mezzi di
montaggio acquosi farà sparire il prodotto di reazione LVRed nel giro di pochi giorni. NOTA 2:
L'utilizzo di un mezzo di montaggio contenente xilene, può parzialmente sciogliere il prodotto di
reazione LVBlue.
CONSIGLI:
1.
Accertarsi che le soluzioni LVBlue e LVRed siano utilizzate a temperatura ambiente; temperature
inferiori a quella ambiente possono provocare una colorazione inferiore, anche se le temperature
troppo alte possono provocare una maggiore colorazione con in più un fondo aspecifico.
2.
L'attività di fosfatasi alcalina è inibita dagli ioni fosfati. Non utilizzare PBS per il lavaggio e la diluizione
dei reagenti.
LIMITAZIONI:
1.
L'utilizzo di questo kit si limita ai campioni fissati in formalina e incorporati in paraffina.
2.
Il prodotto della reazione LVBlue è meno meno preciso del prodotto della reazione LVRed. Questo
può oscurare l'osservazione.
3.
La fosfatasi alcalina endogena in genere è assente nei campioni tissutali fissati in formalina e
incorporati in paraffina. L'attività dell'AP endogena presente nei tessuti intestinali non è inibita dal
levamisole e ha bisogno di trattamento prima dell'immunocolorazione (Bulman AS e Heyderman E, J.
Clin. Pathol. 34:1349, 1981).
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BIBLIOGRAFIA PER LA DOPPIA COLORAZIONE:
1.
Immunoenzyme Multiple Staining Methods. CM van der Loos, Manuale n. 45, BIOS Scientific
Publishers, Oxford, UK, 1999. ISBN: 1-85996-187-8 o Springer-Verlag, New York, ISBN: 0-38791594-x.
2.
Multiple staining in molecular morphology, CM van der Loos. In: Molecular morphology in human
tissues (Eds. Hacker GW and Tubbs RR), CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, pp. 27-63