Serotonin ELISA - IBL international

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Istruzioni per l’Uso
Serotonin ELISA
Saggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro
quantitativa di Serotonina in siero, plasma, piastrine, urina umani.
Il test può anche essere usato per scopi di ricerca su tessuti omogenati
e colture cellulari supernatanti.
RE59121
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
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www.IBL-International.com
Serotonin ELISA (RE59121)
1.
ITALIANO
USO PREVISTO
Saggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro quantitativa di Serotonina in siero,
plasma, piastrine, urina umani. Il test può anche essere usato per scopi di ricerca su tessuti omogenati e
colture cellulari supernatanti.
2.
SOMMARIO E SPIEGAZIONI
La serotonina è un prodotto intermedio del metabolismo del triptofano ed è situato principalmente nelle
cellule enterocromaffini dell’intestino, nei neuroni serotoninergici del cervello, nelle piastrine e nel sistema
nervoso centrale è un neurotrasmettitore consolidato.
Nel sangue in circolazione, quasi tutta la serotonina è concentrata nelle piastrine. Concentrazioni alterate di
serotonina circolante sono state correlate a severe condizioni patologiche quali mal di testa cronico da
tensione, schizofrenia, ipertensione, malattia di Huntington, distrofia muscolare di Duchenne ed appendicite
acuta in fase precoce. La determinazione dei livelli di serotonina nel siero è importante dal punto di vista
clinico per la valutazione diagnostica della sindrome carcinoide. Nel prossimo futuro è prevedibile un
interesse crescente nei confronti della determinazione di serotonina nelle piastrine e della sua cinetica di
cattura e rilascio.
3.
PRINCIPIO DEL TEST
La preparazione dei campioni (derivatizzazione di serotonina in N-acilserotonina) è parte della diluizione dei
campioni ed è ottenuta mediante incubazione dei rispettivi campioni con il Reagente di Acilazione.
La procedura del dosaggio ricalca il principio di base dell’ELISA per competizione, con competizione in
questo caso di antigeni biotinilati verso antigeni non biotinilati per un numero fisso di siti anticorpali di
legame. La quantità di antigene biotinilato legato all’anticorpo è inversamente proporzionale alla
concentrazione dell’analita nel campione. Quando il sistema è in equilibrio, l’antigene libero biotinilato viene
lavato via e il complesso antigene biotinilato ed anticorpo viene rilevato usando streptavidina alcalinfosfatasi
come marker e p-nitrofenilfosfato come substrato. La quantificazione dei campioni viene raggiunta
paragonando l’attività enzimatica dei campioni rispetto alla curva preparata usando standard noti.
4.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale.
2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi
di aver compreso tutte le indicazioni.
3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento
della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme
al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore.
4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i
reagenti scaduti.
5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in
lattice e occhiali protettivi se necessario.
6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed
occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di
sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore.
7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi
secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato.
8. Il personale delle pulizie dev’essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle
procedure da adottare.
9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle.
5.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 °C. Non esporre a luce
solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e
dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente.
La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso
riposta a 2–8 °C.
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6.
ITALIANO
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Alcuni cibi contengono dosi sostanziali di serotonina. Alcuni farmaci potrebbero favorire il rilascio di
serotonina e potrebbero alterare i livelli nel campione. I pazienti devono evitare di assumere tali cibi
(es. avocado, banane, caffè, prugne, ananas, pomodori, noci) e farmaci (es. aspirina,
corticotropina, MAO inibitori, fenazetina, catecolamine, reserpina, nicotina).
Siero
Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l’integrità del campione di
sangue dal momento del prelievo al momento dell’esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati,
itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro
interno.
Conservazione:
Stabilità
18-25°C
2-8°C
2h
6h
 -20°C
(Aliquote)
3 mesi
Non esporre alla luce solare diretta e al calore.
Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento.
Spedire i campioni dopo loro congelamento.
Urina
È possibile usare campioni freschi e campioni delle 24 ore. Il volume totale delle urine delle 24 ore deve
essere raccolto in un unico recipiente con aggiunta di 10-15 mL di HCl 6 N come conservante. Segnare il
volume totale per il calcolo dei risultati. Mescolare e centrifugare i campioni prima di usare nel saggio.
Conservazione:
Stabilità
 -20°C (Aliquote)
6 mesi
Plasma, Piastrine
Più del 98 percento della serotonina in circolazione è localizzata nelle piastrine ed è rilasciata durante la
coagulazione del sangue. Il sangue deve essere raccolto attraverso una puntura venosa in provette di
plastica contenenti EDTA o citrato come anticoagulanti (ad es. 10 mL Monovette NC con 1 mL di soluzione
citrato della SARSTEDT). I campioni sono mantenuti e centrifugati a temperatura ambiente per 10 minuti a
200 x g per ottenere il plasma ricco di piastrine. (PRP). In seguito il supernatante del PRP è trasferito in
un’altra provetta e le piastrine vengono contate.
Per ottenere il pellet di piastrine, un’aliquota di 200 µL di PRP (contententi da 350000 a
500000 piastrine/ µL) è aggiunta a 800 µL di soluzione fisiologica salina e centrifugata a 4500 x g per 10
minuti a 4°C (o a 10000 x g per 2 minuti a 4°C). Il supernatante viene poi eliminato.
200 µL di acqua doppio destillato è aggiunta al pellet, che ora può essere conservato congelato a
< -20°C per diverse settimane senza alterazioni del contentuto di serotonina.
Dopo lo scongelamento dei campioni congelati, centrifugare a 10000 x g per 2 minuti a temperatura
ambiente. 20 µL del supernatante sono usati per l’ELISA (vedi acilazione).
Se si vuole misurare la serotonina nel plasma privo di piastrine (PFP), un’aliquota del PRP viene
centrifugata a 4500 x g per 10 minuti a 4°C (o a 10000 x g per 2 minuti a 4°C) per ottenere il plasma privo
di piastrine (PFP). 50 µL di supernatante vengono usati nell’ELISA per la misurazione della serotonina
libera (non legata alle piastrine) (vedi acilazione).
NOTA: La determinazione diretta della serotonina nel PRP ha dimostrato che nel 10 % dei campioni PRP
sono state misurate concentrazioni di serotonina inaspettatamente alte (risultati ottenuti tramite HPLC e
luorimetria). Per evitare tali discrepanze, si raccomanda di effettuare separatamente la misurazione di
serotonina nel plasma ricco di piastrine e in quello privo di piastrine.
Plasma privo
Piastrine
di Piastrine (dopo la separazione dal plasma)
 -20°C
 -20°C
 -80°C
Conservazione:
Stabilità:
(Aliquote)
(Aliquote)
(Aliquote)
2 settimane
4 settimane
12 mesi
Evitare la ripetizione di cicli di
congelamento / scongelamento.
Spedire i campioni dopo loro congelamento.
Omogenati tissutali, Colture cellulari Supernatant
Omogenati tissutali centrifugati e supernatanti di colture cellulari possono essere utilizzati senza
precauzioni speciali. Attenzione: i terreni di colture cellulari possono contenere serotonina!
Conservazione:
Stabilità:
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 -20°C
(Aliquote)
6 mesi
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7.
ITALIANO
MATERIALE FORNITO
I reagenti forniti nel kit sono sufficienti per le preparazioni in singolo dei campioni (acilazione) e per
analisi in doppio durante l’esecuzione del test. Reagenti aggiuntivi sono disponibili su richiesta.
Quantità
Simbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 8 mL
ANTISERUM
1 x 8 mL
BIOTIN
1 x 0.3 mL
ENZCONJ CONC
1 x 7 x 1 mL
CAL A-G
Componente
Micropiastra
Strisce separabili. Coniugato con antisiero anti-coniglio (capra).
Serotonina Antisiero
Di colore blu. Pronto/a all’uso. Contiene: Antisiero (coniglio), tampone fosfato,
< 0.1 % NaN3.
Serotonina Biotina
Di Colore Giallo. Pronto/a all’uso. Contiene: < 0.1 % NaN3.
Coniugato Enzimatico, Concentrato (100x)
Contiene: streptavidina fosfatase alcalina, Tampone Tris, HCl, < 0.1 % NaN3.
Standard A-G
0; 0.08; 0.24; 0.73; 2.2; 6.6; 19.8 ng/mL
0; 0.45; 1.4; 4.1; 12.5; 37.4; 112.3 nmol/L
Pronto/a all’uso. Contiene: Serotonina (acilato), tampone fosfato, < 0.1 % NaN3.
Controllo 1+2, liofilizzato
1 x 2 x 0.5 mL CONTROL 1+2 LYO Contiene: Siero umano, < 0.1 % NaN .
3
Per le concentrazioni /gli intervalli accettabili vedere le etichette sulle provette.
8.
1 x 3 mL
ACYLREAG
1 x 50 mL
ASSAYBUF CONC
2 x 50 mL
WASHBUF CONC
2 x 13 mL
PNPP SUBS
1 x 15 mL
PNPP STOP
3x
FOIL
Reagente di Acilazione
Anidride Acetica, acetone. Pronto/a all’uso.
Tampone Saggio Concentrato (10x)
Contiene: tampone fosfato, BSA, < 1 % NaN3.
Tampone Lavaggio Concentrato (20x)
Contiene: tampone fosfato, Tween, < 0.1 % Thimerosal.
Soluzione Substrato PNPP
Pronto/a all’uso. Contiene: p-nitrofenil fosfato (PNPP).
Soluzione Stop PNPP
Pronto/a all’uso. Contiene: 1 M NaOH
Pellicola Adesiva
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 20; 25; 50; 100; 1000 µL
2. Provette in vetro (12 x 75 mm)
3. Carrello portaprovette
4. Agitatore orbitale (500 rpm)
5. Vortex mixer
6. Bagno termostatato ad acqua, 37 °C
7. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti
8. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico
9. Centrifuga;  1500 x g
10. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 405 nm
(lunghezza d’onda di riferimento 600-650 nm)
11. Acqua bidistillata o deionizzata
12. Carta assorbente, puntali per pipette e timer
9.
NOTE PER LA PROCEDURA
1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati.
Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento
dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate.
2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti
siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai
campioni e ai componenti del kit (18-25 °C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e
campione prima dell’uso. Non creare schiuma durante il mescolamento.
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3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per
ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non
utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti.
4. Alcuni componenti contengono un volume  250 µL di soluzione. Assicurarsi che la soluzione sia sul
fondo del flacone prima di aprirlo.
5. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento.
6. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un’appropriata distribuzione sulla piastra.
7. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso
ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le
soluzioni in tutti i pozzetti.
8. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a
risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far
asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e
aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti
siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti.
9. L’umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l’involucro finché non ha raggiunto la temperatura
ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell’involucro con il disseccante.
10. La forza di centrifugazione relativa (g) non è equivalente ai giri per minuto (rpm) ma deve essere
calcolata sulla base del raggio della centrifuga.
10.
ISTRUZIONI PRE-TEST
Per la versione manuale ed automatizzata
Il contenuto del kit per 96 determinazioni può essere diviso per 3 esecuzioni separate.
I volumi indicati di seguito si riferiscono a un’esecuzione con 4 strisce (32 determinazioni).
Se il cliente vuole ridurre il numero di standard da 7 a 6 può omettere lo standard G. Il
campo di riferimento verrà quindi ridotto a 155 µg/L (plasma) o 706 µg/L (siero, urina,
omogenati da tessuti, supernatanti di colture cellulari).
La procedura del test si può svolgere in versione abbreviata con 3.5 h d’incubazione per
siero, urina, piastrine, omogenati da tessuti e supernatanti di colture cellulari MA NON PER
IL PLASMA; in alternativa, con un’incubazione di una notte intera, per gli stessi campioni
ED anche per il PLASMA. Il plasma dev’essere SEMPRE incubato per tutta la notte.
10.1.
Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati
Diluire /
Componente
dissolvere
Diluente
Rapporto
Note
Conservazione
Stabilità
La presenza di un colore
bruno-giallastro non influenza
i risultati del test.
2-8°C
2 settimane
2-8°C
4 settimane
 -20°C
(Aliquote)
entro la data
di scadenza
18-25°C
2h
15 mL
ASSAYBUF
CONC
fino a
150 mL
acqua
bidist.
1:10
15 mL
WASHBUF
CONC
fino a
300 mL
acqua
bidist.
1:20
CONTROL 1+2
con
0.50 mL
LYO
acqua
bidist.
60 µL
ENZCONJ
CONC
Soluzione
con
Tampone
6.0 mL
diluita
Lasciare a riposo per 15 min.
Mescolare senza formare
schiuma.
1:101
Preparare freschi ed utilizzare
solo una volta.
10.2. Diluizione dei Campioni
I campioni sospettati di avere una concentrazione superiore a quella dello standard con concentrazione più
alta devono essere diluiti con tampone di diluizione.
10.3. Acilazione dei Campioni e dei Controlli (non degli Standard)
La seguente procedura dev’essere effettuata in due varianti:
Campione A: Siero, Urina, estratto di piastrine, omogenato tissutale e controlli
Campione B: plasma privo di piastrine
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Non acilare gli standard. Essi sono già acilati!
La preparazione del campione porta ad una diluizione di 107 volte del siero, dell’urina, delle piastrine,
degli omogenati tissutali, dei supernatanti di colture cellulari e dei controlli e ad una diluizione di 23.5
volte dei campioni di sangue. Tutto questo dev’essere preso in considerazione per il calcolo dei
risultati.
10.3.1. Campione A: Siero, Urina, estratto di piastrine, omogenato tissutale e controlli
1.
Pipettare 20 µL di ogni Controllo e di ogni campione A in provette di vetro.
2.
Pipettare 100 µL di Soluzione Tampone diluita in ogni provetta. Mescolare sul Vortex mixer.
3.
Pipettare 25 µL di Reagente di Acilazione in ogni provetta.
Agitare ogni provetta nel Vortex immediatamente dopo aver pipettato.
4.
Coprire le provette. Incubare per 15 min a 37 °C in bagno di acqua.
5.
Pipettare 2 mL di Soluzione Tampone diluita in ogni provetta. Mescolare sul Vortex mixer.
6.
Centrifugare tutte le provette per 10 min a 1500 x g.
I campioni preparati devono essere analizzati immediatamente.
Il supernatante è stabile solo 1 h a 18-25 °C.
10.3.2. Campione B: plasma privo di piastrine
1.
Pipettare 50 µL di ogni campione B in provette di vetro.
2.
Pipettare 100 µL di Soluzione Tampone diluita in ogni provetta. Mescolare sul Vortex mixer.
Pipettare 25 µL di Reagente di Acilazione in ogni provetta.
3.
Agitare ogni provetta nel Vortex immediatamente dopo aver pipettato.
4.
Coprire le provette. Incubare per 15 min a 37 °C in bagno di acqua.
5.
Pipettare 1 mL di Soluzione Tampone diluita in ogni provetta. Mescolare sul Vortex mixer.
6.
Centrifugare tutte le provette per 10 min a 1500 x g.
I campioni preparati devono essere analizzati immediatamente.
Il supernatante è stabile solo 1 h a 18-25 °C.
11.
PROCEDURA DEL TEST
11.1. Versione abbreviata (Nota bene: solo per campioni A, non per il plasma)
1.
Pipettare 50 µL di ogni Standard, Controllo acilato e campione acilato nei rispettivi pozzetti della
Micropiastra di provette.
2.
Pipettare 50 µL di Serotonina per Biotina in ogni pozzetto.
3.
Pipettare 50 µL di Serotonina per Antisiero in ogni pozzetto.
4.
Coprire la piastra con pellicola adesiva.
Incubare 90 min a TA (18-25 °C) su un oscillatore orbitale (500 rpm) al buio.
5.
Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d’incubazione. Lavare la piastra 3 x 250 µL
con il Tampone di Lavaggio diluito. Rimuovere l’eccesso di soluzione picchiettando la piastra
capovolta su una salvietta di carta.
6.
Pipettare 100 µL di Coniugato Enzimatico appena preparato in ogni pozzetto.
7.
Incubare 60 min a TA (18-25 °C) su un oscillatore orbitale (500 rpm) al buio.
8.
Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d’incubazione. Lavare la piastra 3 x 250 µL
con il Tampone di Lavaggio diluito. Rimuovere l’eccesso di soluzione picchiettando la piastra
9.
Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali.
Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento
positivo ed evitare la formazione di bolle d’aria.
10. Pipettare 200 µL di Soluzione Substrato PNPP in ogni pozzetto.
11. Incubare 60 min a TA (18-25 °C) su un oscillatore orbitale (500 rpm).
12. Fermare la reazione del substrato aggiungendo in ogni pozzetto 50 μL di Soluzione Stop PNPP.
Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra.
13. Misurare la densità ottica con un fotometro a 405 nm (Lunghezza d’onda di riferimento: 600-650 nm)
entro 60 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop.
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11.2.
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Versione alternativa con incubazione notturna (Campioni A e B)
11.2.1. Primo Giorno
1.
Pipettare 50 µL di Standard, Controllo acilato e campione acilato nei rispettivi pozzetti della Piastra
Microtiter.
2.
Pipettare 50 µL di Biotin Serotonin in ogni pozzetto.
3.
Pipettare 50 µL di Antisiero Serotonin in ogni pozzetto.
4.
Coprire la piastra con pellicola adesiva. Agitare delicatamente la piastra.
Incubare 16-20 h (una notte) a 2-8 °C.
11.2.2. Secondo Giorno
1.
Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d’incubazione. Lavare la piastra 3 volte con
250 µL di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l’eccesso di soluzione picchiettando la piastra
2.
Pipettare 150 µL di Coniugato Enzimatico preparato sul momento in ogni pozzetto.
3.
Incubare 60 min a TA (18-25 °C) su un oscillatore orbitale (500 rpm).
4.
Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d’incubazione. Lavare la piastra 3 volte con
250 µL di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l’eccesso di soluzione picchiettando la piastra
5.
Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali.
Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento
positivo ed evitare la formazione di bolle d’aria.
6.
Pipettare in ogni pozzetto 200 µL di Soluzione Substrato PNPP.
7.
Incubare 30 min a TA (18-25 °C) su un oscillatore orbitale (500 rpm).
8.
Fermare la reazione substrato aggiungendo 50 µL di Soluzione Stop PNPP in ogni pozzetto.
Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra.
9.
Misurare la densità ottica con un fotometro a 405 nm (Lunghezza d’onda di riferimento:
600-650 nm) entro 60 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop.
12.
CONTROLLO DI QUALITA’
I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l’uso. L’utente deve
inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli
utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche
di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e
il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni
laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi
di controllo qualità periodici.
In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di
conservazione, pipette, strumenti, condizioni d’incubazione e metodi di lavaggio.
13.
CALCOLO DEI RISULTATI
La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione
(asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si
ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log.
Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei
duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile).
La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard.
A causa della diluizione dei campioni i valori devono essere moltiplicati per il fattore corrispondente per
ottenere la concentrazione di serotonina in ng/mL:
Siero, urina, piastrine, omogenati tissutali, supernatanti di colture cellulari, controlli:
x 107
Plasma privo di piastrine:
x 23.5
I risultati dei campioni con prediluizioni maggiori devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione.
Il saggio può essere considerato valido se vengono rispettati i seguenti criteri:
50% OD/ODmax (ED 50): 0.60 - 1.00 ng/mL (media 0.8 ng/mL).
 OD Standard A - Standard G:  0.80 OD.
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Conversione:
Serotonina (ng/mL) x 5.67 = nmol/L
I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel
paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati.
13.1. Calcolo delle piastrine
Il contenuto di serotonina nelle piastrine è riferito a 109 piastrine. Di seguito è dato un esempio:
Concentrazione di serotonina: 100 ng/mL.
Numero di piastrine nel PRP: 300 000/µL equivalenti a 60 000 000/200µL PRP e 200 µL del volume di
estrazione. Utilizzando 20 µL per il test, ciò equivale a 6 x 106 piastrine.
Il contenuto di serotonina è riferito a 1 mL. Dunque il valore di piastrine equivalente a 20 µL dev’essere
moltiplicato per 50.
6 x 106 x 50 = 0.3 x 109 piastrine/ml con un contenuto di serotonina di 100 ng.
Il contenuto di serotonina risultante nelle piastrine è 333 ng/109 piastrine
(100 ng serotonina x 1.0 x 109 / 0.3 x 109 ).
OD 405nm
Tipica Curva di Calibrazione
2.500
(Esempio. Non usare per il calcolo!)
Standard Serotonina
DOMedia
(ng/mL)
A
0.0
2.118
B
0.08
1.883
C
0.24
1.568
D
0.73
1.089
E
2.2
0.641
F
6.6
0.369
G
19.8
0.245
14.
DO/DOmax
(%)
100.0
88.9
74.0
51.5
30.3
17.4
11.6
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0.01
0.1
1
Serotonin ng/mL
10
100
VALORI ATTESI
I soli risultati non dovrebbero essere l’unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere
correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici.
Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori: (97.5 % percentile)
Campioni
Siero
Plasma privo di Piastrine
Piastrine
24 h Urina
n
99
35
35
49
Unità
ng/mL
ng/mL
ng/109 Piastrine
µg/giorni
Media
88.6
3.7
490
83.1
Intervallo
30 – 200
1.8 – 7.5
217 – 861
 200
Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento.
15.
LIMITI DELLA PROCEDURA
La raccolta e conservazione dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli.
Per le reazioni crociate vedere la sezione PERFORMANCE.
Azide e thimerosal a concentrazioni > 0.1 % interferiscono con questo test e possono portare a risultati non
veritieri.
I seguenti componenti del sangue non hanno effetto significativo (+/-20%) sui risultati del test fino ai livelli di
concentrazione riportati in tabella:
Emoglobina
Bilirubina
Version 2014-11
8.33 mg/mL
0.33 mg/mL
7 / 10
16.
ITALIANO
PERFORMANCE
Specificità Analitica
(Reattività Crociate)
Sostanza
Reattività Crociate (%)
N-Acil-Serotonina
100
5-HIAA
0.110
Melatonina
0.040
5-Metossi-Triptamina
0.015
3-Indolacrylic acid
Indole-3-pyruvic acid
< 0.01
3-Indolacetic acid
5-Metoxytryptophol
L-5-OH-Triptofano
Media (Zero-Standard) - 2SD
(come letto dalla curva standard)
Sensibilità Analitica
(Limite di Rilevazione)
Tutta la notte: 0.014 ng/mL
versione abbreviata: 0.025 ng/mL
Siero, Urina, Piastrine, Omogenati tissutali,
Colture cellulari Supernatant
versione abbreviata: 2.68 ng/mL
(moltiplicato per il fattore di diluizione)
Plasma
Intervallo (ng/mL)
CV (%)
Precisione
Siero
91 - 327
3.8 – 6.6
Urina
114
625
4.8
– 8.2
Intra-Saggio
Plasma
7.1 - 247
3.7 – 11.5
Siero
23 – 355
6.7 – 17.3
87 – 626
9.4 – 18.1
Inter-Saggio Urina
Plasma
8.9 - 30
6.8 – 17.9
Intervallo (ng/mL)
Diluizioni Seriali fino a
Intervallo (%)
1:16
90 - 125
Siero
226 – 1503
Linearità
Urina
677 - 1264
1:32
89 - 117
Plasma
404 - 597
1:16
89 - 117
Media (%)
Intervallo (%)
Siero
104
85 – 119
% Recupero dopo i picchi
Recupero
Urina
98
85 – 116
Plasma
100
83 –120
Siero
Test IBL = 0.90 x HPLC + 19.5
r = 0.945; n = 28
Metodo di Paragone
Urina
Test IBL = 0.86 x ELISA + 20.0
r = 0.987; n = 32
verso
Piastrine * Test IBL = 0.992 x HPLC + 0.008
r = 0.992; n = 50
HPLC / altro ELISA
*Reference: Kluge, H; Serotonin in Platelets; J Lab Med, 23 (6): 360-364 (1999)
Version 2014-11
8 / 10
17.
ITALIANO
PROTOCOLLO BREVE (TUTTA LA NOTTE E VERSIONE ABBREVIATA)
Tempo complessivo del
dosaggio
Campioni
<5h
(versione abbreviata)
18-22 h
(Tutta la notte)
18-22 h
(Tutta la notte)
Siero, Urina, Piastrineestratto, Omogenati
tissutali e Controlli
Siero, Urina,
Piastrine-estratto,
Omogenati tissutali e
Controlli
Plasma privo di
Piastrine
Pre-trattamento del
campione
Non acilate gli standard! Sono già acilati.
Acilazione
Volume del campione
20 µL
20 µL
50 µL
Soluzione Tampone diluita
100 µL
100 µL
100 µL
Reagente di Acilazione
Condizioni d’incubazione,
Bagno termostatato ad acqua
25 µL
25 µL
25 µL
15 min 37 °C
15 min 37 °C
15 min 37 °C
2000 µL
2000 µL
1000 µL
10 min a 1500 x g
10 min a 1500 x g
10 min a 1500 x g
Pipettare la Micropiastra
Standards/ campione acilato
Serotonina Biotina
Serotonina Antisiero
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
Incubazione dei campioni
Tempo d’incubazione
Temperatura d’incubazione
Condizioni d’incubazione
90 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
16-20 h
2-8 °C
no agitatore
16-20 h
2-8 °C
no agitatore
3 x 250 µL
3 x 250 µL
3 x 250 µL
150 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
150 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
150 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
3 x 250 µL
3 x 250 µL
3 x 250 µL
200 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
200 µL
30 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
200 µL
30 min
TA (18-25 °C)
Agitatore 500 rpm
50 µL
50 µL
50 µL
Soluzione Tampone diluita
Centrifugazione
Fase di lavaggio
Incubazione enzimi
Coniugato enzimatico diluito
Fase di lavaggio
Incubazione di Substrato
Volume da pipettare
Soluzione Stop
Misurare la densita ottica
Version 2014-11
405 nm (lunghezza d’onda di riferimento: 600 – 650 nm)
9 / 10
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1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
ITALIANO
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
Lahiri, D. K., Ge, Y.-W., Sharman, E. H., Bondy, St. C., Age-related changes in serum melatonin in
mice: higher levels of combined melatonin and 6-hydroxymelatonin sulfate in the cerebral cortex than
serum, heart, liver and kidney tissues. J. Pineal Res. May 2004, Vol. 36, issue 4, 217-223
Bethea, C. L., Lu, N. Z., Reddy, A., Shlaes, T., Streicher, J. M., Whittemore, S. R., Characterization of
reproductive steroid receptors and response to estrogen in a rat serotonergic cell line. Journal of
Neuroscience Methods 127, 31-41 (2003). Address: Bethea, C. L., Oregon National Primate Research
Center, Beaverton, USA.
Pan, J et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance regulator Modulates Neurosecretory
Function in Pulmonary Neuroendocrine Cell-Related Tumor Cell Line Models. Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol. Vol. 27, 553 – 560 (2002)
Khan, I., Thomas, P., Disruption of Neuroendocrine Control of Luteinizing Hormone Secretion by Aroclor
1254 involves Inhibition of Hypothalamic Tryptophan Hydroxylase Activity. Biology of Reproduction, 64,
955-964 (2001). Address: Khan, I.A., University of Texas at Austin, U.S.A.
Harenberg, J, Huhle, G., Giese Ch., Wang, L., Feuring, M., Song, X., Hofmann, U.: Determination of
serotonin release from platelets by enzyme immunoassay in the diagnosis of heparin-induced
thrombocytopenia. British Journal of Hematology, 109, 182-186 (2000) Address: Harenberg J.,
University of Heidelberg, Germany
Kluge, H., Bolle, M., Reuter, R., Werner, S., Zahlten, W., Prudlo, J., Serotonin in Platelets: Comparative
Analyses using New Enzyme Immunoassay and HPLC Test Kits and the Traditional Fluorimetric
Procedure. J Lab Med, 23 (6): 360-364 (1999) Address: Kluge, H., University of Jena, Germany
Balaskas, E., Bamihas, G., Karamouzis M., Voyiatzis, G., Tourkantonis, A. Histamine and Serotonin in
uremic pruritus: effect of ondansetron in CAPD-pruritic patients. Nephron, 78:395-402 (1998) Address:
Elias Balaskas, MD Ahepa University Hospital, Thessaloniki, Greece
Sprott,H., Kluge,H., Franke,S, Hein,G. Altered Serotonin-Levels in Patients with Fibromyalgia. In:
Journal of Musculoskeletal Pain, Abstracts from the 3rd World Congress on Myofascial Pain and
Fibromyalgia San Antonio, Texas, USA, Editor: I. J. Russel, p. 65. (1995) Address: Kluge,H., University
of Jena, Jena, Germany
Thomas Stratz, Wlodzimierz Samborski, Pawel Hrycaj, Thomas Pap, Stefan Mackiewicz, Pierre
Mennet, Wolfgang Müller Die Serotoninkonzentration im Serum bei Patienten mit generalisierter
Tendomyopathie (Fibromyalgie) und chronischer Polyarthritis. In: Medizinische Klinik, 88, 458-462
(1993).
Address: Thomas Stratz, Hochrhein-Institut für Rheumaforschung und Rheumaprävention, Bad
Säckingen/Rheinfelden, Germany
Version 2014-11
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
+ 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11
[email protected]
http://www.IBL-International.com
+1 (416) 645 -1703 Fax: -1704
[email protected]
http://www.IBL-International.com
LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20

Serotonin ELISA - IBL international

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