proteina

14° CORSO NAZIONALE
PER TECNICI DI LABORATORIO OPERANTI NEI
SERVIZI DI ANATOMIA PATOLOGICA
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Capaccio
17 - 20 settembre 2007
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Sensibilità e specificità in immunoistochimica:
l’evoluzione di IRF4/MUM1
Giorgio Cattoretti
Universitá degli Studi Milano-Bicocca
U.O. Anatomia Patologica, Citologia Diagnostica
Laboratorio di Genetica Medica
Azienda Ospedaliera San Gerardo
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#8
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#125
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BLOOD, 15 MARCH 2000 VOLUME 95 (6) pag.2084-92
Plasma Cells
HHV8 C.D.
IM9 myeloma
Normal Tonsil
MUM1 CK
Normal Tonsil:
MUM1 in GC
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Normal P.C.
MUM1 Ig light chain
Normal Tonsil:
MUM1 in GC
Mod Pathol 2001;14(7):686–694
944 tissues stained for MUM1
Lymph node
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Melanocytes,
Melanomas
Stages of Germinal Center Transit Are Defined by B Cell
Transcription Factor Coexpression and Relative Abundance
Giorgio Cattoretti, Rita Shaknovich, Paula M. Smith, Hans-Martin Jäck,
Vundavalli V. Murty and Bachir Alobeid
The Journal of Immunology, 2006, 177: 6930–6939
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Names, names, names (parole, parole, parole….)
IRF4, Pip, LSIRF, ICSAT and MUM1
IRF4 : interferon regulatory factor
Pip : PU.1 Interaction Partner
LSIRF : Lymphocyte Specific Interferon Regulatory Factor
ICSAT : Interferon Consensus Sequence Adult T cell leukemia
MUM1 : Multiple Myeloma Oncogene 1
Names, names, names (parole, parole, parole….)
IRF4, Pip, LSIRF, ICSAT and MUM1
HGNC Guidelines
Guidelines for Human Gene Nomenclature
Hester M. Wain, Elspeth A. Bruford, Ruth C. Lovering, Michael J. Lush, Mathew W. Wright and Sue Povey
Genomics 79(4):464-470 (2002)
http://www.genenames.org/guidelines.html
Gene name: IRF4
Protein name: IRF4
Antibody name or clone: MUM1p
IRF4, IRF-4, MUM-1, MUM1, BCL-6, BCL6, Ki67, Ki-67, MIB-1, MIB 1
vWF, Fact8, CD20, L26, panB, CD45, LC, CALLA, CD10
Development of the Minimum Information Specification for In Situ Hybridization and
Immunohistochemistry Experiments (MISFISHIE).
OMICS. 2006 Summer;10(2):205-8. Review.
PMID: 16901227
Deutsch EW, Ball CA, Bova GS, Brazma A, Bumgarner RE, Campbell D, Causton HC, Christiansen J,
Davidson D, Eichner LJ, Goo YA, Grimmond S, Henrich T, Johnson MH, Korb M, Mills JC, Oudes A,
Parkinson HE, Pascal LE, Quackenbush J, Ramialison M, Ringwald M, Sansone SA, Sherlock G, Stoeckert
CJ Jr, Swedlow J, Taylor RC, Walashek L, Zhou Y, Liu AY, True LD
http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1089/omi.2006.10.205
Stages of Germinal Center Transit Are Defined by B Cell
Transcription Factor Coexpression and Relative Abundance
Giorgio Cattoretti, Rita Shaknovich, Paula M. Smith, Hans-Martin Jäck,
Vundavalli V. Murty and Bachir Alobeid
The Journal of Immunology, 2006, 177: 6930–6939
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SPECIFICITA’
Definizione di SPECIFICITA’ nella
pratica IHC quotidiana
Vista dal PATOLOGO:
Colorazione brunastra che conferma il pregiudizio diagnostico del patologo,
pregiudizio formato sulla H&E, irrispettivamente dalla qualitá della colorazione IHC
stessa.
Vista dal TECNICO DI LABORATORIO:
Colorazione diversa dalla concezione astratta di “fondo” che soddisfa la
rappresentazione visiva virtuale conseguente alla lettura del foglietto illustrativo, lettura
fatta sotto l’effetto della inalazione di solventi.
Vista da ENTRAMBI:
Colorazione che soddisfa la percezione estetica del TECNICO e che induce reazioni
non prevedibili nel PATOLOGO.
Antibodies cut down to size
Nature Biotechnology 25, 875 - 877 (2007) doi:10.1038/nbt0807-875
Peptides only 28 amino acids long retain the specificity of a parental antibody.
Comparison of a
“pheromonicin” with a whole
antibody, a Fab domain and a
single-chain Fv fragment. A
pheromonicin is a fusion of the
~70-kDa bacterial toxin colicin
Ia and a ~3-kDa antibody
mimetic comprising the
VHCDR1 (red), VHFR2 (green)
and VLCDR3 (purple) domains.
Binding of an antibody to its
antigen can be mediated by
the VHCDR1 and VLCDR3
domains.
Anticorpi specifici per epitopi, non per antigeni
YKKLAS
YKKLAS
YKKLAS
Rabbit anti YKKLAS
IgG1
human
IgG2a
mouse
YKK
LAS
Anticorpi specifici per epitopi, non per antigeni
Specificita’ per adsorbimento con peptide
YKKLAS
=
Situazione C
YKK
LAS
YKKLAS
Rabbit anti YKKLAS
YKKLAS
+
Proteina A
Proteina B
MITI
Il controllo di specificita’ di un anticorpo si fa guardando sul
foglietto della ditta e comunque si fa l’inibizione con il peptide con
cui si e’ immunizzato l’animale: FALSO
L’inibizione con peptide dimostra solamente che l’antisiero e’
specifico per quel peptide, non che riconosce una proteina nel
tessuto. Proteine portanti antigeni crossreattivi vengono
riconosciute da anticorpi “specifici”.
La definizione di specificita’ e’ comunque responsabilita’
dell’utilizzatore.
Anticorpi diretti contro porzioni diverse di una
proteina la riconoscono specificamente
Protein Z
YKKLAS
Protein X
YKK
LAS
Protein J
YKKLAS
Rabbit anti Protein X, Nterm
Protein Y
Rabbit anti Protein X, Cterm
Regole per validare anticorpi
per uso clinico ed sperimentale
Criteri per validare un anticorpo per IHC/IF.
Criteri maggiori (un test e’ sufficiente per definire la specificita’)
• Due o piu’ anticorpi ottenuti contro sequenze non-identiche della proteina (ad es. N- e C-terminale)
colorano in modo sovrapponibile.
• Colorazione assente in topo Knockout ma presente in topo wild-type (se animale disponibile e peptide
antigenicamente conservato)
• Colorazione di antigene a localizzazione subcellulare dipendente da attivazione sperimentale, in
condizioni controllate (es. da citoplasma va a nucleare solo dopo stimolo)
Criteri minori (un solo test e’ suggestivo, ma non definisce la specificita’)
• 2 anticorpi che riconoscono la stessa proteina in modo differente ad es uomo vs topo colorano in modo
simile
• Transfettanti in cellule non-esprimenti (RNA-negative) sono positivi, i controlli no.
• Linee cellulari con e senza inibizione con siRNA dell’espressione genica si colorano rispettivamente.
• Linee cellulari multiple negative (RNA-negative) sono negative, linee positive, ma a contenuto noto e
variable, quantificato, sono positive con intensita’ corrispondente.
• Transfettanti a contenuto variabile (WB) si colorano rispettivamente.
NON criteri (non definiscono la specificita’)
• L’anticorpo riconosce una banda unica in WB ed e’ molto specifico e pulito con metodi estrattivi.
• Due anticorpi sono prodotti in due animali diversi (es. coniglio e topo)e colorano in modo simile.
Morale della
favola
•E’ totalmente inutile colorare qualsiasi sezione se non si ha un
piano ed i reagenti per verificare la specificita’ di un nuovo
anticorpo.
•Se l’anticorpo viene riferito come specifico, e’ bene fare i conti in
tasca a chi lo ha definito tale.
•Irrispettivamente dalla efficacia e specificita’ di un anticorpo in
applicazioni diverse dalla IHC / IF (Western Blot,
immunoprecipitazione, Flow Cytometry), il comportamento e la
specificita’ in IHC segue la sua logica, le sue regole e la sua
specificita’.
Interferon regulatory factor family
Interacting
partners
IRF2? and IRF8
IRF1? and IRF8
IRF3, IRF7, CBP, p300
IRF8, NFAT, BCL6, PU.1
IRF1, IRF3, IRF7
ND
IRF3, IRF5
IRF1, IRF2, IRF4, PU.1
STAT1, STAT2
ND
5: 125, 2005
Anti-IRF4 antibodies used to define tissue
distribution of the molecule
Antibody
clone or
serum
IRF4
IRF4
IRF4
IRF4
sc-6059
#4964
sc-28696
MUM1
immunogen
Reactive
on
species
Source
dilution
C-term mouse
Asp 175
AA128-267h
AA144-451h
h, m
h
h, m
h
goat
rabbit
rabbit
mouse
SCBT
CST
SCBT
B. Falini
0.2 µg/ml
1:100
1 µg/ml
1:50
La distribuzione di IRF4 é molto piú ampia di quanto descritto
in precedenza, include cellule B mantellari, dendritiche e altre
e corrisponde a quanto riportato per espressione di RNA.
The Journal of Immunology, 2006, 177: 6930–6939
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Anticorpi contro la porzione di IRF4 compresa tra gli AA 128267 riconoscono nel topo e nell’uomo un epitopo
conformazionale presente in cellule PU.1The Journal of Immunology, 2006, 177: 6930–6939
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Sensitivita’ in IHC
Abundance of molecules, target for detection
starting from lowest biologically relevant level, up
DNA
Single copy gene & up
Hemizygosity
(LOH, deletions),
homozygosity
RNA
Protein
1-1,000 copies (30%)
1,000-10,000 copies (15%) ~ 300 molecules /cell & up
10,000-100,000 copies (50%)
Cytokines : 1/10,000 of
housekeeping genes
(J Histochem Cytochem 46:1249,1998)
IL2R(*) : <500
EPO-R (*) : ≈ 1,000
cMYC (*) : <3,000 quiescent
3-6,000 prolif.
CD3ζ : 25x 103
CD20 : 149 x 103
(*)
= not detectable by routine IHC
High sensitivity in situ detection methods
DNA
FISH with CARD
RNA
Protein
FISH with CARD Rolling circle amplification
Single copy genes
IL7 mRNA in
with oligonucleotide probe 5637 line with pooled
(isolated nuclei)
oligonucleotide probes
(J Histochem Cytochem 46:1249,1998)
IHC/ IF with CARD ?
?
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NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 24 NUMBER 8 AUGUST 2006, pag 914-16
Automated quantitative analysis (AQUA) of in situ protein expression, antibody concentration,
and prognosis.
McCabe A, Dolled-Filhart M, Camp RL, Rimm DL.
J Natl Cancer Inst. 2005 Dec 21;97(24):1808-15. PMID: 16368942
HER2 1:250
J Natl Cancer Inst. 2005 Dec 21;97(24):1808-15
HER2 1:4000
CONCLUSIONE
• La linearita’ della risposta colorimetrica varia a seconda della concentrazione
dell’ anticorpo primario.
• La linearita’ della risposta colorimetrica varia a seconda del range di
concentrazione di proteine in cui viene misurata
• Il significato biologico della colorazione ottenuta varia drammaticamente a
seconda della proteina colorata, ma soprattutto dalla diluizione dell’anticorpo
usato.
2nd layer
3rd layer
GtaMo-biot
Av-HRP
GtaMo-biot
Av-HRP
GtaMo-F(ab)-FITC
Gta-FITC AP
GtaMo-F(ab)-FITC
Gta-FITC AP
A hybrid WB, ISH, IHC method
for high sensitivity IHC.
Extensive blocking (skimmed milk powder)
Long washing
Higher primary and secondary Abs dilutions
(1st Ab <1 µg/ml 2nd Ab >1/1,000)
Fewer layers (one AP-conjugated secondary Ab)
NBT/ BCIP color development for > 30 min
Risultati
Sensibilita’: 0.5 picogrammi per mm2
(pubblicati: 30 picogrammi per mm2 con LSAB,
300 picogrammi per mm2 con PAP o ABC)
Non linearita’ della risposta Ag-anticorpo in IHC, ma una
curva vagamente proporzionale alla risposta.
Putative sensitivity of protein detection
RCA
ELISA
Hybrid IHC
CARD IHC/IF
Routine FCM
WB
Routine IF
Routine IHC
Molecules/cell
1x105
1x104
1x103
1x102
1x101
J Immunol. 2006 Nov 15;177(10):6930-9. PMID: 17082608
Stages of germinal center transit are defined by B cell transcription
factor coexpression and relative abundance.
Cattoretti G, et al. JCattoretti G, Shaknovich R, Smith PM, Jack HM,
Murty VV, Alobeid B.
Paragone tra distribuzione
ed abbondanza di fattori di
trascrizione in B cellule, in
IHC, FCM ed espressione
di RNA
IHC
RNA
FCM
Conclusioni
•Conosci la tua PROTEINA come le tue tasche: peso molecolare,
isoforme, alternative splicing, distribuzione subcellulare, distribuzione in
vertebrati, presenza di motifs (transmembrane domain, Nuclear
Localization Signals) etc., etc., etc.
•Stabilisci un piano d’azione SCIENTIFICO e seguilo con cura e
determinazione: potrebbe diventare una pubblicazione.
•Non fidarti del foglietto illustrativo, di nessuna informazione contenuta,
tranne i riferimenti bibliografici: guardateli ed in piú cerca PubMed.
Conosci tutta la letteratura chiave di quella proteina.
•Valuta criticamente i risultati preliminari su controlli positivi multipli.
•Sperimenta fino al punto in cui puoi fidarti cosí tanto di quella colorazione
immunoistochimica da poter dire ad un paziente se vivr á o morrá.
[email protected]
[email protected]
The Western Blot paradox
WB
IHC
Fully denatured
Partially (?) denatured
(boiled in buffer or 6M urea)
Crosslinked
1/10- 100th of IHC
10, 100x of WB
Staining time
hours
minutes
Washing time
hours
minutes
Significant background
Some background sometimes
Status of the protein
Dilutions of primary Ab
Penalty for
excess primary Ab
Poor washing
Quantizzazione in situ di proteine marcate
Anticorpi
Dako Handbook
Anticorpi
Dako Handbook
Anticorpo
Policlonale
Anticorpo
Monoclonale
si
no
Selezione
a monte
a valle
Specificita’ per l’antigene
ristretta
unica
Affinita’ per l’antigene
spettro
fissa
Riproducibilita’
limitata
infinita
Disponibilita’
ridotta
massima
Titolo,
Affinita’
Concentrazione
Tempo di incubazione
affinita’
Necessita di antigene puro per
essere prodotto:
Variabili da considerare:
Sistemi di rilevazione
Diretta
Indiretta
Dako Handbook
Doppia
Indiretta
PAP
APAAP
LSAB
ABC
complex
polymer
NFkB family of TF
Move to the nucleus when activated with CD40L
neg
contr
p65
p52
cRel
phospho
IkBα
pos
contr
CD79a
contr
CD40L
Ki-67
RISULTATI
specifico
specifico specifico
dubbio
specifico
Il test e’ positivo quando la colorazione passa da citoplasmatic a
nucleare dopo stimolazione con CD40L.