Recovery, visualization, and analysis of actin and tubulin polymer

DISS. ETH NO. 15286
High-Resolution Analysis of F-Actin Meshwork
Kinetics and Kinematics using Computational
Fluorescent Speckle Microscopy
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
For the degree of
Doctor of Sciences
Presented by
Aaron Christian Ponti
Dipl. Natw. ETHZ
Born 30.10.1975
Citizen of Breganzona (TI)
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Gaudenz Danuser, examiner
Prof. Dr. Jonathon Howard, co-examiner
Prof. Dr. Yves Barral, co-examiner
2003
Summary
Summary
This thesis presents the development of a software package for the high-resolution
analysis of F-actin (filamentous actin) meshwork kinetics and kinematics imaged by
Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).
FSM has emerged as the tool of choice for the analysis of the movement, assembly
and disassembly dynamics of macromolecular structures in vivo and in vitro. It delivers
simultaneous kinetic information in large areas of the cell, offering the capability to detect
non-steady state molecular dynamics, and the ability to measure variation in dynamics of
molecular systems at high spatial and temporal resolution. The full exploitation of the huge
quantitative potential of this technique, however, has highly been limited by the lack of
specialized software for analysis of the positional and photometric fluctuations of hundreds of
thousand speckles in an FSM time-lapse series, and for translating this data into biologically
relevant information.
Because of the weak and inherently stochastic nature of speckles, any measurement
derived from FSM data must rely on a statistical processing, based on mathematical models,
of large numbers of speckles, and this calls for fully automated, robust computational tools.
This motivated us into the modeling of the speckle signal and the development of a complex
algorithm to extract, track, and analyze huge numbers of speckles in FSM time-lapse series,
which fluctuate in intensity, move, appear and disappear, subject to the underlying molecular
processes.
In the four core chapters of this thesis, our algorithm will be presented in great detail
along with the many exciting biological results and observations we have obtained from the
analysis of the F-actin meshwork of both contact-inhibited and motile newt lung epithelial
cells. With our software we have been able to reveal the kinetic and kinematic organization of
the cortical, lamellipodial and lamellar F-actin in newt cells with unprecedented spatial and
temporal resolution.
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Sommario
Sommario
Questa tesi riporta lo sviluppo di un pacchetto software per l’analisi ad alta risoluzione
della cinetica e cinematica della rete di actinaF (actina fibrosa) visualizzata mediante la
tecnica detta “Fluorescent Speckle Microscopy” (FSM), letteralmente la microscopia delle
macchie fluorescenti.
La FSM si è imposta quale tecnica preferita per l’analisi della dinamica del
movimento, dell’assemblaggio e del disassemblaggio delle strutture macromolecolari in vivo
ed in vitro. Essa fornisce informazioni cinetiche simultanee su ampie aree della cellula, ed
offre la capacità di rilevare dinamiche molecolari lontane dallo stato di equilibrio e di
misurare variazioni nella dinamica dei sistemi molecolari ad alta risoluzione, tanto spaziale
quanto temporale. La carenza di software specializzato per l’analisi delle fluttuazioni nella
posizione ed intensità delle centinaia di migliaia di speckles che caratterizzano le sequenze di
immagini FSM, e per la traduzione di questi dati in informazione biologica rilevante, ha
finora impedito lo sfruttamento dell’immenso potenziale quantitativo di questa tecnica.
A causa della natura stessa degli speckles, entità fievoli ed intrinsecamente stocastiche,
qualunque misurazione ottenuta da dati FSM deve basarsi su elaborazioni statistiche,
imperniate su modelli matematici, di grandi quantità di speckles. Ciò richiede l’impiego (e
quindi, nel nostro caso, lo sviluppo) di strumenti computazionali potenti, robusti ed
completamente automatizzati. Per questo motivo abbiamo modellato il segnale FSM e
sviluppato un complesso algoritmo per l’estrazione, il tracking e l’analisi di grandi quantità
di speckles che fluttuano in intensità, si muovono, appaiono e scompaiono, soggetti all’azione
di processi molecolari che modificano le strutture macromolecolari sottostanti.
Nei quattro capitoli centrali di questa tesi presenteremo il nostro algoritmo
dettagliatamente, così come mostreremo gli eccitanti risultati biologici e le osservazioni che
abbiamo ottenuto dall’analisi della rete dell’actinaF in cellule epiteliali motili e non motili del
tessuto polmonare delle salamandre. Grazie al nostro software siamo stati in grado di
decifrare l’organizzazione cinetica e cinematica della rete corticale, lamellipodiale e lamellare
di actinaF in questo tipo di cellule con una risoluzione spaziale e temporale mai ottenuta in
precedenza.
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