Nanoparticelle: loro misure e tumori

Nanoparticelle: loro misure e
tumori
Antonio Pietroiusti
Università Tor Vergata Roma
Spresal ASL ROMA D 21/01/2013
Background
I nanomateriali rappresentano un gruppo
eterogeneo di particelle con almeno una
dimensione inferiore a 100 nanometri.
Sono oggi prodotti anche intenzionalmente
e trovano crescenti applicazioni
nell’industria e in medicina
Nanoparticelle: raffronti
dimensionali
Molecules
Ultrafine
Viruses
Respirable
Bacteria
Eukaryote
PM2.5
PM10
Nanoparticles
1 nm
10 nm
100 nm
1 µm
10 µm
Definizione nanomateriale
“Materiale naturale, incidentale o
intenzionalmente prodotto che contiene
nanoparticelle come tali o aggregate o
agglomerate e in cui il 50% o piu’ delle
particelle ha almeno una dimensione
inferiore a 100 nm”
(Commissione Europea, Ottobre 2011)
Varie fonti di nanomateriali…
Naturali
Incendi boschivi
Antropogeniche
Incidentali
Motori a combustione
Ingegnerizzate
Dimensioni e forma
controllate
Eruzioni vulcaniche Inceneritori
Metalliche
Virus
Motori a getto
Non metalliche
Fasi di passaggio
gas/particolato
Fumi di saldatura
Nanosfere, nanotubi
…Rischi diversi
Nanomateriali naturali: esposizione
occasionale, di elevate quantità, di
nanomateriali prevalentemente carboniosi.
Nanomateriali incidentali: esposizione a
particolato composito ed eterogeneo
Nanomateriali ingegnerizzati: esposizione
a nanomateriali relativamente omogenei,
con proprietà fisico-chimiche controllate
Nanomateriali rilevanti per
l’esposizione umana
-Nanomateriali lavoro correlati (Lista OECD)
CNTs, Fullereni, Ossido di Alluminio,
Dendrimeri, Biossido di Titanio, Ossido di
Zinco, Ossido di Cerio, Ferro, Argento, Oro,
silice, biossido di silicio
-Nanomateriali consumo-correlati (Lista RIVM)
Biossido di Titanio, Ossido di Zinco, Ossido
di Cerio, Ossido di Alluminio, Idrossiapatite,
Argento
Lavoratori esposti a
nanomateriali in Gran Bretagna
Attività
Lavorazione Metalli
Farmaceutica
Altro
Vernici
Pigmenti/coloranti
Cemento
Università
Compagnie che
producono NM
N Lavoratori
600.000
57.000
50.000
28.000
11.000
4000
1000
1000
Prodotti sul mercato contenenti nanomateriali
Mercedes
CLS-class
Wilson Double
Core tennis balls
Eddie Bauer
Ruston Fit NanoCare khakis
Wyeth Rapamune
immuno-suppressant
3M Adper Single
Bond Plus
dental adhesive
Smith & Nephew Acticoat 7
antimicrobial wound dressing
Kodak EasyShare
LS633 camera
Laufen Gallery washbasin
with Wondergliss
Samsung Nano
SilverSeal Refrigerator
Hummer H2
NanoOpto subwavelength
polarizing beam splitter/combiner
NM ad alta probabilità di venire a
contatto con il consumatore
Creme da sole
Prodotti per l’igiene orale
Prodotti farmaceutici da banco
Carburanti
Rivestimenti vari
Prodotti per la pulizia
Varie forme di nanomateriali
Nanotubi di Carbonio
Parete singola
o multipla
Diametro
pochi nm,
lunghezza fino
a parecchi
micron
Biopersistenti
L’Uomo è stato quindi da sempre
a contatto con i nanomateriali, ma
a differenza del passato
oggi la possibilità di contatto è
aumentata ed è inoltre possibile
misurarli.
Valutazione dell’esposizione
9
Obbiettivi
8
7
6
Monitoraggio
5
Strategie
3
4
2
1
0
0
5
10
15
Nanomateriali
Cosa misurare?
Morfologia
Area di
Superficie
Stabilità
Dimensioni
Aggregazione/Ag
glomerazione
Carica di
superficie
Numero
Problemi nella valutazione dell’esposizione a nanomateriali
Non c’è tuttora consenso sul parametro
più valido da utilizzare nelle misurazione
dei nanomateriali. I parametri
maggiormente presi in considerazione
(massa, numero ed area di superficie)
presentano limiti significativi nel caso
dell’esposizione a nanomateriali.
Le nanoparticelle non hanno praticamente
massa
Bordo di una singola particella di 10 micron
Gruppo di nanoparticelle d 10 nm
Una nanoparticella di 10 micron pesa un bilione di
volte più di una nanoparticella di 10 nm
Valutazione gravimetrica?
Filtro standard
da 37 mm
Le particelle più grandi possono interferire fortemente con la valutazione
Concentrazione numerica
Cruciale per stabilire se ci si trovi di fronte ad
un’esposizione a nanomateriali
(def. Commissione Europea).
Limiti: notevolissime fluttuazioni spaziali e temporali
Valutazione dell’area di superficie
Probabilmente il parametro che più di tutti è
correlabile con gli eventuali effetti tossici, ma
l’attendibilità può essere ridotta da fenomeni di
aggregazione/agglomerazione che si verificano
In prossimità della zona di respiro del lavoratore
Approccio multiplo
L’approccio teorico migliore consiste
probabilmente nella contestuale
valutazione dei tre fattori più
importanti: massa, numero, area di
superficie.
Ma anche questo approccio ha I suoi
problemi
Problemi pratici
Non sono disponibili strumenti per il
personal sampling.
Nessuno degli strumenti disponibili è in
grado di misurare con sufficiente
accuratezza i parametri multipli necessari
per una attendibile valutazione.
Costi elevati.
Problemi pratici
Non sono disponibili limiti di esposizione
Universalmente accettati.
(Recentemente il NIOSH ha proposto dei
limiti di esposizione specifici per il biossido
di titanio in forma nanometrica e per i
nanotubi di carbonio)
Approccio sequenziale: Nanoparticle Emission
Assessment Technique (NEAT)
Alla luce dei limiti su esposti il National Institute of
Occupational Health and Safety ha proposto una
strategia di misurazione con obiettivi limitati, di
tipo semiquantitativo, tesa a valutare
essenzialmente se vi sia dispersione di
nanomateriali in un dato contesto lavorativo.
NEAT
Strategia di campionamento
• Iniziale ispezione del luogo di lavoro per
identificare eventuali fonti di nanomateriali;
• Valutazione in assenza di attività lavorativa (valore
background)
• Campionamento ambientale delle fasi del ciclo
produttivo a rischio con apparecchi portatili
• Se differenza con background >20/25% ulteriori
indagini con apparecchiature più complesse per
valutazioni più approfondite
NEAT: Step 1:Confronto tra
background e valore misurato
Strumentazione: uso concomitante di
condensation counter particle e di optical
counter particle
NEAT: Step 1:Gradiente
superiore al 20%
Implementazione di misure (es. sistema di
ventilazione) idonee a ridurre l’emissione
di nanomateriali in ambiente di lavoro
NEAT: Step 1:Nuova
misurazione
Gradiente inferiore al 20%: non necessarie
ulteriori indagini.
Gradiente ancora superiore al 20%: Step 2.
NEAT: Step 2: Definizione
nanomateriali presenti
Strumentazione: uso apparecchiature
statiche (Es. Electric low pressure
impactor- ELPI) che consentono migliore
definizione e possibilità di raccoglieri i
materiali su filtri per analisi TEM o SEM.
RISCHI DEI NANOMATERIALI
Proprietà specifiche dei nanomateriali
1. Rapporto superficie/volume: area superficiale
estremamente estesa;
2. Elevato numero di atomi in superficie (Una
particelle di 300 nm ha il 5% degli atomi in
superficie, una di 30 il 50%);
3. Capacità di accesso all’interno delle cellule e
di superare le barriere biologiche;
4. Adsorbimento di proteine e lipidi in vivo e in
vitro;
5. Capacità di trasporto attraverso gli assoni
dei neuroni
Estesa area di superficie
1. Aumento superficie di contatto con
membrane biologiche;
1. Aumentata reattività degli atomi di
superficie
Nanomateriali: interazioni
biologiche
La tossicità dei nanomateriali non è legata
solo alle loro caratteristiche strutturali, ma
un ruolo importante è giocato anche dalla
loro interfaccia biologica, cioè alle modifiche
di superficie che intervengono quando i
nanomateriali interagiscono con strutture
subcellulari e biomolecole (protein corona e lipid
corona).
plasma membrane
bio-corona
NP
NP
lysosome
NP
NP
new bio-corona
endocytosis
at synthesis
in living organism
NP
biological barrier(s)
exocytosis
Proprietà non specifiche dei
nanomateriali
1. Aspetto simil fibroso
2. Biopersistenza
3. Carica elettrica di superficie
4. Instabilità chimica in mezzi biologici
Vie patogenetiche finali
Stress ossidativo
Genotossicità
Infiammazione
Stress ossidativo
Sbilanciamento tra la produzione di specie
reattive dell’ossigeno (ROS) e la capacità
della cellula di neutralizzarle.
Un moderato livello di ROS è necessario per
molte funzioni cellulari.
Stress ossidativo
L’eccessiva produzione di ROS causa
danno a varie componenti cellulari, inclusi
proteine, lipidi e DNA, e inoltre induce
l’attivazione della cascata infiammatoria.
Nanomateriali e cancro
Stress ossidativo, alterazioni genotossiche e
infiammazione cronica sono vie
patogenetiche note di cancerogenesi
Carcinogenicità dei nanomateriali:
un fenomeno generale?
L’ipotesi che le dimensioni nanometriche
siano di per sé un fattore di rischio per la
carcinogenicità è supportata da studi
sperimentali in cui sono state
generalmente usate dosi estremamente
elevate di nanomateriali.
Carcinogenicità dei nanomateriali:
un fenomeno generale?
Gap da colmare:
-Studi epidemiologici
-Prove in vitro e in vivo di carcinogenicità
-Approccio di correlazione struttura/attività
Carcinogenicità dei nanomateriali:
studi epidemiologici
Quasi inesistenti (prove indirette da
nanomateriali incidentali, quali quelli
contenuti negli scarichi diesel).
Carcinogenicità dei nanomateriali:
prove in vivo e in vitro
-Differente caratterizzazione dei
nanomateriali utilizzati
-Differenti dosaggi e vie di somministrazione
-Differenti specie animali
-Differente disegno sperimentale
Carcinogenicità dei nanomateriali:
correlazione struttura/attività
Approccio estremamente complesso per i
nanomateriali, dato l’enorme numero di
variabili da considerare. Promettente
l’approccio di tossicologia computerizzata.
Nanomateriali e cancro: stato
dell’arte
Solo alcuni tipi di nanoparticelle sono in
grado di indurre stress ossidativo,
infiammazione e genotossicità, che
rappresentano note vie patogenetiche per
lo sviluppo del cancro.
Carcinogenicità dei nanomateriali:
standardizzazione
Sulla base di questo background vari
Organismi internazionali quali MAK,
SCENHIR, SCCS, EPA e NIOSH
raccomandano una valutazione individuale
dei singoli nanomateriali
Nanomateriali e cancro: una
classificazione pragmatica
-Ad elevata carica di superficie (Es NiO2)
-Biopersistenti granulari a bassa tossicità
(TiO2)
- Biopersistenti similfibrosi (Es CNT)
- A bassa tossicità (Es SiO2)
Nanomateriali ad elevata carica
di superficie
-Aumentata interazione con le membrane
biologiche e le proteine con carica opposta
-Modello di riferimento: quarzo
Nanomateriali biopersistenti
granulari a bassa tossicità
-Ridotta clearance dei macrofagi alveolari
(overload, mancato raggiungimento
dimensioni critiche)
-Diretto effetto cito-tossico (aumentata area
di superficie, aumentata reattività)
-Forma anatasica probabilmente più reattiva
Nanomateriali biopersistenti
similfibrosi
-Biopersistenza
-Paradigma della fibra
-Fagocitosi frustrata
-Materiale di riferimento: asbesto.
Biossido di titanio: studi
epidemiologici
Tra il 1927 e il 2000 è stata valutata in oltre
15.000 lavoratori di 11 industrie europee la
possibile correlazione tra esposizione a
biossido di titanio e neoplasia polmonare,
ma non è stata rilevata correlazione.
(Boffetta, 2004)
Biossido di titanio: studi
epidemiologici
Analoghi risultati sono stati rilevati in due
studio di coorte statunitense in cui
complessivamente oltre 5000
lavoratori esposti sono stati seguiti per
almeno trent’anni.
(Chen e Faerwheather, 1988; Fryzek, 2003).
Biossido di titanio: studi
epidemiologici
Gli studi riportati non contengono dettagli
sulle dimensioni del biossido di titanio e non
è quindi possibile in base ad essi trarre delle
conclusioni definitive sulla carcinogenicità
del biossido di titanio di dimensioni
nanometriche.
Biossido di titanio: studi inalatori
cronici (> 1 anno) in animali
L’inalazione di biossido di titanio di dimensioni
micrometriche a dosi da 5 a 250 mg/m3 causava
rari tumori polmonari nel gruppo più esposto,
mentre l’inalazione di biossido di titanio di
dimensioni nanometriche a basse dosi (10
mg/m3) causava frequenti tumori polmonari
con incidenza analoga a quella degli scarichi
diesel, che sono classificati come carcinogeni dalla
IARC. (Heinirich, 1995; Warheit e Frame, 2006)
Biossido di titanio: studi inalatori
cronici (< 1 anno) in animali
In questi studi non sono state osservate
neoplasie polmonari, ma solo alterazioni
Infiammatorie e fibrosi. Sebbene tali
alterazioni siano risultate qualitativamente
simili sia per la forma micrometrica che per
quella nanometrica, quest’ultima è in grado
di determinarle a concentrazioni 5-10 volte
più basse (Baggs, 1997; Bermudez, 2004; Hext,
2005).
Biossido di titanio: studi di
instillazione intratracheale
L’instillazione di 30 mg di biossido di titanio
di dimensioni nanometriche induceva tumori
nel 50% degli animali, mentre la dose
doppia di dimensioni micrometriche nel
21%. La percentuale di tumori indotta dal
biossido di titanio nanometrico era simile a
quella indotta da 5 mg di quarzo. (Borm,
2004).
Biossido di titanio: meccanismi
patogenetici
-Ridotta clearance dei macrofagi alveolari
(overload, mancato raggiungimento
dimensioni critiche)
-Diretto effetto cito-tossico (aumentata area
di superficie, aumentata reattività)
-Forma anatasica probabilmente più reattiva
-Possibile effetto genotossico diretto o
secondario a stress ossidativo
Biossido di titanio: problemi aperti
-Dose soglia (mancano studi ben condotti
dose/risposta)
-Trasferibilità dei dati all’Uomo (diversi
meccanismi di clearance polmonare, diverse
capacità antiossidanti)
-Carcinogenesi per altre vie. Recente rilievo
di alterazioni genotossiche indotte da nano
titanio dopo somministrazione orale
(Troullier, 2009).
Carcinogenicità del biossido di
titanio: conclusioni
Pochi studi hanno fin qui indagato gli effetti
carcinogenetici del titanio nel lungo periodo.
Sebbene sia gli studi inalatori che quelli di
instillazione intra-tracheale suggeriscano un
effetto pro-carcinogenetico, tale effetto non
trova riscontro negli studi epidemiologici.
Peraltro, del tutto recentemente (2011) il NIOSH
ha definito la forma nanometrica del biossido di
titanio un potenziale carcinogeno occupazionale
Forma nanometrica del biossido di titanio: la posizione del NIOSH
Il limite OSHA per la polvere totale di biossido di titanio è
di 15 mg/mcubo.
Il NIOSH raccomanda un limite di esposizione di 2.4
mg/mcubo per la forma fine (frazione respirabile) del
biossido di titanio e di 0.3 mg/mcubo per la forma
nanometrica (parte della frazione respirabile con
diametro inferiore a 100 nm) in termini di TWA per 10 ore
al giorno per 40 ore di lavoro a settimana. Il NIOSH ha
definito la forma nanometrica del biossido di titanio quale
potenziale carcinogeno occupazionale mentre ci sono
dati insufficienti a tutt’oggi per classificare la forma fine
del biossido di titanio quale potenziale carcinogeno
occupazionale.
Current Intelligence bullettin NIOSH Aprile 2011
Forma nanometrica del biossido di titanio: la posizione del NIOSH
Queste raccomandazioni
rappresentano livelli che si stima che
possano ridurre il rischio di cancro del
polmone nel corso della vita al di
sotto dell’ 1/1000 nei lavoratori
esposti.
Carcinogenicità dei nanotubi di
carbonio
I nanotubi di carbonio di lunghezza
maggiore di 15 micron presentano similarità
strutturali con l’asbesto, che è un
carcinogeno di classe 1.
Nanotubi di carbonio: studi
epidemiologici
Non esistono studi epidemiologici
Nanotubi di carbonio: studi inalatori
di durata> 1 anno
Non esistono studi inalatori di tale durata
Nanotubi di carbonio: studi inalatori
di durata< 1 anno
Non sono stati riportati tumori, ma:
-Capacità di raggiungere la pleura e di
persistervi a lungo
-Capacità di indurre infiammazione,
granulomi e fibrosi
-Capacità di indurre stress ossidativo e
alterazioni genotossiche
(Shvedova, 2008; Li, 2007; Ma-Hock, 2009)
Nanotubi di carbonio: studi di
instillazione intra-tracheale
Risultati analoghi agli studi inalatori
Nanotubi di carbonio: studi di
iniezione intraperitoneale
-Mesoteliomi (Takagi, 2008; Muller, 2009)
-Granulomi (Poland, 2008)
Le lesioni erano simili a quelle indotte da
Asbesto.
Nanotubi di carbonio: studi in vitro
E’ stato riportato che i nanotubi di carbonio
inducono sulle cellule mesoteliali
alterazioni del tutto simili a quelle prodotte
dall’esposizione all’asbesto, anche se tali
studi non sono stati condotti fino allo
sviluppo della neoplasia vera e propria
Nanotubi di carbonio: conclusioni
Sebbene i dati relativi alla carcinogenicità
dei nanotubi di carbonio siano del tutto
insufficienti, le rilevata analogie con i
meccanismi patogenetici dell’asbesto
rendono necessaria l’esecuzione di studi ben
condotti, finalizzati a chiarire in particolare il loro
potenziale effetto sulle cellule mesoteliali.
Nanotubi di Carbonio: la posizione del NIOSH
Il NIOSH raccomanda un limite di esposizione di 7
µg/mcubo (misurati con il NIOSH method 5040) in termini
di TWA per 8 ore al giorno per 40 ore di lavoro a
settimana per 50 settimane l’anno per 45 anni. Appena al
di sopra di questo limite è stato calcolato un aumento del
rischio del 10% di sviluppare fibrosi polmonare. Sulla
base dei dati disponibili il rapporto tra esposizione a
nanotubi di carbonio e cancro deve considerarsi dubbio.
Current Intelligence bullettin NIOSH Novembre 2011
Classificazione dei nanomateriali:
problemi aperti
Esistono tuttora molte lacune nella
valutazione del potenziale carcinogenetico
dei nanomateriali per decidere di
conseguenza sulla loro classificazione.
Il più importante dei problemi è quello di
definire la differenza di comportamento tra
materiale nanometrico e materiale
micrometrico.
Classificazione dei nanomateriali:
scenari
E’ verosimile che sostanze chimiche non
carcinogene in forma micrometrica (“bulk
form”) lo siano in forma nanometrica.
Differenti forme nanometriche di una stessa
sostanza potrebbero avere un diverso
potenziale carcinogeno ed essere di
conseguenza classificate differentemente.
O ancora, una sostanza classificata in classe
3 nella “bulk form potrebbe essere classificata in classe 1 o
2 nella forma nano.
Conclusioni
Non vi sono prove definitive che i nanomateriali
possano causare neoplasie nell’Uomo, ma è
verosimile che ciò sia possibile, come del resto
osservato per vari materiali di uso
occupazionale nella loro “bulk form”. Finchè non
si disporrà di una legislazione ad hoc, è buona
norma limitare quanto più possibile l’esposizione
di lavoratori e consumatori a tali materiali.